WO2018212603A1 - 단일세포 분석을 위한 액적 내 세포 담지 방법 및 장치 - Google Patents

단일세포 분석을 위한 액적 내 세포 담지 방법 및 장치 Download PDF

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박웅양
문희성
김신현
제광휘
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    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/629—Detection means characterised by use of a special device being a microfluidic device

Definitions

  • a method and apparatus for supporting cells in droplets for single cell analysis or a method and apparatus for forming droplets for single cell analysis.
  • Cell analysis using microfluidics can be particularly useful for genome analysis at the single cell level. Genetic heterogeneity, which occurs at the single cell level in cancer, is an important clue for the precise diagnosis and prognosis of cancer. In addition to cancer, it can be applied to many studies such as IPS, identification of cells made of stem cells, and analysis of subtypes of cell bodies.
  • single cell separation and fractionation techniques largely use valves and micro-wells to put one cell into one well and an emulsion to draw one cell into one water droplet in oil).
  • the emulsion method has the advantage of enabling the encapsulation of cells and particles in droplets to enable rapid, accurate and efficient genome analysis of single cells.
  • single cell RNA sequencing is a standardized after lysing a single cell to extract RNA, create cDNA through reverse transcription and amplify it The sequence is analyzed by sequencing preparation. Since a single cell progresses a lot of time, labor, and cost, a method of indexing a single cell-derived RNA with a single barcode and pooling it in a reverse transcription or amplification step is performed. Recently used.
  • the present invention provides a method and apparatus for in-drop cell support for enhancing both of the above mentioned conflicting parameters in single cell analysis for droplet sequencing.
  • the present invention provides a method for forming a droplet for single cell analysis, comprising the steps of providing a cell; Providing one or more distinctly barcoded RNA capture beads; Carrying one distinguished barcoded RNA capture bead into a single drop of said cell, wherein providing said cell or bead is inertial before said cell or bead is loaded into said drop. It provides a method that is provided through alignment.
  • the inertial alignment may be through a helical channel of the microfluidic device in which the cell or bead is provided.
  • the method may further comprise providing one or more oils (carrier oils).
  • the inertial alignment may be to improve the ratio of one cell and one bead in one droplet.
  • providing the cells, or providing the beads may be provided at a flow rate of at least 1.0 ml / h or more.
  • providing the carrier oil may be provided at a flow rate of at least 2 ml / h.
  • the beads may be provided in or with the cell lysate.
  • the beads may be a molecular bar coded on the surface of the plurality of nucleotides or oligonucleotides.
  • the plurality of nucleotides or oligonucleotides may include a nucleotide sequence for capturing mRNA in a cell.
  • the plurality of nucleotides or oligonucleotide sequences may include oligo-dT sequences or primer sequences.
  • Another aspect is a microfluidic device that forms droplets for single cell analysis, comprising: a cell inlet comprising a first channel; An RNA capture bead inlet comprising a second channel; An oil phase inlet comprising a third channel; An intersection point at which the first channel, the second channel, and the third channel are combined; And an outlet connected to the cross point and discharging a droplet comprising a cell and RNA capture beads, wherein the first channel or the second channel is configured such that the cells or RNA capture beads in the fluid cause an inertial alignment.
  • a fluidic device Provide a fluidic device.
  • first channel and / or the second channel may be spiral.
  • the cell inlet, RNA capture bead inlet or oil phase inlet may further comprise a filter.
  • the method and apparatus for supporting cells in droplets according to one aspect, or the method and apparatus for forming droplets for single cell analysis, by using the inertial alignment effect, not only the rate of supporting one cell in one droplet is increased, It is also effective to improve the yield of the droplets are produced.
  • FIG 3 shows a droplet forming microfluidic device according to one embodiment causing inertial alignment to the bead inlet.
  • FIG. 4 is a view showing a droplet forming microfluidic device according to one embodiment causing both the columnar alignment and the bead and the cell inlet.
  • Figure 5a is a photograph showing the alignment of the particles using a conventional microfluidic device.
  • Figure 5b is a photograph showing the alignment of the particles using a microfluidic device according to one embodiment.
  • FIG. 6 is a view showing the cell throughput and the cell yield per hour according to the bead concentration of the microfluidic device according to an embodiment compared with the existing system; p represents an existing system, o represents a system according to one embodiment.
  • FIG. 7 is a view showing the ratio of the number of cells supported in the droplets according to the bead concentration of the microfluidic device according to one embodiment compared with the existing system; p is the existing system, o is the system according to one embodiment, 1 is the number of cells supported in the droplet, 2 is the number of cells supported in the droplet, m is the number of cells supported in the droplet Three or more cases are shown.
  • FIG. 8A illustrates a transverse position in a helical channel according to one embodiment.
  • 8B is a graph showing the distribution of beads along the length of the transverse position in the helical channel according to one embodiment.
  • 9A is an optical microscope image showing droplets collected using a microfluidic device according to one embodiment; Scale bar is 200 um.
  • 9B is a graph showing the fraction (%) of single bead containing droplets and multiple bead containing droplets collected according to the concentration of beads using the microfluidic device according to one embodiment.
  • Figure 10a is a graph showing the throughput (throughput) and the cell yield (cell yield) according to the concentration of beads in the microfluidic device according to one embodiment.
  • 10B is a graph showing the fraction of single cell and single bead containing droplets according to the concentration of beads in the microfluidic device according to one embodiment.
  • 10C is a graph showing the fraction of single cell and single bead containing droplets according to the concentration of beads in a conventional microfluidic device.
  • FIG. 11A is a graph showing the density plot of UMI per cell in a mixture of human and mouse cells in a conventional microfluidic device (Unodered) and a microfluidic device (Ordered) according to one embodiment.
  • FIG. 11B is a graph showing density plots of UMI per cell in human cells alone in a conventional microfluidic device (Unodered) and a microfluidic device (Ordered) according to one embodiment.
  • FIG. 11C is a graph showing the density plot of UMI per cell in mouse cells alone in a conventional microfluidic device (Unodered) and a microfluidic device (Ordered) according to one embodiment.
  • One aspect is a method of forming droplets for single cell analysis, comprising: providing a cell; Providing one or more distinctly barcoded RNA capture beads; Carrying one distinguished barcoded RNA capture bead into a single drop of said cell, wherein providing said cell or bead is inertial before said cell or bead is loaded into said drop. It provides a method that is provided through alignment.
  • a “droplet” herein is a small volume of liquid, typically of spherical shape, surrounded by an immiscible fluid such as a continuous phase of the emulsion.
  • microdroplets may have a value of about 1 microliter or less, between about 1 microliter and 1 nanoliter, or between about 1 microliter and 1 picoliter.
  • microdroplets may mean a dispersed phase having a diameter of less than about 200 micrometers.
  • carrier fluid may be any liquid compound or mixture thereof that is used interchangeably with “cario oil” and is incompatible with water (or aqueous solution).
  • sample is not particularly limited as long as it can contain a sample to be detected.
  • the sample may be a biological sample, for example a biological fluid or biological tissue.
  • biological fluids include urine, blood, plasma, serum, saliva, semen, feces, sputum, cerebrospinal fluid, tears, mucus, amniotic fluid, and the like.
  • Biological tissue is a collection of cells, typically a collection of certain kinds of intracellular substances that form one of the structural substances of human, animal, plant, bacterial, fungal or viral structures, as connective tissue, epithelial tissue, muscle tissue and nerves. This may be an organization.
  • biological tissue may also include organs, tumors, lymph nodes, arteries and individual cell (s).
  • reaction reagent may refer to a compound, or a set thereof, and / or a composition that is associated with a sample to perform a particular test on the sample.
  • the reaction reagent may be an amplification reagent, specifically, a primer for amplifying a target nucleic acid, a probe and / or dye for detecting an amplification product, a polymerase, a nucleotide (specifically, dNTP), a magnesium ion, Potassium chloride, buffer, or any combination thereof.
  • the reaction reagent may include particles that are separately barcoded (eg, beads).
  • the beads may be molecular barcodes of a plurality of nucleotides or oligonucleotides on the surface of the beads.
  • the plurality of nucleotides or oligonucleotides may include a nucleotide sequence for capturing mRNA in a cell.
  • the plurality of nucleotides or oligonucleotide sequences may include oligo-dT sequences or primer sequences.
  • the beads may be provided in or with the cell lysate.
  • amplification may refer to a reaction that occurs repeatedly to form a plurality of copies of at least one segment of a template molecule.
  • PCR refers to a reaction in which a large number of identical DNA strands are formed from one original template by a cycle process (alternating heating and cooling), and (i) a template having a nucleotide sequence to be amplified.
