CN118434450A - 缀合物、含有该缀合物的药物组合物及制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种缀合物，所述缀合物包含一个或多个递送基团和一个或多个诊断剂基团，每个所述递送基团独立地与所述诊断剂基团经共价键连接，或通过连接基团连接，所述递送基团由一种适配体去除一个或多个氢原子或一个或多个官能团形成，所述适配体包含连续的核苷酸序列，所述连续的核苷酸序列具有式(1)所示的序列。本公开提供的缀合物可以高效的将诊断剂基团靶向递送至肿瘤组织，从而有效地对肿瘤及肿瘤相关疾病进行诊断。

Description

缀合物、含有该缀合物的药物组合物及制备方法和用途 技术领域

本公开涉及一种能够特异性靶向体内肿瘤组织和细胞的缀合物，以及含有该缀合物的药物组合物和试剂盒。本公开还涉及这些缀合物与药物组合物的制备方法和用途。

背景技术

肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物。其中，肿瘤细胞发生转移与侵入周遭组织的情形，称为恶性肿瘤。按照生成肿瘤的来源组织细胞分类，一般分为上皮细胞产生的恶性肿瘤(癌症)、间叶组织细胞产生的恶性肿瘤(肉瘤)、血液干细胞产生的恶性肿瘤(白血病等)、以及神经胶质细胞产生的恶性肿瘤(胶质瘤)等。其中，胶质瘤是最常见的颅内原发性恶性肿瘤，约占脑肿瘤的40％-50％，全球年发病率为每10万人3-8例。按照WHO病理分型标准，胶质瘤属于神经上皮肿瘤，包括多种病理类型，包括但不限于毛细胞性星形细胞瘤、弥漫星形细胞瘤、间变星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、少突胶质细胞瘤、间变型少突胶质细胞瘤等。

目前，本领域中对肿瘤、特别是胶质瘤的诊断和治疗的重要问题之一是如何将诊断剂特异性地递送至肿瘤组织和细胞内，并在合适的时间、以合适的方式使这些诊断剂产生相应的诊断作用。

适配体或称核酸适体，是一种能够与多种的目标分子，像小分子化合物、蛋白质、核酸，甚至细胞、组织与器官等等结合的寡核苷酸分子。适配体能够提供“对特定分子辨识”这一重要特性，因此与抗体类似地常应用于生物技术与治疗等方面。适配体可以在试管中设计、并能够快速的利用化学方法合成、同时具有易于保存、免疫原性较低或无免疫原性的优异性质，因此近年来逐渐得到本领域研究人员的重视。然而，适合用于肿瘤靶向递送的适配体在本领域中仍需要进一步开发与应用。

发明内容

本公开的发明人意外发现了一种能够特异性靶向肿瘤细胞、特别是胶质瘤细胞的缀合物，包含基于适配体的递送基团和诊断剂基团。本公 开提供的缀合物能够有效将适合用于各类肿瘤的诊断剂递送至肿瘤细胞、特别是胶质瘤组织和/或细胞，显示出优异的诊断效果，从而，发明人作出如下发明：

在一方面，本公开提供了一种缀合物，包含一个或多个递送基团和一个或多个诊断剂基团，每个所述递送基团独立地与所述诊断剂基团经共价键连接，或通过连接基团连接；

其中，所述递送基团由一种适配体去除一个或多个氢原子或一个或多个官能团形成，所述适配体包含一段连续的核苷酸序列，连接相邻的两个核苷酸的基团独立地为磷酸酯基或者具有修饰基团的磷酸酯基，每个核苷酸选自修饰或未修饰A、U、C或G中的一种，所述连续的核苷酸序列具有式(1)所示的序列：

5'-T₁-S₁-N_a-S₂-N_b-S₃-N_c-S₄-T₂-3' 式(1)

其中，T₁是由1-3个核苷酸组成的基序，T₂是由0-15个核苷酸组成的基序，并且T₂中不包含与T₁完全反向互补的基序；

S₁和S₄各自是由3-7个核苷酸组成的基序，S₁与S₄长度相同并且完全反向互补；

N_a和N_c各自是由1-4个核苷酸组成的基序，N_a中的每个核苷酸与N_c中的每个核苷酸均不互补，并且N_a和N_c中U的总个数占N_a和N_c中全部核苷酸总个数的50％以上；

S₂和S₃各自是由1-4个核苷酸组成的基序，S₂与S₃长度相同并且完全反向互补；

N_b是由3-6个核苷酸组成的基序，并且N_b两端的核苷酸之间不形成AU或GC互补。

在另一方面，本公开还提供了一种药物组合物，包含本公开所述的缀合物，以及药学上可接受的载体。

在又一方面，本公开还提供了本公开所述的缀合物和/或药物组合物在制备用于对肿瘤及肿瘤相关疾病进行诊断的药物中的应用。

在又一方面，本公开还提供了一种对肿瘤及肿瘤相关疾病进行诊断的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予有效量的本公开所述的缀合物和/或药物组合物。

在又一方面，本公开还提供了一种试剂盒，包括本公开所述的缀合物和/或药物组合物。

以引用的方式并入

本说明书中提及的所有出版物、专利以及专利申请均以引用的方式并入本公开，其程度与每一单独的出版物、专利或专利申请均专门并且单独地以引用的方式并入本公开的程度相同。

有益效果

本公开提供的缀合物和药物组合物具有优异的靶向肿瘤、特别是胶质瘤组织和细胞的能力，本公开提供的缀合物能够显著提高肿瘤及肿瘤相关疾病的诊断准确性，进而为相关疾病的治疗提供有效帮助。

在一方面，本公开提供的缀合物能够在体外高效、特异性地进入肿瘤细胞。例如，与随机序列的对比缀合物相比，本公开提供的缀合物在U118MG胶质瘤细胞中均显示出显著更高的平均荧光强度，R值基本保持在2以上，表明本公开提供的缀合物具有优异的进入U118MG胶质瘤细胞的能力。又例如，本公开提供的缀合物具有很强的进入U118MG胶质瘤细胞、U251人胶质瘤细胞、A549人非小细胞肺癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞等各种癌细胞的能力，同时基本不进入正常细胞如SVGp12正常星形胶质细胞和293T人肾上皮细胞。又例如，与对比AP10相比，本公开提供的缀合物具有很强的进入U118MG和A549肿瘤球内部的能力。又例如，不同长度和序列的缀合物均能够有效靶向对U118MG胶质瘤组织。

在另一方面，本公开提供的缀合物能够将其上缀合的各种诊断剂基团，如不同荧光基团递送至肿瘤组织。例如，本公开提供的不同缀合物在小鼠体内接种肿瘤处均能显示出强烈的荧光信号，表明本公开提供的缀合物能够特异性地靶向U118MG胶质瘤；进一步地，本公开提供的缀合物在给药后24h至48h时仍显示出较强的荧光信号，表明在较长时间内均能够稳定靶向胶质瘤组织。又例如，本公开提供的缀合物在尾静脉给药时仍能到达并靶向脑胶质瘤，暗示本公开中的缀合物还具有穿透血脑屏障(Blood-Brain-Barrier，BBB)、并将诊断剂基团跨血脑屏障递送至脑胶质 瘤的优异能力。又例如，具有各种不同核酸序列修饰的缀合物均能够稳定靶向U118MG胶质瘤、A549人非小细胞肺癌肿瘤和PAN02胰腺癌肿瘤细胞，显示出广泛的特异性靶向肿瘤的能力。又例如，本公开提供的缀合物能够将不同的诊断剂基团(例如不同荧光基团Cy3或Cy5)高效、特异性地递送至U118MG胶质瘤，并且能在较长时间内保持稳定。又例如，经由激光共聚焦显微镜的观察，结果表明本公开提供的缀合物能够将诊断剂基团高效、特异性地递送进入U118MG胶质瘤的肿瘤细胞内部，显示出优异的靶向效果和潜在的诊断能力。

进一步地，本公开的发明人意外地发现，本公开提供的缀合物和/或药物组合物能够高效地通过血脑屏障，在全身给药的情况下就能够靶向至脑内的胶质瘤中，从而进一步提高诊断剂基团的递送效率、节省成本并降低不期望的副反应。

由此说明，本公开提供的缀合物具有优异的靶向肿瘤、特别是胶质瘤组织和细胞的能力，能够显著提高肿瘤的诊断成功率，具有良好的应用前景。

附图说明

图1A和图1B分别是示出了AP1和对比AP10进入U118MG胶质瘤细胞和SVGp12正常星形胶质细胞的高内涵成像图。

图1C-1G依次分别是示出了AP1和对比AP10进入U251人胶质瘤细胞、A549人非小细胞肺癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞和293T人肾上皮细胞高内涵成像图。

图2A和2B依次分别是示出了AP1和对比AP10进入U118MG胶质瘤肿瘤球和A549人非小细胞肺癌肿瘤球的高内涵成像图。

图3A-3D依次分别是示出了给药后1h、4h、24h和48h时，给予不同缀合物后的U118MG皮下瘤模型小鼠活体成像及肿瘤组织成像的图。

图4A和4B分别是示出了给药后24h和48h时，给予不同缀合物后建立U118MG原位瘤模型小鼠脑组织的荧光成像图。

图5A-5E分别是示出了给予不同的本公开提供的缀合物以及对比缀合物后，不同时间点的小鼠体内荧光成像图；图5F-5H分别是不同时间点的肿瘤组织成像图。

图6是示出了在给予缀合物后1h时，各组中1只小鼠的脏器荧光影像的图。

图7是示出了给予本公开提供的缀合物后，建立PAN02皮下瘤模型的小鼠中各器官组织的荧光成像的图。

图8A-8E分别是示出了给药后不同时间时，给予本公开提供的缀合物的小鼠的脏器荧光影像的图。

图9是示出了给予缀合物后D9时，各组小鼠的肿瘤荧光影像的图。

图10A-10C依次分别是示出了给予不同缀合物后1h、24h和48h时，小鼠体内的荧光成像结果图。图10D是示出了D5时处死小鼠后，各组小鼠肿瘤组织和肾脏的荧光信号成像的图。

图11A-11C依次分别是示出了给予不同缀合物后1h、24h和48h时，小鼠体内的荧光成像结果的图。图11D是示出了D6时处死小鼠后，各组小鼠肿瘤组织和肾脏的荧光信号成像的图。

图12是示出了向皮下接种U118MG胶质瘤的小鼠给予不同缀合物后24h时，U118MG胶质瘤细胞的激光共聚焦成像结果的图。

具体实施方式

以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

定义

本公开中，如无特别说明，A、U、C、G和T分别指腺嘌呤核苷酸、尿嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸和胸腺嘧啶核苷酸，2-甲基胞嘧啶核苷酸指胞嘧啶核苷酸中的胞嘧啶碱基上2'位的氢被甲基取代得到的核苷酸。这些核苷酸的结构为本领域技术人员所公知。

如本公开所使用的，“核酸基序”或“基序”是指适配体中的核酸序列片段，由1个或多个核苷酸组成。在一些实施方式中，基序是具有生物学功能的核酸序列片段。

如本公开所使用的，“烷基”是指具有指定数量的碳原子的直链和支链饱和烃基，所述数量通常为1至20个碳原子，例如1至10个碳原子， 如1至8个或1至6个碳原子。例如，C₁-C₆烷基指包含1至6个碳原子的直链和支链烷基。当提及具有特定数量的碳的烷基残基时，旨在涵盖具有该数量的碳的所有支链和直链形式；因此，例如，“丁基”意味着包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基；“丙基”包括正丙基和异丙基。亚烷基是烷基的子集，指与烷基相同、但具有两个连接点的残基。

如本公开所使用的，“烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳双键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去一分子氢而获得的。该基团可以处于双键的顺式或反式构型。典型的烯基基团包括但不限于：乙烯基；丙烯基，如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、丙-2-烯-2-基；丁烯基，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基等等。在某些实施方式中，烯基基团具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10个、2至8个或2至6个碳原子。亚烯基是烯基的一个子集，指与烯基相同、但具有两个连接点的残基。

如本公开所使用的，“炔基”是指具有一个或多个碳-碳三键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳三键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去两分子氢而获得的。典型的炔基基团包括但不限于：乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基，丙-2-炔-1-基；丁炔基，例如丁-1-炔-1-基，丁-1-炔-3-基，丁-3-炔-1-基等。在某些实施方式中，炔基具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10、2至8或2至6个碳原子。亚炔基是炔基的一个子集，指的是与炔基相同、但有两个连接点的残基。

如本公开所使用的，“杂环基”是指稳定的3-至18-元非芳香族环基，包含2-12个碳原子和1-6个杂原子，所述杂原子选自氮、氧和硫。除非说明书中另有说明，杂环基是单环、双环、三环或四环系统，可包括稠环或桥环系统。杂环基中的杂原子可以是被氧化的杂原子。一个或多个氮原子(如果存在的话)可以是季铵化的氮原子。杂环基是部分饱和或完全饱和的。杂环基可以通过任何环原子连接至分子的其余部分。此类杂环基的实例包括但不限于：二噁烷基、噻吩基[1,3]二硫酰基(thienyl[1,3]dithianyl)、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷 基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧杂哌嗪基、2-氧杂哌啶基、2-氧杂吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三硫酰基(trithianyl)、四氢吡喃基、硫代吗啉基(thiomorpholinyl)、硫杂吗啉基(thiamorpholinyl)、1-氧代硫吗啉基(1-oxo-thiomorpholinyl)和1,1-二氧代硫吗啉基(1,1-dioxo-thiomorpholinyl)。亚杂环基是杂环基的一个子集，指与杂环基相同、但具有两个附着点的残基。

如本公开所使用的，“芳基”是指通过从环碳原子中除去氢原子而衍生自芳香族单环或多环烃环系统形成的基团。所述芳香族单环或多环烃环系统仅含有氢和6至18个碳原子的碳，其中所述环系统中的一个或多个环是完全不饱和的，即，包含根据Hückel理论的环状、离域的(4n+2)π-电子体系。芳基包括但不限于苯基、芴基和萘基等基团。亚芳基是芳基的子集，指与芳基相同、但具有两个连接点的残基。

“杂芳基”指由3-至18-元芳香环自由基衍生而成的基团，包含2个至17个碳原子和选自氮、氧和硫的1至6个杂原子。如本公开所使用的，杂芳基可以是单环、双环、三环或四环系统，其中环系统中的一个或多个环是完全不饱和的，即，包含根据Hückel理论的环状离域(4n+2)π-电子体系。杂芳基包括稠环或桥环系统。杂芳基中的杂原子可以是被氧化的杂原子。一个或多个氮原子(如果存在的话)可以是季铵化的氮原子。杂芳基通过任何环原子附着至分子的其余部分。杂芳基的实例包括但不限于：氮杂环庚三烯基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、1,3-苯并二噁唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并[d]噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二噁庚英基(benzo[b][1,4]dioxepinyl)、苯并[b][1,4]噁嗪基(benzo[b][1,4]oxazinyl)、1,4-苯并二噁烷基(1,4-benzodioxanyl)、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、苯并二噁英基(benzodioxinyl)、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基、苯并噻吩并[3,2-d]嘧啶基、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基(cinnolinyl)、环戊烷并[d]嘧啶基、6,7-二氢-5H-环戊烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6-二氢苯并[h]喹唑啉基(5,6-dihydrobenzo[h]quinazolinyl)、5,6-二氢苯并[h]噌啉基 (5,6dihydrobenzo[h]cinnolinyl)、6,7-二氢-5H-苯并[6,7]环庚烷并[1,2-c]哒嗪基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、呋喃并[3,2-c]吡啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]嘧啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]哒嗪基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]吡啶基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基(indazolyl)、吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、异喹啉基、吲哚嗪基(indolizinyl)、异噁唑基、5,8-甲醇-5,6,7,8-四氢喹唑啉基(5,8-methano-5,6,7,8-tetrahydroquinazolinyl)、萘啶基(naphthyridinyl)、1,6-萘啶酮基(1,6-naphthyridinonyl)、噁二唑基、2-氧杂吖庚因基(2-oxoazepinyl)、噁唑基、氧杂环丙烷基(oxiranyl)、5,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢苯并[H]喹唑啉基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基(phthalazinyl)、蝶啶基(pteridinyl)、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡唑并[3,4-d]嘧啶基、吡啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯基、喹唑啉基、喹喔啉基(quinoxalinyl)、喹啉基、四氢喹啉基、5,6,7,8-四氢喹唑啉基、5,6,7,8-四氢苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、6,7,8,9-四氢-5H-环庚烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6,7,8-四氢吡啶并[4,5-c]哒嗪基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基、噻吩并[2,3-d]嘧啶基、噻吩并[3,2-d]嘧啶基、噻吩并[2,3-c]吡啶基(thieno[2,3-c]pridinyl)和噻吩基(thiophenyl/thienyl)。亚杂芳基是杂芳基的子集，指与杂芳基相同、但具有两个连接点的残基。

本公开提供的缀合物

在一方面，本公开提供了一种缀合物，包含一个或多个递送基团和一个或多个诊断剂基团，每个所述递送基团独立地与所述诊断剂基团经共价键连接，或通过连接基团连接。通过包含递送基团和诊断剂基团，本公开提供的缀合物能够将诊断剂基团高效且特异性地靶向递送至肿瘤，从而对肿瘤或肿瘤相关疾病进行准确高效的诊断。

本公开提供的缀合物中，递送基团由一种适配体去除一个或多个氢原子或一个或多个官能团形成，所述适配体包含一段连续的核苷酸序列，连接相邻的两个核苷酸的基团独立地为磷酸酯基或者具有修饰基团的磷酸酯基，每个核苷酸选自修饰或未修饰A、U、C或G中的一种，所述连 续的核苷酸序列具有式(1)所示的序列： 5'-T₁-S₁-N_a-S₂-N_b-S₃-N_c-S₄-T₂-3' 式(1)

其中，T₁是由1-3个核苷酸组成的基序。发明人发现，T₁的存在能够使得本公开提供的缀合物显示出高的肿瘤靶向作用。在一些实施方式中，T₁由2个核苷酸组成，此时，本公开提供的缀合物具有更优异的肿瘤靶向能力。在一些实施方式中，T₁由2个核苷酸组成并且含有至少一个C。在一些实施方式中，按照5'-3'方向，T₁为CU、UC或AC。

T₂是由0-15个核苷酸组成的基序。发明人发现，具有这些核苷酸数量和各种核苷酸序列的T₂均不会显著影响本公开提供的缀合物的肿瘤靶向能力。在一些实施方式中，T₂由0-10个核苷酸组成。在一些实施方式中，按照5'-3'方向，T₂由U起始的1-9个核苷酸组成，此时，本公开提供的缀合物可能具有更优异的稳定性。

T₂中不包含与T₁完全反向互补的基序。在本公开的上下文中，“反向互补”是指两段核苷酸序列或基序之间，按照核酸碱基配对的规律形成氢键连接，并且一段核苷酸序列或基序按照5'-3'方向的每一个核苷酸依次与另一端核苷酸序列或基序按照3'-5'方向的每一个核苷酸能够形成碱基配对。在一些实施方式中，“反向互补”包括AU、GC和UG互补中的一种或多种。

S₁和S₄各自是由3-7个核苷酸组成的基序，且S₁与S₄长度相同并且完全反向互补。具有上述S₁和S₄基序的本公开提供的缀合物具有较优的稳定性，能够较长时间地靶向肿瘤组织和细胞。在一些实施方式中，S₁和S₄各自由3-5个核苷酸组成且长度相同。在一些实施方式中，S₁和S₄形成的反向互补中，GC互补占全部互补数量的50％以上，此时，本公开提供的缀合物具有进一步更优的稳定性和肿瘤靶向能力。在一些实施方式中，按照5'-3'方向，S₁为GCU且S₄为AGC，或S₁为GAGU且S₄为GCUC，或S₁为GGAGU且S₄为GCUCU，或S₁为UAUGG且S₄为CCAUG。

N_a和N_c各自是由1-4个核苷酸组成的基序，N_a中的每个核苷酸与N_c中的每个核苷酸均不互补，并且N_a和N_c中U的总个数占N_a和N_c中 全部核苷酸总个数的50％以上。具有上述N_a和N_c基序的适配体显示出优异的肿瘤组织靶向能力。在一些实施方式中，N_a和N_c中核苷酸的数量之和为2-4的整数。在一些实施方式中，N_a和N_c中核苷酸的数量之和为3或4，并且所述N_a和N_c中U的数量之和为2或3。在一些实施方式中，按照5'-3'方向，N_a和/或N_c为U、UU、UC或CU。

