CN117327774A - 一种单细胞快速测序分析方法 - Google Patents
一种单细胞快速测序分析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117327774A CN117327774A CN202311454242.3A CN202311454242A CN117327774A CN 117327774 A CN117327774 A CN 117327774A CN 202311454242 A CN202311454242 A CN 202311454242A CN 117327774 A CN117327774 A CN 117327774A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- droplets
- blood
- layer
- cell
- suspension
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000005259 measurement Methods 0.000 title description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 44
- 239000011325 microbead Substances 0.000 claims abstract description 31
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 23
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 claims abstract description 22
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims abstract description 17
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 claims abstract description 17
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims abstract description 17
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims abstract description 17
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims abstract description 17
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 47
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 35
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 35
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 34
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 34
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 34
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 24
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 23
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 22
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 21
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 17
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 12
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 12
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 10
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 claims description 10
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 8
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 8
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 7
- UQDUPHDELLQMOV-UHFFFAOYSA-N 1,1,2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-heptadecafluorooctan-1-ol Chemical compound OC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F UQDUPHDELLQMOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004696 Poly ether ether ketone Substances 0.000 claims description 5
- JUPQTSLXMOCDHR-UHFFFAOYSA-N benzene-1,4-diol;bis(4-fluorophenyl)methanone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1.C1=CC(F)=CC=C1C(=O)C1=CC=C(F)C=C1 JUPQTSLXMOCDHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 5
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 claims description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 5
- 229920002530 polyetherether ketone Polymers 0.000 claims description 5
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 claims description 5
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 claims description 5
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 abstract description 2
- 238000005086 pumping Methods 0.000 abstract 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及一种单细胞快速测序分析方法，属于基因测序技术领域。本发明先将细胞悬浮液、带有分子条形码的微珠悬浮液及细胞裂解液泵至微流体装置，汇聚形成层流，再与液滴生成油汇聚，形成单分散的微滴，随后裂解微滴，最后进行PCR扩增，并进行测序分析。本发明于细胞悬浮液中添加了聚乙烯醇，于带有分子条形码的微珠悬浮液中添加了聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮，当二者被泵至同一滴液滴生成油中时，聚乙烯醇、聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮协同增加所生成的微滴的稳定性，有效降低了微滴的破损率，同时聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮还可以提高mRNA富集于Poly(dT)的效率，从而提高样本有效率，避免造成浪费。
Description
技术领域
本发明属于基因测序技术领域，涉及一种单细胞快速测序分析方法。
背景技术
细胞是生物结构与功能的基本单位，形态类型千差万别。通过细胞基因组学，可以描述细胞特性及功能，但易用性和规模的限制阻碍了其广泛应用。
单细胞(single-cell)高通量液滴测序(Drop-seq)技术，是该技术将细胞隔离在微小的液滴中，装上用于扩增的条码引物，由此检测数以千计的细胞。Drop-seq能够帮助生物学家进一步发现和分类人体细胞，绘制大脑等复杂组织的细胞多样性图谱，更好地了解干细胞分化，获得更多疾病的遗传学信息。但该技术中的油相不能很好地包裹水相，导致细胞被裂解前液滴已经破损，从而导致Poly(dT)不能高效富集mRNA，影响后续的测序结果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种单细胞快速测序分析方法，具有良好的微滴稳定性及Poly(dT)富集mRNA效率高的特点。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种单细胞快速测序分析方法，包含以下步骤：先将细胞悬浮液、带有分子条形码的微珠悬浮液及细胞裂解液泵至微流体装置，汇聚形成层流，再与液滴生成油汇聚，形成单分散的微滴，随后裂解微滴，最后进行PCR扩增，并进行测序分析。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的微流体装置包含：核心为一块玻璃微流控芯片，其联通四个输入管道及一个输出管道。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的带有分子条形码的微珠由引物及磁珠组成，其引物的序列包含四个部分：PCR primer、12bp的Cell Barcode、8bp的UMI和30bp的Poly(dT)序列。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的微滴具体通过以下步骤得到：
W1.将细胞悬浮液装入3mL塑料注射器A中、将等体积的细胞裂解液和带有分子条形码的微珠悬浮液装入3mL塑料注射器B中；在塑料注射器B中添加了一个6.4mm磁力转子，通过磁力搅拌器控制；
W2.将液滴生成油装入10mL塑料注射器C和塑料注射器D中，四个注射器通过0.38mm内径的PEEK管分别连接到微流体装置的四个输入管道，并使用注射泵使塑料注射器A及塑料注射器B内的流速为4.1mL/h，液滴生成油的流速为14mL/h；
W3.在光学显微镜下以10倍的放大倍率观察微滴的生成及流动情况；将微滴收集在离心管中；
W4.在微滴生成期间，通过连续、温和的磁力搅拌使带有分子条形码的微珠保持悬浮状态。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的细胞悬浮液通过外周血PBMC分离步骤或骨髓血PBMC分离步骤得到；