  • Phosphorylated double helix DNA molecules (ii) primers (single stranded DNA molecules capable of binding to complementary DNA sequences in template DNA), (iii) mixtures of dATP, dTTP, dGTP, and dCTP (new DNA in PCR amplification DNTP, a nucleotide subunit that combines to form a molecule, and (iv) Taq DNA polymerase (an enzyme that synthesizes new DNA molecules using dNTP).
  • complementary means capable of hybridizing base pairs between nucleotides or nucleic acids, typically A and T (or U), or C and G.
  • channel refers to a passageway through which fluid flows, and can be formed by, for example, a tube (eg, a capillary tube), a planar structure or above (eg, a chip), or a combination thereof.
  • a channel is a channel extending along a planar flow path (eg, a channel in a serpentine or spiral planar pattern) or a non-planar flow path (eg, a helical three-dimensional channel).
  • the inertial alignment may be through a helical channel of the microfluidic device in which the cells or beads are provided.
  • the channel may have at least two loops, at least three loops, at least five loops, for example two to twenty loops, five to fifteen loops.
  • the flow of fluid in the microfluidic channel exhibits a pattern of poiseuille flow, where microparticles are present in the shear gradient lift force and wall effect that occurs at the channel wall. will be forced.
  • the interaction of these two forces on a particle causes the particles to gather at a specific location, which is called inertial concentration.
  • the secondary flow that occurs as the flow of the fluid changes due to the presence of particles, which may appear as a force to push other particles or fluid around the particles, such as microchannels It is known to occur when it is limited and when the inertia of the fluid acts. Particles pushed out by this repulsive force are arranged at specific intervals, which is called inertial alignment.
  • Spiral channels can use Dean flow to amplify the inertial alignment effect. Accordingly, the present invention thus produces an inertial alignment, thereby improving the rate at which one cell and one bead are loaded in one droplet, and also improve the yield in which the droplets are made.
  • Embodiments may be subject to various modifications, and specific embodiments will be illustrated in the drawings and described in detail in the written description. Effects and features of the embodiments, and methods of achieving them will become apparent with reference to the following description in detail in conjunction with the drawings. However, the present embodiments are not limited to the embodiments disclosed below but may be implemented in various forms.
  • the term "include” or “having” means that a feature or component described in the specification is present and does not preclude the possibility of adding one or more other features or components.
  • a microfluidic device for forming droplets for single cell analysis includes a cell inlet 1 including a first channel 11; A bead inlet 2 comprising a second channel 21; An oil phase inlet 3 comprising a third channel 31; An intersection point 4 at which the first channel 11, the second channel 21, and the third channel 31 are combined; And an outlet 5 which is connected to the intersection point 4 and discharges droplets containing cells and beads.
  • the microfluidic device may be configured to cause inertial alignment of cells or beads in the first channel 11 or the second channel 21 as compared with the conventional microfluidic device as shown in FIG. 2. That is, the first channel 11 and / or the second channel 21 may be spiral. As such, by inertia alignment of cells or beads in the first channel 11 and / or the second channel 21, the microfluidic device according to one embodiment carries one cell and one bead in one droplet. Not only can the ratio be improved, but also the output can be increased.
  • the aqueous phase of the first channel 11 and / or the second channel 21 is at least 1.0 ml / h, at least 1.6 ml / h, at least 2.0 ml / h, at least 2.4 ml / h, at least 2.8 ml / h, 3.0 It may have a flow rate of at least ml / h, or at least 3.2 ml / h.
  • the flow rate is 1.0 ml / h to 20 ml / h, 2.0 ml / h to 20 ml / h, 3.0 ml / h to 20 ml / h, 2.0 ml / h to 16 ml / h, 2.0 ml / h to 14 ml / h, 3.0 ml / h to 14 ml / h, or 3.2 ml / h to 14 ml / h.
  • the oil phase of the third channel 31 may have a flow rate of at least 2 ml / h, at least 4 ml / h, at least 6 ml / h, at least 8 ml / h, at least 10 ml / h, or at least 12 ml / h. It may be to have.
  • the feed rate is 2.0 ml / h to 30 ml / h, 4.0 ml / h to 30 ml / h, 6.0 ml / h to 28 ml / h, 6.0 ml / h to 24 ml / h, 8.0 ml / h to 24 ml / h, 10 ml / h to 24 ml / h, or 12 ml / h to 24 ml / h.
  • the cells, beads, and oil phases and droplets are as described above.
  • the cell inlet 1, the bead inlet 2 or the oil phase inlet 3 may each further include a filter 12, 22, 32.
  • the filter may be PDMS posts.
  • the outlet 5 may further include a mixing unit 51 for mixing cells and beads formed in the droplets well.
  • the first channel 11 and the second channel 21 of the microfluidic device may be one of which is spiral or both are spiral.
  • the target cell is introduced into the microfluidic device through the cell inlet 1, and the bead is attached to the oligonucleotide for indexing the RNA of the cell and capturing mRNA through the bead inlet 2.
  • oil is introduced into the microfluidic device through the oil inlet (3). Cells, beads, and oil introduced in this way are met at the intersection point 4 through the first channel 11, the second channel 21, and the third channel 31, respectively. Is formed.
  • the formed droplets are discharged through the mixing unit 51 through the outlet 5, and a process for subsequent sequencing analysis or the like is performed.
  • K562 cells human
  • 293T cells Human
  • NIH / 3T3 cells mouse
  • Cells were cultured in RMPI-1640 medium (including 10% FBS, 2 mM Glutamine, 1% PS) for droplet sequencing, and the cells contained in PBS were used in this experiment.
  • beads for capturing RNA that can be distinguished from individual cells can be obtained from Chemgene's barcode beads (# MACOSKO-2011-10), PCR handles, 12-based cell barcodes, and 8-based unique molecular identifiers. UMI), and a poly T site.
  • the syringe pump was 14,000 ul / hr for oil, 4,100 ul / hr for beads and cells, and the droplets formed were collected in a Falcon tube.
  • the cell suspension, bead suspension and droplet generating oil were injected into the microfluidic device through three inlets using a syringe pump (Lagato 210, KD Scientific, Holliston, Mass., USA).
  • a syringe pump Liagato 210, KD Scientific, Holliston, Mass., USA.
  • the cells and beads were continuously stirred in the syringe by gentle magnetic mixing.
  • cells and beads were co-encapsulated together in droplets of 100 ⁇ m diameter.
  • the microfluidic device according to one embodiment uses the microfluidic device of FIG. 3.
  • the conventional microfluidic device constitutes a channel through which beads move as shown in FIG. 2, and the microfluidic device according to the present invention configures beads by moving a channel as shown in FIG. 3. Observations were made and the results are shown in FIGS. 5A and 5B.
  • Figure 5a is a photograph showing the alignment of particles using a conventional microfluidic device.
  • 5B shows the alignment of particles using a microfluidic device according to one embodiment.
  • the existing microfluidic device can be confirmed that the behavior of the particles are not made smoothly, such as clogged, blocked.
  • the microfluidic device according to the exemplary embodiment may be configured as a spiral channel, so that the behavior of the particles may be smoother than that of the conventional microfluidic device.
  • the cell throughput per hour and the ratio of cells supported in the droplets of the conventional microfluidic device and the microfluidic device according to one embodiment were analyzed according to the concentration of beads. Specifically, the conventional system used bead concentration of 500 beads / ul, 1000 beads / ul and 1500 beads / ul, the system according to one embodiment used a beads concentration of 1500 beads / ul.
  • the cell yield indicates the rate at which one cell and one bead are supported in one drop.
  • Throughput indicates the number of cells supported per unit time. The results are shown in FIGS. 6 and 7.
  • FIG. 6 is a view showing the cell throughput and the cell yield per hour according to the bead concentration of the microfluidic device according to an embodiment compared with the existing system; p represents an existing system, o represents a system according to one embodiment.
  • the conventional system has no choice but to maintain a low concentration because the concentration of beads increases the number of double or multiple cells carrying two or more cells in one droplet.
  • the system according to one embodiment uses an inertial alignment, it is possible to add a high concentration of particles and cells, thereby significantly improving the throughput and significantly increasing the yield of the cells.
  • FIG. 7 is a view showing the ratio of the number of cells supported in the droplets according to the bead concentration of the microfluidic device according to one embodiment compared with the existing system; p is the existing system, o is the system according to one embodiment, 1 is the number of cells supported in the droplet, 2 is the number of cells supported in the droplet, m is the number of cells supported in the droplet Three or more cases are shown.