S₂和S₃各自是由1-4个核苷酸组成的基序，S₂与S₃长度相同并且完全反向互补。通过包含S₂和S₃基序，本公开提供的缀合物显示出好的稳定性和优异的肿瘤靶向能力。在一些实施方式中，S₂和S₃各自由2-3个核苷酸组成且长度相同。在一些实施方式中，S₂和S₃形成的反向互补中至少包含一个GC互补，此时该反向互补具有更好的稳定性。在一些实施方式中，按照5'-3'方向，S₂为CA且S₃为UG，或S₂为AC且S₃为GU，或S₂为GCC且S₃为GGU。

N_b是由3-6个核苷酸组成的基序，并且N_b两端的核苷酸不互补。不受理论限制地，具有上述N_b基序的递送基团能够在空间方面保持特定构型，从而使本公开提供的缀合物稳定、高效地靶向肿瘤组织和细胞。在一些实施方式中，N_b由4-5个核苷酸组成。在一些实施方式中，按照5'-3'方向，N_b为GACG、GACGU、GACCG、UACU、GUUG或GAUCU。

本公开的发明人意外地发现，包含上述式(1)所示序列的适配体能够有效地靶向肿瘤、特别是胶质瘤组织，从而使得本公开提供的缀合物中的递送基团能够将对肿瘤具有诊断效果的诊断剂基团递送至肿瘤，从而上更有效地递送诊断剂基团。

在一些实施方式中，本公开提供的缀合物中，所述连续的核苷酸序列的长度为18-50个核苷酸，或者20-40个核苷酸，或者21-36个核苷酸，或者24-32个核苷酸。具有这些连续的核苷酸序列长度的适配体形成的递送基团能够更容易地靶向至肿瘤，并且在合成成本和靶向效果方面具有良好的平衡。

在一些实施方式中，本公开提供的缀合物中，连续的核苷酸序列具有以下SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的序列： 5'-CUGCUUCAGACGUGUUAGCUU-3'(SEQ ID NO:1)

其中，按照5'-3'方向，T₁为CU，S₁为GCU，N_a为U，S₂为CA，N_b为GACG，S₃为UG，N_c为UU，S₄为AGC，T₂为UU；

5'-CUGAGUUCAGACGUGUUGCUCU-3'(SEQ ID NO:2)

其中，按照5'-3'方向，T₁为CU，S₁为GAGU，N_a为U，S₂为CA，N_b为GACG，S₃为UG，N_c为UU，S₄为GCUC，T₂为U；

5'-UCUAUGGCUGCCGAUCUGGUCUCCAUGUACGU-3'(SEQ ID NO:3)。

其中，按照5'-3'方向，T₁为CU，S₁为GAGU，N_a为U，S₂为CA，N_b为GACG，S₃为UG，N_c为UU，S₄为GCUC，T₂为U。

在一些实施方式中，所述连续的核苷酸序列具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列： 5'-N₆GGAGUUCAN₁N₂N₃N₄UGN₅GCUCN₇-3'(SEQ ID NO:4)，

其中，N₁、N₂和N₃各自独立地为A、U、C和G中的一种，N₄为U、C或G或者由U、C或G中的两个组成的基序；N₅为U、CU或UU；N₆为CU、UC或AC；N₇为U、UU或UUN₈，N₈为由1-15个核苷酸组成的基序。

上述核苷酸序列中，按照5'-3'方向，T₁为N₆所示的基序，S₁为GGAGU表示的基序，N_a为U，S₂为CA，N_b为N₁、N₂、N₃和N₄组成的基序N₁N₂N₃N₄，S₃为UG，N_c为N₅表示的基序，S₄为GCUC以及N₇中的第一个核苷酸组成的基序，T₂为N₇中的其余核苷酸组成的基序。

包含上述SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的适配体能够更有效地靶向肿瘤、特别是胶质瘤并在肿瘤组织中富集。

实验验证表明，SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列中，N₁、N₂、N₃和N₄的上述选择不会显著影响本公开提供的缀合物的肿瘤靶向能力。在一些实施方式中，N₁、N₂、N₃和N₄组成的基序N₁N₂N₃N₄为GACG、GACGU、GACCG、UACU、GUUG或GAUCU中的一种，包含这些基序的本公开提供的缀合物具有更高的肿瘤特异性靶向效果。

在一些实施方式中，SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列中，N₅为U或不存在。此时，本公开提供的缀合物对肿瘤均具有优异的靶向作用。

在一些实施方式中，连续的核苷酸序列具有SEQ ID NO:5-11中任意一项所示的核苷酸序列： 5'-CUGGAGUUCAGACGUGUUGCUCUU-3'(SEQ ID NO:5) 5'-CUGGAGUUCAGACGUUGUGCUCUU-3'(SEQ ID NO:6) 5'-CUGGAGUUCAGACCGUGUGCUCUU-3'(SEQ ID NO:7) 5'-CUGGAGUUCAGACGUGUUGCUCU-3'(SEQ ID NO:8) 5'-ACGGAGUUCAGACGUGUUGCUCUU-3'(SEQ ID NO:9) 5'-CUGGAGUUCACUACUGUUGCUCUU-3'(SEQ ID NO:10) 5'-CUGGAGUUCAGUUGUGUUGCUCUU-3'(SEQ ID NO:11)。

具有上述核苷酸序列的本公开提供的缀合物显示出对肿瘤的高度靶向作用。

在一些实施方式中，基序N₈由1-15个核苷酸组成。在一些实施方式中，N₈由1-8个核苷酸组成。

在一些实施方式中，基序N₈的存在使得本公开提供的缀合物对体内的核酸外切酶更加稳定，从而在体内能够更长时间地发挥肿瘤的靶向作用。在一些实施方式中，N₈能够增加或维持本公开提供的缀合物对肿瘤的靶向作用。从稳定性、靶向性和合成效率的平衡出发考虑，在一些实施方式中，基序N₈由8个核苷酸组成。在一些实施方式中，按照5'-3'方向，基序N₈的核苷酸序列为CCGAUCUC。

在一些实施方式中，连续的核苷酸序列具有SEQ ID NO:12-14中任意一项所示的核苷酸序列： 5'-CUGGAGUUCAGACGUGUUGCUCUUCCGAUCUC-3' (SEQ ID NO:12) 5'-CUGGAGUUCAGACGUUGUGCUCUUCCGAUCUC-3' (SEQ ID NO:13) 5'-CUGGAGUUCAGACCGUGUGCUCUUCCGAUCUC-3' (SEQ ID NO:14)

该连续的核苷酸序列中，5'末端核苷酸的核糖5'端以及3'末端核苷酸的核糖3'端的末端基团独立地是羟基或磷酸基，这些末端基团的选择不会 改变本公开提供的缀合物的靶向能力。在一些实施方式中，该连续的核苷酸序列中，5'末端核苷酸的核糖5'端以及3'末端核苷酸的核糖3'端的末端基团均为羟基。

本公开提供的缀合物中，每个核苷酸均可以是修饰或未修饰的核苷酸。一般而言，核苷酸的修饰可能会改变本公开提供的缀合物的稳定性和/或对肿瘤的靶向能力。在一些实施方式中，本公开提供的缀合物中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本公开提供的缀合物中的至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基。

核苷酸的修饰包括但不限于对糖的修饰、对碱基的修饰和/或以核苷酸类似物代替核苷酸。在一些实施方式中，本公开提供的缀合物中，每个所述修饰的核苷酸独立地为为2'-卤素修饰的核苷酸、2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸、碱基经修饰的核苷酸和核苷酸类似物中的一种。

在本公开的上下文中，“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，其具有以下式(7)所示的结构。“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸、或核苷酸类似物。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。

这些核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸是本领域技术人员所公知的，这些核苷酸可以选自2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸中的一种。

在一些实施方式中，2'-烷氧基修饰的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸(2'-OMe)，如式(8)所示。在一些实施方式中，2'-氨基修饰的核苷酸(2'-NH₂)如式(9)所示。在一些实施方式中，2'-脱氧核苷酸(DNA)如式(10)所示：

本领域技术人员知晓各种对核苷酸的碱基进行修饰的方式。在一些实施方式中，碱基修饰包括但不限于在碱基上增加一个或多个甲基。在一些实施方式中，将胸腺嘧啶(T)视为碱基经修饰的尿嘧啶(U)的一种。在一些实施方式中，将2-甲基胞嘧啶视为碱基经修饰的胞嘧啶(C)的一种。

核苷酸类似物指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。在一些实施方式中，核苷酸类似物可以是异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleic acid，简称BNA)或无环核苷酸。

BNA是指受约束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C3'-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥掺入到该核糖的2'-、4'-位处以提供一个2'，4'-BNA核苷酸。在一些实施方式中，BNA可以是LNA、ENA、cET BNA等，其中，LNA如式(12)所示，ENA如式(13)所示，cET BNA如式(14)所示：

无环核苷酸是核苷酸的糖环被打开形成的一类核苷酸。在一些实施方式中，无环核苷酸可以是解锁核酸(UNA)、甘油核酸(GNA)或肽核酸(PNA)，其中，UNA如式(15)所示，GNA如式(16)所示：

上述式(15)和式(16)中，R选自H、OH或烷氧基(O-烷基)。

肽核酸是多肽骨架取代糖苷-磷酸主链形成的一类核苷酸类似物。在一些实施方式中，肽核酸可以是例如以2-氨基乙基甘氨酸键取代糖苷-磷酸单元形成的核苷酸类似物。

异核苷酸是指核苷酸中碱基在核糖环上的位置发生改变而形成的化合物。在一些实施方式中，异核苷酸可以是碱基从核糖环的1'-位移动至2'-位或3'-位而形成的化合物，如式(17)或(18)所示。

上述式(17)-式(18)化合物中，Base表示核酸碱基，例如A、U、G、C或T；R选自H、OH、F或者如上所述的非氟基团。

在一些实施方式中，核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA中的一种。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，在上文和下文中，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。

在上文及下文中，“氟代修饰的核苷酸”、“2'-氟修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被氟取代的核苷酸”和“具有2'-氟代核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸的2'-羟基被氟取代，而形成的具有如式(7)所示结构的化合物；“甲氧基修饰的核苷酸”、“2'-甲氧基修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代的核苷酸”和“具有2'-甲氧基核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代而形成的 具有如式(8)所示结构的化合物。

在一些实施方式中，本公开提供的适配体中的所述连续的核苷酸序列中的每个胞嘧啶核苷酸为氟代修饰的胞嘧啶核苷酸，和/或所述所述连续的核苷酸序列中的每个尿嘧啶核苷酸为氟代修饰的尿嘧啶核苷酸。在一些实施方式中，本公开提供的适配体中的所述连续的核苷酸序列中的每个核苷酸均为2'-甲氧基修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本公开提供的适配体中的一个或多个尿嘧啶核苷酸具有修饰的碱基。。

连接相邻的两个核苷酸的基团可以是磷酸酯基或修饰的磷酸酯基。磷酸酯基的修饰例如将磷酸酯基中的至少一个非桥接氧原子替换为硫原子，形成硫代磷酸酯基或二硫代磷酸酯基。在一些实施方式中，本公开提供的适配体中的至少一个连接相邻的两个核苷酸的基团为硫代磷酸酯基。在一些实施方式中，本公开提供的适配体中的5'末端前四个核苷酸之间的3个连接相邻的两个核苷酸的基团中至少1个为硫代磷酸酯基。在一些实施方式中，本公开提供的适配体中的5'末端前四个核苷酸之间的3个连接相邻的两个核苷酸的基团中至少2个为硫代磷酸酯基。在一些实施方式中，本公开提供的适配体中的3'末端前四个核苷酸之间连接相邻的两个核苷酸的基团中至少1个为硫代磷酸酯基。在一些实施方式中，本公开提供的适配体中的5'末端前四个核苷酸之间的3个连接相邻的两个核苷酸的基团中至少2个为硫代磷酸酯基。在一些实施方式中，本公开提供的适配体中的每个连接相邻的两个核苷酸的基团均为硫代磷酸酯基。

具有上述修饰的本公开提供的缀合物不仅成本低，而且可使体内的核糖核酸酶不易切割递送基团，由此增加本公开提供的缀合物的稳定性，使其具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。同时，具有上述修饰的本公开提供的缀合物具有较高的靶向肿瘤组织和/或细胞的活性。

在一些实施方式中，本公开提供的缀合物具有SEQ ID NO:15-39中的一种所示的核苷酸序列： 5'-CfUfGGAGUfUfCfAGACfGUfGUfUfGCfUfCfUfUfCfCfGAUfCfUfCf-3' (SEQ ID NO:15) 5'-CfUfGGAGUfUfCfAGACfGUfGUfUfGCfUfCfUfUf-3'(SEQ ID NO:16) 5'-CfUfGGAGUfUfCfAGACfGUfUfGUfGCfUfCfUfUfCfCfGAUfCfUfCf-3' (SEQ ID NO:17) 5'-CfUfGGAGUfUfCfAGACfGUfUfGUfGCfUfCfUfUf-3'(SEQ ID NO:18) 5'-CfUfGGAGUfUfCfAGACfCfGUfGUfGCfUfCfUfUfCfCfGAUfCfUfCf-3' (SEQ ID NO:19)

5'-CfUfGGAGUfUfCfAGACfCfGUfGUfGCfUfCfUfUf-3'(SEQ ID NO:20) 5'-CmUmGmGmAmGmUmUmCmAmGmAmCmGmUmGmUmUmGmCmUmCm UmUmCmCmGmAmUmCmUmCm-3'(SEQ ID NO:21) 5'-CmUmGmGmAmGmUmUmCmAmGmAmCmGmUmGmUmUmGmCmUmCm UmUm-3'(SEQ ID NO:22) 5'-CmUmGmGmAmGmUmUmCmAmGmAmCmGmUmUmGmUmGmCmUmCm UmUmCmCmGmAmUmCmUmCm-3'(SEQ ID NO:23) 5'-CmUmGmGmAmGmUmUmCmAmGmAmCmGmUmUmGmUmGmCmUmCm UmUm-3'(SEQ ID NO:24) 5'-CmUmGmGmAmGmUmUmCmAmGmAmCmCmGmUmGmUmGmCmUmCm UmUmCmCmGmAmUmCmUmCm-3'(SEQ ID NO:25) 5'-CmUmGmGmAmGmUmUmCmAmGmAmCmCmGmUmGmUmGmCmUmCm UmUm-3'(SEQ ID NO:26) 5'-CmUmGmGmAmGmUmUmCmAmGmAmCmGmUmGmUmUmGmCmUmCm Um-3'(SEQ ID NO:27) 5'-CmUmGmAmGmUmUmCmAmGmAmCmGmUmGmUmUmGmCmUmCmUm -3'(SEQ ID NO:28) 5'-CmUmGmCmUmUmCmAmGmAmCmGmUmGmUmUmAmGmCmUmUm-3' (SEQ ID NO:29) 5'-AmCmGmGmAmGmUmUmCmAmGmAmCmGmUmGmUmUmGmCmUmCm UmUm-3'(SEQ ID NO:30) 5'-CmUmGmGmAmGmUmUmCmAmCmUmAmCmUmGmUmUmGmCmUmCm UmUm-3'(SEQ ID NO:31) 5'-CmUmGmGmAmGmUmUmCmAmGmUmUmGmUmGmUmUmGmCmUmCm UmUm-3'(SEQ ID NO:32) 5'-UmCmUmAmUmGmGmCmUmGmCmCmGmAmUmCmUmGmGmUmCmUm CmCmAmUmGmUmAmCmGmUm-3'(SEQ ID NO:33) 5'-CmsUmsGmGmAmGmUmUmCmAmGmAmCmGmUmGmUmUmGmCmUmC mUmUmCmCmGmAmUmCmsUmsCm-3'(SEQ ID NO:34) 5'-CmsUmsGmGmAmGmUmUmCmAmGmAmCmGmUmGmUmUmGmCmUmC msUmsUm-3'(SEQ ID NO:35) 5'-CmsUmsGmGmAmGmUmUmCmAmGmAmCmGmUmUmGmUmGmCmUmC mUmUmCmCmGmAmUmCmsUmsCm-3'(SEQ ID NO:36) 5'-CmsUmsGmGmAmGmUmUmCmAmGmAmCmGmUmUmGmUmGmCmUmC msUmsUm-3'(SEQ ID NO:37) 5'-CmsUmsGmGmAmGmUmUmCmAmGmAmCmCmGmUmGmUmGmCmUmC mUmUmCmCmGmAmUmCmsUmsCm-3'(SEQ ID NO:38) 5'-CmsUmsGmGmAmGmUmUmCmAmGmAmCmCmGmUmGmUmGmCmUmC msUmsUm-3'(SEQ ID NO:39)

其中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示该字母s左右两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。

在一些实施方式中，本公开提供的缀合物具有式(2)所示的结构：

其中，每个R_AP基团独立地为具有如式(3)所示的结构的基团：

式中，每个AP基团相同或不同，独立地表示一个所述递送基团；每个A₀基团相同或不同，独立地表示一个所述诊断剂基团；R_j、每个R_k或每个R_i相同或不同，分别独立地表示共价键或者连接基团，且R_i和R_k二者不同时为共价键；m₀为1-6的整数；n₀为1-6的整数，每个n₁各自独立地表示0-4的整数；表示基团共价连接的位点。

在一些实施方式中，m₀为1-6的整数，即，式(2)所示的缀合物中包含1-6个所述诊断剂基团A₀。从递送效率和合成成本的角度考虑，在一些实施方式中，m₀为1-4的整数，即，式(2)所示的缀合物中包含1-4个所述诊断剂基团A₀。在一些实施方式中，m₀为1，即，式(2)所示的缀合物中包含1个所述诊断剂基团A₀。

在一些实施方式中，n₀为1-6的整数，即，式(2)所示的缀合物中包含1-6个R_AP基团。从递送效率和合成成本的角度考虑，在一些实施方式中，n₀为1-3的整数，即，式(2)所示的缀合物中包含1-3个R_AP基团。在一些实施方式中，n₀为1，即，式(2)所示的缀合物中包含1个R_AP基团。

在一些实施方式中，每个n₁各自独立地表示0-4的整数，且R_i和R_k二者不同时为共价键，从而，每个R_AP基团中包含1-5个由本公开的适配体得到的递送基团AP。在一些实施方式中，每个n₁各自独立地表示0-1的整数，从而，每个R_AP基团中包含1-2个递送基团AP。在一些实施方式中，n₀为1、且n₁为0，此时，式(2)所示的缀合物中包含1个递送基团AP。

R_AP基团中，R_k和R_i的作用是将递送基团AP共价连接至R_j基团，并经由R_j基团连接至诊断剂基团A₀。因此，只要是能够实现上述连接、并且不对递送基团A_P和诊断剂基团A₀的作用产生负面影响的任何R_k和/或R_i均可用于本发明。在一些实施方式中，每个所述R_k和/或每个所述R_i独立地为长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，或者，所述直链亚烷基中的一个或多个碳原子被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)₂、OP(O)₂、OP(O)(S)、C₅-C₈亚糖苷基、C₂-C₁₀亚烯基、C₂-C₁₀亚炔基、C₆-C₁₀亚芳基、C₃-C₁₈亚杂环基和C₅-C₁₀亚杂芳基；并且其中，所述直链亚烷基可具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C₁-C₁₀烷基、C₆-C₁₀芳基、C₅-C₁₀杂芳基、C₁-C₁₀卤代烷基、-OC₁-C₁₀烷基、-OC₁-C₁₀烷基苯基、-C₁-C₁₀烷基-OH、-OC₁-C₁₀卤代烷基、-SC₁-C₁₀烷基、-SC₁-C₁₀烷基苯基、-C₁-C₁₀烷基-SH、-SC₁-C₁₀卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH₂、-C₁-C₁₀烷基-NH₂、-N(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基)、-NH(C₁-C₁₀烷基)、-N(C₁- C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基苯基)、-NH(C₁-C₁₀烷基苯基)、氰基、硝基、-CO₂H、-C(O)O(C₁-C₁₀烷基)、-CON(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基)、-CONH(C₁-C₁₀烷基)、-CONH₂，-NHC(O)(C₁-C₁₀烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁-C₁₀烷基)C(O)(C₁-C₁₀烷基)、-N(C₁-C₁₀烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C₁-C₁₀烷基、-C(O)C₁-C₁₀烷基苯基、-C(O)C₁-C₁₀卤代烷基、-OC(O)C₁-C₁₀烷基、-SO₂(C₁-C₁₀烷基)、-SO₂(苯基)、-SO₂(C₁-C₁₀卤代烷基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(C₁-C₁₀烷基)、-SO₂NH(苯基)、-NHSO₂(C₁-C₁₀烷基)、-NHSO₂(苯基)和-NHSO₂(C₁-C₁₀卤代烷基)。

