JP2021031405A - 歯肉上皮細胞活性化剤 - Google Patents

Abstract

【課題】歯肉上皮細胞を活性化または細胞増殖を亢進するために使用される口腔組成物を提供する。また、歯肉のバリア機能を亢進し、または歯周組織を修復するために使用される口腔組成物を提供する。【解決手段】ヒノキチオールを有効成分として配合し、歯肉上皮細胞活性化剤、歯肉上皮細胞増殖亢進剤、歯肉バリア機能亢進剤、または歯周組織修復剤として調製する。【選択図】なし

Description

本発明は、歯肉上皮細胞を活性化または細胞増殖を亢進するために使用される口腔組成物に関する。また、本発明は、歯肉のバリア機能を亢進し、または歯周組織を修復するために使用される口腔組成物に関する。

歯周病は、歯周組織の炎症性疾患であり、細菌の組織内侵入及び感染に対する宿主応答がその原因となっている。
歯周組織は、その構成細胞と主に感染時に増加する免疫細胞とから構成され、それぞれの細胞の感染・炎症に対する反応性が細菌に対する多彩な免疫応答を調節していることが知られている。歯周組織内への細菌の侵入は、通常、歯肉接合上皮によるラミニン５やインテグリンα6β4で構成されるヘミデスモゾーム結合を介したエナメル質への接着と、歯肉接合上皮及び歯肉溝上皮の物理的バリア機能及びβディフェンシンなどの抗菌ペプチドの発現により防御されている。常に存在する細菌に対して、生体は抗菌物質を含んだ唾液、IgGを中心とした抗体、サイトカインを含んだ歯肉溝滲出液、好中球等の貧食細胞による一次防御反応（自然免疫）により対応する。歯肉接合上皮及び歯肉溝上皮は、他の口腔上皮（外縁上皮）と比較して非角化あるいは角化の弱い部分であり、細胞層も薄いが、この構造は逆に接合上皮下にある血管網からの速やかな貧食細胞（好中球等）の歯肉溝内及び歯肉接合上皮へのリクルートに寄与している。実際、細菌に反応した歯肉接合上皮が産生するIL-8等のケモカインや宿主による補体成分C5a、ロイコトリエンB4などの白血球走化誘起物質の産生は、血管内より好中球の滲出を誘導する。臨床的に健康な歯肉において一分間に３万個もの好中球が歯肉接合上皮を通過して、口腔内に到達する。好中球は補体や抗体の働きに助けられながら細菌への貧食能を発揮する。貧食された細菌はファゴソーム内で殺菌され、細胞外へ排出されるか細胞内に残る。通常は、このような生体応答が繰り返されることによって局所で均衡状態が維持され、細菌侵入による、歯周組織破壊から逃れていると考えられる。さらに、プラークに対する歯周組織としての防御策として、歯肉接合上皮と歯肉溝上皮の基底細胞が増殖することによって生体の物理的障壁（バリア）を強化することが知られている（以上、非特許文献１参照）。

このように、細菌の歯周組織内への侵入に対して、歯肉上皮細胞（歯肉接合上皮細胞と歯肉溝上皮細胞）が防御機能を担っている。

ところで、ヒノキチオールは、従来より、抗菌作用、抗炎症作用、及び組織の収斂作用などが知られており、歯肉炎や歯槽膿漏の予防や治療を目的として口腔組成物に配合されている。また、毛包機能賦活作用を有すること（特許文献１）、またサイコサポニンが有する皮膚細胞増殖作用を増強する作用を有すること（特許文献２）などが知られている。しかし、歯肉上皮細胞に作用して、生細胞の増殖を亢進すること（細胞活性化）については、知られていなかった。

特開２００２−４７１４５号公報 特開平５−２６２６３５号公報

菊池毅ら「歯周病における組織破壊に関する免疫学的考察」、日歯周誌、59（4）：185-190、2017

本発明は、ヒノキチオールについて見出した新たな作用に基づいて、新たな用途を提供手することを目的とする。具体的には、ヒノキチオールが有する作用に基づいて、歯肉上皮細胞活性化剤、歯肉上皮細胞増殖亢進剤、歯肉バリア機能亢進剤、及び歯周組織修復剤としての用途を提供することを目的とする。

本発明者らは、日々の研究の中で、ヒノキチオールに歯肉上皮細胞を活性化し、細胞増殖を亢進させる作用があることを新たに見出した。ヒノキチオールのこうした作用によれば、細菌侵入による組織破壊から歯周組織を守り、また細菌侵入やプラークに対する歯肉上皮細胞の防御機能（バリア機能）を亢進することができると考えられる。本発明は、かかる知見に基づいて完成したものであり、下記の実施形態を含有するものである。