  • a concentration of beads is added at a concentration of 1500 beads / ul, a ratio of two cells in a droplet is 20% or more, and a ratio of three or more cells in a droplet is supported. It can be seen that about 5%.
  • the system according to one embodiment when the concentration of the beads is 1500 beads / ul, it can be seen that the ratio of supporting two cells in the droplet is about 1% or less.
  • inertia and secondary flow act on the beads and move transversely to a single focal position. Since the drag force from Dean flow guides the beads towards the inner wall, a single focusing position exists near the inner wall.
  • the inertial effect and parabolic flow field arrange the focused beads in the longitudinal direction at equal intervals as shown in FIG. 8A. Higher inertia is imparted by increasing the flow rate, thus improving focusing and ordering. Therefore, the influence of flow velocity on the inertial concentration of the lateral position was investigated. After varying in the range 1.6-3.2 mL, the transverse position of 300 beads from the inner wall at the end of the spiral channel was measured for each flow rate. Bead concentrations were set to 500 beads per ⁇ l under all conditions and the results are shown in FIG. 8B.
  • FIG. 8A illustrates a transverse position in a helical channel according to one embodiment.
  • 8B is a graph showing the distribution of beads along the length of the transverse position in the helical channel according to one embodiment.
  • the fraction distribution at a flow rate of 1.6 mL / h showed a kurtosis of 2.85, and the beads concentrated and kurtosis increased to 3.39 as the flow rate increased to 2.4 mL / h.
  • the lateral position showed a unimodal distribution with a kurtosis of 5.63.
  • the flow rate for droplet generation may be at least 1.6 mL / h or more.
  • the frequency of beads entering the junction was controlled by droplet generation frequency by varying the bead concentration while maintaining a flow rate of 3.2 mL Qw / 2 and 12 mL Qo.
  • the beads are formed at even intervals at low concentrations of finite inertia, but the spacing between two subsequent beads is so large that small droplets without beads can be produced.
  • the bead concentration increases, the average number of each bead increases and the separation distance decreases. In addition, the distance between each bead decreases, thereby increasing the frequency of bead insertion.
  • 9A is an optical microscope image showing droplets collected using a microfluidic device according to one embodiment; Scale bar is 200 um.
  • 9B is a graph showing the fraction (%) of single droplets and multiple droplets collected according to the concentration of beads using the microfluidic device according to one embodiment.
  • Cells and beads were encapsulated simultaneously to assess simultaneous encapsulation performance.
  • the effect of bead concentration was analyzed in detail.
  • Cell yield defined as the fraction of cells encapsulated one-to-one with beads for all cells, was estimated from the images of the collected droplets.
  • Throughput defined as the number of droplets containing one cell and one bead generated over a given time period, was calculated as the product of the fraction of droplets containing one cell and one bead for all droplets and droplet generation frequency and The results are shown in Figure 10a.
  • the results of the encapsulation of a single bead and a single cell in a single droplet in the microfluidic device and the conventional microfluidic device according to one embodiment are shown in Figures 10b and 10c, respectively.
  • Figure 10a is a graph showing the throughput (throughput) and the cell yield (cell yield) according to the concentration of beads in the microfluidic device according to one embodiment.
  • 10B is a graph showing the fraction of single cell and single bead containing droplets according to the concentration of beads in the microfluidic device according to one embodiment.
  • 10C is a graph showing the fraction of single cell and single bead containing droplets according to the concentration of beads in a conventional microfluidic device.
  • 1C + 1B was as high as 95% and the sum of 1C + mB and mC + mB was the full range of the bead concentration. At as low as 2%.
  • a cell suspension of HEK293T and NIH3T3 cells was injected at 250 cells per ⁇ L and a barcode bead suspension was injected into the device at 1000 beads per ⁇ L.
  • droplets were collected for 2.5 minutes from the outlet. Beads collected from the droplets were subjected to reverse transcription, amplification, library preparation and sequencing.
  • nucleotide ratios of the cell and molecular indices of Read 1 were calculated. Based on the cumulative proportions of the UMI curves in the sequence data set, 2165 cells (more than 686 UMI per cell) and 1719 cells (more than 702 UMI per cell) were collected from the microfluidic device according to one embodiment. . 229 and 282 of these, respectively, were discarded as low quality cells. Thereafter, density plot analysis was performed for UMI per cell, and the results are shown in FIG. 11.
  • FIG. 11A is a graph showing the density plot of UMI per cell in a mixture of human and mouse cells in a conventional microfluidic device (Unodered) and a microfluidic device (Ordered) according to one embodiment.
  • FIG. 11B is a graph showing density plots of UMI per cell in human cells alone in a conventional microfluidic device (Unodered) and a microfluidic device (Ordered) according to one embodiment.
  • FIG. 11C is a graph showing the density plot of UMI per cell in human cells alone in a conventional microfluidic device (Unodered) and microfluidic device (Ordered) according to one embodiment.
  • the number of UMIs in the highest peak of the microfluidic device was 2179 and the number in the conventional microfluidic device was less than half as 866, Similar behavior was observed in human and mouse cells alone.
  • the number of transcripts is cut in half because the mRNA fragment was split into two for capture by two barcoded beads.
  • the number of cells doubles as the two barcoded beads are sequenced separately. 11 shows that the bead doublet generated by the encapsulation in the conventional microfluidic device reduces the number of transcripts and the number of cells, thereby significantly reducing the quality of single cell sequencing data. Indicates.
  • microfluidic device enables high throughput bar coding while minimizing bar coding errors.
  • the existing system is more likely to enter into two or more when the concentration of cells and beads increases, and the concentration of cells and beads when the concentration of cells and beads decreases, so that the cells and beads are less likely to form droplets.
  • the system according to one embodiment can simultaneously enhance two conflicting parameters as described above by inertia aligning cells or beads to form droplets, There is an effect that can minimize coding errors.

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Abstract

단일세포 분석을 위한 액적 내 세포 담지 방법 및 장치, 또는 단일 세포 분석을 위한 액적 형성 방법 및 장치에 관한 것으로, 일 양상에 따른 방법 및 장치에 의하면, 관성 정렬 효과를 이용함으로써, 하나의 액적에 하나의 세포가 담지되는 비율이 증가할 뿐만 아니라, 액적이 만들어지는 수율도 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

단일세포 분석을 위한 액적 내 세포 담지 방법 및 장치
단일세포 분석을 위한 액적 내 세포 담지 방법 및 장치, 또는 단일 세포 분석을 위한 액적 형성 방법 및 장치에 관한 것에 관한 것이다.
미세유체를 이용한 세포 분석은 특히 단일세포 수준의 유전체 분석에 활용할 수 있다. 암에 있어서 단일세포 수준에서 발생하는 유전적 heterogeneity는 암의 정밀 진단, 예후 예측을 위해 중요한 단서가 되므로 단일 세포 분석의 중요성이 매우 증대되고 있다. 암뿐만 아니라 IPS, 줄기세포로 만들어진 세포의 확인, 세포체의 subtype 분석 등 많은 연구에 응용될 수 있다.
이러한 단일 세포 분석을 하기 위해서 실험 전단에 단일세포 단위로 세포를 분리(isolation) 및 분획(compartmentalization)하여 개별 세포들을 독립적으로 반응 시키는 단계가 수행된다. 단일 세포 분리 및 분획 기술은 크게 밸브(valve) 및 마이크로웰(micro-well)을 이용해 하나의 세포를 하나의 웰 에 넣는 방식과 에멀젼(emulsion)을 이용해 하나의 세포를 하나의 액적(water droplet in oil)에 넣는 방식이 있다. 에멀젼 방식은 세포 및 입자를 액적 에 담지(encapsulation)가 가능하게 하여 단일 세포의 유전체 분석을 빠르고, 정확하고 효율적으로 할 수 있는 장점이 있다. 특히 도 1에 나타낸 바와 같이, 단일세포 전사체 염기서열분석 (Single cell RNA sequencing)은 단일세포를 용해하여 RNA를 추출하고 역전사(Reverse transcription)을 통해 cDNA를 만들고 이를 증폭(amplification) 한 후 표준화된 시퀀싱 제조 과정을 거쳐 염기서열이 분석된다. 단일세포를 한 개씩 진행하면 많은 시간과 노동, 비용이 발생하기 때문에 단일세포 유래 RNA를 단일 바코드(barcode)로 인덱싱(indexing)하여 역전사 또는 증폭 단계에서 풀링(Pooling)하여 후속 스텝을 진행하는 방법이 최근 이용되고 있다.