所述的外周血PBMC分离步骤包含以下操作：
X1.按体积比为1:1取人的外周血加入PBS缓冲液得到稀释血液；
X2.取淋巴细胞分离液于灭菌离心管中待用；
X3.吸取稀释血液，在离淋巴细胞分离液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上，并与淋巴细胞分离液形成明显界面；
X4.离心，此时离心管中形成4层：第一层为稀释液层，第二层为呈白膜状的单个核细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层；
X5.吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，加5倍体积的PBS缓冲液洗1～2次，每次300ⅹg离心10min；
X6.离心完成后弃上清，加PBS缓冲液及聚乙烯醇重悬，控制单个核细胞的浓度为60个/μL；
所述的骨髓血PBMC分离步骤包含以下操作：
Y1.取淋巴细胞分离液于灭菌离心管中待用；
Y2.按体积比5:1取骨髓血加入PBS缓冲液稀释血液，300ⅹg离心5min；然后弃上清，加入3倍体积PBS缓冲液稀释血液，300ⅹg离心10min；
Y3.离心完成后弃上清，加入2倍骨髓血体积的PBS缓冲液，重悬，过滤，得到预处理骨髓血；
Y4.吸取预处理骨髓血，在离淋巴细胞分离液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入，使预处理骨髓血重叠于淋巴细胞分离液上，并与淋巴细胞分离液形成明显界面；
Y5.离心，此时离心管中形成5层：最上层是血浆，血浆和淋巴细胞分离液之间是呈白膜状的单个核细胞层；
Y6.吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，加5倍体积的PBS缓冲液洗1～2次，每次300ⅹg离心10min；
Y7.离心完成后弃上清，加PBS缓冲液及聚乙烯醇重悬，控制单个核细胞的浓度为60个/μL。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的带有分子条形码的微珠悬浮液通过以下步骤制备：
将带有分子条形码的微珠先后用100％乙醇洗两次和TE/TW洗两次，1000ⅹg离心1min，然后弃上清，再用TE/TW重悬，用100μm过滤器过滤，放入离心管中，加入的DropSeqlysis buffer洗涤，1000ⅹg离心1min，弃上清；然后重新悬浮在含有1mM DLB缓冲液和50mMDTT的混合液中，并加入聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮，控制带有分子条形码的微珠浓度约为120个珠子/μL；
所述TE/TW包含10mM Tris pH 8.0、1mM EDTA及0.01％Tween；
所述的DropSeq lysis buffer包含1mM DLB缓冲液、200mM Tris pH 7.5、6％Ficoll PM-400、0.2％Sarkosyl及20mM EDTA。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤X6及Y7所述的PBS缓冲液、聚乙烯醇的体积比为3～5:2～4。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的混合液、聚山梨酯、聚乙烯吡咯烷酮的体积比为35～40:7～9:1～3。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的裂解微滴包含以下操作：
Z1.在室温下添加6ⅹSSC缓冲液至收集微滴的离心管中，然后用移液管吸去微滴底部的油；
Z2.加全氟-1-辛醇，摇晃试管20s使微滴破乳，然后以1000ⅹg离心1min。
本发明的有益效果：
本发明于细胞悬浮液中添加了聚乙烯醇，于带有分子条形码的微珠悬浮液中添加了聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮，当二者被泵至同一滴液滴生成油中时，聚乙烯醇、聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮协同增加所生成的微滴的稳定性，有效降低了微滴的破损率，同时聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮还可以提高mRNA富集于Poly(dT)的效率，从而提高样本有效率，避免造成浪费。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为实现预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合实施例，对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如下。
实施例1
一种单细胞快速测序分析方法，包含以下步骤：先将细胞悬浮液、带有分子条形码的微珠悬浮液及细胞裂解液泵至微流体装置，汇聚形成层流，再与液滴生成油汇聚，形成单分散的微滴，随后裂解微滴，最后进行PCR扩增，并进行测序分析。
所述的微流体装置包含：核心为一块玻璃微流控芯片，其联通四个输入管道及一个输出管道。
所述的带有分子条形码的微珠由引物及磁珠组成，其引物序列包含四个部分：PCRprimer、12bp的Cell Barcode、8bp的UMI和30bp的Poly(dT)序列。
所述的微滴具体通过以下步骤得到：
