WO2019187585A1 - 脈動抑制により多糖類カラム担体が大型カラムに充填された充填ベッドの製造方法 - Google Patents

脈動抑制により多糖類カラム担体が大型カラムに充填された充填ベッドの製造方法 Download PDF

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WO2019187585A1
WO2019187585A1 PCT/JP2019/002778 JP2019002778W WO2019187585A1 WO 2019187585 A1 WO2019187585 A1 WO 2019187585A1 JP 2019002778 W JP2019002778 W JP 2019002778W WO 2019187585 A1 WO2019187585 A1 WO 2019187585A1
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WO
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column
pump
less
slurry
mpa
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PCT/JP2019/002778
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Inventor
優 平野
康裕 田多
Original Assignee
株式会社カネカ
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/20—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the conditioning of the sorbent material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/50—Conditioning of the sorbent material or stationary liquid
    • G01N30/56—Packing methods or coating methods

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a packed bed by filling a polysaccharide column carrier into a large column.
  • the column carrier is formed by compacting a suspension of discrete particles (known as a slurry) that is pumped, injected or aspirated into the column and is housed in the column as a so-called packed bed.
  • a slurry a suspension of discrete particles
  • a large-scale column such as a large-sized column is manufactured by sucking or injecting a predetermined volume of slurry having carrier particles having a predetermined concentration into the column.
  • a movable adapter installed between the upper part and the lower part of the column
  • the liquid in the slurry is discharged outside to form a packed bed
  • a spray nozzle a slurry is sprayed into the column from the upper part of the column, and a liquid is discharged from the lower part of the column, thereby forming a packed bed
  • Patent Document 1 The packing method described in Patent Document 1 is also called a pack-in-place method. However, in this method, it is not easy to obtain a good chromatographic peak particularly in a large column, and repacking is repeated several times. The fact is that the carrier filling is completed. In fact, Patent Document 1 discloses diluting the slurry concentration to an appropriate concentration by destroying the bed once filled and filling the slurry again to form the bed.
  • an aired diaphragm pump is usually used as a pump for feeding slurry, but the larger the column, the more air is required to be supplied to the pump, and a large air compressor is required. There is a problem that the equipment cost becomes expensive. Furthermore, since the frequency of pulsation increases as the amount of air required for the liquid pump increases, the difference in flow rate fluctuation or pressure fluctuation increases, which may affect the production of the packed bed and the equipment life. is there.
  • the present invention provides a method for reliably producing a packed bed capable of obtaining a good chromatographic peak with good reproducibility in a method of filling a large column with a carrier by feeding slurry. It is an object.
  • An object of the present invention is to provide a method for reliably producing a packed bed having a good chromatographic peak with good reproducibility even when the amount of air for operating the pump is small.
  • the present inventors have been able to obtain a good chromatographic peak with good reproducibility by suppressing the pulsation of a pump for feeding slurry to a large column.
  • the present inventors have found that a bed is formed and completed the present invention.
  • the present invention relates to a cylindrical body having an inner diameter of 30 cm or more and 270 cm or less, a disk-shaped filter that traverses the lower part of the cylinder, a disk body disposed above the filter, and a jet on the lower surface of the disk body.
  • a method for producing a packed bed of a carrier on a disk-shaped filter by pumping slurry containing a polysaccharide column carrier and ejecting the slurry from the nozzle using a column packing device having a nozzle having an outlet.
  • the present invention relates to a method for producing a packed bed, wherein pulsation during pumping of the slurry is suppressed by either attaching a pump pulsation suppressing device, using a non-pulsating pump, or employing both of them.
  • the chromatogram obtained according to the following column performance evaluation method has a shape: single peak, the number of theoretical plates: 1500 or more, and an asymmetry: 0.7 or more and 1.7 or less.
  • Column performance evaluation method Sample for peak formation: salt water with a concentration of 0.5 mol / L or acetone water with a concentration of 10 mg / mL Sample charge amount: 1.0 L Mobile phase: Water or 0.2 mol / L salt water Mobile phase linear velocity: 48 cm / hr Detection: Electrical conductivity
  • the pump pulsation suppression device (hereinafter also referred to as pulsation suppression device) is preferably a pulsation damper or an accumulator, and the non-pulsation pump is a quattro diaphragm pump, gear pump, magnet pump, mono pump, or smooth A flow pump is also preferred.
  • the carrier concentration (A) of the slurry is in the range of 28 vol% to 80 vol%
  • the maximum discharge column linear velocity (B) of the pump is in the range of 475 cm / hr to 3950 cm / hr
  • bed formation is completed.
  • the range of the ratio of the filling pressure to the filling bed height (filling pressure / filling bed height) (C) is 0.001 MPa / cm or more and 0.030 MPa / cm or less.
  • the reaction is carried out under any of the following conditions.
  • the range of the carrier concentration (A) of the slurry is 35% by volume or more and 80% by volume or less, and the range of the maximum discharge column linear velocity (B) is 475 cm / hr or more and 3950 cm / hr or less.
  • the range of the carrier concentration (A) of the slurry is 28% by volume or more and less than 35% by volume, and the range of the maximum discharge column linear velocity (B) of the pump is 715 cm / More than hr and 3950 cm / hr or less, and the pump operating air pressure range is 0.1 MPa or more and 1 MPa or less.
  • the range of the carrier concentration (A) of the slurry is 28 volume% or more and less than 35 volume%, and the maximum discharge of the pump
  • the range of column linear velocity (B) is 475 cm / hr or more and 715 cm / hr or less, and the pump operating air pressure range is 0.38 MPa or more and 1 MPa or less.
  • the polysaccharide column carrier has an average particle size of 50 to 100 ⁇ m as an intermediate particle size of the cumulative volume distribution.
  • the present invention it is possible to reliably manufacture a packed bed capable of obtaining a good chromatographic peak with good reproducibility in a method of filling a large column with a carrier by feeding slurry. Further, according to a preferred embodiment of the present invention, it is possible to reliably manufacture a packed bed having a good chromatographic peak with good reproducibility even if the amount of air for operating the pump is small.
  • FIG. 1 is an example of a column packing apparatus used in the pack in place method.
  • FIG. 2 is a chromatogram of Example 1 showing good chromatographic peaks.
  • FIG. 3 is a chromatogram of Comparative Example 1 showing a distorted chromatographic peak.
  • FIG. 4 is a view showing the relationship between the column pressure / bed height at the time of stopping packing and the main peak area / all peak areas in Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 and 2.
  • FIG. 5 is a diagram showing the relationship between the column pressure / bed height at the time of stopping packing and the main peak area / all peak areas in Examples 4 to 6 and Comparative Examples 3 to 4.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between the column pressure / bed height at the time of stopping packing and the main peak area / all peak areas in Examples 7 to 9 and Comparative Examples 5 to 7.
  • the present invention relates to a cylindrical body having an inner diameter of 30 cm or more and 270 cm or less, a disk-shaped filter that traverses the lower part of the cylinder, a disk body disposed above the filter, and a jet port on the lower surface of the disk body.
  • a method for producing a packed bed of a carrier on a disk-like filter (hereinafter referred to as pack-in) using a column packing apparatus having a nozzle having a pump and pumping slurry containing a polysaccharide column carrier from the nozzle. (also referred to as a place method).
  • the column packing device 20 includes, for example, a slurry tank 2, a large column (cylindrical body 6), a slurry feeding line 3 that connects the slurry tank 2 and the cylindrical body 6, and a feeding pump 4 on the slurry feeding line 3. And a pulsation suppressing device 12 connected in series to the liquid feed pump 4.
  • the slurry tank 2 contains a slurry 1 containing a predetermined carrier and a solvent, and is fed (pressure fed) to the cylindrical body 6 through the slurry feeding line 3 by the liquid feeding pump 4 and the pulsation suppressing device 12.
  • the cylindrical body 6 is accommodated in, for example, the upper lid 5 installed at the upper end of the cylindrical body 6, the disc body 8 accommodated in the cylindrical body 6, the nozzle 10 installed on the lower surface of the disc body 8, and the cylindrical body 6.
  • the inside of the cylindrical body 6 may be filled with a predetermined solvent before the slurry 1 is fed, and the fed slurry 1 flows from the upper lid 5 and the nozzle 10 on the lower surface of the disk body 8. Sprayed from the spout.
  • the sprayed carrier of the slurry 1 is disposed on the bottom surface portion 7 inside the cylindrical body 6 and is deposited and consolidated on a disk-shaped filter 9 having a particle size smaller than that of the carrier.
  • the solvent of the slurry 1 passes through the disk-shaped filter 9 and is discharged from the discharge line 11 to the outside of the cylindrical body 6.
  • the slurry 1 may be fed until a predetermined packed bed height is formed.
  • the slurry tank may be made of metal, plastic, or the like as long as it can accommodate the slurry, and the shape of the slurry tank may be any shape such as a cylindrical shape, a rectangular parallelepiped shape, or a spherical shape.
  • the volume of the slurry tank may be anything considering the diameter and height of the packed bed suitable for a large column and the slurry concentration required for these, and is, for example, 100 to 500 L, preferably 150 to 450 L.
  • the slurry may be a mixture of a predetermined column carrier and a solvent.
  • the polysaccharide column carrier include cellulose column carriers and the like, but may be ion exchange column carriers (cation exchange column carriers, anion exchange column carriers), silica column carriers and the like. Among these, a cellulose column carrier is preferable.
  • the cellulose column carrier is not particularly limited as long as the effect of the present invention can be obtained, and examples thereof include Kaneka KancapA and Kaneka KancapA3G.
  • the polysaccharide column carrier (preferably a cellulose column carrier) preferably has an average particle size of 50 to 100 ⁇ m as an intermediate particle size of cumulative volume distribution, and more preferably has an average particle size of 60 to 90 ⁇ m.
  • the slurry may be prepared by first dispersing a polysaccharide column carrier in a dispersion solvent, and a conventionally known dispersant may be added.
  • the solvent may be, for example, an aqueous solvent; an organic solvent such as an alcohol solvent, an ester solvent, an ether solvent, or the like, preferably an aqueous solvent or an alcohol solvent, and more preferably water or water and ethanol.
  • the mixed solvent is more preferably water.