이러한 단일 세포 분석의 미세유체 장치에서 세포와 입자가 만나 담지 되는 것은 연속적으로 발생한다. 이때 세포와 입자는 랜덤 분포(random distribution) 상태로 장치에 들어가고 담지 현상 역시 세포와 비드의 분포에 영향을 받는다. 세포 사이 거리(Inter-cell distance) 또는 입자 사이 거리(inter-particle distance)가 너무 좁으면 두 개 이상 뭉쳐서 들어갈 확률이 높아진다. 또한, 세포와 비드의 농도가 낮아지면, 세포와 비드가 액적을 형성하는 경우가 작아져서 액적이 만들어지는 효율(수율, throughput)이 낮아지게 된다. 따라서, 이러한 두 개의 상충되는 파라미터의 효율을 모두 증가시키기 위한 기술에 대한 요구가 존재한다.
본 발명은 드롭렛 시퀀싱을 위한 단일 세포 분석에 있어서, 상기에서 언급된 두 개의 상충되는 파라미터를 모두 향상시키기 위한 액적 내 세포 담지 방법 및 장치를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 단일 세포 분석을 위한 액적을 형성하는 방법으로서, 세포를 제공하는 단계; 하나 이상의 구분되게 바코딩된 RNA 포획 비드를 제공하는 단계; 상기 세포 중의 단일 세포와 하나의 구분되게 바코딩된 RNA 포획 비드를 하나의 액적에 담지하는 단계를 포함하고, 상기 세포, 또는 비드를 제공하는 단계는 상기 세포 또는 비드가 상기 액적에 담지되기 전에 관성 정렬을 통해 제공되는 것인 방법을 제공한다.
상기 관성 정렬은 상기 세포 또는 비드가 제공되는 미세유체 장치의 나선형 채널을 통해 나타나는 것일 수 있다.
또한, 상기 방법은 하나 이상의 오일(캐리어 오일)을 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 관성 정렬은 하나의 액적 내에 하나의 세포 및 하나의 비드가 담지되는 비율을 향상시키는 것일 수 있다.
또한, 상기 세포를 제공하거나, 비드를 제공하는 단계는 적어도 1.0 ml/h 이상의 유속으로 제공되는 것일 수 있다.
또한, 상기 캐리어 오일을 제공하는 단계는 적어도 2 ml/h 이상의 유속으로 제공되는 것일 수 있다.
또한, 상기 비드는 세포 용해액 중 또는 세포 용해액과 함께 제공되는 것일 수 있다.
또한, 상기 비드는 복수의 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드가 비드의 표면에 분자적 바코딩된 것일 수 있다.
또한, 상기 복수의 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 세포 내의 mRNA의 포획을 위한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 복수의 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 서열은 올리고-dT 서열 또는 프라이머 서열을 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은 단일 세포 분석을 위한 액적을 형성하는 미세유체 장치로서, 제1 채널을 포함하는 세포 입구; 제2 채널을 포함하는 RNA 포획 비드 입구; 제3 채널을 포함하는 오일 상 입구; 상기 제1 채널, 제2 채널, 및 제3 채널이 합쳐지는 교차점; 및 상기 교차점과 연결되고, 세포 및 RNA 포획 비드를 포함하는 액적을 토출하는 출구를 포함하고, 상기 제1 채널 또는 제2 채널은 유체 내의 세포 또는 RNA 포획 비드가 관성 정렬을 일으키도록 구성된 것인 미세유체 장치를 제공한다.
또한, 상기 제1 채널 및/또는 제2 채널은 나선형인 것일 수 있다.
또한, 상기 세포 입구, RNA 포획 비드 입구 또는 오일 상 입구는 필터를 더 포함하는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 액적 내 세포 담지 방법 및 장치, 또는 단일 세포 분석을 위한 액적 형성 방법 및 장치에 의하면, 관성 정렬 효과를 이용함으로써, 하나의 액적에 하나의 세포가 담지되는 비율이 증가할 뿐만 아니라, 액적이 만들어지는 수율도 향상시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1은 드롭렛 시퀀싱의 원리를 나타낸 도면이다.
도 2는 종래 기술의 액적 형성 미세유체 장치를 나타낸 도면이다.
도 3은 관성 정렬을 비드 입구에 일으키는 일 구체예에 따른 액적 형성 미세유체 장치를 나타낸 도면이다.
도 4는 관정 성렬을 비드 및 세포 입구에 모두 일으키는 일 구체예에 따른 액적 형성 미세유체 장치를 나타낸 도면이다.
도 5a는 종래의 미세유체 장치를 이용한 입자의 정렬을 나타낸 사진이다.
도 5b는 일 구체예에 따른 미세유체 장치를 이용한 입자의 정렬을 나타낸 사진이다.
도 6은 일 구체예에 따른 미세유체 장치의 비드 농도에 따른 시간당 세포 처리량 및 세포 수율을 기존의 시스템과 비교하여 나타낸 도면이다; p는 기존 시스템, o는 일 구체예에 따른 시스템을 나타낸다.
도 7은 일 구체예에 따른 미세유체 장치의 비드 농도에 따른 액적 내 담지되는 세포의 수의 비율을 기존의 시스템과 비교하여 나타낸 도면이다; p는 기존 시스템, o는 일 구체예에 따른 시스템이고, 1은 액적 내 담지되는 세포의 수가 한 개인 경우, 2는 액적 내 담지되는 세포의 수가 두 개인 경우, m은 액적 내 담지되는 세포의 수가 세 개 이상인 경우를 나타낸다.
도 8a는 일 구체예에 따른 나선형 채널에서의 횡 방향 위치를 나타낸 도면이다.
도 8b는 일 구체예에 따른 나선형 채널에서 횡 방향 위치의 길이에 따른 비드의 분포를 나타낸 그래프이다.
도 9a는 일 구체예에 따른 미세유체 장치를 이용하여 수집된 액적을 나타낸 광학 현미경 이미지이다; 스케일바는 200 um이다.
도 9b는 일 구체예에 따른 미세유체 장치를 이용하여 비드의 농도에 따라 수집된 단일 비드 함유 액적 및 복수 비드 함유 액적 의 분율(%)를 나타낸 그래프이다.
도 10a는 일구체예에 따른 미세유체 장치에서 비드의 농도에 따른 처리량(throughput) 및 세포 수율(cell yield)를 나타낸 그래프이다.
도 10b는 일구체예에 따른 미세유체 장치에서 비드의 농도에 따른 단일 세포 및 단일 비드 함유 액적의 분율을 나타낸 그래프이다.
도 10c는 기존의 미세유체 장치에서 비드의 농도에 따른 단일 세포 및 단일 비드 함유 액적의 분율을 나타낸 그래프이다.
도 11a는 기존의 미세유체 장치(Unodered) 및 일 구체예에 따른 미세유체 장치(Ordered)에서 인간 및 마우스 세포의 혼합에서의 세포당 UMI를 밀도 플랏으로 나타낸 그래프이다.
도 11b는 기존의 미세유체 장치(Unodered) 및 일 구체예에 따른 미세유체 장치(Ordered)에서 인간 세포 단독에서의 세포당 UMI를 밀도 플랏으로 나타낸 그래프이다.
도 11c는 기존의 미세유체 장치(Unodered) 및 일 구체예에 따른 미세유체 장치(Ordered)에서 마우스 세포 단독에서의 세포당 UMI를 밀도 플랏으로 나타낸 그래프이다.
일 양상은 단일 세포 분석을 위한 액적을 형성하는 방법으로서, 세포를 제공하는 단계; 하나 이상의 구분되게 바코딩된 RNA 포획 비드를 제공하는 단계; 상기 세포 중의 단일 세포와 하나의 구분되게 바코딩된 RNA 포획 비드를 하나의 액적에 담지하는 단계를 포함하고, 상기 세포, 또는 비드를 제공하는 단계는 상기 세포 또는 비드가 상기 액적에 담지되기 전에 관성 정렬을 통해 제공되는 것인 방법을 제공한다.
본 명세서에서 "액적(droplet)"은 전형적으로 구형 형상을 갖는 작은 체적의 액체로서 에멀션의 연속 상과 같은 비혼화성 유체에 의하여 둘러싸여 있다. 이 중 "미세액적"은 액적의 체적이 약 1 마이크로리터 이하, 약 1 마이크로리터와 1 나노리터 사이, 또는 약 1 마이크로리터와 1 피코리터 사이의 값을 가질 수 있다. 택일적으로, 미세액적은 약 200 마이크로미터 미만의 직경을 갖는 분산 상(dispersed phase)을 의미할 수도 있다.