从合成成本和难度以及缀合物的肿瘤靶向效果出发考虑，在一些实施方式中，每个n₁独立地为0或1，每个R_i独立地为以下连接基团的一种或多种的连接组合：C₁-C₂₀亚烷基、磷酸酯键、硫代磷酸酯键、酰胺键、酯键、醚键、硫醚键、二硫键、1,2,3-三唑亚基、聚乙二醇亚基、吡咯烷亚基、2-氧代吡咯烷亚基、亚苯基、亚环己基、2-丁二酰亚胺亚基、2-硫代丁二酰亚胺亚基、氨基酸亚基、核苷酸亚基。在一些实施方式中，每个R_i独立地为共价键、二硫键、亚十二烷基或者GAU三核苷酸亚基中的一种或2种的连接组合。

R_j基团的作用是将R_AP基团与诊断剂基团A₀相连接，从而通过R_AP基团中递送基团AP的肿瘤靶向作用将诊断剂基团A₀特异性地递送至肿瘤组织和/或细胞。因此，任何能够实现上述连接、且不会影响递送基团AP的肿瘤靶向作用和诊断剂基团A₀的效果的R_j基团都能够实现本发明的目的、解决本发明所要解决的技术问题。在一些实施方式中，在式(2)所示的缀合物到达肿瘤组织和/或进入肿瘤细胞后，所述R_j发生裂解，释放出单独的诊断剂基团A₀对应的诊断剂分子。在一些实施方式中，所述R_j在体内不发生裂解，此时缀合物中R_j基团和R_AP基团的存在不会影响诊断剂基团A₀发挥诊断作用。

在一些实施方式中，R_j为共价键，m₀为1，此时，式(2)所示的缀合物中包含1个诊断剂基团A₀和n₀个R_AP基团，每个R_AP基团直接连接至该诊断剂基团A₀。在一些实施方式中，每个R_AP基团连接至诊断剂基团A₀的同一原子。在一些实施方式中，每个R_AP基团连接至诊断剂基团A₀的不同原子。

在一些实施方式中，R_j为连接基团，所述连接基团R_j包含主链部分、侧链部分和缀合连接部。

主链部分分别与缀合连接部和侧链部分连接。在一些实施方式中，主链部分为长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，或者，所述直链亚烷基中的一个或多个碳原子被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)₂、OP(O)₂、C₅-C₈亚糖苷基、C₂-C₁₀亚烯基、C₂-C₁₀亚炔基、C₆-C₁₀亚芳基、C₃-C₁₈亚杂环基和C₅-C₁₀亚杂芳基；并且其中，所述直链亚烷基可具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C₁-C₁₀烷基、C₆-C₁₀芳基、C₅-C₁₀杂芳基、C₁-C₁₀卤代烷基、-OC₁-C₁₀烷基、-OC₁-C₁₀烷基苯基、-C₁-C₁₀烷基-OH、-OC₁-C₁₀卤代烷基、-SC₁-C₁₀烷基、-SC₁-C₁₀烷基苯基、-C₁-C₁₀烷基-SH、-SC₁-C₁₀卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH₂、-C₁-C₁₀烷基-NH₂、-N(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基)、-NH(C₁-C₁₀烷基)、-N(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基苯基)、-NH(C₁-C₁₀烷基苯基)、氰基、硝基、-CO₂H、-C(O)O(C₁-C₁₀烷基)、-CON(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基)、-CONH(C₁-C₁₀烷基)、-CONH₂，-NHC(O)(C₁-C₁₀烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁-C₁₀烷基)C(O)(C₁-C₁₀烷基)、-N(C₁-C₁₀烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C₁-C₁₀烷基、-C(O)C₁-C₁₀烷基苯基、-C(O)C₁-C₁₀卤代烷基、-OC(O)C₁-C₁₀烷基、-SO₂(C₁-C₁₀烷基)、-SO₂(苯基)、-SO₂(C₁-C₁₀卤代烷基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(C₁-C₁₀烷基)、-SO₂NH(苯基)、-NHSO₂(C₁-C₁₀烷基)、-NHSO₂(苯基)和-NHSO₂(C₁-C₁₀卤代烷基)。

侧链部分分别与主链部分和R_AP基团连接。在一些实施方式中，每个侧链部分独立地是共价键，或者是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，或者，所述直链亚烷基中的一个或多个碳原子被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)₂、OP(O)₂、C₅-C₈亚糖苷基、C₂-C₁₀亚烯基、C₂-C₁₀亚炔基、C₆-C₁₀亚芳基、C₃-C₁₈亚杂环基和C₅-C₁₀亚杂芳基；并且，所述直链亚烷基可具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C₁-C₁₀烷基、C₆-C₁₀芳基、C₅-C₁₀杂芳基、C₁-C₁₀卤代烷基、-OC₁-C₁₀烷基、-OC₁-C₁₀烷基苯基、-C₁-C₁₀烷基-OH、-OC₁-C₁₀卤代烷基、-SC₁-C₁₀烷基、-SC₁-C₁₀烷基苯基、- C₁-C₁₀烷基-SH、-SC₁-C₁₀卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH₂、-C₁-C₁₀烷基-NH₂、-N(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基)、-NH(C₁-C₁₀烷基)、-N(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基苯基)、-NH(C₁-C₁₀烷基苯基)、氰基、硝基、-CO₂H、-C(O)O(C₁-C₁₀烷基)、-CON(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基)、-CONH(C₁-C₁₀烷基)、-CONH₂，-NHC(O)(C₁-C₁₀烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁-C₁₀烷基)C(O)(C₁-C₁₀烷基)、-N(C₁-C₁₀烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C₁-C₁₀烷基、-C(O)C₁-C₁₀烷基苯基、-C(O)C₁-C₁₀卤代烷基、-OC(O)C₁-C₁₀烷基、-SO₂(C₁-C₁₀烷基)、-SO₂(苯基)、-SO₂(C₁-C₁₀卤代烷基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(C₁-C₁₀烷基)、-SO₂NH(苯基)、-NHSO₂(C₁-C₁₀烷基)、-NHSO₂(苯基)和-NHSO₂(C₁-C₁₀卤代烷基)；

缀合连接部分别与主链部分和诊断剂基团A₀连接。在一些实施方式中，每个缀合连接部独立地为共价键或者以下连接结构的一种或多种的连接组合：C₁-C₁₀直链亚烷基、磷酸酯键、硫代磷酸酯键、酰胺键、酯键、醚键、二硫键、1,2,3-三唑亚基、聚乙二醇亚基、吡咯烷亚基、2-氧代吡咯烷亚基、亚苯基、亚环己基、2-丁二酰亚胺亚基、2-硫代丁二酰亚胺亚基、氨基酸亚基、核苷酸亚基。

在一些实施方式中，连接基团R_j包含本领域技术人员知晓能够用于抗体偶联药物的连接基团。连接基团R_j可以是可裂解的或不可裂解的。在一些实施方式中，连接基团R_j可以是可裂解的。在上下文中，“可裂解”是指在本公开的缀合物靶向至肿瘤后，连接基团R_j在肿瘤内环境下和/或肿瘤细胞内发生共价键断裂，释放出单独的诊断剂基团产生诊断效果。在一些实施方式中，连接基团R_j包含活化酶连接基团、硫酸酯酶-可切割连接基团、半乳糖可切割连接基团、对溶酶体蛋白酶敏感的连接基团、肽基连接基团、葡糖苷酸连接基团、酸敏可切割连接基团、或对谷胱甘肽敏感的二硫化物连接基团的一种或多种。在一些实施方式中，连接基团R_j包含肽基连接基团。在一些实施方式中，肽基连接基团选自缬氨酸-瓜氨酸二肽连接子(Val–Cit)、丙氨酸-丙氨酸二肽连接子(Ala–Ala)、缬氨酸-丙氨酸二肽连接子(Val–Ala)、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸的四肽连接子(Gly-Gly-Phc-Gly)中的一种或多种。在一些实施方式中，连接基团R_j选自N-琥珀酰亚基4-(2-二硫吡啶)丁酸盐(SPDB)、N-琥珀 酰亚胺-4-(2-硫代吡啶亚基)戊酸盐(SPP)、(S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺)-5-脲基戊酸(Val-Cit-PAB-OH)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC)或者2-(磷酸酯基-(CH₂)₆-S-)-马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲基亚基中的一种。在一些实施方式中，连接基团R_j包含Mckertish CM,Kayser V.Advances and Limitations of Antibody Drug Conjugates for Cancer.Biomedicines.2021Jul 23；9(8):872.中列举的连接基团，以引用的方式将该文献的全部内容整体并入本文。在一些实施方式中，连接基团R_j是不可裂解的。

在一些实施方式中，连接基团R_j包含缬氨酸-瓜氨酸二肽连接子(Val–Cit)、聚乙二醇亚基、亚氨基己基亚基、N-琥珀酰亚胺基、GAU三核苷酸连接基团中的一种或多种。在一些实施方式中，每个R_i独立地为共价键、二硫键、亚十二烷基、缬氨酸-瓜氨酸二肽连接子(Val–Cit)、聚乙二醇亚基、亚氨基己基亚基、N-琥珀酰亚胺基或者GAU三核苷酸亚基中的一种或2种的连接组合。

在一些实施方式中，连接基团R_j中的每个所述缀合连接部分别与所述主链部分和一个所述诊断剂基团A₀连接；所述侧链部分为n₀个，每个侧链部分分别与所述主链部分和一个所述R_AP基团连接。从而，每个诊断剂基团A₀和R_AP基团各自独立地连接至连接基团R_j。在一些实施方式中，全部侧链部分连接至主链部分中的同一原子；或者，每个侧链部分连接至主链部分中的不同原子。

在一些实施方式中，m₀为1，所述连接基团R_j包含如式(301)所示的结构：

其中，k为1-3的整数；L^C为所述主链部分，L^A为所述侧链部分，L^B为所述缀合连接部，表示基团共价连接的位点。

所述主链部分L^C为共价键或2-4价、直链或支链的C₁-C₂₅饱和烃基，或者，所述饱和烃基中的一个或多个碳原子被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)₂、OP(O)₂、 C₅-C₈亚糖苷基、C₂-C₅亚烯基、C₂-C₅亚炔基、C₆-C₁₀亚芳基、C₃-C₈亚杂环基和C₅-C₁₀亚杂芳基；其中，所述饱和烃基可具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C₁-C₅烷基、C₆-C₁₀芳基、C₅-C₁₀杂芳基、-O-C₁-C₅烷基、-OC₁-C₅烷基苯基、-C₁-C₅烷基-OH、-SC₁-C₅烷基、硝基、-C(O)O(C₁-C₅烷基)、-CON(C₁-C₅烷基)(C₁-C₅烷基)、-CONH(C₁-C₅烷基)、-CONH₂，-NHC(O)(C₁-C₅烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁-C₅烷基)C(O)(C₁-C₅烷基)、-N(C₁-C₅烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C₁-C₅烷基、-C(O)C₁-C₅烷基苯基、-OC(O)C₁-C₅烷基、-SO₂(C₁-C₅烷基)、-SO₂(苯基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(C₁-C₅烷基)、-SO₂NH(苯基)、-NHSO₂(C₁-C₅烷基)和-NHSO₂(苯基)。

在一些实施方式中，L^C为2-4价的C₅-C₂₀饱和烃基，或者，所述饱和烃基中的一个或多个碳原子被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)₂、OP(O)₂、C₅-C₈亚糖苷基、C₂-C₅亚烯基、C₂-C₅亚炔基、C₆-C₁₀亚芳基、C₃-C₈亚杂环基和C₅-C₁₀亚杂芳基；其中，所述饱和烃基可具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C₁-C₅烷基、C₆-C₁₀芳基、C₅-C₁₀杂芳基、-O-C₁-C₅烷基、-OC₁-C₅烷基苯基、-C₁-C₅烷基-OH、-SC₁-C₅烷基、硝基、-CONH₂。在一些实施方式中，L^C的长度为5-30个原子，其中所述L^C的长度指L^C中与L^A直接连接的原子到与L^B直接连接的原子形成的最长的原子链上的成链原子的个数。为了简化结构，在一些实施方式中，L^C的长度为8-25个原子。

所述侧链部分L^A为共价键，或者C₁-C₂₀亚烷基，或者，所述亚烷基中的一个或多个碳原子被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)₂、OP(O)₂、C₅-C₈亚糖苷基、C₂-C₅亚烯基、C₂-C₅亚炔基、C₆-C₁₀亚芳基、C₃-C₈亚杂环基和C₅-C₁₀亚杂芳基；其中，所述亚烷基可具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C₁-C₅烷基、C₆-C₁₀芳基、C₅-C₁₀杂芳基、-O-C₁-C₅烷基、-OC₁-C₅烷基苯基、-C₁-C₅烷基-OH-SC₁-C₅烷基、-SC₁-C₅烷基苯基、-C₁-C₅烷基-SH、-OH、-SH、-NH₂、-C₁-C₅烷基-NH₂、-N(C₁-C₅烷基)(C₁-C₅烷基)、-NH(C₁-C₅烷基)、-N(C₁-C₅烷基)(C₁-C₅烷基苯基)、-NH(C₁-C₅烷 基苯基)、硝基、-C(O)O(C₁-C₅烷基)、-CON(C₁-C₅烷基)(C₁-C₅烷基)、-CONH(C₁-C₅烷基)、-CONH₂，-NHC(O)(C₁-C₅烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁-C₅烷基)C(O)(C₁-C₅烷基)、-N(C₁-C₅烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C₁-C₅烷基、-C(O)C₁-C₅烷基苯基、-OC(O)C₁-C₅烷基、-SO₂(C₁-C₅烷基)、-SO₂(苯基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(C₁-C₅烷基)、-SO₂NH(苯基)、-NHSO₂(C₁-C₅烷基)和-NHSO₂(苯基)。

所述缀合连接部L^B为1-5个以下连接键中的一种或多种的连接组合：磷酸酯键、硫代磷酸酯键、酰胺键、酯键、醚键、二硫键。

在一些实施方式中，k为1-3的整数；L^C含有如式(L1)-(L3)所示的基团中的任意一个，通过如式(L1)-(L3)所示的基团中的醚键与L^A部分连接：

表示基团连接至分子其余部分的位点；

在一些实施方式中，k＝1,L^C含有如式(L1)所示的基团，基团(L1)中的O原子和L^A直接相连。在一些实施方式中，k＝2，L^C含有如式(L2)所示的基团，基团(L1)中的2个O原子各自和1个L^A直接相连。在一些实施方式中，k＝4，L^C含有如式(L3)所示的基团，基团(L3)中的3个O原子各自和1个L^A直接相连。

L^B为磷酸酯键或二硫键；

每个L^A为共价键，或者每个L^A选自于由基团(L4)-(L23)及其连接组合所组成的组：

式中，每个j1为1-10的整数；

每个R'为C₁-C₁₀烷基；

每个Ra为氢原子，C₁-C₁₀烷基，或者选自由基团(L24)-(L37)组成的组：

在一些实施方式中，L^A的长度为3-35个原子，其中所述L^A的长度指L^A中与L^C直接连接的原子到与L^A中与R_AP直接连接的原子形成的最长的原子链上的成链原子的个数。在一些实施方式中，每个L^A为基团(L4)-(L9)、(L13)、(L14)、(L18)中至少2个的连接组合。在一些实施方式中，每个L^A为基团(L4)、(L5)、(L7)、(L9)、(L13)、(L14)、(L18)中至少2个的连接组合。

在一些实施方式中，L^A具有如式(302)所示的包含酰胺键的结构，L^B具有如式(303)所示的包含N-酰基吡咯烷的结构，含有羰基和氧原子，L^C为基于羟甲基氨基甲烷、二羟甲基氨基甲烷或三羟甲基氨基甲烷的连接基团：

其中，n₃₀₂、q₃₀₂和p₃₀₂各自独立地为2-6的整数，可选地，n₃₀₂、q₃₀₂和p₃₀₂各自独立地为2或3；n₃₀₃为4-16的整数，可选地，n₃₀₃为8-12的整数，表示基团共价连接的位点。

在一些实施方式中，每个所述侧链部分L^A分别与一个R_AP基团通过磷酸酯键、醚键或酯键而连接，并通过所述主链部分L^C中羟基的氧原子与所述主链部分L^C形成醚键而连接；所述缀合连接部L^B通过式(303)中的羰基与所述主链部分L^C中氨基的氮原子形成酰胺键而连接，并通过式(303)中的氧原子与所述诊断剂基团A₀形成磷酸酯键、醚键或酯键而连接。在一些实施方式中，主链部分L^C是基于羟甲基氨基甲烷、二羟甲基氨基甲烷或三羟甲基氨基甲烷的连接基团，所述主链部分L^C经由羟基的氧原子与各个所述侧链部分L^A通过醚键相连接，并且经由氨基的氮原子与所述缀合连接部L^B通过酰胺键相连接。从而，该连接基团R_j中1-3个侧链连接至同一氨甲基的碳原子上，并通过缀合连接部L^B连接至包含递送基团的R_AP基团。

在一些实施方式中，所述缀合物具有如式(305)所示的结构：

在一些实施方式中，所述连接基团R_j包含如式(306)所示的结构：

其中，n₃₀₆为0-3的整数，每个p₃₀₆独立地为1-6的整数，表示基团共价连接的位点；由吡咯烷亚基和磷酸二酯基团交替形成的结构构成主链部分，由连接至吡咯烷基上的氮原子的羰基与由*标出的氧原子之间的原子链构成每个侧链部分，所述侧链部分通过由*标出的氧原子与R_AP基团形成醚键连接；由#标出的氧原子中的至少一个为缀合连接部并与诊断剂基团A₀形成醚键、酯键或磷酸酯键而连接，其余由#标出的氧原子与氢原子连接形成羟基，或者与C₁-C₃烷基连接形成C₁-C₃烷氧基。从而，该连接基团R_j中1-3个侧链部分连接至主链部分中不同的碳原子上，并通过氧原子连接至包含递送基团的R_AP基团。

在一些实施方式中，所述化合物具有如式(307a)、(307b)或(307c)所示的结构：

在一些实施方式中，所述化合物具有如式(308)所示的结构：

其中，n₃₀₈可为1-10的整数；在一些实施方式中，从合成容易程度、结构/工艺成本和肿瘤细胞特异性等多方面综合考虑，n₃₀₈为2-6的整数。在一些实施方式中，n₃₀₈为3或4。

每个R₃独立地为诊断剂基团A₀，或者包含递送基团AP的R_AP基团。在一些实施方式中，至少一个R₃为诊断剂基团A₀，且至少一个R₃为R_AP。

在一些实施方式中，当每个m₃₀₈独立地选自2-10的整数时，认为可能使得该化合物中，多个递送基团AP之间的空间位置更适合于与肿瘤细胞表面的相应受体发生相互作用，为了使式(308)表示的化合物更为简单，更容易合成和/或降低成本，根据本公开的一些实施方式，每个m₃₀₈独立地为2-5的整数，在一些实施方式中，每个m₃₀₈均相等。

本领域技术人员可以理解，当每个R₃₀₈独立地选自H、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀卤代烷基和C₁-C₁₀烷氧基时，不改变式(308)表示的化合物的性质，均可实现本公开的目的。在一些实施方式中，每个R₃₀₈独立地选自H、甲基或乙基。在一些实施方式中，每个R₃₀₈均为H。

连接至所述诊断剂基团A₀的每个L₁表示所述缀合连接部，并且连接至所述R_AP的每个L₁表示所述侧链部分。在一些实施方式中，一个R₃为所述诊断剂团A₀，其余R₃为所述R_AP基团。在一些实施方式中，一个或多个L₁作为所述侧链部分，将R_AP基团与含氮骨架上的N原子连接；并且另外的一个或多个L₁作为所述缀合连接部，将诊断剂基团A₀与含氮骨架上的N原子连接。所述含氮骨架共同组成连接基团R_j的主链部分。在本公开的上下文中，“含氮骨架”是指式(308)所示结构中的链结构，其中连接有R₃₀₈的碳原子与N原子互相连接。

从递送效率和合成成本的角度出发考虑，在一些实施方式中，每个L₁的长度独立地为3-25个原子。在一些实施方式中，每个L₁的长度独立地为4-15个原子。本领域技术人员会理解，尽管为了方便起见，L₁被定义为线性亚烷基，但是它可能不是线性基团或者名称不同，例如由于上述替换和/或取代而产生的胺或烯基。为了本公开的目的，L₁的长度是连接两个连接点的链中的原子数。为此目的，将替换所述直链亚烷基的碳原子而得到的环(如亚杂环基或亚杂芳基)按照环上连接点之间的最小 原子数计算链中与该环相应部分的长度。