項１．ヒノキチオールを有効成分として含有することを特徴とする、歯肉上皮細胞活性化剤。
項２．ヒノキチオールを有効成分として含有することを特徴とする、歯肉上皮細胞増殖亢進剤。
項３．ヒノキチオールを有効成分として含有することを特徴とする、歯肉バリア機能亢進剤。
項４．ヒノキチオールを有効成分として含有することを特徴とする、歯周組織修復剤。
項５．ヒノキチオールを口腔組成物に配合することにより、当該口腔組成物に対して、歯肉上皮細胞活性化作用、歯肉上皮細胞増殖亢進作用、歯肉バリア機能亢進作用、及び歯周組織修復作用よりなる群から選択される少なくとも１つの作用を付与することを特徴とする、ヒノキチオールの使用方法。なお、当該使用方法は、歯肉上皮細胞活性化剤、歯肉上皮細胞増殖亢進剤、歯肉バリア機能亢進剤、及び歯周組織修復剤よりなる群から選択される少なくとも１つの口腔組成物を製造するための、ヒノキチオールの使用とも言い換えることができる。

本発明の歯肉上皮細胞活性化剤で口腔内を処理することで、歯肉上皮細胞を活性化させることができる。また本発明の歯肉上皮細胞増殖亢進剤で口腔内を処理することで、歯肉上皮細胞の増殖を亢進することができる。さらに本発明の歯肉バリア機能亢進剤で口腔内を処理することで、歯肉上皮細胞が活性化または細胞増殖が亢進される結果、細菌やプラーク等に対する歯肉のバリア機能（防御機能）を亢進することができ、歯周ポケット形成の抑制作用や歯周上皮組織の再生作用が期待できる。さらにまた本発明の歯周組織修復剤で口腔内を処理することで、歯肉上皮細胞が活性化または細胞増殖が亢進される結果、細菌やプラーク等によりダメージを受けた歯周組織を修復することができる。つまり、本発明の各種用途の口腔組成物によれば、歯肉上皮細胞（歯肉接合上皮細胞、歯肉溝上皮細胞）が増殖することによって生体の物理的障壁（バリア）を強化することができ、その結果、細菌侵入やプラーク、その他の物理的や化学的な刺激に対して有効な防御効果を奏することが可能になる。このため、本発明の各種用途の口腔組成物は、歯肉強化剤として有効に使用することができる。

ヒノキチオール存在下（実施例１：６００ｎＭ、実施例２：３００ｎＭ、実施例３：６０ｎＭ）またはヒノキチオール非存在下（比較例）で培養した歯肉上皮細胞の増殖の時間推移を示す。縦軸は培養時間（ｈｒ）、縦軸は歯肉上皮細胞の生細胞数を初期数との比（初期比）で示したものである。また、図はｎ＝６の平均値を示す。

本発明の歯肉上皮細胞活性化剤、歯肉上皮細胞増殖亢進剤、歯肉バリア機能亢進剤、及び歯周組織修復剤は、いずれもヒノキチオールを有効成分として含有することを特徴とする。

ヒノキチオールは、下式で示される化合物である。

ヒノキチオール（2-ヒドロキシ-4-イソプロピルシクロヘプタ-2,4,6-トリエン-1-オン、別名として「β−ツヤプリシン（Thujaplicin）」とも称される）は、タイワンヒノキや青森ヒバ等の精油中に含まれる天然物であり、低毒性であるものの、広い抗菌スペクトルを有し、優れた抗菌作用を有する結晶性物質である。金属イオンと接触すると塩を形成するが、本発明ではその塩も含めてヒノキチオールと総称する。ヒノキチオールは前述するタイワンヒノキやヒバから抽出された精油から単離することもできるが,最近では、化学合成によっても製造されて提供されてもいる。本発明で使用されるヒノキチオールは、天然由来および合成品の別を問わない。また、本発明の効果を損なわないことを限度として、精製品に拘らず、精油または精油の粗精製物であってもよい。

