JP2021113681A - 多糖類カラム担体が大型カラムに充填された充填ベッドの製造方法 - Google Patents

多糖類カラム担体が大型カラムに充填された充填ベッドの製造方法 Download PDF

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Abstract

【課題】本発明は、スラリーを送液することにより大型カラムに担体を充填する方法において、再現性よく良好なクロマトピークを得ることのできる充填ベッドを確実に製造する方法を提供することを目的とする。【解決手段】直径３０ｃｍ以上２７０ｃｍ以下の内径を有する円筒体と、該円筒体内下部を横断する円盤状フィルターと、該フィルターの上方に配設された円盤体と、この円盤体下面に噴出口を有するノズルとを備えたカラムパッキング装置を用い、多糖類カラム担体を含むスラリーをポンプ圧送して前記ノズルから噴出させ、円盤状フィルターの上に該担体の充填ベッドを製造する方法であって、前記スラリーの担体濃度範囲（Ａ）、前記ポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）、及びベッド形成終了時の充填圧と充填ベッド高さの比（充填圧／充填ベッド高さ）（Ｃ）を制御して、下記カラム性能評価法に従って得られるクロマトグラムが、形状：シングルピーク、理論段数：１５００以上、アシンメトリー：０．７以上１．７以下となる充填ベッドを製造する方法。【選択図】図１

Description

本発明は、多糖類カラム担体を大型カラムへ充填し、充填ベッドを製造するための方法に関する。
バイオセパレーション分野では、目的物精製のためにカラムクロマトグラフィーが用いられることが多い。通例、カラム担体は、カラムにポンプ送液、注入又は吸引された離散粒子の懸濁液（スラリーとして知られる）を圧密化することにより形成され、いわゆる、充填ベッドとしてカラム内に収容される。
他方、大型カラムのような大規模なカラムは、規定の濃度の担体粒子を有する所定の体積のスラリーをカラム内に吸引又は注入することによって製造される。例えばカラム下部からスラリーを導入してカラム上部とカラム下部との間に設置された可動アダプターを下方に移動させることにより、スラリー中の液体を外部に排出して充填ベッドを形成したり、または、スプレーノズルを利用して、カラム内上部よりスラリーをカラム内に噴霧し、カラム下部より液体を排出することにより、充填ベッドを形成させたりする（特許文献１）。
この様に、この手順中に過剰の液体はカラム出口から追い出されるが、担体粒子はこれらの担体粒子が通り抜けられないような小さい細孔を有するフィルター物質、いわゆる「ベッド支持体」によって保持されることになる。その後、充填ベッドが最適な圧縮度で圧縮されたらパッキングプロセスは終了である。
特表２０１１−５２２２４８号公報
上記特許文献１に記載される充填手法はｐａｃｋ ｉｎ ｐｌａｃｅ法とも呼ばれているが、当該方法では特に大型カラムでは良好なクロマトピークを得ることが容易ではなく、何回かの再充填を繰り返し、担体充填を完了させていることが実状である。実際、特許文献１では、一度充填されたベッドを破壊して再度スラリーを充填してベッドを形成することにより、スラリー濃度を適切な濃度に希釈することが開示されている。
また、スラリーを送液するポンプにはエアードダイヤフラムポンプが通常用いられているが、大型カラムになるほどポンプに供給する空気量が多く要求され、大型のエアーコンプレッサーが必要とされるなど、カラム付帯設備費用が高価になるという問題があった。
上記問題に鑑み、本発明は、スラリーを送液することにより大型カラムに担体を充填する方法において、再現性よく良好なクロマトピークを得ることのできる充填ベッドを確実に製造する方法を提供することを目的としている。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、大型カラムに送液するスラリーの濃度と充填速度を制御することで再現性よく確実に良好なクロマトピークを得ることのできる充填ベッドが形成されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、直径３０ｃｍ以上２７０ｃｍ以下の内径を有する円筒体と、該円筒体内下部を横断する円盤状フィルターと、該フィルターの上方に配設された円盤体と、この円盤体下面に噴出口を有するノズルとを備えたカラムパッキング装置を用い、多糖類カラム担体を含むスラリーをポンプ圧送して前記ノズルから噴出させ、円盤状フィルターの上に該担体の充填ベッドを製造する方法であって、
前記スラリーの担体濃度範囲（Ａ）、前記ポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）、及びベッド形成終了時の充填圧と充填ベッド高さの比（充填圧／充填ベッド高さ）（Ｃ）[充填停止時カラム圧／ベッド高ともいう]を制御して、下記カラム性能評価法に従って得られるクロマトグラムが、形状：シングルピーク、理論段数：１５００以上、アシンメトリー：０．７以上１．７以下となる充填ベッドを製造する方法。
（カラム性能評価法）
ピーク形成用試料：濃度０．５ｍｏｌ／Ｌの塩水又は濃度１０ｍｇ／ｍＬのアセトン水
試料チャージ量：１．０Ｌ
移動相：水又は０．２ｍｏｌ／Ｌの塩水
移動相線速：４８ｃｍ／ｈｒ
検知：電気伝導度
本発明において、前記濃度範囲（Ａ）を４０体積％超８０体積％以下とし、かつ前記最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲と、前記充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）の範囲を下記の組み合わせにすることが好ましい。
最大吐出カラム線速度（Ｂ）を１５００ｃｍ／ｈｒ超３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とする；
最大吐出カラム線速度（Ｂ）を７１５ｃｍ／ｈｒ超１５００ｃｍ／ｈｒ以下とし、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とする；又は
最大吐出カラム線速度（Ｂ）を４７５ｃｍ／ｈｒ超７１５ｃｍ／ｈｒ以下とし、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００２８ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とする
本発明において、前記濃度範囲（Ａ）を３５体積％超４０体積％以下とし、かつ前記最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲と、前記充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）の範囲を下記の組み合わせにすることも好ましい。
