JP2021059555A - アミン含有トランスフェクション試薬ならびにそれを生成および使用するための方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】生物学的に活性な物質のインビトロ及びインビボ送達のための新規アミン含有トランスフェクション化合物並びにそれを生成及び使用するための方法の提供。【解決手段】式Ｉで示されるアミン含有トランスフェクション化合物。［Ｘ１及びＸ２は、各々Ｏ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ−Ｃ１−２０アルキル等；Ｙ及びＺは、各々Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ−ＯＨ又はＳＯ２；Ｒ１〜Ｒ７は、Ｈ、脂肪族基等；ｘは１〜１０の整数；ｎは１〜３の整数；ｍは０〜２０の整数；ｐは０又は１］【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９に基づき、２０１１年１０月４日出願の米国仮出願番号６１／５４３，２４２および２０１１年２月２日出願の米国仮出願番号６１／４３８，９０３および２０１１年１月２８日出願の米国仮出願番号６１／４３７，５０３および２２１０年１１月１５日出願の米国仮出願番号６１／４１３，９０５に対して優先権を主張するものである。上述の出願は、本願と共同所有されており、それらの全内容は、本明細書中に完全に示されたかのように、それらの全体が明確に参考として援用される。
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９に基づき、２０１１年１０月４日出願の米国仮出願番号６１／５４３，２４２および２０１１年２月２日出願の米国仮出願番号６１／４３８，９０３および２０１１年１月２８日出願の米国仮出願番号６１／４３７，５０３および２２１０年１１月１５日出願の米国仮出願番号６１／４１３，９０５に対して優先権を主張するものである。上述の出願は、本願と共同所有されており、それらの全内容は、本明細書中に完全に示されたかのように、それらの全体が明確に参考として援用される。
発明の分野
本発明は、概して、生物学的に活性な物質のインビトロ送達およびインビボ送達のためのトランスフェクション試薬の分野に関する。より詳細には、本発明は、インビトロまたはインビボにおいて核酸または他の生物学的に活性な物質を細胞に導入するために使用され得る、生分解性および生体適合性の脂質ならびにそれらを使用して生成されたトランスフェクション複合体に関する。
本発明は、概して、生物学的に活性な物質のインビトロ送達およびインビボ送達のためのトランスフェクション試薬の分野に関する。より詳細には、本発明は、インビトロまたはインビボにおいて核酸または他の生物学的に活性な物質を細胞に導入するために使用され得る、生分解性および生体適合性の脂質ならびにそれらを使用して生成されたトランスフェクション複合体に関する。
ヌクレオチドベースの薬物の適用による疾患の処置のような遺伝子治療は、重要な医学分野となっている。典型的なものとしては、近年、遺伝子トランスファーベクターとして改変ウイルスが使用されている。しかしながら、ウイルスベクターを使用した際に望まれていない免疫応答などの望ましくない副作用が発生する可能性に対する懸念から、非ウイルス性の代替物（例えば、ポリマー送達系、リポソーム製剤および「裸の」ＤＮＡ注射）の開発が試みられている。これらの代替アプローチは未だウイルスベクターの臨床上の有効性に達していないが、これらの方法によってもたらされる潜在的な安全性、プロセシングおよび経済的恩恵は、期待できるものである。
したがって、核酸をトランスフェクトするために使用するために容易かつ経済的に効率的に調製されるより良好な無毒性、生分解性、生体適合性の脂質が必要とされている。そのような脂質は、遺伝子治療、ならびに診断的、治療的および予防的な薬物のパッケージングおよび／または送達における核酸の送達をはじめとしたいくつかの用途を有するだろう。本明細書は、そのような新しいトランスフェクション試薬およびそれを合成するための方法を記載する。
本発明は、アミン含有トランスフェクション試薬およびそれを合成するための方法に関する。本発明のさらなる実施形態は、１つ以上の生物学的に活性な物質をインビトロにおいて細胞にまたはインビボにおいてヒトもしくは動物の組織に細胞内送達する際の使用に適したトランスフェクション複合体を生成するためのアミン含有トランスフェクション試薬の使用に関する。
本発明のいくつかの実施形態によると、一般構造Ｉを有するアミン含有トランスフェクション化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくは誘導体が提供され：
式中、Ｘ１およびＸ２の各々は、Ｏ、Ｓ、Ｎ−ＡおよびＣ−Ａからなる群から独立して選択される部分であり、ここで、Ａは、水素およびＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖からなる群から選択され；ＹおよびＺの各々は、ＣＨ−ＯＨ、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝ＯおよびＳＯ２からなる群から独立して選択される部分であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の各々は、水素、環式または非環式の置換または非置換の分枝状または非分枝状の脂肪族基、環式または非環式の置換または非置換の分枝状または非分枝状のヘテロ脂肪族基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアシル基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアリール基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のヘテロアリール基からなる群から独立して選択される部分であり、ｘは、１以上１０以下の値を独立して有する整数であり、ｎは、１以上３以下の値を独立して有する整数であり、ｍは、０以上２０以下の値を独立して有する整数であり、ｐは、０または１の値を独立して有する整数であり、ここで、ｍ＝ｐ＝０である場合、Ｒ２は、水素であるが、但しさらに、ｎまたはｍの少なくとも１つが２という値を有する場合、Ｒ３および構造Ｉ中の窒素は：
からなる群から選択される部分を形成し、式中、ｇ、ｅおよびｆの各々は、１以上６以下の値を独立して有する整数であり、「ＨＣＣ」は、炭化水素鎖を表し、各＊は、構造Ｉ中の窒素原子を示す。
本発明の他の実施形態によると、一般構造ＩＩを有するアミン含有トランスフェクション化合物またはその薬学的に許容可能な塩が提供され：
式中、ｎ＝ｐ＝０のとき、Ｒ２は、Ｈである。
本発明の他の実施形態によると、構造Ｉを有するアミン含有トランスフェクション化合物またはその薬学的に許容可能な塩を合成するための方法が提供され、その方法は、構造Ｒ１−Ｘ１−Ｙ−（ＣＲ４Ｒ５）ｎ−Ｂｒを有する第１中間体および構造Ｒ２−Ｘ２−Ｚ−（ＣＲ６Ｒ７）ｍ−Ｂｒを有する第２中間体からなる群から選択される少なくとも２つの化合物を含む１当量以上の不飽和成分（これらの構造の（ＣＲ４Ｒ５）ｎおよび（ＣＲ６Ｒ７）ｍ部分において、各Ｒ４は、同じであるかまたは異なり、各Ｒ５は、同じであるかまたは異なり、各Ｒ６は、同じであるかまたは異なり、各Ｒ７は、同じであるかまたは異なり、第１および第２中間体は、同じであるかまたは異なる）を、第一級アミンＮＨ２−Ｒ３、ジアミン、ポリアミンまたはそれらの組み合わせを含む１当量のアミノ成分と反応させる工程を包含する。
本発明のアミン含有トランスフェクション化合物は、中性型でまたは陽イオンとして存在し得る。いくつかの実施形態において、生理的に中性または生理的に中性付近のｐＨ（例えば、約５〜約８のｐＨ）において、ここで記載される実施形態に係るアミン含有トランスフェクション化合物の優勢な形態は、陽イオンである。他の実施形態において、生理的に中性または生理的に中性付近のｐＨ（例えば、約５〜約８のｐＨ）において、ここで記載される実施形態に係るアミン含有トランスフェクション化合物の優勢な形態は、中性である。
非限定的な実施形態のさらなるセットにおいて、インビトロまたはインビボにおける細胞または組織への１つ以上の生物学的に活性な物質の送達に適したトランスフェクション複合体が、本明細書中に提供される。そのトランスフェクション複合体は、本明細書中に記載されるアミン含有トランスフェクション化合物の１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態において、そのトランスフェクション複合体は、必要に応じて１つ以上のヘルパー脂質と組み合わせて、必要に応じて１つ以上のペグ化脂質と組み合わせて、必要に応じて１つ以上の陽イオン性脂質と組み合わせて、および必要に応じて１つ以上の標的化部分と組み合わせて、生成され得る。いくつかの実施形態において、トランスフェクションは、ペプチドもしくは非ペプチドのトランスフェクションエンハンサー、融合性ペプチド物質もしくは融合性非ペプチド物質、ペプチドもしくは非ペプチドのエンドソーム放出物質、または核標的化物質（例えば、１つ以上の核局在化配列を含むペプチド（例えば、過度の実験なしに当業者に容易に明らかになるもの）を用いて行われ得る。
本明細書中に開示されるトランスフェクション複合体の調製および形成における使用に適したヘルパー脂質としては、コレステロール、コレステロール誘導体、１つ以上のステロール（フィトステロール、動物ステロールおよびホパノイド（ｈｏｐａｎｏｉｄｓ）を含む）、または細胞もしくは組織の内部に外来性の生理活性分子を導入することを可能にするかもしくは容易にすると知られている任意の中性脂質もしくは陽イオン性脂質が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、２つ以上のヘルパー脂質が、本明細書中に記載されるトランスフェクション複合体の製剤化において使用され得る。
本明細書中に示される実施形態に係るヘルパー脂質としての使用に適した例証的であるが非限定的な中性脂質または陽イオン性脂質としては、飽和および不飽和のアルキルエーテルおよび脂環式エーテルならびにアミン、アミドまたはそれらの誘導体のエステルが挙げられ得る。陽イオン性脂質の直鎖および分枝鎖のアルキル基およびアルケン基は、１〜約２５個の炭素原子を含み得る。いくつかの実施形態において、直鎖状または分枝状のアルキル基またはアルケン基は、６個以上の炭素原子を有する。いくつかの実施形態において、直鎖状または分枝状のアルキル基またはアルケン基は、８〜約２０個の炭素原子を有する。脂環式基は、約６〜３０個の炭素原子またはいくつかの実施形態において８〜２０個の炭素原子を含み得る。いくつかの実施形態において、脂環式基は、コレステロール基および他のステロイド基を含む。陽イオン性脂質は、種々の対イオン（陰イオン）（とりわけ：Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、Ｆ−、アセテート、トリフルオロアセテート、スルフェート、ニトライト、トリフレートおよびニトレートを含む）を用いて調製され得る。
ここで開示されるトランスフェクション複合体の調製における使用について企図される例示的であるが非限定的な中性脂質または陽イオン性脂質としては、以下から選択される１つ以上の（ｏｎｅ ｏｒ）脂質が挙げられ得る：ＢＭＯＰ（Ｎ−（２−ブロモエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（９−オクタデセニルオキシ）−プロパンアミニウムブロミド（ｐｒｏｐａｎａ ｍｉｎｉｍｕｎ ｂｒｏｍｉｄｅ））、ＤＤＰＥＳ（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミド）、ＤＳＰＣ、ＣＴＡＢ：ＤＯＰＥ（臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＡＴＢ）とＤＯＰＥとの配合物）、ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＭＧ、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）、ＤＭＰＥ（ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｐｈｏｓｐａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ））、ＤＯＭＧ、ＤＭＡ、ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）、ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）、ＤＰＥＰＣ（ジパルミトイルエチルホスファチジルコリン）、ＤＯＤＡＣ（ジオレオイルジメチルアンモニウムクロリド（ｄｉｏｌｅｏｙｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ））、ＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジ−オレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミド）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−ｎ，ｎ，ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＤＡＢ（ジデシルメチルアンモニウムブロミド（ｄｉｄｏｃｅｙｌ ｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ））、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルスルフェート）、ＤＯＴＡＰ・Ｃｌ、ＤＣ−ｃｈｏｌ（３，β−Ｎ，（Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール）、ＤＯＳＰＡ（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アンモニウムトリフルオロアセテート）、ＤＣ−６−１４（Ｏ，Ｏ'−ジテトラデカノイル−Ｎ−（アルファトリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド）、ＤＣＰＥ（ジカプロイルホスファチジルエタノールアミン（Ｄｉｃａｐｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ））、ＤＬＲＩＥ（ジラウリルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン）、エチル−ＰＣ、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミドエチル］−Ｎ，Ｎ−ジ−メチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン）、ＤＭＲＩＥ（Ｎ−［１−（２，３ジミリスチルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド）、ＤＯＥＰＣ（ジオレオイルエチル−ホスホコリン）、ＤＯＨＭＥ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ−［１−（２−ヒドロキシエチル）］−Ｎ，Ｎジメチルアンモニウムヨージド）、ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ（Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ドデシルオキシ）−１−プロパンイミニウムブロミド／ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（３−リシル（１−グリセロール））・Ｃｌ）、Ｎ−ラウロイルサルコシン、（Ｒ）−（＋）−リモネン、レシチン類（およびそれらの誘導体）；ホスホチジルエタノールアミン（およびその誘導体）；ホスファチジルエタノールアミン類、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰＰＥジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｐａｌｍｉｔｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、Ｏ−Ｃｈｏｌ（３ベータ［１−オルニチンアミドカルバモイル］コレステロール）、ＰＯＰＥ（パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン）およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン；ホスホチジルコリン；ホスファチジルコリン類、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）およびジステアロイルホスファチジルコリン；ホスファチジルグリセロール；ピペラジンベースの陽イオン性脂質、ホスファチジルグリセロール類、例えば、ＤＯＰＧ（ジオレオイルホスファチジルグリセロール）、ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）およびジステアロイルホスファチジルグリセロール；ホスファチジルセリン（およびその誘導体）；ホスファチジルセリン類、例えば、ジオレオイル−またはジパルミトイルホスファチジルセリン；ジ第四級アンモニウム塩（ｄｉｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔｓ）、例えば、Ｎ，Ｎ'−ジオレイル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−１，２−エタンジアミン（ＴｍｅｄＥｃｅ）、Ｎ，Ｎ'−ジオレイル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−１，３−プロパンジアミン（ＰｒｏｐＥｃｅ）、Ｎ，Ｎ'−ジオレイル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−１，６−ヘキサンジアミン（ＨｅｘＥｃｅ）およびそれらの対応するＮ，Ｎ'−ジセチル飽和アナログ（ＴｍｅｄＡｃｅ、ＰｒｏｐＡｃｅおよびＨｅｘＡｃｅ）、ジホスファチジルグリセロール類；脂肪酸エステル類；一価陽イオン性トランスフェクション脂質、例えば、１−デオキシ−１−［ジヘキサデシル（メチル）アンモニオ］−Ｄ−キシリトール；１−デオキシ−１−［メチル（ジテトラデシル）アンモニオ］−Ｄアラビニトール；１−デオキシ−１−［ジヘキサデシル（メチル）アンモニオ］−Ｄ−アラビニトール；１−デオキシ−１−［メチル（ジオクタデシル）アンモニオ］−Ｄアラビニトール、グリセロールエステル類；スフィンゴ脂質；カルジオリピン（ｃａｒｄｏｌｉｐｉｎ）；セレブロシド類；およびセラミド類；ならびにそれらの混合物。中性脂質にはまた、とりわけ、コレステロールおよび他の３βＯＨ−ステロール、ならびにその誘導体ホスファチジルコリンまたは商業的に入手可能な陽イオン性脂質混合物、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラメチル−Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラパルミチルスペルミン（ＴＭＴＰＳ）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）との１：１．５（Ｍ／Ｍ）配合物、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（登録商標）、ＧＳ ２８８８ ＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＦＵＧＥＮＥ ６（登録商標）、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００（登録商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＬＩＰＯＴＡＸＩ（登録商標）、ＰＯＬＹＥＣＴ（登録商標）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）、ＴＦＸＮ（商標）、ＴＲＡＮＳＦＡＳＴ（商標）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）、ＴＲＡＮＳＭＥＳＳＥＮＧＥＲ（登録商標）、ベクタミジン（ｖｅｃｔａｍｉｄｉｎｅ）（３−テトラデシルアミノ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ'−テトラデシルプロピオンアミジン（ジＣ１４−アミジンとしても知られる）、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）が含まれる。上に列挙されたヘルパー脂質の組み合わせの任意の混合物もまた企図される。
本明細書中に開示されるトランスフェクション複合体の調製および形成における使用に適したペグ化脂質は、本明細書中に記載されるトランスフェクション複合体の形成、およびそのインビボにおける動物もしくはヒトへのまたはインビトロにおける組織もしくは細胞への投与と適合性である任意の脂質または脂質の混合物であり得る。本発明において使用されるペグ化脂質には、約２５０ダルトン〜約１２，０００またはいくつかの実施形態において約３５０ダルトン〜約６，０００ダルトン、またはいくつかの実施形態において約５００ダルトン〜約１，０００ダルトン、またはいくつかの実施形態において約１，０００ダルトン〜約２，０００ダルトン、またはいくつかの実施形態において、約２，０００ダルトン〜５，０００ダルトンの分子量を有するＰＥＧポリマーが含まれる。
いくつかの実施形態において、トランスフェクション複合体は、インビトロまたはインビボにおいて細胞または標的組織に送達される１つ以上の生物学的に活性な物質を含み得る。好適な生物学的に活性な物質には、ここで記載されるアミン含有トランスフェクション試薬とトランスフェクション複合体を形成することができ、かつインビボまたはインビトロにおいて細胞の内部または組織に送達されると生物学的応答を誘発する、任意の分子が含まれ得る。ここで記載される実施形態における使用について企図される生物学的に活性な物質は、陽イオン性、中性または陰イオン性の物質であり得る。非限定的な例として、トランスフェクション複合体としての製剤化に適した例示的な生物学的に活性な物質としては；核酸（一本鎖または二本鎖の線状または環状のＤＮＡ分子（ｃＤＮＡ分子を含む）、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、センスオリゴヌクレオチドを含むがこれらに限定されない）、ポリペプチド、抗体、オリゴペプチド、治療用のペプチドもしくはタンパク質分子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、陽イオン性、陰イオン性もしくは中性の有機分子または薬物がその薬学的に許容可能な塩に加えて挙げられ得るが、これらに限定されない。
本発明のある特定の非限定的な例示的実施形態において、インビトロまたはインビボにおいて核酸分子を細胞または組織に送達する（遺伝子発現を阻害するために細胞内にＲＮＡ干渉分子（ＲＮＡｉ）または低分子干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）を送達することを含む）ために本発明の化合物を使用するトランスフェクション複合体および方法が提供される。
ある特定の非限定的な例示的実施形態において、特定のタンパク質の発現を促進するためにインビボまたはインビトロにおいてｍＲＮＡ分子を細胞または組織に送達するために本発明の化合物を使用するトランスフェクション複合体および方法が提供される。
本発明の他の非限定的な例示的実施形態において、インビボまたはインビトロにおいてＤＮＡ分子（ｃＤＮＡ分子を含む）を細胞または組織に送達するため、特定のタンパク質の発現を促進するためまたは特定のＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ分子またはＲＮＡｉもしくはｍｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ分子を含むがこれらに限定されない）を合成するために本発明の化合物を使用するトランスフェクション複合体および方法が提供される。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるトランスフェクション複合体は、必要に応じて１つ以上の融合性または細胞透過性ペプチドを含み得る。融合性または細胞透過性ペプチドは、脂質含有複合体と細胞膜（原形質膜またはエンドソーム膜）との融合を促進することができる任意のペプチド分子である。種々の融合性または細胞透過性ペプチドが当該分野で公知であり、過度の実験なしに好適な融合性または細胞透過性ペプチドを特定することおよび本発明においてそれを使用するための条件を特定することは、十分に当業者の技術レベルの範囲内である。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるトランスフェクション複合体は、必要に応じて１つ以上のトランスフェクションヘルパーまたは標的化部分を含み得る。標的化部分は、ペプチド、改変されたペプチド、抗体、改変された抗体、レセプター分子、改変されたレセプター分子、一本鎖もしくは二本鎖の核酸分子、改変された一本鎖もしくは二本鎖の核酸分子、ペプチドアプタマーもしくは核酸アプタマー、改変されたペプチドアプタマーもしくは核酸アプタマー、有機分子、多糖、または生物学的物質の標的化送達のためにトランスフェクション複合体を特定の組織もしくは細胞型に標的化することができる他の任意の分子（例えば、当業者に容易に明らかになるもの）であり得る。いくつかの実施形態において、ペプチド、抗体、核酸、アプタマーなどの改変は、そのペプチド、抗体、核酸、アプタマーなどをＰＥＧ部分に結合体化することを含み得る。あるいは、ペプチド、抗体、核酸、アプタマーなどの改変は、そのペプチド、抗体、核酸、アプタマーなどをＰＥＧ脂質部分に結合体化することを含み得る。種々の標的化部分は、当業者に広く公知のものであり、そのすべてが、限定されないがここで記載される実施形態での使用について企図される。
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるトランスフェクション複合体は、最長１年間にわたって安定であり得、トランスフェクトするために細胞もしくは組織と接触され得るか、または形成された直後もしくはすぐ後に動物もしくはヒトに投与され得るか、あるいは必要に応じて、細胞もしくは組織と接触させるまでまたは動物もしくはヒトに投与するまでの時間にわたって貯蔵され得る。本トランスフェクション複合体は、安定であり、室温、または凍結温度より高い温度からおよそ室温までの温度において少なくとも３０分間、少なくとも４５分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも５日間、少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２８日間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間または少なくとも１年間にわたって貯蔵され得る。本明細書中に記載される製剤が、生理活性な製剤の長期間の安定化および貯蔵を助ける１つ以上の安定化剤、保存剤、緩衝剤など（例えば、生物学および薬学分野の当業者が容易に理解し、かつそれを確かめるために過度の実験を必要としないもの）を含み得ることが理解されるべきである。貯蔵期間が、これらの時間のいずれかの範囲、例えば、３１分間〜１時間または１時間〜２４時間であり得ることも理解される。
いくつかの実施形態において、機能性トランスフェクション複合体を調製するための方法が提供される。その方法は、概して、本明細書中に記載されるアミン含有トランスフェクション化合物の１つ以上を、必要に応じて１つ以上のヘルパー脂質、安定化脂質、トランスフェクションヘルパー、ペグ化脂質または標的化部分と組み合わせて含む組成物内に生物学的に活性な物質を被包することによって脂質凝集物を形成する工程を包含する。そのような方法は、ａ１）１つ以上のアミン含有トランスフェクション化合物、少なくとも１つのヘルパー脂質、必要に応じて２つ以上のヘルパー脂質および１つ以上のペグ化脂質またはそれらの塩をアルコール／水溶液中で混合する工程（そのアルコール濃度は＜５０％である）；ａ２）１つ以上のアミン含有トランスフェクション化合物、少なくとも１つのヘルパー、必要に応じて２つ以上のヘルパー脂質および１つ以上のペグ化脂質またはそれらの塩を、１つ以上のアミン含有トランスフェクション化合物が１５％〜５０％で存在するようなモル濃度百分率（ｍｏｌａｒ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）において混合する工程；ａ３）１つ以上のアミン含有トランスフェクション化合物、少なくとも１つのヘルパー脂質、必要に応じて２つ以上の（ｍｏｒｅ ｔｈａ ｏｎｅ）ヘルパー脂質および１つ以上のペグ化脂質またはそれらの塩を、ペグ化脂質が＜５０％で存在するようなモル濃度百分率において混合する工程；およびａ４）１つ以上のアミン含有トランスフェクション化合物、少なくとも１つのヘルパー脂質、必要に応じて２つ以上のヘルパー脂質および１つ以上のペグ化脂質またはそれらの塩を混合する工程（そのペグ化脂質は、約２０００〜１２０００のポリエチレングリコール分子量およびＣ６−Ｃ２０アルキルまたはＣ１０−Ｃ２０アルケニルの脂肪酸鎖長を有する）；ならびにそのアルコール／水溶液中の脂質凝集物を生理活性物質と複合体化することにより、トランスフェクション複合体を形成する工程（そのアルコール濃度は＜５０％、好ましくは、４０％未満である）を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、例えば、ａ１）およびａ２）、ａ２）およびａ３）、ａ１）およびａ３）、ａ２）およびａ４）、ａ３）およびａ４）、ａ１）およびａ４）またはａ１）〜ａ）４を包含する。いくつかの実施形態において、上記アルコールは、Ｃ１−Ｃ４アルコールである。いくつかの実施形態において、上記アルコールは、エタノールである。いくつかの実施形態において、上記アルコールは、薬学的に許容可能なアルコール（例えば、およそ室温において液体であるアルコール、例えば、エタノール、プロピレングリコール、２−（２−エトキシエトキシ）エタノール（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ（商標））、ベンジルアルコール、グリセロール、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００またはそれらの混合物）である。いくつかの実施形態において、混合用のアルコールは、複合体化用のアルコールと異なる。
本明細書中に記載されるさらなる実施形態は、インビボでの組織特異的（ｔｉｓｓｕｅ−ｂｉａｓｅｄ）送達のための多数のトランスフェクション化合物をスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は、マーカーの検出を難なく容易にする化合物を被験トランスフェクション化合物とともに含む複数のトランスフェクション複合体を調製する工程、その複数のトランスフェクション複合体の各々を被験動物に送達する工程、およびマーカーを検出する工程を包含し得る。
いくつかの実施形態において、トランスフェクション複合体の組織特異的送達をスクリーニングするための方法は、複数のトランスフェクション複合体（各トランスフェクション複合体は、組織への送達の検出を容易にする少なくとも１つの核酸とともに少なくとも１つの被験トランスフェクション化合物を有する）を調製する工程を包含し得る。その核酸は、直接検出され得るタンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼなど）をコードするかまたは直接検出され得るタンパク質の発現に影響するタンパク質をコードするＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子であり得る。
ある実施形態において、トランスフェクション複合体の組織特異的送達をスクリーニングするための方法は、複数の独特のトランスフェクション複合体（各トランスフェクション複合体は、緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとともに少なくとも１つの被験トランスフェクション化合物を有する）を調製する工程を包含し得る。独特のトランスフェクション複合体の各々は、マウスなどの被験動物の静脈内、皮下または組織に送達され得る。所定の時間が経過した後、そのマウスの組織が回収され得、様々な組織におけるＧＦＰの発現が、肉眼的検査、組織学的検査または分子検出（ＰＣＲ、ウエスタンブロッティングなど）によって検出されることにより、特定のトランスフェクション化合物を含むトランスフェクション複合体がどの組織に送達されたかが判定され得る。
ある実施形態において、トランスフェクション複合体の組織特異的送達をスクリーニングするための方法は、複数の独特のトランスフェクション複合体（各トランスフェクション複合体は、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとともに少なくとも１つの被験トランスフェクション化合物を有する）を調製する工程を包含し得る。独特のトランスフェクション複合体の各々は、マウスなどの被験動物の静脈内、皮下または組織に送達され得る。所定の時間が経過した後、そのマウスの組織が回収され得、様々な組織におけるルシフェラーゼの発現が、肉眼的検査、組織学的検査または分子検出（ＰＣＲ、ウエスタンブロッティングなど）によって検出され得るか、またはＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いてインビボで画像化され得る。
ある実施形態において、トランスフェクション複合体の組織特異的送達をスクリーニングするための方法は、複数の独特のトランスフェクション複合体（各トランスフェクション複合体は、特定の転写因子をコードするｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとともに少なくとも１つの被験トランスフェクション化合物を有する）を調製する工程を包含し得る。独特のトランスフェクション複合体の各々は、その特定の転写因子の支配下のレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）を発現するトランスジェニック動物の静脈内、皮下または組織に送達され得る。所定の時間が経過した後、そのトランスジェニック動物の組織が回収され得、様々な組織におけるレポーター遺伝子の発現が、肉眼的検査、組織学的検査または分子検出（ＰＣＲ、ウエスタンブロッティングなど）によって検出され得る。レポーター遺伝子がルシフェラーゼである場合、検出は、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いてインビボで行われ得る。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
一般構造Ｉを有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩：
［化１］
式中：
Ｘ１およびＸ２の各々は、Ｏ、Ｓ、Ｎ−ＡおよびＣ−Ａからなる群から独立して選択される部分であり、ここで、Ａは、水素およびＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖からなる群から選択され；
ＹおよびＺの各々は、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ−ＯＨおよびＳＯ２からなる群から独立して選択される部分であり；Ｒ１、Ｒ２およびＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の各々は、水素、環式または非環式の置換または非置換の分枝状または非分枝状の脂肪族基、環式または非環式の置換または非置換の分枝状または非分枝状のヘテロ脂肪族基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアシル基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアリール基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のヘテロアリール基からなる群から独立して選択される部分であり；