在一些实施方式中，L₁选自上述式L4-L23所示基团及其任意连接组合所组成的组。在一些实施方式中，每个L₁独立地选自于由基团(L4)-(L9)、(L13)、(L14)、(L18)中至少2个的连接组合所组成的组。在一些实施方式中，每个L₁独立地为基团(L4)、(L5)、(L7)、(L9)、(L13)、(L14)、(L18)中至少2个的连接组合。

在一些实施方式中，式(308)所示的缀合物中，每个L₁上同时含有与含氮骨架上的N原子连接的连接位点和与诊断剂基团A₀或所述R_AP基团连接的连接位点，与含氮骨架上的N原子连接的位点与该N原子形成酰胺键。在一些实施方式中，一个或多个L₁选自B5、B6、B5'或B6'：

其中，表示基团共价连接的位点，q₂为1-10的整数。在一些实施方式中，q₂为1-5的整数。

在一些实施方式中，每个R_AP基团中包含一个或多个递送基团。在一些实施方式中，式(308)所示的化合物中包含多个诊断剂基团。在一些实施方式中，式(308)化合物中每个诊断剂基团是相同的诊断剂基团。在一些实施方式中，式(308)化合物中每个诊断剂基团是用于同一目的和功能的诊断剂基团。在一些实施方式中，式(308)化合物中含有不同种类的用于不同目的和功能的诊断剂基团。

在一些实施方式中，所述式(308)所示的化合物具有式(403)、(404)、(405)、(406)、(407)、(408)、(409)、(410)、(411)、(412)、(413)、(414)、(415)、(416)、(417)、(418)、(419)、(420)、(421)、(422)、(423)、(424)、(425)、(426)或(427)所示的结构：

在一些实施方式中，连接基团R_j包含核苷酸序列I和核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II各自包含5-25个修饰或未修饰的核苷酸，所述苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补，所述递送基团连接至所述核苷酸序列I，所述诊断剂基团连接至所述核苷酸序列II，并且所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II在受试者体内不引发免疫反应或毒性反应。在一些实施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II实质上反向互补或者完全反向互补；或者，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II的长度相等并且均为10-20个修饰或未修饰的核苷酸；或者，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II均由17个核苷酸组成并且完全反向互补。在一些实施方式中，所述递送基团3'末端经磷酸酯键连接至所述核苷酸序列I的5'末端核苷酸的核糖5'位，所述诊断剂基团连接至所述核苷酸序列II的5'末端核苷酸的核糖5'位；或者，所述诊断剂基团包含一段核苷酸序列，所述核苷酸序列的3'末端经磷酸酯键连接至所述核苷酸序列I的5'末端核苷酸的核糖5'位。在一些实施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II分别具有SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41所示的序列： 5'-GUACAUUCUAGAUAGCC-3'(SEQ ID NO:40) 5'-GGCUAUCUAGAAUGUAC-3'(SEQ ID NO:41)。

在一些实施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II分别具有SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43所示的序列： 5'-GmUfAmCfAmUfUfCfUfAmGmAmUfAmGmCfCf-3' (SEQ ID NO:42) 5'-GmGmCfUfAmUfCfUfAmGmAmAmUfGmUfAmCf-3' (SEQ ID NO:43)。

本公开提供的缀合物可以包含一个或多个诊断剂基团。在本公开的上下文中，诊断剂基团是指，由相应诊断剂化合物去除一个或多个原子、官能团或部分结构基团(例如，去除一个氢原子)而形成的包含自由基的基团，并且所述诊断剂基团通过该自由基与本公开提供的缀合物的分子其它部分形成共价连接。

在一些实施方式中，每个所述诊断剂基团独立地选自造影剂基团或荧光标记示踪剂基团。通过包含诊断剂基团，本公开提供的缀合物能够将该诊断剂基团递送至肿瘤，从而特异性地、高效、准确地对肿瘤的存在以及疾病进展状态等相关疾病和/或症状信息进行诊断。在一些实施方式中，所述诊断剂基团可用于在体外实验中对待测样品中的肿瘤细胞/组织进行诊断。在一些实施方式中，所述诊断剂基团可用于在受试者体内对肿瘤细胞/组织的存在和/或性质进行诊断。

适用于不同摄影技术的造影剂基团，例如可独立地选自于本领域技术任意熟知的以下造影剂中的一种或多种形成的基团：计算机体层摄影术(CT)造影剂、核磁共振体层摄影术(MRI)造影剂、磁粒子成像造影剂、超声波(US)造影剂。在一些实施方式中，本公开的特异性造影剂化合物中的至少一个造影剂基团为MRI造影剂形成的造影剂基团。在一些实施方式中，本公开提供的缀合物中的全部造影剂基团为MRI造影剂形成的造影剂基团。

不同类化合物的造影剂基团例如可以是本领域技术任意熟知的含碘基团、包含螯合剂基团和与所述螯合剂基团螯合的金属离子、具有表面修饰的铁粒子的表面修饰基团或者全氟化合物形成的基团。

在一些实施方式中，所述计算机体层摄影术(CT)造影剂可以选自碘钛酸盐、碘海醇、泛影葡胺、碘帕醇、乙碘油制剂或碘番酸盐。

在一些实施方式中，所述核磁共振体层摄影术(MRI)造影剂或磁粒 子成像造影剂可以选自钆螯合物、锰螯合物、铬螯合物或铁粒子。

在一些实施方式中，所述超声波(US)造影剂可以选自全氟化合物或全氟化合物类似物。

在一些实施方式中，所述荧光标记示踪剂基团(本领域中也称为荧光成像基团或荧光基团)可以是荧光标记示踪剂形成的基团，所述荧光标记示踪剂可以选自荧光素、荧光素衍生物、吲哚箐绿、奥勒冈绿、奥勒冈绿衍生物、罗丹明绿、罗丹明绿衍生物、曙红、藻红、德克萨斯红、德克萨斯红衍生物、孔雀绿、纳米金磺基琥珀酰亚胺基酯、cascade蓝、香豆素衍生物、萘、吡啶基恶唑衍生物、cascade黄染料或dapoxyl染料。在一些实施方式中，荧光标记示踪剂基团是Cy5(Cyanine 5)荧光染料基团或Cy3(Cyanine 3)荧光染料基团。

所述诊断剂基团可通过任何合适的方式包含于本公开提供的缀合物中。例如，可以通过前述的缀合连接部将诊断剂基团A₀与所述主链部分相连接。

在一些实施方式中，本公开提供的缀合物中还包含至少一个递送助剂基团，所述递送助剂基团选自于C₁₀-C₃₀烃基、胆固醇基、磷脂基团中的一种或多种。通过包含该递送助剂基团，本公开提供的缀合物能够更好地与中枢神经系统中的体内环境相容，可能具有更好的生物利用度，和/或使本公开提供的缀合物更有效地递送至肿瘤。在一些实施方式中，所述递送助剂基团通过共价键或连接基团连接至所述递送基团或者所述连接基团。在一些实施方式中，所述递送助剂基团连接至所述诊断剂基团。

本领域技术人员可以采用任意合理的合成路线制备本公开提供的缀合物。

在一些实施方式中，本公开提供的缀合物的合成方法包括在脱保护反应条件下，在溶剂中，将经保护的缀合物与脱保护试剂接触，分离获得本公开提供的缀合物。经保护的缀合物是本公开提供的缀合物中任意活性官能团均被保护基团保护而形成的化合物。在一些实施方式中，所述活性官能团包括但不限于羟基、氨基和/或磷酸基，所述保护基团相应 地为羟基保护基、氨基保护基和/或磷酸羟基保护基(例如，氰乙基保护基)。根据保护基团的不同，对所使用的溶剂、脱保护反应条件和脱保护试剂进行选择和确定。在一些实施方式中，所述脱保护反应条件、溶剂和脱保护试剂是核酸固相合成中使用的脱保护反应条件、溶剂和试剂。在一些实施方式中，所述方法包括将经保护的缀合物加入甲胺水溶液和氨水的混合溶液中，所述脱保护反应条件包括在常温常压下反应1-5h。在一些实施方式中，以等体积混合所述甲胺水溶液与饱和浓氨水得到所述混合溶液，所述溶液相对于经保护的缀合物的用量为0.1-10ml/μmol。在一些实施方式中，所述分离包括通过柱色谱分离进行纯化，收集产品洗脱液并除去溶剂。纯化条件可以是例如使用制备型离子色谱纯化柱，以氯化钠水溶液与磷酸钠水溶液的梯度洗脱剂进行洗脱。在一些实施方式中，以20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱剂B：1.5M氯化钠，20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱梯度：洗脱剂A:洗脱剂B＝100:0-50:50梯度洗脱。

在一些实施方式中，本公开提供的缀合物具有式(101)所示的结构，所述经保护的缀合物的合成方法包括在有机溶剂中，在偶联反应条件下，将包含活性基团R_x1和递送基团的化合物与包含活性基团R_x2和诊断剂基团的化合物接触，反应获得所述经保护的缀合物，其中，所述递送基团由本公开提供的适配体去除一个或多个氢原子或一个或多个官能团形成，其中所述递送基团和诊断剂基团中的任何活性基团均被保护基团保护，所述活性基团R_x1和所述活性基团R_x2是能够经反应形成共价键或者连接基团R_j的基团。在一些实施方式中，连接有活性基团R_x1的递送基团和连接有活性基团R_x2的诊断剂基团的摩尔比为m₀:n₀。在一些实施方式中，所述递送基团和诊断剂基团中的活性基团包括但不限于羟基、氨基、磷酸基中的一种或多种，所述保护基团相应地为羟基保护基、氨基保护基、磷酸羟基保护基(例如，氰乙基保护基)中的一种或多种。

本领域的技术人员可以通过各种方法获得包含活性基团R_x1和递送基团的化合物。在一些实施方式中，所述包含活性基团R_x1和递送基团的化合物可以通过本领域技术人员熟知的核酸合成方法，例如亚磷酰胺固相合成或者磷酸二酯法/磷酸三酯法液相合成获得。在一些实施方式中，所 述包含活性基团R_x1和递送基团的化合物采用亚磷酰胺固相合成法得到，该方法包括，在亚磷酰胺固相合成条件下，按照寡核苷酸单链中核苷酸的顺序，将核苷单体依次连接，其中，至少一个核苷单体为具有活性基团R_x1的核苷单体，或者，在连接全部核苷单体后，再按照亚磷酰胺固相合成法连接一个具有活性基团R_x1的亚磷酰胺单体或经保护的亚磷酰胺单体，随后再脱除该保护基团形成活性基团R_x1。亚磷酰胺固相合成法为本领域技术人员所公知，其过程和条件在Methods in Molecular Biology,vol.288:Oligonucleotide Synthesis:Methods and Applications，P17-P31中详细公开，以引用的方式将其全部内容整体并入本文。

在一些实施方式中，所述偶联反应条件是缩合反应条件或者巯基-二硫键交换反应的条件。

在一些实施方式中，所述偶联反应条件是缩合反应条件，所述缩合反应条件是酰基化缩合反应条件、脱水缩合反应条件或者点击化学反应的条件，活性基团R_x1与活性基团R_x2是能够发生前述缩合反应的基团。在一些实施方式中，所述缩合反应条件是酰基化缩合反应的条件，所述活性基团R_x1和R_x2是能够发生酰基化缩合反应形成R_I的基团。在一些实施方式中，所述缩合反应条件是脱水缩合反应的条件，所述活性基团R_x1和R_x2中的一个是包含酰卤基团或羧基的基团，另一个是包含氨基或羟基的基团。在一些实施方式中，所述缩合反应条件是点击化学的条件，所述活性基团R_x1和R_x2中的一个是包含炔基的基团，另一个是包含叠氮基团的基团。在一些实施方式中，所述缩合反应条件是Michael加成反应的条件，所述活性基团R_x1和R_x2中的一个是包含巯基的基团，另一个是包含琥珀酰亚胺基的基团。在一些实施方式中，所述缩合反应条件是N-羟基琥珀酰亚胺-碳二亚胺(NHS-EDC)联用偶联反应的条件，所述活性基团R_x1和R_x2中的一个是包含N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的基团，另一个是包含碳二亚胺基(EDC)的基团。

在一些实施方式中，所述包含活性基团R_x1和递送基团的化合物是通过在偶联反应的条件下，将具有活性基团R_x0的本公开提供的适配体和交联剂接触制备得到的，所述交联剂含有点击化学活性基团和酰基化基团。所述活性基团R_X0与所述酰基化基团通过发生偶联反应而形成共价连接， 使所述点击化学活性基团连接至本公开的适配体。

在一些实施方式中，活性基团R_x1是末端含有1-3个点击化学活性基团的活性基团，所述点击化学活性基团包含末端炔基。在一些实施方式中，所述酰基化基团是活性酯基团，例如可以是NHS酯基、亚氨酸酯基以及五氟苯酯基中的一种。本领域的技术人员可以通过各种方法获得所述交联剂，例如，当所述酰基化基团是五氟苯酯基，所述点击化学基团包含末端炔基时，所述交联剂可以按照如Michael E.,et al."Efficient synthesis and biological evaluation of 5'-GalNAc conjugated antisense oligonucleotides."Bioconjugate chemistry 26.8(2015):1451-1455中Scheme 1a(A)中描述的方法制备获得，以引用的方式将其全部内容整体并入本文。在一些实施方式中，所述活性基团R_x0是氨基。在一些实施方式中，所述偶联条件是碱性条件。在一些实施方式中，所述碱性条件是有弱碱水溶液存在的条件，例如有碳酸氢钠水溶液存在的条件。

本领域的技术人员可以通过各种方式获得所述具有活性基团R_x0的适配体，在一些实施方式中，所述具有活性基团R_x0的适配体是通过在合成适配体的过程中在相应位置使用含有活性基团的亚磷酰胺单体制备得到的。本领域的技术人员可以通过各种方式获得含有活性基团的亚磷酰胺单体。在一些实施方式中，所述活性基团R_x0是氨基，含有R_x0的亚磷酰胺单体可以通过本领域技术人员熟知的方法商购获得或制备获得，例如，含有R_x0的亚磷酰胺单体可以是容易商购获得的6-(三氟乙酰氨基)-己基-(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺单体，其中，活性基团R_x0为氨基，该活性基团R_x0可以是通过亚磷酰胺固相合成法将所述亚磷酰胺单体连接至寡核苷酸单链后，经本领域技术人员容易实现的脱保护反应(如浓氨水氨解)脱除三氟乙酰基保护基而获得。在这些情况下，经亚磷酰胺固相合成方法连接的活性基团R_x0经由磷酸二酯键连接至适配体5'末端核苷酸的核糖5'端。

在一些实施方式中，所述偶联反应条件是巯基-二硫键交换反应中的一种，所述活性基团R_x1和R_x2中的一个是包含巯基的基团，另一个包含经二硫键连接的离去基团。为了避免副反应发生，在一些实施方式中，上述含有活性基团R_x1的亚磷酰胺单体中的R_x1以被保护的R_x1’形式存在， 所述制备方法还包含在脱保护反应条件下，通过将制备得到的包含被保护的活性基团R_x1’和递送基团的化合物与脱保护试剂接触，分离得到包含活性基团R_x1和递送基团的化合物的步骤。在一些实施方式中，所述R_x1’含有二硫键离去基团，所述脱保护反应条件是巯基-二硫键交换反应条件，所述脱保护试剂是二硫键活化剂。在一些实施方式中，所述二硫键活化剂是二硫二吡啶。本领域的技术人员可以通过各种方法获得上述含有活性基团R_x1或R_x1’的亚磷酰胺单体，在一些实施方式中，所述含有活性基团R_x1或R_x1’的亚磷酰胺单体是商购得到的，例如可以通过商购得到如式(105)所示的亚磷酰胺单体。

其中n₁₀₅和m₁₀₅各自独立地是1-10的整数。

本领域的技术人员可以通过各种方式获得所述包含活性基团R_x2和诊断剂基团的化合物。在一些实施方式中，所述偶联反应条件是巯基-二硫键交换反应条件，所述活性基团R_x2包含巯基，所述包含活性基团R_x2和诊断剂基团的化合物可以由本领域技术人员按照各种已知的方式获得，例如通过使用包含巯基的亚磷酰胺单体通过亚磷酰胺固相合成方法制备获得，或者商购获得。在一些实施方式中，所述偶联反应条件是亚磷酰胺固相合成反应条件，所述活性基团R_x2是亚磷酰胺基团，所述包含活性基团R_x2和诊断剂基团的化合物可以是例如容易商业订制获得或者通过核酸固相合成方法获得的包含亚磷酰胺基团和诊断剂基团的化合物。在一些实施方式中，在一些实施方式中，所述偶联反应条件是Michael加成反应条件，所述活性基团R_x2是N-琥珀酰亚胺基团，所述包含活性基团R_x2和诊断剂基团的化合物可以是例如容易商业订制获得或者通过核酸固相合成方法获得的包含N-琥珀酰亚胺基团和诊断剂基团的化合物。其中，可例如通过使用容易商购获得的N-琥珀酰亚胺基团的亚磷酰胺单体，经亚磷酰胺固相合成方法将N-琥珀酰亚胺基团连接至诊断剂。包含在一些 实施方式中，所述活性基团R_x1与活性基团R_x2分别是核苷酸序列I和核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II各自包含5-25个修饰或未修饰的核苷酸，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补，所述递送基团连接至所述核苷酸序列I，所述诊断剂基团连接至所述核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II在受试者体内不引发免疫反应或毒性反应，所述偶联反应条件是退火形成核酸双链的反应条件。在一些实施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II均由17个核苷酸组成并且完全反向互补。在一些实施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II分别具有SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41所示的序列。在一些实施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II分别具有SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43所示的序列。

递送基团由适配体去除一个或多个氢原子或官能团形成。在一些实施方式中，所述连续的核苷酸序列的5'末端核苷酸的核糖5'基团以及3'末端核苷酸的核糖3'基团均为羟基，递送基团由前述适配体在5'末端核苷酸的5'羟基中去除一个氢原子形成；在一些实施方式中，递送基团由前述适配体在3'末端核苷酸的3'羟基中去除一个氢原子形成；在一些实施方式中，递送基团由本公开所述的适配体在5'末端核苷酸中去除5'羟基形成；在一些实施方式中，递送基团由本公开所述的适配体在3'末端核苷酸中去除3'羟基形成。在一些实施方式中，递送基团由本公开所述的适配体在其包含的核苷酸中去除核糖2'-羟基形成。所述适配体可以通过本领域常规的适配体制备方法(例如核酸固相合成和液相合成的方法)得到。其中，核酸固相合成已经有商业化订制服务。可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的适配体中，制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入适配体的方法也是本领域技术人员所熟知的。所有修饰的核苷单体均可以商购得到或者采用已知方法制备得到。

在一些实施方式中，所述缀合物还可以其药学上可接受的盐或前体化合物的形式用于本公开。在本公开的上下文中，“药学上可接受的盐”是指为了增加药物的稳定性、溶解性和/或生物利用度而将药物形成相应的在药学上不对人体产生额外副作用的盐，例如钾盐、钠盐、羧酸盐等。 “前体化合物”是指尽管其本身与所述缀合物结构和功能上都不完全相同，但在进入体内之后或在体液环境下能够发生反应、形成所述包含本公开提供的缀合物、从而发挥效果、实现本公开的目的的化合物。某些情况下，这些前体化合物能够增加药物的稳定性、延长缓释时间、增加生物利用度等作用。在一些实施方式中，所述前体化合物包括可在人体内反应形成缀合物中全部诊断剂基团A₀的前体基团。在一些实施方式中，所述前体化合物包括缀合物中全部活性羟基被乙酰氧基取代形成的化合物。在一些实施方式中，所述前体化合物包括药物前体基团，所述药物前体基团是由缀合物中所述诊断剂基团的前体化合物形成的残基。在一些实施方式中，所述药物前体基团可以是例如所述诊断剂基团中羟基或氨基官能团中的活性氢被酰基、烷基、或者磷酰基取代而形成的基团。本领域技术人员可以理解，这些药学上可接受的盐以及前体化合物的应用同样处于本公开的范围之内。

药物组合物

在一方面，本公开还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本公开提供的缀合物，以及药学上可接受的载体。