最大吐出カラム線速度（Ｂ）を１５００ｃｍ／ｈｒ超３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．０１０ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とする；
最大吐出カラム線速度（Ｂ）を７１５ｃｍ／ｈｒ超１５００ｃｍ／ｈｒ以下とし、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００９ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とする；又は
最大吐出カラム線速度（Ｂ）を４７５ｃｍ／ｈｒ超７１５ｃｍ／ｈｒ以下とし、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００４ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とする
本発明において、前記濃度範囲（Ａ）を２８体積％以上３４体積％以下とし、かつ前記最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲と、前記充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）の範囲を下記の組み合わせにすることも好ましい。
最大吐出カラム線速度（Ｂ）を１５００ｃｍ／ｈｒ超３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．０１１５ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とする；
最大吐出カラム線速度（Ｂ）を７１５ｃｍ／ｈｒ超１５００ｃｍ／ｈｒ以下とし、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００９５ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とする；又は
最大吐出カラム線速度（Ｂ）を４７５ｃｍ／ｈｒ超７１５ｃｍ／ｈｒ以下とし、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００５ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とする
本発明において、前記多糖類カラム担体が、累積体積分布の中間粒径として平均粒子径５０〜１００μｍを有することは好ましい態様である。
本発明によれば、スラリーを送液することにより大型カラムに担体を充填する方法において、再現性よく良好なクロマトピークを得ることのできる充填ベッドを確実に製造することが可能となる。また、本発明により、充填し直しによる費用損失、機会損失を防ぐことができる。
図１は、ｐａｃｋ ｉｎ ｐｌａｃｅ法に用いられるカラムパッキング装置の例である。 図２は、良好なクロマトピークを示す実施例１のクロマトグラムである。 図３は、歪なクロマトピークを示す比較例１のクロマトグラムである。 図４は、実施例１〜５、比較例１〜３における、充填停止時カラム圧／ベッド高とメインピークエリア／全ピークエリアとの関係を示す図である。 図５は、実施例６〜９、比較例４〜６における、充填停止時カラム圧／ベッド高とメインピークエリア／全ピークエリアとの関係を示す図である。 図６は、実施例１０〜１３、比較例７と８における、充填停止時カラム圧／ベッド高とメインピークエリア／全ピークエリアとの関係を示す図である。
本発明は、直径３０ｃｍ以上２７０ｃｍ以下の内径を有する円筒体と、該円筒体内下部を横断する円盤状フィルターと、該フィルターの上方に配設された円盤体と、この円盤体下面に噴出口を有するノズルとを備えたカラムパッキング装置を用い、多糖類カラム担体を含むスラリーをポンプ圧送して前記ノズルから噴出させ、円盤状フィルターの上に該担体の充填ベッドを製造する方法（本発明において、ｐａｃｋ ｉｎ ｐｌａｃｅ法ともいう）に関するものである。
本発明で使用されるｐａｃｋ ｉｎ ｐｌａｃｅ法について図を参照して説明する。
カラムパッキング装置２０は、例えば、スラリータンク２と、大型カラム（円筒体６）と、スラリータンク２と円筒体６を接続するスラリー送液ライン３と、スラリー送液ライン３上の送液ポンプ４から構成される。スラリータンク２には、所定の担体と溶媒を含むスラリー１が収容されており、送液ポンプ４により、スラリー送液ライン３を通じて円筒体６に送液（圧送）される。
円筒体６は、例えば、円筒体６上端に設置される上部蓋体５、円筒体６内に収容される円盤体８、円盤体８下面に設置されるノズル１０、円筒体６内に収容されかつ前記円盤体８よりも下方に配設される円盤状フィルター９、円筒体６下端を構成する底面部７、及び前記円盤状フィルター９よりも下方で円筒体６に接続する（図示例では円筒体底面部７に接続する）排出ライン１１から構成される。円筒体６の内部は、スラリー１を送液する前に、所定の溶媒で満たされていてもよく、送液されたスラリー１は、上部蓋体５から流入し、円盤体下面のノズル１０の噴出口から噴霧される。
噴霧されたスラリー１の担体は、円筒体内部において、底面部７の上に配置され、担体の粒径よりも小さい粒径を有する円盤状フィルター９上に堆積して圧密化される。
一方、スラリー１の溶媒は、円盤状フィルター９を通り抜けて、排出ライン１１から円筒体６の外部に排出される。スラリー１の送液は、所定の充填ベッド高が形成されるまで、行えばよい。
スラリータンクは、スラリーを収容することができる限り、金属、プラスチック等から形成されてもよく、スラリータンクの形状は、円筒形、直方体形、球形等の任意の形状であってもよい。
スラリーは、所定のカラム担体と溶媒の混合物であればよい。多糖類カラム担体としては、セルロースカラム担体等が挙げられるが、イオン交換カラム担体（カチオン交換カラム担体、アニオン交換カラム担体）、シリカカラム担体等であってもよい。多糖類カラム担体としては、本発明の効果が得られるものであれば特に制限されないが、例えば、セルロースカラム担体であるＫａｎｅｋａ ＫｎｃａｐＡ、Ｋａｎｅｋａ ＫａｎｃａｐＡ３Ｇなどが挙げられる。
多糖類カラム担体は、累積体積分布の中間粒径としての平均粒子径が５０〜１００μｍであることが好ましく、該平均粒子径が６０〜９０μｍであることがより好ましい。上記スラリーは、多糖類カラム担体をまず、分散溶媒に分散させて調製すればよく、従来公知の分散剤を添加してもよい。
溶媒は、例えば、水系溶媒、アルコール系溶媒、エステル系溶媒、エーテル系溶媒などの有機溶媒等であってもよく、好ましくは水系溶媒、アルコール系溶媒であり、より好ましくは水、または水とエタノールの混和溶媒である。水とエタノールの混和溶媒はエタノール濃度３０体積％以下であることが好ましい。
スラリータンクに収容されるスラリーのスラリー濃度は、１０体積％以上、８０体積％以下であることが好ましく、１５体積％以上、７５体積％以下であることがより好ましく、２０体積％以上、７０体積％以下であることがさらに好ましく、２０体積％以上、６５体積％以下であることがさらにより好ましく、２８体積％以上、３４体積％以下、又は３５体積％以上、４０体積％以下、又は４１体積％以上、６０体積％以下であることがさらにより一層好ましい。
１０体積％未満のスラリー濃度では、大きなスラリータンク容量が要求され、８０体積％超のスラリー濃度ではスラリー粘度が高くなるため、下記で説明するポンプでの送液が容易ではなくなる。なお、スラリー濃度はスラリータンクよりスラリーをサンプリングし、多糖類カラム担体を沈降、タッピングし、多糖類カラム担体の沈降体積を全液量体積で割った値で評価することができる。
特に、スラリー濃度は４０体積％超８０体積％以下に制御するのが望ましい。後述する様に、Ｐａｃｋ ｉｎ ｐｌａｃｅ法では、最大吐出カラム線速度（Ｂ）を大きくするほど、また充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を大きくするほど、良好なクロマトピークが得られやすくなるが、スラリー濃度を高くすると、最大吐出カラム線速度（Ｂ）や充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を比較的小さくした場合にも、良好なクロマトピークを得ることが可能となる。
またスラリー濃度は、３５体積％超４０体積％以下、或いは２８体積％以上３５体積％以下とすることも可能である。これら濃度の場合にも、後述する様に、最大吐出カラム線速度（Ｂ）を大きくするほど、また充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を大きくするほど、良好なクロマトピークが得られやすくなる。
スラリー送液ラインは、スラリータンクと円筒体を接続するものであれば特に限定されないが、金属、プラスチック等の材料から構成される管状構造を有することが好ましい。
送液ポンプは、非容積式ポンプ、容積式ポンプのいずれであってもよい。
非容積式ポンプとしては、渦巻ポンプ、タービンポンプ等の遠心ポンプ、軸流ポンプ、斜流ポンプ等のプロペラポンプ、カスケードポンプ等の粘性ポンプ等が挙げられる。
容積式ポンプとしては、ピストンポンプ、プランジャーポンプ、ダイヤフラムポンプ、ウイングポンプ等の往復動ポンプ、ギヤーポンプ、偏心ポンプ、ねじポンプ等の回転ポンプ等が挙げられる。
中でも、容積式ポンプが好ましく、往復動ポンプがより好ましく、ダイヤフラムポンプがさらに好ましい。ダイヤフラムポンプは、逆止弁の働きによって液の吸引と吐出が交互に行われるものであればよい。
ダイヤフラムポンプとしては、例えば、タプフロー社製ダイヤフラムポンプＴＨＵ２０３、タプフロー社製Ｔ−１００、タプフロー社製Ｔ−２００、タプフロー社製Ｔ−４００、タプフロー社製Ｔ−８００、タプフロー社製Ｔ−５０等が挙げられる。
送液ポンプの圧力、送液速度、送液量等の条件は、例えば、送液ポンプの稼働空気圧、ポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）、充填停止時のカラム圧、充填停止時のカラム線速度、及びベッド形成終了時の充填圧と充填ベッド高さの比（充填圧／充填ベッド高さ）（Ｃ）等が後述の範囲となるように調節すればよい。
本発明において、送液ポンプの稼働空気圧、充填停止時のカラム圧、充填停止時のカラム線速度、及びベッド形成終了時の充填圧と充填ベッド高さの比（充填圧／充填ベッド高さ）（Ｃ）の条件は、スラリーの担体濃度範囲（Ａ）と最大吐出カラム線速度（Ｂ）と共に表されてもよい。
スラリーの担体濃度範囲（Ａ）と最大吐出カラム線速度（Ｂ）の組み合わせは、以下の通りであり、これらの組み合わせを（ｉ）〜（ｉｘ）として標記する場合がある。
（ｉ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）４０体積％超８０体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）１５００ｃｍ／ｈｒ超３９５０ｃｍ／ｈｒ以下
（ｉｉ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）４０体積％超８０体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）７１５ｃｍ／ｈｒ超１５００ｃｍ／ｈｒ以下
（ｉｉｉ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）４０体積％超８０体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）４７５ｃｍ／ｈｒ超７１５ｃｍ／ｈｒ以下
（ｉｖ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）３５体積％超４０体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）１５００ｃｍ／ｈｒ超３９５０ｃｍ／ｈｒ以下
（ｖ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）３５体積％超４０体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）７１５ｃｍ／ｈｒ超１５００ｃｍ／ｈｒ以下
（ｖｉ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）３５体積％超４０体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）４７５ｃｍ／ｈｒ超７１５ｃｍ／ｈｒ以下
（ｖｉｉ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）２８体積％以上３４体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）１５００ｃｍ／ｈｒ超３９５０ｃｍ／ｈｒ以下
（ｖｉｉｉ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）２８体積％以上３４体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）を７１５ｃｍ／ｈｒ超１５００ｃｍ／ｈｒ以下
（ｉｘ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）２８体積％以上３４体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）４７５ｃｍ／ｈｒ超７１５ｃｍ／ｈｒ以下
送液ポンプの稼働空気圧は、スラリー濃度と最大吐出カラム線速度に応じて変化してもよい。
送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｉ）の場合、０．２０〜１ＭＰａであることが好ましく、０．２５〜０．８ＭＰａであることがより好ましい。
送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｉｉ）の場合、０．２０〜１ＭＰａであることが好ましく、０．２３〜０．８ＭＰａであることがより好ましい。
送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｉｉｉ）の場合、０．２７〜１ＭＰａであることが好ましく、０．２９〜０．８ＭＰａであることがより好ましい。送液ポンプの稼働空気圧を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。
送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｉｖ）の場合、０．３５〜１ＭＰａであることが好ましく、０．３８〜０．８ＭＰａであることがより好ましい。
送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｖ）の場合、０．４５〜１ＭＰａであることが好ましく、０．４８〜１ＭＰａであることがより好ましい。
送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｖｉ）の場合、０．３５〜１ＭＰａであることが好ましく、０．３８〜０．８ＭＰａであることがより好ましい。送液ポンプの稼働空気圧を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。
送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｖｉｉ）の場合、０．４５〜１ＭＰａであることが好ましく、０．４８〜０．８ＭＰａであることがより好ましい。
送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｖｉｉｉ）の場合、０．４５〜１ＭＰａであることが好ましく、０．４８〜０．８ＭＰａであることがより好ましい。
送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｉｘ）の場合、０．４５〜１ＭＰａであることが好ましく、０．４８〜０．８ＭＰａであることがより好ましい。送液ポンプの稼働空気圧を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。
大型カラム（円筒体）は、本発明の効果が得られるものであれば材質及び形状において特に制限されない。大型カラム（円筒体）は、直径３０ｃｍ以上２７０ｃｍ以下の内径を有し、直径４０ｃｍ以上２４０ｃｍ以下の内径を有することが好ましく、直径５０ｃｍ以上２００ｃｍ以下の内径を有することがより好ましく、直径６０ｃｍ以上１５０ｃｍ以下の内径を有することがさらに好ましい。
円筒体は、円筒体上部蓋体と円筒体底面部とこれらを接続する円筒形状を有していればよく、円筒体上部蓋体と円筒体下部との間に、円筒体の内周囲に沿って円盤体が配置されていてもよい。
円盤体は、円筒体上部蓋体側に近くなるように、円筒体上方に配設されていることが好ましい。当該円盤体下面には、スラリーを噴出するための噴出口を有するノズルが設置されていてもよい。円盤体は、使用するスラリーや必要とされる充填ベッド高さに応じて、上下方向に移動してもよい。
ノズルは、円盤体に１つ又は複数存在してもよく、円盤体に１つ存在することが好ましい。ノズルの噴出口の形状や構造は、スラリーによってノズルが詰まらない限り、特に制限されない。
円盤状フィルターは、円筒体底面部を横断していてもよく、円筒体底面部（この場合円筒体底面部は、円盤状フィルターを支持でき、溶媒を通液できる構造を有する）上にあってもよく、スラリーの担体と溶媒を分けることができるように、所定の孔径を有していればよい。カラム担体が円盤状フィルター上に堆積して充填ベッドが形成され、一方、スラリーの溶媒は円盤状フィルターの孔径を通過して、円筒体外部に排出される。
スラリーを大型カラム（円筒体）に充填する前に、カラム内をバッファで満たし、カラム内の空気を除去することが好ましい。前記バッファとしては水、０．２ｍｏｌ／Ｌの塩水等を用いることができる。その後、スラリーを送液ポンプでスラリータンクから円筒体に送液し、円筒体の円盤体下面のノズルからスラリーを噴霧することで、充填ベッドが形成される。
この手順中に過剰の液体はカラム出口から追い出されるが、多糖類カラム担体粒子はこれらの多糖類カラム担体粒子が通り抜けられないような小さい細孔を有するフィルター物質、いわゆる「ベッド支持体」によって保持される。その後、さらにカラムの平衡化のため、前記バッファをカラムに通液してもよい。
充填停止時のカラム圧は、スラリー濃度と最大吐出カラム線速度に応じて変化してもよい。充填停止時のカラム圧は、例えば、長野計器株式会社製サニタリタイプ防水型デジタル圧力計ＳＵ１を用いて測定可能である。
充填停止時のカラム圧は、前記（ｉ）の場合、０．０６〜０．５ＭＰａであることが好ましく、０．０９〜０．４ＭＰａであることがより好ましい。
充填停止時のカラム圧は、前記（ｉｉ）の場合、０．０６〜０．５ＭＰａであることが好ましく、０．０８〜０．４５ＭＰａであることがより好ましい。
充填停止時のカラム圧は、前記（ｉｉｉ）の場合、０．０６〜０．５ＭＰａであることが好ましく、０．０６〜０．２ＭＰａであることがより好ましい。充填停止時のカラム圧を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。
充填停止時のカラム圧は、前記（ｉｖ）の場合、０．２０〜０．５ＭＰａであることが好ましく、０．２１〜０．４ＭＰａであることがより好ましい。
充填停止時のカラム圧は、前記（ｖ）の場合、０．１８〜０．５ＭＰａであることが好ましく、０．１９〜０．３５ＭＰａであることがより好ましい。
充填停止時のカラム圧は、前記（ｖｉ）の場合、０．０８〜０．５ＭＰａであることが好ましく、０．０８〜０．３ＭＰａであることがより好ましく、０．１０〜０．２ＭＰａであることがさらに好ましい。充填停止時のカラム圧を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。
充填停止時のカラム圧は、前記（ｖｉｉ）の場合、０．２４〜０．５ＭＰａであることが好ましく、０．２６〜０．４ＭＰａであることがより好ましい。
充填停止時のカラム圧は、前記（ｖｉｉｉ）の場合、０．１９〜０．５ＭＰａであることが好ましく、０．２０〜０．３５ＭＰａであることがより好ましい。
充填停止時のカラム圧は、前記（ｉｘ）の場合、０．０９〜０．５ＭＰａであることが好ましく、０．０９〜０．３ＭＰａであることがより好ましく、０．１０〜０．２ＭＰａであることがさらに好ましい。充填停止時のカラム圧を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。
充填停止時のカラム線速度は、スラリー濃度と最大吐出カラム線速度に応じて変化してもよい。カラム線速度は、スラリーが送液ラインから大型カラムに導入される際の線速度であってもよく、スラリーが円盤体下面のノズル噴出口から噴出される際の線速度であってもよく、スラリーが大型カラムを通過した後の線速度であってもよい。カラム線速度は、好ましくはスラリーが大型カラムを通過した後の線速度であり、大型カラムの直後に接続される配管に設置された流量センサー（例えばクランプオン式流量センサー ＦＤ−Ｑ３２Ｃ 株式会社キーエンス製）で計測してもよい。
充填停止時のカラム線速度は、前記（ｉ）の場合、１００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、４００ｃｍ／ｈｒ以上１２００ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。
充填停止時のカラム線速度は、前記（ｉｉ）の場合、１００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、３００ｃｍ／ｈｒ以上１１００ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。
充填停止時のカラム線速度は、前記（ｉｉｉ）の場合、１００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、１００ｃｍ／ｈｒ以上１３００ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましく、２００ｃｍ／ｈｒ以上１０００ｃｍ／ｈｒ以下であることがさらに好ましい。充填停止時のカラム線速度を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。
充填停止時のカラム線速度は、前記（ｉｖ）の場合、７８０ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、８００ｃｍ／ｈｒ以上１２００ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。
充填停止時のカラム線速度は、前記（ｖ）の場合、７２０ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、７６０ｃｍ／ｈｒ以上１２００ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。
充填停止時のカラム線速度は、前記（ｖｉ）の場合、４００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、４００ｃｍ／ｈｒ以上１３００ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましく、４５０ｃｍ／ｈｒ以上１０００ｃｍ／ｈｒ以下であることがさらに好ましい。充填停止時のカラム線速度を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。
充填停止時のカラム線速度は、前記（ｖｉｉ）の場合、８００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、８５０ｃｍ／ｈｒ以上１２００ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。
充填停止時のカラム線速度は、前記（ｖｉｉｉ）の場合、７２０ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、７４０ｃｍ／ｈｒ以上１１００ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。
充填停止時のカラム線速度は、前記（ｉｘ）の場合、４５０ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、４５０ｃｍ／ｈｒ以上１３００ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましく、５００ｃｍ／ｈｒ以上１０００ｃｍ／ｈｒ以下であることがさらに好ましい。充填停止時のカラム線速度を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。
本発明は、上記の如くｐａｃｋ ｉｎ ｐｌａｃｅ法であって、スラリーの担体濃度範囲（Ａ）、ポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）、及びベッド形成終了時の充填圧と充填ベッド高さの比（充填圧／充填ベッド高さ）（Ｃ）を制御して、下記カラム性能評価法に従って得られるクロマトグラムが、形状：シングルピーク、理論段数：１５００以上、アシンメトリー：０．７以上１．７以下となる充填ベッドを製造する方法であることを特徴とする。
本発明において、スラリーの担体濃度範囲（Ａ）、最大吐出カラム線速度（Ｂ）、ベッド形成終了時の充填圧と充填ベッド高さの比（Ｃ）（充填停止時カラム圧／ベッド高）の最適な組み合わせは以下の通りである。
前記（ｉ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００５ＭＰａ／ｃｍ以上０．０２５ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい；
前記（ｉｉ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００２ＭＰａ／ｃｍ以上０．０２５ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい；又は
前記（ｉｉｉ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００２８ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００２８ＭＰａ／ｃｍ以上０．０２５ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい。
充填圧／充填ベッド高さの比が小さいと、クロマトピークがシングルピークとならない場合がある。
前記（ｉｖ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．０１０ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．０１０５ＭＰａ／ｃｍ以上０．０２５ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい；
前記（ｖ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００９ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００９５ＭＰａ／ｃｍ以上０．０２５ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい；又は
前記（ｖｉ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００４ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００４５ＭＰａ／ｃｍ以上０．０２５ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい。
充填圧／充填ベッド高さの比が小さいと、クロマトピークがシングルピークとならない場合がある。
前記（ｖｉｉ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．０１１５ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．０１２０ＭＰａ／ｃｍ以上０．０２５ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい；
前記（ｖｉｉｉ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００９５ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．０１０ＭＰａ／ｃｍ以上０．０２５ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい；又は
前記（ｉｘ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００５ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００５５ＭＰａ／ｃｍ以上０．０２５ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい。
充填圧／充填ベッド高さの比が小さいと、クロマトピークがシングルピークとならない場合がある。
この様にして得られた充填ベッドは、次にカラム性能評価に供されてもよく、バッファを通液して充填ベッドを平衡化してもよい。
カラム性能評価では、カラム充填評価マーカーを用いてクロマトグラムのピーク形状を評価する。用いるカラム充填評価マーカーとしては、０．５ｍｏｌ／Ｌの塩水、１０ｍｇ／ｍｌのアセトン水溶液等が挙げられる。
上記カラム充填評価マーカーをカラムに注入し、バッファをカラムに通液する。カラム通過液の電気伝導度を検知し、クロマトグラムのピーク形状を評価する。
電気伝導度は、例えば導電率センサ（マイクロゼロ社製、ＭＺＳ２０６）等により求めることができる。
（カラム性能評価法）
ピーク形成用試料：濃度０．５ｍｏｌ／Ｌの塩水又は濃度１０ｍｇ／ｍＬのアセトン水
試料チャージ量：０．５〜５Ｌ、好ましくは０．８〜２Ｌ
移動相：水又は０．２ｍｏｌ／Ｌの塩水
移動相線速：１２〜１２０ｃｍ／ｈｒ、好ましくは２４〜６０ｃｍ／ｈｒ
検知：電気伝導度
得られたクロマトグラムのピーク形状の歪さは下記式で評価することができる。
シングルピークを表すガウス分布式
Figure 2021113681
ピーク形状の歪さは複数ピークが重なっていると考え、次式でフィッティングし、ピーク分割を行う。
Figure 2021113681
上記式中、Ｈ0、Ｈ01、Ｈ02はピーク高さを、tc、ｔc1、ｔc2はピークトップ位置を、σ0、σ01、σ02はピーク幅を表している。ピーク高さが最も高いピーク（メインピークとする）のピーク面積を全ピーク面積で割り、ピーク形状の歪さを評価する。メインピーク面積（エリア）／全ピーク面積（エリア）の値が１である場合、クロマトピークがシングルピークとみなされる。
メインピーク面積／全ピーク面積の値が１であるものは、カラム高１ｍあたりの理論段数とアシンメトリーを次式で評価する。
Figure 2021113681
Figure 2021113681
上記式中、σ0.5はピーク半分高さの幅、Ｌはカラム高を表している。ｔa、ｔbはピーク高さ１０％の位置で、ｔa＜ｔc、ｔb＞ｔcである。
本発明の製造方法で得られる充填ベッドは上記評価方法で評価した際のクロマトピークがシングルピークであり、かつ理論段数が１５００以上（好ましくは１７００以上）、アシンメトリーが０．７以上１．７以下（好ましくは０．７５以上１．６以下）であることが望ましい。
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
多糖類カラム担体としてスラリー濃度５０体積％のプロテインＡ担体（Ｋａｎｅｋａ ＫａｎｃａｐＡ）をスラリータンクに２７０Ｌ調製した。Ｋａｎｅｋａ ＫａｎｃａｐＡは、累積体積分布の中間粒径として平均粒子径８０μｍのプロテインＡ担体である。スラリー溶媒、バッファは水を使用した。スラリー濃度はスラリータンクよりサンプリングし、１００ｍＬのメスシリンダーにスラリーをいれ、一晩沈降させることで測定した。その際に、メスシリンダーはシンフォニアテクノロジー株式会社製バイブレトリーパッカＶＰ−４Ｄを使用し、タッピングした。
スラリータンク中のスラリーは佐竹化学機械株式会社製ポータブルミキサーＡ７４０を使用して攪拌した。
スラリーは、バッファでカラム内を空気抜きされたＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製クロマフローカラムに送液した。クロマフローカラムはカラム径８０ｃｍのものを使用し、ベッド高は２０ｃｍに設定した。スラリーの送液はタプフロー社製ダイヤフラムポンプＴＨＵ２０３（内径８０ｃｍのカラムに対する最大吐出カラム線速度３９５０ｃｍ／ｈｒ）を使用した。ポンプ駆動のための圧縮空気は日立社製マルチドライブスクロールＳＲＬ−１５ＤＭＮ６を用いて作製し、ポンプ駆動空気圧はレギュレーターで表１に示す値に調整した。スラリーがカラム内に送液されていくにつれ、充填ベッドが形成された。充填ベッドの形成は目視で確認し、充填中のベッド高が１９．５ｃｍに到達したところで、スラリーの送液を停止した。充填中又は充填停止時のカラム圧力は、長野計器株式会社製サニタリタイプ防水型デジタル圧力計ＳＵ１で測定し、カラム出口から追い出された水の流量や充填停止時カラム線速度はキーエンス社製クランプオン式流量センサーＦＤ−Ｑ３２Ｃで検知した。充填終了後、ＴＥＫＮＯＦＬＯＷ社製ロータリーポンプＬＡＢＴＯＰ４５０を使用し、２カラム体積分のバッファを流し、カラムの平衡化を行うことで、充填ベッドを得た。
その後、０．５ｍｏｌ／Ｌの塩水をカラムに１Ｌ注入し、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製チューブポンプＰｒｏＦｌｕｘＭ１２により４８ｃｍ／ｈｒの速度で通液することで、カラム性能を評価した。具体的には、カラム出口より追い出されたバッファの電気伝導度をマイクロゼロ社製の導電率センサ（ＭＺＳ２０６）で測定し、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表１に結果を記す。また、ポンプ稼動空気圧０．５０ＭＰaで調製した充填ベッドで評価した場合のピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を図２に記す。
Figure 2021113681
実施例２
スラリー濃度を６０体積％、スラリー体積を２２４Ｌとした以外は実施例１と同様の方法、条件により充填ベッドを得、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表２に結果を記す。
Figure 2021113681
実施例３
スラリー濃度を４０体積％、スラリー体積を３４３Ｌとした以外は実施例１と同様の方法、条件により充填ベッドを得、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表３に結果を記す。
Figure 2021113681
比較例１
充填停止時カラム圧／ベッド高を０．００９ＭＰａ／ｃｍ以下とした以外は実施例３と同様の方法、条件により充填ベッドを得、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表４に結果を記す。また、得られた歪なピーク例を図３に示す。メインピークエリア／全ピークエリアが１より小さくなり、ピーク形状がシングルピークとならなかった。
Figure 2021113681
実施例４
スラリー濃度を３４体積％、スラリー体積を３９２Ｌとした以外は実施例１と同様の方法、条件により充填ベッドを得、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表５に結果を記す。
Figure 2021113681
比較例２
充填停止時カラム圧／ベッド高を０．０１１ＭＰａ／ｃｍ以下とした以外は実施例４と同様の方法、条件により充填ベッドを得、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表６に結果を記す。メインピークエリア／全ピークエリアが１より小さくなり、ピーク形状がシングルピークとならなかった。
Figure 2021113681
実施例５
スラリー濃度を２８体積％、スラリー体積を４７６Ｌとした以外は実施例４と同様の方法、条件により充填ベッドを得、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表７に結果を記す。
Figure 2021113681
比較例３
充填停止時カラム圧／ベッド高を０．０１１ＭＰａ／ｃｍ以下とした以外は実施例５と同様の方法、条件により充填ベッドを得、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表８に結果を記す。メインピークエリア／全ピークエリアが１より小さくなり、ピーク形状がシングルピークとならなかった。図４に実施例１から５、比較例１から３の結果を記す。スラリー濃度が高くなるほど、充填停止時カラム圧／ベッド高の値が高くなるほど、シングルピークが得られやすいことが示される。
Figure 2021113681
実施例６
ダイヤフラムポンプをタプフロー社製Ｔ−１００（内径８０ｃｍのカラムに対する最大吐出カラム線速１５００ｃｍ／ｈｒ）とした以外は実施例１と同様の方法、条件により充填ベッドを得、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表９に結果を記す。
Figure 2021113681
実施例７
スラリー濃度を４０体積％、スラリー体積を３４３Ｌとした以外は実施例６と同様の方法、条件により充填ベッドを得、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表１０に結果を記す。
Figure 2021113681
比較例４
充填停止時カラム圧／ベッド高を０．００８ＭＰａ／ｃｍ以下とした以外は実施例６と同様の方法、条件により充填ベッドを得、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表１１に結果を記す。メインピークエリア／全ピークエリアが１より小さくなり、ピーク形状がシングルピークとならなかった。
Figure 2021113681
実施例８
スラリー濃度を３４体積％、スラリー体積を３９２Ｌとした以外は実施例６と同様の方法、条件により充填ベッドを得、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表１２に結果を記す。
Figure 2021113681
比較例５
充填停止時カラム圧／ベッド高を０．００８ＭＰａ／ｃｍ以下とした以外は実施例８と同様の方法、条件により充填ベッドを得、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表１３に結果を記す。メインピークエリア／全ピークエリアが１より小さくなり、ピーク形状がシングルピークとならなかった。
Figure 2021113681
実施例９
スラリー濃度を２８体積％、スラリー体積を４７６Ｌとした以外は実施例６と同様の方法、条件により充填ベッドを得、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表１４に結果を記す。
Figure 2021113681
比較例６
充填停止時カラム圧／ベッド高を０．００９ＭＰａ／ｃｍ以下とした以外は実施例９と同様の方法、条件により充填ベッドを得、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表１５に結果を記す。メインピークエリア／全ピークエリアが１より小さくなり、ピーク形状がシングルピークとならなかった。図５に実施例６から９、比較例４から６の結果を記す。ダイヤフラムポンプをタプフロー社製Ｔ−１００に変えてもスラリー濃度が高くなるほど、充填停止時カラム圧／ベッド高の値が高くなるほど、シングルピークが得られやすいことが示される。
Figure 2021113681
実施例１０
ダイヤフラムポンプをタプフロー社製Ｔ−５０（内径８０ｃｍのカラムに対する最大吐出カラム線速７１５ｃｍ／ｈｒ）とした以外は実施例１と同様の方法、条件により充填ベッドを得、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表１６に結果を記す。
Figure 2021113681
実施例１１
スラリー濃度を６０体積％、スラリー体積を２２４Ｌとした以外は実施例１０と同様の方法、条件により充填ベッドを得、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表１７に結果を記す。
Figure 2021113681
実施例１２
スラリー濃度を４０体積％、スラリー体積を３４３Ｌとした以外は実施例１０と同様の方法、条件により充填ベッドを得、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表１８に結果を記す。
Figure 2021113681
比較例７
充填停止時カラム圧／ベッド高を０．００３３ＭＰａ／ｃｍ以下とした以外は実施例１２と同様の方法、条件により充填ベッドを得、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表１９に結果を記す。メインピークエリア／全ピークエリアが１より小さくなり、ピーク形状がシングルピークとならなかった。