ｘは、１以上１０以下の値を独立して有する整数であり；
ｎは、１以上３以下の値を独立して有する整数であり、ｍは、０以上２０以下の値を独立して有する整数であり、ｐは、０または１の値を独立して有する整数であり、ここで、ｍ＝ｐ＝０である場合、Ｒ２は、水素であるが、
但しさらに、ｎまたはｍの少なくとも１つが２という値を有する場合、Ｒ３および構造Ｉ中の窒素は、
［化２］
からなる群から選択される部分を形成し、式中、ｇ、ｅおよびｆの各々は、１以上６以下の値を独立して有する整数であり、「ＨＣＣ」は、炭化水素鎖を表し、各＊は、構造Ｉ中の窒素原子を示す。
［２］
Ｒ１およびＲ２の各々が、３〜約２０個の炭素原子および０〜４個の二重結合を有する、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［１］記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［３］
Ｒ１およびＲ２の各々が、８〜約１８個の炭素原子および０〜２個の二重結合を有する、置換または非置換の非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［２］記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［４］
ｎおよびｍの各々が、独立して、１または３という値を有し、Ｒ３が、
［化３］
からなる群から選択され、式中、各「ＨＣＣ」は、炭化水素鎖を表し、各＊は、構造Ｉ中の窒素原子に対するＲ３の潜在的な結合点を示し、ここで、任意の＊位における各Ｈは、構造Ｉ中の窒素原子への結合を達成するために置換され得る、［１］記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［５］
ｘが、１〜６の値を有する、［１］記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［６］
一般構造ＩＩ：
［化４］
を有する［１］記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［７］
少なくとも１つのＸ１が、ＮＨである、［６］記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［８］
少なくとも１つのＸ１が、Ｏである、［６］記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［９］
各Ｒ１が、３〜約２０個の炭素原子および０〜４個の二重結合を有する、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［６］記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［１０］
Ｒ１の各々が、８〜約１８個の炭素原子および０〜２個の二重結合を有する、置換または非置換の非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［９］記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［１１］
ｎおよびｍの各々が、独立して、１または３という値を有し、Ｒ３が、
［化５］
からなる群から選択され、式中、各「ＨＣＣ」は、炭化水素鎖を表し、各＊は、構造ＩＩ中の窒素原子に対するＲ３の潜在的な結合点を示し、ここで、任意の＊位における各Ｈは、構造ＩＩ中の窒素原子への結合を達成するために置換され得る、［６］記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［１２］
ｘが、１〜６の値を有する、［６］記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［１３］
化合物１〜８７またはそれらの異性体：
［化６−１］
［化６−２］
［化６−３］
［化６−４］
［化６−５］
［化６−６］
［化６−７］
［化６−８］
［化６−９］
［化６−１０］
［化６−１１］
［化６−１２］
［化６−１３］
［化６−１４］
［化６−１５］
［化６−１６］
［化６−１７］
［化６−１８］
［化６−１９］
［化６−２０］
［化６−２１］
［化６−２２］
［化６−２３］
［化６−２４］
［化６−２５］
［化６−２６］
［化６−２７］
［化６−２８］
［化６−２９］
［化６−３０］
［化６−３１］
［化６−３２］
［化６−３３］
［化６−３４］
［化６−３５］
［化６−３６］
［化６−３７］
［化６−３８］
［化６−３９］
［化６−４０］
からなる群から選択される、［１］記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［１４］
以下の工程を含む、構造Ｉを有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩を合成するための方法：
［化７］
（ａ）構造Ｒ１−Ｘ１−Ｙ−（ＣＲ４Ｒ５）ｎ−Ｂｒを有する第１中間体および構造Ｒ２−Ｘ２−Ｚ−（ＣＲ６Ｒ７）ｍ−Ｂｒを有する第２中間体からなる群から選択される少なくとも２つの化合物を含む１当量以上の不飽和成分であって、式中、該構造の（ＣＲ４Ｒ５）ｎおよび（ＣＲ６Ｒ７）ｍ部分において、各Ｒ４は、同じであるかまたは異なり、各Ｒ５は、同じであるかまたは異なり、各Ｒ６は、同じであるかまたは異なり、各Ｒ７は、同じであるかまたは異なり、該第１中間体および該第２中間体は、同じであるかまたは異なる、１当量以上の不飽和成分を
（ｂ）第一級アミンＮＨ２−Ｒ３、ジアミン、ポリアミンまたはそれらの組み合わせを含む１当量のアミノ成分と
反応させる工程であって、それにより、構造Ｉを有する化合物を得る、工程、
式中：
Ｘ１およびＸ２の各々は、Ｏ、Ｓ、Ｎ−ＡおよびＣ−Ａからなる群から独立して選択される部分であり、ここで、Ａは、水素およびＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖からなる群から選択され；
ＹおよびＺの各々は、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ−ＯＨおよびＳＯ２からなる群から独立して選択される部分であり；Ｒ１、Ｒ２およびＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の各々は、水素、環式または非環式の置換または非置換の分枝状または非分枝状の脂肪族基、環式または非環式の置換または非置換の分枝状または非分枝状のヘテロ脂肪族基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアシル基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアリール基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のヘテロアリール基からなる群から独立して選択される部分であり；
ｘは、１以上１０以下の値を独立して有する整数であり；
ｎは、１以上３以下の値を独立して有する整数であり、ｍは、０以上２０以下の値を独立して有する整数であり、ｐは、０または１の値を独立して有する整数であり、ここで、ｍ＝ｐ＝０である場合、Ｒ２は、水素であるが、
但しさらに、ｎまたはｍの少なくとも１つが２という値を有する場合、Ｒ３および構造Ｉ中の窒素は、
［化８］
からなる群から選択される部分を形成し、式中、ｇ、ｅおよびｆの各々は、１以上６以下の値を独立して有する整数であり、「ＨＣＣ」は、炭化水素鎖を表し、各＊は、構造Ｉ中の窒素原子を示す。
［１５］
Ｒ１およびＲ２の各々が、３〜約２０個の炭素原子および０〜４個の二重結合を有する、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［１４］記載の方法。
［１６］
Ｒ１およびＲ２の各々が、３〜約２０個の炭素原子および０〜４個の二重結合を有する、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［１４］記載の方法。
［１７］
Ｒ１およびＲ２の各々が、８〜約１８個の炭素原子および０〜２個の二重結合を有する、置換または非置換の非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［１６］記載の方法。
［１８］
ｎおよびｍの各々が、独立して、１または３という値を有し、前記第一級アミンＮＨ２−Ｒ３が、
［化９］
からなる群から選択され、式中、各「ＨＣＣ」は、炭化水素鎖を表し、各＊は、該第一級アミンＮＨ２−Ｒ３中のアミノ基に対するＲ３の潜在的な結合点を示し、ここで、任意の＊位における各Ｈは、該第一級アミンＮＨ２−Ｒ３中の窒素原子への結合を達成するために置換され得る、［１４］記載の方法。
［１９］
前記アミノ成分が、第一級アミンＮＨ２−Ｒ３であり、前記不飽和成分と該第一級アミンとのモル比が、約１：１〜約６：１である、［１４］記載の方法。
［２０］
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の各々が、水素であり、ＹおよびＺの各々が、Ｃ＝Ｏである、［１４］記載の方法。
［２１］
各Ｒ１が、３〜約２０個の炭素原子および０〜４個の二重結合を有する、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［２０］記載の方法またはその薬学的に許容可能な塩。
［２２］
Ｒ１の各々が、８〜約１８個の炭素原子および０〜２個の二重結合を有する、置換または非置換の非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［２１］記載の方法またはその薬学的に許容可能な塩。
［２３］
一般構造Ｉを有するアミン含有トランスフェクション試薬またはその薬学的に許容可能な塩を含む、トランスフェクション複合体：
［化１０］
式中：
Ｘ１およびＸ２の各々は、Ｏ、Ｓ、Ｎ−ＡおよびＣ−Ａからなる群から独立して選択される部分であり、ここで、Ａは、水素およびＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖からなる群から選択され；
ＹおよびＺの各々は、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ−ＯＨおよびＳＯ２からなる群から独立して選択される部分であり；Ｒ１、Ｒ２およびＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の各々は、水素、環式または非環式の置換または非置換の分枝状または非分枝状の脂肪族基、環式または非環式の置換または非置換の分枝状または非分枝状のヘテロ脂肪族基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアシル基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアリール基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のヘテロアリール基からなる群から独立して選択される部分であり；
ｘは、１以上１０以下の値を独立して有する整数であり；
ｎは、１以上３以下の値を独立して有する整数であり、ｍは、０以上２０以下の値を独立して有する整数であり、ｐは、０または１の値を独立して有する整数であり、ここで、ｍ＝ｐ＝０である場合、Ｒ２は、水素であるが、
但しさらに、ｎまたはｍの少なくとも１つが２という値を有する場合、Ｒ３および構造Ｉ中の窒素は、
［化１１］
からなる群から選択される部分を形成し、式中、ｇ、ｅおよびｆの各々は、１以上６以下の値を独立して有する整数であり、「ＨＣＣ」は、炭化水素鎖を表し、各＊は、構造Ｉ中の窒素原子を示す。
［２４］
Ｒ１およびＲ２の各々が、３〜約２０個の炭素原子および０〜４個の二重結合を有する、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［２３］記載のトランスフェクション複合体またはその薬学的に許容可能な塩。
［２５］
Ｒ１およびＲ２の各々が、８〜約１８個の炭素原子および０〜２個の二重結合を有する、置換または非置換の非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［２４］記載のトランスフェクション複合体またはその薬学的に許容可能な塩。
［２６］
ｎおよびｍの各々が、独立して、１または３という値を有し、Ｒ３が、
［化１２］
からなる群から選択され、式中、各「ＨＣＣ」は、炭化水素鎖を表し、各＊は、構造Ｉ中の窒素原子に対するＲ３の潜在的な結合点を示し、ここで、任意の＊位における各Ｈは、構造Ｉ中の窒素原子への結合を達成するために置換され得る、［２３］記載のトランスフェクション複合体またはその薬学的に許容可能な塩。
［２７］
ｘが、１〜６の値を有する、［２３］記載のトランスフェクション複合体またはその薬学的に許容可能な塩。
［２８］
前記アミン含有トランスフェクション試薬が、一般構造ＩＩ：
［化１３］
を有する、［２３］記載のトランスフェクション複合体またはその薬学的に許容可能な塩。
［２９］
少なくとも１つのＸ１が、ＮＨである、［２８］記載のトランスフェクション複合体またはその薬学的に許容可能な塩。
［３０］
少なくとも１つのＸ１が、Ｏである、［２８］記載のトランスフェクション複合体またはその薬学的に許容可能な塩。
［３１］
各Ｒ１が、３〜約２０個の炭素原子および０〜４個の二重結合を有する、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［２８］記載のトランスフェクション複合体またはその薬学的に許容可能な塩。
［３２］
Ｒ１の各々が、８〜約１８個の炭素原子および０〜２個の二重結合を有する、置換または非置換の非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［３１］記載のトランスフェクション複合体またはその薬学的に許容可能な塩。
［３３］
ｎおよびｍの各々が、独立して、１または３という値を有し、Ｒ３が、
［化１４］
からなる群から選択され、式中、各「ＨＣＣ」は、炭化水素鎖を表し、各＊は、構造ＩＩ中の窒素原子に対するＲ３の潜在的な結合点を示し、ここで、任意の＊位における各Ｈは、構造ＩＩ中の窒素原子への結合を達成するために置換され得る、［２８］記載のトランスフェクション複合体またはその薬学的に許容可能な塩。
［３４］
ｘが、１〜６の値を有する、［２８］記載のトランスフェクション複合体またはその薬学的に許容可能な塩。
［３５］
前記化合物が、化合物１〜８７またはそれらの異性体：
［化１５−１］
［化１５−２］
［化１５−３］
［化１５−４］
［化１５−５］
［化１５−６］
［化１５−７］
［化１５−８］
［化１５−９］
［化１５−１０］
［化１５−１１］
［化１５−１２］
［化１５−１３］
［化１５−１４］
［化１５−１５］
［化１５−１６］
［化１５−１７］
［化１５−１８］
［化１５−１９］
［化１５−２０］
［化１５−２１］
［化１５−２２］
［化１５−２３］
［化１５−２４］
［化１５−２５］
［化１５−２６］
［化１５−２７］
［化１５−２８］
［化１５−２９］
［化１５−３０］
［化１５−３１］
［化１５−３２］
［化１５−３３］
［化１５−３４］
［化１５−３５］
［化１５−３６］
［化１５−３７］
［化１５−３８］
［化１５−３９］
［化１５−４０］
からなる群から選択される、［２３］記載のトランスフェクション複合体またはその薬学的に許容可能な塩。
［３６］
少なくとも１つのヘルパー脂質をさらに含む、［２３］記載のトランスフェクション複合体。
［３７］
前記ヘルパー脂質が、ＢＭＯＰ（Ｎ−（２−ブロモエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（９−オクタデセニルオキシ）−プロパンアミニウムブロミド）、ＤＤＰＥＳ（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミド）、ＤＳＰＣ、ＣＴＡＢ：ＤＯＰＥ（臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＡＴＢ）とＤＯＰＥとの配合物）、ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＭＧ、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）、ＤＭＰＥ（ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＯＭＧ、ＤＭＡ、ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）、ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）、ＤＰＥＰＣ（ジパルミトイルエチルホスファチジルコリン）、ＤＯＤＡＣ（ジオレオイルジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジ−オレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミド）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−ｎ，ｎ，ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＤＡＢ（ジデシルメチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルスルフェート）、ＤＯＴＡＰ・Ｃｌ、ＤＣ−ｃｈｏｌ（３，β−Ｎ，（Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール）、ＤＯＳＰＡ（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アンモニウムトリフルオロアセテート）、ＤＣ−６−１４（Ｏ，Ｏ'−ジテトラデカノイル−Ｎ−（アルファトリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド）、ＤＣＰＥ（ジカプロイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＬＲＩＥ（ジラウリルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン）、エチル−ＰＣ、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミドエチル］−Ｎ，Ｎ−ジ−メチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン）、ＤＭＲＩＥ（Ｎ−［１−（２，３ジミリスチルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド）、ＤＯＥＰＣ（ジオレオイルエチル−ホスホコリン）、ＤＯＨＭＥ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ−［１−（２−ヒドロキシエチル）］−Ｎ，Ｎジメチルアンモニウムヨージド）、ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ（Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ドデシルオキシ）−１−プロパンイミニウムブロミド／ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（３−リシル（１−グリセロール））・Ｃｌ）、Ｎ−ラウロイルサルコシン、（Ｒ）−（＋）−リモネン、レシチン類（およびそれらの誘導体）；ホスホチジルエタノールアミン（およびその誘導体）；ホスファチジルエタノールアミン類、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰＰＥジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、Ｏ−Ｃｈｏｌ（３ベータ［１−オルニチンアミドカルバモイル］コレステロール）、ＰＯＰＥ（パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン）およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン；ホスホチジルコリン；ホスファチジルコリン類、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）およびジステアロイルホスファチジルコリン；ホスファチジルグリセロール；ピペラジンベースの陽イオン性脂質、ホスファチジルグリセロール類、例えば、ＤＯＰＧ（ジオレオイルホスファチジルグリセロール）、ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）およびジステアロイルホスファチジルグリセロール；ホスファチジルセリン（およびその誘導体）；ホスファチジルセリン類、例えば、ジオレオイル−またはジパルミトイルホスファチジルセリン；ジ第四級アンモニウム塩、例えば、Ｎ，Ｎ'−ジオレイル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−１，２−エタンジアミン（ＴｍｅｄＥｃｅ）、Ｎ，Ｎ'−ジオレイル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−１，３−プロパンジアミン（ＰｒｏｐＥｃｅ）、Ｎ，Ｎ'−ジオレイル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−１，６−ヘキサンジアミン（ＨｅｘＥｃｅ）およびそれらの対応するＮ，Ｎ'−ジセチル飽和アナログ（ＴｍｅｄＡｃｅ、ＰｒｏｐＡｃｅおよびＨｅｘＡｃｅ）、ジホスファチジルグリセロール類；脂肪酸エステル類；一価陽イオン性トランスフェクション脂質、例えば、１−デオキシ−１−［ジヘキサデシル（メチル）アンモニオ］−Ｄ−キシリトール；１−デオキシ−１−［メチル（ジテトラデシル）アンモニオ］−Ｄアラビニトール；１−デオキシ−１−［ジヘキサデシル（メチル）アンモニオ］−Ｄ−アラビニトール；１−デオキシ−１−［メチル（ジオクタデシル）アンモニオ］−Ｄアラビニトール、グリセロールエステル類；スフィンゴ脂質；カルジオリピン；セレブロシド類；およびセラミド類；ならびにそれらの混合物からなるリストから選択され、中性脂質にはまた、コレステロールおよび他の３βＯＨ−ステロールならびにそれらの誘導体のホスファチジルコリンまたは商業的に入手可能な陽イオン性脂質混合物、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラメチル−Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラパルミチルスペルミン（ＴＭＴＰＳ）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）との１：１．５（Ｍ／Ｍ）配合物、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（登録商標）、ＧＳ ２８８８ ＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＦＵＧＥＮＥ ６（登録商標）、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００（登録商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＬＩＰＯＴＡＸＩ（登録商標）、ＰＯＬＹＥＣＴ（登録商標）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）、ＴＦＸＮ（商標）、ＴＲＡＮＳＦＡＳＴ（商標）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）、ＴＲＡＮＳＭＥＳＳＥＮＧＥＲ（登録商標）、ベクタミジン（３−テトラデシルアミノ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ'−テトラデシルプロピオンアミジン（ジＣ１４−アミジン）、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）も含まれる、［３６］記載のトランスフェクション複合体。
［３８］
少なくとも１つのペグ化脂質をさらに含む、［２３］記載のトランスフェクション複合体。
［３９］
少なくとも１つの生理活性物質をさらに含む、［２３］記載のトランスフェクション複合体。
［４０］
前記生理活性物質が、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子、薬物のタンパク質である、［３９］記載のトランスフェクション複合体。
［４１］
前記ＲＮＡ分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｓｔＲＮＡまたはｍＲＮＡである、［４０］記載のトランスフェクション複合体。
［４２］
前記生理活性物質が、ｓｉＲＮＡ分子である、［３９］記載のトランスフェクション複合体。
［４３］
前記生理活性物質が、ｍＲＮＡ分子である、［３９］記載のトランスフェクション複合体。
［４４］
前記生理活性物質が、ＤＮＡ分子である、［３９］記載のトランスフェクション複合体。
［４５］
標的化部分をさらに含む、［２３］記載のトランスフェクション複合体。
［４６］
ペプチド、改変されたペプチド、抗体、改変された抗体、レセプター分子、改変されたレセプター分子、一本鎖または二本鎖の核酸分子、改変された一本鎖または二本鎖の核酸分子、ペプチドアプタマーまたは核酸アプタマー、改変されたペプチドアプタマーまたは核酸アプタマー、有機分子、多糖からなるリストから選択される標的化部分をさらに含む、［２３］記載のトランスフェクション複合体。
本発明のこれらおよび他の特徴は、以下の説明、図面および添付の請求項を参照することにより、よりよく理解されるようになるだろう。
［１］
一般構造Ｉを有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩：
［化１］
Ｘ１およびＸ２の各々は、Ｏ、Ｓ、Ｎ−ＡおよびＣ−Ａからなる群から独立して選択される部分であり、ここで、Ａは、水素およびＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖からなる群から選択され；
ＹおよびＺの各々は、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ−ＯＨおよびＳＯ２からなる群から独立して選択される部分であり；Ｒ１、Ｒ２およびＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の各々は、水素、環式または非環式の置換または非置換の分枝状または非分枝状の脂肪族基、環式または非環式の置換または非置換の分枝状または非分枝状のヘテロ脂肪族基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアシル基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアリール基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のヘテロアリール基からなる群から独立して選択される部分であり；
ｘは、１以上１０以下の値を独立して有する整数であり；
ｎは、１以上３以下の値を独立して有する整数であり、ｍは、０以上２０以下の値を独立して有する整数であり、ｐは、０または１の値を独立して有する整数であり、ここで、ｍ＝ｐ＝０である場合、Ｒ２は、水素であるが、
但しさらに、ｎまたはｍの少なくとも１つが２という値を有する場合、Ｒ３および構造Ｉ中の窒素は、
［化２］
［２］
Ｒ１およびＲ２の各々が、３〜約２０個の炭素原子および０〜４個の二重結合を有する、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［１］記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［３］
Ｒ１およびＲ２の各々が、８〜約１８個の炭素原子および０〜２個の二重結合を有する、置換または非置換の非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［２］記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［４］
ｎおよびｍの各々が、独立して、１または３という値を有し、Ｒ３が、
［化３］
［５］
ｘが、１〜６の値を有する、［１］記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［６］
一般構造ＩＩ：
［化４］
［７］
少なくとも１つのＸ１が、ＮＨである、［６］記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［８］
少なくとも１つのＸ１が、Ｏである、［６］記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［９］
各Ｒ１が、３〜約２０個の炭素原子および０〜４個の二重結合を有する、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［６］記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［１０］
Ｒ１の各々が、８〜約１８個の炭素原子および０〜２個の二重結合を有する、置換または非置換の非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［９］記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［１１］
ｎおよびｍの各々が、独立して、１または３という値を有し、Ｒ３が、
［化５］
［１２］
ｘが、１〜６の値を有する、［６］記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
［１３］
化合物１〜８７またはそれらの異性体：
［化６−１］
［１４］
以下の工程を含む、構造Ｉを有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩を合成するための方法：
［化７］
（ｂ）第一級アミンＮＨ２−Ｒ３、ジアミン、ポリアミンまたはそれらの組み合わせを含む１当量のアミノ成分と
反応させる工程であって、それにより、構造Ｉを有する化合物を得る、工程、
式中：
Ｘ１およびＸ２の各々は、Ｏ、Ｓ、Ｎ−ＡおよびＣ−Ａからなる群から独立して選択される部分であり、ここで、Ａは、水素およびＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖からなる群から選択され；
ＹおよびＺの各々は、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ−ＯＨおよびＳＯ２からなる群から独立して選択される部分であり；Ｒ１、Ｒ２およびＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の各々は、水素、環式または非環式の置換または非置換の分枝状または非分枝状の脂肪族基、環式または非環式の置換または非置換の分枝状または非分枝状のヘテロ脂肪族基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアシル基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアリール基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のヘテロアリール基からなる群から独立して選択される部分であり；
ｘは、１以上１０以下の値を独立して有する整数であり；
ｎは、１以上３以下の値を独立して有する整数であり、ｍは、０以上２０以下の値を独立して有する整数であり、ｐは、０または１の値を独立して有する整数であり、ここで、ｍ＝ｐ＝０である場合、Ｒ２は、水素であるが、
但しさらに、ｎまたはｍの少なくとも１つが２という値を有する場合、Ｒ３および構造Ｉ中の窒素は、
［化８］
［１５］
Ｒ１およびＲ２の各々が、３〜約２０個の炭素原子および０〜４個の二重結合を有する、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［１４］記載の方法。
［１６］
Ｒ１およびＲ２の各々が、３〜約２０個の炭素原子および０〜４個の二重結合を有する、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［１４］記載の方法。
［１７］
Ｒ１およびＲ２の各々が、８〜約１８個の炭素原子および０〜２個の二重結合を有する、置換または非置換の非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［１６］記載の方法。
［１８］
ｎおよびｍの各々が、独立して、１または３という値を有し、前記第一級アミンＮＨ２−Ｒ３が、
［化９］
［１９］
前記アミノ成分が、第一級アミンＮＨ２−Ｒ３であり、前記不飽和成分と該第一級アミンとのモル比が、約１：１〜約６：１である、［１４］記載の方法。
［２０］
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の各々が、水素であり、ＹおよびＺの各々が、Ｃ＝Ｏである、［１４］記載の方法。
［２１］
各Ｒ１が、３〜約２０個の炭素原子および０〜４個の二重結合を有する、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［２０］記載の方法またはその薬学的に許容可能な塩。
［２２］
Ｒ１の各々が、８〜約１８個の炭素原子および０〜２個の二重結合を有する、置換または非置換の非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［２１］記載の方法またはその薬学的に許容可能な塩。
［２３］
一般構造Ｉを有するアミン含有トランスフェクション試薬またはその薬学的に許容可能な塩を含む、トランスフェクション複合体：
［化１０］
Ｘ１およびＸ２の各々は、Ｏ、Ｓ、Ｎ−ＡおよびＣ−Ａからなる群から独立して選択される部分であり、ここで、Ａは、水素およびＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖からなる群から選択され；
ＹおよびＺの各々は、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ−ＯＨおよびＳＯ２からなる群から独立して選択される部分であり；Ｒ１、Ｒ２およびＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の各々は、水素、環式または非環式の置換または非置換の分枝状または非分枝状の脂肪族基、環式または非環式の置換または非置換の分枝状または非分枝状のヘテロ脂肪族基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアシル基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアリール基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のヘテロアリール基からなる群から独立して選択される部分であり；
ｘは、１以上１０以下の値を独立して有する整数であり；
ｎは、１以上３以下の値を独立して有する整数であり、ｍは、０以上２０以下の値を独立して有する整数であり、ｐは、０または１の値を独立して有する整数であり、ここで、ｍ＝ｐ＝０である場合、Ｒ２は、水素であるが、
但しさらに、ｎまたはｍの少なくとも１つが２という値を有する場合、Ｒ３および構造Ｉ中の窒素は、