  • the mixed solvent of water and ethanol preferably has an ethanol concentration of 30% by volume or less.
  • the slurry concentration of the slurry stored in the slurry tank is preferably 10% by volume or more and 80% by volume or less, more preferably 15% by volume or more and 75% by volume or less, and 20% by volume or more and 70% by volume. % Or less, more preferably 20% by volume or more and 65% by volume or less, more preferably 28% by volume or more, 34% by volume or less, 35% by volume or more, 40% by volume or less, or 41% by volume. As mentioned above, it is still more preferable that it is 60 volume% or less.
  • the slurry concentration can be evaluated by sampling the slurry from the slurry tank, precipitating and tapping the polysaccharide column carrier, and dividing the polysaccharide column carrier sedimentation volume by the total liquid volume.
  • the slurry feeding line is not particularly limited as long as it connects the slurry tank and the cylindrical body, but preferably has a tubular structure made of a material such as metal or plastic.
  • the liquid feed pump may be a positive displacement pump.
  • the positive displacement pump include a reciprocating pump such as a piston pump, a plunger pump, a diaphragm pump, and a wing pump, and a rotary pump such as an eccentric pump and a screw pump.
  • a reciprocating pump is preferable, and a diaphragm pump is more preferable. Any diaphragm pump may be used as long as the suction and discharge of the liquid are alternately performed by the check valve.
  • diaphragm pump examples include a diaphragm pump THU203 manufactured by Tapflow, T-100 manufactured by Tapflow, T-200 manufactured by Tapflow, T-400 manufactured by Tapflow, T-800 manufactured by Tapflow, and T-50 manufactured by Tapflow. Can be mentioned.
  • the conditions such as the pressure of the liquid feed pump, the liquid feed speed, and the liquid feed amount are, for example, the operating air pressure of the liquid feed pump, the maximum discharge column linear velocity (B), the column pressure when the filling is stopped, the column when the filling is stopped.
  • B maximum discharge column linear velocity
  • C packing pressure / packing bed height
  • the working air pressure of the liquid feed pump, the column pressure when the filling is stopped, the column linear velocity when the filling is stopped, and the ratio of the filling pressure and the filling bed height at the end of bed formation may be expressed together with the carrier concentration (A) of the slurry and the maximum discharge column linear velocity (B).
  • the combinations of the carrier concentration (A) of the slurry and the maximum discharge column linear velocity (B) are as follows, and these combinations may be denoted as (i) to (ix).
  • the range of the carrier concentration (A) of the slurry is 28% by volume or more and 80% by volume or less
  • the range of the maximum discharge column linear velocity (B) of the pump is 475 cm / hr or more and 3950 cm. / Hr or less
  • the ratio of the filling pressure at the end of bed formation to the filling bed height (filling pressure / filling bed height) (C) may be 0.001 MPa / cm or more and 0.030 MPa / cm or less.
  • it is more preferably performed under any of the following conditions.
  • the range of the carrier concentration (A) of the slurry is 35% by volume or more and 80% by volume or less, and the range of the maximum discharge column linear velocity (B) is 475 cm / hr or more and 3950 cm / hr or less.
  • the range of the carrier concentration (A) of the slurry is 28% by volume or more and less than 35% by volume, and the range of the maximum discharge column linear velocity (B) of the pump is 715 cm / More than hr and 3950 cm / hr or less, and the pump operating air pressure range is 0.1 MPa or more and 1 MPa or less.
  • the range of the carrier concentration (A) of the slurry is 28 volume% or more and less than 35 volume%, and the maximum discharge of the pump
  • the range of column linear velocity (B) is 475 cm / hr or more and 715 cm / hr or less, and the pump operating air pressure range is 0.38 MPa or more and 1 MPa or less.
  • the operating air pressure of the liquid feed pump may vary depending on the slurry concentration and the maximum discharge column linear velocity.
  • the operating air pressure of the liquid feeding pump is preferably 0.1 to 1 MPa, more preferably 0.2 to 0.8 MPa.
  • the operating air pressure of the liquid feed pump is preferably 0.1 to 1 MPa, and more preferably 0.2 to 0.8 MPa.
  • the operating air pressure of the liquid feeding pump is preferably 0.1 to 1 MPa, and more preferably 0.269 MPa or less.
  • the operating air pressure of the liquid feed pump is preferably 0.1 to 1 MPa, and more preferably 0.349 MPa or less.
  • the operating air pressure of the liquid feed pump is preferably 0.1 to 1 MPa, and more preferably 0.449 MPa or less.
  • the operating air pressure of the liquid feeding pump is preferably 0.1 to 1 MPa, and more preferably 0.349 MPa or less.
  • the operating air pressure of the liquid feed pump is preferably 0.1 to 1 MPa, and more preferably 0.449 MPa or less.
  • the operating air pressure of the liquid feeding pump is preferably 0.1 to 1 MPa, and more preferably 0.449 MPa or less.
  • the operating air pressure of the liquid feed pump is preferably 0.38 to 1 MPa, and more preferably 0.449 MPa or less.
  • the present invention suppresses pulsation at the time of pumping slurry by either attaching a pump pulsation suppressing device, using a non-pulsating pump, or employing both of them.
  • Pulsation means that the process of suctioning slurry and discharging slurry by pistons and blades attached to the liquid feed pump are performed alternately, resulting in fluctuations in flow rate or fluctuations in pressure. It is a phenomenon in which a pulsating slurry flow occurs when it becomes larger. The pulsation is likely to occur when the liquid feed pump is mainly a positive displacement reciprocating pump. Especially when preparing a large column, the amount of air required increases, so vibration due to pulsation is more than usual.
  • a pulsation suppressing device may be installed between the liquid feed pump and the large column line.
  • the pulsation suppression device is connected to, for example, a pipe on the discharge side of the liquid feed pump, and nitrogen gas is enclosed in instantaneous fluctuations in the discharge amount and discharge pressure so as to make the pressure fluctuation and quantity fluctuation during suction and discharge uniform.
  • Any device that can be relaxed by a bladder, an air chamber or the like may be used.
  • Suppressing pulsation means that, for example, in a line connected from a liquid feed pump to a large column, a flow rate fluctuation difference or a pressure fluctuation difference is reduced, and these fluctuation differences are eliminated.
  • Pulsation dampers, accumulators, etc. can be used as specific pulsation suppression devices.
  • One or more pulsation suppressing devices may be connected in series or in parallel with the liquid feeding pump.
  • the pulsation suppressing device has a tubular structure having a diameter of, for example, about 10 to 100 mm, preferably 10 to 60 mm, and the line on the liquid feed pump side and the line on the large column side are connected via this tubular structure. It may be.
  • a pulsation damper (DT200PT (having a tubular structure with a diameter of 45 mm, and connecting the liquid feed pump side and the large column side through the tubular structure) manufactured by Tapflow, PD50PTT (tubular structure with a diameter of 19 mm) (Tapflow, AD-TTN series, Yamada Corporation, AD series, Yamada Corporation, accumulator (N series) A series, J series, Nippon Accumulator Co., Ltd.) etc.
  • DT200PT having a tubular structure with a diameter of 45 mm, and connecting the liquid feed pump side and the large column side through the tubular structure
  • PD50PTT tubular structure with a diameter of 19 mm
  • non-pulsation pump instead of installing a pulsation suppression apparatus or with a pulsation suppression apparatus.
  • Any non-pulsating pump may be used as long as it makes pressure fluctuations and quantity fluctuations uniform during suction and discharge.
  • the non-pulsating pump is preferably a quatro diaphragm pump, a gear pump, a magnet pump, a mono pump, a smooth flow pump, or the like.
  • Non-pulsating pumps include quattro diaphragm pumps (QF150 series, QF1200 series, QF4400 series, QF20K, manufactured by Quattroflow, etc.), gear pumps (MC type sealless gear pump, Daito Kogyo Co., Ltd .; CF type stainless steel rotary pump, PF type stainless steel) Rotary pump, manufactured by Hanatsuka Manufacturing Co., Ltd.), magnet pump (ND / MD-F type, MX / MXM type magnetic pump, manufactured by Iwaki Co., Ltd .; TSN type, TS type, TSM type magnetic pump, manufactured by Tochemi Co., Ltd .; YD -GV / GVF type valveless self-priming magnet pump, YD-GS / GSF type sealless magnet pump, manufactured by World Chemical Co., Ltd .; SL series sealless pump, manufactured by Elepon Chemical Machinery Co., Ltd., MONO pump (NE type, NY type, YT type, NYS type Heisin Mono
  • the pulsation generating pump (preferably a diaphragm pump) is preferably used in combination with a pump pulsation suppressing device (preferably a pulsation damper or an accumulator).
  • a pump pulsation suppressing device preferably a pulsation damper or an accumulator.
  • a non-pulsating pump preferably a quatro diaphragm pump, a gear pump, a magnet pump, a Mono pump, or a smooth flow pump.
  • the material and shape of the large column (cylindrical body) are not particularly limited as long as the effects of the present invention can be obtained.
  • the large column (cylindrical body) has an inner diameter of 30 to 270 cm in diameter, preferably has an inner diameter of 40 to 240 cm, more preferably has an inner diameter of 50 to 200 cm, more preferably 60 to 150 cm. More preferably, it has the following inner diameter.
  • the cylindrical body only has to have a cylindrical shape that connects the cylindrical upper lid body, the cylindrical bottom surface portion, and the cylindrical body, and extends along the inner periphery of the cylindrical body between the cylindrical upper lid body and the cylindrical lower body.
  • a disk body may be arranged.
  • the disc body is disposed above the cylindrical body so as to be close to the cylindrical body upper lid side.
  • a nozzle having a spout for ejecting slurry may be provided on the lower surface of the disc body. The disc may move up and down depending on the slurry used and the required packed bed height.
  • One or a plurality of nozzles may exist in the disk body, and preferably one nozzle exists in the disk body.
  • the shape and structure of the nozzle outlet are not particularly limited as long as the nozzle is not clogged with slurry.
  • the disk-shaped filter may cross the bottom surface of the cylindrical body, and is located on the bottom surface of the cylindrical body (in this case, the bottom surface of the cylindrical body has a structure that can support the disk-shaped filter and can pass a solvent). In other words, it may have a predetermined pore size so that the slurry carrier and the solvent can be separated.