本発明の歯肉上皮細胞活性化剤、歯肉上皮細胞増殖亢進剤、歯肉バリア機能亢進剤、または歯周組織修復剤（以下、これらを総称して「本剤」とも称する。）におけるヒノキチオールの配合量は、各剤を口腔組成物として口腔内に適用した場合に、各々の効果を奏するヒノキチオール量であればよく、その限りにおいて特に制限されるものではない。例えば、本剤がそのまま口腔内に適用される口腔用組成物である場合は、０．００５〜０．５質量％の範囲から適宜選択設定することができる。好ましくは０．０１〜０．３質量％であり、より好ましくは０．０２〜０．２質量％である。また本剤が、用時に水で希釈して口腔内に適用される口腔用組成物である場合は、希釈後の濃度が前記範囲になるようにヒノキチオールを含有するものであればよい。例えば、制限されないものの、一例を挙げると、用時に水で１０倍に希釈して使用する場合、例えばヒノキチオールを０．０５〜５質量％の濃度で含むように口腔用組成物を調製することができる。さらに本剤が、前述する口腔用組成物（そのまま使用、用時希釈使用のものを含む）に歯肉上皮細胞活性化作用、歯肉上皮細胞増殖亢進作用、歯肉バリア機能亢進作用、または歯周組織修復作用を付与するための添加剤として使用されるものである場合、前記口腔用組成物が調製できることを限度としてヒノキチオールの含有量は特に制限されることなく、例えば０．１〜１００質量％の範囲から適宜設定することができる。ちなみに、歯肉上皮細胞活性化剤が有する歯肉上皮細胞活性化効果は、後述する実験例１に示すように、対象とする歯肉上皮細胞活性化剤の存在下で歯肉上皮細胞を培養することで評価することができる。歯肉上皮細胞（生細胞）の数が、歯肉上皮細胞活性化剤の存在下での培養により、歯肉上皮細胞活性化剤非存在下の場合と比較して、増加している場合は、歯肉上皮細胞が活性化されたとして、当該歯肉上皮細胞活性化剤が当該歯肉上皮細胞活性化効果を奏するとして判断することができる。また歯肉上皮細胞増殖亢進剤が有する歯肉上皮細胞増殖亢進効果も同様な方法で判断することができる。歯肉バリア機能亢進剤が有する歯肉バリア機能亢進効果、及び歯周組織修復剤が有する歯周組織修復効果は、いずれも歯肉上皮細胞が活性化または歯肉上皮細胞の増殖が亢進することによる結果として得られる効果である（非特許文献１参照）。このため、これらの効果も、前記と同様な方法で判断することができる。

本発明の歯肉上皮細胞活性化剤、歯肉上皮細胞増殖亢進剤、歯肉バリア機能亢進剤、または歯周組織修復剤は、おのおの歯肉上皮細胞活性化用口腔組成物、歯肉上皮細胞増殖亢進用口腔組成物、歯肉バリア機能亢進用口腔組成物、または歯周組織修復用口腔組成物として、口腔内に適用されることで、各々の効果を発揮することができる。前述するように、本剤はそのまままたは水で希釈して口腔内に適用される口腔用組成物として使用されるものであってもよいし、またこれらの口腔用組成物に添加して歯肉上皮細胞活性化作用、歯肉上皮細胞増殖亢進作用、歯肉バリア機能亢進作用、または歯周組織修復作用を有する口腔用組成物を調製するための添加剤として使用されるものであってもよい。つまり、本剤は最終的には口腔組成物の形態で使用されるものであればよく、それに適した形態に調製されて提供することができる。

なお、ヒノキチオールは水に微溶性の結晶であるため、例えば本剤を口腔用組成物への添加剤として使用する場合は、ヒノキチオールをエタノールまたはプロピレングリコール等の可溶性溶媒に溶解した液剤の状態に調製されることが好ましい。

口腔組成物の形態としては、錠剤、丸剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤、乳液剤、シート剤、ゲル剤、フォーム剤及びペースト剤等のいずれの形態をも挙げることができる。これらの形態には、具体的には、歯磨き剤（粉末状、液体状、クリーム状、ペースト状の製剤を含む）、洗口剤（液体状、フォーム状の製剤を含む）、軟膏剤、パスタ剤、歯肉クリーム、歯肉ゲル、義歯安定剤、トローチ剤、咀嚼剤（チューインガム、グミ等を含む）、貼付剤（フィルム、パック）、アメ類（キャンディ、錠菓［清涼菓子、ミントタブレット、サプリメントを含む］等を含む）等が含まれる。こうした形態に調製して、口腔内で適用することで、効果的に歯肉上皮細胞を活性化し、歯肉上皮細胞の増殖を亢進し、歯肉バリア機能を亢進し、または歯周組織を修復することができ、その結果、歯肉を強化し、歯周炎、歯肉炎、歯根膜炎、智歯周囲炎、インプラント周囲炎、等の歯周組織に関する口腔内疾患の予防または治療に有効に対処することが可能になる。