［化１１］
［２４］
Ｒ１およびＲ２の各々が、３〜約２０個の炭素原子および０〜４個の二重結合を有する、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［２３］記載のトランスフェクション複合体またはその薬学的に許容可能な塩。
［２５］
Ｒ１およびＲ２の各々が、８〜約１８個の炭素原子および０〜２個の二重結合を有する、置換または非置換の非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［２４］記載のトランスフェクション複合体またはその薬学的に許容可能な塩。
［２６］
ｎおよびｍの各々が、独立して、１または３という値を有し、Ｒ３が、
［化１２］
［２７］
ｘが、１〜６の値を有する、［２３］記載のトランスフェクション複合体またはその薬学的に許容可能な塩。
［２８］
前記アミン含有トランスフェクション試薬が、一般構造ＩＩ：
［化１３］
［２９］
少なくとも１つのＸ１が、ＮＨである、［２８］記載のトランスフェクション複合体またはその薬学的に許容可能な塩。
［３０］
少なくとも１つのＸ１が、Ｏである、［２８］記載のトランスフェクション複合体またはその薬学的に許容可能な塩。
［３１］
各Ｒ１が、３〜約２０個の炭素原子および０〜４個の二重結合を有する、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［２８］記載のトランスフェクション複合体またはその薬学的に許容可能な塩。
［３２］
Ｒ１の各々が、８〜約１８個の炭素原子および０〜２個の二重結合を有する、置換または非置換の非分枝状のアルキルまたはアルケニル基からなる群から独立して選択される、［３１］記載のトランスフェクション複合体またはその薬学的に許容可能な塩。
［３３］
ｎおよびｍの各々が、独立して、１または３という値を有し、Ｒ３が、
［化１４］
［３４］
ｘが、１〜６の値を有する、［２８］記載のトランスフェクション複合体またはその薬学的に許容可能な塩。
［３５］
前記化合物が、化合物１〜８７またはそれらの異性体：
［化１５−１］
［３６］
少なくとも１つのヘルパー脂質をさらに含む、［２３］記載のトランスフェクション複合体。
［３７］
前記ヘルパー脂質が、ＢＭＯＰ（Ｎ−（２−ブロモエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（９−オクタデセニルオキシ）−プロパンアミニウムブロミド）、ＤＤＰＥＳ（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミド）、ＤＳＰＣ、ＣＴＡＢ：ＤＯＰＥ（臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＡＴＢ）とＤＯＰＥとの配合物）、ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＭＧ、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）、ＤＭＰＥ（ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＯＭＧ、ＤＭＡ、ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）、ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）、ＤＰＥＰＣ（ジパルミトイルエチルホスファチジルコリン）、ＤＯＤＡＣ（ジオレオイルジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジ−オレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミド）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−ｎ，ｎ，ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＤＡＢ（ジデシルメチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルスルフェート）、ＤＯＴＡＰ・Ｃｌ、ＤＣ−ｃｈｏｌ（３，β−Ｎ，（Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール）、ＤＯＳＰＡ（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アンモニウムトリフルオロアセテート）、ＤＣ−６−１４（Ｏ，Ｏ'−ジテトラデカノイル−Ｎ−（アルファトリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド）、ＤＣＰＥ（ジカプロイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＬＲＩＥ（ジラウリルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン）、エチル−ＰＣ、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミドエチル］−Ｎ，Ｎ−ジ−メチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン）、ＤＭＲＩＥ（Ｎ−［１−（２，３ジミリスチルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド）、ＤＯＥＰＣ（ジオレオイルエチル−ホスホコリン）、ＤＯＨＭＥ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ−［１−（２−ヒドロキシエチル）］−Ｎ，Ｎジメチルアンモニウムヨージド）、ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ（Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ドデシルオキシ）−１−プロパンイミニウムブロミド／ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（３−リシル（１−グリセロール））・Ｃｌ）、Ｎ−ラウロイルサルコシン、（Ｒ）−（＋）−リモネン、レシチン類（およびそれらの誘導体）；ホスホチジルエタノールアミン（およびその誘導体）；ホスファチジルエタノールアミン類、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰＰＥジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、Ｏ−Ｃｈｏｌ（３ベータ［１−オルニチンアミドカルバモイル］コレステロール）、ＰＯＰＥ（パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン）およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン；ホスホチジルコリン；ホスファチジルコリン類、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）およびジステアロイルホスファチジルコリン；ホスファチジルグリセロール；ピペラジンベースの陽イオン性脂質、ホスファチジルグリセロール類、例えば、ＤＯＰＧ（ジオレオイルホスファチジルグリセロール）、ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）およびジステアロイルホスファチジルグリセロール；ホスファチジルセリン（およびその誘導体）；ホスファチジルセリン類、例えば、ジオレオイル−またはジパルミトイルホスファチジルセリン；ジ第四級アンモニウム塩、例えば、Ｎ，Ｎ'−ジオレイル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−１，２−エタンジアミン（ＴｍｅｄＥｃｅ）、Ｎ，Ｎ'−ジオレイル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−１，３−プロパンジアミン（ＰｒｏｐＥｃｅ）、Ｎ，Ｎ'−ジオレイル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−１，６−ヘキサンジアミン（ＨｅｘＥｃｅ）およびそれらの対応するＮ，Ｎ'−ジセチル飽和アナログ（ＴｍｅｄＡｃｅ、ＰｒｏｐＡｃｅおよびＨｅｘＡｃｅ）、ジホスファチジルグリセロール類；脂肪酸エステル類；一価陽イオン性トランスフェクション脂質、例えば、１−デオキシ−１−［ジヘキサデシル（メチル）アンモニオ］−Ｄ−キシリトール；１−デオキシ−１−［メチル（ジテトラデシル）アンモニオ］−Ｄアラビニトール；１−デオキシ−１−［ジヘキサデシル（メチル）アンモニオ］−Ｄ−アラビニトール；１−デオキシ−１−［メチル（ジオクタデシル）アンモニオ］−Ｄアラビニトール、グリセロールエステル類；スフィンゴ脂質；カルジオリピン；セレブロシド類；およびセラミド類；ならびにそれらの混合物からなるリストから選択され、中性脂質にはまた、コレステロールおよび他の３βＯＨ−ステロールならびにそれらの誘導体のホスファチジルコリンまたは商業的に入手可能な陽イオン性脂質混合物、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラメチル−Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラパルミチルスペルミン（ＴＭＴＰＳ）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）との１：１．５（Ｍ／Ｍ）配合物、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（登録商標）、ＧＳ ２８８８ ＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＦＵＧＥＮＥ ６（登録商標）、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００（登録商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＬＩＰＯＴＡＸＩ（登録商標）、ＰＯＬＹＥＣＴ（登録商標）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）、ＴＦＸＮ（商標）、ＴＲＡＮＳＦＡＳＴ（商標）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）、ＴＲＡＮＳＭＥＳＳＥＮＧＥＲ（登録商標）、ベクタミジン（３−テトラデシルアミノ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ'−テトラデシルプロピオンアミジン（ジＣ１４−アミジン）、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）も含まれる、［３６］記載のトランスフェクション複合体。
［３８］
少なくとも１つのペグ化脂質をさらに含む、［２３］記載のトランスフェクション複合体。
［３９］
少なくとも１つの生理活性物質をさらに含む、［２３］記載のトランスフェクション複合体。
［４０］
前記生理活性物質が、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子、薬物のタンパク質である、［３９］記載のトランスフェクション複合体。
［４１］
前記ＲＮＡ分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｓｔＲＮＡまたはｍＲＮＡである、［４０］記載のトランスフェクション複合体。
［４２］
前記生理活性物質が、ｓｉＲＮＡ分子である、［３９］記載のトランスフェクション複合体。
［４３］
前記生理活性物質が、ｍＲＮＡ分子である、［３９］記載のトランスフェクション複合体。
［４４］
前記生理活性物質が、ＤＮＡ分子である、［３９］記載のトランスフェクション複合体。
［４５］
標的化部分をさらに含む、［２３］記載のトランスフェクション複合体。
［４６］
ペプチド、改変されたペプチド、抗体、改変された抗体、レセプター分子、改変されたレセプター分子、一本鎖または二本鎖の核酸分子、改変された一本鎖または二本鎖の核酸分子、ペプチドアプタマーまたは核酸アプタマー、改変されたペプチドアプタマーまたは核酸アプタマー、有機分子、多糖からなるリストから選択される標的化部分をさらに含む、［２３］記載のトランスフェクション複合体。
本発明のこれらおよび他の特徴は、以下の説明、図面および添付の請求項を参照することにより、よりよく理解されるようになるだろう。
ここで、本発明のいくつかの実施形態について詳細に言及される。本発明は、下記で論じられる実施形態と併せて説明されるが、それは、本発明をそれらの実施形態に限定すると意図されていないことが理解されるだろう。それどころか、本発明は、添付の請求項によって定義されるような本発明の範囲内に含まれる代替物、改変および等価物を包含すると意図されている。
Ｉ．定義および省略形
本発明が、特定のデバイスまたは生体系に限定されないことが理解されるべきであり、本発明は、当然のことながら変化し得る。本明細書および添付の請求項において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が明らかに他のことを表していない限り、単数および複数の指示対象を含むこともまた理解されるべきである。したがって、例えば、「脂質（ａ ｌｉｐｉｄ）」への言及は、１つ以上の脂質を含む。本明細書中で使用される任意の用語が、特定の実施形態だけを説明する目的のものであって、限定すると意図されないことが、なおもさらに理解されるべきである。
本発明が、特定のデバイスまたは生体系に限定されないことが理解されるべきであり、本発明は、当然のことながら変化し得る。本明細書および添付の請求項において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が明らかに他のことを表していない限り、単数および複数の指示対象を含むこともまた理解されるべきである。したがって、例えば、「脂質（ａ ｌｉｐｉｄ）」への言及は、１つ以上の脂質を含む。本明細書中で使用される任意の用語が、特定の実施形態だけを説明する目的のものであって、限定すると意図されないことが、なおもさらに理解されるべきである。
本明細書全体を通して使用される用語は、本発明の文脈において、および各用語が使用される特定の文脈において、当該分野におけるその通常の意味を広く有する。本発明の一般的な実施形態ならびにそれを生成するおよび使用する方法を説明する際に、当業者に対して追加の指図を提供するために、ある特定の用語が下記または本明細書の他の箇所で論じられる。同じことが２つ以上の方法で述べられ得ることが容易に認識されるだろう。その結果として、代替の言語および同義語が、本明細書中で論じられる用語の任意の１つ以上に対して使用されることがあり、ある用語が本明細書中で詳細に詳しく述べられるかまたは論じられるか否かに関係なく、それにいかなる特別な重大さもあるわけではない。ある特定の用語に対する同義語が提供される。１つ以上の同義語の記述によって、他の同義語の使用が排除されない。本明細書中で論じられる任意の用語の例を含む、本明細書のいずれの箇所での例の使用も、単なる例証であって、本発明または例証される任意の用語の範囲および意味を決して限定しない。
本発明の化合物は、特定の幾何異性体または立体異性体として存在し得る。本発明は、本発明の範囲内に入る、ｃｉｓ−およびｔｏｍｓ−異性体、Ｒ−およびＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、それらのラセミ混合物およびそれらの他の混合物を含むそのような化合物のすべてを企図する。さらなる不斉炭素原子が、アルキル基などの置換基に存在する。そのような異性体のすべてならびにそれらの混合物は、本発明に含まれると意図される。
任意の種々の異性体比を含む異性体混合物が、本発明に従って使用される。例えば、２つだけの異性体が混和されている場合、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、９０：１０、９５：５、９６：４、９７：３、９８：２、９９：１または１００：０の異性体比を含む混合物のすべてが、本発明によって企図される。当業者は、より複雑な異性体混合物について類似の比が企図されることを容易に認識するだろう。例えば、本発明の化合物の特定のエナンチオマーが望まれる場合、それは、不斉合成またはキラル補助剤を用いた誘導によって調製され、ここで、得られたジアステレオ異性混合物は分離され、補助剤基が切断されることにより、所望の純粋なエナンチオマーが得られる。あるいは、分子が、アミノなどの塩基性の官能基またはカルボキシルなどの酸性の官能基を含む場合、適切な光学活性な酸または塩基を用いてジアステレオ異性塩が形成された後、このように形成されたジアステレオマーが当該分野で周知の分別結晶法またはクロマトグラフィー手段によって分割され、続いて、純粋なエナンチオマーが回収される。
別段述べられない限り、本明細書中で使用される以下の用語、定義および省略形は、以下の意味を有すると意図される。
用語「保護基」は、本明細書中で使用されるとき、特定の官能部分、例えば、Ｏ、ＳまたはＮを一時的に遮断する基のことを指し、それにより、ある反応が多官能性化合物における別の反応性部位において選択的に行われる。保護基は、良好な収率で選択的に反応することにより、計画された反応にとって安定である保護された基質をもたらし、保護基は、他の官能基を攻撃しない容易に入手可能な試薬によって、良好な収率で選択的に除去可能であり；保護基は、容易に分離可能な誘導体を形成し；保護基は、さらなる反応部位を回避するためにさらなる官能性を最低限しか有しない。
本明細書中で詳述されるように、酸素、硫黄、窒素および炭素保護基が使用される。例示的なヒドロキシル保護基の非限定的な例としては、メチル、メトキシルメチル（ＭＯＭ）、メチルチオメチル（ＭＴＭ）、ｔ−ブチルチオメチル、（フェニルジメチルシリル）メトキシメチル（ＳＭＯＭ）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル（ＰＭＢＭ）、（４−メトキシフェノキシ）メチル（ｐ−Ａ０Ｍ）、グアイアコールメチル（ＧＵＭ）、ｔ−ブトキシメチル、４−ペンテニルオキシメチル（ＰＯＭ）、シロキシメチル、２−メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、２，２，２−トリクロロエトキシメチル、ビス（２−クロロエトキシ）メチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭＯＲ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、３−ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、１−メトキシシクロヘキシル、４−メトキシテトラヒドロピラニル（ＭＴＨＰ）、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ−ジオキシド、１−［（２−クロロ−４−メチル）フェニル］−４−メトキシピペリジン−４−イル（ＣＴＭＰ）、１，４−ジオキサン−２−イル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、２，３，３ａ，４，５，６，７，７ａ−オクタヒドロ−７，８，８−トリメチル−４，７−メタノベンゾフラン−２−イル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、１−メチル−１−メトキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシ−２−フルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、２−（フェニルセレニル）エチル、ｔ−ブチル、アリル、ｐ−クロロフェニル、ｐ−メトキシフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−ハロベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｐ−シアノベンジル、ｐ−フェニルベンジル、２−ピコリル、４−ピコリル、３−メチル−２−ピコリルｉＶ−オキシド、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ'−ジニトロベンズヒドリル、５−ジベンゾスベリル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ（ｐ−メトキシフェニル（ｎｉｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ））フェニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル、４−（４'−ブロモフェナシルオキシフェニル）ジフェニルメチル、４，４'，４"−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル、４，４'，４"−トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル、４，４'，４"−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル、３−（イミダゾール−１−イル）ビス（４'，４"−ジメトキシフェニル）メチル、１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１'−ピレニルメチル、９−アントリル、９−（９−フェニル）キサンテニル、９−（９−フェニル−１０−オキソ）アントリル、１，３−ベンゾジチオラン−２−イル、ベンズイソチアゾリルＳ，Ｓ−ジオキシド、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、ジメチルイソプロピルシリル（ＩＰＤＭＳ）、ジエチルイソプロピルシリル（ＤＥＩＰＳ）、ジメチルテキシルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリベンジルシリル、トリ−ｐ−キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル（ＤＰＭＳ）、ｔ−ブチルメトキシフェニルシリル（ＴＢＭＰＳ）、ホルメート、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、フェノキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート（レブリネート）、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート（レブリノイルジチオアセタール）、ピバロエート、アダマントエート、クロトネート、４−メトキシクロトネート、ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート（メシトエート）、アルキルメチルカーボネート、９−フルオレニルメチルカーボネート（Ｆｍｏｃ）、アルキルエチルカーボネート、アルキル２，２，２−トリクロロエチルカーボネート（Ｔｒｏｃ）、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート（ＴＭＳＥＣ）、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート（Ｐｓｅｃ）、２−（トリフェニルホスホニオ）エチルカーボネート（Ｐｅｏｃ）、アルキルイソブチルカーボネート、アルキルビニルカーボネートアルキルアリルカーボネート、アルキルｐ−ニトロフェニルカーボネート、アルキルベンジルカーボネート、アルキルｐ−メトキシベンジルカーボネート、アルキル３，４−ジメトキシベンジルカーボネート、アルキルｏ−ニトロベンジルカーボネート、アルキルｐ−ニトロベンジルカーボネート、アルキルＳ−ベンジルチオカーボネート、４−エトキシ−１−ナフチル（ｎａｐｔｈｔｈｙｌ）カーボネート、メチルジチオカーボネート、２−ヨードベンゾエート、４−アジドブチレート、４−ニトロ−４−メチルペンタノエート、ｏ−（ジブロモメチル）ベンゾエート、２−ホルミルベンゼンスルホネート、２−（メチルチオメトキシ）エチル、４−（メチルチオメトキシ）ブチレート、２−（メチルチオメトキシメチル）ベンゾエート、２，６−ジクロロ−４−メチルフェノキシアセテート、２，６−ジクロロ−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシアセテート、２，４−ビス（１，１−ジメチルプロピル）フェノキシアセテート、クロロジフェニルアセテート、イソブチレート、モノスクシノエート、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノエート、ｏ−（メトキシカルボニル）ベンゾエート、α−ナフトエート、ニトレート、アルキルＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルホスホロジアミデート、アルキルＮ−フェニルカルバメート、ボレート、ジメチルホスフィノチオイル、アルキル２，４−ジニトロフェニルスルフェネート、スルフェート、メタンスルホネート（メシレート）、ベンジルスルホネートおよびトシレート（Ｔｓ）が挙げられる。
１，２−または１，３−ジオールを保護する場合、例示的な保護基の非限定的な例としては、メチレンアセタール、エチリデンアセタール、１−ｔ−ブチルエチリデンケタール、１−フェニルエチリデンケタール、（４−メトキシフェニル）エチリデンアセタール、２，２，２−トリクロロエチリデンアセタール、アセトニド、シクロペンチリデンケタール、シクロヘキシリデンケタール、シクロヘプチリデンケタール、ベンジリデンアセタール、ｐ−メトキシベンジリデンアセタール、２，４−ジメトキシベンジリデンケタール、３，４−ジメトキシベンジリデンアセタール、２−ニトロベンジリデンアセタール、メトキシメチレンアセタール、エトキシメチレンアセタール、ジメトキシメチレンオルトエステル、１−メトキシエチリデンオルトエステル、１−エトキシエチリジンオルトエステル、１，２−ジメトキシエチリデンオルトエステル、α−メトキシベンジリデンオルトエステル、１−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチリデン誘導体、α−（Ｎ，Ｎ'−ジメチルアミノ）ベンジリデン誘導体、２−オキサシクロペンチリデンオルトエステル、ジ−ｔ−ブチルシリレン基（ＤＴＢＳ）、１，３−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサニリデン）誘導体（ＴＩＰＤＳ）、テトラ−ｔ−ブトキシジシロキサン−１，３−ジイリデン誘導体（ＴＢＤＳ）、環状カーボネート、環状ボロネート、エチルボロネートおよびフェニルボロネートが挙げられる。
例示的なアミノ保護基の非限定的な例としては、メチルカルバメート、エチルカルバメート（ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｎｔｅ）、９−フルオレニルメチルカルバメート（Ｆｍｏｃ）、９−（２−スルホ）フルオレニルメチルカルバメート、９−（２，７−ジブロモ）フルオロエニルメチルカルバメート、２，７−ジ−ｆ−ブチル−［９−（１０，１０−ジオキソ−１０，１０，１０，１０−テトラヒドロチオキサンチル）］メチルカルバメート（ＤＢＤ−Ｔｍｏｃ）、４−メトキシフェナシルカルバメート（Ｐｈｅｎｏｃ）、２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（Ｔｒｏｃ）、２−トリメチルシリルエチルカルバメート（Ｔｅｏｃ）、２−フェニルエチルカルバメート（ｈＺ）、１−（１−アダマンチル）−１−メチルエチルカルバメート（Ａｄｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−ハロエチルカルバメート、１，１−ジメチル−２，２−ジブロモエチルカルバメート（ＤＢ−ｔ−ＢＯＣ）、１，１−ジメチル−２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（ＴＣＢＯＣ）、１−メチル−１−（４−ビフェニリル）エチルカルバメート（Ｂｐｏｃ）、１−（３，５−ジ−ｔ−ブチルフェニル）−１−メチルエチルカルバメート（ｔ−Ｂｕｍｅｏｃ）、２−（２'−および４'−ピリジル）エチルカルバメート（Ｐｙｏｃ）、２−（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボキサミド）エチルカルバメート、ｔ−ブチルカルバメート（ＢＯＣ）、１−アダマンチルカルバメート（Ａｄｏｃ）、ビニルカルバメート（Ｖｏｃ）、アリルカルバメート（Ａｌｌｏｃ）、１−イソプロピルアリルカルバメート（Ｉｐａｏｃ）、シンナミルカルバメート（Ｃｏｃ）、４−ニトロシンナミル（ｎｉｔｒｏｃｉｍｉａｍｙｌ）カルバメート（Ｎｏｃ）、８−キノリルカルバメート、Ｎ−ヒドロキシピペリジニルカルバメート、アルキルジチオカルバメート、ベンジルカルバメート（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルバメート（Ｍｏｚ）、ｐ−ニトロベンジル（ｎｉｔｏｂｅｎｚｙｌ）カルバメート、ｐ−ブロモベンジルカルバメート、ｐ−クロロベンジルカルバメート、２，４−ジクロロベンジルカルバメート、４−メチルスルフィニルベンジル（ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｍｙｌｂｅｎｚｙｌ）カルバメート（Ｍｓｚ）、９−アントリルメチルカルバメート、ジフェニルメチルカルバメート、２−メチルチオエチルカルバメート、２−メチルスルホニルエチルカルバメート、２−（ｐ−トルエンスルホニル）エチルカルバメート、［２−（１，３−ジチアニル）］メチルカルバメート（Ｄｍｏｃ）、４−メチルチオフェニルカルバメート（Ｍｔｐｃ）、２，４−ジメチルチオフェニルカルバメート（Ｂｍｐｃ）、２−ホスホニオエチルカルバメート（Ｐｅｏｃ）、２−トリフェニルホスホニオイソプロピルカルバメート（Ｐｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−シアノエチルカルバメート、ｍ−クロロ−ｐ−アシルオキシベンジルカルバメート、ｐ−（ジヒドロキシボリル）ベンジルカルバメート、５−ベンズイソオキサゾリルメチルカルバメート、２−（トリフルオロメチル）−６−クロモニルメチルカルバメート（Ｔｃｒｏｃ）、ｍ−ニトロフェニルカルバメート、３，５−ジメトキシベンジルカルバメート、ｏ−ニトロベンジルカルバメート、３，４−ジメトキシ−６−ニトロベンジルカルバメート、フェニル（ｏ−ニトロフェニル）メチルカルバメート、フェノチアジニル−（１０）−カルボニル誘導体、Ｎ'−ｐ−トルエンスルホニルアミノカルボニル誘導体、Ｎ'−フェニルアミノチオカルボニル誘導体、ｔ−アミルカルバメート、Ｓ−ベンジルチオカルバメート、ｐ−シアノベンジルカルバメート、シクロブチルカルバメート、シクロヘキシルカルバメート、シクロペンチルカルバメート、シクロプロピルメチルカルバメート、ｐ−デシルオキシベンジルカルバメート、２，２−ジメトキシカルボニルビニルカルバメート、ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）ベンジルカルバメート、１，１−ジメチル−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）プロピルカルバメート、１，１−ジメチルプロピニルカルバメート、ジ（２−ピリジル）メチルカルバメート、２−フラニルメチルカルバメート、２−ヨードエチルカルバメート、イソボルニル（ｉｓｏｂｏｒｙｎｌ）カルバメート、イソブチルカルバメート、イソニコチニルカルバメート、ｐ−（ｐ'−メトキシフェニルアゾ）ベンジルカルバメート、１−メチルシクロブチルカルバメート、１−メチルシクロヘキシルカルバメート、１−メチル−１−シクロプロピルメチルカルバメート、１−メチル−１−（３，５−ジメトキシフェニル）エチルカルバメート、１−メチル−１−（ｐ−フェニルアゾフェニル）エチルカルバメート、１−メチル−１−フェニルエチルカルバメート、１−メチル−１−（４−ピリジル）エチルカルバメート、フェニルカルバメート、ｐ−（フェニルアゾ）ベンジルカルバメート、２，４，６−トリ−ｔ−ブチルフェニルカルバメート、４−（トリメチルアンモニウム）ベンジルカルバメート、２，４，６−トリメチルベンジルカルバメート、ホルムアミド、アセトアミド、クロロアセトアミド、トリクロロアセトアミド、トリフルオロアセトアミド、フェニルアセトアミド、３−フェニルプロパンアミド、ピコリンアミド、３−ピリジルカルボキサミド、Ｎ−ベンゾイルフェニルアラニル誘導体、ベンズアミド、ｐ−フェニルベンズアミド、ｏ−ニトロフェニルアセトアミド（ｎｉｔｏｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ｏ−ニトロフェノキシアセトアミド、アセトアセトアミド、（Ｎ'−ジチオベンジルオキシカルボニルアミノ）アセトアミド、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロパンアミド、３−（ｏ−ニトロフェニル）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−ニトロフェノキシ）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−フェニルアゾフェノキシ）プロパンアミド（ｐｒｏｐａｎａｒｎｉｄｅ）、４−クロロブタンアミド、３−メチル−３−ニトロブタンアミド、ｏ−ニトロシンナミド、Ｎ−アセチルメチオニン誘導体、ｏ−ニトロベンズアミド、ｏ−（ベンゾイルオキシメチル）ベンズアミド、４，５−ジフェニル−３−オキサゾリン−２−オン、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−ジチアスクシンイミド（Ｄｔｓ）、Ｎ−２，３−ジフェニルマレイミド、Ｎ−２，５−ジメチルピロール、Ｎ−１，１，４，４−テトラメチルジシリルアザシクロペンタン付加物（ＳＴＡＢＡＳＥ）、５−置換１，３−ジメチル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、５−置換１，３−ジベンジル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、１−置換３，５−ジニトロ−４−ピリドン、Ｎ−メチルアミン、Ｎ−アリルアミン、Ｎ−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチルアミン（ＳＥＭ）、Ｎ−３−アセトキシプロピルアミン、Ｎ−（１−イソプロピル−４−ニトロ−２−オキソ−３−ピロリン（ｐｙｒｏｏｌｉｎ）−３−イル）アミン、第四級アンモニウム塩、Ｎ−ベンジルアミン、Ｎ−ジ（４−メトキシフェニル）メチルアミン、Ｎ−５−ジベンゾスベリルアミン、Ｎ−トリフェニルメチルアミン（Ｔｒ）、Ｎ−［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミン（ＭＭＴｒ）、Ｎ−９−フェニルフルオレニルアミン（ＰｈＦ）、Ｎ−２，７−ジクロロ−９−フルオレニルメチレンアミン、Ｎ−フェロセニルメチルアミノ（Ｆｃｍ）、Ｎ−２−ピコリルアミノＮ'−オキシド、Ｎ−１，１−ジメチルチオメチレンアミン、Ｎ−ベンジリデンアミン、Ｎ−ｐ−メトキシベンジリデンアミン、Ｎ−ジフェニルメチレンアミン、Ｎ−［（２−ピリジル）メシチル］メチレンアミン、Ｎ−（Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノメチレン）アミン、ＮＮ'−イソプロピリデンジアミン、Ｎ−ｐ−ニトロベンジリデンアミン、Ｎ−サリチリデンアミン、Ｎ−５−クロロサリチリデンアミン、Ｎ−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）フェニルメチレンアミン、Ｎ−シクロヘキシリデンアミン、Ｎ−（５，５−ジメチル−３−オキソ−１−シクロヘキセニル）アミン、Ｎ−ボラン誘導体、Ｎ−ジフェニルボリン酸誘導体、Ｎ−［フェニル（ペンタカルボニルクロム−またはタングステン）カルボニル］アミン、Ｎ−銅キレート、Ｎ−亜鉛キレート、Ｎ−ニトロアミン、Ｎ−ニトロソアミン、アミンＮ−オキシド、ジフェニルホスフィンアミド（Ｄｐｐ）、ジメチルチオホスフィンアミド（Ｍｐｔ）、ジフェニルチオホスフィンアミド（Ｐｐｔ）、ジアルキルホスホルアミデート、ジベンジルホスホルアミデート、ジフェニルホスホルアミデート、ベンゼンスルフェンアミド、ｏ−ニトロベンゼンスルフェンアミド（Ｎｐｓ）、２，４−ジニトロベンゼンスルフェンアミド、ペンタクロロベンゼンスルフェンアミド、２−ニトロ−４−メトキシベンゼンスルフェンアミド、トリフェニルメチルスルフェンアミド、３−ニトロピリジンスルフェンアミド（Ｎｐｙｓ）、ｐ−トルエンスルホンアミド（Ｔｓ）、ベンゼンスルホンアミド、２，３，６，−トリメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｒ）、２，４，６−トリメトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｂ）、２，６−ジメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｐｍｅ）、２，３，５，６−テトラメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｅ）、４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｂｓ）、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｓ）、２，６−ジメトキシ−４−メチルベンゼンスルホンアミド（ｉＭｄｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホンアミド（Ｐｍｃ）、メタンスルホンアミド（Ｍｓ）、β−トリメチルシリルエタンスルホンアミド（ＳＥＳ）、９−アントラセンスルホンアミド、４−（４'，８'−ジメトキシナフチルメチル）ベンゼンスルホンアミド（ＤＮＭＢＳ）、ベンジルスルホンアミド、トリフルオロメチルスルホンアミドおよびフェナシルスルホンアミドが挙げられる。