W1.将细胞悬浮液装入3mL塑料注射器A中、将等体积的细胞裂解液和带有分子条形码的微珠悬浮液装入3mL塑料注射器B中；在塑料注射器B中添加了一个6.4mm磁力转子，通过磁力搅拌器控制；
W2.将液滴生成油装入10mL塑料注射器C和塑料注射器D中，四个注射器通过0.38mm内径的PEEK管分别连接到微流体装置的四个输入管道，并使用注射泵使塑料注射器A及塑料注射器B内的流速为4.1mL/h，液滴生成油的流速为14mL/h；
W3.在光学显微镜下以10倍的放大倍率观察微滴的生成及流动情况；将微滴收集在50mL离心管中；
W4.在微滴生成期间，通过连续、温和的磁力搅拌使带有分子条形码的微珠保持悬浮状态。
所述的细胞悬浮液通过外周血PBMC分离得到；
所述的外周血PBMC分离步骤包含以下操作：
X1.按体积比为1:1取人的外周血加入PBS缓冲液得到稀释血液；
X2.取淋巴细胞分离液5mL于15mL灭菌离心管中待用；
X3.吸取稀释血液，在离淋巴细胞分离液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上，并与淋巴细胞分离液形成明显界面；
X4.2000rpm离心20min，此时离心管中形成4层：第一层为稀释液层，第二层为呈白膜状的单个核细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层；
X5.小心吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，尽量全部吸出单个核细胞，加5倍以上体积的PBS缓冲液洗1次，300ⅹg离心10min；
X6.离心完成后弃上清，加PBS缓冲液及聚乙烯醇重悬，PBS缓冲液、聚乙烯醇的体积比为3:2，控制单个核细胞的浓度为60个/μL；
所述的带有分子条形码的微珠悬浮液通过以下步骤制备：
将带有分子条形码的微珠先后用30ml 100％乙醇洗两次和30mL TE/TW洗两次，1000ⅹg离心1min，然后弃上清，再用10mL TE/TW重悬，用100μm过滤器过滤，放入50mL离心管中，加入500μL的DropSeq lysis buffer洗涤，1000ⅹg离心1min，弃上清；然后重新悬浮在含有1mM DLB缓冲液和50mM DTT的混合液中，并加入聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮，控制带有分子条形码的微珠浓度约为120个珠子/μL，混合液、聚山梨酯、聚乙烯吡咯烷酮的体积比为35:7:1；
所述TE/TW包含10mM Tris pH 8.0、1mM EDTA及0.01％Tween；
所述的DropSeq lysis buffer包含1mM DLB缓冲液、200mM Tris pH 7.5、6％Ficoll PM-400、0.2％Sarkosyl及20mM EDTA。
所述的裂解微滴包含以下操作：
Z1.在室温下添加30mL 6ⅹSSC缓冲液至收集微滴的离心管中，然后用移液管吸去微滴底部的油；
Z2.加600μL全氟-1-辛醇，摇晃试管20s使微滴破乳，然后以1000ⅹg离心1min。
实施例2
一种单细胞快速测序分析方法，包含以下步骤：先将细胞悬浮液、带有分子条形码的微珠悬浮液及细胞裂解液泵至微流体装置，汇聚形成层流，再与液滴生成油汇聚，形成单分散的微滴，随后裂解微滴，最后进行PCR扩增，并进行测序分析。
所述的微流体装置包含：核心为一块玻璃微流控芯片，其联通四个输入管道及一个输出管道。
所述的带有分子条形码的微珠由引物及磁珠组成，其引物序列包含四个部分：PCRprimer、12bp的Cell Barcode、8bp的UMI和30bp的Poly(dT)序列。
所述的微滴具体通过以下步骤得到：
W1.将细胞悬浮液装入3mL塑料注射器A中、将等体积的细胞裂解液和带有分子条形码的微珠悬浮液装入3mL塑料注射器B中；在塑料注射器B中添加了一个6.4mm磁力转子，通过磁力搅拌器控制；
W2.将液滴生成油装入10mL塑料注射器C和塑料注射器D中，四个注射器通过0.38mm内径的PEEK管分别连接到微流体装置的四个输入管道，并使用注射泵使塑料注射器A及塑料注射器B内的流速为4.1mL/h，液滴生成油的流速为14mL/h；
W3.在光学显微镜下以10倍的放大倍率观察微滴的生成及流动情况；将微滴收集在50mL离心管中；
W4.在微滴生成期间，通过连续、温和的磁力搅拌使带有分子条形码的微珠保持悬浮状态。
所述的细胞悬浮液通过骨髓血PBMC分离得到；
所述的骨髓血PBMC分离步骤包含以下操作：
Y1.取淋巴细胞分离液5mL于15mL灭菌离心管中待用；
Y2.按体积比5:1取骨髓血加入PBS缓冲液稀释血液，300ⅹg离心5min；然后弃上清，加入PBS缓冲液按3:1稀释血液，300ⅹg离心10min；
Y3.离心完成后弃上清，加入2倍骨髓血体积的PBS缓冲液，重悬，过滤，得到预处理骨髓血；
Y4.吸取预处理骨髓血，在离淋巴细胞分离液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入，使预处理骨髓血重叠于淋巴细胞分离液上，并与淋巴细胞分离液形成明显界面；
Y5.2000rpm离心20min，此时离心管中形成5层：最上层是血浆，血浆和淋巴细胞分离液之间是呈白膜状的单个核细胞层；
Y6.小心吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，尽量全部吸出单个核细胞，加5倍以上体积的PBS缓冲液洗2次，每次300g离心10min；
Y7.离心完成后弃上清，加PBS缓冲液及聚乙烯醇重悬，PBS缓冲液、聚乙烯醇的体积比为4:3，控制单个核细胞的浓度为60个/μL。
所述的带有分子条形码的微珠悬浮液通过以下步骤制备：