  • the column carrier is deposited on the disk-shaped filter to form a packed bed, while the solvent of the slurry passes through the hole diameter of the disk-shaped filter and is discharged outside the cylindrical body.
  • the slurry Before filling the slurry into a large column (cylindrical body), it is preferable to fill the column with a buffer and remove the air in the column.
  • a buffer water, 0.2 mol / L salt water, or the like can be used.
  • the slurry is fed from the slurry tank to the cylindrical body by a liquid feed pump, and the slurry is sprayed from the nozzle at the lower part of the cylindrical body of the cylindrical body, thereby forming a packed bed.
  • excess liquid is expelled from the column outlet, but the polysaccharide column carrier particles are retained by a so-called “bed support” that has small pores to prevent these polysaccharide column carrier particles from passing through. Is done.
  • the buffer may be passed through the column for further column equilibration.
  • the column pressure when stopping filling may vary depending on the slurry concentration and the maximum discharge column linear velocity.
  • the column pressure when the filling is stopped can be measured using, for example, a sanitary waterproof digital pressure gauge manufactured by Nagano Keiki Co., Ltd.
  • the column pressure at the time of stopping the packing is preferably 0.01 to 0.5 MPa, more preferably 0.05 to 0.3 MPa.
  • the column pressure when stopping the packing is preferably 0.01 to 0.5 MPa, and more preferably 0.05 to 0.3 MPa.
  • the column pressure when stopping the packing is preferably 0.01 to 0.5 MPa, more preferably 0.059 MPa or less.
  • the column pressure at the time of stopping the packing is preferably 0.01 to 0.5 MPa, and more preferably 0.199 MPa or less.
  • the column pressure when stopping the packing is preferably 0.01 to 0.5 MPa, more preferably 0.179 MPa or less.
  • the column pressure at the time of stopping the packing is preferably 0.01 to 0.5 MPa, and more preferably 0.079 MPa or less.
  • the column pressure at the time of stopping the packing is preferably 0.01 to 0.5 MPa, more preferably 0.239 MPa or less. In the case of (viii), the column pressure at the time of stopping the packing is preferably 0.01 to 0.5 MPa, and more preferably 0.189 MPa or less. In the case of (ix), the column pressure at the time of stopping the packing is preferably 0.01 to 0.5 MPa, and more preferably 0.089 MPa or less. When the column pressure at the time of stopping the packing is within the above preferred range, it is possible to make the chromatographic peak more reliably a single peak.
  • the column linear velocity when the filling is stopped may vary depending on the slurry concentration and the maximum discharge column linear velocity.
  • the column linear velocity may be a linear velocity when the slurry is introduced into the large column from the liquid feeding line, or may be a linear velocity when the slurry is ejected from the nozzle outlet on the lower surface of the disk body,
  • the linear velocity after the slurry passes through the large column may be used.
  • the column linear velocity is preferably the linear velocity after the slurry passes through the large column, and a flow rate sensor (for example, a clamp-on type flow rate sensor FD-Q32C, manufactured by Keyence Corporation) installed in a pipe connected immediately after the large column. ).
  • the column linear velocity at the time of stopping the packing is preferably from 100 cm / hr to 1500 cm / hr, more preferably from 400 cm / hr to 1200 cm / hr.
  • the column linear velocity at the time of stopping the packing is preferably from 100 cm / hr to 1500 cm / hr, more preferably from 100 cm / hr to 1300 cm / hr, more preferably from 300 cm / hr to 1100 cm. / Hr or less is more preferable.
  • the column linear velocity at the time of stopping the packing is preferably 100 cm / hr or more and 1500 cm / hr or less, and more preferably 200 cm / hr or more and 1000 cm / hr or less.
  • the column linear velocity at the time of stopping the packing is in the preferred range, the chromatographic peak can be more surely made a single peak.
  • the column linear velocity at the time of stopping the packing is preferably 100 cm / hr or more and 1500 cm / hr or less, and more preferably 779 cm / hr or less.
  • the column linear velocity at the time of stopping the packing is preferably 100 cm / hr or more and 1500 cm / hr or less, and more preferably 719 cm / hr or less.
  • the column linear velocity at the time of stopping the packing is preferably 100 cm / hr or more and 1500 cm / hr or less, and more preferably 399 cm / hr or less.
  • the column linear velocity at the time of stopping the packing is preferably 100 cm / hr or more and 1500 cm / hr or less, and more preferably 799 cm / hr or less.
  • the column linear velocity at the time of stopping the packing is preferably 100 cm / hr or more and 1500 cm / hr or less, and more preferably 719 cm / hr or less.
  • the column linear velocity at the time of stopping the packing is preferably 100 cm / hr or more and 1500 cm / hr or less, more preferably 449 cm / hr or less.
  • the optimum combination of the carrier concentration (A) of the slurry, the maximum discharge column linear velocity (B), and the ratio (C) of the filling pressure at the end of bed formation to the packed bed height is as follows.
  • the ratio (C) of filling pressure / filling bed height is preferably 0.001 MPa / cm or more and 0.030 MPa / cm or less, preferably 0.005 MPa / cm or more and 0.020 MPa / cm or less. And more preferably;
  • the filling pressure / filled bed height ratio (C) is preferably 0.001 MPa / cm or more and 0.030 MPa / cm or less, and 0.005 MPa / cm or more and 0.020 MPa / cm or less.
  • the ratio (C) of filling pressure / filling bed height is preferably 0.001 MPa / cm or more and 0.030 MPa / cm or less, and 0.00279 MPa / More preferably, it is not more than cm.
  • the column pressure / bed height at the time of stopping the packing is within the preferable range, the chromatographic peak can be more surely made a single peak.
  • the filling pressure / filled bed height ratio (C) is preferably 0.001 MPa / cm or more and 0.030 MPa / cm or less, and more preferably 0.0099 MPa / cm or less. ; In the case of (v), the filling pressure / filled bed height ratio (C) is preferably 0.001 MPa / cm or more and 0.030 MPa / cm or less, and more preferably 0.0089 MPa / cm or less. Or In the case of (vi), the ratio (C) of the filling pressure / filled bed height is preferably 0.001 MPa / cm or more and 0.030 MPa / cm or less, and preferably 0.0039 MPa / cm or less. More preferred. When the column pressure / bed height at the time of stopping the packing is within the preferable range, the chromatographic peak can be more surely made a single peak.
  • the filling pressure / filled bed height ratio (C) is preferably 0.001 MPa / cm or more and 0.030 MPa / cm or less, and more preferably 0.0114 MPa / cm or less. ; In the case of (viii), the filling pressure / filled bed height ratio (C) is preferably 0.001 MPa / cm or more and 0.030 MPa / cm or less, and more preferably 0.0089 MPa / cm or less. Or In the case of (ix), the filling pressure / filled bed height ratio (C) is preferably 0.001 MPa / cm or more and 0.030 MPa / cm or less, and preferably 0.0049 MPa / cm or less. More preferred. When the column pressure / bed height at the time of stopping the packing is within the preferable range, the chromatographic peak can be more surely made a single peak.
  • the packed bed thus obtained may then be subjected to column performance evaluation, and the packed bed may be equilibrated by passing a buffer.
  • the height of the packed bed may be in an appropriate range depending on the inner diameter of the column packing apparatus used and the volume of the slurry, and is, for example, 5 to 50 cm, preferably 10 to 30 cm.
  • the volume of the packed bed may be set to an appropriate range depending on the inner diameter of the column packing apparatus and the height of the packed bed, for example, 0.01 to 1.0 m 3 , preferably 0.05 to 0.5 m 3. It is.
  • the peak shape of the chromatogram is evaluated using a column packing evaluation marker.
  • the column packing evaluation marker to be used include 0.5 mol / L salt water, 10 mg / ml acetone aqueous solution, and the like.
  • the column packing evaluation marker is injected into the column, and the buffer is passed through the column.
  • the electric conductivity of the liquid passing through the column is detected, and the peak shape of the chromatogram is evaluated.
  • the electrical conductivity can be determined by, for example, a conductivity sensor (MZS206, manufactured by Micro Zero).
  • the present invention is preferably a method for producing a packed bed in which a chromatogram obtained according to the following column performance evaluation method has a shape: single peak, the number of theoretical plates: 1500 or more, and an asymmetry: 0.7 or more and 1.7 or less. .
  • the distortion of the peak shape of the obtained chromatogram can be evaluated by the following formula.
  • Gaussian distribution that represents a single peak
  • the peak shape distortion is considered to be a combination of multiple peaks.
  • H 0 , H 01 and H 02 represent peak heights
  • t c , t c1 and t c2 represent peak top positions
  • ⁇ 0 , ⁇ 01 and ⁇ 02 represent peak widths.
  • ⁇ 0.5 represents the width of the peak half height
  • L represents the column height
  • t a and t b are positions where the peak height is 10%
  • the packed bed obtained by the production method of the present invention has a single peak as a chromatographic peak when evaluated by the above evaluation method, and has a theoretical plate number of 1500 or more (preferably 1,700 or more, more preferably 2000 or more, more preferably 3000 or more. ), And asymmetry is preferably 0.7 to 1.7 (preferably 0.75 to 1.6).
  • Example 1 As a polysaccharide column carrier, 270 L of protein A carrier (Kaneka Kancap A) having a slurry concentration of 50% by volume was prepared in a slurry tank.
  • Kaneka Kancap A is a protein A carrier having an average particle size of 80 ⁇ m as an intermediate particle size of cumulative volume distribution.
  • the slurry solvent and buffer were water.
  • the slurry concentration was measured by sampling from the slurry tank, placing the slurry in a 100 mL graduated cylinder and allowing it to settle overnight. At that time, the graduated cylinder was tapped using a vibratory packer VP-4D manufactured by Symphonia Technology Co., Ltd.
  • the slurry in the slurry tank was stirred using a portable mixer A740 manufactured by Satake Chemical Machinery Co., Ltd.
  • the slurry was fed to a chroma flow column manufactured by GE healthcare, in which the column was vented with a buffer.
  • a chroma flow column having a column diameter of 80 cm was used, and the bed height was set to 20 cm.