所述药学上可接受的载体可以是本领域常规使用的载体，例如但不限于水、生理盐水、磁性纳米粒(magnetic nanoparticles，如基于Fe₃O₄或Fe₂O₃的纳米粒)、碳纳米管(carbon nanotubes)、介孔硅(mesoporous silicon)、磷酸钙纳米粒(calcium phosphate nanoparticles)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)、聚酰胺型树形高分子(polyamidoamine(PAMAM)dendrimer)、聚赖氨酸(poly(L-lysine)，PLL)、壳聚糖(chitosan)、1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)、聚D型或L型乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(D&L-lactic/glycolic acid)copolymer，PLGA)、聚(氨乙基乙撑磷酸酯)(poly(2-aminoethyl ethylene phosphate)，PPEEA)和聚(甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯)(poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate)，PDMAEMA)以及它们的衍生物中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述药学上可接受的载体含有生理学可接受的化合物，所述化合物起到例如稳定药物组合物或增加或减少适配体、缀 合物和/或药物组合物的吸收的作用。所述生理学可接受的化合物选自如下化合物中的一种或多种：碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖和/或葡聚糖；抗氧化剂，例如抗坏血酸和/或谷胱甘肽；螯合剂；低分子量蛋白；降低任何共同给药的物质的清除或水解的组合物；赋形剂；稳定剂和缓冲剂。也可以将清洁剂用于稳定组合物或增加或减少药物组合物的吸收。所述生理学可接受的化合物还可以包括湿润剂、乳化剂、分散剂或特别用于防止微生物生长或作用的防腐剂中的一种或多种。所述生理学可接受的化合物是本领域技术人员已知的，本公开不再赘述。本领域技术人员容易理解的是，药学上可接受的载体以及生理学可接受的化合物的选择取决于例如给药途径和任何共同给药的物质的特定生理化学特性。

在一些实施方式中，药学上可接受的载体是无菌的并且通常不含不合需要的物质。本公开的药物组合物可根据需要进一步包含可药用的辅助物质以接近生理学条件，例如pH调节剂和缓冲剂，毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等，药物组合物中的本公开提供的缀合物的浓度可以在大的区间内变化，并且主要依据流体体积、粘度、体重等按照特定的给药方式加以选择。

在一些实施方式中，所述药物组合物中，对缀合物和药学上可接受的载体的含量没有特别要求，在一些实施方式中，缀合物与药学上可接受的载体的重量比可以为1:(1-500)，在一些的实施方式中，上述重量比为1:(1-50)。

在一些实施方式中，所述药物组合物中，还可以包含药学上可接受的其它辅料，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种。例如，所述药学上可接受的其它辅料可以包括pH缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。

所述pH缓冲液可以为pH值7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，例如可以为pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。

所述保护剂可以为肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和葡萄糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述 保护剂的含量可以为0.01-30重量％。

所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克(mOsm/kg)。根据所需渗透压，本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。在一些实施方式中，所述药物组合物所制成的制剂在给药过程中的剂量会因给药方式的不同而发生调整。

在一些实施方式中，所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过穿刺注射、或通过口咽吸入、或鼻腔给药等方式递送所述药物组合物。在一些实施方式中，所述药物组合物用于皮下、肌肉或静脉注射给药。

在一些实施方式中，所述药物组合物可以为脂质体制剂的形式。在一些实施方式中，所述脂质体制剂中使用的药学上可接受的载体包含含胺的转染化合物(下文也可将其称为有机胺)、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质。其中，所述有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质可分别选自于中国专利申请CN103380113A(通过引用的方式将其整体并入本公开)中所描述的含胺的转染化合物或其药学上可接受的盐或衍生物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述有机胺可为中国专利申请CN103380113A中描述的如式(201)所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中：

X₁₀₁和X₁₀₂各自独立地是O、S、N-A或C-A，其中A是氢或C₁-C₂₀烃链；

Y₁₀₁和Z₁₀₁各自独立地是C＝O、C＝S、S＝O、CH-OH或SO₂；

R₁₀₁、R₁₀₂、R₁₀₃、R₁₀₄、R₁₀₅、R₁₀₆和R₁₀₇各自独立地是氢，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链脂族基团，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链杂脂族基团，被取代的或未被取代的、支链或直链酰基，被取代的或未被取代的、支链或直链芳基，被取代的或未被取代的、支链或直链杂芳基；

x是1-10的整数；

n是1-3的整数，m是0-20的整数，p是0或1；其中，如果m＝p＝0，则R₁₀₂是氢；

并且，如果n或m中的至少一个是2，那么R₁₀₃和在式(201)中的氮形成如式(202)或式(203)所示的结构：

其中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，“HCC”代表烃链，且每个*N代表式(201)中的氮原子。

在一些实施方式中，R₁₀₃是多胺。在其它实施方式中，R₁₀₃是缩酮。在一些实施方式中，在式(201)中的R₁₀₁和R₁₀₂中的每一个独立地是任意的被取代的或未被取代的、支链或直链烷基或烯基，所述烷基或烯基具有3至约20个碳原子，诸如8至约18个碳原子，和0至4个双键，诸如0至2个双键。

在一些实施方式中，如果n和m中的每一个独立地具有1或3的值，那么R₁₀₃可以是下述式(204)-式(213)中的任一个：

其中，式(204)-式(213)中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，每个“HCC”代表烃链，且每个*显示R₁₀₃与在式(201)中的氮原子的可能连接点，其中在任意*位置上的每个H可以被替换以实现与在式(201)中的氮原子的连接。

本领域技术人员可以通过任何合理的方法获得式(201)所示的化合物。在一些实施方式中，式(201)所示化合物可以根据中国专利申请CN103380113A中的描述制备。

在一些实施方式中，所述有机胺为如式(214)所示的有机胺和/或如式(215)所示的有机胺：

所述辅助脂质为胆固醇、胆固醇的类似物和/或胆固醇的衍生物；

所述聚乙二醇化脂质为1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]-2000。

在一些实施方式中，所述药物组合物中，所述有机胺、所述辅助脂质和所述聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(19.7-80):(19.7-80):(0.3-50)，例如可以为(50-70):(20-40):(3-20)。

在一些实施方式中，由本公开提供的缀合物与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物颗粒具有约30nm至约200nm的平均直径，通常为约40nm至约135nm，更通常地，该脂质体颗粒的平均直径是约50nm至约120nm、约50nm至约100nm、约60nm至约90nm或约70nm至约90nm，例如，该脂质体颗粒的平均直径是约30、40、50、60、70、75、80、85、90、100、110、120、130、140、150或160nm。

在一些实施方式中，由本公开提供的缀合物与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物中，缀合物与全部脂质(例如有机胺、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质)的重量比(重量/重量比)在从约1:1至约1:50、从约1:1至约1:30、从约1:3至约1:20、从约1:4至约1:18、从约1:5至约1:17、从约1:5至约1:15、从约1:5至约1:12、从约1:6至约1:12或从约 1:6至约1:10的范围内，例如，本公开提供的缀合物与全部脂质的重量比为约1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17或1:18。

在一些实施方式中，所述药物组合物在销售时各组分可以独立存在，在使用时可以液体制剂的形式存在。在一些实施方式中，本公开提供的缀合物与上述药学上可接受的载体形成的药物组合物可以按照已知的各种方法制备，只是用本公开提供的缀合物替代现有缀合物即可；在一些实施方式中，可以按照如下方法制备：

将有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质按照上述摩尔比悬浮于醇中并混匀得到脂质溶液；醇的用量使得到的脂质溶液的总质量浓度为2-25mg/mL，例如可以为8-18mg/mL。所述醇选自药学上可接受的醇，诸如在室温附近为液体的醇，例如，乙醇、丙二醇、苯甲醇、甘油、聚乙二醇200，聚乙二醇300，聚乙二醇400中的一种或多种，例如可以为乙醇。

将本公开提供的缀合物溶解于缓冲盐溶液中，得到缀合物水溶液。缓冲盐溶液的浓度为0.05-0.5M，例如可以为0.1-0.2M，调节缓冲盐溶液的pH至4.0-5.5，例如可以为5.0-5.2，缓冲盐溶液的用量使缀合物的浓度不超过0.6mg/mL，例如可以为0.2-0.4mg/mL。所述缓冲盐选自可溶性醋酸盐、可溶性柠檬酸盐中的一种或多种，例如可以为醋酸钠和/或醋酸钾。

将脂质溶液和缀合物水溶液混合，将混合后得到的产物在40-60孵育至少2分钟，例如可以为5-30分钟，得到孵育后的脂质体制剂。脂质溶液和缀合物水溶液的体积比为1:(2-5)，例如可以为1:4。

将孵育后的脂质体制剂浓缩或稀释，去除杂质，除菌，得到本公开提供的药物组合物，其理化参数为pH值为6.5-8，包封率不低于80％，粒径为40-200nm，多分散指数不高于0.30，渗透压为250-400mOsm/kg；例如理化参数可以为pH值为7.2-7.6，包封率不低于90％，粒径为60-100nm，多分散指数不高于0.20，渗透压为300-400mOsm/kg。

其中，浓缩或稀释可以在去除杂质之前、之后或同时进行。去除杂 质的方法可以采用现有各种方法，例如可以使用切相流系统、中空纤维柱，在100K Da条件下超滤，超滤交换溶液为pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。除菌的方法可以采用现有各种方法，例如可以在0.22μm滤器上过滤除菌。

本公开提供的缀合物的应用

在又一方面，本公开还提供了本公开所述的缀合物和/或药物组合物在制备用于对肿瘤及肿瘤相关疾病或症状进行诊断的药物中的应用。

在又一方面，本公开还提供了一种对肿瘤及肿瘤相关疾病或症状进行诊断的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予有效量的本公开所述的缀合物和/或药物组合物。

通过给予本公开所述的缀合物和/或药物组合物，本公开的方法能够有效诊断肿瘤及肿瘤相关疾病或症状；并且，在本公开所述缀合物的高特异性靶向作用下，可以减少诊断剂在不期望的身体其它器官/组织处的分布，降低潜在的副反应。在一些实施方式中，所述药物可用于在体外实验中对待测样品中的肿瘤细胞/组织进行诊断。在一些实施方式中，所述药物可用于在受试者体内对肿瘤细胞/组织进行诊断。在一些实施方式中，所述药物可用于对受试者体内的肿瘤或肿瘤相关疾病以及症状进行治疗。

本公开所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将适配体和/或缀合物和/或药物组合物定位于期望的位点以产生期望效果的方法或途径，将适配体和/或缀合物和/或药物组合物放置入受试者体内。适于本公开方法的给药途径包括局部给药和全身给药。一般而言，局部给药导致与受试者整个身体相比将更多适配体和/或缀合物和/或药物组合物递送至特定位点；而全身给药导致将所述适配体和/或缀合物和/或药物组合物递送至受试者的基本整个身体。

进一步地，本公开的发明人意外地发现，本公开的适配体和/或缀合物和/或药物组合物能够高效地通过血脑屏障，在全身给药的情况下就能够靶向至脑内的肿瘤中，从而进一步提高诊断剂基团的递送效率、节省成本并降低不期望的副反应。

可通过本领域已知的任何合适途径向受试者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，如静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。给药频率可以是每天、每周、每两周、每三周、每个月或每年1次或多次。

本公开所述的适配体和/或缀合物和/或药物组合物的使用剂量可为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其是受试者的年龄、体重和性别来确定。可在细胞培养或实验动物中通过标准药学程序测定毒性和疗效，例如测定LD50(使50％的群体致死的剂量)和ED50(在量反应中指能引起50％最大反应强度的剂量，在质反应中，指引起50％实验对象出现阳性反应时的剂量)。可基于由细胞培养分析和动物研究得到的数据得出人用剂量的范围。

在给予本公开所述的适配体和/或缀合物和/或药物组合物时，例如，对于雄性或雌性、6-12周龄、体重18-25g的C57BL/6J或C3H/HeNCrlVr小鼠，以所述适配体和/或缀合物和/或药物组合物中的缀合物的量计：对于缀合物与药学上可接受的缀合分子形成的缀合物，其适配体和/或缀合物用量可以为0.001-100mg/kg体重，在一些实施方式中为0.01-50mg/kg体重，在进一步的实施方式中为0.05-20mg/kg体重，在更进一步的实施方式中为0.1-15mg/kg体重，在又进一步的实施方式中为0.1-10mg/kg体重。在给予本公开所述的适配体和/或缀合物和/或药物组合物时，可优选上述用量。

试剂盒

本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本公开提供的缀合物和/或药物组合物。

在一些实施方式中，本公开所述的试剂盒可在一个容器中提供适配体和/或缀合物和/或药物组合物。在一些实施方式中，本公开所述的试剂盒可包含一个提供药学上可接受的赋形剂的容器。在一些实施方式中，所述试剂盒中还可包含其它成分，如稳定剂或防腐剂等。在一些实施方式中，本公开所述的试剂盒可在不同于提供本公开所述适配体和/或缀合 物和/或药物组合物的容器以外的其它容器中包含至少一种其它治疗剂。在一些实施方式中，所述试剂盒可包含用于将适配体和/或缀合物和/或药物组合物与药学上可接受的载体和/或辅料或其它成分(若有的话)进行混合的说明书。

在本公开的试剂盒中，所述适配体和/或缀合物和药学上可接受的载体和/或辅料以及所述药物组合物，和/或药学上可接受的辅料可以任何形式提供，例如液体形式、干燥形式或冻干形式。在一些实施方式中，所述适配体和/或缀合物和药学上可接受的载体和/或辅料以及所述药物组合物和任选的药学上可接受的辅料基本上纯净和/或无菌。在一些实施方式中，可在本公开的试剂盒中提供无菌水。

下面将通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。

实施例

除非特别说明，以下实施例中所用到的试剂、培养基均为市售商品，所用到的核酸电泳、real-time PCR等操作均参照Molecular Cloning(Cold Spring Harbor LBboratory Press(1989))所记载的方法进行。

制备例1-9和12本公开提供的缀合物的合成

通过固相合成方法分别合成了表1中编号为AP1-AP8和AP12的缀合物，并且，在分别按照表1中AP1-AP8和AP12对应的核苷酸序列从3'-5'方向依次连接全部核苷单体后，再按照固相合成方法连接核苷亚磷酰胺单体的方式连接Cy5亚磷酰胺单体(购自苏州吉玛公司，批号CY5P21H1B)。随后，将核苷酸序列加入甲胺水溶液与氨水等体积混合溶液中，溶液相对于缀合物的用量为0.5ml/μmol，在25℃下反应2h，过滤除去固体，将上清液真空浓缩至干。

利用制备型离子色谱纯化柱(Source 15Q)，通过NaCl水溶液的梯度洗脱，完成制备的缀合物的纯化。具体而言为：洗脱剂A：20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱剂B：1.5M氯化钠，20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱梯度：洗脱剂A:洗脱剂B＝100:0-50:50梯度洗脱。收集产品洗脱液后合并，采用反 相色谱纯化柱进行脱盐，具体条件包括采用葡聚糖凝胶柱进行脱盐，填料为葡聚糖凝胶G25，以去离子水洗脱。将获得的洗脱液浓缩除去溶剂并冻干，分别获得了5'末端连接荧光基团Cy5的缀合物AP1-AP8。其中荧光基团Cy5通过磷酸二酯键连接至连续核苷酸序列5'末端核苷酸的核糖5'端。

按照同样的方法，制备获得5'末端核苷酸的核糖5'位通过磷酸酯基连接基团连接荧光基团Cy3的缀合物AP9，区别仅在于，按照表1中AP9对应的核酸序列依次连接核苷单体，并使用Cy3亚磷酰胺单体(购自上海兆维公司，货号OP-038)代替Cy5亚磷酰胺单体进行制备。

在上述缀合物AP1-AP9和AP12合成完成后，使用超纯水(Milli-Q超纯水仪自制，电阻率18.2MΩ*cm(25))将制备获得的缀合物稀释至浓度为0.2mg/mL后，利用液质联用仪(LC-MS，Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，购于Waters公司，型号：LCT Premier)进行分子量检测。其结果，分子量实测值与理论值一致，表明获得了目标缀合物。

对比制备例10、11、13和14对比缀合物的合成

按照制备例1-8和12的方法，分别合成了表1中编号为对比AP10、对比AP11、对比AP13和对比AP14的缀合物，区别仅在于，分别按照表1中对应于对比AP10、对比AP11、对比AP13和对比AP14的序列，依次连接核苷单体。从而，分别获得了5'末端核苷酸的核糖5'位通过磷酸酯基连接基团连接荧光基团Cy5的对比缀合物对比AP10、对比AP11、对比AP13和对比AP14。其中，对比AP10和对比AP11分别是具有不同序列或修饰方案的阴性对照缀合物，其适配体序列具有一定随机性并且与本公开提供的适配体几乎不具有序列同源性。对比AP13和对比AP14分别是序列分别与缀合物AP2和AP4仅存在少量核苷酸差异的对比缀合物。具体来说，对比AP13与AP2相比，5'末端多了两个核苷酸G和A、3'末端少一个核苷酸C，并且链内在对应于AP2的5'端起算第17-18个核苷酸的位置处缺失了一个核苷酸U；对比AP14与AP4相比，5'末端多了两个核苷酸G和A、3'末端少一个核苷酸U，并且链内在对应于AP2的5'端起算第17-18个核苷酸的位置处缺失了一个核苷酸U。

表1缀合物的核苷酸序列

表1中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示该字母s左右两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；CY3和CY5分别表示荧光染料基团Cy3(Cyanine 3)和Cy5(Cyanine 5)基团在核苷酸序列上的连接位置。

制备例21-26本公开提供的缀合物AP21-AP26的合成

按照制备例1-8和12的方法，分别合成了表2中编号为AP21-AP26的缀合物并检测分子量以对合成的缀合物进行确认，区别仅在于，分别按照表2中对应于AP21-AP26的序列，依次连接核苷单体。从而，分别获得了5'末端核苷酸的核糖5'位通过磷酸酯基连接基团连接荧光基团 Cy5的缀合物AP21-AP26。其中，AP21与前述AP4相比，在3'末端减少1个核苷酸；AP22与前述AP4相比，是对应于式(1)中S₁和S₄基序各减少1个核苷酸所示的结构；AP23是AP22对应于式(1)中S₁基序再减少1个核苷酸所示的结构；AP24是AP4改变5'末端前2个核苷酸获得的缀合物；AP25和AP26与前述AP4相比，是对应于式(1)中N_b基序发生改变获得的缀合物。

在上述缀合物AP11-AP26合成完成后，使用超纯水(Milli-Q超纯水仪自制，电阻率18.2MΩ*cm(25))将制备获得的缀合物稀释至浓度为0.2mg/mL后，利用液质联用仪(LC-MS，Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，购于Waters公司，型号：LCT Premier)进行分子量检测。其结果，分子量实测值与理论值一致，表明获得了目标缀合物。

缀合物AP11-AP26的MS理论值和MS实测值值如下表2-a：

表2-a缀合物的分子量检测结果

对比制备例27-35对照缀合物对比AP27-对比AP35的合成

按照制备例1-8和12的方法，分别合成了表2中编号为对比AP27-对比AP35的缀合物，并检测分子量以对合成的缀合物进行确认，区别仅在于，分别按照表2中对应于对比AP27-对比AP35的序列，依次连接核苷单体。从而，分别获得了5'末端核苷酸的核糖5'位通过磷酸酯基连接基团连接荧光基团Cy5的对比AP27-对比AP35。其中，对比AP27和对比AP28是序列碱基组成与AP4相同、但核苷酸排列顺序不同的对照缀合物；对比AP29和对比AP30是序列碱基组成与AP2相同，但核苷酸排列顺序不同的对照缀合物；对比AP31与对比AP4相比，在5'末端少2个核苷酸、在3'末端少1个核苷酸；对比AP32与对比AP4相比，对应于式(1)中 缺失了N_b基序；对比AP33与AP4相比，对应于式(1)中缺失了N_a和N_c基序；对比AP34和对比AP35相比，是在S2和S3基序部分各增加了多个核苷酸且改变部分序列的对照缀合物。

上述各缀合物中，诊断剂基团Cy3或Cy5连接至核苷酸序列的5'末端核苷酸的核糖5'端。

表2缀合物的核苷酸序列

表2中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；CY5表示荧光染料基团Cy5(Cyanine 5)基团在核苷酸序列上的连接位置。

在上述对比AP27-对比AP35合成完成后，使用超纯水(Milli-Q超纯水仪自制，电阻率18.2MΩ*cm(25))将制备获得的缀合物稀释至浓度为0.2mg/mL后，利用液质联用仪(LC-MS，Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，购于Waters公司，型号：LCT Premier)进行分子量检测。其结果，分子量实测值与理论值一致，表明获得了目标缀合物。

对比AP27-对比AP35的MS理论值和MS实测值值如下表2-b：

表2-b缀合物的分子量检测结果

实验例1本公开提供的缀合物及对照缀合物在体外进入U118-MG胶质瘤细胞能力的评价比较

本实验例中，对缀合物AP1和对照缀合物对比AP10在体外进入U118-MG胶质瘤细胞的能力进行了评价和比较。

在添加有10％的胎牛血清(FBS，Thermo Fisher公司)的DMEM培养基(Thermo Fisher公司)中，于37℃在含5％CO₂/95％空气的培养箱中培养U118MG神经胶质瘤细胞(购自中科院上海细胞库)。