将带有分子条形码的微珠先后用30ml 100％乙醇洗两次和30mL TE/TW洗两次，1000ⅹg离心1min，然后弃上清，再用10mL TE/TW重悬，用100μm过滤器过滤，放入50mL离心管中，加入500μL的DropSeq lysis buffer洗涤，1000ⅹg离心1min，弃上清；然后重新悬浮在含有1mM DLB缓冲液和50mM DTT的混合液中，并加入聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮，控制带有分子条形码的微珠浓度约为120个珠子/μL，混合液、聚山梨酯、聚乙烯吡咯烷酮的体积比为37:8:2；
所述TE/TW包含10mM Tris pH 8.0、1mM EDTA及0.01％Tween；
所述的DropSeq lysis buffer包含1mM DLB缓冲液、200mM Tris pH 7.5、6％Ficoll PM-400、0.2％Sarkosyl及20mM EDTA。
所述的裂解微滴包含以下操作：
Z1.在室温下添加30mL 6ⅹSSC缓冲液至收集微滴的离心管中，然后用移液管吸去微滴底部的油；
Z2.加600μL全氟-1-辛醇，摇晃试管20s使微滴破乳，然后以1000ⅹg离心1min。
实施例3
一种单细胞快速测序分析方法，包含以下步骤：先将细胞悬浮液、带有分子条形码的微珠悬浮液及细胞裂解液泵至微流体装置，汇聚形成层流，再与液滴生成油汇聚，形成单分散的微滴，随后裂解微滴，最后进行PCR扩增，并进行测序分析。
所述的微流体装置包含：核心为一块玻璃微流控芯片，其联通四个输入管道及一个输出管道。
所述的带有分子条形码的微珠由引物及磁珠组成，其引物序列包含四个部分：PCRprimer、12bp的Cell Barcode、8bp的UMI和30bp的Poly(dT)序列。
所述的微滴具体通过以下步骤得到：
W1.将细胞悬浮液装入3mL塑料注射器A中、将等体积的细胞裂解液和带有分子条形码的微珠悬浮液装入3mL塑料注射器B中；在塑料注射器B中添加了一个6.4mm磁力转子，通过磁力搅拌器控制；
W2.将液滴生成油装入10mL塑料注射器C和塑料注射器D中，四个注射器通过0.38mm内径的PEEK管分别连接到微流体装置的四个输入管道，并使用注射泵使塑料注射器A及塑料注射器B内的流速为4.1mL/h，液滴生成油的流速为14mL/h；
W3.在光学显微镜下以10倍的放大倍率观察微滴的生成及流动情况；将微滴收集在50mL离心管中；
W4.在微滴生成期间，通过连续、温和的磁力搅拌使带有分子条形码的微珠保持悬浮状态。
所述的细胞悬浮液通过外周血PBMC分离得到；
所述的外周血PBMC分离步骤包含以下操作：
X1.按体积比为1:1取人的外周血加入PBS缓冲液得到稀释血液；
X2.取淋巴细胞分离液5mL于15mL灭菌离心管中待用；
X3.吸取稀释血液，在离淋巴细胞分离液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上，并与淋巴细胞分离液形成明显界面；
X4.2000rpm离心20min，此时离心管中形成4层：第一层为稀释液层，第二层为呈白膜状的单个核细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层；
X5.小心吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，尽量全部吸出单个核细胞，加5倍以上体积的PBS缓冲液洗2次，每次300ⅹg离心10min；
X6.离心完成后弃上清，加PBS缓冲液及聚乙烯醇重悬，PBS缓冲液、聚乙烯醇的体积比为5:4，控制单个核细胞的浓度为60个/μL；
所述的带有分子条形码的微珠悬浮液通过以下步骤制备：
将带有分子条形码的微珠分别用30ml 100％乙醇洗两次和30mL TE/TW洗两次，1000ⅹg离心1min，然后弃上清，再用10mL TE/TW重悬，用100μm过滤器过滤，放入50mL离心管中，加入500μL的DropSeq lysis buffer洗涤，1000ⅹg离心1min，弃上清；然后重新悬浮在含有1mM DLB缓冲液和50mM DTT的混合液中，并加入聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮，控制带有分子条形码的微珠浓度约为120个珠子/μL，混合液、聚山梨酯、聚乙烯吡咯烷酮的体积比为40:9:3；
所述TE/TW包含10mM Tris pH 8.0、1mM EDTA及0.01％Tween；
所述的DropSeq lysis buffer包含1mM DLB缓冲液、200mM Tris pH 7.5、6％Ficoll PM-400、0.2％Sarkosyl及20mM EDTA。
所述的裂解微滴包含以下操作：
Z1.在室温下添加30mL 6ⅹSSC缓冲液至收集微滴的离心管中，然后用移液管吸去微滴底部的油；
Z2.加600μL全氟-1-辛醇，摇晃试管约20s使微滴破乳，然后以1000ⅹg离心1min。
对比例1
步骤X6中不添加聚乙烯醇，其余操作参照实施例3。
对比例2
不添加聚山梨酯，其余操作参照实施例3。
对比例3
不添加聚乙烯吡咯烷酮，其余操作参照实施例3。
性能检测
对实施例1～3及对比例1～3步骤W3中生成的微滴形态进行观察并记录微滴破损数(/100滴)，记录结果如下表1所示。
表1微滴形态观察结果
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种单细胞快速测序分析方法，其特征在于，包含以下步骤：先将细胞悬浮液、带有分子条形码的微珠悬浮液及细胞裂解液泵至微流体装置，汇聚形成层流，再与液滴生成油汇聚，形成单分散的微滴，随后裂解微滴，最后进行PCR扩增，并进行测序分析。