  • a slurry pump THU203 maximum discharge column linear velocity 3950 cm / hr for a column having an inner diameter of 80 cm
  • Compressed air for driving the pump was prepared using a multi-drive scroll SRL-15DMN6 manufactured by Hitachi, and the pump driving air pressure was adjusted to a value shown in Table 1 with a regulator.
  • a pulsation damper As a pulsation suppression device, a pulsation damper (DT200PT: 45mm diameter, 45mm diameter, connected to the pump (diaphragm pump) side and the large column (chroma flow column) side.
  • the pulsation damper air pressure was adjusted to the same value as the pump drive air pressure.
  • a packed bed was formed. Formation of the packed bed was visually confirmed, and when the bed height during filling reached 19.5 cm, the slurry feeding was stopped.
  • the column pressure during the packing was measured with a sanitary waterproof digital pressure gauge manufactured by Nagano Keiki Co., Ltd., and the flow rate of water expelled from the column outlet was detected by a clamp-on type flow sensor FDQ-32C manufactured by Keyence Corporation.
  • a packed bed was obtained by using a rotary pump LABTOP450 manufactured by TEKNOFLOW, flowing a buffer for two column volumes, and performing column equilibration.
  • Example 2 A packed bed was obtained by the same method and conditions as in Example 1 except that the slurry concentration was 40% by volume and the slurry volume was 343L. Table 2 shows the results.
  • Comparative Example 1 A packed bed was obtained by the same method and conditions as in Example 2 except that the pulsation damper DT200PT was not used. Table 3 shows the results. Moreover, the obtained distorted peak example is shown in FIG.
  • Example 3 A packed bed was obtained by the same method and conditions as in Example 1 except that the slurry concentration was 34% by volume and the slurry volume was 392L. Table 4 shows the results.
  • Comparative Example 2 A packed bed was obtained by the same method and conditions as in Example 3 except that the pulsation damper DT200PT was not used. Table 5 shows the results. FIG. 4 shows the results of Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 and 2. By using a pulsation damper and suppressing the pulsation, it was shown that a single peak can be easily obtained regardless of the slurry concentration and the column pressure / bed height at the time of stopping packing.
  • Example 4 A packed bed was obtained by the same method and conditions as in Example 1 except that the diaphragm pump was T-100 manufactured by Tapflow. Table 6 shows the results.
  • Example 5 A packed bed was obtained by the same method and conditions as in Example 4 except that the slurry concentration was 40% by volume and the slurry volume was 343L. Table 7 shows the results.
  • Comparative Example 3 A packed bed was obtained by the same method and conditions as in Example 5 except that the pulsation damper DT200PT was not used. Table 8 shows the results.
  • Example 6 A packed bed was obtained by the same method and conditions as in Example 4 except that the slurry concentration was 34% by volume and the slurry volume was 392L. Table 9 shows the results.
  • Comparative Example 4 A packed bed was obtained by the same method and conditions as in Example 6 except that the pulsation damper DT200PT was not used. Table 10 shows the results.
  • FIG. 5 shows the results of Examples 4 to 6 and Comparative Examples 3 to 4. It was shown that by suppressing the pulsation with the pulsation damper, a single peak was easily obtained regardless of the slurry concentration and the column pressure / bed height at the time of stopping packing.
  • Example 7 A packed bed was obtained by the same method and conditions as in Example 1 except that the diaphragm pump was T-50 manufactured by Tapflow and the pulsation damper was PD50PTT (having a tubular structure having a diameter of 19 mm) manufactured by Tapflow. Table 11 shows the results.
  • Comparative Example 5 A packed bed was obtained by the same method and conditions as in Example 7 except that the pulsation damper PD50PTT was not used. Table 12 shows the results.
  • Example 8 A packed bed was obtained by the same method and conditions as in Example 7 except that the slurry concentration was 40% by volume and the slurry volume was 343L. Table 13 shows the results.
  • Comparative Example 6 A packed bed was obtained by the same method and conditions as in Example 8 except that the pulsation damper PD50PTT was not used. Table 14 shows the results.
  • Example 9 A packed bed was obtained by the same method and conditions as in Example 7 except that the slurry concentration was 34% by volume and the slurry volume was 392L. Table 15 shows the results.
  • Comparative Example 7 A packed bed was obtained by the same method and conditions as in Example 9 except that the pulsation damper PD50PTT was not used. Table 16 shows the results. FIG. 6 shows the results of Examples 7 to 9 and Comparative Examples 5 to 7. It was shown that by suppressing the pulsation with the pulsation damper, a single peak was easily obtained regardless of the slurry concentration and the column pressure / bed height at the time of stopping packing. It can also be seen that by suppressing the pulsation, a single peak can be easily obtained even at a very low column pressure / bed height at the time of stopping the packing, that is, at a low slurry feeding speed. Thereby, the pump required in the large column packing can be reduced in size. If the pump is downsized, the cost of the incidental equipment for the column can be reduced, such as downsizing the air compressor for driving the pump.
  • Slurry 2 Slurry tank 3: Slurry liquid feed line 4: Liquid feed pump 5: Upper lid body 6: Cylindrical body 7: Bottom surface part 8: Disk body 9: Disk-shaped filter 10: Nozzle 11: Discharge line 12: Pulsation Suppression device 20: Column packing device

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Abstract