これらの口腔組成物は、各形態に応じて、当該分野で使用される各種の成分を配合することができ、本発明の効果を妨げない限り、それを制限するものではない。例えば、歯磨き剤の場合、本発明の効果を妨げない範囲で、研磨剤、湿潤剤、粘結剤、発泡剤、粘稠剤、界面活性剤、甘味剤、香料、着色料、防腐剤、その他の薬用成分（例えば、抗炎症剤など）を配合することができる。

［研磨剤］沈降性シリカ、シリカゲル、アルミノシリケート、ジルコノシリケート等のシリカ系研磨剤、歯磨用リン酸水素カルシウム、第二リン酸カルシウム２水和物、第二リン酸カルシウム無水和物、ピロリン酸カルシウム等のリン酸系研磨剤、水酸化アルミニウム、アルミナ、二酸化チタン、結晶性ジルコニウムシリケート、ポリメチルメタアクリレート、不溶性メタリン酸カルシウム、軽質炭酸カルシウム、重質炭酸カルシウム、炭酸マ
グネシウム、第三リン酸マグネシウム、ゼオライト、ケイ酸ジルコニウム、ハイドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、カルシウム欠損アパタイト、第三リン酸カルシウム、第四リン酸カルシウム、第八リン酸カルシウム、合成樹脂系研磨剤。

［湿潤剤］グリセリン、濃グリセリン、ジグリセリン、ソルビット、マルチトール、ジプロピレングリコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、キシリトール等の多価アルコール等。

［粘結剤］カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルエチルセルロース、メチルセルロースなどのセルロース系粘結剤、キサンタンガム、カラギーナン、グアガム、アルギン酸ナトリウム、カチオン化セルロース、モンモリロナイト、ゼラチン、ポリアクリル酸ナトリウム等。

［発泡剤］ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、アルキルスルホコハク酸ナトリウム、ヤシ油脂肪酸モノグリセリンスルホン酸ナトリウム、α-オレフィンスルホン酸ナトリウム、N-アシルグルタメート等のN-アシルアミノ酸塩、2-アルキル-N-カルボキシメチル-N-ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、マルチトール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、アルキルグリコシド等。

［粘稠剤］グリセリン、ソルビット、プロピレングリコール、分子量２００〜６０００のポリエチレングリコール、エチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、還元でんぷん糖化物等。

［界面活性剤］アニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤、両性界面活性剤、カチオン性界面活性剤等を配合できる。アニオン性界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ−ミリストイルサルコシンナトリウム等のＮ−アシルサルコシンナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、水素添加ココナッツ脂肪酸モノグリセリドモノ硫酸ナトリウム、ラウリルスルホ酢酸ナトリウム、Ｎ−パルミトイルグルタミン酸ナトリウム等のＮ−アシルグルタミン酸塩、Ｎ−メチル−Ｎ−アシルタウリンナトリウム、Ｎ−メチル−Ｎ−アシルアラニンナトリウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。ノニオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ショ糖脂肪酸エステル、アルキロールアマイド、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、アルキルグルコシド、ラウリン酸デカグリセリル等が用いられる。両性界面活性剤としては、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインや、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン等。

［甘味剤］サッカリンナトリウム、アスパルテーム、ステビオサイド、ステビアエキス、パラメトキシシンナミックアルデヒド、ネオヘスペリジルジヒドロカルコン、ペリラルチン、スクラロース、キシリトール、還元パラチノース、エリスリトール、マルチトール等。

［香料］ペパーミント油、スペアミント油、アニス油、ユーカリ油、ウィンターグリーン油、カシア油、クローブ油、タイム油、セージ油、レモン油、オレンジ油、ハッカ油、カルダモン油、コリアンダー油、マンダリン油、ライム油、ラベンダー油、ローズマリー
油、ローレル油、カモミル油、キャラウェイ油、マジョラム油、ベイ油、レモングラス油、オリガナム油、パインニードル油、ネロリ油、ローズ油、ジャスミン油、イリスコンクリート、アブソリュートペパーミント、アブソリュートローズ、オレンジフラワー等の天然香料、及び、これら天然香料の加工処理（前溜部カット、後溜部カット、分留、液液抽出、エッセンス化、粉末香料化等）した香料や、メントール、カルボン、アネトール、シネオール、サリチル酸メチル、シンナミックアルデヒド、オイゲノール、３−ｌ−メントキシプロパン−１，２−ジオール、チモール、リナロール、リナリールアセテート、リモネン、メントン、メンチルアセテート、Ｎ−置換−パラメンタン−３−カルボキサミド、ピネン、オクチルアルデヒド、シトラール、プレゴン、カルビールアセテート、アニスアルデヒド、エチルアセテート、エチルブチレート、アリルシクロヘキサンプロピオネート、メチルアンスラニレート、エチルメチルフェニルグリシデート、バニリン、ウンデカラクトン、ヘキサナール、プロピルアルコール、ブタノール、イソアミルアルコール、ヘキセノール、ジメチルサルファイド、シクロテン、フルフラール、トリメチルピラジン、エチルラクテート、メチルラクテート、エチルチオアセテート等の単品香料、更に、ストロベリーフレーバー、アップルフレーバー、バナナフレーバー、パイナップルフレーバー、グレープフレーバー、マンゴーフレーバー、バターフレーバー、ミルクフレーバー、フルーツミックスフレーバー、トロピカルフルーツフレーバー等の調合香料等。