본 명세서에서 "캐리어 유체"는 "캐리오 오일"과 상호호환적으로 사용되고 물(또는 수용액)과 비혼화성인 임의의 액체 화합물 또는 이의 혼합물일 수 있다.
본 명세서에서 "샘플"은 검출하고자 하는 검체를 함유할 수 있는 한, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예시적으로, 샘플은 생물학적 샘플, 예를 들면 생물학적 유체(fluid) 또는 생물학적 조직일 수 있다. 생물학적 유체의 예로서, 뇨, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 가래, 뇌척수액, 눈물, 점액, 양수 등을 들 수 있다. 생물학적 조직은 세포의 집합으로서, 대체적으로 인간, 동물, 식물, 세균, 진균 또는 바이러스 구조물의 구조적 물질의 하나를 형성하는 세포 내 물질들과 특정 종류의 집합으로서 연결 조직, 상피 조직, 근육 조직 및 신경 조직 등이 이에 해당될 수 있다. 또한, 생물학적 조직의 예에는 장기, 종양, 림프절, 동맥 및 개별적인 세포(들)도 포함될 수 있다.
본 명세서에서 "반응시약(reagent)"은 샘플에 대한 특정 테스트를 수행하기 위하여 샘플과 결합되는 화합물 또는 이들의 세트, 및/또는 조성을 의미할 수 있다. 예시적으로, 반응시약은 증폭용 시약일 수 있는데, 구체적으로 타겟 핵산의 증폭용 프라이머, 증폭 생성물의 검출을 위한 프로브 및/또는 염료, 폴리머라아제, 뉴클레오티드(구체적으로, dNTP), 마그네슘 이온, 염화칼륨, 버퍼 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 상기 반응 시약은 구분되게 바코딩된 입자(예를 들면, 비드)를 포함할 수 있다. 상기 비드는 복수의 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드가 비드의 표면에 분자적 바코딩된 것일 수 있다. 또한, 상기 복수의 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 세포 내의 mRNA의 포획을 위한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 복수의 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 서열은 올리고-dT 서열 또는 프라이머 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 비드는 세포 용해액 중 또는 세포 용해액과 함께 제공되는 것일 수 있다.
본 명세서에서 "증폭(amplification)"은 주형 분자의 적어도 하나의 세그먼트의 복수개 복제물을 형성하기 위하여 반복적으로 일어나는 반응을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 "PCR"은 사이클 프로세스(가열 및 냉각이 교대로 이루어짐)에 의하여 하나의 최초 주형으로부터 다량의 동일한 DNA 스트랜드가 형성되는 반응을 의미하는 바, (i) 증폭하고자 하는 염기서열을 갖는 주형인 이중나선형 DNA 분자, (ii) 프라이머(주형 DNA 내 상보적 DNA 염기서열과 결합할 수 있는 단일 스트랜드 DNA 분자), (iii) dATP, dTTP, dGTP, 및 dCTP의 혼합물(PCR 증폭 과정에서 새로운 DNA 분자를 형성하도록 합쳐지는 뉴클레오티드 서브유닛)인 dNTP, 및 (iv) Taq DNA 폴리머라아제(dNTP를 사용하여 새로운 DNA 분자를 합성하는 효소)로 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 "상보적"이라는 용어는 뉴클레오티드 또는 핵산 사이의 염기쌍을 혼성화할 수 있는 것을 의미하며, 통상 A와 T(또는 U), 또는 C와 G이다.
본 명세서에서 "채널"은 유체가 이동하는 통로를 의미하며, 예를 들면 튜브(예를 들면, 모세관), 평면 구조 내 또는 그 위(예를 들면, 칩) 또는 이의 조합에 의하여 형성될 수 있다. 본 명세서에서 채널은 평면 흐름 경로를 따라 연장되는 채널(예를 들면, 꾸불꾸불하거나 스파이럴(spiral) 평면 패턴의 채널) 또는 비평면 흐름 경로(예를 들면, 나선형의(helical) 3차원적 채널)일 수 있다. 즉, 상기 관성 정렬은 상기 세포 또는 비드가 제공되는 미세유체 장치의 나선형 채널을 통해 나타나는 것일 수 있다. 상기 채널은 나선형이 적어도 2 루프 이상, 3 루프 이상, 5 루프 이상, 예를 들면, 2 루프 내지 20 루프, 5 내지 15루프일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 미세유체채널 내에서 유체의 유동은 포이쉴리 흐름(poiseuille flow)의 양상을 보이는데 이 안에 미세 입자가 있을 경우 전단 구배 양력(shear gradient lift force)과 채널 벽면에서 발생하는 wall effect force를 받게 된다. 입자에 가해지는 이 두 힘의 상호 작용으로 입자는 특정한 위치로 모이게 되는데 이를 관성 집중이라 한다. 이때 입자가 집중점으로 이동하는 것 외에, 입자가 존재함으로써 유체의 흐름이 변화되면서 형성되는 이차적 흐름이 발생하고 이는 입자 주변에서 다른 입자나 유체를 밀어내는 힘으로 나타날 수 있는데 미세채널과 같이 공간이 제한되어 있을 때와 유체의 관성이 작용할 때 발생하는 것으로 알려져 있다. 이러한 척력에 의해 밀려난 입자는 특정 간격으로 정렬되는 양상을 보이는데 이를 관성 정렬이라 한다. 나선형 채널은 딘 흐름(Dean flow)를 이용해 관성 정렬 효과를 증폭할 수 있다. 따라서, 이와 같이 본 발명은 관성 정렬을 일으킴으로써, 하나의 액적 내에 하나의 세포 및 하나의 비드가 담지되는 비율을 향상시키면서, 액적이 만들어지는 수율도 향상시킬 수 있다.
실시예들은 다양한 변환을 가할 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 실시예들의 효과 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 내용들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 실시예들은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 다양한 형태로 구현될 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세히 설명하기로 하며, 도면을 참조하여 설명할 때 동일하거나 대응하는 구성 요소는 동일한 도면부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.
이하의 실시예에서 제1, 제2 등의 용어는 한정적인 의미가 아니라 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하는 목적으로 사용되었다.
이하의 실시예에서 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
이하의 실시예에서 포함하다 또는 가지다 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 또는 구성요소가 존재함을 의미하는 것이고, 하나 이상의 다른 특징들 또는 구성요소가 부가될 가능성을 미리 배제하는 것은 아니다.
도면에서는 설명의 편의를 위하여 구성 요소들이 그 크기가 과장 또는 축소될 수 있다. 예컨대, 도면에서 나타난 각 구성의 크기 및 두께는 설명의 편의를 위해 임의로 나타내었으므로, 이하의 실시예는 반드시 도시된 바에 한정되지 않는다.
도 3을 참조하여 일 구체예에 따른 단일 세포 분석을 위한 액적을 형성하는 미세유체 장치를 설명하면, 상기 장치는 제1 채널(11)을 포함하는 세포 입구(1); 제2 채널(21)을 포함하는 비드 입구(2); 제3 채널(31)을 포함하는 오일 상 입구(3); 상기 제1 채널(11), 제2 채널(21), 및 제3 채널(31)이 합쳐지는 교차점(4); 및 상기 교차점(4)과 연결되고, 세포 및 비드를 포함하는 액적을 토출하는 출구(5)를 포함한다.
상기 미세유체 장치는 도 2에 나타낸 바와 같은 종래의 미세유체 장치와 비교하여, 제1 채널(11) 또는 제2 채널(21) 내의 세포 또는 비드가 관성 정렬을 일으키도록 구성된 것일 수 있다. 즉, 상기 제1 채널(11) 및/또는 제2 채널(21)은 나선형일 수 있다. 이와 같이 제1 채널(11) 및/또는 제2 채널(21) 내의 세포 또는 비드에 관성 정렬을 일으킴으로써, 일 구체예에 따른 미세유체 장치는 하나의 액적 내에 하나의 세포 및 하나의 비드가 담지되는 비율을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 산출량도 증가시킬 수 있는 효과가 있다.
제1 채널(11) 및/또는 제2 채널(21)의 수성 상은 적어도 1.0 ml/h 이상, 1.6 ml/h 이상, 2.0 ml/h 이상, 2.4 ml/h 이상, 2.8 ml/h 이상, 3.0 ml/h 이상, 또는 3.2 ml/h이상의 유속을 갖는 것일 수 있다. 더욱 상세하게는 상기 유속은 1.0 ml/h 내지 20 ml/h, 2.0 ml/h 내지 20 ml/h, 3.0 ml/h 내지 20 ml/h, 2.0 ml/h 내지 16 ml/h, 2.0 ml/h 내지 14 ml/h, 3.0 ml/h 내지 14 ml/h, 또는 3.2 ml/h 내지 14 ml/h일 수 있다.