本発明は、スラリーを送液することにより大型カラムに担体を充填する方法において、再現性よく良好なクロマトピークを得ることのできる充填ベッドを確実に製造する方法を提供することを目的としている。　直径３０ｃｍ以上２７０ｃｍ以下の内径を有する円筒体と、該円筒体内下部を横断する円盤状フィルターと、該フィルターの上方に配設された円盤体と、この円盤体下面に噴出口を有するノズルとを備えたカラムパッキング装置を用い、多糖類カラム担体を含むスラリーをポンプ圧送して前記ノズルから噴出させ、円盤状フィルターの上に該担体の充填ベッドを製造する方法であって、ポンプ脈動抑制装置を取り付けるか、無脈動ポンプを用いるか、それらの両方を採用するかのいずれかによって前記スラリーのポンプ圧送時の脈動を抑制することを特徴とする充填ベッドの製造方法。

Description

脈動抑制により多糖類カラム担体が大型カラムに充填された充填ベッドの製造方法
　本発明は、多糖類カラム担体を大型カラムへ充填し、充填ベッドを製造するための方法に関する。
　バイオセパレーション分野では、目的物精製のためにカラムクロマトグラフィーが用いられることが多い。通例、カラム担体は、カラムにポンプ送液、注入又は吸引された離散粒子の懸濁液（スラリーとして知られる）を圧密化することにより形成され、いわゆる、充填ベッドとしてカラム内に収容される。
　他方、大型カラムのような大規模なカラムは、規定の濃度の担体粒子を有する所定の体積のスラリーをカラム内に吸引又は注入することによって製造される。例えばカラム下部からスラリーを導入してカラム上部とカラム下部との間に設置された可動アダプターを下方に移動させることにより、スラリー中の液体を外部に排出して充填ベッドを形成したり、または、スプレーノズルを利用して、カラム内上部よりスラリーをカラム内に噴霧し、カラム下部より液体を排出することにより、充填ベッドを形成させたりする（特許文献１）。
　この様に、この手順中に過剰の液体はカラム出口から追い出されるが、担体粒子はこれらの担体粒子が通り抜けられないような小さい細孔を有するフィルター物質、いわゆる「ベッド支持体」によって保持されることになる。その後、充填ベッドが最適な圧縮度で圧縮されたらパッキングプロセスは終了である。
特表２０１１－５２２２４８号公報
　上記特許文献１に記載される充填手法はｐａｃｋ　ｉｎ　ｐｌａｃｅ法とも呼ばれているが、当該方法では特に大型カラムでは良好なクロマトピークを得ることが容易ではなく、何回かの再充填を繰り返し、担体充填を完了させていることが実状である。実際、特許文献１では、一度充填されたベッドを破壊して再度スラリーを充填してベッドを形成することにより、スラリー濃度を適切な濃度に希釈することが開示されている。
　また、スラリーを送液するポンプにはエアードダイヤフラムポンプが通常用いられているが、大型カラムになるほどポンプに供給する空気量が多く要求され、大型のエアーコンプレッサーが必要とされるなど、カラム付帯設備費用が高価になるという問題がある。
　さらに、送液ポンプで必要とされる空気量が多くなると、脈動の頻度が高くなる為、流量の変動又は圧力の変動の差が大きくなり、充填ベッドの作製及び設備寿命に影響を及ぼす虞がある。
　上記問題に鑑み、本発明は、スラリーを送液することにより大型カラムに担体を充填する方法において、再現性よく良好なクロマトピークを得ることのできる充填ベッドを確実に製造する方法を提供することを目的としている。本発明は、好ましくはポンプ稼動のための空気量が少なくても、再現性よく良好なクロマトピークを持った充填ベッドを確実に製造する方法を提供することを目的としている。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、大型カラムにスラリーを送液するポンプの脈動を抑制することで再現性よく確実に良好なクロマトピークを得ることのできる充填ベッドが形成されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　即ち、本発明は、直径３０ｃｍ以上２７０ｃｍ以下の内径を有する円筒体と、該円筒体内下部を横断する円盤状フィルターと、該フィルターの上方に配設された円盤体と、この円盤体下面に噴出口を有するノズルとを備えたカラムパッキング装置を用い、多糖類カラム担体を含むスラリーをポンプ圧送して前記ノズルから噴出させ、円盤状フィルターの上に該担体の充填ベッドを製造する方法であって、
　ポンプ脈動抑制装置を取り付けるか、無脈動ポンプを用いるか、それらの両方を採用するかのいずれかによって前記スラリーのポンプ圧送時の脈動を抑制することを特徴とする充填ベッドの製造方法に関する。
　本発明において、下記カラム性能評価法に従って得られるクロマトグラムが、形状：シングルピーク、理論段数：１５００以上、アシンメトリー：０．７以上１．７以下となる充填ベッドを製造することが好ましい。
　（カラム性能評価法）
　ピーク形成用試料：濃度０．５ｍｏｌ／Ｌの塩水又は濃度１０ｍｇ／ｍＬのアセトン水
　試料チャージ量：１．０Ｌ
　移動相：水又は０．２ｍｏｌ／Ｌの塩水
　移動相線速：４８ｃｍ／ｈｒ
　検知：電気伝導度
　本発明において、ポンプ脈動抑制装置（以下、脈動抑制装置ともいう）が、パルセーションダンパー、又はアキュムレーターであることが好ましく、無脈動ポンプが、クワトロダイヤフラムポンプ、ギヤポンプ、マグネットポンプ、モーノポンプ、又はスムーズフローポンプであることも好ましい。
　本発明では、スラリーの担体濃度（Ａ）の範囲を２８体積％以上８０体積％以下とし、ポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を４７５ｃｍ／ｈｒ以上３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、ベッド形成終了時の充填圧と充填ベッド高さの比（充填圧／充填ベッド高さ）（Ｃ）の範囲を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることも好ましい。
　本発明の好ましい態様において、以下のいずれかの条件で行う。
　（Ｉ）スラリーの担体濃度（Ａ）の範囲が３５体積％以上８０体積％以下であってポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を４７５ｃｍ／ｈｒ以上３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、ポンプ稼働空気圧の範囲を０．１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下とする
　（ＩＩ）スラリーの担体濃度（Ａ）の範囲が２８体積％以上３５体積％未満であってポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を７１５ｃｍ／ｈｒ超３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、ポンプ稼働空気圧の範囲を０．１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下とする
　（ＩＩＩ）スラリーの担体濃度（Ａ）の範囲が２８体積％以上３５体積％未満であってポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を４７５ｃｍ／ｈｒ以上７１５ｃｍ／ｈｒ以下とし、ポンプ稼働空気圧の範囲を０．３８ＭＰａ以上１ＭＰａ以下とする
　本発明において、多糖類カラム担体が、累積体積分布の中間粒径としての平均粒子径５０～１００μｍを有することも好ましい態様である。
　本発明によれば、スラリーを送液することにより大型カラムに担体を充填する方法において、再現性よく良好なクロマトピークを得ることのできる充填ベッドを確実に製造することが可能となる。また、本発明の好ましい態様により、ポンプ稼動のための空気量が少なくても、再現性よく良好なクロマトピークを持った充填ベッドを確実に製造することも可能である。
図１は、ｐａｃｋ　ｉｎ　ｐｌａｃｅ法に用いられるカラムパッキング装置の例である。 図２は、良好なクロマトピークを示す実施例１のクロマトグラムである。 図３は、歪なクロマトピークを示す比較例１のクロマトグラムである。 図４は、実施例１～３、比較例１～２における、充填停止時カラム圧／ベッド高とメインピークエリア／全ピークエリアとの関係を示す図である。 図５は、実施例４～６、比較例３～４における、充填停止時カラム圧／ベッド高とメインピークエリア／全ピークエリアとの関係を示す図である。 図６は、実施例７～９、比較例５～７における、充填停止時カラム圧／ベッド高とメインピークエリア／全ピークエリアとの関係を示す図である。
　本発明は、直径３０ｃｍ以上２７０ｃｍ以下の内径を有する円筒体と、該円筒体内下部を横断する円盤状フィルターと、該フィルターの上方に配設された円盤体と、この円盤体下面に噴出口を有するノズルとを備えたカラムパッキング装置を用い、多糖類カラム担体を含むスラリーをポンプ圧送して前記ノズルから噴出させ、円盤状フィルターの上に該担体の充填ベッドを製造する方法（以下、ｐａｃｋ　ｉｎ　ｐｌａｃｅ法ともいう）に関するものである。
　本発明で使用されるｐａｃｋ　ｉｎ　ｐｌａｃｅ法について図を参照して説明する。
　カラムパッキング装置２０は、例えば、スラリータンク２と、大型カラム（円筒体６）と、スラリータンク２と円筒体６を接続するスラリー送液ライン３と、スラリー送液ライン３上の送液ポンプ４と、送液ポンプ４に直列に接続される脈動抑制装置１２から構成される。スラリータンク２には、所定の担体と溶媒を含むスラリー１が収容されており、送液ポンプ４及び脈動抑制装置１２により、スラリー送液ライン３を通じて円筒体６に送液（圧送）される。
　円筒体６は、例えば、円筒体６上端に設置される上部蓋体５、円筒体６内に収容される円盤体８、円盤体８下面に設置されるノズル１０、円筒体６内に収容されかつ前記円盤体８よりも下方に配設される円盤状フィルター９、円筒体６下端を構成する底面部７、及び前記円盤状フィルター９よりも下方で円筒体６に接続する（図示例では円筒体底面部７に接続する）排出ライン１１から構成される。円筒体６の内部は、スラリー１を送液する前に、所定の溶媒で満たされていてもよく、送液されたスラリー１は、上部蓋体５から流入し、円盤体８下面のノズル１０の噴出口から噴霧される。
　噴霧されたスラリー１の担体は、円筒体６内部において、底面部７の上に配置され、担体の粒径よりも小さい粒径を有する円盤状フィルター９上に堆積して圧密化される。
　一方、スラリー１の溶媒は、円盤状フィルター９を通り抜けて、排出ライン１１から円筒体６の外部に排出される。スラリー１の送液は、所定の充填ベッド高が形成されるまで、行えばよい。
　スラリータンクは、スラリーを収容することができる限り、金属、プラスチック等から形成されてもよく、スラリータンクの形状は、円筒形、直方体形、球形等の任意の形状であってもよい。スラリータンクの容積は、大型カラムに適した充填ベッドの直径及び高さ、これらに必要なスラリー濃度を考慮したものであればよく、例えば１００～５００Ｌであり、好ましくは１５０～４５０Ｌである。
　スラリーは、所定のカラム担体と溶媒の混合物であればよい。多糖類カラム担体としては、セルロースカラム担体等が挙げられるが、イオン交換カラム担体（カチオン交換カラム担体、アニオン交換カラム担体）、シリカカラム担体等であってもよい。中でも、セルロースカラム担体が好ましい。
　セルロースカラム担体としては、本発明の効果が得られるものであれば特に制限されないが、例えば、Ｋａｎｅｋａ　ＫａｎｃａｐＡ、Ｋａｎｅｋａ　ＫａｎｃａｐＡ３Ｇなどが挙げられる。
　多糖類カラム担体（好ましくはセルロースカラム担体）は、累積体積分布の中間粒径としての平均粒子径５０～１００μｍを有することが好ましく、該平均粒子径６０～９０μｍを有することがより好ましい。上記スラリーは、多糖類カラム担体をまず、分散溶媒に分散させて調製すればよく、従来公知の分散剤を添加してもよい。
　溶媒は、例えば、水系溶媒；アルコール系溶媒、エステル系溶媒、エーテル系溶媒などの有機溶媒等であってもよく、好ましくは水系溶媒、アルコール系溶媒であり、より好ましくは水、または水とエタノールの混和溶媒であり、さらに好ましくは水である。水とエタノールの混和溶媒はエタノール濃度が３０体積％以下であることが好ましい。
　スラリータンクに収容されるスラリーのスラリー濃度は、１０体積％以上、８０体積％以下であることが好ましく、１５体積％以上、７５体積％以下であることがより好ましく、２０体積％以上、７０体積％以下であることがさらに好ましく、２０体積％以上、６５体積％以下であることがさらにより好ましく、２８体積％以上、３４体積％以下、３５体積％以上、４０体積％以下、又は４１体積％以上、６０体積％以下であることがさらにより一層好ましい。
　１０体積％未満のスラリー濃度では、大きなスラリータンク容量が要求され、８０体積％超のスラリー濃度ではスラリー粘度が高くなるため、下記で説明するポンプでの送液が容易ではなくなる。なお、スラリー濃度はスラリータンクよりスラリーをサンプリングし、多糖類カラム担体を沈降、タッピングし、多糖類カラム担体沈降体積を全液量体積で割った値で評価することができる。
　スラリー送液ラインは、スラリータンクと円筒体を接続するものであれば特に限定されないが、金属、プラスチック等の材料から構成される管状構造を有することが好ましい。
　送液ポンプは、容積式ポンプであってもよい。
　容積式ポンプとしては、ピストンポンプ、プランジャーポンプ、ダイヤフラムポンプ、ウイングポンプ等の往復動ポンプ、偏心ポンプ、ねじポンプ等の回転ポンプ等が挙げられる。