2.根据权利要求1所述的一种单细胞快速测序分析方法，其特征在于，所述的微流体装置包含：核心为一块玻璃微流控芯片，其联通四个输入管道及一个输出管道。
3.根据权利要求1所述的一种单细胞快速测序分析方法，其特征在于，所述的带有分子条形码的微珠由引物及磁珠组成，其引物的序列包含四个部分：PCR primer、12bp的CellBarcode、8bp的UMI和30bp的Poly(dT)序列。
4.根据权利要求2所述的一种单细胞快速测序分析方法，其特征在于，所述的微滴具体通过以下步骤得到：
W1.将细胞悬浮液装入3mL塑料注射器A中、将等体积的细胞裂解液和带有分子条形码的微珠悬浮液装入3mL塑料注射器B中；在塑料注射器B中添加了一个6.4mm磁力转子，通过磁力搅拌器控制；
W2.将液滴生成油装入10mL塑料注射器C和塑料注射器D中，四个注射器通过0.38mm内径的PEEK管分别连接到微流体装置的四个输入管道，并使用注射泵使塑料注射器A及塑料注射器B内的流速为4.1mL/h，液滴生成油的流速为14mL/h；
W3.在光学显微镜下以10倍的放大倍率观察微滴的生成及流动情况；将微滴收集在离心管中；
W4.在微滴生成期间，通过连续、温和的磁力搅拌使带有分子条形码的微珠保持悬浮状态。
5.根据权利要求1所述的一种单细胞快速测序分析方法，其特征在于，所述的细胞悬浮液通过外周血PBMC分离步骤或骨髓血PBMC分离步骤得到；
所述的外周血PBMC分离步骤包含以下操作：
X1.按体积比为1:1取人的外周血加入PBS缓冲液得到稀释血液；
X2.取淋巴细胞分离液于灭菌离心管中待用；
X3.吸取稀释血液，在离淋巴细胞分离液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上，并与淋巴细胞分离液形成明显界面；
X4.离心，此时离心管中形成4层：第一层为稀释液层，第二层为呈白膜状的单个核细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层；
X5.吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，加5倍体积的PBS缓冲液洗1～2次，每次300ⅹg离心10min；
X6.离心完成后弃上清，加PBS缓冲液及聚乙烯醇重悬，控制单个核细胞的浓度为60个/μL；
所述的骨髓血PBMC分离步骤包含以下操作：
Y1.取淋巴细胞分离液于灭菌离心管中待用；
Y2.按体积比5:1取骨髓血加入PBS缓冲液稀释血液，300ⅹg离心5min；然后弃上清，加入3倍体积PBS缓冲液稀释血液，300ⅹg离心10min；
Y3.离心完成后弃上清，加入2倍骨髓血体积的PBS缓冲液，重悬，过滤，得到预处理骨髓血；
Y4.吸取预处理骨髓血，在离淋巴细胞分离液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入，使预处理骨髓血重叠于淋巴细胞分离液上，并与淋巴细胞分离液形成明显界面；
Y5.离心，此时离心管中形成5层：最上层是血浆，血浆和淋巴细胞分离液之间是呈白膜状的单个核细胞层；
Y6.吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，加5倍体积的PBS缓冲液洗1～2次，每次300g离心10min；
Y7.离心完成后弃上清，加PBS缓冲液及聚乙烯醇重悬，控制单个核细胞的浓度为60个/μL。
6.根据权利要求1所述的一种单细胞快速测序分析方法，其特征在于，所述的带有分子条形码的微珠悬浮液通过以下步骤制备：
将带有分子条形码的微珠先后用100％乙醇洗两次和TE/TW洗两次，1000ⅹg离心1min，然后弃上清，再用TE/TW重悬，用100μm过滤器过滤，放入离心管中，加入的DropSeq lysisbuffer洗涤，1000ⅹg离心1min，弃上清；然后重新悬浮在含有1mM DLB缓冲液和50mM DTT的混合液中，并加入聚山梨酯及聚乙烯吡咯烷酮，控制带有分子条形码的微珠浓度约为120个珠子/μL；
所述TE/TW包含10mM Tris pH 8.0、1mM EDTA及0.01％Tween；
所述的DropSeq lysis buffer包含1mM DLB缓冲液、200mM Tris pH 7.5、6％FicollPM-400、0.2％Sarkosyl及20mM EDTA。
7.根据权利要求5所述的一种单细胞快速测序分析方法，其特征在于，步骤X6及Y7所述的PBS缓冲液、聚乙烯醇的体积比为3～5:2～4。
8.根据权利要求6所述的一种单细胞快速测序分析方法，其特征在于，所述的混合液、聚山梨酯、聚乙烯吡咯烷酮的体积比为35～40:7～9:1～3。
9.根据权利要求4所述的一种单细胞快速测序分析方法，其特征在于，所述的裂解微滴包含以下操作：
Z1.在室温下添加6ⅹSSC缓冲液至收集微滴的离心管中，然后用移液管吸去微滴底部的油；
Z2.加全氟-1-辛醇，摇晃试管20s使微滴破乳，然后以1000ⅹg离心1min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311454242.3A CN117327774A (zh) | 2023-11-03 | 2023-11-03 | 一种单细胞快速测序分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311454242.3A CN117327774A (zh) | 2023-11-03 | 2023-11-03 | 一种单细胞快速测序分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117327774A true CN117327774A (zh) | 2024-01-02 |