将U118MG细胞以5×10⁵细胞/孔接种于96孔板中。用DMEM培养基将前述制备的缀合物AP1和酵母tRNA分别配制成缀合物溶液1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H和1I，该缀合物溶液1A-1I中含有终浓度为100μg/mL的酵母tRNA，并且分别含有终浓度依次为5nM、10nM、20nM、40nM、60nM、80nM、100nM、150nM、200nM和500nM的缀合物AP1。

用DMEM培养基将前述制备的对照缀合物对比AP10和酵母tRNA 分别配制成缀合物溶液1A'、1B'、1C'、1D'、1E'、1F'、1G'、1H'和1I'，该缀合物溶液1A'-1I'中含有终浓度为100μg/mL的酵母tRNA，并且分别含有终浓度依次为5nM、10nM、20nM、40nM、60nM、80nM、100nM、150nM、200nM和500nM的对照缀合物对比AP10。

向前述含有U118MG细胞的培养孔中，分别加入上述缀合物溶液1A-1I，加入量为200μL/孔，依次记为测试组1A-测试组1I。向前述含有U118MG细胞的培养孔中，分别加入上述缀合物溶液1A'-1I'，加入量为200μL/孔，依次记为对照组1A'-对照组1I'。在另一含有U118MG细胞的培养孔中加入含有终浓度为100μg/mL的酵母tRNA的DMEM培养基200μL，记为空白对照组1J。将含有上述各测试组和空白对照组的96孔板在37℃下避光孵育1h，孵育结束后，对每一测试组和空白对照组中的反应混合物，分别吸去上清液并加入DPBS缓冲液(购自Thermo Fisher公司)洗涤3次，每次100μL。吸去洗涤液后，每一培养孔加入100μL DMEM培养基获得细胞悬液。离心除去上清液，随后加入500μL DPBS缓冲液重悬细胞，使用流式细胞仪(BD Biosciences公司)进行流式细胞分析，每一测试组或空白对照组分析10000个细胞，测定荧光强度分布并计算平均荧光强度(MFI，a.u.)。进一步地，将各缀合物终浓度对应的平均荧光强度(MFI，a.u.)列于以下表3中进行对比，并按照以下公式计算相对荧光差值R：R＝(MFI_AP1-MFI_CAP10)/MFI_CAP10

其中MFI_AP1表示缀合物AP1在U118-MG胶质瘤细胞中的平均荧光强度，MFI_CAP10表示对比AP10在U118-MG胶质瘤细胞中的平均荧光强度。R值反映缀合物AP1进入U118-MG胶质瘤细胞的相对能力，当R>2时，提示对应缀合物进入细胞的能力较强(参见Engineering of Targeted Nanoparticles for Cancer Therapy Using Internalizing Aptamers Isolated by Cell-Uptake Selection.ACS Nano.2012 January 24；6(1)在其表2中的记载，以引用的方式将该文献的全部公开内容并入本文)。

表3缀合物平均荧光强度及R值

从表3中可见，在不同浓度下，与随机序列的对比AP10相比，本公开提供的缀合物AP1在U118MG胶质瘤细胞中均显示出显著更高的平均荧光强度，表明本公开提供的缀合物具有优异的进入U118MG胶质瘤细胞的能力。

实验例2荧光成像系统观察缀合物进入不同细胞情况

在本实验中，使用PerkinElmer高内涵成像系统(Operatta公司)对本公开提供的缀合物AP1与对比缀合物对比AP10进入不同细胞的情况进行了观察。

U118MG胶质瘤细胞、SVGp12正常星形胶质细胞、T98G人脑胶质瘤细胞、U251人胶质瘤细胞、A549人非小细胞肺癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞和293T人肾上皮细胞均购自中科院上海细胞库。在实验前，对每一细胞系，选取对数生长的细胞，以每孔5000个细胞接种于96孔板中，每一细胞系接种2个培养孔，于37℃在含5％CO₂/95％空气的培养箱中培养24h。吸出上清液，加入DPBS缓冲液(购自Thermo Fisher公司)洗涤2次，每次100μL。

用DMEM培养基将前述制备的缀合物AP1和酵母tRNA分别配制成适配体溶液2A，该缀合物溶液2A中含有终浓度为100μg/mL的酵母tRNA和终浓度为100nM的缀合物AP1；

用DMEM培养基将前述制备的对照缀合物对比AP10和酵母tRNA分别配制成对照缀合物溶液2B，该对照缀合物溶液2B中含有终浓度为100μg/mL的酵母tRNA和终浓度为100nM的对比AP10；

对于每一细胞系，在1个培养孔中加入200μL缀合物溶液2A，在37℃下避光孵育30分钟，吸出上清液，加入DPBS缓冲液洗涤2次，每 次100μL，得到测试组2X；

对于每一细胞系，在另1个培养孔中加入200μL对照缀合物溶液2B，在37℃下避光孵育30分钟，吸出上清液，加入DPBS缓冲液洗涤2次，每次100μL，得到对照组2Y。

对上述各细胞系的测试组2X和对照组2Y，分别加入100μL 37℃DMEM培养基，在高内涵成像系统中成像。按照对照组2Y的平均荧光强度归一化，即测试组的2X荧光强度减去对照组2Y的平均荧光强度后进行成像。结果分别示于图1A-图1G中。

图1A和图1B分别是示出了AP1和对比AP10进入U118MG胶质瘤细胞和SVGp12正常星形胶质细胞的高内涵成像图。由图1A和1B中可见，仅在经AP1处理的U118MG细胞中显示出了强烈的Cy5荧光信号，而在SVGp12细胞中测试组和对照组均无任何荧光信号，表明与对比AP10相比，本公开提供的缀合物具有很强的进入U118MG胶质瘤细胞的能力，同时基本不进入SVGp12正常星形胶质细胞。上述结果也表明，本发明提供的缀合物能够将诊断剂基团选择性地靶向递送至U118MG胶质瘤细胞。

进一步地，图1C-1G依次分别是示出了AP1和对比AP10进入U251人胶质瘤细胞、A549人非小细胞肺癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞和293T人肾上皮细胞高内涵成像图。由图1C-1G中可见，在经AP1处理的U251人胶质瘤细胞、A549人非小细胞肺癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞中均显示出强烈的Cy5荧光信号，而上述各组经对比AP10处理的肿瘤细胞以及293T人肾上皮细胞中测试组和对照组均无任何荧光信号，表明与对比AP10相比，本公开提供的缀合物具有很强的进入各种肿瘤细胞的能力，同时不进入正常细胞，本发明提供的缀合物能够将诊断剂基团选择性地靶向递送至各种肿瘤细胞。

实验例3荧光成像系统观察缀合物进入肿瘤球的情况

在本实验中，使用PerkinElmer高内涵成像系统(Operatta公司)对本公开提供的缀合物AP1与对比缀合物对比AP10进入U118MG胶质瘤肿瘤球和A549人非小细胞肺癌肿瘤球的情况进行了观察。

在96孔板的培养孔中，加入80μL新鲜灭菌且未凝固的2％琼脂糖，待完全凝固后，对每一细胞系，选取对数生长的细胞，以每孔2000个细胞接种于96孔板中，每一细胞系接种2个培养孔，每孔200μL细胞悬液，以添加有10％FBS和1％青霉素双抗的DMEM培养基培养，于37℃在含5％CO₂/95％空气的培养箱中培养。每隔48h吸出一半上清液，并贴培养孔壁加入新的DMEM培养基。培养7天后，于镜下观察确认获得完整的细胞球，表明肿瘤球培养成功。

按照实验例2的方法向各培养孔中加入AP1或对比AP10，并在高内涵成像系统中成像，区别仅在于，在培养后不进行洗涤，直接进行成像；并且按照Cy5荧光实测强度进行成像。结果参见图2A和2B所示。

图2A和2B依次分别是示出了AP1和对比AP10进入U118MG胶质瘤肿瘤球和A549人非小细胞肺癌肿瘤球的高内涵成像图。由图2A和2B中可见，在经AP1处理的U118MG肿瘤球和A549肿瘤球中内部中显示出了强烈的Cy5荧光信号，而在对比AP10处理的肿瘤球中，仅在肿瘤球边缘显示出明显较弱的荧光信号，表明与对比AP10相比，本公开提供的缀合物具有很强的进入U118MG和A549肿瘤球内部的能力。上述结果说明，本公开提供的适配体能够将诊断剂基团有效递送至肿瘤内部，具有较高的诊断剂药物成药能力。

实验例4缀合物在U118MG细胞皮下瘤模型小鼠体内分布

在添加有10％的胎牛血清(FBS，RMBIO公司)的DMEM完全培养基(MACGENE公司，货号CM15019)中，于37在含5％CO₂/95％空气的培养箱中培养U118MG人胶质瘤细胞(购自广州吉妮欧生物科技有限公司)。

取对数期生长的U118MG人胶质瘤细胞，以(0.25％的胰酶)消化，收集细胞，离心去上清，将细胞重悬于添加10％FBS的DMEM培养基中制成浓度为1×10⁸cells/mL的细胞培养液。

实验动物NOD-SCID小鼠10只(购自斯贝福(北京)生物技术有限公司)，雄性，12周龄。将上述细胞培养液接种于NOD-SCID小鼠右前肢皮下位置，接种体积为每只100μL，即，每只小鼠接种1×10⁷个细胞。注射 后继续饲养小鼠20天。

用1×DMEM(购自中科迈晨(北京)科技有限公司，批号为K1902200)培养基将AP1、AP2和对比AP11分别溶解成0.3mg/mL浓度(以适配体计)的溶液。

将上述接种U118MG的小鼠随机分为3组，每组4只；对于每组的4只小鼠，分别按10μL/g体重计算给药体积，采取尾静脉注射的方式，向不同组小鼠分别给予AP1、AP2和对比AP11，分别记为测试组4A1、测试组4A2和对照组4A3。从而，每只小鼠的给药剂量均为3mg/kg(按适配体计)。向另外1只上述接种U118MG的小鼠尾静脉注射1×DMEM培养基，给药体积为10μL/g体重，记为空白对照组4Y。

给药后1h时，依次将各组小鼠放置于小动物活体光学成像系统IVIS Lumina Series III(PerkinElmer)中，采用异氟烷气体麻醉小鼠，将麻醉后的小鼠腹部朝上放置于小动物活体光学成像系统中进行活体成像。给药后1h、4h、24h和48h时，分别将各组中的1只小鼠处死，取肿瘤组织进行荧光成像(24h和48h结果未做空白对照组)，结果分别参见图3A、3B、3C和3D所示。

图3A-3D依次分别是示出了给药后1h、4h、24h和48h时的活体成像及肿瘤组织成像图，其中blank表示空白对照组4Y。从图3A-3D可以看出，空白对照组4Y和给予具有随机序列的对比AP11的对照组4A3在小鼠体内基本不显示或仅显示较弱的荧光信号；与此不同，本公开提供的缀合物AP1和AP2在小鼠体内接种肿瘤处显示出强烈的荧光信号，表明本公开提供的适配体能够特异性地将荧光基团靶向递送至U118MG胶质瘤；进一步地，缀合物AP2在给药后24h至48h时仍显示出较强的荧光信号，表明本公开提供的缀合物在较长时间内均能够稳定靶向胶质瘤组织。

实验例5缀合物在U118MG细胞原位瘤模型小鼠体内分布

取对数期生长的如实验例4中培养的U118MG人胶质瘤细胞，以0.25wt％胰酶消化并收集细胞，吸去上清并将细胞重悬于添加10％FBS的DMEM培养基中制成细胞密度为4×10⁷cells/mL的细胞培养液。

实验动物NOD-SCID小鼠16只(购自斯贝福(北京)生物技术有限公 司)，雄性，12周龄。将上述细胞培养液接种于NOD-SCID小鼠中，采用小鼠侧脑室注射方式，将细胞培养液注射于小鼠右侧纹状体，位置为AP(anteroposterior前后/正位):1mm，ML(medial lateral内侧):1.5mm,DV(dorsal ventral背腹侧):3.5mm，注射体积10μL，即，每只小鼠接种4×10⁵个细胞。注射后继续饲养小鼠14天。

用1×DMEM(购自中科迈晨(北京)科技有限公司，批号为K1902200)培养基将AP1、AP2和对比AP11分别溶解成2mg/mL浓度(以适配体计)的缀合物溶液。取10只前述小鼠，通过鞘内注射给药方式分别注射50μL的AP1和AP2溶液，以适配体的量计，每只动物给药量为100μg，每组给予3只小鼠，分别记为测试组5A、5B；向2只小鼠中的每一只分别注射50μL的对比AP11溶液，以适配体的量计，每只动物给药量为100μg，记为对照组5C；向2只小鼠中的每一只分别注射50μL的DMEM培养基，记为空白对照组5Y。

用1×DMEM培养基将AP1、AP2和对比AP11分别溶解成0.3mg/mL浓度(以适配体计)的缀合物溶液。取另外6只前述小鼠，通过尾静脉注射给药，分别注射AP1、AP2和对比AP11溶液，所有动物根据体重计算给药剂量，给药体积均为10μL/g，以适配体的量计，每只动物给药量为3mg/kg，每组给予2只小鼠，分别记为测试组5D、5E和对照组5F。

在给药后24h时，分别杀死各组小鼠中的一只并取脑组织，给药后48h时杀死剩余小鼠并取脑组织，在IVIS Lumina Series III中对小鼠脑组织进行荧光成像。结果分别参见图4A和4B所示。

图5A和5B分别是示出了给药后24h和48h时，给予空白对照组5Y、测试组5A、5B、5D和5E以及对照组5C和5F后建立U118MG原位瘤模型小鼠脑组织的荧光成像图。从图4A和图4B的结果可以看出，空白对照组和对比AP11的对照组均未显示出肿瘤位置处的明显荧光信号，表明对原位脑胶质瘤没有显著靶向效果；与此不同，给予本公开提供的缀合物的测试组5A和5B在接种肿瘤位置显示出强的荧光信号，表明能够有效靶向肿瘤组织，并且表明本公开提供的适配体能够将诊断剂基团如荧光基团有效递送至肿瘤组织；进一步地，测试组5E在24h和48h时均显示出明显荧光 信号，表明缀合物AP2在尾静脉给药时仍能到达并靶向脑胶质瘤，说明本公开提供的缀合物还可以穿透血脑屏障(Blood-Brain-Barrier，BBB)进入脑胶质瘤。

实施例6不同修饰缀合物在U118MG皮下瘤模型小鼠体内分布

按照实验例4描述的方法制备获得U118MG皮下瘤模型小鼠。

用1×DMEM培养基将AP2、AP3和AP12分别溶解成0.3mg/mL浓度(以适配体计)的缀合物溶液。将9只小鼠分为3组，每组3只，向各组的每只小鼠分别尾静脉注射上述AP2、AP3和AP12溶液，所有动物根据体重计算给药剂量，给药体积均为10μL/g，以适配体的量计，每只动物给药量为3mg/kg，3组小鼠依次分别记为测试组6A、测试组6B以及测试组6C。向另外2只小鼠给予DMEM培养基，给药体积为为10μL/g，记为空白对照组6Y。分别于给药后30min、1h、24h、48h将各组小鼠中的1只放置于小动物活体光学成像系统IVIS Lumina Series III(PerkinElmer)中，采用异氟烷气体麻醉小鼠，将麻醉后的小鼠腹部朝上放置于小动物活体光学成像系统中进行活体成像。结果见图5A-5D所示。在给药后第10天，将空白对照组6Y和测试组6A的1只小鼠进行活体成像，结果如图5E所示；在给药后24h和48h时，分别将各组中的1只小鼠处死，取肿瘤组织进行荧光成像，结果分别如图5F和图5G所示。在给药后第10天处死空白对照组6Y和测试组6A的1只小鼠，取肿瘤组织进行荧光成像，结果如图5H所示。图5A-5H中，Blank表示空白对照组6Y。

图5A-5E分别是示出给予不同序列的本公开提供的缀合物以及对比缀合物后，不同时间点的小鼠体内荧光成像图；图5F-5H分别是不同时间点的肿瘤组织成像图。图5A-5H的结果表明：在给药后30min，各测试组和对照组皮下瘤均可见荧光信号；给药后4h-24h，给予本公开提供的AP2、AP3和AP12的测试组6A、6B和6C小鼠中仍显示出较高的荧光强度；给药后48h-第10天时，给予AP2的测试组6A小鼠仍显示出强的荧光信号。上述结果表明，与对照缀合物相比，本公开提供的缀合物能够在长时间内稳定地靶向肿瘤组织，并且说明本公开提供的缀合物能够在长时间内稳定地将诊断剂基团靶向递送至肿瘤。

实验例7缀合物在A549皮下瘤模型小鼠中的体内分布

按照实验例4描述的方法制备获得A549人非小细胞肺癌细胞皮下瘤模型小鼠，区别仅在于，使用A549人非小细胞肺癌细胞代替U118MG胶质瘤细胞制备细胞培养液。

选取11只6-8周龄的NOD-SCID雄性小鼠(购自斯贝福(北京)生物技术公司)，随机分组，其中，空白对照组2只小鼠，其余每组3只小鼠。取上述含有A549肿瘤细胞的培养基分别接种于小鼠右前肢皮下位置，每只小鼠接种A549肿瘤细胞的体积为100μL，从而计算可知，每只小鼠接种细胞数为1×10⁷个。

用1×DMEM(购自中科迈晨(北京)科技有限公司，批号为K1902200)培养基将AP2、AP3和AP12分别溶解成0.3mg/mL浓度(以适配体计)的缀合物溶液。在上述A549肿瘤细胞接种21天时，分别向每只小鼠尾静脉注射1×DMEM以及上述配制的AP2、AP3和AP12缀合物溶液，且分别将注射1×DMEM、AP2、AP3和AP12缀合物溶液的小鼠各自命名为空白对照组、AP2组、AP3组和AP12组。所有动物根据体重计算给药剂量，每只小鼠的给药体积为10μL/g。即，除空白对照组外，其余组中每只小鼠的给药剂量均为3mg/kg(以适配体的量计)；空白对照组仅给予10μL/g DMEM培养基。

在给药后1h和24h时，分别将每组中的1只小鼠处死，并分别取出各只被处死的小鼠的肿瘤组织，在IVIS Lumina Series III中进行荧光成像。将各只小鼠的2个脏器各自依次横向排布，并各自放在同一视野下拍照，结果见图6所示。

图6示出了在给药后1h时，各组中1只小鼠的脏器荧光影像。从图7可以看出，除空白对照组外，在AP2组、AP3组和AP12组的A549肿瘤中均可检测到较强的荧光信号强度，且AP3组的荧光信号强度较其他组的荧光信号强度更强。

由上述结果可知，本公开具有不同修饰的缀合物均能够特异性地靶向至A549肿瘤。

实验例8本公开提供的缀合物进入PAN02肿瘤细胞的能力

本实验例中采用PAN02肿瘤细胞模型，用来验证本公开提供的缀合物进入PAN02肿瘤细胞的能力。

取对数期生长的PAN02肿瘤细胞(购自中科院上海细胞库)，消化重悬于添加有10％胎牛血清的DMEM培养基中，直至PAN02肿瘤细胞的细胞密度达到1×10⁸cells/mL。

选取1只6周龄的C57/BL小鼠(雄性)，取上述含有PAN02肿瘤细胞的培养基接种于小鼠右前肢皮下位置，小鼠接种PAN02肿瘤细胞的体积为100μL，计算可知，小鼠接种细胞数为1×10⁷个。

用1×DMEM(购自中科迈晨(北京)科技有限公司，批号为K1902200)培养基将AP2溶解成0.3mg/mL浓度(以适配体计)的缀合物溶液。在上述PAN02肿瘤细胞接种21天时，向小鼠尾静脉注射AP2缀合物溶液。根据小鼠体重计算给药剂量，以适配体的量计，给药体积为10μL/g，给药剂量为3mg/kg。

在给药后135min时，将小鼠处死，并取出被处死小鼠的心、肝、脾、肺和肿瘤组织，在IVIS Lumina Series III中进行荧光成像，并放在同一视野下拍照，结果见图7所示。

图7是示出了给予本公开提供的缀合物后，建立PAN02皮下瘤模型的小鼠中各器官组织的荧光成像的图。从图7可以看出，PAN02肿瘤细胞中的荧光信号明显强于其他脏器中的荧光信号强度，表明本公开提供的缀合物能够特异性地靶向PAN02胰腺癌肿瘤细胞。

实验例9缀合不同荧光基团的缀合物进入U118MG胶质瘤细胞的能力

本实验例中采用U118MG胶质瘤模型，验证了本公开提供的分别包含CY5-荧光基团和CY3-荧光基团的缀合物对U118MG胶质瘤的进入能力。

取对数期生长的U118MG胶质瘤细胞(购自广州吉妮欧生物科技有限公司)，消化重悬于添加有10％胎牛血清的DMEM培养基中，直至U118MG胶质瘤细胞的细胞密度达到1×10⁸cells/mL。