Figure 2021113681
実施例１３
スラリー濃度を３４体積％、スラリー体積を３９２Ｌとした以外は実施例１０と同様の方法、条件により充填ベッドを得、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表２０に結果を記す。
Figure 2021113681
比較例８
充填停止時カラム圧／ベッド高を０．００４３ＭＰａ／ｃｍ以下とした以外は実施例１３と同様の方法、条件により充填ベッドを得、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表２１に結果を記す。図６に実施例１０から１３、比較例７から８の結果を記す。ダイヤフラムポンプをタプフロー社製Ｔ−５０に変えてもスラリー濃度が高くなるほど、充填停止時カラム圧／ベッド高の値が高くなるほど、シングルピークが得られやすいことが示される。
Figure 2021113681
１：スラリー
２：スラリータンク
３：スラリー送液ライン
４：送液ポンプ
５：上部蓋体
６：円筒体
７：底面部
８：円盤体
９：円盤状フィルター
１０：ノズル
１１：排出ライン
２０：カラムパッキング装置

Claims (5)

  1. 直径３０ｃｍ以上２７０ｃｍ以下の内径を有する円筒体と、該円筒体内下部を横断する円盤状フィルターと、該フィルターの上方に配設された円盤体と、この円盤体下面に噴出口を有するノズルとを備えたカラムパッキング装置を用い、多糖類カラム担体を含むスラリーをポンプ圧送して前記ノズルから噴出させ、円盤状フィルターの上に該担体の充填ベッドを製造する方法であって、
    前記スラリーの担体濃度範囲（Ａ）、前記ポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）、及びベッド形成終了時の充填圧と充填ベッド高さの比（充填圧／充填ベッド高さ）（Ｃ）を制御して、下記カラム性能評価法に従って得られるクロマトグラムが、形状：シングルピーク、理論段数：１５００以上、アシンメトリー：０．７以上１．７以下となる充填ベッドを製造する方法。
    （カラム性能評価法）
    ピーク形成用試料：濃度０．５ｍｏｌ／Ｌの塩水又は濃度１０ｍｇ／ｍＬのアセトン水
    試料チャージ量：１．０Ｌ
    移動相：水又は０．２ｍｏｌ／Ｌの塩水
    移動相線速：４８ｃｍ／ｈｒ
    検知：電気伝導度
  2. 前記濃度範囲（Ａ）を４０体積％超８０体積％以下とし、かつ前記最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲と、前記充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）の範囲を下記の組み合わせにする請求項１に記載の製造方法。
    最大吐出カラム線速度（Ｂ）を１５００ｃｍ／ｈｒ超３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とする；
    最大吐出カラム線速度（Ｂ）を７１５ｃｍ／ｈｒ超１５００ｃｍ／ｈｒ以下とし、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とする；又は
    最大吐出カラム線速度（Ｂ）を４７５ｃｍ／ｈｒ超７１５ｃｍ／ｈｒ以下とし、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００２８ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とする
  3. 前記濃度範囲（Ａ）を３５体積％超４０体積％以下とし、かつ前記最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲と、前記充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）の範囲を下記の組み合わせにする請求項１に記載の製造方法。
    最大吐出カラム線速度（Ｂ）を１５００ｃｍ／ｈｒ超３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．０１０ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とする；
    最大吐出カラム線速度（Ｂ）を７１５ｃｍ／ｈｒ超１５００ｃｍ／ｈｒ以下とし、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００９ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とする；又は
    最大吐出カラム線速度（Ｂ）を４７５ｃｍ／ｈｒ超７１５ｃｍ／ｈｒ以下とし、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００４ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とする
  4. 前記濃度範囲（Ａ）を２８体積％以上３４体積％以下とし、かつ前記最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲と、前記充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）の範囲を下記の組み合わせにする請求項１に記載の製造方法。
    最大吐出カラム線速度（Ｂ）を１５００ｃｍ／ｈｒ超３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．０１１５ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とする；
    最大吐出カラム線速度（Ｂ）を７１５ｃｍ／ｈｒ超１５００ｃｍ／ｈｒ以下とし、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００９５ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とする；又は
    最大吐出カラム線速度（Ｂ）を４７５ｃｍ／ｈｒ超７１５ｃｍ／ｈｒ以下とし、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００５ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とする
  5. 前記多糖類カラム担体が、累積体積分布の中間粒径として平均粒子径５０〜１００μｍを有する、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
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