Family
ID=89295460
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311454242.3A Pending CN117327774A (zh) | 2023-11-03 | 2023-11-03 | 一种单细胞快速测序分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117327774A (zh) |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170260584A1 (en) * | 2016-02-11 | 2017-09-14 | 10X Genomics, Inc. | Cell population analysis using single nucleotide polymorphisms from single cell transcriptomes |
| CN107873054A (zh) * | 2014-09-09 | 2018-04-03 | 博德研究所 | 用于复合单细胞核酸分析的基于微滴的方法和设备 |
| CN111468050A (zh) * | 2020-04-29 | 2020-07-31 | 福州大学 | 一种基于微流控技术制备复合精油微粒的方法 |
| US20200277672A1 (en) * | 2016-12-21 | 2020-09-03 | The Regent Of The University Of California | Single Cell Genomic Sequencing Using Hydrogel Based Droplets |
| US20210214802A1 (en) * | 2020-01-13 | 2021-07-15 | Fluent Biosciences Inc. | Single cell sequencing |
| CN217297855U (zh) * | 2021-12-24 | 2022-08-26 | 浙江达普生物科技有限公司 | 一种单细胞包裹仪 |
| CN217888042U (zh) * | 2022-07-27 | 2022-11-25 | 广州君瑞康医学检验实验室有限公司 | 一种用于微流控的单细胞分离装置 |
| WO2022251509A1 (en) * | 2021-05-27 | 2022-12-01 | Chan Zuckerberg Biohub, Inc. | Partitioning cells for high throughput single-cell sequencing |
| WO2023069424A1 (en) * | 2021-10-19 | 2023-04-27 | Cz Biohub Sf, Llc | Nuclear dna-antibody sequencing for joint profiling of genotype and protein in single nuclei |
| WO2023099667A1 (en) * | 2021-12-01 | 2023-06-08 | Vilnius University | Methods for processing and barcoding nucleic acids |
-
2023
- 2023-11-03 CN CN202311454242.3A patent/CN117327774A/zh active Pending
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107873054A (zh) * | 2014-09-09 | 2018-04-03 | 博德研究所 | 用于复合单细胞核酸分析的基于微滴的方法和设备 |
| US20170260584A1 (en) * | 2016-02-11 | 2017-09-14 | 10X Genomics, Inc. | Cell population analysis using single nucleotide polymorphisms from single cell transcriptomes |
| US20200277672A1 (en) * | 2016-12-21 | 2020-09-03 | The Regent Of The University Of California | Single Cell Genomic Sequencing Using Hydrogel Based Droplets |
| US20210214802A1 (en) * | 2020-01-13 | 2021-07-15 | Fluent Biosciences Inc. | Single cell sequencing |
| CN111468050A (zh) * | 2020-04-29 | 2020-07-31 | 福州大学 | 一种基于微流控技术制备复合精油微粒的方法 |
| WO2022251509A1 (en) * | 2021-05-27 | 2022-12-01 | Chan Zuckerberg Biohub, Inc. | Partitioning cells for high throughput single-cell sequencing |
| WO2023069424A1 (en) * | 2021-10-19 | 2023-04-27 | Cz Biohub Sf, Llc | Nuclear dna-antibody sequencing for joint profiling of genotype and protein in single nuclei |