　中でも、往復動ポンプが好ましく、ダイヤフラムポンプがより好ましい。ダイヤフラムポンプは、逆止弁の働きによって液の吸引と吐出が交互に行われるものであればよい。
　ダイヤフラムポンプとしては、例えば、タプフロー社製ダイヤフラムポンプＴＨＵ２０３、タプフロー社製Ｔ－１００、タプフロー社製Ｔ－２００、タプフロー社製Ｔ－４００、タプフロー社製Ｔ－８００、タプフロー社製Ｔ－５０等が挙げられる。
　送液ポンプの圧力、送液速度、送液量等の条件は、例えば、送液ポンプの稼働空気圧、ポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）、充填停止時のカラム圧、充填停止時のカラム線速度、及びベッド形成終了時の充填圧と充填ベッド高さの比（充填圧／充填ベッド高さ）[充填停止時カラム圧／ベッド高ともいう]（Ｃ）等が後述の範囲となるように調節すればよい。
　本発明において、送液ポンプの稼働空気圧、充填停止時のカラム圧、充填停止時のカラム線速度、及びベッド形成終了時の充填圧と充填ベッド高さの比（充填圧／充填ベッド高さ）（Ｃ）の条件は、スラリーの担体濃度（Ａ）と最大吐出カラム線速度（Ｂ）と共に表されてもよい。
　スラリーの担体濃度（Ａ）と最大吐出カラム線速度（Ｂ）の組み合わせは、以下の通りであり、これらの組み合わせを（ｉ）～（ｉｘ）として標記する場合がある。
（ｉ）スラリーの担体濃度（Ａ）４０体積％超８０体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）１５００ｃｍ／ｈｒ超３９５０ｃｍ／ｈｒ以下
（ｉｉ）スラリーの担体濃度（Ａ）４０体積％超８０体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）７１５ｃｍ／ｈｒ超１５００ｃｍ／ｈｒ以下
（ｉｉｉ）スラリーの担体濃度（Ａ）４０体積％超８０体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）４７５ｃｍ／ｈｒ超７１５ｃｍ／ｈｒ以下
（ｉｖ）スラリーの担体濃度（Ａ）３５体積％超４０体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）１５００ｃｍ／ｈｒ超３９５０ｃｍ／ｈｒ以下
（ｖ）スラリーの担体濃度（Ａ）３５体積％超４０体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）７１５ｃｍ／ｈｒ超１５００ｃｍ／ｈｒ以下
（ｖｉ）スラリーの担体濃度（Ａ）３５体積％超４０体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）４７５ｃｍ／ｈｒ超７１５ｃｍ／ｈｒ以下
（ｖｉｉ）スラリーの担体濃度（Ａ）２８体積％以上３５体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）１５００ｃｍ／ｈｒ超３９５０ｃｍ／ｈｒ以下
（ｖｉｉｉ）スラリーの担体濃度（Ａ）２８体積％以上３５体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）を７１５ｃｍ／ｈｒ超１５００ｃｍ／ｈｒ以下
（ｉｘ）スラリーの担体濃度（Ａ）２８体積％以上３５体積％以下、最大吐出カラム線速度（Ｂ）４７５ｃｍ／ｈｒ超７１５ｃｍ／ｈｒ以下
　本発明で使用されるｐａｃｋ　ｉｎ　ｐｌａｃｅ法では、スラリーの担体濃度（Ａ）の範囲を２８体積％以上８０体積％以下とし、ポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を４７５ｃｍ／ｈｒ以上３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、ベッド形成終了時の充填圧と充填ベッド高さの比（充填圧／充填ベッド高さ）（Ｃ）の範囲を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、以下のいずれかの条件で行うことがより好ましい。
　（Ｉ）スラリーの担体濃度（Ａ）の範囲が３５体積％以上８０体積％以下であってポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を４７５ｃｍ／ｈｒ以上３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、ポンプ稼働空気圧の範囲を０．１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下とする
　（ＩＩ）スラリーの担体濃度（Ａ）の範囲が２８体積％以上３５体積％未満であってポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を７１５ｃｍ／ｈｒ超３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、ポンプ稼働空気圧の範囲を０．１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下とする
　（ＩＩＩ）スラリーの担体濃度（Ａ）の範囲が２８体積％以上３５体積％未満であってポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を４７５ｃｍ／ｈｒ以上７１５ｃｍ／ｈｒ以下とし、ポンプ稼働空気圧の範囲を０．３８ＭＰａ以上１ＭＰａ以下とする
　送液ポンプの稼働空気圧は、スラリー濃度と最大吐出カラム線速度に応じて変化してもよい。
　送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｉ）の場合、０．１～１ＭＰａであることが好ましく、０．２～０．８ＭＰａであることがより好ましい。
　送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｉｉ）の場合、０．１～１ＭＰａであることが好ましく、０．２～０．８ＭＰａであることがより好ましい。
　送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｉｉｉ）の場合、０．１～１ＭＰａであることが好ましく、０．２６９ＭＰａ以下であることがより好ましい。送液ポンプの稼働空気圧を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。
　送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｉｖ）の場合、０．１～１ＭＰａであることが好ましく、０．３４９ＭＰａ以下であることがより好ましい。
　送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｖ）の場合、０．１～１ＭＰａであることが好ましく、０．４４９ＭＰａ以下であることがより好ましい。
　送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｖｉ）の場合、０．１～１ＭＰａであることが好ましく、０．３４９ＭＰａ以下であることがより好ましい。送液ポンプの稼働空気圧を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。
　送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｖｉｉ）の場合、０．１～１ＭＰａであることが好ましく、０．４４９ＭＰａ以下であることがより好ましい。
　送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｖｉｉｉ）の場合、０．１～１ＭＰａであることが好ましく、０．４４９ＭＰａ以下であることがより好ましい。
　送液ポンプの稼働空気圧は、前記（ｉｘ）の場合、０．３８～１ＭＰａであることが好ましく、０．４４９ＭＰａ以下であることがより好ましい。送液ポンプの稼働空気圧を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。
　本発明は、上記のｐａｃｋ　ｉｎ　ｐｌａｃｅ法において、ポンプ脈動抑制装置を取り付けるか、無脈動ポンプを用いるか、それらの両方を採用するかのいずれかによってスラリーのポンプ圧送時の脈動を抑制することを特徴とする。
　脈動とは、送液ポンプに付属するピストンや羽根等によるスラリーの吸込み及びスラリーの吐出しの各工程が交互に行われることにより、流量の変動または圧力の変動が生じたり、これら変動の差が大きくなったりして、脈打ったスラリーの流れが発生する現象のことをいう。
　当該脈動は、送液ポンプが主に容積式の往復動ポンプの場合に起こりやすく、特に大型カラムを調製する際には、必要とされる空気量が多くなるため、脈動による振動が通常よりも頻度高く発生する虞があり、ポンプや配管が破損し、寿命を縮める虞がある。
　多糖類カラム担体を送液ポンプによりカラムに充填する際には、ポンプ脈動を抑制することにより、再現性よく良好なクロマトピークが得られる充填ベッドが得られる。
　ポンプ脈動を抑制する方法としては、送液ポンプと大型カラムのライン間に脈動抑制装置を設置すること等が挙げられる。脈動抑制装置は、例えば、送液ポンプ吐出側の配管に連結され、吸引及び吐出時の圧変動や量変動を均一にするように、吐出量や吐出圧力の瞬時的変動を窒素ガスが封入されたブラダやエアーチャンバー等によって緩和する装置であればよい。
　脈動が抑制されるとは、例えば送液ポンプから大型カラムへと接続するラインにおいて、流量の変動差または圧力の変動差が小さくなること、これらの変動差が無くなること等を意味する。
　具体的な脈動抑制装置としてパルセーションダンパー、アキュムレーター等が使用できる。脈動抑制装置は、送液ポンプに対して１つ又は複数を直列又は並列につないでもよい。脈動抑制装置は、例えば直径１０～１００ｍｍ程度、好ましくは直径１０～６０ｍｍを有する管状構造を有しており、この管状構造を介して送液ポンプ側のラインと大型カラム側のラインとが接続されていてもよい。
　脈動抑制装置としては、パルセーションダンパー（ＤＴ２００ＰＴ（直径４５ｍｍの管状構造を有し、当該管状構造を介して送液ポンプ側と大型カラム側を接続する）　タプフロー社製、ＰＤ５０ＰＴＴ（直径１９ｍｍの管状構造を有し、当該管状構造を介して送液ポンプ側と大型カラム側を接続する）　タプフロー社製、ＡＤ－ＴＴＮシリーズ　株式会社ヤマダコーポレーション製、ＡＤシリーズ　株式会社ヤマダコーポレーション製、アキュムレーター（Ｎシリーズ、Ａシリーズ、Ｊシリーズ、日本アキュムレーター株式会社製））等が使用できる。
　また、脈動抑制装置を設置する代わりに、または脈動抑制装置と共に、無脈動ポンプを使用することが好ましい。
　無脈動ポンプは、吸引及び吐出時の圧変動や量変動を均一にするものであればよい。
　無脈動ポンプは、好ましくはクワトロダイヤフラムポンプ、ギヤポンプ、マグネットポンプ、モーノポンプ、スムーズフローポンプ等である。
　無脈動ポンプとしては、クワトロダイヤフラムポンプ（ＱＦ１５０シリーズ、ＱＦ１２００シリーズ、ＱＦ４４００シリーズ、ＱＦ２０Ｋ、クワトロフロー社製等）、ギヤポンプ（ＭＣ型シールレスギアポンプ、大東工業株式会社；ＣＦ型ステンレスロータリーポンプ、ＰＦ型ステンレスロータリーポンプ、株式会社花塚製作所製等）、マグネットポンプ（ＮＤ・ＭＤ－Ｆ型、ＭＸ・ＭＸＭ型マグネットポンプ、株式会社イワキ製；ＴＳＮ型、ＴＳ型、ＴＳＭ型マグネットポンプ、株式会社トーケミ製；ＹＤ－ＧＶ／ＧＶＦ型バルブレス自吸式マグネットポンプ、ＹＤ－ＧＳ／ＧＳＦ型シールレスマグネットポンプ、株式会社ワールドケミカル製；ＳＬシリーズシールレスポンプ、エレポン化工機製等）、モーノポンプ（ＮＥ型、ＮＹ型・ＮＹＴ型、ＮＹＳ型ヘイシンモーノポンプ（登録商標）、兵神装備株式会社製等）、スムーズフローポンプ（ＴＰＬ、ＸＰＬ、ＡＰＬ、ＢＰＬ、ＰＬ、ＰＬＳＳ、Ｑ、株式会社タクミナ製等）等を使用することができる。
　本発明において、脈動発生ポンプ（好ましくはダイヤフラムポンプ）は、ポンプ脈動抑制装置（好ましくはパルセーションダンパー又はアキュムレーター）と組み合わせて使用することが好ましく、脈動発生ポンプ（好ましくはダイヤフラムポンプ）の代わりに、無脈動ポンプ（好ましくはクワトロダイヤフラムポンプ、ギヤポンプ、マグネットポンプ、モーノポンプ、又はスムーズフローポンプ）を使用することが好ましい。
　大型カラム（円筒体）は、本発明の効果が得られるものであれば材質及び形状において特に制限されない。大型カラム（円筒体）は、直径３０ｃｍ以上２７０ｃｍ以下の内径を有し、直径４０ｃｍ以上２４０ｃｍ以下の内径を有することが好ましく、直径５０ｃｍ以上２００ｃｍ以下の内径を有することがより好ましく、直径６０ｃｍ以上１５０ｃｍ以下の内径を有することがさらに好ましい。
　円筒体は、円筒体上部蓋体と円筒体底面部とこれらを接続する円筒形状を有していればよく、円筒体上部蓋体と円筒体下部との間に、円筒体の内周囲に沿って円盤体が配置されていてもよい。
　円盤体は、円筒体上部蓋体側に近くなるように、円筒体上方に配設されていることが好ましい。当該円盤体下面には、スラリーを噴出するための噴出口を有するノズルが設置されていてもよい。円盤体は、使用するスラリーや必要とされる充填ベッド高さに応じて、上下方向に移動してもよい。
　ノズルは、円盤体に１つ又は複数存在してもよく、円盤体に１つ存在することが好ましい。ノズルの噴出口の形状や構造は、スラリーによってノズルが詰まらない限り、特に制限されない。
　円盤状フィルターは、円筒体底面部を横断していてもよく、円筒体底面部（この場合円筒体底面部は、円盤状フィルターを支持でき、溶媒を通液できる構造を有する）上にあってもよく、スラリーの担体と溶媒を分けることができるように、所定の孔径を有していればよい。カラム担体が円盤状フィルター上に堆積して充填ベッドが形成され、一方、スラリーの溶媒は円盤状フィルターの孔径を通過して、円筒体外部に排出される。
　スラリーを大型カラム（円筒体）に充填する前に、カラム内をバッファで満たし、カラム内の空気を除去することが好ましい。前記バッファとしては水、０．２ｍｏｌ／Ｌの塩水等を用いることができる。その後、スラリーを送液ポンプでスラリータンクから円筒体に送液し、円筒体の円盤体下部のノズルからスラリーを噴霧することで、充填ベッドが形成される。
　この手順中に過剰の液体はカラム出口から追い出されるが、多糖類カラム担体粒子はこれらの多糖類カラム担体粒子が通り抜けられないような小さい細孔を有するフィルター物質、いわゆる「ベッド支持体」によって保持される。その後、さらにカラムの平衡化のため、前記バッファをカラムに通液してもよい。
　充填停止時のカラム圧は、スラリー濃度と最大吐出カラム線速度に応じて変化してもよい。充填停止時のカラム圧は、例えば、長野計器株式会社製サニタリタイプ防水型デジタル圧力計を用いて測定可能である。
　充填停止時のカラム圧は、前記（ｉ）の場合、０．０１～０．５ＭＰａであることが好ましく、０．０５～０．３ＭＰａであることがより好ましい。
　充填停止時のカラム圧は、前記（ｉｉ）の場合、０．０１～０．５ＭＰａであることが好ましく、０．０５～０．３ＭＰａであることがより好ましい。
　充填停止時のカラム圧は、前記（ｉｉｉ）の場合、０．０１～０．５ＭＰａであることが好ましく、０．０５９ＭＰａ以下であることがより好ましい。充填停止時のカラム圧を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。
　充填停止時のカラム圧は、前記（ｉｖ）の場合、０．０１～０．５ＭＰａであることが好ましく、０．１９９ＭＰａ以下であることがより好ましい。
　充填停止時のカラム圧は、前記（ｖ）の場合、０．０１～０．５ＭＰａであることが好ましく、０．１７９ＭＰａ以下であることがより好ましい。
　充填停止時のカラム圧は、前記（ｖｉ）の場合、０．０１～０．５ＭＰａであることが好ましく、０．０７９ＭＰａ以下であることがより好ましい。充填停止時のカラム圧を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。
　充填停止時のカラム圧は、前記（ｖｉｉ）の場合、０．０１～０．５ＭＰａであることが好ましく、０．２３９ＭＰａ以下であることがより好ましい。
　充填停止時のカラム圧は、前記（ｖｉｉｉ）の場合、０．０１～０．５ＭＰａであることが好ましく、０．１８９ＭＰａ以下であることがより好ましい。
　充填停止時のカラム圧は、前記（ｉｘ）の場合、０．０１～０．５ＭＰａであることが好ましく、０．０８９ＭＰａ以下であることがより好ましい。充填停止時のカラム圧を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。
　充填停止時のカラム線速度は、スラリー濃度と最大吐出カラム線速度に応じて変化してもよい。カラム線速度は、スラリーが送液ラインから大型カラムに導入される際の線速度であってもよく、スラリーが円盤体下面のノズル噴出口から噴出される際の線速度であってもよく、スラリーが大型カラムを通過した後の線速度であってもよい。カラム線速度は、好ましくはスラリーが大型カラムを通過した後の線速度であり、大型カラムの直後に接続される配管に設置された流量センサー（例えばクランプオン式流量センサー　ＦＤ－Ｑ３２Ｃ　株式会社キーエンス製）で計測してもよい。
　充填停止時のカラム線速度は、前記（ｉ）の場合、１００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、４００ｃｍ／ｈｒ以上１２００ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。
　充填停止時のカラム線速度は、前記（ｉｉ）の場合、１００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、１００ｃｍ／ｈｒ以上１３００ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましく、３００ｃｍ／ｈｒ以上１１００ｃｍ／ｈｒ以下であることがさらに好ましい。
　充填停止時のカラム線速度は、前記（ｉｉｉ）の場合、１００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、２００ｃｍ／ｈｒ以上１０００ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。充填停止時のカラム線速度を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。
　充填停止時のカラム線速度は、前記（ｉｖ）の場合、１００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、７７９ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。
　充填停止時のカラム線速度は、前記（ｖ）の場合、１００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、７１９ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。
　充填停止時のカラム線速度は、前記（ｖｉ）の場合、１００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、３９９ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。充填停止時のカラム線速度を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。
　充填停止時のカラム線速度は、前記（ｖｉｉ）の場合、１００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、７９９ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。
　充填停止時のカラム線速度は、前記（ｖｉｉｉ）の場合、１００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、７１９ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。
　充填停止時のカラム線速度は、前記（ｉｘ）の場合、１００ｃｍ／ｈｒ以上１５００ｃｍ／ｈｒ以下であることが好ましく、４４９ｃｍ／ｈｒ以下であることがより好ましい。充填停止時のカラム線速度を前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。
　本発明において、スラリーの担体濃度（Ａ）、最大吐出カラム線速度（Ｂ）、ベッド形成終了時の充填圧と充填ベッド高さの比（Ｃ）の最適な組み合わせは以下の通りである。
　前記（ｉ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００５ＭＰａ／ｃｍ以上０．０２０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい；
　前記（ｉｉ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００５ＭＰａ／ｃｍ以上０．０２０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい；又は
　前記（ｉｉｉ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００２７９ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい。
　充填停止時のカラム圧／ベッド高さを前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。
　前記（ｉｖ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００９９ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい；
　前記（ｖ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００８９ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい；又は
　前記（ｖｉ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００３９ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい。
　充填停止時のカラム圧／ベッド高さを前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。
　前記（ｖｉｉ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．０１１４ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい；
　前記（ｖｉｉｉ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００８９ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい；又は
　前記（ｉｘ）の場合、充填圧／充填ベッド高さの比（Ｃ）を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とすることが好ましく、０．００４９ＭＰａ／ｃｍ以下とすることがより好ましい。
　充填停止時のカラム圧／ベッド高さを前記好ましい範囲にすると、クロマトピークをより確実にシングルピークにすることが可能となる。
　この様にして得られた充填ベッドは、次にカラム性能評価に供されてもよく、バッファを通液して充填ベッドを平衡化してもよい。
　充填ベッドの高さは、使用されるカラムパッキング装置の内径及びスラリーの体積に応じて適切な範囲とすればよく、例えば５～５０ｃｍであり、好ましくは１０～３０ｃｍである。
　充填ベッドの容積は、上記のカラムパッキング装置の内径や充填ベッドの高さに応じて適切な範囲とすればよく、例えば０．０１～１．０ｍ3、好ましくは０．０５～０．５ｍ3である。
　カラム性能評価では、カラム充填評価マーカーを用いてクロマトグラムのピーク形状を評価する。用いるカラム充填評価マーカーとしては、０．５ｍｏｌ／Ｌの塩水、１０ｍｇ／ｍｌのアセトン水溶液等が挙げられる。
　上記カラム充填評価マーカーをカラムに注入し、バッファをカラムに通液する。カラム通過液の電気伝導度を検知し、クロマトグラムのピーク形状を評価する。
　電気伝導度は、例えば導電率センサ（マイクロゼロ社製、ＭＺＳ２０６）等により求めることができる。
　本発明は、下記カラム性能評価法に従って得られるクロマトグラムが、形状：シングルピーク、理論段数：１５００以上、アシンメトリー：０．７以上１．７以下となる充填ベッドを製造する方法であることが好ましい。
　（カラム性能評価法）
　ピーク形成用試料：濃度０．５ｍｏｌ／Ｌの塩水又は濃度１０ｍｇ／ｍＬのアセトン水
　試料チャージ量：０．５～５Ｌ、好ましくは０．８～２Ｌ
　移動相：水又は０．２ｍｏｌ／Ｌの塩水
　移動相線速：１２～１２０ｃｍ／ｈｒ、好ましくは２４～６０ｃｍ／ｈｒ
　検知：電気伝導度
　得られたクロマトグラムのピーク形状の歪さは下記式で評価することができる。
　シングルピークを表すガウス分布式
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　ピーク形状の歪さは複数ピークが重なっていると考え、次式でフィッティングし、ピーク分割を行う。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　上記式中、Ｈ0、Ｈ01、Ｈ02はピーク高さを、tc、ｔc1、ｔc2はピークトップ位置を、σ0、σ01、σ02はピーク幅を表している。ピーク高さが最も高いピーク（メインピークとする）のピーク面積を全ピーク面積で割り、ピーク形状の歪さを評価する。メインピーク面積（エリア）／全ピーク面積（エリア）の値が１である場合、クロマトピークがシングルピークとみなされる。
　メインピーク面積／全ピーク面積の値が１であるものは、カラム高１ｍあたりの理論段数とアシンメトリーを次式で評価する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　上記式中、σ0.5はピーク半分高さの幅、Ｌはカラム高を表している。ｔa、ｔbはピーク高さ１０％の位置で、ｔa＜ｔc、ｔb＞ｔcである。
　本発明の製造方法で得られる充填ベッドは上記評価方法で評価した際のクロマトピークがシングルピークであり、かつ理論段数が１５００以上（好ましくは１７００以上、より好ましくは２０００以上、さらに好ましくは３０００以上）、アシンメトリーが０．７以上１．７以下（好ましくは０．７５以上１．６以下）であることが望ましい。
　本願は、２０１８年３月３０日に出願された日本国特許出願第２０１８－０６７７６８号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１８年３月３０日に出願された日本国特許出願第２０１８－０６７７６８号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
　多糖類カラム担体としてスラリー濃度５０体積％のプロテインＡ担体（Ｋａｎｅｋａ　ＫａｎｃａｐＡ）をスラリータンクに２７０Ｌ調製した。Ｋａｎｅｋａ　ＫａｎｃａｐＡは、累積体積分布の中間粒径として平均粒子径８０μｍのプロテインＡ担体である。スラリー溶媒、バッファは水を使用した。スラリー濃度はスラリータンクよりサンプリングし、１００ｍＬのメスシリンダーにスラリーをいれ、一晩沈降させることで測定した。その際に、メスシリンダーはシンフォニアテクノロジー株式会社製バイブレトリーパッカＶＰ－４Ｄを使用し、タッピングした。
　スラリータンク中のスラリーは佐竹化学機械株式会社製ポータブルミキサーＡ７４０を使用して攪拌した。
　スラリーは、バッファでカラム内を空気抜きされたＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製クロマフローカラムに送液した。クロマフローカラムはカラム径８０ｃｍのものを使用し、ベッド高は２０ｃｍに設定した。スラリーの送液はタプフロー社製ダイヤフラムポンプＴＨＵ２０３（内径８０ｃｍのカラムに対する最大吐出カラム線速度３９５０ｃｍ／ｈｒ）を使用した。ポンプ駆動のための圧縮空気は日立社製マルチドライブスクロールＳＲＬ－１５ＤＭＮ６を用いて作製し、ポンプ駆動空気圧はレギュレーターで表１に示す値に調整した。脈動抑制装置として、パルセーションダンパー（ＤＴ２００ＰＴ　直径４５ｍｍの管状構造を介して送液ポンプ（ダイヤフラムポンプ）側と大型カラム（クロマフローカラム）側を接続した。タプフロー社製）を、送液ポンプの吐出側に直列に接続し、パルセーションダンパー空気圧はポンプ駆動空気圧と同じ値に調整した。
　スラリーがカラム内に送液されていくにつれ、充填ベッドが形成された。充填ベッドの形成は目視で確認し、充填中のベッド高が１９．５ｃｍに到達したところで、スラリーの送液を停止した。充填中のカラム圧力は、長野計器株式会社製サニタリタイプ防水型デジタル圧力計で測定し、カラム出口から追い出された水の流量はキーエンス社製クランプオン式流量センサーＦＤＱ－３２Ｃで検知した。充填終了後、ＴＥＫＮＯＦＬＯＷ社製ロータリーポンプＬＡＢＴＯＰ４５０を使用し、２カラム体積分のバッファを流し、カラムの平衡化を行うことで、充填ベッドを得た。
　その後、０．５ｍｏｌ／Ｌの塩水をカラムに１Ｌ注入し、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製チューブポンプＰｒｏＦｌｕｘＭ１２により４Ｌ／ｍｉｎの速度で通液することで、カラム性能を評価した。具体的には、カラム出口より追い出されたバッファの電気伝導度をマイクロゼロ社製の導電率センサ（ＭＺＳ２０６）で測定し、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を評価した。表１に結果を記す。また、ピーク形状（メインピークエリア／全ピークエリア）を図２に記す。図２に示す様に、ピーク形状は、良好なシングルピークを示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例２
　スラリー濃度を４０体積％、スラリー体積を３４３Ｌとした以外は実施例１と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表２に結果を記す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
比較例１
　パルセーションダンパーＤＴ２００ＰＴを使用しなかった以外は実施例２と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表３に結果を記す。また、得られた歪なピーク例を図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
実施例３
　スラリー濃度を３４体積％、スラリー体積を３９２Ｌとした以外は実施例１と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表４に結果を記す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
比較例２
　パルセーションダンパーＤＴ２００ＰＴを使用しなかった以外は実施例３と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表５に結果を記す。図４に実施例１～３、比較例１～２の結果を記す。パルセーションダンパーを使用し、脈動を抑制することでスラリー濃度、充填停止時カラム圧／ベッド高の値に関わらず、シングルピークが得られやすいことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
実施例４
　ダイヤフラムポンプをタプフロー社製Ｔ－１００とした以外は実施例１と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表６に結果を記す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
実施例５
　スラリー濃度を４０体積％、スラリー体積を３４３Ｌとした以外は実施例４と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表７に結果を記す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
比較例３
　パルセーションダンパーＤＴ２００ＰＴを使用しなかった以外は実施例５と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表８に結果を記す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
実施例６
　スラリー濃度を３４体積％、スラリー体積を３９２Ｌとした以外は実施例４と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表９に結果を記す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
比較例４
　パルセーションダンパーＤＴ２００ＰＴを使用しなかった以外は実施例６と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表１０に結果を記す。図５に実施例４～６、比較例３～４の結果を記す。パルセーションダンパーにより脈動を抑制することでスラリー濃度、充填停止時カラム圧／ベッド高の値に関わらず、シングルピークが得られやすいことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
実施例７
　ダイヤフラムポンプをタプフロー社製Ｔ－５０、パルセーションダンパーをタプフロー社製ＰＤ５０ＰＴＴ（直径１９ｍｍの管状構造を有する）とした以外は実施例１と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表１１に結果を記す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
比較例５
　パルセーションダンパーＰＤ５０ＰＴＴを使用しなかった以外は実施例７と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表１２に結果を記す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
実施例８
　スラリー濃度を４０体積％、スラリー体積を３４３Ｌとした以外は実施例７と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表１３に結果を記す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
比較例６
　パルセーションダンパーＰＤ５０ＰＴＴを使用しなかった以外は実施例８と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表１４に結果を記す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
実施例９
　スラリー濃度を３４体積％、スラリー体積を３９２Ｌとした以外は実施例７と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表１５に結果を記す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
比較例７
　パルセーションダンパーＰＤ５０ＰＴＴを使用しなかった以外は実施例９と同様の方法、条件により充填ベッドを得た。表１６に結果を記す。図６に実施例７～９、比較例５～７の結果を記す。パルセーションダンパーにより脈動を抑制することでスラリー濃度、充填停止時カラム圧／ベッド高の値に関わらず、シングルピークが得られやすいことが示された。また、脈動を抑制することで、非常に低い充填停止時カラム圧／ベッド高、すなわち遅いスラリー送液速度でもシングルピークが得られやすいことがわかる。これにより、大型カラム充填において必要とされるポンプを小型化することができる。ポンプが小型になれば、ポンプ駆動のためのエアーコンプレッサーを小型化できるなど、カラム付帯設備費用が安価にできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　１：スラリー
　２：スラリータンク
　３：スラリー送液ライン
　４：送液ポンプ
　５：上部蓋体
　６：円筒体
　７：底面部
　８：円盤体
　９：円盤状フィルター
　１０：ノズル
　１１：排出ライン
　１２：脈動抑制装置
　２０：カラムパッキング装置

Claims (7)

  1. 　直径３０ｃｍ以上２７０ｃｍ以下の内径を有する円筒体と、該円筒体内下部を横断する円盤状フィルターと、該フィルターの上方に配設された円盤体と、この円盤体下面に噴出口を有するノズルとを備えたカラムパッキング装置を用い、多糖類カラム担体を含むスラリーをポンプ圧送して前記ノズルから噴出させ、円盤状フィルターの上に該担体の充填ベッドを製造する方法であって、
    　ポンプ脈動抑制装置を取り付けるか、無脈動ポンプを用いるか、それらの両方を採用するかのいずれかによって前記スラリーのポンプ圧送時の脈動を抑制することを特徴とする充填ベッドの製造方法。
  2. 　下記カラム性能評価法に従って得られるクロマトグラムが、形状：シングルピーク、理論段数：１５００以上、アシンメトリー：０．７以上１．７以下となる充填ベッドを製造する請求項１に記載の製造方法。
    　（カラム性能評価法）
    　ピーク形成用試料：濃度０．５ｍｏｌ／Ｌの塩水又は濃度１０ｍｇ／ｍＬのアセトン水
    　試料チャージ量：１．０Ｌ
    　移動相：水又は０．２ｍｏｌ／Ｌの塩水
    　移動相線速：４８ｃｍ／ｈｒ
    　検知：電気伝導度
  3. 　前記脈動抑制装置が、パルセーションダンパー、又はアキュムレーターである請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　前記無脈動ポンプが、クワトロダイヤフラムポンプ、ギヤポンプ、マグネットポンプ、モーノポンプ、又はスムーズフローポンプである請求項１～３のいずれかに記載の製造方法。
  5. 　スラリーの担体濃度（Ａ）の範囲を２８体積％以上８０体積％以下とし、ポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を４７５ｃｍ／ｈｒ以上３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、ベッド形成終了時の充填圧と充填ベッド高さの比（充填圧／充填ベッド高さ）（Ｃ）の範囲を０．００１ＭＰａ／ｃｍ以上０．０３０ＭＰａ／ｃｍ以下とする、請求項１～４のいずれかに記載の製造方法。
  6. 　以下のいずれかの条件で行う請求項１～５のいずれかに記載の製造方法。
    　（Ｉ）スラリーの担体濃度（Ａ）の範囲が３５体積％以上８０体積％以下であってポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を４７５ｃｍ／ｈｒ以上３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、ポンプ稼働空気圧の範囲を０．１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下とする
    　（ＩＩ）スラリーの担体濃度（Ａ）の範囲が２８体積％以上３５体積％未満であってポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を７１５ｃｍ／ｈｒ超３９５０ｃｍ／ｈｒ以下とし、ポンプ稼働空気圧の範囲を０．１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下とする
    　（ＩＩＩ）スラリーの担体濃度（Ａ）の範囲が２８体積％以上３５体積％未満であってポンプの最大吐出カラム線速度（Ｂ）の範囲を４７５ｃｍ／ｈｒ以上７１５ｃｍ／ｈｒ以下とし、ポンプ稼働空気圧の範囲を０．３８ＭＰａ以上１ＭＰａ以下とする
  7. 　前記多糖類カラム担体が、累積体積分布の中間粒径としての平均粒子径５０～１００μｍを有する、請求項１～６のいずれかに記載の製造方法。
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