选取11只6-8周龄的NOD-SCID雄性小鼠(购自斯贝福(北京)生物技术公司)，随机分组，其中，第一组3只小鼠，第二组2只小鼠，第三组 3只小鼠，第四组3只小鼠。取上述含有U118MG胶质瘤细胞的培养基分别接种于小鼠右前肢皮下位置，每只小鼠接种细胞的体积为100μL，从而计算可知，每只小鼠接种细胞数为1×10⁷个。

用1×DMEM(购自中科迈晨(北京)科技有限公司，批号为K1902200)培养基将AP2、AP9和AP12分别溶解成0.3mg/mL浓度(以适配体计)的缀合物溶液。在上述U118MG胶质瘤接种21天时，分别向每只小鼠尾静脉注射1×DMEM以及上述配制的AP2、AP9和AP12缀合物溶液。其中，第一组的3只小鼠注射AP2缀合物溶液，第二组的2只小鼠注射AP9缀合物溶液，第三组的3只小鼠注射AP12缀合物溶液，第四组的3只小鼠注射1×DMEM作为空白对照组。所有动物根据体重计算给药剂量，每只小鼠的给药体积为10μL/g。即，第一组-第三组中每只小鼠的给药剂量均为3mg/kg(以适配体的量计)。

将给药当天记为D1，在给药后48h、96h和11天(D12)时，分别将每组中的1只小鼠处死，并分别取出各只被处死的小鼠的肿瘤、肺、肝和肾组织，在IVIS Lumina Series III中进行荧光成像。将各只小鼠的4个脏器依次纵向排布，并放在同一视野下拍照，结果分别见图8A-8E所示。其中，组一表示给予AP2的测试组，组二表示给予AP9的测试组，组三表示给予AP12的测试组，组四表示空白对照组。

图8A示出了给药后48h时，第一组中的1只小鼠、第三组中的1只小鼠和第四组中的1只小鼠的脏器荧光影像。从图8A可以看出，第三组和第四组中均未检测到荧光信号。同时，在注射AP2的小鼠肿瘤组织中能够检测出显著的荧光信号，且除代谢器官肾脏以外未在其他组织中检测到荧光信号，表明与对比缀合物相比，AP2可有效地靶向递送至肿瘤组织，并且在其他组织中无显著的靶向递送。

图8B示出了给药后96h时，第一组中的1只小鼠、第三组中的1只小鼠和第四组中的1只小鼠的脏器荧光影像。从图8B可以看出，在96h后，AP2在肿瘤组织中仍显示出较显著的荧光信号。

图8C示出了给药后48h时，第二组中的1只小鼠和第四组中的1只小鼠的脏器荧光影像。从图8C可以看出，与对照组相比，在注射Cy3标记 的AP9的小鼠肿瘤组织中能够检测到显著的荧光信号，表明本公开提供的缀合物能高效地将不同的诊断剂基团(如荧光基团)靶向递送至肿瘤组织，本公开提供的包含诊断剂基团的缀合物能够稳定地靶向至肿瘤组织。

图8D示出了给药后96h时，第二组中的1只小鼠和第四组中的1只小鼠的脏器荧光影像。从图8D可以看出，在注射Cy3标记的AP9的小鼠肿瘤组织中能够检测到显著的荧光信号，且除代谢器官肾脏以外未在其他组织中检测到荧光信号。可见，本公开提供的缀合物能够将不同的诊断剂基团(例如不同荧光基团)高效递送至U118MG胶质瘤，并且能在较长时间内保持稳定。

图8E示出了给药后11天时，第一组中的1只小鼠、第三组中的1只小鼠和第四组中的1只小鼠的脏器荧光影像。从图8E可以看出，在给药后第11天时，AP2在肿瘤组织中仍能检测到显著的荧光信号，且且除代谢器官肾脏以外未在其他组织中检测到荧光信号。可见，本公开提供的缀合物在长时间内仍然能够稳定地、高特异性地靶向U118MG胶质瘤组织。

从上述结果可知，本公开提供的缀合物不仅能够特异性靶向胶质瘤组织，还能够将不同的诊断剂基团递送至胶质瘤。从而，本公开提供的缀合物显示出优异的递送能力；同时，本公开提供的包含诊断剂基团的缀合物能够高效、稳定地靶向胶质瘤，从而能够迅速、有效地对胶质瘤的存在进行诊断，且诊断效果可在较长时间内保持稳定。

实验例10不同序列和长度的缀合物对U118MG胶质瘤的靶向效果

本实验例中采用U118MG胶质瘤模型，考察了不同序列和不同长度的缀合物对U118MG胶质瘤的靶向效果。

取对数期生长的U118MG胶质瘤细胞(购自广州吉妮欧生物科技有限公司)，消化重悬于添加有10％胎牛血清的DMEM培养基中，直至U118MG胶质瘤细胞的细胞密度达到1×10⁸cells/mL。

选取14只6-8周龄的NOD-SCID雄性小鼠(购自斯贝福(北京)生物技术公司)，随机分组，每组2只小鼠。取上述含有U118MG胶质瘤细胞的培养基分别接种于小鼠右前肢皮下位置，每只小鼠接种U118MG胶质瘤的体积为100μL，从而计算可知，每只小鼠接种细胞数为1×10⁷个。

用1×DMEM(购自中科迈晨(北京)科技有限公司，批号为K1902200)培养基将AP2、AP4、AP5、AP6、AP7、AP8和AP12分别溶解成0.3mg/mL浓度(以适配体计)的缀合物溶液。在上述U118MG胶质瘤接种21天时，分别向每只小鼠尾静脉注射上述配制的AP2、AP4、AP5、AP6、AP7、AP8和AP12缀合物溶液。其中，分别将注射AP2、AP4、AP5、AP6、AP7、AP8和AP12的各组小鼠各自命名为AP2组、AP4组、AP5组、AP6组、AP7组、AP8组和AP12组。所有动物根据体重计算给药剂量，以适配体的量计，每只小鼠的给药体积为10μL/g。即，每只小鼠的给药剂量均为3mg/kg。

将给药当天记为D1，给药1h、24h(D2)、48h(D3)和72h(D4)后，依次将各组小鼠放置于小动物活体光学成像系统IVIS Lumina Series III中，采用异氟烷气体麻醉小鼠，将麻醉后的小鼠腹部朝上放置于小动物活体光学成像系统中进行活体成像，动态检测Cy5的荧光信号，追踪各Cy5标记的不同缀合物在动物活体的分布情况。分析观察结果可知，在给药1h后，各个小鼠体内的皮下瘤中均可见荧光信号，且各组小鼠之间的荧光信号强度无显著性差异。在给药24h和48h后，各组小鼠体内仍可检测到荧光信号，但是注射AP6和AP8的小鼠体内的皮下瘤中的荧光信号均要强于注射AP2、AP4、AP5、AP7和AP12的小鼠体内的皮下瘤中的荧光信号。

在D9时，分别将每组中的1只小鼠处死，并分别取出各只被处死的小鼠的肿瘤、肺、肝和肾组织，在IVIS Lumina Series III中进行荧光成像。将各只小鼠的肿瘤组织纵向排布，并放在同一视野下拍照，结果见图9所示。

图9是示出了给药后D9时，各组小鼠的肿瘤荧光影像的图。从图9可以看出，各组小鼠的肿瘤组织中均可检测到Cy5荧光信号，表明本公开不同长度和序列的缀合物均能够在长时间内稳定有效地靶向至肿瘤组织。

实验例11缀合物在小鼠体内的靶向性

本实验例考察了制备得到的缀合物AP2、AP21-26以及对比AP27-对比AP30在小鼠体内的靶向性。

按照实验例4的方法培养U118MG细胞并皮下接种至24只小鼠(均为雌性)，获得接种U118MG皮下瘤的小鼠。

用DMEM培养基将上述制备的缀合物AP2、AP21-26以及对比AP27-对比AP30分别配制为0.3mg/mL的溶液。

U118MG细胞接种后14天开始给药，给药当天记为D1。实验采用尾静脉注射给药方式，每天给药一次，共三次给药。

将接种U118MG皮下瘤的24只小鼠随机分为12组，每组2只小鼠：

对于7组小鼠，分别向每组中的每只小鼠给予AP2、AP21、AP22、AP23、AP24、AP25或AP26，单次给药容积为10μL/g小鼠体重，计算可知单次给药剂量为3mg/kg，依次分别记为测试组11A-11G；

对于另外4组小鼠，分别向每组中的每只小鼠给予对比AP27、对比AP28、对比AP29或对比AP30，单次给药容积为10μL/g小鼠体重，计算可知单次给药剂量为3mg/kg，依次分别记为对照组11H-11K；

对于另外1组中的2只小鼠，向每只小鼠给予DMEM培养基，给药容积为10μL/g小鼠体重，记为空白对照组12Y。

于首次给药后1h、24h和48h时，使用小动物活体光学成像系统IVIS Lumina Series III对各小鼠进行活体成像。在D5时，处死各组小鼠并取肿瘤组织和肾脏进行荧光成像。

图10A-10C依次分别是示出了给予不同缀合物后1h、24h和48h时，小鼠体内的荧光成像结果的图，其中每一小图内3只小鼠中最左侧的1只为空白对照组11Y的小鼠。由图10A可知，空白对照组不显示任何荧光信号；与其不同，在给药后1h时，各测试组和对照组的小鼠在皮下肿瘤处均显示出荧光信号；由图10B和10C可知，在给药后24h和48h时，仅测试组11A-11G的小鼠在皮下肿瘤处显示出较强的荧光信号，而对照组11H-11K的小鼠几乎不显示荧光信号或仅显示很弱的荧光信号。进一步地，图10D是示出了D5时处死小鼠后，各组小鼠肿瘤组织和肾脏的荧光信号成像的图，其中，Blank表示空白对照组11Y。由图10D可知，空白对照组11Y和对照组11H-11K的小鼠的肿瘤组织几乎不显示荧光信号或仅显示很弱的荧光信号；与此相对，给予本公开提供的缀合物的测试组11A-11G的小鼠的肿瘤组织均显示出强烈的荧光信号，同时在代谢器官肾脏处仅显示微弱的荧光信号，表明与对照缀合物相比，本公开的缀 合物能够稳定、高效地靶向肿瘤组织。本公开提供的各种缀合物均能够稳定高效地靶向肿瘤组织，从而有助于对肿瘤的存在进行成功诊断和监控。

实验例12缀合物在小鼠体内的靶向性

本实验例考察了制备得到的缀合物AP2、AP12以及对比AP31-对比AP35在小鼠体内的靶向性。

按照实验例4的方法培养U118MG细胞并皮下接种至16只小鼠(均为雄性)，获得接种U118MG皮下瘤的小鼠。

用DMEM培养基将上述制备的缀合物AP2、AP12以及对比AP31-对比AP35分别配制为0.3mg/mL的溶液。

U118MG细胞接种后21天开始给药，给药当天记为D1。实验采用尾静脉注射给药方式，每天给药一次，共三次给药。

将接种U118MG皮下瘤的16只小鼠随机分为8组，每组2只小鼠：

对于2组小鼠，分别向每组中的每只小鼠给予AP2或AP12，单次给药容积为10μL/g小鼠体重，计算可知单次给药剂量为3mg/kg，依次分别记为测试组12A-12B；

对于另外5组小鼠，分别向每组中的每只小鼠给予对比AP31、对比AP32、对比AP33、对比AP34或对比AP35，单次给药容积为10μL/g小鼠体重，计算可知单次给药剂量为3mg/kg，依次分别记为对照组12C-12G；

对于另外1组中的2只小鼠，向每只小鼠给予DMEM培养基，给药容积为10μL/g小鼠体重，记为空白对照组12Y。

于首次给药后1h、24h和48h时，使用小动物活体光学成像系统IVIS Lumina Series III对各小鼠进行活体成像。在D6时，处死各组小鼠并取肿瘤组织和肾脏进行荧光成像。

图11A-11D依次分别是示出了给予不同缀合物后1h、24h和48h时，小鼠体内的荧光成像结果的图，其中每一小图内3只小鼠中最左侧的1只为空白对照组12Y的小鼠。由图11A可知，空白对照组不显示任何荧光 信号；与其不同，在给药后1h时，各测试组和对照组的小鼠在皮下肿瘤处均显示出荧光信号；由图11B和11C可知，在给药后24h和48h时，仅测试组12A和12B的小鼠在皮下肿瘤处显示出较强的荧光信号，而空白对照组12Y及对照组12C-12G的小鼠完全不显示荧光信号。进一步地，图11D是示出了D6时处死小鼠后，各组小鼠肿瘤组织和肾脏的荧光信号成像的图，其中，Blank表示空白对照组12Y。由图11D可知，空白对照组12Y和对照组12C-12G的小鼠的肿瘤组织完全不显示荧光信号；与此相对，给予本公开提供的缀合物的测试组12A或12B的小鼠的肿瘤组织均显示出强烈的荧光信号，同时在代谢器官肾脏处仅显示微弱的荧光信号，表明与对照缀合物相比，本公开提供的缀合物能够稳定、高效地靶向肿瘤组织，并且不具有式(1)结构的各种缀合物均未显示出对肿瘤组织的靶向效果。

实验例13缀合物AP2、AP4和AP13在U118MG人胶质瘤细胞内的分布

按照实验例4的方法培养U118MG人胶质瘤细胞(购自广州吉妮欧生物科技有限公司)。取对数期生长的U118MG人胶质瘤细胞，以(0.25％的胰酶)消化，收集细胞，离心去上清，将细胞重悬于无血清DMEM培养基中制成浓度为1×10⁸cells/mL的细胞培养液。

实验动物NOD-SCID小鼠8只(购自斯贝福(北京)生物技术有限公司)，雄性，12周龄。将上述细胞培养液接种于NOD-SCID小鼠右侧背部皮下位置，接种体积为每只100μL，即每只小鼠接种1×10⁷个细胞。注射后继续饲养小鼠21天。将8只小鼠随机分为4组，每组2只。

用无血清DMEM培养基将缀合物AP2、AP4和AP13溶解成0.3mg/mL浓度(以适配体计)的缀合物溶液。

U118MG细胞接种后21天开始给药，给药当天记为D1。实验采用尾静脉注射给药方式，单次给药。

对于3组小鼠，分别向不同组中的每只小鼠给予缀合物AP2、AP4或AP13，单次给药容积为10μL/g小鼠体重，计算可知单次给药剂量为3mg/kg，依次分别记为测试组1-3。

对于另外的1组小鼠，分别向每只小鼠给予DMEM，单次给药容积为10μL/g小鼠体重，记为空白对照组。

于给药后24h，安乐死小鼠，收集肿瘤组织固定于4％多聚甲醛溶液中，

将肿瘤组织置于15％蔗糖脱水24h，再置于30％蔗糖脱水24h，OCT包埋剂浸润组织后，液氮速冻，冷冻切片机(型号POLAR-D-JC，购自樱花精机株式会社)切片，厚度为10μm，获得肿瘤组织切片。将组织切片在室温下静置5min，使用4％多聚甲醛固定组织15min，以PBS对切片进行洗涤3次，每次5ml，使用DAPI避光染色3min，再重复上述洗涤步骤3次，封片，得到DAPI染色切片。使用激光共聚焦成像仪(型号LSM 900 Basic Operation，购自卡尔蔡司(上海)管理有限公司)对上述得到的DAPI染色切片进行成像分析，参数选择为Cy5激光强度20％(em 650nm，ex 670nm)，DAPI激光强度1.5％(em 360nm，ex 460nm)，在Best signal模式下拍摄。结果参见图12。

图12是示出了向皮下接种U118MG胶质瘤的小鼠给予不同缀合物后24h时，U118MG胶质瘤细胞的激光共聚焦成像结果的图。

实验结果表明与空白对照组DMEM和对比缀合物AP13相比，本公开提供的缀合物均能够将诊断剂基团高效、特异性地递送进入U118MG胶质瘤的肿瘤细胞内部，显示出优异的靶向效果和潜在的诊断能力。以上详细描述了本公开的一些实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述一些实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (50)

1. 一种缀合物，包含一个或多个递送基团和一个或多个诊断剂基团，每个所述递送基团独立地与所述诊断剂基团经共价键连接，或通过连接基团连接；

   其中，所述递送基团由一种适配体去除一个或多个氢原子或一个或多个官能团形成，所述适配体包含一段连续的核苷酸序列，连接相邻的两个核苷酸的基团独立地为磷酸酯基或者具有修饰基团的磷酸酯基，每个核苷酸选自修饰或未修饰A、U、C或G中的一种，所述连续的核苷酸序列具有式(1)所示的序列： 5'-T₁-S₁-N_a-S₂-N_b-S₃-N_c-S₄-T₂-3' 式(1)

   其中，T₁是由1-3个核苷酸组成的基序，T₂是由0-15个核苷酸组成的基序，并且T₂中不包含与T₁完全反向互补的基序；

   S₁和S₄各自是由3-7个核苷酸组成的基序，S₁与S₄长度相同并且完全反向互补；

   N_a和N_c各自是由1-4个核苷酸组成的基序，N_a中的每个核苷酸与N_c中的每个核苷酸均不互补，并且N_a和N_c中U的总个数占N_a和N_c中全部核苷酸总个数的50％以上；

   S₂和S₃各自是由1-4个核苷酸组成的基序，S₂与S₃长度相同并且完全反向互补；

   N_b是由3-6个核苷酸组成的基序，并且N_b两端的核苷酸之间不形成AU或GC互补。
2. 如权利要求1所述的缀合物，其中，所述连续的核苷酸序列的长度为18-50个核苷酸，或者20-40个核苷酸，或者21-36个核苷酸，或者24-32个核苷酸。
3. 如权利要求1或2所述的缀合物，其中，T₁由2个核苷酸组成；或者，T₁由2个核苷酸组成并且含有至少一个C；或者，按照5'-3'方向，T₁为CU、UC或AC。
4. 如权利要求1-3中任意一项所述的缀合物，其中，T₂由0-10个核 苷酸组成；或者，按照5'-3'方向，T₂由U起始的1-9个核苷酸组成。
5. 如权利要求1-4中任意一项所述的缀合物，其中，S₁和S₄各自由3-5个核苷酸组成且长度相同；或者，S₁和S₄形成的反向互补中，GC互补占全部互补数量的至少40％；或者，按照5'-3'方向，S₁为GCU且S₄为AGC，或S₁为GAGU且S₄为GCUC，或S₁为GGAGU且S₄为GCUCU，或S₁为UAUGG且S₄为CCAUG。
6. 如权利要求1-5中任意一项所述的缀合物，其中，所述N_a和N_c中核苷酸的数量之和为2-4的整数；或者，所述N_a和N_c中核苷酸的数量之和为3或4，并且所述N_a和N_c中U的数量之和为2或3；或者，按照5'-3'方向，N_a或N_c独立地为U、UU、UC或CU。
7. 如权利要求1-6中任意一项所述的缀合物，其中，S₂和S₃各自由2-3个核苷酸组成且长度相同；或者，S₂和S₃形成的反向互补中至少包含一个GC互补；或者，按照5'-3'方向，S₂为CA且S₃为UG，或S₂为AC且S₃为GU，或S₂为GCC且S₃为GGU。
8. 如权利要求1-7中任意一项所述的缀合物，其中，N_b由4个或5个核苷酸组成；或者，按照5'-3'方向，N_b为GACG、GACGU、GACCG、UACU、GUUG或GAUCU。
9. 如权利要求1-8中任意一项所述的缀合物，其中，所述连续的核苷酸序列具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的序列。
10. 如权利要求1-8中任意一项所述的缀合物，其中，所述连续的核苷酸序列具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列： 5'-N₆GGAGUUCAN₁N₂N₃N₄UGN₅GCUCN₇-3'(SEQ ID NO:4)，