| WO2023099667A1 (en) * | 2021-12-01 | 2023-06-08 | Vilnius University | Methods for processing and barcoding nucleic acids |
| CN217297855U (zh) * | 2021-12-24 | 2022-08-26 | 浙江达普生物科技有限公司 | 一种单细胞包裹仪 |
| CN217888042U (zh) * | 2022-07-27 | 2022-11-25 | 广州君瑞康医学检验实验室有限公司 | 一种用于微流控的单细胞分离装置 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 包梦颖等: "基于单细胞RNA测序探讨膀胱癌患者外周血单个核细胞特征的研究术", 《广西医科大学学报》, vol. 38, no. 4, 30 April 2021 (2021-04-30), pages 636 - 643 * |
| 周鲁林等: "液滴微流控单细胞转录组检测技术的建立和优化", 《癌变·畸变·突变》, vol. 31, no. 1, 30 January 2019 (2019-01-30), pages 9 - 14 * |
| 李东光: "《实用化妆品生产技术手册》", 30 September 2001, 化学工业出版社, pages: 187 * |
| 肖琳等: "《环境微生物实验技术》", 31 July 2004, 中国环境科学出版社, pages: 93 * |
| 韩县伟等: "基于微流控液滴形成技术的聚乙烯醇微球制备", 《分析化学》, vol. 46, no. 8, 31 August 2018 (2018-08-31), pages 1269 - 1274 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10427160B2 (en) | Rapid and continuous analyte processing in droplet microfluidic devices | |
| US20220154248A1 (en) | Combined multiple-displacement amplification and pcr in an emulsion microdroplet | |
| JP5804148B2 (ja) | 管内で対象成分を操作するための操作管 | |
| US6043354A (en) | Method for the simultaneous isolation of genomic DNA and high-purity RNA | |
| EP1996931B1 (en) | Blood cell sorting methods and systems | |
| CN101665785B (zh) | 一种采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法 | |
| CN1973197B (zh) | 用于进行核酸序列的扩增和检测过程的诊断系统 | |
| CN1187362C (zh) | 核酸的固相分离法 | |
| AU2017382905A1 (en) | Single cell genomic sequencing using hydrogel based droplets | |
| JP4699868B2 (ja) | 核酸精製方法及び核酸精製器具 | |
| US9144799B2 (en) | Modular microfluidic system for biological sample preparation | |
| CN1304589C (zh) | 利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法 | |
| CN112827517B (zh) | 一种微流控芯片的使用方法及其装置 | |
| CN117327774A (zh) | 一种单细胞快速测序分析方法 | |
| CN113025695A (zh) | 高通量单细胞染色质可及性的测序方法 | |
| CN113026110A (zh) | 高通量单细胞转录组测序方法及试剂盒 | |
| US11701668B1 (en) | Methods and devices for magnetic separation | |
| CN112592967B (zh) | 一种基于液滴pcr快速检测单细胞的方法 | |
| WO2021146279A1 (en) | Devices and methods for determining nucleic acids using digital droplet pcr and related techniques | |
| CN110373394A (zh) | 分离单个噬菌体粒子的方法 | |
| CN116218966A (zh) | 一种脐带血细菌和真菌快速检测的方法 | |
| WO2022226791A1 (zh) | 芯片、微流控装置以及分选目标液滴的方法 | |
| CN112871226A (zh) | 一种微流控芯片和微流控芯片的使用方法 | |
| CN113588963A (zh) | 一种高通量单细胞蛋白组分析及其与转录组联合分析方法 | |
| CN201823341U (zh) | 磁性吸附分离装置 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |