JP2021105523A - 脈動抑制により多糖類カラム担体が大型カラムに充填された充填ベッドの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、スラリーを送液することにより大型カラムに担体を充填する方法において、再現性よく良好なクロマトピークを得ることのできる充填ベッドを確実に製造する方法を提供することを目的としている。【解決手段】直径３０ｃｍ以上２７０ｃｍ以下の内径を有する円筒体と、該円筒体内下部を横断する円盤状フィルターと、該フィルターの上方に配設された円盤体と、この円盤体下面に噴出口を有するノズルとを備えたカラムパッキング装置を用い、多糖類カラム担体を含むスラリーをポンプ圧送して前記ノズルから噴出させ、円盤状フィルターの上に該担体の充填ベッドを製造する方法であって、ポンプ脈動抑制装置を取り付けるか、無脈動ポンプを用いるか、それらの両方を採用するかのいずれかによって前記スラリーのポンプ圧送時の脈動を抑制することを特徴とする充填ベッドの製造方法。【選択図】図１

Description

本発明は、多糖類カラム担体を大型カラムへ充填し、充填ベッドを製造するための方法に関する。

バイオセパレーション分野では、目的物精製のためにカラムクロマトグラフィーが用いられることが多い。通例、カラム担体は、カラムにポンプ送液、注入又は吸引された離散粒子の懸濁液（スラリーとして知られる）を圧密化することにより形成され、いわゆる、充填ベッドとしてカラム内に収容される。

他方、大型カラムのような大規模なカラムは、規定の濃度の担体粒子を有する所定の体積のスラリーをカラム内に吸引又は注入することによって製造される。例えばカラム下部からスラリーを導入してカラム上部とカラム下部との間に設置された可動アダプターを下方に移動させることにより、スラリー中の液体を外部に排出して充填ベッドを形成したり、または、スプレーノズルを利用して、カラム内上部よりスラリーをカラム内に噴霧し、カラム下部より液体を排出することにより、充填ベッドを形成させたりする（特許文献１）。

この様に、この手順中に過剰の液体はカラム出口から追い出されるが、担体粒子はこれらの担体粒子が通り抜けられないような小さい細孔を有するフィルター物質、いわゆる「ベッド支持体」によって保持されることになる。その後、充填ベッドが最適な圧縮度で圧縮されたらパッキングプロセスは終了である。

特表２０１１−５２２２４８号公報

上記特許文献１に記載される充填手法はｐａｃｋ ｉｎ ｐｌａｃｅ法とも呼ばれているが、当該方法では特に大型カラムでは良好なクロマトピークを得ることが容易ではなく、何回かの再充填を繰り返し、担体充填を完了させていることが実状である。実際、特許文献１では、一度充填されたベッドを破壊して再度スラリーを充填してベッドを形成することにより、スラリー濃度を適切な濃度に希釈することが開示されている。

また、スラリーを送液するポンプにはエアードダイヤフラムポンプが通常用いられているが、大型カラムになるほどポンプに供給する空気量が多く要求され、大型のエアーコンプレッサーが必要とされるなど、カラム付帯設備費用が高価になるという問題がある。

上記問題に鑑み、本発明は、スラリーを送液することにより大型カラムに担体を充填する方法において、再現性よく良好なクロマトピークを得ることのできる充填ベッドを確実に製造する方法を提供することを目的としている。本発明は、好ましくはポンプ稼動のための空気量が少なくても、再現性よく良好なクロマトピークを持った充填ベッドを確実に製造する方法を提供することを目的としている。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、スラリーを送液するポンプの脈動を抑制することで再現性よく確実に良好なクロマトピークを得ることのできる充填ベッドが形成されることを見出し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明は、直径３０ｃｍ以上２７０ｃｍ以下の内径を有する円筒体と、該円筒体内下部を横断する円盤状フィルターと、該フィルターの上方に配設された円盤体と、この円盤体下面に噴出口を有するノズルとを備えたカラムパッキング装置を用い、多糖類カラム担体を含むスラリーをポンプ圧送して前記ノズルから噴出させ、円盤状フィルターの上に該担体の充填ベッドを製造する方法であって、
ポンプ脈動抑制装置を取り付けるか、無脈動ポンプを用いるか、それらの両方を採用するかのいずれかによって前記スラリーのポンプ圧送時の脈動を抑制することを特徴とする充填ベッドの製造方法に関する。

本発明において、下記カラム性能評価法に従って得られるクロマトグラムが、形状：シングルピーク、理論段数：１５００以上、アシンメトリー：０．７以上１．７以下となる充填ベッドを製造することが好ましい。
（カラム性能評価法）
ピーク形成用試料：濃度０．５ｍｏｌ／Ｌの塩水又は濃度１０ｍｇ／ｍＬのアセトン水
試料チャージ量：１．０Ｌ
移動相：水又は０．２ｍｏｌ／Ｌの塩水
移動相線速：４８ｃｍ／ｈｒ
検知：電気伝導度

本発明において、脈動抑制装置が、パルセーションダンパー、又はアキュムレーターであることが好ましく、無脈動ポンプが、クワトロダイヤフラムポンプ、ギヤポンプ、マグネットポンプ、モーノポンプ、又はスムーズフローポンプであることも好ましい。

本発明では、スラリーの担体濃度範囲（Ａ）を２８体積％以上８０体積％以下とし、ポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を４７５ｃｍ／ｈｒ以上３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、ベッド形成終了時の充填圧と充填ベッド高さの比（充填圧／充填ベッド高さ）（Ｃ）の範囲を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることも好ましい。

本発明の好ましい態様において、以下のいずれかの条件で行う。
（Ｉ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）が３５体積％以上８０体積％以下であってポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を４７５ｃｍ／ｈｒ以上３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、ポンプ稼働空気圧を０．１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下とする
（ＩＩ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）が２８体積％以上３５体積％未満であってポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を７１５ｃｍ／ｈｒ超３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、ポンプ稼働空気圧を０．１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下とする
（ＩＩＩ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）が２８体積％以上３５体積％未満であってポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を４７５ｃｍ／ｈｒ以上７１５ｃｍ／ｈｒ以下とし、ポンプ稼働空気圧を０．３８ＭＰａ以上１ＭＰａ以下とする

本発明において、多糖類カラム担体が、累積体積分布の中間粒径としての平均粒子径５０〜１００μｍを有することも好ましい態様である。

本発明によれば、スラリーを送液することにより大型カラムに担体を充填する方法において、再現性よく良好なクロマトピークを得ることのできる充填ベッドを確実に製造することが可能となる。また、本発明の好ましい態様により、ポンプ稼動のための空気量が少なくても、再現性よく良好なクロマトピークを持った充填ベッドを確実に製造することも可能である。

図１は、ｐａｃｋ ｉｎ ｐｌａｃｅ法に用いられるカラムパッキング装置の例である。 図２は、良好なクロマトピークを示す実施例１のクロマトグラムである。 図３は、歪なクロマトピークを示す比較例１のクロマトグラムである。 図４は、実施例１〜３、比較例１〜２における、充填停止時カラム圧／ベッド高とメインピークエリア／全ピークエリアとの関係を示す図である。 図５は、実施例４〜６、比較例３〜４における、充填停止時カラム圧／ベッド高とメインピークエリア／全ピークエリアとの関係を示す図である。 図６は、実施例７〜９、比較例５〜７における、充填停止時カラム圧／ベッド高とメインピークエリア／全ピークエリアとの関係を示す図である。

本発明は、直径３０ｃｍ以上２７０ｃｍ以下の内径を有する円筒体と、該円筒体内下部を横断する円盤状フィルターと、該フィルターの上方に配設された円盤体と、この円盤体下面に噴出口を有するノズルとを備えたカラムパッキング装置を用い、セルロースカラム担体を含むスラリーをポンプ圧送して前記ノズルから噴出させ、円盤状フィルターの上に該担体の充填ベッドを製造する方法（以下、ｐａｃｋ ｉｎ ｐｌａｃｅ法ともいう）に関するものである。

本発明で使用されるｐａｃｋ ｉｎ ｐｌａｃｅ法について図を参照して説明する。
カラムパッキング装置２０は、例えば、スラリータンク２と、大型カラム（円筒体６）と、スラリータンク２と円筒体６を接続するスラリー送液ライン３と、スラリー送液ライン３上の送液ポンプ４と、送液ポンプ４に直列に接続される脈動抑制装置１２から構成される。スラリータンク２には、所定の担体と溶媒を含むスラリー１が収容されており、送液ポンプ４及び脈動抑制装置１２により、スラリー送液ライン３を通じて円筒体６に送液（圧送）される。

円筒体６は、例えば、円筒体６上端に設置される上部蓋体５、円筒体６内に収容される円盤体８、円盤体８下面に設置されるノズル１０、円筒体６内に収容されかつ前記円盤体８よりも下方に配設される円盤状フィルター９、円筒体６下端を構成する底面部７、及び前記円盤状フィルター９よりも下方で円筒体６に接続する（図示例では円筒体底面部７に接続する）排出ライン１１から構成される。円筒体６の内部は、スラリー１を送液する前に、所定の溶媒で満たされていてもよく、送液されたスラリー１は、上部蓋体５から流入し、円盤体８下面のノズル１０の噴出口から噴霧される。
噴霧されたスラリー１の担体は、円筒体６内部において、底面部７の上に配置され、担体の粒径よりも小さい粒径を有する円盤状フィルター９上に堆積して圧密化される。
一方、スラリー１の溶媒は、円盤状フィルター９を通り抜けて、排出ライン１１から円筒体６の外部に排出される。スラリー１の送液は、所定の充填ベッド高が形成されるまで、行えばよい。

スラリータンクは、スラリーを収容することができる限り、金属、プラスチック等から形成されてもよく、スラリータンクの形状は、円筒形、直方体形、球形等の任意の形状であってもよい。

スラリーは、所定のカラム担体と溶媒の混合物であればよい。多糖類カラム担体としては、セルロースカラム担体等が挙げられるが、イオン交換カラム担体（カチオン交換カラム担体、アニオン交換カラム担体）、シリカカラム担体等であってもよい。中でも、セルロースカラム担体が好ましい。
セルロースカラム担体としては、本発明の効果が得られるものであれば特に制限されないが、例えば、Ｋａｎｅｋａ ＫｎｃａｐＡ、Ｋａｎｅｋａ ＫａｎｃａｐＡ３Ｇなどが挙げられる。
多糖類カラム担体（好ましくはセルロースカラム担体）は、累積体積分布の中間粒径としての平均粒子径５０〜１００μｍを有することが好ましく、該平均粒子径６０〜９０μｍを有することがより好ましい。上記スラリーは、多糖類カラム担体をまず、分散溶媒に分散させて調製すればよく、従来公知の分散剤を添加してもよい。

溶媒は、例えば、水系溶媒；アルコール系溶媒、エステル系溶媒、エーテル系溶媒などの有機溶媒等であってもよく、好ましくは水系溶媒、アルコール系溶媒であり、より好ましくは水、または水とエタノールの混和溶媒である。水とエタノールの混和溶媒はエタノール濃度が３０体積％以下であることが好ましい。

スラリータンクに収容されるスラリーのスラリー濃度は、１０体積％以上、８０体積％以下であることが好ましく、１５体積％以上、７５体積％以下であることがより好ましく、２０体積％以上、７０体積％以下であることがさらに好ましく、２０体積％以上、６５体積％以下であることがさらにより好ましく、２８体積％以上、３４体積％以下、３５体積％以上、４０体積％以下、又は４１体積％以上、６０体積％以下であることがさらにより一層好ましい。
１０体積％未満のスラリー濃度では、大きなスラリータンク容量が要求され、８０体積％超のスラリー濃度ではスラリー粘度が高くなるため、下記で説明するポンプでの送液が容易ではなくなる。なお、スラリー濃度はスラリータンクよりスラリーをサンプリングし、多糖類カラム担体を沈降、タッピングし、多糖類カラム担体沈降体積を全液量体積で割った値で評価することができる。

スラリー送液ラインは、スラリータンクと円筒体を接続するものであれば特に限定されないが、金属、プラスチック等の材料から構成される管状構造を有することが好ましい。

送液ポンプは、容積式ポンプであってもよい。
容積式ポンプとしては、ピストンポンプ、プランジャーポンプ、ダイヤフラムポンプ、ウイングポンプ等の往復動ポンプ、偏心ポンプ、ねじポンプ等の回転ポンプ等が挙げられる。

中でも、往復動ポンプが好ましく、ダイヤフラムポンプがより好ましい。ダイヤフラムポンプは、逆止弁の働きによって液の吸引と吐出が交互に行われるものであればよい。

ダイヤフラムポンプとしては、例えば、タプフロー社製ダイヤフラムポンプＴＨＵ２０３、タプフロー社製Ｔ−１００、タプフロー社製Ｔ−２００、タプフロー社製Ｔ−４００、タプフロー社製Ｔ−８００、タプフロー社製Ｔ−５０等が挙げられる。

送液ポンプの圧力、送液速度、送液量等の条件は、例えば、送液ポンプの稼働空気圧、ポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）、充填停止時のカラム圧、充填停止時のカラム線速度、及びベッド形成終了時の充填圧と充填ベッド高さの比（充填圧／充填ベッド高さ）[充填停止時カラム圧／ベッド高ともいう]（Ｃ）等が後述の範囲となるように調節すればよい。

本発明において、送液ポンプの稼働空気圧、充填停止時のカラム圧、充填停止時のカラム線速度、及びベッド形成終了時の充填圧と充填ベッド高さの比（充填圧／充填ベッド高さ）（Ｃ）の条件は、スラリーの担体濃度範囲（Ａ）と最大吐出カラム線速度（Ｂ）と共に表されてもよい。

スラリーの担体濃度範囲（Ａ）と最大吐出カラム線速度（Ｂ）の組み合わせは、以下の通りであり、これらの組み合わせを（ｉ）〜（ｉｘ）として標記する場合がある。
（ｉ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）４０体積％超８０体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）１５００ｃｍ／ｈｒ超３９５０ｃｍ／ｈｒ以下
（ｉｉ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）４０体積％超８０体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）７１５ｃｍ／ｈｒ超１５００ｃｍ／ｈｒ以下
（ｉｉｉ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）４０体積％超８０体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）４７５ｃｍ／ｈｒ超７１５ｃｍ／ｈｒ以下
（ｉｖ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）３５体積％超４０体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）１５００ｃｍ／ｈｒ超３９５０ｃｍ／ｈｒ以下
（ｖ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）３５体積％超４０体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）７１５ｃｍ／ｈｒ超１５００ｃｍ／ｈｒ以下
（ｖｉ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）３５体積％超４０体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）４７５ｃｍ／ｈｒ超７１５ｃｍ／ｈｒ以下
（ｖｉｉ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）２８体積％以上３４体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）１５００ｃｍ／ｈｒ超３９５０ｃｍ／ｈｒ以下
（ｖｉｉｉ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）２８体積％以上３４体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）を７１５ｃｍ／ｈｒ超１５００ｃｍ／ｈｒ以下
（ｉｘ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）２８体積％以上３４体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）４７５ｃｍ／ｈｒ超７１５ｃｍ／ｈｒ以下

本発明で使用されるｐａｃｋ ｉｎ ｐｌａｃｅ法では、スラリーの担体濃度範囲（Ａ）を２８体積％以上８０体積％以下とし、ポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を４７５ｃｍ／ｈｒ以上３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、ベッド形成終了時の充填圧と充填ベッド高さの比（充填圧／充填ベッド高さ）（Ｃ）の範囲を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、以下のいずれかの条件で行うことがより好ましい。

（Ｉ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）が３５体積％以上８０体積％以下であってポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を４７５ｃｍ／ｈｒ以上３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、ポンプ稼働空気圧を０．１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下とする
（ＩＩ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）が２８体積％以上３５体積％未満であってポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を７１５ｃｍ／ｈｒ超３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、ポンプ稼働空気圧を０．１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下とする
（ＩＩＩ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）が２８体積％以上３５体積％未満であってポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を４７５ｃｍ／ｈｒ以上７１５ｃｍ／ｈｒ以下とし、ポンプ稼働空気圧を０．３８ＭＰａ以上１ＭＰａ以下とする

送液ポンプの稼働空気圧は、スラリー濃度と最大吐出カラム線速度に応じて変化してもよい。

送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｉ）の場合、０．１〜１ＭＰａであることが好ましく、０．２〜０．８ＭＰａであることがより好ましい。
送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｉｉ）の場合、０．１〜１ＭＰａであることが好ましく、０．２〜０．８ＭＰａであることがより好ましい。
送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｉｉｉ）の場合、０．１〜１ＭＰａであることが好ましく、０．２６９ＭＰａ以下であることがより好ましい。送液ポンプの稼働空気圧を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。

送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｉｖ）の場合、０．１〜１ＭＰａであることが好ましく、０．３４９ＭＰａ以下であることがより好ましい。
送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｖ）の場合、０．１〜１ＭＰａであることが好ましく、０．４４９ＭＰａ以下であることがより好ましい。
送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｖｉ）の場合、０．１〜１ＭＰａであることが好ましく、０．３４９ＭＰａ以下であることがより好ましい。送液ポンプの稼働空気圧を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。

送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｖｉｉ）の場合、０．１〜１ＭＰａであることが好ましく、０．４４９ＭＰａ以下であることがより好ましい。
送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｖｉｉｉ）の場合、０．１〜１ＭＰａであることが好ましく、０．４４９ＭＰａ以下であることがより好ましい。
送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｉｘ）の場合、０．３８〜１ＭＰａであることが好ましく、０．４４９ＭＰａ以下であることがより好ましい。送液ポンプの稼働空気圧を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。

本発明は、上記のｐａｃｋ ｉｎ ｐｌａｃｅ法において、ポンプ脈動抑制装置を取り付けるか、無脈動ポンプを用いるか、それらの両方を採用するかのいずれかによってスラリーのポンプ圧送時の脈動を抑制することを特徴とする。
多糖類カラム担体を送液ポンプによりカラムに充填する際には、ポンプ脈動を抑制することにより、再現性よく良好なクロマトピークが得られる充填ベッドが得られる。

ポンプ脈動を抑制する方法としては、送液ポンプと大型カラムのライン間に脈動抑制装置を設置することが挙げられる。脈動抑制装置は、例えば、送液ポンプ吐出側の配管に連結され、吸引及び吐出時の圧変動や量変動を均一にするように、吐出量や吐出圧力の瞬時的変動を窒素ガスが封入されたブラダやエアーチャンバー等によって緩和する装置であればよい。

具体的な脈動抑制装置としてパルセーションダンパー、アキュムレーター等が使用できる。脈動抑制装置は、送液ポンプに対して１つ又は複数を直列又は並列につないでもよい。脈動抑制装置は、例えば直径１０〜１００ｍｍ程度、好ましくは直径１０〜６０ｍｍを有する管状構造を有しており、この管状構造を介して送液ポンプ側のラインと大型カラム側のラインとが接続されていてもよい。

脈動抑制装置としては、パルセーションダンパー（ＤＴ２００ＰＴ（直径４５ｍｍの管状構造を有し、当該管状構造を介して送液ポンプ側と大型カラム側を接続する） タプフロー社製、ＰＤ５０ＰＴＴ（直径１９ｍｍの管状構造を有し、当該管状構造を介して送液ポンプ側と大型カラム側を接続する） タプフロー社製、ＡＤ−ＴＴＮシリーズ 株式会社ヤマダコーポレーション製、ＡＤシリーズ 株式会社ヤマダコーポレーション製、アキュムレーター（Ｎシリーズ、Ａシリーズ、Ｊシリーズ、日本アキュムレーター株式会社製））等が使用できる。

また、脈動抑制装置を設置する代わりに、または脈動抑制装置ポンプと共に、無脈動ポンプを使用することが好ましい。
無脈動ポンプは、吸引及び吐出時の圧変動や量変動を均一にするものであればよい。
無脈動ポンプは、好ましくはクワトロダイヤフラムポンプ、ギヤポンプ、マグネットポンプ、モーノポンプ、スムーズフローポンプ等である。

無脈動ポンプとしては、クワトロダイヤフラムポンプ（ＱＦ１５０シリーズ、ＱＦ１２００シリーズ、ＱＦ４４００シリーズ、ＱＦ２０Ｋ、クワトロフロー社製等）、ギヤポンプ（ＭＣ型シールレスギアポンプ、大東工業株式会社；ＣＦ型ステンレスロータリーポンプ、ＰＦ型ステンレスロータリーポンプ、株式会社花塚製作所製等）、マグネットポンプ（ＮＤ・ＭＤ−Ｆ型、ＭＸ・ＭＸＭ型マグネットポンプ、株式会社イワキ製；ＴＳＮ型、ＴＳ型、ＴＳＭ型マグネットポンプ、株式会社トーケミ製；ＹＤ−ＧＶ／ＧＶＦ型バルブレス自吸式マグネットポンプ、ＹＤ−ＧＳ／ＧＳＦ型シールレスマグネットポンプ、株式会社ワールドケミカル製；ＳＬシリーズシールレスポンプ、エレポン化工機製等）、モーノポンプ（ＮＥ型、ＮＹ型・ＮＹＴ型、ＮＹＳ型ヘイシンモーノポンプ（登録商標）、兵神装備株式会社製等）、スムーズフローポンプ（ＴＰＬ、ＸＰＬ、ＡＰＬ、ＢＰＬ、ＰＬ、ＰＬＳＳ、Ｑ、株式会社タクミナ製等）等を使用することができる。

大型カラム（円筒体）は、本発明の効果が得られるものであれば材質及び形状において特に制限されない。大型カラム（円筒体）は、直径３０ｃｍ以上２７０ｃｍ以下の内径を有し、直径４０ｃｍ以上２４０ｃｍ以下の内径を有することが好ましく、直径５０ｃｍ以上２００ｃｍ以下の内径を有することがより好ましく、直径６０ｃｍ以上１５０ｃｍ以下の内径を有することがさらに好ましい。

円筒体は、円筒体上部蓋体と円筒体底面部とこれらを接続する円筒形状を有していればよく、円筒体上部蓋体と円筒体下部との間に、円筒体の内周囲に沿って円盤体が配置されていてもよい。

円盤体は、円筒体上部蓋体側に近くなるように、円筒体上方に配設されていることが好ましい。当該円盤体下面には、スラリーを噴出するための噴出口を有するノズルが設置されていてもよい。円盤体は、使用するスラリーや必要とされる充填ベッド高さに応じて、上下方向に移動してもよい。

ノズルは、円盤体に１つ又は複数存在してもよく、円盤体に１つ存在することが好ましい。ノズルの噴出口の形状や構造は、スラリーによってノズルが詰まらない限り、特に制限されない。

円盤状フィルターは、円筒体底面部を横断していてもよく、円筒体底面部（この場合円筒体底面部は、円盤状フィルターを支持でき、溶媒を通液できる構造を有する）上にあってもよく、スラリーの担体と溶媒を分けることができるように、所定の孔径を有していればよい。カラム担体が円盤状フィルター上に堆積して充填ベッドが形成され、一方、スラリーの溶媒は円盤状フィルターの孔径を通過して、円筒体外部に排出される。

スラリーを大型カラム（円筒体）に充填する前に、カラム内をバッファで満たし、カラム内の空気を除去することが好ましい。前記バッファとしては水、０．２ｍｏｌ／Ｌの塩水等を用いることができる。その後、スラリーを送液ポンプでスラリータンクから円筒体に送液し、円筒体の円盤体下部のノズルからスラリーを噴霧することで、充填ベッドが形成される。
この手順中に過剰の液体はカラム出口から追い出されるが、多糖類カラム担体粒子はこれらの多糖類カラム担体粒子が通り抜けられないような小さい細孔を有するフィルター物質、いわゆる「ベッド支持体」によって保持される。その後、さらにカラムの平衡化のため、前記バッファをカラムに通液してもよい。

充填停止時のカラム圧は、スラリー濃度と最大吐出カラム線速度に応じて変化してもよい。充填停止時のカラム圧は、例えば、長野計器株式会社製サニタリタイプ防水型デジタル圧力計を用いて測定可能である。

充填停止時のカラム圧は、前記（ｉ）の場合、０．０１〜０．５ＭＰａであることが好ましく、０．０５〜０．３ＭＰａであることがより好ましい。
充填停止時のカラム圧は、前記（ｉｉ）の場合、０．０１〜０．５ＭＰａであることが好ましく、０．０５〜０．３ＭＰａであることがより好ましい。
充填停止時のカラム圧は、前記（ｉｉｉ）の場合、０．０１〜０．５ＭＰａであることが好ましく、０．０５９ＭＰａ以下であることがより好ましい。充填停止時のカラム圧を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。

充填停止時のカラム圧は、前記（ｉｖ）の場合、０．０１〜０．５ＭＰａであることが好ましく、０．１９９ＭＰａ以下であることがより好ましい。
充填停止時のカラム圧は、前記（ｖ）の場合、０．０１〜０．５ＭＰａであることが好ましく、０．１７９ＭＰａ以下であることがより好ましい。
充填停止時のカラム圧は、前記（ｖｉ）の場合、０．０１〜０．５ＭＰａであることが好ましく、０．０７９ＭＰａ以下であることがより好ましい。充填停止時のカラム圧を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。

充填停止時のカラム圧は、前記（ｖｉｉ）の場合、０．０１〜０．５ＭＰａであることが好ましく、０．２３９ＭＰａ以下であることがより好ましい。
充填停止時のカラム圧は、前記（ｖｉｉｉ）の場合、０．０１〜０．５ＭＰａであることが好ましく、０．１８９ＭＰａ以下であることがより好ましい。
充填停止時のカラム圧は、前記（ｉｘ）の場合、０．０１〜０．５ＭＰａであることが好ましく、０．０８９ＭＰａ以下であることがより好ましい。充填停止時のカラム圧を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。

充填停止時のカラム線速度は、スラリー濃度と最大吐出カラム線速度に応じて変化してもよい。カラム線速度は、スラリーが送液ラインから大型カラムに導入される際の線速度であってもよく、スラリーが円盤体下面のノズル噴出口から噴出される際の線速度であってもよく、スラリーが大型カラムを通過した後の線速度であってもよい。カラム線速度は、好ましくはスラリーが大型カラムを通過した後の線速度であり、大型カラムの直後に接続される配管に設置された流量センサー（例えばクランプオン式流量センサー ＦＤ−Ｑ３２Ｃ 株式会社キーエンス製）で計測してもよい。

充填停止時のカラム線速度は、前記（ｉ）の場合、１００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、４００ｃｍ／ｈｒ以上１２００ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。
充填停止時のカラム線速度は、前記（ｉｉ）の場合、１００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、１００ｃｍ／ｈｒ以上１３００ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましく、３００ｃｍ／ｈｒ以上１１００ｃｍ／ｈｒ以下であることがさらに好ましい。
充填停止時のカラム線速度は、前記（ｉｉｉ）の場合、１００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、２００ｃｍ／ｈｒ以上１０００ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。充填停止時のカラム線速度を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。

充填停止時のカラム線速度は、前記（ｉｖ）の場合、１００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、７７９ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。
充填停止時のカラム線速度は、前記（ｖ）の場合、１００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、７１９ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。
充填停止時のカラム線速度は、前記（ｖｉ）の場合、１００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、３９９ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。充填停止時のカラム線速度を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。

充填停止時のカラム線速度は、前記（ｖｉｉ）の場合、１００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、７９９ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。
充填停止時のカラム線速度は、前記（ｖｉｉｉ）の場合、１００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、７１９ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。
充填停止時のカラム線速度は、前記（ｉｘ）の場合、１００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、４４９ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。充填停止時のカラム線速度を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。

本発明において、スラリーの担体濃度範囲（Ａ）、最大吐出カラム線速度（Ｂ）、ベッド形成終了時の充填圧と充填ベッド高さの比（Ｃ）の最適な組み合わせは以下の通りである。

前記（ｉ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００５ＭＰａ／ｃｍ以上０．０２０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい；
前記（ｉｉ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００５ＭＰａ／ｃｍ以上０．０２０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい；又は
前記（ｉｉｉ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００２７９ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい。充填停止時のカラム圧／ベッド高さを前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。

前記（ｉｖ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００９９ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい；
前記（ｖ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００８９ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい；又は
前記（ｖｉ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００３９ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい。
充填停止時のカラム圧／ベッド高さを前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。

前記（ｖｉｉ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．０１１４ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい；
前記（ｖｉｉｉ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００８９ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい；又は
前記（ｉｘ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００４９ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい。充填停止時のカラム圧／ベッド高さを前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。

この様にして得られた充填ベッドは、次にカラム性能評価に供されてもよく、バッファを通液して充填ベッドを平衡化してもよい。

カラム性能評価では、カラム充填評価マーカーを用いてクロマトグラムのピーク形状を評価する。用いるカラム充填評価マーカーとしては、０．５ｍｏｌ／Ｌの塩水、１０ｍｇ／ｍｌのアセトン水溶液等が挙げられる。

上記カラム充填評価マーカーをカラムに注入し、バッファをカラムに通液する。カラム通過液の電気伝導度を検知し、クロマトグラムのピーク形状を評価する。
電気伝導度は、例えば導電率センサ（マイクロゼロ社製、ＭＺＳ２０６）等により求めることができる。

本発明は、下記カラム性能評価法に従って得られるクロマトグラムが、形状：シングルピーク、理論段数：１５００以上、アシンメトリー：０．７以上１．７以下となる充填ベッドを製造する方法であることが好ましい。

（カラム性能評価法）
ピーク形成用試料：濃度０．５ｍｏｌ／Ｌの塩水又は濃度１０ｍｇ／ｍＬのアセトン水
試料チャージ量：０．５〜５Ｌ、好ましくは０．８〜２Ｌ
移動相：水又は０．２ｍｏｌ／Ｌの塩水
移動相線速：１２〜１２０ｃｍ／ｈｒ、好ましくは２４〜６０ｃｍ／ｈｒ
検知：電気伝導度

得られたクロマトグラムのピーク形状の歪さは下記式で評価することができる。

シングルピークを表すガウス分布式

ピーク形状の歪さは複数ピークが重なっていると考え、次式でフィッティングし、ピーク分割を行う。

上記式中、Ｈ₀、Ｈ₀₁、Ｈ₀₂はピーク高さを、t_c、ｔ_c1、ｔ_c2はピークトップ位置を、σ₀、σ₀₁、σ₀₂はピーク幅を表している。ピーク高さが最も高いピーク（メインピークとする）のピーク面積を全ピーク面積で割り、ピーク形状の歪さを評価する。メインピーク面積（エリア）／全ピーク面積（エリア）の値が１である場合、クロマトピークがシングルピークとみなされる。

メインピーク面積／全ピーク面積の値が１であるものは、カラム高１ｍあたりの理論段数とアシンメトリーを次式で評価する。

上記式中、σ_0.5はピーク半分高さの幅、Ｌはカラム高を表している。ｔ_a、ｔ_bはピーク高さ１０％の位置で、ｔ_a＜ｔ_c、ｔ_b＞ｔ_cである。

本発明の製造方法で得られる充填ベッドは上記評価方法で評価した際のクロマトピークがシングルピークであり、かつ理論段数が１５００以上（好ましくは１７００以上）、アシンメトリーが０．７以上１．７以下（好ましくは０．７５以上１．６以下）であることが望ましい。

以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１
多糖類カラム担体としてスラリー濃度５０体積％のプロテインＡ担体（Ｋａｎｅｋａ ＫａｎｃａｐＡ）をスラリータンクに２７０Ｌ調製した。Ｋａｎｅｋａ ＫａｎｃａｐＡは、累積体積分布の中間粒径として平均粒子径８０μｍのプロテインＡ担体である。スラリー溶媒、バッファは水を使用した。スラリー濃度はスラリータンクよりサンプリングし、１００ｍＬのメスシリンダーにスラリーをいれ、一晩沈降させることで測定した。その際に、メスシリンダーはシンフォニアテクノロジー株式会社製バイブレトリーパッカＶＰ−４Ｄを使用し、タッピングした。

スラリータンク中のスラリーは佐竹化学機械株式会社製ポータブルミキサーＡ７４０を使用して攪拌した。

スラリーは、バッファでカラム内を空気抜きされたＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製クロマフローカラムに送液した。クロマフローカラムはカラム径８０ｃｍのものを使用し、ベッド高は２０ｃｍに設定した。スラリーの送液はタプフロー社製ダイヤフラムポンプＴＨＵ２０３（内径８０ｃｍのカラムに対する最大吐出カラム線速度３９５０ｃｍ／ｈｒ）を使用した。ポンプ駆動のための圧縮空気は日立社製マルチドライブスクロールＳＲＬ−１５ＤＭＮ６を用いて作製し、ポンプ駆動空気圧はレギュレーターで表１に示す値に調整した。脈動抑制装置として、パルセーションダンパー（ＤＴ２００ＰＴ 直径４５ｍｍの管状構造を介して送液ポンプ（ダイヤフラムポンプ）側と大型カラム（クロマフローカラム）側を接続した。タプフロー社製）を、送液ポンプの吐出側に直列に接続し、パルセーションダンパー空気圧はポンプ駆動空気圧と同じ値に調整した。
スラリーがカラム内に送液されていくにつれ、充填ベッドが形成された。充填ベッドの形成は目視で確認し、充填中のベッド高が１９．５ｃｍに到達したところで、スラリーの送液を停止した。充填中のカラム圧力は、長野計器株式会社製サニタリタイプ防水型デジタル圧力計で測定し、カラム出口から追い出された水の流量はキーエンス社製クランプオン式流量センサーＦＤＱ−３２Ｃで検知した。充填終了後、ＴＥＫＮＯＦＬＯＷ社製ロータリーポンプＬＡＢＴＯＰ４５０を使用し、２カラム体積分のバッファを流し、カラムの平衡化を行うことで、充填ベッドを得た。

その後、０．５ｍｏｌ／Ｌの塩水をカラムに１Ｌ注入し、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製チューブポンプＰｒｏＦｌｕｘＭ１２により４Ｌ／ｍｉｎの速度で通液することで、カラム性能を評価した。具体的には、カラム出口より追い出されたバッファの電気伝導度をマイクロゼロ社製の導電率センサ（ＭＺＳ２０６）で測定し、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表１に結果を記す。また、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を図２に記す。

実施例２
スラリー濃度を４０体積％、スラリー体積を３４３Ｌとした以外は実施例１と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表２に結果を記す。

比較例１
パルセーションダンパーＤＴ２００ＰＴを使用しなかった以外は実施例２と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表３に結果を記す。また、得られた歪なピーク例を図３に示す。

実施例３
スラリー濃度を３４体積％、スラリー体積を３９２Ｌとした以外は実施例１と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表４に結果を記す。

比較例２
パルセーションダンパーＤＴ２００ＰＴを使用しなかった以外は実施例３と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表５に結果を記す。図４に実施例１〜３、比較例１〜２の結果を記す。パルセーションダンパーを使用し、脈動を抑制することでスラリー濃度、充填停止時カラム圧／ベッド高の値に関わらず、シングルピークが得られやすいことが示された。

実施例４
ダイヤフラムポンプをタプフロー社製Ｔ−１００とした以外は実施例１と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表６に結果を記す。

実施例５
スラリー濃度を４０体積％、スラリー体積を３４３Ｌとした以外は実施例４と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表７に結果を記す。

比較例３
パルセーションダンパーＤＴ２００ＰＴを使用しなかった以外は実施例５と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表８に結果を記す。

実施例６
スラリー濃度を３４体積％、スラリー体積を３９２Ｌとした以外は実施例４と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表９に結果を記す。

比較例４
パルセーションダンパーＤＴ２００ＰＴを使用しなかった以外は実施例６と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表１０に結果を記す。図５に実施例４〜６、比較例３〜４の結果を記す。パルセーションダンパーにより脈動を抑制することでスラリー濃度、充填停止時カラム圧／ベッド高の値に関わらず、シングルピークが得られやすいことが示された。

実施例７
ダイヤフラムポンプをタプフロー社製Ｔ−５０、パルセーションダンパーをタプフロー社製ＰＤ５０ＰＴＴ（直径１９ｍｍの管状構造を有する）とした以外は実施例１と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表１１に結果を記す。

比較例５
パルセーションダンパーＰＤ５０ＰＴＴを使用しなかった以外は実施例７と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表１２に結果を記す。

実施例８
スラリー濃度を４０体積％、スラリー体積を３４３Ｌとした以外は実施例７と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表１３に結果を記す。

比較例６
パルセーションダンパーＰＤ５０ＰＴＴを使用しなかった以外は実施例８と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表１４に結果を記す。

実施例９
スラリー濃度を３４体積％、スラリー体積を３９２Ｌとした以外は実施例７と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表１５に結果を記す。

比較例７
パルセーションダンパーＰＤ５０ＰＴＴを使用しなかった以外は実施例９と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表１６に結果を記す。図６に実施例７〜９、比較例５〜７の結果を記す。パルセーションダンパーにより脈動を抑制することでスラリー濃度、充填停止時カラム圧／ベッド高の値に関わらず、シングルピークが得られやすいことが示された。また、脈動を抑制することで、非常に低い充填停止時カラム圧／ベッド高、すなわち遅いスラリー送液速度でもシングルピークが得られやすいことがわかる。これにより、大型カラム充填において必要とされるポンプを小型化することができる。ポンプが小型になれば、ポンプ駆動のためのエアーコンプレッサーを小型化できるなど、カラム付帯設備費用が安価にできる。

１：スラリー
２：スラリータンク
３：スラリー送液ライン
４：送液ポンプ
５：上部蓋体
６：円筒体
７：底面部
８：円盤体
９：円盤状フィルター
１０：ノズル
１１：排出ライン
１２：脈動抑制装置
２０：カラムパッキング装置

Claims (7)

1. 直径３０ｃｍ以上２７０ｃｍ以下の内径を有する円筒体と、該円筒体内下部を横断する円盤状フィルターと、該フィルターの上方に配設された円盤体と、この円盤体下面に噴出口を有するノズルとを備えたカラムパッキング装置を用い、多糖類カラム担体を含むスラリーをポンプ圧送して前記ノズルから噴出させ、円盤状フィルターの上に該担体の充填ベッドを製造する方法であって、
   ポンプ脈動抑制装置を取り付けるか、無脈動ポンプを用いるか、それらの両方を採用するかのいずれかによって前記スラリーのポンプ圧送時の脈動を抑制することを特徴とする充填ベッドの製造方法。
2. 下記カラム性能評価法に従って得られるクロマトグラムが、形状：シングルピーク、理論段数：１５００以上、アシンメトリー：０．７以上１．７以下となる充填ベッドを製造する請求項１に記載の製造方法。
   （カラム性能評価法）
   ピーク形成用試料：濃度０．５ｍｏｌ／Ｌの塩水又は濃度１０ｍｇ／ｍＬのアセトン水
   試料チャージ量：１．０Ｌ
   移動相：水又は０．２ｍｏｌ／Ｌの塩水
   移動相線速：４８ｃｍ／ｈｒ
   検知：電気伝導度
3. 前記脈動抑制装置が、パルセーションダンパー、又はアキュムレーターである請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 前記無脈動ポンプが、クワトロダイヤフラムポンプ、ギヤポンプ、マグネットポンプ、モーノポンプ、又はスムーズフローポンプである請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
5. スラリーの担体濃度範囲（Ａ）を２８体積％以上８０体積％以下とし、ポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を４７５ｃｍ／ｈｒ以上３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、ベッド形成終了時の充填圧と充填ベッド高さの比（充填圧／充填ベッド高さ）（Ｃ）の範囲を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とする、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
6. 以下のいずれかの条件で行う請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
   （Ｉ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）が３５体積％以上８０体積％以下であってポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を４７５ｃｍ／ｈｒ以上３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、ポンプ稼働空気圧を０．１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下とする
   （ＩＩ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）が２８体積％以上３５体積％未満であってポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を７１５ｃｍ／ｈｒ超３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、ポンプ稼働空気圧を０．１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下とする
   （ＩＩＩ）スラリーの担体濃度範囲（Ａ）が２８体積％以上３５体積％未満であってポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を４７５ｃｍ／ｈｒ以上７１５ｃｍ／ｈｒ以下とし、ポンプ稼働空気圧を０．３８ＭＰａ以上１ＭＰａ以下とする
7. 前記多糖類カラム担体が、累積体積分布の中間粒径としての平均粒子径５０〜１００μｍを有する、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。

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