또한, 상기 제3 채널(31)의 오일 상은 적어도 2 ml/h 이상, 4 ml/h 이상, 6 ml/h 이상, 8 ml/h 이상, 10 ml/h 이상, 또는 12 ml/h 이상의 유속을 갖는 것일 수 있다. 더욱 상세하게는 사익 유속은 2.0 ml/h 내지 30 ml/h, 4.0 ml/h 내지 30 ml/h, 6.0 ml/h 내지 28 ml/h, 6.0 ml/h 내지 24 ml/h, 8.0 ml/h 내지 24 ml/h, 10 ml/h 내지 24 ml/h, 또는 12 ml/h 내지 24 ml/h일 수 있다.
상기 세포, 비드, 및 오일 상 및 액적에 대해서는 상기한 바와 같다.
또한, 상기 세포 입구(1), 비드 입구(2) 또는 오일 상 입구(3)는 각각 필터(12, 22, 32)를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 필터는 PDMS 포스트(square PDMS posts)일 수 있다.
또한, 상기 출구(5)는 액적 내에 형성된 세포와 비드를 잘 혼합해주기 위한 혼합 유닛(51)을 더 포함할 수 있다.
도 4를 참조하여 설명하면, 일 구체예에 따른 미세 유체 장치의 제1 채널(11)과 제2 채널(21)은 둘 중 하나가 나선형이거나, 아니면 둘 모두 나선형인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 세포 입구(1)를 통해 타겟하는 세포가 미세유체 장치 내로 유입되고, 비드 입구(2)를 통해 상기 세포의 RNA를 인덱싱하고, mRNA를 포획하기 위한 올리고뉴클레오티드가 부착된 비드가 미세유체 장치 내로 유입된다. 또한, 오일이 오일 입구(3)를 통해 미세유체 장치 내로 유입된다. 이렇게 각각 유입된 세포, 비드 및 오일은 각각 제1 채널(11), 제2 채널(21) 및 제3 채널(31)을 거쳐 교차점(4)에서 만나게 되고, 상기 교차점(4) 부근에서 액적이 형성된다. 형성된 액적은 혼합 유닛(51)을 거쳐 출구(5)를 통해 토출되고, 이후의 시퀀싱 분석 등을 위한 과정이 수행된다.
실시예. 나선형 채널을 이용한 관성 정렬 및 그의 효과 분석
도 2에 나타낸 바와 같은 기존의 미세유체 장치와, 도 3에 나타낸 바와 같은 일 구체예에 따른 미세유체 장치의 효과를 비교 분석하였다.
구체적으로 세포로서는 K562세포(human), 293T 세포(Human), 및 NIH/3T3 세포(mouse)를 사용하였다. 드롭렛 시퀀싱을 위해 세포를 RMPI-1640배지(10% FBS, 2mM Glutamine, 1% PS 포함)에서 배양하고, PBS 중 포함된 상기 세포를 본 실험에서 사용하였다. 또한, 개별 세포를 구분할 수 있게 바코딩된 RNA 포획용 위한 비드는 Chemgene社의 바코드 비드(#MACOSKO-2011-10), PCR 핸들(handle), 12-based 세포 바코드, 8-based unique molecular identifier(UMI), 및 폴리 T site를 사용하였다. 이들을 에탄올과 TE/TW 버퍼 (10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.01% Tween)로 세척한 후 세포 용해액에 재현탁하고 100 μm filter (BD Falcon # 352360)에 통과 후 실험에 사용하였다. 드롭렛 시퀀싱을 위해 500, 1000, 및 1500 beads/ul 농도의 비드를 사용하였다. 세포 용해액으로는 200mM Tris pH 7.5, 20mM EDTA, 6% Ficoll PM400, 0.2% Sarcosyl, 50mM DTT 혼합액을 사용하였고, 상기 비드를 세포 용해액에 포함시켰다. 오일 상으로는 Droplet Generation Oil(Biorad #186-4006) 을 사용하였다. 시린지 펌프는 오일에 대해서는 14,000 ul/hr이었고, 비드 및 세포에 대해서는 4,100 ul/hr이었고, 형성된 액적을 팔콘 튜브에 수집하였다. 구체적으로 세포 현탁액, 비드 현탁액 및 액적 생성 오일을 주사기 펌프 (Lagato 210, KD Scientific, Holliston, MA, USA)를 사용하여 3 개의 주입구를 통해 미세 유체 장치에 주입 하였다. 주사하는 동안, 세포 및 비드는 부드러운 자기 혼합에 의해 주사기 내에서 연속적으로 교반되었다. 미세유체 장치에서 세포와 비드는 100μm 직경의 액적에 함께 캡슐화(co-encapsulated)되었다. 유동 조건을 최적화하기 위해 광학 현미경 (Ti-U, Nikon, Tokyo)이 장착된 고속 카메라 (Phantom V7.3, Vision Research, Wayne, NJ, 미국)를 사용하여 나선형 마이크로 채널 및 채널 접합부에서 연속적인 이미지를 포착하였다. ImageJ 소프트웨어 (NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 관성 정렬, 비드-주입 프리퀀시(bead-entering frequency) 및 액적 생성 모드를 유속을 변화시키면서 특정하였다. 이미지는 일반적으로 초당 5000 - 10,000 프레임으로 수집되었다. 생성된 액적을 튜브에 모으고 디시에 적재하였다. 광학 현미경 (Ti-U, Nikon) 및 형광 현미경 (X81, Olympus, Tokyo, Japan)하에 액적의 알리쿼트(aliqouts)를 관찰함으로써 액적 내의 세포 및 비드의 점유를 평가 하였다.
(1) 나선형 채널을 이용한 관성 정렬
기존의 미세유체 장치인 도 2 및 일 구체예에 따른 미세유체 장치인 도 3의 채널에서 입자(비드)의 정렬 효과를 비교하였다. 이하에의 실험에서 일 구체예에 따른 미세유체 장치는 도 3의 미세유체 장치를 사용한 것이다. 상세하게는 기존의 미세유체 장치는 도 2에 나타낸 바와 같이 비드가 이동하는 채널을 구성하였고, 본 발명에 따른 미세유체 장치는 도 3에 나타낸 바와 같이 비드가 이동하는 채널을 구성하여 비드의 정렬을 관찰하였고, 그 결과를 도 5a 및 도 5b에 나타내었다.
도 5a는 기존의 미세유체 장치를 이용한 입자의 정렬을 나타낸 사진이다.
도 5b는 일 구체예에 따른 미세유체 장치를 이용한 입자의 정렬을 나타낸 것이다.
도 5a에 나타낸 바와 같이, 기존의 미세유체 장치는 입자의 거동이 뭉쳐있거나, 막혀있거나 하는 등 원할하게 이루어지지 않는 것을 확인할 수 있다. 이에 반해, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 미세유체 장치는 나선형 채널로 구성함으로써, 입자의 거동이 기존의 미세유체 장치에 비해 원할하게 이루어지는 것을 확인할 수 있다.
(2) 나선형 채널을 이용한 담지되는 세포의 비율 및 시간당 세포 처리량 분석
상기한 바와 같은 기존의 미세유체 장치와 일 구체예에 따른 미세유체장치의 시간당 세포 처리량(Throughput) 및 액적에 담지되는 세포의 비율을 비드의 농도에 따라 분석하였다. 구체적으로 기존의 시스템은 500 beads/ul, 1000 beads/ul 및 1500 beads/ul의 비드 농도를 사용하였고, 일 구체예에 따른 시스템은 1500 beads/ul의 비드 농도를 사용하였다. 세포 수율은 하나의 액적에 하나의 세포 및 하나의 비드가 담지되는 비율을 나타낸다, Throughput은 단위시간당 담지된 세포의 수를 나타낸다. 상기의 결과는 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6은 일 구체예에 따른 미세유체 장치의 비드 농도에 따른 시간당 세포 처리량 및 세포 수율을 기존의 시스템과 비교하여 나타낸 도면이다; p는 기존 시스템, o는 일 구체예에 따른 시스템을 나타낸다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 기존의 시스템은 비드의 농도가 증가할수록 하나의 액적에 두 개 이상의 세포가 담지되는 이중 또는 다중 세포가 많아지기 때문에 저농도를 유지할 수밖에 없음을 알 수 있다. 이에 반해, 일 구체예에 따른 시스템은 관성 정렬을 이용하므로, 고농도의 입자 및 세포를 투입할 수 있어 throughput을 대폭 향상시킬 수 있고, 세포의 수율도 현저히 높아질 수 있음을 알 수 있다.
도 7은 일 구체예에 따른 미세유체 장치의 비드 농도에 따른 액적 내 담지되는 세포의 수의 비율을 기존의 시스템과 비교하여 나타낸 도면이다; p는 기존 시스템, o는 일 구체예에 따른 시스템이고, 1은 액적 내 담지되는 세포의 수가 한 개인 경우, 2는 액적 내 담지되는 세포의 수가 두 개인 경우, m은 액적 내 담지되는 세포의 수가 세 개 이상인 경우를 나타낸다.
도 7에 나타낸 바와 같이 기존의 시스템은 비드의 농도를 1500 beads/ul의 농도로 투입했을 때, 액적 내 두 개의 세포가 담지되는 비율이 20% 이상이고, 액적 내 세 개 이상의 세포가 담지되는 비율도 약 5%임을 알 수 있다. 이에 반해, 일 구체예에 따른 시스템은 비드의 농도가 1500 beads/ul일 때, 액적 내 두 개의 세포가 담지되는 비율이 약 1% 이하임을 알 수 있다.
(3) 액적 생성을 위한 유동 속도의 최적화
정확하고 고효율의 드롭렛 시퀀싱의 경우 높은 주파수의 액적 생성과 비드의 캡슐화가 전제 조건이고, 캡슐화는 비드 입구와 액적 생성의 동기화에 의해 달성된다. 액적 생성을 위한 유동 속도의 최적화를 위해, 2 개의 수성 상(aqueous phase) Qw 을 변화시켰다. 셀 및 비드는 수성 상에 포함되지 않았고, 수성 상의 유속은 Qw /2로 설정되었다. 캐리어 오일의 유량 Qo는 12 ml/h로 설정하였다.
비드는 충분한 유속으로 나선형 채널을 통과할 때 관성과 2차 유동이 비드에 작용하여 단일 초점 위치로 횡 방향으로 이동한다. 딘 플로우 (Dean flow)에서 유래하는 항력(drag force)이 비드를 내부벽(inner wall)을 향하여 가이드하기 때문에 단일 포커싱 위치는 내부벽 근처에 존재한다. 또한, 관성 효과와 포물선 유동 필드(parabolic flow field)는 도 8a와 같이 초점이 맞춰진 비드를 균일한 간격으로 길이 방향으로 배열한다. 더 높은 관성은 유속을 증가시킴으로써 부여되고, 따라서 포커싱 및 순서를 향상시킬 수 있다. 이에, 유속이 횡 방향 위치(lateral position)의 관성 집중에 미치는 영향을 조사하였다. 1.6 - 3.2 mL의 범위에서 변화시킨 후, 나선 채널의 끝에서 내벽으로부터 300 개의 비드의 횡 방향 위치가 각 유속에 대해 측정되었다. 비드 농도는 모든 조건에서 μl 당 500 개의 비드로 설정되었고, 그 결과를 도 8b에 나타내었다.
도 8a는 일 구체예에 따른 나선형 채널에서의 횡 방향 위치를 나타낸 도면이다.
도 8b는 일 구체예에 따른 나선형 채널에서 횡 방향 위치의 길이에 따른 비드의 분포를 나타낸 그래프이다.
도 8b에 나타낸 바와 같이, 1.6 mL/h의 유속에서 분율 분포는 2.85의 첨도를 보였고, 유속이 2.4 mL/h로 증가함에 따라 비드가 집중되고 첨도가 3.39로 증가했다. 3.2 mL/h의 유속에서는 측 방향 위치는 5.63의 첨도를 갖는 단봉 분포를 보였다.　이상의 결과로 액적 생성을 위한 유동 속도는 적어도 1.6 mL/h 이상일 수 있음을 알 수 있었다.
(4) 비드 진입의 동기화
단일 비드를 함유하는 액적의 비율을 향상시키기 위해, Qw/2가 3.2 mL 및 Qo가 12 mL 인 유속을 유지하면서 비드 농도를 변화시킴으로써 접합부에 진입하는 비드의 빈도를 액적 생성 빈도로 조절했다. 비드는 유한 관성 상태의 저농도에서 균일한 간격으로 형성되지만, 두 개의 후속 비드 사이의 간격은 매우 커서 비드가 없는 작은 액적이 생성될 수 있다. 비드 농도가 증가함에 따라, 각 비드의 평균 수가 증가하고 이격 거리가 감소한다. 또한 각 비드 간 거리가 감소하여 비드 삽입 빈도가 증가한다. 따라서, 매우 높은 농도의 비드에서 비드 진입 주파수가 액적-생성 주파수(frequency)를 초과하면, 복수의 비드를 함유하는 액적을 생성하여 셀 인덱싱에서 간헐적인 에러를 일으킨다. 즉 복수의 비드로 캡슐화된 세포는 단일 세포의 mRNA가 여러 개의 비드에 분배됨에 따라 간헐적인 오류를 일으킨다. 그러므로, 단일 비드(1B)를 함유하는 액적의 비율을 최대화하고 복수의 비드 (mB)를 함유하는 액적의 분율을 최소화하고자 하였다. 이를 위해, μL 당 100 - 1250 비드의 범위에서 비드 농도를 변화 시켰고 1B 및 mB는 출구에서 수집된 액적으로부터 측정되었고, 그 결과를 도 9b에 나타내었다. 수집된 액적의 예를 도 9a에 나타내었다.
도 9a는 일 구체예에 따른 미세유체 장치를 이용하여 수집된 액적을 나타낸 광학 현미경 이미지이다; 스케일바는 200 um이다.
도 9b는 일 구체예에 따른 미세유체 장치를 이용하여 비드의 농도에 따라 수집된 단일 액적 및 복수 액적의 분율(%)를 나타낸 그래프이다.
도 9b에 나타낸 바와 같이, 1B는 농도가 증가함에 따라 3 %에서 28 %로 증가하였으나, mB는 모든 농도에서 0.5 % 이하로 유지되었다. mB의 작은 값은 비드가 농도 범위에 대해 잘 정렬되었고 비드 진입 주파수가 μL 당 1250 비드의 고농축에서도 드롭 생성 주파수를 초과하지 않았다는 것을 나타낸다.
(5) 세포와 비드의 동시 캡슐화 평가
동시 캡슐화 성능을 평가하기 위해 세포와 비드를 동시에 캡슐화하였다. 세포를 캡슐화하는 동안, 비드 농도의 영향을 상세히 분석하였다. 모든 세포에 대해 비드와 일대일로 캡슐화된 세포의 분획으로 정의되는 세포 수율은 수집된 액적의 이미지로부터 추정되었다. 주어진 기간 동안 생성된 하나의 세포 및 하나의 비드를 함유하는 액적의 수로서 정의되는 처리량은 모든 액적 및 액적 생성 주파수에 대해 하나의 세포 및 하나의 비드를 함유하는 액적의 분율의 곱으로서 계산되었고 그 결과를 도 10a에 나타내었다. 또한, 일 구체예에 따른 미세유체장치와 기존의 미세유체 장치에서의 단일 액적 내 단일 비드 및 단일 세포의 캡슐화의 결과를 각각 도 10b 및 10c에 나타내었다.
도 10a는 일구체예에 따른 미세유체 장치에서 비드의 농도에 따른 처리량(throughput) 및 세포 수율(cell yield)를 나타낸 그래프이다.
도 10b는 일구체예에 따른 미세유체 장치에서 비드의 농도에 따른 단일 세포 및 단일 비드 함유 액적의 분율을 나타낸 그래프이다.
도 10c는 기존의 미세유체 장치에서 비드의 농도에 따른 단일 세포 및 단일 비드 함유 액적의 분율을 나타낸 그래프이다.
도 10 a에 나타낸 바와 같이, 처리량과 세포 수율은 비드의 농도와 함께 증가하였음을 확일할 수 있다. 1 μL 당 1000 비드의 농도에서 처리량과 세포 수율은 min 당 2700 세포 및 20 %이며, 이는 1 μL 당 100 비드의 농도에서 min 당 300 세포 및 3%보다 현저히 높은 수치이다. 이것은 기존의 장치보다 높은 20%의 주입 세포를 비드로 공동 캡슐화 할 수 있음을 의미한다. 이러한 큰 값은 일 구체예에 따른 캡슐화에 의해 달성된 액적 내 단일 비드의 높은 비율에 기인한 것이다. 세포가 비드를 만날 확률이 높아짐에 따라, 비드로 세포를 캡슐화할 확률이 증가 할 수 있는 것이다.
또한, 도 10 b 및 10c에 나타낸 바와 같이, 하나의 세포와 하나의 비드 (1C + 1B), 복수의 세포와 하나의 비드 (mC1B), 하나의 세포와 복수의 비드 (1C + mB), 복수의 세포와 복수의 비드 (mC + mB)의 분율을 분석한 결과, 일 구체예에 따른 미세유체 장치에서 1C + 1B는 95 %로 높았고 1C + mB와 mC + mB의 합은 비드 농도의 전체 범위에서 2 %로 낮았다. 높은 비드 농도에서도 다수의 비드를 포함하는 액적은 매우 낮은 비율로 나타났으며, 기존의 미세유체 장치 플랫폼과 비교하여 단일 세포 분석에 유리한 것을 의미한다. 또한, 셀 인덱싱에서의 오류는 액적 내 다중 비드의 낮은 분율을 유지함으로써 감소될 수 있다. 특히 도 10c에 나타낸 바와 같이, 기존의 미세유체 장치에서 1C + mB는 실질적으로 20 %까지 증가했다. 이러한 결과는 일 구체예에 따른 미세유체 장치에서의 캡슐화는 비어있는 액적 및 액적 내 복수 비드의 분율을 최소화하면서 하나의 액적 내 하나의 비드의 분율을 극대화한 것을 의미한다. 따라서 캡슐화된 단일 세포가 높은 분율로 단일 비드로 포획되었고, 이는 세포 수율을 높이는 동시에 셀 인덱싱의 오류를 줄여 일 구체예에 따른 미세유체 장치는 고효율 단일 세포 분석에 적합하다는 것을 의미한다.
(6) 단일 세포 RNA 시퀀싱
일 구체예에 따른 미세유체 장치의 성능을 확인하고 조사하기 위해 μL 당 250 개의 세포에 HEK293T 및 NIH3T3 세포의 세포 현탁액을 주입하고 μL 당 1000 개의 비드로 바코드 비드 현탁액을 장치에 주입했다. 캡슐화, 혼합, 세포 용해 및 mRNA 포획 후, 액적을 출구로부터 2.5 분 동안 수집하였다. 상기 액적으로부터 수집된 비드에 대해 역전사, 증폭, 라이브러리 제조 및 시퀀싱을 수행하였다.
바코드의 적합성을 평가하기 위해 리드 1의 세포 인덱스와 분자 인덱스의 뉴클레오타이드 비율을 계산하였다. 시퀀스 데이터 세트에서 UMI 곡선의 누적 비율을 기준으로 기존의 미세유체 장치에서 2165 세포와 (세포 당 686 UMI 이상), 일 구체예에 따른 미세유체 장치에서 1719 세포 (세포 당 702 UMI 이상)를 수집하였다. 이들 중 각각 229 개와 282 개가 저품질 세포로 폐기되었다. 이후에 세포당 UMI에 대해 밀도 플랏 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11a는 기존의 미세유체 장치(Unodered) 및 일 구체예에 따른 미세유체 장치(Ordered)에서 인간 및 마우스 세포의 혼합에서의 세포당 UMI를 밀도 플랏으로 나타낸 그래프이다.
도 11b는 기존의 미세유체 장치(Unodered) 및 일 구체예에 따른 미세유체 장치(Ordered)에서 인간 세포 단독에서의 세포당 UMI를 밀도 플랏으로 나타낸 그래프이다.
도 11c는 기존의 미세유체 장치(Unodered) 및 일 구체예에 따른 미세유체 장치(Ordered)에서 인간 세포 단독에서의 세포당 UMI를 밀도 플랏으로 나타낸 그래프이다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 인간과 마우스 세포를 함께 분석했을 때, 일 구체예에 따른 미세유체 장치의 최고 피크에서 UMI의 수는 2179 였고 기존의 미세유체 장치에서의 수는 866으로 절반 이하였고, 유사한 양상이 인간 세포 및 마우스 세포 단독에서도 관찰되었다. 2 개의 비드가 하나의 세포로 캡슐화 될 때, mRNA 단편이 2 개의 바코드된 비드에 의한 포획을 위해 2 개로 분할 되었기 때문에 전사체의 수가 절반으로 줄어든다. 또한, 2 개의 바코드된 비드가 개별적으로 시퀀싱됨에 따라 세포의 수가 두배가 된다. 상기 도 11의 결과는 기존의 미세유체장치에서의 캡슐화로 생성된 비드쌍(bead doublet)이 전사체 수를 과소하게 하고, 세포의 수를 과장함으로써, 단일세포 시퀀싱 데이터의 품질을 현저하게 감소시킨다는 것을 나타낸다. 또한, 이는 비드 쌍-매개 바코딩 에러에 의해 유발된 부정확한 전사체 및 세포의 수에 의해 단일 세포 mRNA 프로파일의 오인을 일으킬 수 있음을 의미한다. 이에 반해 일 구체예에 따른 미세유체 장치는 바코딩 에러를 최소화하면서 높은 처리량의 바코딩을 가능하게 함을 알 수 있다.
이상의 결과로, 기존의 시스템은 세포와 비드의 농도가 높아지면, 두 개 이상 뭉쳐서 들어갈 확률이 높아지고, 세포와 비드의 농도가 낮아지면, 세포와 비드가 만나 액적을 형성하는 경우가 적어져서 액적이 만들어지는 효율(수율, throughput)이 낮아지게 되는데 반해, 일 구체예에 따른 시스템은 세포 또는 비드를 관성 정렬하여 액적을 형성시킴으로써, 상기한 바와 같이 상충되는 두 가지 파라미터를 동시에 향상시킬 수 있고, 바코딩 에러를 최소화할 수 있는 효과가 있다.

Claims (16)

  1. 단일 세포 분석을 위한 액적을 형성하는 방법으로서,
    세포를 제공하는 단계;
    하나 이상의 구분되게 바코딩된 RNA 포획 비드를 제공하는 단계;
    상기 세포 중의 단일 세포와 하나의 구분되게 바코딩된 RNA 포획 비드를 하나의 액적에 담지하는 단계를 포함하고,
    상기 세포, 또는 비드를 제공하는 단계는 상기 세포 또는 비드가 상기 액적에 담지되기 전에 관성 정렬을 통해 제공되는 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 관성 정렬은 상기 세포 또는 비드가 제공되는 미세유체 장치의 나선형 채널을 통해 나타나는 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 관성 정렬은 하나의 액적 내에 하나의 세포 및 하나의 비드가 담지되는 비율을 향상시키는 것인 방법.
  4. 청구항 1`에 있어서, 상기 비드는 세포 용해액과 함께 제공되는 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 비드는 복수의 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드가 비드의 표면에 분자적 바코딩된 것인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 복수의 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 세포 내의 mRNA의 포획을 위한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 복수의 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 서열은 올리고-dT 서열 또는 프라이머 서열을 포함하는 것인 방법.
  8. 단일 세포 분석을 위한 액적을 형성하는 미세유체 장치로서,
    제1 채널을 포함하는 세포 입구;
    제2 채널을 포함하는 RNA 포획 비드 입구;
    제3 채널을 포함하는 오일 상 입구;
    상기 제1 채널, 제2 채널, 및 제3 채널이 합쳐지는 교차점; 및
    상기 교차점과 연결되고, 세포 및 RNA 포획 비드를 포함하는 액적을 토출하는 출구를 포함하고, 상기 제1 채널 또는 제2 채널은 유체 내의 세포 또는 RNA 포획 비드가 관성 정렬을 일으키도록 구성된 것인 미세유체 장치.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 제1 채널 또는 제2 채널은 나선형인 것인 미세유체 장치.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 관성 정렬은 하나의 액적 내에 하나의 세포 및 하나의 비드가 담지되는 비율을 향상시키는 것인 미세유체 장치.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 비드는 세포 용해액과 함께 제공되는 것인 미세유체 장치.
  12. 청구항 8에 있어서, 상기 비드는 복수의 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드가 비드의 표면에 분자적 바코딩된 것인 미세유체 장치.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 복수의 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 세포 내의 mRNA의 포획을 위한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 미세유체 장치.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 복수의 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 서열은 올리고-dT 서열 또는 프라이머 서열을 포함하는 것인 미세유체 장치.
  15. 청구항 8에 있어서, 상기 세포 입구, RNA 포획 비드 입구 또는 오일 상 입구는 필터를 더 포함하는 것인 미세유체 장치.
  16. 청구항 8에 있어서, 상기 제1 채널 및 제2 채널은 나선형인 것인 미세유체 장치.
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