    其中，N₁、N₂、N₃各自独立地为A、U、C和G中的一种；N₄为U、C或G或者由U、C或G中的两个组成的基序；N₅为U、CU或UU；N₆为CU、UC或AC；N₇为U、UU或UUN₈，N₈为由1-15个核苷酸组成的基序。
11. 如权利要求10所述的缀合物，其中，N₁、N₂、N₃和N₄组成的基序N₁N₂N₃N₄为GACG、GACGU、GACCG、UACU、GUUG或GAUCU中的一种。
12. 如权利要求10或11所述的缀合物，其中，所述连续的核苷酸序列具有SEQ ID NO:5-11中任意一项所示的核苷酸序列。
13. 如权利要求10或11所述的缀合物，其中，N₈是由1-8个核苷酸组成的基序；或者，按照5'-3'方向，N₈的核苷酸序列为CCGAUCUC；或者，所述连续的核苷酸序列具有SEQ ID NO:12-14中的一种所示的序列。
14. 如权利要求1-13中任意一项所述的缀合物，其中，所述连续的核苷酸序列中的每个胞嘧啶核苷酸为氟代修饰的胞嘧啶核苷酸，和/或所述连续的核苷酸序列中的每个尿嘧啶核苷酸为氟代修饰的尿嘧啶核苷酸；或者，所述连续的核苷酸序列中的每个核苷酸均为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，所述连续的核苷酸序列中N_b和S₃基序中的一个或多个尿嘧啶核苷酸具有修饰的碱基。
15. 如权利要求14所述的缀合物，其中，所述连续的核苷酸序列具有SEQ ID NO:15-33中的一种所示的核苷酸序列。
16. 如权利要求1所述的缀合物，其中，所述连续的核苷酸序列中的至少一个连接相邻的两个核苷酸的基团为硫代磷酸酯基，或者每个连接相邻的两个核苷酸的基团均为硫代磷酸酯基。
17. 如权利要求16所述的缀合物，其中，所述连续的核苷酸序列具有SEQ ID NO:34-39中的一种所示的核苷酸序列。
18. 如权利要求1-17中任意一项所述的缀合物，其中，每个所述诊断剂基团独立地选自造影剂基团或荧光标记示踪剂基团。
19. 如权利要求1-18中任意一项所述的缀合物，其中，所述缀合物具有如式(2)所示的结构：

    其中，每个R_AP基团独立地为具有如式(3)所示的结构的基团：

    式中，每个AP基团相同或不同，独立地表示一个所述递送基团；R_j、每个R_k或每个R_i相同或不同，分别独立地表示共价键或者连接基团，且R_i和R_k二者不同时为共价键；每个n₁各自独立地表示0-4的整数；

    每个A₀基团相同或不同，独立地表示一个所述诊断剂基团；m₀为1-6的整数；n₀为1-6的整数，表示基团共价连接的位点。
20. 如权利要求19所述的缀合物，其中，m₀为1-4的整数，和/或n₀为1-3的整数，和/或每个n₁独立地为0-1的整数；

    或者，m₀为1，和/或n₀为1，和/或至少一个或者每个n₁为0。
21. 如权利要求19或20所述的缀合物，其中，每个所述R_k和/或每个所述R_i独立地为共价键或者长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，或者，所述直链亚烷基中的一个或多个碳原子被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)₂、OP(O)₂、 OP(O)(S)、C₅-C₈亚糖苷基、C₂-C₁₀亚烯基、C₂-C₁₀亚炔基、C₆-C₁₀亚芳基、C₃-C₁₈亚杂环基和C₅-C₁₀亚杂芳基；并且其中，所述直链亚烷基可具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C₁-C₁₀烷基、C₆-C₁₀芳基、C₅-C₁₀杂芳基、C₁-C₁₀卤代烷基、-OC₁-C₁₀烷基、-OC₁-C₁₀烷基苯基、-C₁-C₁₀烷基-OH、-OC₁-C₁₀卤代烷基、-SC₁-C₁₀烷基、-SC₁-C₁₀烷基苯基、-C₁-C₁₀烷基-SH、-SC₁-C₁₀卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH₂、-C₁-C₁₀烷基-NH₂、-N(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基)、-NH(C₁-C₁₀烷基)、-N(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基苯基)、-NH(C₁-C₁₀烷基苯基)、氰基、硝基、-CO₂H、-C(O)O(C₁-C₁₀烷基)、-CON(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基)、-CONH(C₁-C₁₀烷基)、-CONH₂，-NHC(O)(C₁-C₁₀烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁-C₁₀烷基)C(O)(C₁-C₁₀烷基)、-N(C₁-C₁₀烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C₁-C₁₀烷基、-C(O)C₁-C₁₀烷基苯基、-C(O)C₁-C₁₀卤代烷基、-OC(O)C₁-C₁₀烷基、-SO₂(C₁-C₁₀烷基)、-SO₂(苯基)、-SO₂(C₁-C₁₀卤代烷基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(C₁-C₁₀烷基)、-SO₂NH(苯基)、-NHSO₂(C₁-C₁₀烷基)、-NHSO₂(苯基)和-NHSO₂(C₁-C₁₀卤代烷基)。
22. 如权利要求21所述的缀合物，其中，每个n₁独立地为0或1，每个R_i独立地为共价键，或者为以下连接基团的一种或多种的连接组合：C₁-C₂₀亚烷基、磷酸酯键、硫代磷酸酯键、酰胺键、酯键、醚键、硫醚键、二硫键、1,2,3-三唑亚基、聚乙二醇亚基、吡咯烷亚基、2-氧代吡咯烷亚基、亚苯基、亚环己基、2-丁二酰亚胺亚基、2-硫代丁二酰亚胺亚基、氨基酸亚基、核苷酸亚基。
23. 如权利要求22所述的缀合物，其中，每个R_i独立地为共价键、二硫键、亚丙基磷酸酯基、2-硫代丁二酰亚胺亚基、氨基酸亚基、或者GAU三核苷酸亚基中的一种或两种的连接组合。
24. 如权利要求19-23中任意一项所述的缀合物，其中，R_j为共价键，m₀为1。
25. 如权利要求19-23中任意一项所述的缀合物，其中，R_j为连接基 团，所述连接基团R_j包含主链部分、侧链部分和缀合连接部，所述主链部分分别与所述缀合连接部和所述侧链部分连接，每个所述侧链部分分别与所述主链部分和所述R_AP基团连接，每个所述缀合连接部分别与所述主链部分和所述诊断剂基团A₀连接，其中，

    所述主链部分为长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，或者，所述直链亚烷基中的一个或多个碳原子被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)₂、OP(O)₂、C₅-C₈亚糖苷基、C₂-C₁₀亚烯基、C₂-C₁₀亚炔基、C₆-C₁₀亚芳基、C₃-C₁₈亚杂环基和C₅-C₁₀亚杂芳基；并且其中，所述直链亚烷基可具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C₁-C₁₀烷基、C₆-C₁₀芳基、C₅-C₁₀杂芳基、C₁-C₁₀卤代烷基、-OC₁-C₁₀烷基、-OC₁-C₁₀烷基苯基、-C₁-C₁₀烷基-OH、-OC₁-C₁₀卤代烷基、-SC₁-C₁₀烷基、-SC₁-C₁₀烷基苯基、-C₁-C₁₀烷基-SH、-SC₁-C₁₀卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH₂、-C₁-C₁₀烷基-NH₂、-N(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基)、-NH(C₁-C₁₀烷基)、-N(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基苯基)、-NH(C₁-C₁₀烷基苯基)、氰基、硝基、-CO₂H、-C(O)O(C₁-C₁₀烷基)、-CON(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基)、-CONH(C₁-C₁₀烷基)、-CONH₂，-NHC(O)(C₁-C₁₀烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁-C₁₀烷基)C(O)(C₁-C₁₀烷基)、-N(C₁-C₁₀烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C₁-C₁₀烷基、-C(O)C₁-C₁₀烷基苯基、-C(O)C₁-C₁₀卤代烷基、-OC(O)C₁-C₁₀烷基、-SO₂(C₁-C₁₀烷基)、-SO₂(苯基)、-SO₂(C₁-C₁₀卤代烷基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(C₁-C₁₀烷基)、-SO₂NH(苯基)、-NHSO₂(C₁-C₁₀烷基)、-NHSO₂(苯基)和-NHSO₂(C₁-C₁₀卤代烷基)；

    每个所述侧链部分独立地是共价键，或者是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，或者，所述直链亚烷基中的一个或多个碳原子被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)₂、OP(O)₂、C₅-C₈亚糖苷基、C₂-C₁₀亚烯基、C₂-C₁₀亚炔基、C₆-C₁₀亚芳基、C₃-C₁₈亚杂环基和C₅-C₁₀亚杂芳基；并且，所述直链亚烷基可具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C₁-C₁₀烷基、C₆-C₁₀芳基、C₅-C₁₀杂芳基、C₁-C₁₀卤代烷基、-OC₁-C₁₀烷基、-OC₁-C₁₀烷基苯基、-C₁-C₁₀烷基-OH、-OC₁-C₁₀卤代烷基、-SC₁-C₁₀烷基、-SC₁-C₁₀烷基苯基、-C₁-C₁₀烷基-SH、-SC₁-C₁₀卤代烷基、卤素取代基、-OH、 -SH、-NH₂、-C₁-C₁₀烷基-NH₂、-N(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基)、-NH(C₁-C₁₀烷基)、-N(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基苯基)、-NH(C₁-C₁₀烷基苯基)、氰基、硝基、-CO₂H、-C(O)O(C₁-C₁₀烷基)、-CON(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基)、-CONH(C₁-C₁₀烷基)、-CONH₂，-NHC(O)(C₁-C₁₀烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁-C₁₀烷基)C(O)(C₁-C₁₀烷基)、-N(C₁-C₁₀烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C₁-C₁₀烷基、-C(O)C₁-C₁₀烷基苯基、-C(O)C₁-C₁₀卤代烷基、-OC(O)C₁-C₁₀烷基、-SO₂(C₁-C₁₀烷基)、-SO₂(苯基)、-SO₂(C₁-C₁₀卤代烷基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(C₁-C₁₀烷基)、-SO₂NH(苯基)、-NHSO₂(C₁-C₁₀烷基)、-NHSO₂(苯基)和-NHSO₂(C₁-C₁₀卤代烷基)；

    每个所述缀合连接部独立地为共价键或者以下连接结构的一种或多种的连接组合：C₁-C₁₀直链亚烷基、磷酸酯键、硫代磷酸酯键、酰胺键、酯键、醚键、二硫键、1,2,3-三唑亚基、聚乙二醇亚基、吡咯烷亚基、2-氧代吡咯烷亚基、亚苯基、亚环己基、2-丁二酰亚胺亚基、2-硫代丁二酰亚胺亚基、氨基酸亚基、核苷酸亚基。
26. 如权利要求25所述的缀合物，其中，所述连接基团R_j中的每个所述缀合连接部分别与所述主链部分和一个所述诊断剂基团A₀连接；所述侧链部分为n₀个，每个所述侧链部分分别与所述主链部分和一个所述R_AP基团连接。
27. 如权利要求25或26所述的缀合物，其中，全部所述侧链部分连接至所述主链部分中的同一原子；或者，每个所述侧链部分连接至所述主链部分中的不同原子。
28. 如权利要求27所述的缀合物，其中，m₀为1，所述连接基团R_j包含如式(301)所示的结构：

    其中，k为1-3的整数；L^C为所述主链部分，L^A为所述侧链部分，L^B为所述缀合连接部，表示基团共价连接的位点；

    所述主链部分L^C为共价键或2-4价、直链或支链的C₁-C₂₅饱和烃基，或者，所述饱和烃基中的一个或多个碳原子被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)₂、OP(O)₂、C₅-C₈亚糖苷基、C₂-C₅亚烯基、C₂-C₅亚炔基、C₆-C₁₀亚芳基、C₃-C₈亚杂环基和C₅-C₁₀亚杂芳基；其中，所述饱和烃基可具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C₁-C₅烷基、C₆-C₁₀芳基、C₅-C₁₀杂芳基、-O-C₁-C₅烷基、-OC₁-C₅烷基苯基、-C₁-C₅烷基-OH、-SC₁-C₅烷基、硝基、-C(O)O(C₁-C₅烷基)、-CON(C₁-C₅烷基)(C₁-C₅烷基)、-CONH(C₁-C₅烷基)、-CONH₂，-NHC(O)(C₁-C₅烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁-C₅烷基)C(O)(C₁-C₅烷基)、-N(C₁-C₅烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C₁-C₅烷基、-C(O)C₁-C₅烷基苯基、-OC(O)C₁-C₅烷基、-SO₂(C₁-C₅烷基)、-SO₂(苯基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(C₁-C₅烷基)、-SO₂NH(苯基)、-NHSO₂(C₁-C₅烷基)和-NHSO₂(苯基)；

    每个所述侧链部分独立地是共价键，或者是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，或者，所述直链亚烷基中的一个或多个碳原子被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)₂、OP(O)₂、C₅-C₈亚糖苷基、C₂-C₁₀亚烯基、C₂-C₁₀亚炔基、C₆-C₁₀亚芳基、C₃-C₁₈亚杂环基和C₅-C₁₀亚杂芳基；并且，所述直链亚烷基可具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C₁-C₁₀烷基、C₆-C₁₀芳基、C₅-C₁₀杂芳基、C₁-C₁₀卤代烷基、-OC₁-C₁₀烷基、-OC₁-C₁₀烷基苯基、-C₁-C₁₀烷基-OH、-OC₁-C₁₀卤代烷基、-SC₁-C₁₀烷基、-SC₁-C₁₀烷基苯基、-C₁-C₁₀烷基-SH、-SC₁-C₁₀卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH₂、-C₁-C₁₀烷基-NH₂、-N(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基)、-NH(C₁-C₁₀烷基)、-N(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基苯基)、-NH(C₁-C₁₀烷基苯基)、氰基、硝基、-CO₂H、-C(O)O(C₁-C₁₀烷基)、-CON(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基)、-CONH(C₁-C₁₀烷基)、-CONH₂，-NHC(O)(C₁-C₁₀烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁-C₁₀烷基)C(O)(C₁-C₁₀烷基)、-N(C₁-C₁₀烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C₁-C₁₀烷基、-C(O)C₁-C₁₀烷基苯基、-C(O)C₁-C₁₀卤代烷基、-OC(O)C₁-C₁₀烷基、-SO₂(C₁-C₁₀烷基)、-SO₂(苯基)、-SO₂(C₁-C₁₀卤代烷基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(C₁-C₁₀烷基)、-SO₂NH(苯基)、-NHSO₂(C₁-C₁₀烷基)、-NHSO₂(苯基)和-NHSO₂(C₁-C₁₀卤代烷基)；

    每个所述缀合连接部独立地为共价键或者以下连接结构的一种或多种的连接组合：C₁-C₁₀直链亚烷基、磷酸酯键、硫代磷酸酯键、酰胺键、酯键、醚键、二硫键、1,2,3-三唑亚基、聚乙二醇亚基、吡咯烷亚基、2-氧代吡咯烷亚基、亚苯基、亚环己基、2-丁二酰亚胺亚基、2-硫代丁二酰亚胺亚基、氨基酸亚基、核苷酸亚基。
29. 如权利要求28所述的缀合物，其中，所述缀合物具有如式(305)所示的结构：
30. 如权利要求25所述的缀合物，其中，所述连接基团R_j具有式(306)所示的结构：

    其中，n₃₀₆为0-3的整数，每个p₃₀₆独立地为1-6的整数，表示基团共价连接的位点；由吡咯烷亚基和磷酸二酯基团交替形成的结构构成所述主链部分，由连接至吡咯烷基上的氮原子的羰基与由*标出的氧原子之间的原子链构成每个所述侧链部分，所述侧链部分通过由*标出的氧原子与所述R_AP基团形成磷酸酯键、醚键或酯键连接；由#标出的氧原子中 的至少一个为所述缀合连接部并与所述诊断剂基团A₀形成醚键、酯键或磷酸酯键而连接，其余由#标出的氧原子与氢原子连接形成羟基，或者与C₁-C₃烷基连接形成C₁-C₃烷氧基。
31. 如权利要求30所述的缀合物，其中，所述缀合物具有如式(307a)、(307b)或(307c)所示的结构：
32. 如权利要求25所述的缀合物，其中，所述缀合物具有式(308)所示的结构：

    其中，

    n₃₀₈为选自1-10的整数；

    每个m₃₀₈独立地为选自2-10的整数；

    每个R₃₀₈独立地为H、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀卤代烷基或C₁-C₁₀烷氧基；

    每个R₃独立地为所述诊断剂基团A₀，或者为所述R_AP基团，并且至少一个R₃为所述诊断剂基团A₀，且至少一个R₃为所述R_AP基团；

    连接至所述诊断剂基团A₀的每个L₁表示所述缀合连接部，并且连接 至所述R_AP的每个L₁表示所述侧链部分。
33. 如权利要求32所述的缀合物，其中，每个L₁独立地选自于由基团L4-L23及其任意连接组合所组成的组。
34. 如权利要求33所述的缀合物，其中，每个L₁独立地选自于由基团(L4)-(L9)、(L13)、(L14)、(L18)中至少2个的连接组合所组成的组；或者，每个L₁独立地为基团(L4)、(L5)、(L7)、(L9)、(L13)、(L14)、(L18)中至少2个的连接组合。
35. 如权利要求32-34中任意一项所述的缀合物，其中，每个L₁的长度独立地为3-25个原子；或者，每个L₁的长度独立地为4-15个原子。
36. 如权利要求32-35中任意一项所述的缀合物，其中，n₃₀₈为2-6的整数，2-4个R₃为所述R_AP基团，其余的R₃为所述诊断剂基团。
37. 如权利要求32-36中任意一项所述的缀合物，其中，每个m₃₀₈各自独立地为2-5的整数，和/或每个m₃₀₈均相等。
38. 如权利要求32-37中任意一项所述的缀合物，其中，n₃₀₈为选自2-4的整数；每个m₃₀₈独立地为选自2-4的整数；每个R₃₀₈均为H。
39. 如权利要求38所述的缀合物，其中，一个R₃为所述诊断剂基团A₀，其余R₃为所述R_AP基团。
40. 如权利要求38或39所述的缀合物，其中，每个L₁上同时含有与含氮骨架上的N原子连接的连接位点和与所述诊断剂基团A₀或所述R_AP基团连接的连接位点，所述与含氮骨架上的N原子连接的位点与该N原子形成酰胺键；或者，一个或多个L₁选自B5、B6、B5'或B6'：

    其中，表示基团共价连接的位点，q₂为1-10的整数；或者，q₂为1-5的整数。
41. 如权利要求32-40中任意一项所述的缀合物，其中，所述缀合物具有式(403)、(404)、(405)、(406)、(407)、(408)、(409)、(410)、(411)、(412)、(413)、(414)、(415)、(416)、(417)、(418)、(419)、(420)、(421)、(422)、(423)、(424)、(425)、(426)或(427)所示的结构：
42. 如权利要求19-23中任意一项所述的缀合物，其中，R_j包含核苷酸序列I和核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II各自包含5-25个修饰或未修饰的核苷酸，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补，所述递送基团连接至所述核苷酸序列I，所述诊断剂基团连接至所述核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II在受试者体内不引发免疫反应或毒性反应。
43. 如权利要求42所述的缀合物，其中，所述递送基团的3'末端经磷酸酯键连接至所述核苷酸序列I的5'末端核苷酸的核糖5'位，所述诊断剂基团连接至所述核苷酸序列II的5'末端核苷酸的核糖5'位；或者，所述诊断剂基团包含一段核苷酸序列，所述核苷酸序列的3'末端经磷酸酯键连接至所述核苷酸序列II的5'末端核苷酸的核糖5'位。
44. 如权利要求43所述的缀合物，其中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II实质上反向互补或者完全反向互补；或者，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II的长度相等并且均为10-20个修饰或未修饰的核苷酸；或者，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II均由17个核苷酸组成并且完全反向互补；或者，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II分别具有SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41所示的序列： 5'-GUACAUUCUAGAUAGCC-3'(SEQ ID NO:40) 5'-GGCUAUCUAGAAUGUAC-3'(SEQ ID NO:41)，

    或者，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II分别具有SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43所示的序列： 5'-GmUfAmCfAmUfUfCfUfAmGmAmUfAmGmCfCf-3' (SEQ ID NO:42) 5’-GmGmCfUfAmUfCfUfAmGmAmAmUfGmUfAmCf-3’ (SEQ ID NO:43)。
45. 如权利要求19-44中任意一项所述的缀合物，其中，R_j为可裂解的。
46. 如权利要求1-45中任意一项所述的缀合物，所述缀合物还包含至少一个递送助剂基团，所述递送助剂基团选自于C₁₀-C₃₀烃基、胆固醇基、磷脂基团中的一种或多种。
47. 一种药物组合物，包含权利要求1-46中任意一项所述的缀合物，以及药学上可接受的载体。
48. 权利要求1-46中任意一项所述的缀合物和/或权利要求47所述的药物组合物在制备用于对肿瘤及肿瘤相关疾病或症状进行诊断的药物中的应用。
49. 一种对肿瘤及肿瘤相关疾病进行诊断的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予有效量的权利要求1-46中任意一项所述的缀合物和/或权利要求47所述的药物组合物。
50. 一种试剂盒，包括权利要求1-46中任意一项所述的缀合物和/或权利要求47所述的药物组合物。