用語「置換（される）」は、単独で使用されるかまたは用語「必要に応じて」および本発明の式に含まれる置換基が後ろに置かれるかを問わず、指定の置換基のラジカルによる所与の構造内の水素ラジカルの置換のことを指す。任意の所与の構造内の２つ以上の位置が、指定の基から選択される２つ以上の置換基で置換されるとき、その置換基は、すべての位置において同じであるかまたは異なる。用語「置換（される）」は、有機化合物の許容できるすべての置換基を包含する。広範な態様において、その許容できる置換基には、有機化合物の非環式および環式の分枝状および非分枝状の炭素環式および複素環式の芳香族および非芳香族の置換基が含まれる。ヘテロ原子は、そのヘテロ原子の原子価を満たす、水素置換基および／または本明細書中に記載される有機化合物の任意の許容できる置換基を有し得る。さらに、本発明は、有機化合物の許容できる置換基によって、いかなる様式でも限定されないと意図されている。置換基と変数の組み合わせは、安定な化合物の形成をもたらす組み合わせである。
用語「安定」は、本明細書中で使用されるとき、製造を可能にするのに十分な安定性を有し、かつ検出されるのに十分な時間にわたって、好ましくは、本明細書中に詳述される目的のために有用であるのに十分な時間にわたって、化合物の完全性を維持する、化合物のことを指す。
用語「脂肪族」は、本明細書中で使用されるとき、１つ以上の官能基で必要に応じて置換される、飽和と不飽和の両方の直鎖（すなわち、非分枝状）、分枝状、非環式、環式または多環式の脂肪族炭化水素を含む。用語「脂肪族」は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニルおよびシクロアルキニル部分を包含するがこれらに限定されない。
用語「アルキル」は、直鎖状、分枝状および環式のアルキル基を包含する。類似の交換が、「アルケニル」または「アルキニル」などの他の総称的な用語に適用される。用語「アルキル」、「アルケニル」および「アルキニル」は、置換された基と置換されていない基の両方を包含する。本発明において使用されるアルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、１〜２０個の脂肪族炭素原子を含む。「低級アルキル」は、１〜６個の炭素原子を有するそれらのアルキル基（環式、非環式、置換、非置換、分枝状または非分枝状のアルキル基）を指し示すために使用される。
例示的な脂肪族基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、−ＣＨ２−シクロプロピル、ビニル、アリル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチル、−ＣＨ２−シクロブチル、ｎ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、シクロペンチル、−ＣＨ２−シクロペンチル、ｎ−ヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、シクロヘキシルおよび−ＣＨ２−シクロヘキシル部分が挙げられるがこれらに限定されず、それらは、１つ以上の置換基である（ｉｓａｒ）。例示的なアルケニル基としては、エテニル、プロペニル、ブテニルおよび１−メチル−２−ブテン−１−イルが挙げられるが、これらに限定されない。代表的なアルキニル基としては、エチニル、２−プロピニル（プロパルギル）および１−プロピニルが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アルキル」は、本明細書中で使用されるとき、単一の水素原子の除去によって１〜２０個の炭素原子を含む炭化水素部分から得られる直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素ラジカルのことを指す。例示的なアルキルラジカルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデシルおよびドデシルが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アルケニル」は、本明細書中で使用されるとき、単一の水素原子の除去によって少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する炭化水素部分から得られる一価の基のことを指す。例示的なアルケニル基としては、エテニル、プロペニル、ブテニルおよび１−メチル−２−ブテン−１−イルが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アルキニル」は、本明細書中で使用されるとき、単一の水素原子の除去によって少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する炭化水素から得られる一価の基のことを指す。例示的なアルキニル基としては、エチニル、２−プロピニル（プロパルギル）および１−プロピニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アルコキシ」および「チオアルキル」は、本明細書中で使用されるとき、それぞれ酸素原子または硫黄原子を介して親分子に結合される、先に定義されたようなアルキル基のことを指す。ある特定の実施形態において、アルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、１〜２０個の脂肪族（ａｌｉｐａｈｔｉｃ）炭素原子を含む。例示的なアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ネオペントキシおよびｎ−ヘキソキシが挙げられるがこれらに限定されない。例示的なチオアルキル基としては、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオおよびｎ−ブチルチオが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アルキルアミノ」は、本明細書中で使用されるとき、構造−ＮＨＲ'（Ｒ'は、１〜２０個の脂肪族炭素原子を含む上で定義されたような脂肪族である）を有する基のことを指す。例示的なアルキルアミノ基としては、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ−プロピルアミノ、イソ−プロピルアミノ、シクロプロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノ、ｔｅｒｔ−ブチルアミノ、ネオペンチルアミノ、ｎ−ペンチルアミノ、ヘキシルアミノおよびシクロヘキシルアミノが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「ジアルキルアミノ」は、本明細書中で使用されるとき、構造−ＮＲＲ１（ＲおよびＲ１は各々、１〜２０個の脂肪族炭素原子を含む上で定義されたような脂肪族基である）を有する基のことを指す。ＲおよびＲ１は、同じであるかまたは異なり、連結されることにより、芳香族または非芳香族の環構造を形成する。例示的なジアルキルアミノ基としては、ジメチルアミノ、メチルエチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルプロピルアミノ、ジ（ｎ−プロピル）アミノ、ジ（イソ−プロピル（ｐｒｏｐｙｉ））アミノ、ジ（シクロプロピル）アミノ、ジ（ｎ−ブチル）アミノ、ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）アミノ、ジ（ネオペンチル）アミノ５ジ（ｎ−ペンチル）アミノ、ジ（ヘキシル）アミノおよびジ（シクロヘキシル）アミノが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な環式のジアミノアルキル基としては、アジリジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピロリル、イミダゾリル、１，３，４−トリアノリルおよびテトラゾリルが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「カルボン酸」は、本明細書中で使用されるとき、式−ＣＯＯＨの基を含む化合物のことを指す。
本発明の化合物の上に記載された脂肪族部分および他の部分の置換基のいくつかの例としては、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、ヘテロアルキルチオ、ヘテロアリールチオ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨＣｌ２、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｒｘ、−ＣＯ２（Ｒｘ）、−ＣＯＮ（ＲＸ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｘ、−ＯＣＯ２Ｒｘ、−ＯＣＯＮ（Ｒｘ）２、−Ｎ（Ｒｘ）２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｘおよび−ＮＲｘ（ＣＯ）Ｒｘが挙げられるが、これらに限定されず、ここで、Ｒｘの各存在は、独立して、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルを含むがこれらに限定されず、ここで、上記および本明細書中に記載される任意の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル置換基は、置換または非置換の分枝状または非分枝状の環式または非環式であり、上記および本明細書中に記載される任意のアリールまたはヘテロアリール置換基は、置換または非置換である。
用語「アリール」および「ヘテロアリール」は、本明細書中で使用されるとき、３〜１４個の炭素原子を有する安定な単環式または多環式、複素環式、多環式および複素多環式（ｐｏｌｙｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ）の不飽和部分（その各々は、置換または非置換である）のことを指す。置換基としては、脂肪族部分に対して上に列挙された任意の置換基が挙げられるが、これらに限定されない。用語「アリール」は、１つまたは２つの芳香族環（フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニルを含むがこれらに限定されない）を有する単環式または二環式の炭素環系を包含する。用語「ヘテロアリール」は、５〜１０個の環原子（そのうちの１〜３個の環原子は、Ｓ、ＯおよびＮから選択され、残りの環原子は炭素である）を有する環式の芳香族ラジカルを包含し、そのラジカルは、任意の環原子を介して分子の残りの部分に結合される（例えば、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニルまたはイソキノリニル）。
アリールおよびヘテロアリール基は、非置換または置換であり、ここで、置換は、独立して以下の部分のいずれか１つ以上による、その基上の水素原子の１、２、３個またはそれ以上の置換を含み、その以下の部分としては、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、ヘテロアルキルチオ、ヘテロアリールチオ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨＣｌ２、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｒｘ、−ＣＯ２（Ｒｘ）、−ＣＯＮ（ＲＸ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｘ、−ＯＣＯ２Ｒｘ、−ＯＣＯＮ（Ｒｘ）２、−Ｎ（Ｒｘ）２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｘおよび−ＮＲｘ（ＣＯ）Ｒｘが挙げられるがこれらに限定されず、ここで、Ｒｘの各存在は、独立して、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルを含むがこれらに限定されず、上記および本明細書中に記載される任意の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル置換基は、置換または非置換の分枝状または非分枝状の環式または非環式であり、上記および本明細書中に記載される任意のアリールまたはヘテロアリール置換基は、置換または非置換である。
用語「シクロアルキル」は、本明細書中で使用されるとき、詳細には、３〜７個、好ましくは、３〜１０個の炭素原子を有する基のことを指す。好適なシクロアルキルとしては、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、ヘテロアルキルチオ、ヘテロアリールチオ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨＣｌ２、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｒｘ、−ＣＯ２（Ｒｘ）、−ＣＯＮ（ＲＸ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｘ、−ＯＣＯ２Ｒｘ、−ＯＣＯＮ（Ｒｘ）２、−Ｎ（Ｒｘ）２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｘおよび−ＮＲｘ（ＣＯ）Ｒｘを含むがこれらに限定されない置換基で必要に応じて置換され得る、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロヘプチルが挙げられるがこれらに限定されず、ここで、Ｒｘの各存在は、独立して、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルを含むがこれらに限定されず、上に記載された任意の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル置換基は、置換または非置換、分枝状または非分枝状、環式のまたは非環式であり、上記および本明細書中に記載される任意のアリールまたはヘテロアリール置換基は、置換または非置換である。
用語「ヘテロ脂肪族」は、本明細書中で使用されるとき、例えば炭素原子の代わりに１つ以上の酸素、硫黄、窒素、リンまたはケイ素原子を含む脂肪族部分のことを指す。ヘテロ脂肪族部分は、分枝状、非分枝状、環式または非環式であり、モルホリノ、ピロリジニルなどのような飽和および不飽和の複素環を含む。ヘテロ脂肪族部分は、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、ヘテロアルキルチオ、ヘテロアリールチオ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨＣｌ２、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｒｘ、−ＣＯ２（Ｒｘ）、−ＣＯＮ（ＲＸ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｘ、−ＯＣＯ２Ｒｘ、−ＯＣＯＮ（Ｒｘ）２、−Ｎ（Ｒｘ）２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｘおよび−ＮＲｘ（ＣＯ）Ｒｘを含むがこれらに限定されない１つ以上の部分による、そのヘテロ脂肪族部分上の水素原子の１つ以上の独立した置換によって置換され、ここで、Ｒｘの各存在は、独立して、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルを含むがこれらに限定されず、上記および本明細書中に記載される任意の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル置換基は、置換または非置換の分枝状または非分枝状の環式または非環式であり、上記および本明細書中に記載される任意のアリールまたはヘテロアリール置換基は、置換または非置換である。
用語「ハロ」および「ハロゲン」は、本明細書中で使用されるとき、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素から選択される原子のことを指す。
用語「ハロアルキル」は、それに結合された１、２または３個のハロゲン原子を有する上で定義されたようなアルキル基のことを表し、クロロメチル、ブロモエチルおよびトリフルオロメチルなどのような基によって例証される。
用語「ヘテロシクロアルキル」または「複素環」は、本明細書中で使用されるとき、酸素、硫黄および窒素から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を有する縮合６員環を含む二環式基または三環式基を含むがこれらに限定されない、非芳香族の５、６もしくは７員環の基または多環式基のことを指し、ここで、（ｉ）各５員環は、０〜１個の二重結合を有し、各６員環は、０〜２個の二重結合を有し、（ｉｉ）窒素および硫黄ヘテロ原子は、必要に応じて酸化され、（ｉｉｉ）窒素ヘテロ原子は、必要に応じて四級化され得、（ｉｖ）任意の上記複素環式環は、ベンゼン環に縮合される。代表的な複素環としては、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニルおよびテトラヒドロフリルが挙げられるが、これらに限定されない。用語「置換」ヘテロシクロアルキルまたは複素環基が使用され、それは、本明細書中で使用されるとき、以下に限定されないが、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、ヘテロアルキルチオ、ヘテロアリールチオ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨＣｌ２、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）Ｒｘ、−ＣＯ２（Ｒｘ）、−ＣＯＮ（ＲＸ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｘ、−ＯＣＯ２Ｒｘ、−ＯＣＯＮ（Ｒｘ）２、−Ｎ（Ｒｘ）２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｘおよび−ＮＲｘ（ＣＯ）Ｒｘによる、その基上の１、２または３個の水素原子の独立した置換によって置換された、上で定義されたようなヘテロシクロアルキル基または複素環基のことを指し、ここで、Ｒｘの各存在は、独立して、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルを含むがこれらに限定されず、上記および本明細書中に記載される任意の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル置換基は、置換または非置換の分枝状または非分枝状の環式または非環式であり、上記および本明細書中に記載される任意のアリールまたはヘテロアリール置換基は、置換または非置換である。
本発明の化合物に含まれる例示的な非限定的な複素環式基および芳香族複素環式基としては、３−メチル−４−（３−メチルフェニル）ピペラジン、３メチルピペリジン、４−（ビス−（４−フルオロフェニル）メチル）ピペラジン、４−（ジフェニルメチル）ピペラジン、４−（エトキシカルボニル）ピペラジン、４−（エトキシカルボニルメチル）ピペラジン、Ａ−（フェニルメチル）ピペラジン、４−（１−フェニルエチル）ピペラジン、４−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）ピペラジン、４−（２−（ビス−（２−プロペニル）アミノ）エチル）ピペラジン、Ａ−（２−（ジエチルアミノ）エチル）ピペラジン、４−（２−クロロフェニル）ピペラジン、４−（２−シアノフェニル）ピペラジン、４−（２−エトキシフェニル）ピペラジン、４−（２−エチルフェニル）ピペラジン、４−（２−フルオロフェニル）ピペラジン、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン、４−（２−メトキシエチル）ピペラジン、４−（２−メトキシフェニル）ピペラジン、４−（２−メチルフェニル）ピペラジン、４−（２−メチルチオフェニル）ピペラジン、４−（２−ニトロフェニル）ピペラジン、４−（２−ニトロフェニル）ピペラジン、４−（２−フェニルエチル）ピペラジン、Ａ−（２−ピリジル）ピペラジン、４−（２−ピリミジニル）ピペラジン、４−（２，３−ジメチルフェニル）ピペラジン、４−（２，４−ジフルオロフェニル）ピペラジン、４−（２，４−ジメトキシフェニル）ピペラジン、４−（２，４−ジメチルフェニル）ピペラジン、４−（２，５−ジメチルフェニル）ピペラジン、４−（２，６−ジメチルフェニル）ピペラジン、４−（３−クロロフェニル）ピペラジン、４−（３−メチルフェニル）ピペラジン、４−（３−トリフルオロメチルフェニル）ピペラジン、４−（３，４−ジクロロフェニル）ピペラジン、４−３，４−ジメトキシフェニル）ピペラジン、４−（３，４−ジメチルフェニル）ピペラジン、４−（３，４−メチレンジオキシフェニル）ピペラジン、４−（３，４，５−トリメトキシフェニル）ピペラジン、４−（３，５−ジクロロフェニル）ピペラジン、４−（３，５−ジメトキシフェニル）ピペラジン、４−（４−（フェニルメトキシ）フェニル）ピペラジン、４−（４−（３，１−ジメチルエチル）フェニルメチル）ピペラジン、４−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）ピペラジン、４−（４−クロロフェニル）−３−メチルピペラジン、４−（４−クロロフェニル）ピペラジン、４−（４−クロロフェニル）ピペラジン、４−（４−クロロフェニルメチル）ピペラジン、４−（４−フルオロフェニル）ピペラジン、４−（４−メトキシフェニル）ピペラジン、４−（４−メチルフェニル）ピペラジン、４−（４−ニトロフェニル）ピペラジン、４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ピペラジン、４−シクロヘキシルピペラジン、４−エチルピペラジン、４−ヒドロキシ−４−（４−クロロフェニル）メチルピペリジン、４−ヒドロキシ−４−フェニルピペリジン、４−ヒドロキシピロリジン、４−メチルピペラジン、４−フェニルピペラジン、４−ピペリジニルピペラジン、４−（２−フラニル）カルボニル）ピペラジン、４−（（１，３−ジオキソラン−５−イル）メチル）ピペラジン、６−フルオロ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２−メチルキノリン、１，４−ジアザシクロヘプタン（ｄｉａｚａｃｙｌｃｌｏｈｅｐｔａｎｅ）、２，３−ジヒドロインドリル、３，３−ジメチルピペリジン、４，４−エチレンジオキシピペリジン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン、１，２，３，４−テトラヒドロキノリン、アザシクロオクタン、デカヒドロキノリン、ピペラジン、ピペリジン、ピロリジン、チオモルホリンおよびトリアゾールが挙げられる。
用語「炭素環」は、本明細書中で使用されるとき、その環の各原子が炭素原子である芳香族環または非芳香族環のことを指す。
用語「独立して選択される」は、それらの基が同一または異なることを指し示すために本明細書中で使用される。
本明細書中で使用されるとき、用語「標識（される）」は、ある化合物が、放射性標識もしくは重同位体標識、または免疫標識（例えば、抗体または抗原）、または有色色素、発光色素、リン光色素もしくは蛍光色素から得られる標識を使用することによってその化合物の検出を可能にするために結合される少なくとも１つのエレメント、同位体または化学的化合物を有することを意味すると意図される。１つ以上のハロゲン部分で置換された、例えば、ｏ−、ｍ−およびｐ−アジドベンゾイル（４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸を含むがこれに限定されない）を使用する光親和性標識が、生体系における分子間相互作用の直接的な解明のために利用される。
用語「動物」は、本明細書中で使用されるとき、ヒト、ならびに非ヒト動物（例えば、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、霊長類またはブタ）、鳥類、爬虫類、両生類および魚類を含む）のことを指し得る。
用語「細胞」とは、任意のタイプの真核細胞および任意の起源由来の真核細胞のことを広く指す。真核細胞のタイプとしては、初代細胞由来の上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、造血細胞、腫瘍細胞または不死化細胞株などが挙げられる。そのような細胞の起源としては、任意の動物（例えば、ヒト、イヌ、マウス、ハムスター、ネコ、ウシ、ブタ、サル、類人猿、ヒツジ、魚類、昆虫、真菌）および任意の植物（作物植物、藻類、観賞植物および樹木を含む）が挙げられる。
「送達」は、所望の化合物が最終的に標的細胞内または標的細胞膜内もしくは標的細胞膜上に位置するように、所望の化合物が標的細胞に運搬されるプロセスのことを表すために使用される。本発明の化合物の多くの用途において、その所望の化合物は、標的細胞によって容易に取り込まれず、脂質凝集物またはトランスフェクション複合体を介した送達は、所望の化合物を細胞内の適切な細胞内コンパートメントに送達するために意図されている。特にインビボ条件下におけるある特定の用途では、特定の標的細胞型への送達が好ましく、その送達は、本発明の化合物によって容易になり得る。
薬物とは、人間または動物の疾患の予防、診断、軽減、処置または治癒において使用される食物以外の任意の治療薬または予防薬のことを指す。
「キット」とは、本発明の化合物またはそれらの混合物の１つ以上を備えるトランスフェクションキットまたはタンパク質発現キットのことを指す。そのようなキットは、厳重な管理下で１つ以上の容器手段（例えば、バイアル、試験管など）を収納するように区画化された運搬手段を備え得る。そのような容器手段の各々は、トランスフェクションを行うために必要な成分または成分の混合物を備える。そのようなキットは、核酸（好ましくは、１つ以上のベクター）、細胞、本発明の１つ以上の化合物、脂質凝集物形成化合物、トランスフェクションエンハンサー、生物学的に活性な物質などから選択される１つ以上の成分を備え得る。
用語「〜と会合される」は、分子相互作用の文脈において使用されるとき、直接的または間接的な共有結合性または非共有結合性の相互作用（例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性相互作用、静電相互作用など）によって連結された２つの実体のことを指す。
用語「生体適合性」は、本明細書中で使用されるとき、細胞にとって毒性でない化合物のことを指す。化合物をインビトロにおいて細胞に添加しても２０％以下の細胞死しかもたらされず、かつそれがインビボで投与されても炎症または他のそのような有害作用を誘導しない場合、その化合物は、生体適合性である。
用語「生分解性」は、本明細書中で使用されるとき、細胞に導入されたときに、その細胞に対して有意な有毒作用なしに（すなわち、それらの成分がインビトロにおいて細胞に加えられたとき、その細胞の約２０％未満しか死滅せずに）、細胞が再利用し得るかまたは処分し得る成分に分解される化合物のことを指す。それらの成分は、インビボにおいて炎症または他の有害作用を誘導しない。生分解性化合物の分解を左右する化学反応は、通常、触媒されない。用語「有効量」は、活性な物質に関して本明細書中で使用されるとき、所望の生物学的応答を誘発するのに必要な量のことを指す。物質またはデバイスの有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達される物質、被包性マトリックスの組成、標的組織などのような因子に応じて変動し得る。「有効量の分子」の送達は、その分子が生物学的応答を誘発する（例えば、細胞内における１つ以上の遺伝子の発現を調節する）のに十分な量での、細胞内への分子の送達である。特定の実施形態において、有効量の分子が細胞に送達され、その結果、その細胞に関係する疾患、病状または障害の回復または改善を得ることができる。「有効量のｓｉＲＮＡ」または「有効量またはＲＮＡｉ」の送達は、細胞における標的遺伝子の発現の低下を引き起こすのに十分な量での、その細胞内へのｓｉＲＮＡまたは他のＲＮＡｉの送達である。
用語「生物学的に活性な物質」、「生理活性物質」などは、生物学的作用を有するか、あるいは生物学的作用を改変するか、引き起こすか、促進するか、増強するか、阻止するかもしくは減少させるか、または生物学的作用を有する第２の分子の生成もしくは活性を増強するかもしくは制限し、その第２の分子と反応し、かつ／または第２の分子に結合する、組成物、複合体、化合物または分子のことを広く指す。その第２の分子は、内因性分子（例えば、標的細胞内に通常存在するタンパク質または核酸などの分子）であり得るが、それである必要はない。生物学的作用は、免疫反応性応答を刺激するかまたは引き起こす作用；細胞、組織もしくは生物（例えば、動物）における生物学的プロセスに影響を及ぼす作用；病原体もしくは寄生生物における生物学的プロセスに影響を及ぼす作用；検出可能なシグナルを生成するかもしくは生成させる作用；タンパク質もしくはポリペプチドの発現を制御する作用；タンパク質もしくはポリペプチドの発現を停止するかもしくは阻害する作用；またはタンパク質もしくはポリペプチドの発現を引き起こすかもしくは増強する作用であり得るが、これらに限定されない。生物学的に活性な組成物、複合体、化合物または分子は、研究上の、治療的な、予防的なおよび診断的な方法および組成物において使用され得、一般に、それらを引き起こすように作用し得る。
用語「陽イオン性脂質」とは、トランスフェクションのために使用され得る、生理学的条件下において少なくとも１つの正電荷を有する、任意の陽イオン性脂質のことを指す。本開示の基礎を形成するある特定のアミン含有トランスフェクション物質もまた、生理学的条件下において陽イオンとして存在することが理解されるべきであるが、この用語は、以下に限定されないが、本明細書中に記載されるようなトランスフェクション複合体を共製剤化する（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅ）ために使用され得る任意の陽イオン性ヘルパー脂質にまで拡張される。本明細書中に記載される新規のアミン含有トランスフェクション物質以外のさらなる陽イオン性脂質としては、例えば、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＴ ＡＰ、ＤＯＧＳおよびＴＭＴＰＳ、ならびに「ヘルパー脂質」と本明細書中に記載される任意の陽イオン性脂質が挙げられ得るがこれらに限定されない。
「標的細胞」または「標的組織」とは、所望の化合物用の担体として脂質凝集物またはトランスフェクション複合体を用いて所望の化合物が送達される任意の細胞または組織のことを指す。
トランスフェクションは、インビトロまたはインビボにおける（すなわち、動物、植物またはヒトにおける）標的細胞または標的組織への任意の核酸、タンパク質または他の高分子の送達（その結果、その核酸、タンパク質または他の高分子が、その細胞において発現されるか、その細胞に表現型を付与するか、またはその細胞において生物学的機能を有する）のことを意味するために本明細書中で使用される。
用語「発現可能な核酸」には、分子量とは無関係にＤＮＡとＲＮＡの両方が含まれ、用語「発現」は、細胞内での核酸の機能的な存在の任意の顕性化（一過性の発現と安定な発現の両方を含むがこれらに限定されない）を意味する。
用語「トランスフェクション複合体」は、本明細書中で使用されるとき、インビボまたはインビトロにおいて細胞または組織に生物学的に活性な物質（例えば、核酸、タンパク質、高分子など）を送達するために製剤化された組成物のことを広く指す。本明細書中で使用されるトランスフェクション複合体は、アミン含有トランスフェクション化合物の少なくとも１つ以上を、送達される生理活性物質に加えて、送達される生物学的に活性な化合物とともに、必要に応じて１つ以上のヘルパー脂質、１つ以上のペグ化脂質、１つ以上の標的化部分と組み合わせて、含み得る。本明細書中に記載される目的のために、用語「トランスフェクション複合体」は、生理活性物質と接触されるリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）または脂質凝集物と考えられ得る。したがって、以下の開示において場合によっては、リポプレックス、脂質凝集物などのような用語は、１つ以上の生理活性物質または「搭載物」を欠くトランスフェクション複合体のことを言及するために使用され得る。
用語「ヘルパー脂質」は、本明細書中で使用されるとき、本明細書中に開示されるトランスフェクション複合体の調製および形成における使用に適した脂質のことを広く指す。好適なヘルパー脂質としては、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロール（フィトステロール、動物ステロールおよびホパノイドを含む）または細胞もしくは組織の内部に外来性の生理活性分子を導入することを可能にするかもしくは容易にすると知られている任意の中性脂質もしくは陽イオン性脂質が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、２つ以上のヘルパー脂質が、本明細書中に記載されるトランスフェクション複合体の製剤化において使用され得る。ここで開示されるトランスフェクション複合体の調製における使用について企図される例示的であるが非限定的な中性脂質または陽イオン性脂質としては、以下から選択される１つ以上の脂質が挙げられ得る：ＢＭＯＰ（Ｎ−（２−ブロモエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（９−オクタデセニルオキシ）−プロパンアミニウムブロミド）、ＤＤＰＥＳ（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミド）、ＤＳＰＣ、ＣＴＡＢ：ＤＯＰＥ（臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＡＴＢ）とＤＯＰＥとの配合物）、ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＭＧ、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）、ＤＭＰＥ（ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＯＭＧ、ＤＭＡ、ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）、ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）、ＤＰＥＰＣ（ジパルミトイルエチルホスファチジルコリン）、ＤＯＤＡＣ（ジオレオイルジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジ−オレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミド）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−ｎ，ｎ，ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＤＡＢ（ジデシルメチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルスルフェート）、ＤＯＴＡＰ・Ｃｌ、ＤＣ−ｃｈｏｌ（３，β−Ｎ，（Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール）、ＤＯＳＰＡ（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アンモニウムトリフルオロアセテート）、ＤＣ−６−１４（Ｏ，Ｏ'−ジテトラデカノイル−Ｎ−（アルファトリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド）、ＤＣＰＥ（ジカプロイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＬＲＩＥ（ジラウリルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン）、エチル−ＰＣ、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミドエチル］−Ｎ，Ｎ−ジ−メチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン）、ＤＭＲＩＥ（Ｎ−［１−（２，３ジミリスチルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド）、ＤＯＥＰＣ（ジオレオイルエチル−ホスホコリン）、ＤＯＨＭＥ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ−［１−（２−ヒドロキシエチル）］−Ｎ，Ｎジメチルアンモニウムヨージド）、ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ（Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ドデシルオキシ）−１−プロパンイミニウムブロミド／ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（３−リシル（１−グリセロール））・Ｃｌ）、Ｎ−ラウロイルサルコシン、（Ｒ）−（＋）−リモネン、レシチン類（およびそれらの誘導体）；ホスホチジルエタノールアミン（およびその誘導体）；ホスファチジルエタノールアミン類、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰＰＥジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、Ｏ−Ｃｈｏｌ（３ベータ［１−オルニチンアミドカルバモイル］コレステロール）、ＰＯＰＥ（パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン）およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン；ホスホチジルコリン；ホスファチジルコリン類、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）およびジステアロイルホスファチジルコリン；ホスファチジルグリセロール；ピペラジンベースの陽イオン性脂質、ホスファチジルグリセロール類、例えば、ＤＯＰＧ（ジオレオイルホスファチジルグリセロール）、ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）およびジステアロイルホスファチジルグリセロール；ホスファチジルセリン（およびその誘導体）；ホスファチジルセリン類、例えば、ジオレオイル−またはジパルミトイルホスファチジルセリン；ジ第四級アンモニウム塩、例えば、Ｎ，Ｎ'−ジオレイル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−１，２−エタンジアミン（ＴｍｅｄＥｃｅ）、Ｎ，Ｎ'−ジオレイル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−１，３−プロパンジアミン（ＰｒｏｐＥｃｅ）、Ｎ，Ｎ'−ジオレイル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−１，６−ヘキサンジアミン（ＨｅｘＥｃｅ）およびそれらの対応するＮ，Ｎ'−ジセチル飽和アナログ（ＴｍｅｄＡｃｅ、ＰｒｏｐＡｃｅおよびＨｅｘＡｃｅ）、ジホスファチジルグリセロール類；脂肪酸エステル類；一価陽イオン性トランスフェクション脂質、例えば、１−デオキシ−１−［ジヘキサデシル（メチル）アンモニオ］−Ｄ−キシリトール；１−デオキシ−１−［メチル（ジテトラデシル）アンモニオ］−Ｄアラビニトール；１−デオキシ−１−［ジヘキサデシル（メチル）アンモニオ］−Ｄ−アラビニトール；１−デオキシ−１−［メチル（ジオクタデシル）アンモニオ］−Ｄアラビニトール、グリセロールエステル類；スフィンゴ脂質；カルジオリピン；セレブロシド類；およびセラミド類；ならびにそれらの混合物。中性脂質にはまた、とりわけ、コレステロールおよび他の３βＯＨ−ステロール、ならびにその誘導体ホスファチジルコリンまたは商業的に入手可能な陽イオン性脂質混合物、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラメチル−Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラパルミチルスペルミン（ＴＭＴＰＳ）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）との１：１．５（Ｍ／Ｍ）配合物、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（登録商標）、ＧＳ ２８８８ ＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＦＵＧＥＮＥ ６（登録商標）、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００（登録商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＬＩＰＯＴＡＸＩ（登録商標）、ＰＯＬＹＥＣＴ（登録商標）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）、ＴＦＸＮ（商標）、ＴＲＡＮＳＦＡＳＴ（商標）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）、ＴＲＡＮＳＭＥＳＳＥＮＧＥＲ（登録商標）、ベクタミジン（３−テトラデシルアミノ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ'−テトラデシルプロピオンアミジン（ジＣ１４−アミジンとしても知られる）、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）が含まれる。上に列挙されたヘルパー脂質の組み合わせの任意の混合物もまた企図される。以下の特許文書、特許出願または参考文献は、それらの全体が、特に、本発明のトランスフェクション複合体を構成するために使用され得る陽イオン性ヘルパー脂質および中性ヘルパー脂質を含むトランスフェクション物質の開示のために、本明細書中で参考として援用される：米国特許第６，０７５，０１２号；同第６，０２０，２０２号；同第５，５７８，４７５号；同第５，７３６，３９２号；同第６，０５１，４２９号；同第６，３７６，２４８号；同第５，３３４，７６１号；同第５，３１６，９４８号；同第５，６７４，９０８号；同第５，８３４，４３９号；同第６，１１０，９１６号；同第６，３９９，６６３号；同第６，７１６，８８２号；同第５，６２７，１５９号；ＷＯ０４０６３３４２Ａ２として公開されたＰＣＴ／ＵＳ／２００４／０００４３０；ＷＯ００２７７９５Ａ１として公開されたＰＣＴ／ＵＳ／９９２６８２５；ＷＯ０４１０５６９７として公開されたＰＣＴ／ＵＳ／０４０１６４０６；およびＷＯ０７１３００７３Ａ２として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１９３５６。
本明細書中で使用される用語「ペグ化脂質」は、１つ以上のポリエチレングリコール部分に共有結合的に結合体化された脂質のことを広く指す。本明細書中のリポプレックスの実施形態のためのペグ化脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）ベースのペグ化脂質、例えば、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−ＭＷ］（ＭＷは、ポリエチレングリコール部分の平均ＭＷのことを指す）を含む。そのようなジミリストイル−ＰＥＧ−ＰＥ脂質は、一般に、１４：０ＰＥＧ（ＭＷ）ＰＥと称される。そのポリエチレングリコール部分の平均ＭＷは、例えば、２５、３５０、５５０、７５０、１０００、２０００、３０００、５０００、６０００、８０００または１２０００であり得る。ホスファチジルエタノールアミンベースのペグ化脂質の脂肪酸鎖は、例えば、１８：１ＰＥＧ（ＭＷ）ＰＥの場合などの１，２−ジオレオイル基、１６：０ＰＥＧ（ＭＷ）ＰＥの場合などの１，２−ジパルミトイル基または１８：０ＰＥＧ（ＭＷ）ＰＥの場合などの１，２−ジステアロイル基を含み得る。さらにホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）ベースのペグ化脂質には、例えば、ＤＳＰＥ−ＭＯＤ ＰＥＧ（ＭＷ）とも呼ばれる１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ＭＯＤ（ポリエチレングリコール）−ＭＷ］（ＭＯＤとは、アミン、ビオチン、カルボン酸、ホレート、マレイミド、ＰＤＰまたはカルボキシフルオレセイン部分などの官能性部分のことを指す）が含まれる。そのＭＷは、例えば、２０００または５０００であり得る。本明細書中に記載される実施形態のためのペグ化脂質には、セラミドベースのペグ化脂質、例えば、Ｃ８ ＰＥＧ（ＭＷ）セラミドと称されるＮ−オクタノイル−スフィンゴシン−１−｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）ＭＷ］｝（ＭＷは、例えば、７５０、２０００または５０００である）も含まれる。あるいは、脂肪酸部分は、Ｃ１６ ＰＥＧ（ＭＷ）セラミドの場合などのＮ−パルミトイル（Ｃ１６）基を有し得る。
「リポソーム組成物」は、一般に、１つ以上のリポソームを含む配合物である。場合によっては、用語「リポソーム組成物」は、用語「トランスフェクション複合体」と交換可能に使用され得る。これらの配合物は、通常、コロイドであるが、乾燥された配合物でもあり得る。リポソームは、自己組織化した両親媒性の分子から構成される小胞のコロイド粒子である。本発明のリポソーム組成物は、通常、単独で、または必要に応じて、標準的な方法を用いて処理されることによりリポソーム含有コロイド懸濁液を形成する１つ以上のヘルパー脂質（すなわち、中性脂質、コレステロールまたはコレステロール誘導体、陽イオン性脂質）と組み合わせて、少なくとも１つ以上の陽イオン性脂質を含む。本発明のリポソーム組成物は、必要に応じて１つ以上の中性脂質および／もしくはヘルパー脂質または当該分野で公知の任意の非限定的な標準的方法によって処理される標的化部分とともに、１つ以上のアミン含有トランスフェクション脂質、１つ以上のヘルパー脂質、１つ以上のペグ化脂質を含むことにより、リポソームを形成する組成物である。リポソーム組成物は、粒径測定値によって互いに区別され得る。異なる組成物は、粒径および粒径の均一性、例えば、平均粒径および多分散性の差異を示す。異なる組成物は、リポソームの形態で存在する組成物の程度の差異を示す。いくつかの非限定的な実施形態において、リポソーム組成物は、１２０ｎｍおよび８００ｎｍの範囲内の粒径を示し、一般に、低い多分散性を示す。リポプレックスの粒径（ｓｉＲＮＡまたは他のカーゴを含む）は、約４０ｎｍ〜１３５ｎｍの範囲であり得る。いくつかの実施形態において、リポプレックスの粒径は、５０ｎｍ〜１２０ｎｍ、５０ｎｍ〜１００ｎｍ、６０ｎｍ〜９０ｎｍ、７０ｎｍ〜９０ｎｍまたは約８５ｎｍである。
用語「脂質凝集物」または「リポプレックス」は、単層と多層の両方のすべてのタイプのリポソーム、ならびにベシクル、ミセルおよびよりアモルファスな凝集物を含む総称的な用語である。陽イオン性脂質凝集物は、その脂質凝集物が正味の正電荷を有するように、１つ以上の陽イオン性化合物の組み合わせを必要に応じて非陽イオン性脂質（中性脂質を含む）とともに含む脂質凝集物である。本発明のアミン含有トランスフェクション化合物は、必要に応じてヘルパー脂質とともに、さらに必要に応じて１つ以上のペグ化脂質および／または１つ以上の標的化部分とともに、脂質凝集物を形成し得、次いでそれは、好適な生理活性物質と接触されると、脂質−生理活性物質複合体を形成し得る。用語「脂質凝集物」または「リポプレックス」は、本明細書中において、「裸の」トランスフェクション複合体、すなわち、一般に、インビトロまたはインビボにおいて細胞または組織に送達される搭載物である生理活性物質を欠くトランスフェクション複合体のことを指すために広く使用される。
用語「脂質−生理活性物質」は、脂質または脂質凝集物と生理活性物質（例えば、核酸、ポリペプチドなど）との非共有結合性会合物のことを広く指す。
本明細書中で使用されるとき、「核酸」およびその文法上の等価物は、一本鎖または二本鎖のヌクレオチドのあらゆる種類のポリマーを含み、天然の起源から単離された；ＰＣＲ増幅または化学合成などの手法を用いてインビトロで調製される；インビボで、例えば、組換えＤＮＡ技術を介して調製される；または任意の公知の方法によって調製されるかもしくは得られる、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子を含む）を含む。核酸は、通常、２つ以上のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチド）またはそのバリアント、誘導体および／もしくはアナログの直鎖を含むポリヌクレオチド分子のことを指す。正確なサイズは、多くの因子に依存し、そしてそれは、当該分野で周知であるように、最終的な使用条件に依存する。本発明の核酸としては、プライマー、プローブ、オリゴヌクレオチド、ベクター、構築物、プラスミド、遺伝子、導入遺伝子、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ＰＣＲ産物、制限フラグメント、オリゴヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用されるとき、用語「ヌクレオチド」は、糖部分（ペントース）、リン酸および窒素含有複素環式塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡの任意のモノマー単位を含み、そのようなヌクレオチドの一リン酸、二リン酸および三リン酸の形態も含み得る。上記塩基は、通常、グリコシドの炭素を介して（ペントースの１'炭素において）糖部分に連結され、その塩基と糖の組み合わせは、「ヌクレオシド」と呼ばれる。その塩基が、ヌクレオチドを特徴づけ、ＤＮＡの４つの通例の塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）である。イノシン（Ｉ）は、天然に存在する４種の塩基（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）のいずれかの代わりになるために使用できる合成塩基の例である。４種のＲＮＡ塩基は、Ａ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（Ｕ）である。したがって、核酸は、隣接するペントースの３'炭素と５'炭素との間のホスホジエステル結合によって接続されたヌクレオチドの直線配列を含むヌクレオチド配列であり得る。他の改変されたヌクレオチドが公知であり、本発明の実施において使用され（ｓｕｅｄ）得る。ヌクレオチドという用語は、リボヌクレオシド三リン酸ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＩＴＰ、ＣＴＧ、ＧＴＰおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）またはそれらの誘導体を包含する。そのような誘導体としては、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰおよび７−デアザ−ｄＡＴＰ、ならびにそれらを含む核酸分子にヌクレアーゼ耐性を付与するヌクレオチド誘導体が挙げられる。本明細書中で使用されるヌクレオチドという用語は、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびそれらの誘導体のことも指す。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例証される例としては、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰおよびｄｄＴＴＰが挙げられるが、これらに限定されない。本発明によると、「ヌクレオチド」は、標識されていないこともあるし、周知の手法によって検出可能に標識されることもある。検出可能な標識としては、例えば、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識および酵素標識が挙げられる。当該分野で公知の様々な標識方法が、本発明の実施において使用され得る。
「ＲＮＡ」または「ＲＮＡ分子」とは、ウイルス、原核生物および真核生物由来のＲＮＡを含む、任意の起源由来の任意の配列を有する任意のサイズの任意のＲＮＡ分子またはその機能的な一部のことを指す。そのＲＮＡ分子は、化学的に改変され得、任意の形態（線状または環状の一本鎖または二本鎖を含むがこれらに限定されない）であり得る。ＲＮＡ分子の非限定的な例としては、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｔＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｓｔＲＮＡが挙げられる。いくつかの実施形態において、本発明の実施において有用なｓｉＲＮＡ分子は、例えば、Ｕ．Ｓ．２００４／００１４９５６として公開されている米国特許出願番号１０／３５７，５２９、Ｕ．Ｓ．２００４／００５４１５５として公開されている１０／３５７，８２６、Ｕ．Ｓ．２００６／０００９４０９として公開されている１１／０４９，６３６、Ｕ．Ｓ．２００９／００２３２１６として公開されている１１／７７６，３１３および２００８年４月３日出願の１２／０６２，３８０に記載されているもの；ならびにＷＯ２００３／０６４６２６として公開されているＰＣＴ公開出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／０３２２３およびＷＯ０３／０６４６２５として公開されているＰＣＴ／ＵＳ０３／０３２０８に記載されているものを含む（それらの米国出願およびＰＣＴ出願は、本明細書中で参考として援用される）。本発明の実施において有用なさらなるｓｉＲＮＡ分子は、例えば、２００９年３月２６日にＷＯ２００９／０３９１７３として公開されているＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７６６７５に記載されているものを含む；その出願は、本明細書中で参考として援用される。
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、本明細書中で使用されるとき、ペプチド結合によって共に連結されて連なった少なくとも３つのアミノ酸のことを指す。用語「タンパク質」および「ペプチド」は、交換可能に使用され得るが、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、一般にペプチドよりも大きいと理解されている。「ペプチド」は、個別のペプチドまたはペプチドの一群のことを指し得る。
用語「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で使用されるとき、ヌクレオチドのポリマーのことを指す。通常、ポリヌクレオチドは、少なくとも３つのヌクレオチドを含む。そのポリマーは、天然のヌクレオシド（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシンおよびデオキシシチジン）、ヌクレオシドアナログ（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニンおよび２−チオシチジン）、化学的に改変された塩基、生物学的に改変された塩基（例えば、メチル化された塩基）、インターカレートされた塩基、改変された糖（例えば、２'−フルオロリボース、リボース、２'−デオキシリボース、アラビノースおよびヘキソース）または改変されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５'−Ｎ−ホスホルアミダイト結合）を含み得る。
用語「脂質」とは、脂肪、油およびトリグリセリド（ｔｒｉｇｌｙｄｅｒｉｄｅｓ）を包含する疎水性または両親媒性の有機化合物のことを指す。
ＩＩ．本発明の実施形態
アミン含有トランスフェクション化合物
本発明は、トランスフェクション試薬として有用な様々なアミン含有化合物およびそれを合成する方法を記載する。より詳細には、本発明のいくつかの実施形態によると、一般構造Ｉを有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩が提供され：
式中、Ｘ１およびＸ２の各々は、Ｏ、Ｓ、Ｎ−ＡおよびＣ−Ａからなる群から独立して選択される部分であり、ここで、Ａは、水素およびＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖からなる群から選択され；ＹおよびＺの各々は、ＣＨ−ＯＨ、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝ＯおよびＳＯ２からなる群から独立して選択される部分であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の各々は、水素、環式または非環式の置換または非置換の分枝状または非分枝状の脂肪族基、環式または非環式の置換または非置換の分枝状または非分枝状のヘテロ脂肪族基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアシル基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアリール基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のヘテロアリール基からなる群から独立して選択される部分であり、ｘは、１以上１０以下の値を独立して有する整数であり、ｎは、１以上３以下の値を独立して有する整数であり、ｍは、０以上２０以下の値を独立して有する整数であり、ｐは、０または１の値を独立して有する整数であり、ここで、ｍ＝ｐ＝０である場合、Ｒ２は、水素であるが、但しさらに、ｎまたはｍの少なくとも１つが２という値を有する場合、Ｒ３および構造Ｉ中の窒素は：
からなる群から選択される部分を形成し、式中、ｇ、ｅおよびｆの各々は、１以上６以下の値を独立して有する整数であり、「ＨＣＣ」は、炭化水素鎖を表し、各＊は、構造Ｉ中の窒素原子を示す。
アミン含有トランスフェクション化合物
本発明は、トランスフェクション試薬として有用な様々なアミン含有化合物およびそれを合成する方法を記載する。より詳細には、本発明のいくつかの実施形態によると、一般構造Ｉを有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩が提供され：
いくつかの実施形態において、Ｒ３は、ポリアミンである。他の実施形態において、Ｒ３は、ケタールである。いくつかの実施形態において、一般構造Ｉ中のＲ１およびＲ２の各々は、独立して、３〜約２０個の炭素原子（例えば、８〜約１８個の炭素原子）および０〜４個の二重結合（例えば、０〜２個の二重結合）を有する置換または非置換の分枝状または非分枝状の任意のアルキル基またはアルケニル基である。
いくつかの実施形態において、ｎおよびｍの各々が独立して１または３という値を有する場合、Ｒ３は、以下の部分のいずれかであり：
式中、各「ＨＣＣ」は、炭化水素鎖を表し、各＊は、構造Ｉ中の窒素原子に対するＲ３の潜在的な結合点を示し、ここで、任意の＊位における各Ｈは、構造Ｉ中の窒素原子への結合を達成するために置換され得る。
いくつかの実施形態によると、一般構造Ｉの化合物は、各々が水素であるＲ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７、各々がＣ＝ＯであるＹおよびＺ、各々が同じであるＲ１およびＲ２、各々が同じであるＸ１およびＸ２を有し得る。そのような化合物は、一般構造ＩＩによって表され（これは、一般構造Ｉの化合物の亜属である）：
式中、ｎ＝ｐ＝０であるとき、Ｒ２は、Ｈである。
一般構造ＩＩの化合物において、少なくとも１つのＸ１は、ＮＨであるか、または少なくとも１つのＸ１は、Ｏである。さらに、いくつかの実施形態において、一般構造ＩＩの化合物では、各Ｒ１は独立して、３〜約２０個の炭素原子、例えば、８〜約１８個の炭素原子、および０〜４個の二重結合、例えば、０〜２個の二重結合を有する、置換または非置換の分枝状または非分枝状の任意のアルキル基またはアルケニル基である。さらに、いくつかの実施形態において、ｎおよびｍの各々が、独立して１または３という値を有する場合、Ｒ３は、以下の部分のいずれかであり：
式中、各「ＨＣＣ」は、炭化水素鎖を表し、各＊は、構造ＩＩ中の窒素原子に対するＲ３の潜在的な結合点を示し、ここで、任意の＊位における各Ｈは、構造ＩＩ中の窒素原子への結合を達成するために置換され得る。
いくつかの実施形態において、一般構造ＩＩ中のｎまたはｍの少なくとも１つが、２という値を有する場合、Ｒ３は、以下の部分のいずれかであり：
式中、ｇ、ｅおよびｆの各々は、１以上６以下の値を独立して有する整数であり、各「ＨＣＣ」は、炭化水素鎖を表し、各＊は、構造ＩＩ中の窒素原子に対するＲ３の結合点を示す。
本発明の実施形態によると、一般構造Ｉもしくは一般構造ＩＩまたはその両方の範囲内の種であるいくつかの特定の化合物が提供される。そのような特定の化合物の非限定的な例は、以下の脂質１〜８７のいずれかもしくは化合物１〜８７の各々の任意の異性体、または化合物１〜８７の各々に対する異性体の任意の組み合わせであり得る：
上に示された化合物１〜８７のうちのいくつかを使用して、いくつかの脂質組成物を調製した。これらの組成物は、下記の実施例９に詳細に記載され、実施例９中の表１に示される。表１の１番目の縦列における化合物の番号は、上に示された化合物の番号に対応する。
本発明の他の実施形態によると、上に記載された本発明の化合物は、アミノ成分を不飽和成分と反応させることによって、例えば、アミノ成分の第一級アミノ基を不飽和成分の二重結合に付加することによって、合成され得る（その二重結合は、例えば、カルボニルなどの求電子（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｌｉｃ）基と共役する）。通常、本合成方法は、１当量のアミノ成分を１当量以上の不飽和成分と反応させる工程を包含する。そのアミノ成分は、第一級アミンＮＨ２−Ｒ３、ジアミン、ポリアミンまたはそれらの組み合わせを含む。その不飽和成分は、構造Ｒ１−Ｘ１−Ｙ−（ＣＲ４Ｒ５）ｎ−Ｂｒを有する少なくとも１つの第１中間体および構造Ｒ２−Ｘ２−Ｚ−（ＣＲ６Ｒ７）ｍ−Ｂｒを有する第２中間体を含み、ここで、それらの構造の（ＣＲ４Ｒ５）ｎおよび（ＣＲ６Ｒ７）ｍ部分において、各Ｒ４は、同じであるかまたは異なり、各Ｒ５は、同じであるかまたは異なり、各Ｒ６は、同じであるかまたは異なり、各Ｒ７は、同じであるかまたは異なり、第１および第２中間体は、同じであるかまたは異なる。いくつかの実施形態において、不飽和成分の第１および／または第２中間体は、アクリレートまたはアクリルアミドであり得る。
ある特定の実施形態において、アミンＮＨ２−Ｒ３、ジアミンまたはポリアミンのアミノ基のすべてが、不飽和成分と完全に反応することにより、第三級アミンが形成される。他の実施形態では、すべてのアミノ基がそのように反応して第三級アミンを形成するとは限らず、それにより、脂質分子において第一級または第二級アミンがもたらされる。
本発明の化合物の合成は、溶媒ありまたはなしで行われ得、その合成は、室温〜約１００℃の範囲の温度、例えば、約９５℃において行われ得る。反応は、酸、塩基または金属を加えることによって、必要に応じて触媒され得る。当業者は、その合成が行われる最適条件を選択することにより、必要であれば適切な触媒を選択し、アミノ成分と不飽和成分とのモル比を選択し得る。例えば、アミノ成分が、第一級アミンＮＨ２−Ｒ３であるとき、不飽和成分と第一級アミンＮＨ２−Ｒ３とのモル比は、約１：１〜約６：１であり得る。調製された脂質は、必要に応じて精製され得る。その脂質はまた、ハロゲン化アルキル（例えば、ヨウ化メチル）または他のアルキル化剤を用いてアルキル化され得る。
１つの例示的な非限定的実施形態において、合成プロセスは、以下の反応スキームによって例証され得る。
不飽和成分を構成する第１および第２中間体の上に提供された構造において、Ｘ１およびＸ２の各々は、Ｏ、Ｓ、Ｎ−ＡおよびＣ−Ａからなる群から独立して選択される部分であり、ここで、Ａは、水素およびＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖からなる群から選択され；ＹおよびＺの各々は、ＣＨ−ＯＨ、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝ＯおよびＳＯ２からなる群から独立して選択される部分であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の各々は、水素、環式または非環式の置換または非置換の分枝状または非分枝状の脂肪族基、環式または非環式の置換または非置換の分枝状または非分枝状のヘテロ脂肪族基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアシル基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアリール基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のヘテロアリール基からなる群から独立して選択される部分であり、ｎおよびｍの各々は、１以上３以下の値を独立して有する整数である。
いくつかの実施形態において、不飽和成分の第１および第２中間体の上に提供された構造におけるｎまたはｍの少なくとも１つが、２という値を有し、かつ第一級アミンＮＨ２−Ｒ３が、アミノ成分として使用される場合、上に提供された第一級アミンの構造におけるＲ３は、以下の部分のいずれかであり：
式中、ｇ、ｅおよびｆの各々は、１以上６以下の値を独立して有する整数であり、各「ＨＣＣ」は、炭化水素鎖を表し、各＊は、第一級アミンＮＨ２−Ｒ３中のアミノ基に対するＲ３の結合点を示す。
いくつかの実施形態において、不飽和成分の第１および第２中間体の上に提供された構造におけるＲ１およびＲ２の各々は、独立して、３〜約２０個の炭素原子（例えば、８〜約１８個の炭素原子）および０〜４個の二重結合（例えば、０〜２個の二重結合）を有する置換または非置換の分枝状または非分枝状の任意のアルキル基またはアルケニル基である。
いくつかの実施形態において、不飽和成分の第１および第２中間体の上に提供された構造において、ｎおよびｍの各々が、独立して１または３という値を有し、かつ第一級アミンＮＨ２−Ｒ３が、アミノ成分として使用される場合、上に提供された第一級アミンの構造におけるＲ３は、以下の部分のいずれかであり得：
式中、各「ＨＣＣ」は、炭化水素鎖を表し、各＊は、第一級アミンＮＨ２−Ｒ３中のアミノ基に対するＲ３の潜在的な結合点を示し、ここで、任意の＊位における各Ｈは、第一級アミンＮＨ２−Ｒ３中の窒素原子への結合を達成するために置換され得る。
本発明の上に記載された化合物は、インビトロまたはインビボにおける、被験体、動物、または細胞もしくは組織への生物学的に活性な物質または治療薬の送達において使用され得る。ある特定の例証的であるが非限定的な実施形態において、それらの化合物は、特に、負に帯電した生理活性物質の送達にふさわしい場合がある。例えば、本発明のアミン（ａｍｉｎ）含有トランスフェクション化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、他のポリヌクレオチド、他のアニオンまたはポリアニオンを被験体または細胞に送達するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の脂質は、ある物質と混和されることにより、トランスフェクション複合体（例えば、微小粒子、リポソームまたはミセル）を形成する。これらの送達ビヒクルによって送達される生理活性物質（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチドまたは小分子）は、固体もしくは液体または溶解された（ｄｉｓｏｌｖｅｄ）形態であり得る。本発明の脂質は、他の脂質、ポリマー、界面活性物質、コレステロール、炭水化物、タンパク質などと混和されることにより、粒子を形成し得る。これらの粒子は、医薬賦形剤と混和されることにより、医薬組成物を形成し得る。
上に記載されたように合成される脂質は、任意の公知の手法によって（例えば、結晶化、クロマトグラフィー、沈殿（例えば、ジエチルエーテル、ヘキサンまたは別の有機溶媒中での再三の沈殿）または蒸留によって）さらに精製され得る。その脂質は、その脂質が有機酸または無機酸と反応したときに形成され得る塩としても単離され得る。いくつかの実施形態において、その脂質が、第三級アミン部分を含む場合、それは、任意のアルキル化剤、例えば、ヨウ化メチルなどのハロゲン化アルキルでアルキル化されることにより、その脂質の第四級アンモニウム塩を形成し得る。第四級アミンと会合されるアニオンは、任意の薬学的に許容可能な有機または無機アニオンであり得る。
いくつかの実施形態において、上記合成プロセスは、様々な数および位置のアクリレートテイルとともにアクリルテイルを有する異性体の混合物を生じ得る。そのような混合物は、所望のとおり、さらなる精製ありまたはなしで使用され得る。アミンが、完全にアルキル化されないとき、得られる生成物は、別の求電子剤（例えば、アクリレートまたはアクリルアミド）とさらに反応させた後、必要に応じてさらに精製され得る。
いくつかの実施形態において、種々の脂質のライブラリーが、平行して調製され得る。そのために、異なるアミンおよび／または不飽和成分が、バイアルセットの各バイアルまたはマルチウェルプレートの各ウェルに加えられ得る。その反応混合物のアレイが、脂質の形成を生じさせるのに十分な温度かつ時間の長さでインキュベートされる。次いで、それらの脂質は、公知の手法を用いて単離および精製された後、所望の特徴（例えば、溶解性、ポリヌクレオチドへの結合能、ヘパリンへの結合能、小分子への結合能、微小粒子の形成能、トランスフェクション効率を増加させる能力など）を有する脂質を同定するハイスループット法を用いてスクリーニングされ得る。
トランスフェクション複合体
生物学的に活性な化合物を、インビトロにおいて細胞もしくは組織にまたはインビボにおいて動物の細胞もしくは組織に送達するために製剤化される新規トランスフェクション複合体を提供することが、ここで開示される実施形態のさらなる目的である。本明細書中で企図されるような細胞または組織への生物学的に活性な物質の送達は、障害を処置するための治療様式を提供するためのものであり得るか、または科学研究を行う過程において（例えば、研究ツールとして）提供され得る。
生物学的に活性な化合物を、インビトロにおいて細胞もしくは組織にまたはインビボにおいて動物の細胞もしくは組織に送達するために製剤化される新規トランスフェクション複合体を提供することが、ここで開示される実施形態のさらなる目的である。本明細書中で企図されるような細胞または組織への生物学的に活性な物質の送達は、障害を処置するための治療様式を提供するためのものであり得るか、または科学研究を行う過程において（例えば、研究ツールとして）提供され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるようなトランスフェクション複合体は、上記生物学的に活性な物質が細胞または組織に送達されることにより、所望の生物学的応答に作用し得るような脂質凝集物として製剤化される１つ以上のアミン含有トランスフェクション物質を含み得る。いくつかの実施形態において、トランスフェクション複合体は、必要に応じて、１つ以上のヘルパー脂質を含み得る。ある実施形態において、トランスフェクション複合体は、必要に応じて、１つ以上のペグ化脂質を含み得る。ある実施形態において、トランスフェクション複合体は、必要に応じて、１つ以上の標的化部分またはトランスフェクションエンハンサーを含み得る。
ある実施形態において、トランスフェクション複合体は、一般構造Ｉを有するアミン含有トランスフェクション化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含み得：
式中、Ｘ１およびＸ２の各々は、Ｏ、Ｓ、Ｎ−ＡおよびＣ−Ａからなる群から独立して選択される部分であり、ここで、Ａは、水素およびＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖からなる群から選択され；ＹおよびＺの各々は、ＣＨ−ＯＨ、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝ＯおよびＳＯ２からなる群から独立して選択される部分であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の各々は、水素、環式または非環式の置換または非置換の分枝状または非分枝状の脂肪族基、環式または非環式の置換または非置換の分枝状または非分枝状のヘテロ脂肪族基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアシル基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアリール基、置換または非置換の分枝状または非分枝状のヘテロアリール基からなる群から独立して選択される部分であり、ｘは、１以上１０以下の値を独立して有する整数であり、ｎは、１以上３以下の値を独立して有する整数であり、ｍは、０以上２０以下の値を独立して有する整数であり、ｐは、０または１の値を独立して有する整数であり、ここで、ｍ＝ｐ＝０である場合、Ｒ２は、水素であるが、但しさらに、ｎまたはｍの少なくとも１つが２という値を有する場合、Ｒ３および構造Ｉ中の窒素は：
からなる群から選択される部分を形成し、式中、ｇ、ｅおよびｆの各々は、１以上６以下の値を独立して有する整数であり、「ＨＣＣ」は、炭化水素鎖を表し、各＊は、構造Ｉ中の窒素原子を示す。
いくつかの実施形態において、Ｒ３は、ポリアミンである。他の実施形態において、Ｒ３は、ケタールである。いくつかの実施形態において、一般構造Ｉ中のＲ１およびＲ２の各々は、独立して、３〜約２０個の炭素原子（例えば、８〜約１８個の炭素原子）および０〜４個の二重結合（例えば、０〜２個の二重結合）を有する置換または非置換の分枝状または非分枝状の任意のアルキル基またはアルケニル基である。
いくつかの実施形態において、ｎおよびｍの各々が、独立して１または３という値を有する場合、Ｒ３は、以下の部分のいずれかであり：
式中、各「ＨＣＣ」は、炭化水素鎖を表し、各＊は、構造Ｉ中の窒素原子に対するＲ３の潜在的な結合点を示し、ここで、任意の＊位における各Ｈは、構造Ｉ中の窒素原子への結合を達成するために置換され得る。
いくつかの実施形態によると、一般構造Ｉを有するアミン含有トランスフェクション化合物を含むトランスフェクション複合体は、各々が水素であるＲ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７、各々がＣ＝ＯであるＹおよびＺ、各々が同じであるＲ１およびＲ２、ならびに各々が同じであるＸ１およびＸ２を有し得る。そのような化合物は、一般構造ＩＩによって表され（これは、一般構造Ｉの化合物の亜属である）：
式中、ｎ＝ｐ＝０であるとき、Ｒ２は、Ｈである。
一般構造ＩＩの化合物において、少なくとも１つのＸ１は、ＮＨであるか、または少なくとも１つのＸ１は、Ｏである。さらに、いくつかの実施形態において、一般構造ＩＩの化合物では、各Ｒ１は独立して、３〜約２０個の炭素原子、例えば、８〜約１８個の炭素原子、および０〜４個の二重結合、例えば、０〜２個の二重結合を有する、置換または非置換の分枝状または非分枝状の任意のアルキル基またはアルケニル基である。さらに、いくつかの実施形態において、ｎおよびｍの各々が、独立して１または３という値を有する場合、Ｒ３は、以下の部分のいずれかであり：
式中、各「ＨＣＣ」は、炭化水素鎖を表し、各＊は、構造ＩＩ中の窒素原子に対するＲ３の潜在的な結合点を示し、ここで、任意の＊位における各Ｈは、構造ＩＩ中の窒素原子への結合を達成するために置換され得る。
いくつかの実施形態において、一般構造ＩＩ中のｎまたはｍの少なくとも１つが、２という値を有する場合、Ｒ３は、以下の部分のいずれかであり：
式中、ｇ、ｅおよびｆの各々は、１以上６以下の値を独立して有する整数であり、各「ＨＣＣ」は、炭化水素鎖を表し、各＊は、構造ＩＩ中の窒素原子に対するＲ３の結合点を示す。
本発明の実施形態によると、トランスフェクション複合体は、一般構造Ｉもしくは一般構造ＩＩまたはその両方の範囲内の種である１つ以上のアミン含有トランスフェクション化合物を含み得る。そのような特定の化合物の非限定的な例は、上に示された以下の脂質１〜８７のいずれかもしくは化合物１〜８７の各々の任意の異性体、または化合物１〜８７の各々に対する異性体の任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態において、アミン含有トランスフェクション化合物のモル濃度百分率は、脂質凝集物の約１５％〜約５０％であり；他の実施形態において、陽イオン性脂質のモル濃度百分率は、トランスフェクション複合体の約２０％〜約４０％であり；いくつかの実施形態において、アミン含有トランスフェクション化合物のモル濃度百分率は、脂質凝集物の約２５％〜約３５％であるか；またはいくつかの実施形態において、アミン含有トランスフェクション化合物のモル濃度百分率は、脂質凝集物の約３３％である。いくつかの実施形態において、アミン含有トランスフェクション化合物のモル濃度百分率は、脂質凝集物の約１５％〜約３５％であり；他の実施形態において、アミン含有トランスフェクション化合物のモル濃度百分率は、脂質凝集物の約２０％〜約３０％であるか；またはいくつかの実施形態において、アミン含有トランスフェクション化合物のモル濃度百分率は、脂質凝集物のおよそ２５％である。
いくつかの実施形態において、トランスフェクション複合体は、必要に応じて、１つ以上のヘルパー脂質を含み得る。ここで記載されるトランスフェクション複合体の製剤化における使用に適したヘルパー脂質の例証的であるが非限定的な例としては、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロール（フィトステロール、動物ステロールおよびホパノイドを含む）または細胞もしくは組織の内部に外来性の生理活性分子を導入することを可能にするかもしくは容易にすると知られている任意の中性脂質もしくは陽イオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態において、２つ以上のヘルパー脂質が、本明細書中に記載されるトランスフェクション複合体の製剤化において使用され得る。ここで開示されるトランスフェクション複合体の調製における使用について企図された例示的であるが非限定的な中性脂質または陽イオン性脂質としては、以下から選択される１つ以上の脂質が挙げられ得る：ＢＭＯＰ（Ｎ−（２−ブロモエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（９−オクタデセニルオキシ）−プロパンアミニウムブロミド）、ＤＤＰＥＳ（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミド）、ＤＳＰＣ、ＣＴＡＢ：ＤＯＰＥ（臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＡＴＢ）とＤＯＰＥとの配合物）、ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＭＧ、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）、ＤＭＰＥ（ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＯＭＧ、ＤＭＡ、ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）、ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）、ＤＰＥＰＣ（ジパルミトイルエチルホスファチジルコリン）、ＤＯＤＡＣ（ジオレオイルジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジ−オレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミド）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−ｎ，ｎ，ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＤＡＢ（ジデシルメチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルスルフェート）、ＤＯＴＡＰ・Ｃｌ、ＤＣ−ｃｈｏｌ（３，β−Ｎ，（Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール）、ＤＯＳＰＡ（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アンモニウムトリフルオロアセテート）、ＤＣ−６−１４（Ｏ，Ｏ'−ジテトラデカノイル−Ｎ−（アルファトリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド）、ＤＣＰＥ（ジカプロイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＬＲＩＥ（ジラウリルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン）、エチル−ＰＣ、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミドエチル］−Ｎ，Ｎ−ジ−メチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン）、ＤＭＲＩＥ（Ｎ−［１−（２，３ジミリスチルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド）、ＤＯＥＰＣ（ジオレオイルエチル−ホスホコリン）、ＤＯＨＭＥ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ−［１−（２−ヒドロキシエチル）］−Ｎ，Ｎジメチルアンモニウムヨージド）、ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ（Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ドデシルオキシ）−１−プロパンイミニウムブロミド／ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（３−リシル（１−グリセロール））・Ｃｌ）、Ｎ−ラウロイルサルコシン、（Ｒ）−（＋）−リモネン、レシチン類（およびそれらの誘導体）；ホスホチジルエタノールアミン（およびその誘導体）；ホスファチジルエタノールアミン類、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰＰＥジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、Ｏ−Ｃｈｏｌ（３ベータ［１−オルニチンアミドカルバモイル］コレステロール）、ＰＯＰＥ（パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン）およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン；ホスホチジルコリン；ホスファチジルコリン類、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）およびジステアロイルホスファチジルコリン；ホスファチジルグリセロール；ピペラジンベースの陽イオン性脂質、ホスファチジルグリセロール類、例えば、ＤＯＰＧ（ジオレオイルホスファチジルグリセロール）、ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）およびジステアロイルホスファチジルグリセロール；ホスファチジルセリン（およびその誘導体）；ホスファチジルセリン類、例えば、ジオレオイル−またはジパルミトイルホスファチジルセリン；ジ第四級アンモニウム塩、例えば、Ｎ，Ｎ'−ジオレイル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−１，２−エタンジアミン（ＴｍｅｄＥｃｅ）、Ｎ，Ｎ'−ジオレイル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−１，３−プロパンジアミン（ＰｒｏｐＥｃｅ）、Ｎ，Ｎ'−ジオレイル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−１，６−ヘキサンジアミン（ＨｅｘＥｃｅ）およびそれらの対応するＮ，Ｎ'−ジセチル飽和アナログ（ＴｍｅｄＡｃｅ、ＰｒｏｐＡｃｅおよびＨｅｘＡｃｅ）、ジホスファチジルグリセロール類；脂肪酸エステル類；一価陽イオン性トランスフェクション脂質、例えば、１−デオキシ−１−［ジヘキサデシル（メチル）アンモニオ］−Ｄ−キシリトール；１−デオキシ−１−［メチル（ジテトラデシル）アンモニオ］−Ｄアラビニトール；１−デオキシ−１−［ジヘキサデシル（メチル）アンモニオ］−Ｄ−アラビニトール；１−デオキシ−１−［メチル（ジオクタデシル）アンモニオ］−Ｄアラビニトール、グリセロールエステル類；スフィンゴ脂質；カルジオリピン；セレブロシド類；およびセラミド類；ならびにそれらの混合物。中性脂質にはまた、とりわけ、コレステロールおよび他の３βＯＨ−ステロール、ならびにその誘導体ホスファチジルコリンまたは商業的に入手可能な陽イオン性脂質混合物、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラメチル−Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラパルミチルスペルミン（ＴＭＴＰＳ）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）との１：１．５（Ｍ／Ｍ）配合物、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（登録商標）、ＧＳ ２８８８ ＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＦＵＧＥＮＥ ６（登録商標）、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００（登録商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＬＩＰＯＴＡＸＩ（登録商標）、ＰＯＬＹＥＣＴ（登録商標）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）、ＴＦＸＮ（商標）、ＴＲＡＮＳＦＡＳＴ（商標）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）、ＴＲＡＮＳＭＥＳＳＥＮＧＥＲ（登録商標）、ベクタミジン（３−テトラデシルアミノ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ'−テトラデシルプロピオンアミジン（ジＣ１４−アミジンとしても知られる）、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）が含まれる。上に列挙されたヘルパー脂質の組み合わせの任意の混合物もまた企図される。以下の特許文書、特許出願または参考文献は、特に、本発明のトランスフェクション複合体を構成するために使用され得る陽イオン性および中性ヘルパー脂質を含むトランスフェクション物質の開示のために、それらの全体が本明細書中で参考として援用される。
上記ヘルパー脂質または中性脂質のモル濃度百分率は、脂質凝集物の約６０％〜約８５％であり；いくつかの実施形態において、ヘルパー脂質または中性脂質のモル濃度百分率は、脂質凝集物の約７０％〜約８０％であるか；またはいくつかの実施形態において、ヘルパー脂質または中性脂質のモル濃度百分率は、脂質凝集物の約７０％〜約７５％である。
いくつかの実施形態において、トランスフェクション複合体は、１つ以上のペグ化脂質を含み得る。本明細書中に開示されるトランスフェクション複合体の調製および形成における使用に適したペグ化脂質は、本明細書中に記載されるトランスフェクション複合体の形成、およびインビボにおける動物もしくはヒトへのまたはインビトロにおける組織もしくは細胞へのその投与と適合性である任意の脂質または脂質の混合物であり得る。本発明において使用されるペグ化脂質は、約２５０ダルトン〜約１２，０００、またはいくつかの実施形態において、約３５０ダルトンおよび約６，０００ダルトン、またはいくつかの実施形態において、約５００ダルトン〜約１，０００ダルトン、またはいくつかの実施形態において、約１，０００ダルトン〜約２，０００ダルトン、またはいくつかの実施形態において、約２，０００ダルトン〜５，０００ダルトンの分子量を有するＰＥＧポリマーを含む。より詳細には、好適なペグ化脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）ベースのペグ化脂質、例えば、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−ＭＷ］（ＭＷは、そのポリエチレングリコール部分の平均ＭＷのことを指す）を含む。そのようなジミリストイル−ＰＥＧ−ＰＥ脂質は、一般に、１４：０ＰＥＧ（ＭＷ）ＰＥと称される。そのポリエチレングリコール部分の平均ＭＷは、例えば、２５、３５０、５５０、７５０、１０００、２０００、３０００、５０００、６０００、８０００または１２０００であり得る。ホスファチジルエタノールアミンベースのペグ化脂質の脂肪酸鎖は、例えば、１８：１ＰＥＧ（ＭＷ）ＰＥの場合などの１，２−ジオレオイル基、１６：０ＰＥＧ（ＭＷ）ＰＥの場合などの１，２−ジパルミトイル基または１８：０ＰＥＧ（ＭＷ）ＰＥの場合などの１，２−ジステアロイル基を含み得る。さらにホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）ベースのペグ化脂質には、例えば、ＤＳＰＥ−ＭＯＤ ＰＥＧ（ＭＷ）とも呼ばれる１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ＭＯＤ（ポリエチレングリコール）−ＭＷ］（ＭＯＤとは、アミン、ビオチン、カルボン酸、ホレート、マレイミド、ＰＤＰまたはカルボキシフルオレセイン部分などの官能性部分のことを指す）が含まれる。そのＭＷは、例えば、２０００または５０００であり得る。本明細書中に記載される実施形態の場合のペグ化脂質には、セラミドベースのペグ化脂質、例えば、Ｃ８ ＰＥＧ（ＭＷ）セラミドと称されるＮ−オクタノイル−スフィンゴシン−１−｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）ＭＷ］｝（ＭＷは、例えば、７５０、２０００または５０００である）も含まれる。あるいは、脂肪酸部分は、Ｃ１６ ＰＥＧ（ＭＷ）セラミドの場合などのＮ−パルミトイル（Ｃ１６）基を有し得る。
いくつかの実施形態において、ペグ化脂質のモル濃度百分率は、トランスフェクション複合体の約０．５％〜１５％であり；いくつかの実施形態において、ペグ化脂質のモル濃度百分率は、トランスフェクション複合体の約１％〜約１０％であるか；またはいくつかの実施形態において、ペグ化脂質のモル濃度百分率は、トランスフェクション複合体のおよそ１％または５％である。
いくつかの実施形態において、トランスフェクション複合体のアミン含有トランスフェクション化合物：ヘルパー脂質：ペグ化脂質のモル濃度百分率は、１５：８４：１〜１５：７５：１０、２０：７９：１〜２０：７０：１０、２５：７４：１〜２５：６５：１０、３０：６９：１〜３０：６０：１０、４０：５９：１〜４０：５０：１０または５０：４９：１〜５０：４０：１０の範囲である。いくつかの実施形態において、トランスフェクション複合体のアミン含有トランスフェクション化合物：ヘルパー脂質：ペグ化脂質のモル濃度百分率は、１０〜９０：７〜３５：５〜７０、１５〜８５：５〜３５：８〜５０、３０〜８５：５〜３５：８〜５０、３５〜７０；１０〜３０：１５〜４５、４０〜６５：１５〜２５：２０〜４０、５０〜６０：１８〜２２：２５〜３５、５０〜５５：１９〜２１：２７〜３０または５１〜５３：２０〜２０．５：２８〜２９の範囲である。当然のことながら、代替の比が使用され得ること、および過度の実験を必要としないそのような配合の比の最適化が十分に当業者の技術レベルの範囲内であることが、当業者によって容易に認識されるだろう。
本発明のさらなる非限定的な実施形態は、生理活性物質、例えば、ポリアニオン、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを細胞または組織に送達するための方法を提供し、ここで、その方法は、上に記載されたアミン含有トランスフェクション化合物の１つ以上を、必要に応じて１つ以上のヘルパー脂質および／または１つ以上のペグ化脂質とともに含むリポソームなどの脂質凝集物を形成する工程、ならびにその脂質凝集物を生理活性物質と接触させることにより、中性または正に帯電した生理活性物質−脂質凝集物複合体を形成する工程、ならびにその複合体を細胞または組織とともにインビトロでインキュベートする工程、または得られたトランスフェクション複合体を動物またはヒトに必要に応じて治療用組成物として投与する工程を包含する。そのような投与のために企図される有用な生理活性物質としては、タンパク質、ペプチドおよび核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、トランスフェクション複合体は、インビトロまたはインビボにおいて細胞または標的組織に送達される１つ以上の生物学的に活性な物質を含み得る。好適な生物学的に活性な物質には、ここで記載されるアミン含有トランスフェクション試薬とトランスフェクション複合体を形成することができ、かつインビボまたはインビトロにおいて細胞の内部または組織に送達されると生物学的応答を誘発する、任意の分子が含まれ得る。ここで記載される実施形態における使用について企図される生物学的に活性な物質は、陽イオン性、中性または陰イオン性の物質であり得る。非限定的な例として、トランスフェクション複合体としての製剤化に適した例示的な生物学的に活性な物質としては；核酸（一本鎖または二本鎖の線状または環状のＤＮＡ分子（ｃＤＮＡ分子を含む）、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、センスオリゴヌクレオチドを含むがこれらに限定されない）、ポリペプチド、抗体、オリゴペプチド、治療用のペプチドもしくはタンパク質分子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、陽イオン性、陰イオン性もしくは中性の有機分子または薬物がその薬学的に許容可能な塩に加えて挙げられ得るが、これらに限定されない。
本発明のある特定の非限定的な例示的実施形態において、インビトロまたはインビボにおいて核酸分子を細胞または組織に送達する（遺伝子発現を阻害するために細胞内にＲＮＡ干渉分子（ＲＮＡｉ）または低分子干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）を送達することを含む）ために本発明の化合物を使用するトランスフェクション複合体および方法が提供される。
ある特定の非限定的な例示的実施形態において、特定のタンパク質の発現を促進するためにインビボまたはインビトロにおいてｍＲＮＡ分子を細胞または組織に送達するために本発明の化合物を使用するトランスフェクション複合体および方法が提供される。
本発明の他の非限定的な例示的実施形態において、インビボまたはインビトロにおいてＤＮＡ分子（ｃＤＮＡ分子を含む）を細胞または組織に送達するため、特定のタンパク質の発現を促進するためまたは特定のＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ分子またはＲＮＡｉもしくはｍｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ分子を含むがこれらに限定されない）を合成するために本発明の化合物を使用するトランスフェクション複合体および方法が提供される。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるトランスフェクション複合体は、必要に応じて１つ以上の融合性または細胞透過性ペプチドを含み得る。融合性または細胞透過性ペプチドは、脂質含有複合体と細胞膜（原形質膜またはエンドソーム膜）との融合を促進することができる任意のペプチド分子である。種々の融合性または細胞透過性ペプチドが当該分野で公知であり、過度の実験なしに好適な融合性または細胞透過性ペプチドを特定することおよび本発明においてそれを使用するための条件を特定することは、十分に当業者の技術レベルの範囲内である。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるトランスフェクション複合体は、必要に応じて１つ以上のトランスフェクションヘルパーまたは標的化部分を含み得る。標的化部分は、ペプチド、改変されたペプチド、抗体、改変された抗体、レセプター分子、改変されたレセプター分子、一本鎖もしくは二本鎖の核酸分子、改変された一本鎖もしくは二本鎖の核酸分子、ペプチドアプタマーもしくは核酸アプタマー、改変されたペプチドアプタマーもしくは核酸アプタマー、有機分子、多糖、または生物学的物質の標的化送達のためにトランスフェクション複合体を特定の組織もしくは細胞型に標的化することができる他の任意の分子（例えば、当業者に容易に明らかになるもの）であり得る。いくつかの実施形態において、ペプチド、抗体、核酸、アプタマーなどの改変は、そのペプチド、抗体、核酸、アプタマーなどをＰＥＧ部分に結合体化することを含み得る。あるいは、ペプチド、抗体、核酸、アプタマーなどの改変は、そのペプチド、抗体、核酸、アプタマーなどをＰＥＧ脂質部分に結合体化することを含み得る。種々の標的化部分は、当業者に広く公知のものであり、そのすべてが、限定されないがここで記載される実施形態での使用について企図される。
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるトランスフェクション複合体は、最長１年間にわたって安定であり得、トランスフェクトするために細胞もしくは組織と接触され得るか、または形成された直後もしくはすぐ後に動物もしくはヒトに投与され得るか、あるいは必要に応じて、細胞もしくは組織と接触させるまでまたは動物もしくはヒトに投与するまでの時間にわたって貯蔵され得る。本トランスフェクション複合体は、安定であり、室温、または凍結温度より高い温度からおよそ室温までの温度において少なくとも３０分間、少なくとも４５分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも５日間、少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２８日間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間または少なくとも１年間にわたって貯蔵され得る。本明細書中に記載される製剤が、生理活性な製剤の長期間の安定化および貯蔵を助ける１つ以上の安定化剤、保存剤、緩衝剤など（例えば、生物学および薬学分野の当業者が容易に理解し、かつそれを確かめるために過度の実験を必要としないもの）を含み得ることが理解されるべきである。貯蔵期間が、これらの時間のいずれかの範囲、例えば、３１分間〜１時間または１時間〜２４時間であり得ることも理解される。
必要に応じて、生理活性物質−脂質凝集物複合体は、細胞と接触される前にある期間にわたって貯蔵される。ポリアニオン−脂質凝集物複合体は、安定であり、少なくとも４５分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも５日間、少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２８日間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間もしくは少なくとも１年間、またはこれらの任意の時間の間の時間にわたって貯蔵され得る。
本発明は、特に、必要に応じて化学的に改変される、ｓｉＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および低分子時間制御型（ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）を含むＲＮＡｉ成分を、インビトロまたはインビボにおいて細胞または組織に送達するのにふさわしい。
本発明のトランスフェクション複合体またはそれらの混合物を使用する送達方法は、インビトロ、エキソビボおよびインビボにおいて、特に、真核細胞または組織（動物細胞、ヒト細胞、非ヒト動物細胞、昆虫細胞、植物細胞（藻類を含む）、鳥類細胞、魚類細胞、哺乳動物細胞などを含む）のトランスフェクションのために、細胞に適用され得る。
いくつかの実施形態において、細胞に送達される生理活性物質は、本発明の脂質凝集物と接触されることにより、生理活性物質−脂質凝集物複合体を含むトランスフェクション複合体を形成する。次いで、標的細胞または標的組織が、その複合体とともにインキュベートされるか、またはインビボで適用の場合、その複合体は、その複合体が標的細胞または標的組織と接触するように、適切な経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、経皮的、経粘膜的など）によって生物に投与される。トランスフェクション複合体を、インビトロにおいて細胞もしくは組織に、またはインビボにおいて組織もしくは動物に適用するための方法は、当該分野で広く公知であり、そのような方法の使用は、以下に限定されないが、ここで記載される脂質トランスフェクション複合体を細胞、組織または動物に投与することについて本明細書中で企図される。これらの方法を、本明細書中に記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、ここで記載される組成物を用いて使用することに適合することは、十分に当業者の能力の範囲内である。それらの化合物はまた、細胞標的化、取り込み、内部移行、核標的化および発現（これらのすべてが、同様に当業者の技術レベルの範囲内である）を増強するために、トランスフェクションヘルパーまたは標的化部分とも呼ばれる種々の有用な分子および物質（例えば、タンパク質、ペプチド、成長因子、抗体、核酸、アプタマーまたはそれらの改変されたバージョン（例えば、前記トランスフェクションヘルパーまたは標的化部分をＰＥＧまたはＰＥＧ−脂質と結合体化させているもの）など）と結合体化され得るか、またはそれらと混合され得るか、またはそれらとともに使用され得る。
さらなる実施形態は、インビボにおいて細胞または組織を核酸でトランスフェクトする方法を提供し、ここで、その方法は、１つ以上のアミン含有トランスフェクション化合物、１つ以上のペグ化脂質および必要に応じて１つ以上のヘルパー脂質を含むリポソームなどの脂質凝集物を形成する工程、その脂質凝集物を核酸と接触させることにより、中性または正に帯電した脂質凝集物−核酸複合体を形成する工程、ならびにその脂質凝集物−核酸複合体をインビトロにおいて細胞もしくは組織にまたは生物に投与して、複合体が標的細胞または標的組織と接触する工程を包含する。その脂質凝集物−核酸複合体の投与は、下記にさらに記載されるように、経口的に、静脈内に、または皮下注射もしくは筋肉内注射によって行われ得るか、あるいは組織に局部的に適用され得る。
必要に応じて、生理活性物質−脂質凝集物複合体は、トランスフェクションのために細胞と接触される前にある期間にわたって貯蔵される。ポリアニオン−脂質凝集物複合体は、安定であり、少なくとも３０分間、少なくとも４５分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも５日間、少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２８日間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間もしくは少なくとも１年間、またはこれらの任意の時間の間の時間にわたって貯蔵され得る。
別の実施形態において、本発明のトランスフェクション複合体（およそ５μｌ〜２０００μｌ）が、マルチウェルプレートのウェルに提供される。標的細胞に送達される生理活性分子が選択され、それがそのウェルに加えられることにより、ポリアニオン−脂質凝集物複合体が形成され、続いてその複合体は、インビトロまたはインビボにおいて標的細胞と接触される。その脂質凝集物は、各ウェルにおいて同じ組成および濃度を有し得るか、または脂質凝集物の組成および／もしくは濃度は、ウェルごとに異なり得る（例えば、脂質凝集物中のペグ化の量は、ウェルによって異なることにより、送達およびトランスフェクションのための範囲が決定され得る）。生理活性物質が、ＲＮＡｉなどの核酸である場合、その核酸は、標的細胞と接触する前にウェルに加えられ、必要に応じて貯蔵され得る。
本発明の方法は、必要に応じて、生理活性物質を１つ以上のアミン含有トランスフェクション化合物と接触させることによりその生理活性物質を被包する脂質凝集物を形成する前またはそれと同時に、その１つ以上のアミン含有トランスフェクション化合物を、１つ以上のヘルパー脂質および１つ以上のペグ化脂質と接触させる工程を包含する。その方法はまた、必要に応じて、生理活性物質と接触させる前に脂質凝集物をリポソームに形成する工程も包含する。さらなる実施形態では、リポソームは、マイクロ流動化、押出成形または当該分野で公知の他の手段によって形成される。いくつかの実施形態において、生理活性物質には、標的遺伝子の発現を阻害するかまたは促進する、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸分子が含まれ得る。いくつかの実施形態において、生理活性物質は、遺伝子の転写物と会合することにより、その阻害をもたらす。いくつかの実施形態において、生理活性物質は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｔＲＮＡ）であり、必要に応じて化学的に改変される。
別の実施形態において、本発明は、１つ以上のアミン含有トランスフェクション化合物を、必要に応じて１つ以上のヘルパー脂質、必要に応じて１つ以上のペグ化脂質および必要に応じて１つ以上の標的化部分もしくはトランスフェクションヘルパー（上に記載されたようなもの）またはそれらの塩とともに含むリポソームを、生理活性物質、例えば、核酸と混和することによって調製される医薬も提供し、ここで、その生理活性物質を細胞または組織に導入することによって、それらの中の１つ以上の標的遺伝子の発現が調節され、それにより、少なくとも１つの生物学的応答および／または少なくとも１つの治療的利点がもたらされる。必要に応じて、その医薬はさらに、薬学および／または医学の分野の当業者に容易に明らかになり得るような追加の賦形剤または薬学的担体を含む。いくつかの実施形態において、生理活性物質は、核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、その核酸は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｔＲＮＡであり、必要に応じて化学的に改変される。いくつかの実施形態において、細胞または組織における１つ以上の遺伝子の発現に関係する疾患、病状または障害を処置するための医薬または医薬品が提供される。薬理学的に許容可能な医薬の製剤化は、当該分野で公知である。その医薬の投与によって、有効量のポリアニオン、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡが、その疾患、病状または障害に関連する細胞または組織に送達されることにより、その疾患、病状または障害が回復する。非限定的な例として、そのような医薬は、下記にさらに記載されるように、経口的に、静脈内に、または皮下注射もしくは筋肉内注射によって投与され得るか、あるいは組織に局部的に適用され得る。
本発明は、ここで記載される本発明本発明の１つ以上のトランスフェクション複合体を調製するためのキットも提供する。そのようなキットは、例えば、本発明の１つ以上のリポソーム組成物を備え得る。そのようなキットは、通常、運搬手段（例えば、箱、カートン、チューブなど）を備え（その中に、厳重な管理下で１つ以上の容器（例えば、バイアル、チューブ、アンプル、ボトルなど）を有する）、ここで、容器は、１つ以上のアミン含有トランスフェクション化合物を、必要に応じて１つ以上のヘルパー脂質、必要に応じて上に記載された実施形態に係る１つ以上のペグ化脂質もしくは陽イオン性脂質（またはその許容可能な塩）、または本発明のリポソーム組成物とともに含む。本発明のこの態様によって包含されるキットは、さらに、本発明の組成物の１つ以上の特定の用途を行うために必要または有益な１つ以上のさらなる成分（例えば、試薬および化合物）を備え得る。いくつかの実施形態において、そのキットは、必要に応じて、本発明の脂質凝集物またはトランスフェクション複合体を保持するために適した１つ以上のマルチウェルプレートを備え得る。さらなる例において、それらのキットは、細胞の所望のトランスフェクションを行う際に有用な１つ以上の成分も備え得る。なおもさらなる例において、そのキットは、特定の疾患または身体的障害の診断、処置または予防を行う際に有用な１つ以上の成分（例えば、１つ以上のさらなる治療用の化合物または組成物、１つ以上の診断用試薬）も備え得る。通常、キットは、１つ以上の緩衝液、ポジティブまたはネガティブコントロールサンプル、担体または賦形剤など、１つ以上のさらなる本発明の組成物、１つ以上の指示書のセットなども備え得る。
生理活性物質（例えば、核酸、ＤＮＡおよびＲＮＡなど）をトランスフェクション複合体（すなわち、脂質凝集物−生理活性物質複合体）内に被包する方法が、いくつかの実施形態として提供される。そのような方法は、１つ以上のアミン含有トランスフェクション化合物（例えば、構造ＩおよびＩＩならびに式１〜８７に表されている化合物）、１つ以上のヘルパー脂質、１つ以上のペグ化脂質および必要に応じて１つ以上のトランスフェクションヘルパーまたは標的化部分を含む脂質凝集物を、下記の条件のうちのいずれか１つ以上において形成する工程を包含し得る。
ａ１）１つ以上のアミン含有トランスフェクション化合物、少なくとも１つのヘルパー脂質、必要に応じて２つ以上のヘルパー脂質および１つ以上のペグ化脂質またはそれらの塩をアルコール／水溶液中で混合する条件（そのアルコール濃度は＜５０％である）；
ａ２）１つ以上のアミン含有トランスフェクション化合物、少なくとも１つのヘルパー、必要に応じて２つ以上のヘルパー脂質および１つ以上のペグ化脂質またはそれらの塩を、１つ以上のアミン含有トランスフェクション化合物が１５％〜５０％で存在するようなモル濃度百分率において混合する条件；
ａ３）１つ以上のアミン含有トランスフェクション化合物、少なくとも１つのヘルパー脂質、必要に応じて２つ以上のヘルパー脂質および１つ以上のペグ化脂質またはそれらの塩を、ペグ化脂質が＜５０％で存在するようなモル濃度百分率において混合する条件；および
ａ４）１つ以上のアミン含有トランスフェクション化合物、少なくとも１つのヘルパー脂質、必要に応じて２つ以上のヘルパー脂質および１つ以上のペグ化脂質またはそれらの塩を混合する条件（そのペグ化脂質は、約２０００〜１２０００のポリエチレングリコール分子量およびＣ６−Ｃ２０アルキルまたはＣ１０−Ｃ２０アルケニルの脂肪酸鎖長を有する）；およびそのアルコール／水溶液中の脂質凝集物を生理活性物質と複合体化することにより、トランスフェクション複合体を形成する条件（そのアルコール濃度は＜５０％、好ましくは、４０％未満である）。いくつかの実施形態において、上記方法は、例えば、ａ１）およびａ２）、ａ２）およびａ３）、ａ１）およびａ３）、ａ２）およびａ４）、ａ３）およびａ４）、ａ１）およびａ４）またはａ１）〜ａ）４を包含する。いくつかの実施形態において、上記アルコールは、Ｃ１−Ｃ４アルコールである。いくつかの実施形態において、上記アルコールは、エタノールである。いくつかの実施形態において、上記アルコールは、薬学的に許容可能なアルコール（例えば、およそ室温において液体であるアルコール、例えば、エタノール、プロピレングリコール、２−（２−エトキシエトキシ）エタノール（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ（商標））、ベンジルアルコール、グリセロール、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００またはそれらの混合物）である。いくつかの実施形態において、混合するためのアルコールは、複合体化するためのアルコールと異なる。
本明細書中に記載される実施形態のトランスフェクション複合体は、インビボ投与のための以下の経路を介して、例えば、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、脳（心）室内、前立腺内（ｉｎｔｒａｐｒｏｓｔａｔｉｃａ）、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、子宮内、直腸内、局部的、腫瘍内、鞘内、筋肉内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍下（ｉｎｔｒａｕｍｂｉｌｉｃａｌ）、眼内、経口、局部的、局所的、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、持続注入、標的細胞を直接浸漬する局所的な灌流、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリームとして、または当業者に公知であろう他の方法もしくは前述の任意の組み合わせによって（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．１９９０）、投与され得る。
エキソビボまたはインビボにおいて使用するための投与量は、０．０１μｇ〜１ｇ／ｋｇ体重、０．１μｇ〜０．１ｇ／ｋｇ体重、１μｇ〜０．０１ｇ／ｋｇ体重、１０μｇ〜０．０１ｇ／ｋｇ体重、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であるか、または０．１ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ体重のいずれかの間およびそれらを含む範囲である。投与は、１日あたり、１週間あたり、１ヶ月間あたりまたは１年あたり１回またはそれ以上であり得る。投与は、ボーラスの形態であり得る。通常、本明細書中の実施形態のリポプレックスの有効量は、標的にされた遺伝子の発現を低下させるのに十分な量であり、標的細胞の表面において、１００ｐＭ〜１μＭまたは１ｎＭ〜１００ｎＭまたは２ｎＭ〜約２５ｎＭまたは約１０ｎＭまでの細胞外の濃度をもたらす。この局所的濃度を得るのに必要とされる量は、送達方法、送達部位、送達部位と標的細胞または標的組織との間の細胞層の数、送達が局所的であるかまたは全身性であるかなどをはじめとしたいくつかの因子に応じて変動する。送達部位における濃度は、それが標的細胞または標的組織の表面における濃度よりもかなり高い可能性がある。
インビボ投与のためのいくつかの実施形態において、トランスフェクション複合体は、０．５〜１ｍｇ／ｍｌという最終濃度で調製される。脂質凝集物と核酸との比は、標的にされる器官に応じて、約０．７：１〜１．３：１（ｖ：ｗ）である。当業者は、本明細書中の教示に鑑みて、インビボ投与のために、脂質凝集物と核酸との様々な比を試験することができる。例えば、５％グルコース中の１ｍｇ／ｍｌリポプレックスの場合、投与は、例えば、静脈内投与であり得、それにより、肺、腎臓、肝臓、腫瘍または脾臓が標的化される（５０〜２００μｌを用いる）か、腹腔内投与であり得、それにより、腫瘍または炎症が標的化される（１００ ｌを用いる）か、鼻腔内投与であり得、それにより、肺が標的化される（５０μｌを用いる）か、腫瘍内もしくは後眼窩（局所的）投与であり得、それにより、眼、腫瘍、膝関節もしくは耳が標的化される（１０〜１００μｌを用いる）か、脳内（局所的）投与であり得、それにより、脳が標的化される（０．５〜５μｌを用いる）か、鞘内投与であり得、それにより、脊髄が標的化される（１０μｌを用いる）か、または流体力学的投与であり得、それにより、肝臓、腎臓もしくはウイルスが標的化される（０．８〜２．５ｍｌを用いる）。
組織特異的（Ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）送達をスクリーニングするための方法
本明細書中に記載されるさらなる実施形態は、インビボにおける組織特異的送達のために、多数のトランスフェクション化合物をスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は、被験トランスフェクション化合物とともに、マーカーの検出を難なく容易にする化合物を含む複数のトランスフェクション複合体を調製する工程、その複数のトランスフェクション複合体の各々を被験動物に送達する工程、およびマーカーを検出する工程を包含し得る。
本明細書中に記載されるさらなる実施形態は、インビボにおける組織特異的送達のために、多数のトランスフェクション化合物をスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は、被験トランスフェクション化合物とともに、マーカーの検出を難なく容易にする化合物を含む複数のトランスフェクション複合体を調製する工程、その複数のトランスフェクション複合体の各々を被験動物に送達する工程、およびマーカーを検出する工程を包含し得る。
いくつかの実施形態において、トランスフェクション複合体の組織特異的送達をスクリーニングするための方法は、複数のトランスフェクション複合体（各トランスフェクション複合体は、組織への送達の検出を容易にする少なくとも１つの核酸とともに少なくとも１つの被験トランスフェクション化合物を有する）を調製する工程を包含し得る。その核酸は、直接検出され得るタンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼなど）をコードするかまたは直接検出され得るタンパク質の発現に影響するタンパク質をコードするＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子であり得る。
ある実施形態において、トランスフェクション複合体の組織特異的送達をスクリーニングするための方法は、複数の独特のトランスフェクション複合体（各トランスフェクション複合体は、緑色蛍光タンパク質をコードするｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとともに少なくとも１つの被験トランスフェクション化合物を有する）を調製する工程を包含し得る。独特のトランスフェクション複合体の各々は、マウスなどの被験動物の静脈内、皮下または組織に送達され得る。所定の時間が経過した後、そのマウスの組織が回収され得、様々な組織におけるＧＦＰの発現が、肉眼的検査、組織学的検査または分子検出（ＰＣＲ、ウエスタンブロッティングなど）によって検出されることにより、特定のトランスフェクション化合物を含むトランスフェクション複合体がどの組織に送達されたかが判定され得る。
ある実施形態において、トランスフェクション複合体の組織特異的送達をスクリーニングするための方法は、複数の独特のトランスフェクション複合体（各トランスフェクション複合体は、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとともに少なくとも１つの被験トランスフェクション化合物を有する）を調製する工程を包含し得る。独特のトランスフェクション複合体の各々は、マウスなどの被験動物の静脈内、皮下または組織に送達され得る。所定の時間が経過した後、そのマウスの組織が回収され得、様々な組織におけるルシフェラーゼの発現が、肉眼的検査、組織学的検査または分子検出（ＰＣＲ、ウエスタンブロッティングなど）によって検出され得るか、またはＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いてインビボで画像化され得る。
ある実施形態において、トランスフェクション複合体の組織特異的送達をスクリーニングするための方法は、複数の独特のトランスフェクション複合体（各トランスフェクション複合体は、特定の転写因子をコードするｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとともに少なくとも１つの被験トランスフェクション化合物を有する）を調製する工程を包含し得る。独特のトランスフェクション複合体の各々は、その特定の転写因子の支配下のレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）を発現するトランスジェニック動物の静脈内、皮下または組織に送達され得る。所定の時間が経過した後、そのトランスジェニック動物の組織が回収され得、様々な組織におけるレポーター遺伝子の発現が、肉眼的検査、組織学的検査または分子検出（ＰＣＲ、ウエスタンブロッティングなど）によって検出され得る。レポーター遺伝子がルシフェラーゼである場合、検出は、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いてインビボで行われ得る。
１つの非限定的な実施形態において、トランスフェクション複合体の組織特異的送達をスクリーニングするための方法は、複数の独特のトランスフェクション複合体（独特のトランスフェクション複合体の各々は、ＣｒｅリコンビナーゼをコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子とともに少なくとも１つの独特の被験トランスフェクション化合物を含む）を調製する工程を包含し得る。その複数の独特のトランスフェクション複合体はまた、必要に応じて、上に記載されたおよび本明細書中に組み込まれるような、１つ以上のトランスフェクションエンハンサー、１つ以上のヘルパー脂質、１つ以上のペグ化脂質または１つ以上の標的化部分も含み得る。その独特のトランスフェクション複合体の各々は、Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下においてレポーター遺伝子を発現するトランスジェニックマウスに、静脈内に（例えば、尾静脈注射によって）、皮下に、または組織内注射を介して、送達され得る。例示的な実施形態において、その独特のトランスフェクション複合体の各々は、ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ルシフェラーゼ遺伝子を有するトランスジェニックマウス、例えば、ホタルルシフェラーゼ遺伝子がＧｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ遺伝子座に挿入されている１２９Ｓ６（Ｂ６）−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６トランスジェニックマウス系統のいずれかに送達され得る。このトランスジェニック系統では、そのルシフェラーゼ遺伝子は、ルシフェラーゼ導入遺伝子とそのプロモーターの間に配置されたｌｏｘＰ隣接ＳＴＯＰ配列によって阻止されている。Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下では（すなわち、Ｃｒｅ−ｍＲＮＡまたはＤＮＡを含むトランスフェクション複合体が送達される組織では）、ＳＴＯＰ配列が切除されて、ルシフェラーゼが発現される。
どの組織においてＣｒｅルシフェラーゼが発現されているか（およびゆえに、独特の被験トランスフェクション化合物の各々がどの組織に優先的に送達されているか）を判定するために、ルシフェラーゼ導入遺伝子の発現が、遺伝子発現を評価するために広く使用されている当業者に公知の任意の手法（例えば、ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティングなど、またはルシフェラーゼ活性の直接的な測定）に従って、行われ得る。いくつかの好ましい実施形態において、切除された組織のホールマウント（ｔｒａｎｓｇｅｗｈｏｌｅ ｍｏｕｎｔ）または組織切片が、例えば、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｎ Ｖｉｖｏを用いて、調べられ得る。
ＩＩＩ．実施例
本発明はさらに、以下の実施例を考慮することによって明らかにされ得、その実施例は、純粋に本発明の例示であって、決してその範囲を限定しないと意図されている。
本発明はさらに、以下の実施例を考慮することによって明らかにされ得、その実施例は、純粋に本発明の例示であって、決してその範囲を限定しないと意図されている。
実施例１．２−ブロモ−Ｎ−ドデシルアセトアミドの合成
表題の中間体を、以下の一般的な反応スキームに従って合成した。
表題の中間体を、以下の一般的な反応スキームに従って合成した。
均圧の滴下漏斗を備えた丸底フラスコにおいて、２００ｍＬのジクロロメタンに、１．５ｇ（７．４３１ｍｍｏｌ，１．０５当量）の臭化ブロモアセチルを加え、その混合物を窒素下で撹拌した。そのフラスコを、氷浴を用いて約０℃に冷却した。１．３１ｇ（７．０７７ｍｍｏｌ）のドデシルアミン酸０．７１６（９８３μＬ，７．０７７ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを１００ｍＬのジクロロメタンに溶解した。この溶液を上記滴下漏斗に移し、臭化ブロモアセチル溶液をおよそ１時間以内でゆっくり加えた。その反応混合物を約０℃においてさらに約１時間撹拌し、氷を融解させることによって室温にゆっくり温めた。
得られた反応混合物を分液漏斗に移し、１００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で抽出した。水層を５０ｍＬのジクロロメタンで洗浄し、合わせた有機層を１００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。最後に、水層を１００ｍＬのジクロロメタンで洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過することにより硫酸ナトリウムを除去し、その混合物をロータリーエバポレーターにより濃縮して、約２．０２２ｇ（９３．３％収率）の純粋な生成物を得た。分子量計算値：３０５．１４，分子量実測値：３０６．２５。
実施例２．テトラデシル−２−ブロモアセテートの合成
表題の中間体を、以下の一般的な反応スキームに従って合成した。
表題の中間体を、以下の一般的な反応スキームに従って合成した。
３ｇ（１．３ｍＬ，１４．８６２ｍｍｏｌ，１．０５当量）の臭化ブロモアセチルを５０ｍＬのジクロロメタンに溶解した。そのフラスコを、氷浴を用いて約０℃に冷却した。３．０３ｇ（１４．１５４ｍｍｏｌ）のテトラデカノールを５０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、ピペットを介して上記混合物にゆっくり加えた後、約５滴の濃硫酸を加え、約０℃で約３０分間、次いで、室温で一晩撹拌した。
約１５０ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加え、直ちに約３０分間撹拌した。次いで、その混合物を分液漏斗に移し、有機層を回収する。水層を約１００ｍＬのジクロロメタンで洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮することにより、４．０９５ｇ（８９．７％収率）の生成物を得た。
質量ピークは観察されなかった。構造を確かめるために、試験反応物を以下のとおり準備した：４．６ｍｇ（０．０４３ｍｍｏｌ）のベンジルアミン、１７ｍｇ（２３μＬ，０．１３０ｍｍｏｌ，３当量）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよび２２ｍｇ（０．０６５ｍｍｏｌ，１．５当量）のテトラデシル−２−ブロモアセテートを１ｍＬのＤＭＦに溶解し、約１６０℃／２００Ｗのマイクロ波の中に１０分間置いた。得られた反応混合物をＬＣＭＳで解析した。分子量計算値：３６１．５６，分子量実測値：３６２．４２。
実施例３．ペンタデシル−４−ブロモブタノエートの合成
表題の中間体を、以下の一般的な反応スキームに従って合成した。
表題の中間体を、以下の一般的な反応スキームに従って合成した。
４−ブロモブチルクロリド（１当量）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、その反応フラスコを、氷浴を用いて約０℃に冷却した。上記の混合物に、ジクロロメタン（５０ｍＬ）中の１−ペンタデカノール（１当量）を、均圧の滴下漏斗を用いて約３０分間にわたってゆっくり加えた。得られた上記混合物に、触媒量（５滴）の濃硫酸を加えた。その反応混合物を約０℃で約３０分間撹拌し、次いで、室温で４時間撹拌した。その反応混合物を分液漏斗に移し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム（×３）、水（×２）、ブライン（×１）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮することにより、所望の生成物であるペンタデシル−４−ブロモブタノエートを無色の油状物として得た（８８％収率）。
質量ピークは観察されなかった。予想される生成物の構造を、試験反応物を介して確かめた：ベンジルアミン（１当量）、Ｎ−メチルモルホリン（１当量）、ペンタデシル−４−ブロモブタノエート（０．９当量）を、ＤＭＦ（１ｍＬ）が入った乾燥された厚肉のｐｙｒｅｘチューブに加えた。その反応混合物を、約１７０℃において約１０分間、マイクロ波照射（２００Ｗ）に曝露した。その照射の後、温度が約３０℃未満に低下するまで、その反応混合物をその装置内の内蔵のシステムに通して冷却した。得られた反応混合物をＬＣＭＳで解析した。分子量計算値：４０３．６４，分子量実測値：４０４．５０。
実施例４．テトラデシル２−［３−メチルアミノプロピル−（２−オキソ−２−テトラデコキシ−エチル）アミノ］アセテートの合成
表題の化合物を、以下の一般的な反応スキームに従って合成した。
表題の化合物を、以下の一般的な反応スキームに従って合成した。
２０ｍｇ（０．２２７ｍｍｏｌ）のＮ−メチルプロパン−１，３−ジアミン、上記の実施例２に記載されたように合成された１６０ｍｇ（０．４７７ｍｍｏｌ，２．１当量）のテトラデシル−２−ブロモアセテートおよび１７６ｍｇ（２３７μｌ，１．３６１ｍｍｏｌ，６当量）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを、１ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、一晩、約６０℃に加熱した。得られた混合物を分取ＨＰＬＣで精製した。表題化合物を含む画分を回収し、ＬＣＭＳで特徴付けた。分子量計算値：５９６．５５，分子量実測値：５９７．７６。
実施例５．（ａ）２−［２−［２−［２−［ビス［２−（ドデシルアミノ）−２−オキソ−エチル］アミノ］エチル−［２−（ドデシルアミノ）−２−オキソ−エチル］アミノ］エチルアミノ］エチル−［２−（ドデシルアミノ）−２−オキソ−エチル］アミノ］−Ｎ−ドデシル−アセトアミドおよび（ｂ）２−［２−［２−［２−［ビス［２−（ドデシルアミノ）−２−オキソ−エチル］アミノ］エチルアミノ］エチルアミノ］エチル−［２−（ドデシルアミノ）−２−オキソ−エチル］アミノ］−Ｎ−ドデシル−アセトアミドの合成
表題の２つの化合物の混合物を、４テイルの表題化合物（ａ）および５テイルの表題化合物（ｂ）を示している以下の一般的な反応スキームに従って合成した。
表題の２つの化合物の混合物を、４テイルの表題化合物（ａ）および５テイルの表題化合物（ｂ）を示している以下の一般的な反応スキームに従って合成した。
１４．６ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ'−ビス（２−アミノエチル）エタン−１，２−ジアミン、上記の実施例１に記載されたように得られた１５９ｍｇ（０．５２ｍｍｏｌ，５．２当量）の２−ブロモ−Ｎ−ドデシルアセトアミドおよび１２９ｍｇ（１７４μｌ，１ｍｍｏｌ，１０当量）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを１ｍｌのＤＭＦに溶解し、一晩、約６０℃に加熱する。得られた混合物を分取ＨＰＬＣで精製する。
２−［２−［２−［２−［ビス［２−（ドデシルアミノ）−２−オキソ−エチル］アミノ］エチルアミノ］エチルアミノ］エチル−［２−（ドデシルアミノ）−２−オキソ−エチル］アミノ］−Ｎ−ドデシル−アセトアミド（上に示された４テイルの化合物）および２−［２−［２−［２−［ビス［２−（ドデシルアミノ）−２−オキソ−エチル］アミノ］エチル−［２−（ドデシルアミノ）−２−オキソ−エチル］アミノ］エチルアミノ］エチル−［２−（ドデシルアミノ）−２−オキソ−エチル］アミノ］−Ｎ−ドデシル−アセトアミド（上に示された５テイルの化合物）を回収し、ＬＣＭＳで特徴付けた。
４テイルの化合物については：分子量計算値は、１０４６．９９であり、分子量実測値は、１０４８．２８だった。５テイルの化合物については：分子量計算値は、１２７２．２０であり、分子量実測値は、１２７３．５０だった。
実施例６．ペンタデシル−４−ブロモブタノエートの合成
表題の中間体を、以下の一般的な反応スキームに従って合成した。
表題の中間体を、以下の一般的な反応スキームに従って合成した。
４−ブロモブチルクロリド（１当量）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、その反応フラスコを、氷浴を用いて約０℃に冷却した。上記の混合物に、ジクロロメタン（５０ｍＬ）中の１−ペンタデカノール（１当量）を、均圧の滴下漏斗を用いて約３０分間にわたってゆっくり加えた。得られた上記混合物に、触媒量（５滴）の濃硫酸を加えた。その反応混合物を約０℃で約３０分間撹拌し、次いで、室温で４時間撹拌した。その反応混合物を分液漏斗に移し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム（×３）、水（×２）、ブライン（×１）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮することにより、所望の生成物であるペンタデシル−４−ブロモブタノエートを無色の油状物として得た（８８％収率）。
質量ピークは観察されなかった。予想される生成物の構造を、試験反応物を介して確かめた：ベンジルアミン（１当量）、Ｎ−メチルモルホリン（１当量）、ペンタデシル−４−ブロモブタノエート（０．９当量）を、ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）が入った乾燥された厚肉のｐｙｒｅｘチューブに加えた。その反応混合物を、１７０℃において１０分間、マイクロ波照射（２００Ｗ）に曝露した。その照射の後、温度が３０℃未満に低下するまで、その反応混合物をその装置内の内蔵のシステムに通して冷却した。得られた反応混合物をＬＣＭＳで解析した。分子量計算値：４０３．６４，分子量実測値：４０４．５０。
実施例７．４−ブロモ−Ｎ−ドデシルブタンアミドの合成
表題の中間体を、以下の一般的な反応スキームに従って合成した。
表題の中間体を、以下の一般的な反応スキームに従って合成した。
４−ブロモブタノイルクロリド（１．０５当量）を、均圧の滴下漏斗が取り付けられた、約０℃のジクロロメタン（２００ｍＬ）が入った丸底フラスコに加え、窒素下で撹拌した。ドデシルアミン（１当量）およびトリエチルアミン（１当量）を別々にジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解し、その混合物を上記滴下漏斗に移した。この混合物を、約６０分間にわたって丸底フラスコに非常にゆっくり加えた。添加が完了した後、その反応混合物を約０℃でさらに１５分間撹拌し、分液漏斗に移した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム（×３）、水（×２）およびブライン（×１）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮することにより、所望の生成物である４−ブロモ−Ｎ−ドデシルブタンアミドを白色固体として得た（８８．７％収率）。分子量計算値：３３３．１７，分子量実測値：３３４．３１。
実施例８．（ａ）ジペンタデシル４，４'−（３−（メチル（４−オキソ−４−（ペンタデシルオキシ）ブチル）アミノ）プロピルアザンジイル）ジブタノエートおよび（ｂ）ペンタデシル４−（メチル（３−（４−オキソ−４−（ペンタデシルオキシ）ブチルアミノ）プロピル）アミノ）ブタノエートの合成
表題の２つの化合物の混合物を、以下の一般的な反応スキームに従って合成した。
表題の２つの化合物の混合物を、以下の一般的な反応スキームに従って合成した。
小さな磁気撹拌棒が入ったマイクロ波反応合成用の乾燥容器に、Ｎ１−メチルプロパン−１，３−ジアミン（４２ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）、ペンタデシル−４−ブロモブタノエート（２．１当量）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．１当量）およびジメチルホルムアミド（１．０ｍＬ）を投入した。その容器を密閉し、反応混合物をＣＥＭマイクロ波合成装置において９０℃まで加熱した。約２０分後、その反応を停止し、容器を約４０℃に冷却した。粗反応物の分析ＬＣＭＳのトレースは、所望の生成物の形成を示した。その粗材料を分取ＬＣＭＳで精製した。
所望の生成物を含むすべての画分を慎重に選択し、プールした。各画分の溶媒を、元の体積の半分まで減圧下で乾燥して減少させた後、メタノール中の１Ｍ ＨＣｌ（１．０ｍＬ）を加えた。最後に、すべての溶媒を真空下で除去することにより、上記の反応スキームに示されている表題化合物（ａ）および（ｂ）の塩酸塩を白色固体として得た。
化合物（ａ）については：分子量計算値は、９７６．９１であり、分子量実測値は、９７７．９１だった。化合物（ｂ）については：分子量計算値は、６８０．６４であり、分子量実測値は、６８１．６４だった。
実施例９．インビボ送達用の脂質組成物の調製
本発明のいくつかの脂質を、コレステロール、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質、緩衝液およびエタノールも含む脂質組成物に製剤化した。動物起源非含有コレステロールを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（Ｃ１６ ＰＥＧ２０００ ＰＥ）および１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（Ｃ１４ ＰＥＧ２０００ ＰＥ）を、Ａｖａｎｔｉ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から購入した。ＲＮＡｉは、安定化化学修飾を伴った２５塩基対の二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを有するＳＴＥＡＬＴＨ（商標）ＲＮＡｉだった。ＳＴＥＡＬＴＨ（商標）ＲＮＡｉは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から商業的に入手可能である。
本発明のいくつかの脂質を、コレステロール、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質、緩衝液およびエタノールも含む脂質組成物に製剤化した。動物起源非含有コレステロールを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（Ｃ１６ ＰＥＧ２０００ ＰＥ）および１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（Ｃ１４ ＰＥＧ２０００ ＰＥ）を、Ａｖａｎｔｉ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から購入した。ＲＮＡｉは、安定化化学修飾を伴った２５塩基対の二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを有するＳＴＥＡＬＴＨ（商標）ＲＮＡｉだった。ＳＴＥＡＬＴＨ（商標）ＲＮＡｉは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から商業的に入手可能である。
乾燥粉末脂質を、エタノールに再懸濁し、陽イオン性脂質：コレステロールおよびＰＥＧ脂質を、それぞれ５２：２０：２８の重量比で混合した。その脂質エタノール混合物を、２００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．２溶液中において１：４比で非常に迅速に混合した。最終的な配合物（すなわち、合計すると本発明の脂質＋ＰＥＧ脂質＋コレステロール）を、０．２２μｍフィルターで滅菌濾過し、それは、５０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび２５％エタノール中において１５．６２５ｍｇ／ｍｌの濃度および５０〜８０ｎｍのサイズを有する（プレリポソーム）。生成された配合物を、表１に記載する。
（表１）脂質配合物
（表１）脂質配合物
水および２５％エタノール中で１．５ｍｇ／ｍｌに希釈された等体積のプレリポソームおよびＳＴＥＡＬＴＨ（商標）ＲＮＡｉ溶液を混合することによって、リポプレックス（ｓｉＲＮＡプレリポソーム複合体）を調製した。混合後、その複合体を約５０℃で約３０分間インキュベートした。インキュベート後、そのリポプレックスを、ＳＰＥＣＴＲＡ／ＰＯＲ（登録商標）ＦＬＯＡＴ−Ａ−ＬＹＺＥＲ（登録商標）Ｇ２ ８ＫＤａを用いて、１リットルのＰＢＳ１×ｐＨ７．４において約２時間透析した。透析後、体積を測定し、所望のｓｉＲＮＡ濃度にＰＢＳで調整した。そのリポプレックスを、インビボ尾静脈注射まで約４℃でインキュベートした。
４〜６週齢のマウスを使用した。アンチセンス配列
を有する第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）マウス遺伝子に対するＲＮＡｉおよびネガティブコントロールのＭｅｄｉｕｍ ＧＣ含有量−ＲＮＡｉを、先に記載したようなプレリポソームと複合体化し、インビボで試験した。マウス２０ｇあたり２００μｌのリポプレックス（ＰＢＳ中のＦＶＩＩまたはＣＴＲＬ ＲＮＡｉを含む）を、１０ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇの用量（ｓｉＲＮＡ用量）で低圧尾静脈注射によって注射した。尾静脈注射の３６時間後、肝臓組織および血清を、それぞれｍＲＮＡおよびタンパク質のノックダウン解析のために回収した。
凍結された肝臓組織を粉末に粉砕し、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）ＰＬＵＳ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出した。第１鎖（ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ）合成用の全ＲＮＡ（約７５０ｎｇ）を、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＩＩＩ ＲＴキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて測定し、ＥＸＰＲＥＳＳ ｑＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（ｃａｔ＃１１７８５−０１Ｋ）を使用するｔａｑｍａｎアッセイを用いてＱＰＣＲ解析を行った。
第ＶＩＩ因子血清タンパク質レベルを、以下のとおり測定した。ケタミン／キシラジン／アセプロマジン（それぞれ７５／５／１ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内注射することによって動物を麻酔し、後眼窩出血によって血液を回収し、血清を処理することにより、発色アッセイ（Ｂｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ，Ａｎｉａｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を製造者のプロトコルに従って使用して第ＶＩＩ因子タンパク質レベルを測定した。
図１は、発色アッセイで測定されたときの、肝臓における種々のリポプレックス配合物の、第ＶＩＩ因子タンパク質の残存（ｒｅｍａｉｎｇ）活性の相対％を要約しているグラフを提供している。ｘ軸に関して、番号は、表１に示されたような試験された陽イオン性脂質化合物を指す。このデータから、そのような配合物が、インビボにおいて活性を有することが証明される。ＣＴＲＬネガティブコントロールを肝臓に注射したとき、ノックダウンは観察されなかった。
図２は、２つのＴａｑｍａｎアッセイを用いてｑＲＴ−ＰＣＲで測定されたときの、第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡの相対％を要約しているグラフを提供している。図２に示されているバーの各対において、左側のバーは、Ｔａｑｍａｎ２９アッセイを指し、右側のバーは、Ｔａｑｍａｎ３３アッセイ（ａｓｓｙｓ）を指している。ｘ軸に沿った番号は、表１に示されたような試験された陽イオン性脂質化合物を指す。このデータから、そのような配合物が、インビボにおいて活性を有することが証明される。ＣＴＲＬネガティブコントロールを肝臓に注射したとき、ノックダウンは観察されなかった。
実施例１０．脂質組成物の調製
以下の実験セットを、以下の例外を伴って、本質的には実施例９において上に記載されたように行った。ｓｉＲＮＡ／リポプレックスの形成後に行われる透析工程は、行わなかった。さらに、ＩＶＦ２．０、５７ＮＯおよび８４ＮＯサンプルの乾燥粉末の重量比は、３７．８：１０．４：５１．８であり、５７ＯＰＴ、７２ＯＰＴおよび８４ＯＰＴサンプルの乾燥粉末の重量比は、６０：７：３３だった。生成された配合物を、表２に記載する。
（表２）脂質配合物
以下の実験セットを、以下の例外を伴って、本質的には実施例９において上に記載されたように行った。ｓｉＲＮＡ／リポプレックスの形成後に行われる透析工程は、行わなかった。さらに、ＩＶＦ２．０、５７ＮＯおよび８４ＮＯサンプルの乾燥粉末の重量比は、３７．８：１０．４：５１．８であり、５７ＯＰＴ、７２ＯＰＴおよび８４ＯＰＴサンプルの乾燥粉末の重量比は、６０：７：３３だった。生成された配合物を、表２に記載する。
（表２）脂質配合物
図３は、上に記載されたようなｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されたときの、第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡの相対％を要約しているグラフを提供している。結果は、正規化され、投与された投与量（ｍｇ／ｋｇ体重）に対する％残存ＦＶＩＩ発現（ｙ軸）として表されている。
実施例１１．インビトロ送達用の脂質組成物の調製
本発明のいくつかの脂質を、コレステロールまたはＤＯＰＥ、緩衝液およびエタノールも含む脂質組成物に製剤化した。動物起源非含有コレステロールを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、ＤＯＰＥをＡｖａｎｔｉ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から購入した。それぞれアンチセンス配列
を有する、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ ＣＳＮＫ２Ａ１ ｓｉＲＮＡおよびＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）ＳｅｌｅｃｔネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（ｃａｔ＃４３９０８２４ ｓｉＲＮＡ ｉｄ＃ｓ３６３７およびｃａｔ＃４３９０８４３）は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から商業的に入手可能であり、それらを、ヌクレアーゼ非含有水で５０μＭのストック濃度に再懸濁し、それを下流の実験に適うようにさらに希釈した。
本発明のいくつかの脂質を、コレステロールまたはＤＯＰＥ、緩衝液およびエタノールも含む脂質組成物に製剤化した。動物起源非含有コレステロールを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、ＤＯＰＥをＡｖａｎｔｉ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から購入した。それぞれアンチセンス配列
化合物８３および６７の場合は、乾燥粉末脂質を、１ｍｇ／ｍｌという最終濃度でエタノールに再懸濁し、脂質単独で使用したか（化合物８３）、またはコレステロールと１：０．５比で併用した（化合物６７）。試験された配合物を、表３に記載されるように生成した。
（表３）脂質配合物
（表３）脂質配合物
初代ラット皮質神経細胞を、ＧＩＢＣＯから購入し（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１０８４０）、２％Ｂ−２７（登録商標）Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ（５０×ｃａｔ＃１７５０４−０４４）および０．５ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（ｃａｔ＃３５０５０−０６１）が補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地（ｃａｔ＃２１１０３−０４９）中で維持した。初代ラット海馬神経細胞を、ＧＩＢＣＯから購入し（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１０８４１）、２％Ｂ−２７（登録商標）Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ（５０×ｃａｔ＃１７５０４−０４４）、０．５ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（ｃａｔ＃３５０５０−０６１）および２５μＭ Ｌ−グルタメート（Ｓｉｇｍａ ｃａｔ＃Ｇ−２８３４）が補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地（ｃａｔ＃２１１０３−０４９）中で維持した。Ｈｅｌａ細胞を、ＡＴＣＣから購入し（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２）、抗生物質を含まない１０％ウシ胎児血清，米国保証，加熱不活性化（ｃａｔ＃１００８２−１３９）が補充されたＤＭＥＭ，高グルコース，ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標），ピルベート（ｃａｔ＃１０５６９−０１０）中で維持した。
神経細胞を、トランスフェクションの２日前に、ポリ−ｄ−リジンがコーティングされた９６ウェルプレートに１０Ｋ細胞／ウェルでプレーティングした。Ｈｅｌａ細胞を、トランスフェクションの１日前に、９６ウェルプレートに２５Ｋ／ウェルでプレーティングした。ｓｉＲＮＡ（３ｐｍｏｌ）を、１．５ｍＬチューブにおいて３０ｎＭの最終濃度で２０μｌヌクレアーゼ非含有水に希釈した。各ｓｉＲＮＡに対してトランスフェクトされるすべてのウェルを網羅するマスターミックスを調製した。０．１５、０．３および／もしくは０．６μｌ／ウェル、またはコントロールとして０．３μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標） ＲＮＡｉＭＡＸをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ中に１０μｌ／ウェルという最終総体積でピペットで取ることによって、脂質希釈物を調製した。その脂質およびｓｉＲＮＡ複合体を、１０μｌの脂質混合物を２０μｌの希釈ｓｉＲＮＡに加えることによって調製した。その複合体を、ピペッティングすることにより混合し、室温で１０分間インキュベートした。１０分間のインキュベート後、次いで、３０μｌの複合体を、１５０μｌを含む９６ウェルプレートにおいて培養された、１２０μｌの増殖培地を含む予めプレーティングされていた細胞に加えた。２４時間後、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴ（商標）キット（ｃａｔ＃ＡＭ１７２８，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者のプロトコルに従って用いて細胞を回収した。細胞を溶解した後、逆転写（ＲＴ）反応物を調製し、続いて目的の標的遺伝子（ＣＳＮＫ２Ａ１（ヒトの場合、Ｈｓ００９５３５３６＿ｍ１またはラットの場合、Ｒｎ００５８７５８２＿ｍ１））に対するＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎアッセイを用いるリアルタイムＰＣＲを行い、真核生物１８ｓ ｒＲＮＡ（４３３３７６０Ｔ）を内在性コントロールとして使用した。
図４は、ＨｅＬａ細胞、ラット初代皮質神経細胞およびラット初代海馬神経細胞において化合物８３リポプレックス配合物のｑＰＣＲアッセイで測定されたときの、ネガティブコントロールに対して正規化されたＣＳＮＫ２Ａ１の残存活性の相対パーセントを要約しているグラフを表している。ｘ軸に関して、数字は、表３で要約された陽イオン性脂質配合物の各ウェルに対する最終体積を指す。
図５は、Ｈｅｌａ、初代皮質神経細胞および初代海馬神経細胞において化合物６７リポプレックス配合物のｑＰＣＲアッセイで測定されたときの、ネガティブコントロールに対して正規化されたＣＳＮＫ２Ａ１の残存活性の相対パーセントを要約しているグラフを提供している。ｘ軸に関して、数字は、表３に示されるような、試験された１ウェルあたりの陽イオン性脂質の最終体積を指す。このデータから、そのような配合物が、インビトロにおいて活性を有することが証明される。
上記の結果は、上に記載された配合物が、インビボにおいて動物の様々な器官に、ならびにインビトロにおいて培養された動物細胞およびヒト細胞に、ｓｉＲＮＡ分子を導入する際に有効であることを証明する。
実施例１２．インビボにおけるｍＲＮＡの送達および発現
トランスフェクション脂質の調製
陽イオン性脂質８７（上に示された）は、本明細書中に記載される方法に従ってＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡにおいて合成され；動物起源非含有コレステロールを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ＳｔＬｏｕｉｓ）から購入し、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（Ｃ１６ＰＥＧ））をＡｖａｎｔｉ Ｌｉｐｉｄｓ Ａｌａｂａｓｔｅｒから購入した。ＣＢ５４７、コレステロールおよびＣ１６ＰＥＧを、４０℃の１００％エタノール中で希釈した。次いで、その脂質混合物を、２７Ｇ針を備えた注射器を用いて、２０ｍｌ／分の流速で２００ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ５．２中で混合した。次いで、その配合物を４℃で貯蔵した。
トランスフェクション脂質の調製
陽イオン性脂質８７（上に示された）は、本明細書中に記載される方法に従ってＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡにおいて合成され；動物起源非含有コレステロールを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ＳｔＬｏｕｉｓ）から購入し、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（Ｃ１６ＰＥＧ））をＡｖａｎｔｉ Ｌｉｐｉｄｓ Ａｌａｂａｓｔｅｒから購入した。ＣＢ５４７、コレステロールおよびＣ１６ＰＥＧを、４０℃の１００％エタノール中で希釈した。次いで、その脂質混合物を、２７Ｇ針を備えた注射器を用いて、２０ｍｌ／分の流速で２００ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ５．２中で混合した。次いで、その配合物を４℃で貯蔵した。
ＣＲＥ ｍＲＮＡの調製
下に示される実験において使用されたＣＲＥに対するｃＤＮＡ配列は、以下のとおりだった。
下に示される実験において使用されたＣＲＥに対するｃＤＮＡ配列は、以下のとおりだった。
上記ｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドは、合成のものであり（ＧＥＮＥＡＲＴ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、それをプラスミドＤＮＡベクターにクローニングした。
精製されたプラスミドＤＮＡを、製造者のプロトコルに従ってＡｓｅＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ０５２６）で消化する。線状にされたＤＮＡを、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標） ＰＣＲ精製キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ３１０００１）を製造者のプロトコルに従って使用して精製し、精製水で溶出した。ＤＮＡ濃度をＵＶ吸光度によって測定した。Ｐｒｏｍｅｇａ ＲｉｂｏＭＡＸ（商標） Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ１３００）を使用して、製造者のプロトコルに従ってｍＲＮＡを合成した。各反応において、５〜１０μｇの線状ＤＮＡから、２００〜２５０μｇのｍＲＮＡが得られた。合成後、フェノール：クロロホルム抽出に続くエタノール沈殿を用いてｍＲＮＡを精製した。そのｍＲＮＡ生成物を、精製水に再懸濁し、濃度を測定した。ＳｃｒｉｐｔＣａｐ（商標） ｍ７Ｇ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ−ＳＣＣＥ０６２５）およびＳｃｒｉｐｔＣａｐ（商標） ２'−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ−ＳＣＭＴ０６２５）（両方ともＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ（商標）製）を使用して、そのｍＲＮＡをキャッピングした。キャッピングされたｍＲＮＡを、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｔａｉｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＰＡＰ５１０４Ｈ）を用いてポリアデニル化した。最終生成物を、フェノール：クロロホルム抽出に続く核酸沈殿によって再度精製する。精製されたｍＲＮＡを精製水に再懸濁し、濃度を測定する。濃度を、水で３ｍｇ／ｍｌに調整し、−８０℃で貯蔵した。
脂質８７およびＣｒｅ ｍＲＮＡを含むトランスフェクション複合体の調製
前の工程において合成されたｍＲＮＡの濃度を、２５％エタノールを含む水で０．３ｍｇ／ｍｌに調整した。等体積のプレリポソームおよびｍＲＮＡ溶液を混合することによって、リポプレックス（ｍＲＮＡプレリポソーム複合体）を調製した。混合後、その複合体を、５０℃で３０分間インキュベートし、次いで、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）Ｇ２ ８ｋＤａを用いて、１リットルのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ），ｐＨ７．４において２時間透析した。透析後、体積を測定し、所望のｍＲＮＡ濃度までＰＢＳで調整した。そのリポプレックスを、インビボ注射まで４℃で貯蔵した。
前の工程において合成されたｍＲＮＡの濃度を、２５％エタノールを含む水で０．３ｍｇ／ｍｌに調整した。等体積のプレリポソームおよびｍＲＮＡ溶液を混合することによって、リポプレックス（ｍＲＮＡプレリポソーム複合体）を調製した。混合後、その複合体を、５０℃で３０分間インキュベートし、次いで、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）Ｇ２ ８ｋＤａを用いて、１リットルのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ），ｐＨ７．４において２時間透析した。透析後、体積を測定し、所望のｍＲＮＡ濃度までＰＢＳで調整した。そのリポプレックスを、インビボ注射まで４℃で貯蔵した。
インビボフェクタミン（ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）−５４７ｍＲＮＡ複合体の静脈内注射
動物試験において用いたすべての手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたものであり、当てはまる地域、州および連邦の規制に一致していた。マウスをＪａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した（Ｂ６．１２９Ｓ４−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ３（ＣＡＧ−ｌｕｃ）Ｔｙｊ／Ｊ）。このマウスは、ＣＭＶプロモーターの支配下におけるｌｏｘＰ隣接終止コドンを有する、ＣＭＶによって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を有する。Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下において、このｌｏｘＰ部位は、組み換わることにより、その終止コドンを切り取り、それにより、ルシフェラーゼレポータータンパク質の翻訳が可能になる。
動物試験において用いたすべての手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたものであり、当てはまる地域、州および連邦の規制に一致していた。マウスをＪａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した（Ｂ６．１２９Ｓ４−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ３（ＣＡＧ−ｌｕｃ）Ｔｙｊ／Ｊ）。このマウスは、ＣＭＶプロモーターの支配下におけるｌｏｘＰ隣接終止コドンを有する、ＣＭＶによって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を有する。Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下において、このｌｏｘＰ部位は、組み換わることにより、その終止コドンを切り取り、それにより、ルシフェラーゼレポータータンパク質の翻訳が可能になる。
ｌａｃＺ実験のために、ｌａｃＺ遺伝子を有する４〜６週齢のマウス（Ｂ６．１２９Ｓ４−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１Ｓｏｒ／Ｊ）を購入した。ｌａｃＺの発現は、標準的な方法を用いるｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された。上に記載されたように調製された、ＰＢＳ中にｍＲＮＡ ＣＲＥを含む２００μｌのリポプレックスを、１．５ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇの用量（ｍＲＮＡ用量）で低圧尾静脈注射によって、マウス１匹あたり２回注射した。ルミネセンスの画像化のために、体重１ｋｇあたり１５０ｍｇのホタルルシフェラーゼ（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ ＡＧ，Ｓｔａａｄ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をマウスにｉ．ｐ．投与した。イソフルランガス（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）で麻酔した後、マウスをＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳイメージングステーション（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）に置き、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて画像化した。
図６Ａは、１．５ｍｇ／ｋｇ（左）、０．５ｍｇ／ｋｇ（中央）またはＰＢＳ（右）の、Ｃｒｅ ｍＲＮＡおよび脂質８７を含むトランスフェクション複合体で処置されたマウスの全身画像を示している。ルシフェラーゼ発現を、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳを用いて測定し、シグナルを定量化した。
図６Ｂは、図６Ａに示された処置された２匹のマウスの各々から解剖されたホールマウントの肺、心臓、脾臓および肝臓（記載のとおり）の器官を示している。ルシフェラーゼ発現を、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳにおいて測定した。ルシフェラーゼ発現は、肝臓および脾臓において検出された。ルシフェラーゼ発現は、ＰＢＳを注射されたマウスでは検出されなかった（図１）。
図７Ａ〜Ｆは、ｑＲＴ−ＰＣＲで測定されたＬａｃＺ遺伝子発現の解析を示しているグラフ表示である。Ｃｒｅ ｍＲＮＡおよび脂質８７を含むトランスフェクション複合体で処置されたマウスは、Ｃｔｓで測定されたとき、コントロールと比べて、脾臓（図７Ａの脾臓コントロールＨＭＢＳ発現と図７Ｂの脾臓ＬａｃＺ発現とを比較のこと）、肝臓（図７Ｃの肝臓コントロールＨＭＢＳ発現と図７Ｄの肝臓ＬａｃＺ発現とを比較のこと）においてｌａｃＺ遺伝子のかなり強い発現を示した。ｃＤＮＡ投入量を、ＨＭＢＳを用いて正規化した。ｌａｃＺの発現の増加は、腎臓では観察されなかった（図７Ｅおよび図７Ｆ）。
いくつかの実施形態だけしか、詳細に記載されず、上で例証されなかったが、当業者は、記載された実施形態の教示から逸脱することなく、その記載された実施形態において多くの改変が可能であることをはっきりと理解するだろう。そのような改変のすべてが、以下の請求項の範囲内に包含されると意図される。
Claims (15)
- 一般構造Ｉを有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩：
Ｘ１およびＸ２の各々は、Ｏ、Ｎ−ＡおよびＣ−Ａからなる群から独立して選択される部分であり、ここで、Ａは、水素およびＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖からなる群から選択され；
ＹおよびＺの各々は、Ｃ＝Ｏ、およびＣ＝Ｓからなる群から独立して選択される部分であり；
Ｒ１の各々が、それぞれ３〜２０個の炭素原子および０〜４個の二重結合を有する、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアルキル基とアルケニル基からなる群から独立して選択され；
Ｒ２の各々が、
それぞれ３〜２０個の炭素原子および０〜４個の二重結合を有する、置換または非置換の分枝状または非分枝状のアルキル基とアルケニル基、ならびに
水素（ただしｍ＝ｐ＝０である場合に限る。）
からなる群から独立して選択され；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の各々は、水素と、環式または非環式の置換または非置換の分枝状または非分枝状の脂肪族基からなる群から独立して選択される部分であり；
ｘは、２であり；
ｎは、１以上３以下の値を独立して有する整数であり；
ｍは、０以上２０以下の値を独立して有する整数であり；
ｐは、０または１の値を独立して有する整数であり；
Ｒ３は、
- Ｒ１およびＲ２の各々が、それぞれ８〜１８個の炭素原子および０〜２個の二重結合を有する、置換または非置換の非分枝状のアルキル基とアルケニル基からなる群から独立して選択される、請求項１記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
- 化合物１９、２０、２５、２８、２９、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４８、４９、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６４、６５、７２、７３、７６、７７、８０、８２、８３、８４、８５、および８６からなる群から選択される化合物またはその薬学的に許容可能な塩：
- 請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む、トランスフェクション複合体。
- 少なくとも１つのヘルパー脂質をさらに含む、請求項４記載のトランスフェクション複合体。
- 前記少なくとも１つのヘルパー脂質が、中性脂質および陽イオン性脂質からなる群から選択される、請求項５記載のトランスフェクション複合体。
- 前記少なくとも１つのヘルパー脂質が、コレステロール、３βＯＨ−ステロールおよびその誘導体、ホスファチジルコリン、ＢＭＯＰ（Ｎ−（２−ブロモエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（９−オクタデセニルオキシ）−プロパンアミニウムブロミド）、ＤＤＰＥＳ（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミド）、ＤＳＰＣ、ＣＴＡＢ：ＤＯＰＥ（臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＡＴＢ）とＤＯＰＥとの配合物）、ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＭＧ、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）、ＤＭＰＥ（ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＯＭＧ、ＤＭＡ、ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）、ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）、ＤＰＥＰＣ（ジパルミトイルエチルホスファチジルコリン）、ＤＯＤＡＣ（ジオレオイルジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジ−オレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミド）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−ｎ，ｎ，ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＤＡＢ（ジデシルメチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルスルフェート）、ＤＯＴＡＰ・Ｃｌ、ＤＣ−ｃｈｏｌ（３，β−Ｎ，（Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール）、ＤＯＳＰＡ（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アンモニウムトリフルオロアセテート）、ＤＣ−６−１４（Ｏ，Ｏ'−ジテトラデカノイル−Ｎ−（アルファトリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド）、ＤＣＰＥ（ジカプロイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＬＲＩＥ（ジラウリルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン）、エチル−ＰＣ、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミドエチル］−Ｎ，Ｎ−ジ−メチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン）、ＤＭＲＩＥ（Ｎ−［１−（２，３ジミリスチルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド）、ＤＯＥＰＣ（ジオレオイルエチル−ホスホコリン）、ＤＯＨＭＥ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ−［１−（２−ヒドロキシエチル）］−Ｎ，Ｎジメチルアンモニウムヨージド）、ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ（Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ドデシルオキシ）−１−プロパンイミニウムブロミド／ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（３−リシル（１−グリセロール））・Ｃｌ）、Ｎ−ラウロイルサルコシン、（Ｒ）−（＋）−リモネン、レシチン類（およびそれらの誘導体）；ホスホチジルエタノールアミン（およびその誘導体）；ホスファチジルエタノールアミン類、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰＰＥジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、Ｏ−Ｃｈｏｌ（３ベータ［１−オルニチンアミドカルバモイル］コレステロール）、ＰＯＰＥ（パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン）およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン；ホスホチジルコリン；ホスファチジルコリン類、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）およびジステアロイルホスファチジルコリン；ホスファチジルグリセロール；ピペラジンベースの陽イオン性脂質、ホスファチジルグリセロール類、例えば、ＤＯＰＧ（ジオレオイルホスファチジルグリセロール）、ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）およびジステアロイルホスファチジルグリセロール；ホスファチジルセリン（およびその誘導体）；ホスファチジルセリン類、例えば、ジオレオイル−またはジパルミトイルホスファチジルセリン；ジ第四級アンモニウム塩、例えば、Ｎ，Ｎ'−ジオレイル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−１，２−エタンジアミン（ＴｍｅｄＥｃｅ）、Ｎ，Ｎ'−ジオレイル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−１，３−プロパンジアミン（ＰｒｏｐＥｃｅ）、Ｎ，Ｎ'−ジオレイル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−１，６−ヘキサンジアミン（ＨｅｘＥｃｅ）およびそれらの対応するＮ，Ｎ'−ジセチル飽和アナログ（ＴｍｅｄＡｃｅ、ＰｒｏｐＡｃｅおよびＨｅｘＡｃｅ）、ジホスファチジルグリセロール類；脂肪酸エステル類；一価陽イオン性トランスフェクション脂質、例えば、１−デオキシ−１−［ジヘキサデシル（メチル）アンモニオ］−Ｄ−キシリトール；１−デオキシ−１−［メチル（ジテトラデシル）アンモニオ］−Ｄアラビニトール；１−デオキシ−１−［ジヘキサデシル（メチル）アンモニオ］−Ｄ−アラビニトール；１−デオキシ−１−［メチル（ジオクタデシル）アンモニオ］−Ｄアラビニトール、グリセロールエステル類；スフィンゴ脂質；カルジオリピン；セレブロシド類；およびセラミド類；ならびにそれらの混合物からなるリストから選択される、請求項５記載のトランスフェクション複合体。
- 少なくとも１つのペグ化脂質をさらに含む、請求項４記載のトランスフェクション複合体。
- 少なくとも１つの生理活性物質をさらに含む、請求項４記載のトランスフェクション複合体。
- 前記少なくとも１つの生理活性物質が、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質、および薬物からなる群から選択される、請求項９記載のトランスフェクション複合体。
- 前記ＲＮＡ分子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡからなる群から選択される、請求項１０記載のトランスフェクション複合体。
- 前記少なくとも１つの生理活性物質が、ｓｉＲＮＡ分子である、請求項９記載のトランスフェクション複合体。
- 前記少なくとも１つの生理活性物質が、ｍＲＮＡ分子である、請求項９記載のトランスフェクション複合体。
- 前記少なくとも１つの生理活性物質が、ＤＮＡ分子である、請求項９記載のトランスフェクション複合体。
- 請求項３記載の化合物のうちの少なくとも１つの化合物；
その薬学的に許容される塩；
少なくとも１つのヘルパー脂質；
ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、およびタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つの生理活性物質；ならびに
任意で少なくとも１つのペグ化脂質
を含むトランスフェクション複合体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022141466A JP7512335B2 (ja) | 2010-11-15 | 2022-09-06 | アミン含有トランスフェクション試薬ならびにそれを生成および使用するための方法 |
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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