［着色料］青色１号、黄色４号、緑色３号等。

［防腐剤］メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン等のパラベン類、安息香酸ナトリウム、フェノキシエタノール、塩酸アルキルジアミノエチルグリシン等。

［薬用成分］フッ化ナトリウム、モノフルオロリン酸ナトリウム、フッ化スズなどのフッ素化合物、正リン酸のカリウム塩、ナトリウム塩等の水溶性リン酸化合物、ポリリン酸ナトリウム、トラネキサム酸、イプシロン−アミノカプロン酸、アラントイン、アラントインクロルヒドロキシアルミニウム、アスコルビン酸、酢酸ｄｌ−α−トコフェロール、ニコチン酸ｄｌ−ファ−α−トコフェロール、塩酸ピリドキシン、ジヒドロコレステロール、α−ビサボロール、クロルヘキシジン塩類、アズレンスルホン酸ナトリウム、グァイアズレンスルホン酸、グリチルレチン、グリチルレチン酸、グルコン酸銅等の銅化合物、乳酸アルミニウム、塩化ストロンチウム、硝酸カリウム、ベルベリン、ヒドロキサム酸及びその誘導体、ゼオライト、メトキシエチレン無水マレイン酸共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、エピジヒドロコレステリン、塩化セチルピリジウム、塩化ベンゼトニウム、イソプロピルメチルフェノール、ラウロイルサルコシンナトリウム、ジヒドロコレステロール、トリクロロカルバニリド、クエン酸亜鉛、トウキ軟エキス、オウバクエキス、カミツレ、チョウジ、ローズマリー、オウゴン、ベニバナ等の抽出物、塩化リゾチーム、塩化ナトリウム等。

なお、これら任意成分の配合量は、本発明の効果を妨げない範囲で、当業界で使用される通常の量とすることができる。

斯くして口腔組成物の形態に調製される本剤は、その形態に応じて通常の使用をすることで、対象とする被験者の口腔内を処理することができる。例えば、歯磨き剤の形態を有する場合、本剤を用いて被験者の歯を磨くことで本剤の各々の効果を発揮することができる。また、洗口剤の形態を有する場合、本剤を用いて被験者の口腔を洗浄（リンス）することで本剤の各々の効果を発揮することができる。本剤が前述するその他の形態を有する場合も同様である。なお、制限されないが、本発明の効果をより発揮するうえでは、口腔内に適用される際に、唾液を含む口腔内でのヒノキチオールの濃度が１ｎＭ〜２０ｍＭの範囲、好ましくは１０ｎＭ〜１０ｍＭ、より好ましくは５０ｎＭ〜５ｍＭになるように、調製されることが好ましい。

本剤を口腔内に適用する回数は特に制限されず、１日に１回乃至複数回、好ましくは食後、または／及び就寝前後に実施することができる。

以上、本明細書において、「含む」及び「含有する」の用語には、「からなる」及び「から実質的になる」という意味が含まれる。

以下、本発明の構成及び効果について、その理解を助けるために、実験例を用いて本発明を説明する。但し、本発明はこれらの実験例によって何ら制限を受けるものではない。以下の実験は、特に言及しない限り、室温（約２５℃）、及び大気圧条件下で実施した。

実験例１ ヒノキチオールの歯肉上皮細胞の増殖に対する作用
歯肉上皮細胞をヒノキチオールの存在下または非存在下で培養して、経時的に生細胞数を測定し、ヒノキチオールの歯肉上皮細胞の増殖に対する作用を評価した。

１．材料
細胞：歯肉上皮細胞（ＯＢＡ−９、国立大学法人大阪大学より供与）
培地：ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２（倉敷紡績株式会社製）
生細胞測定用試薬：Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（株式会社同仁化学研究所製）
ヒノキチオール：東京化成工業株式会社
ヒノキチオール用溶媒：ジメチルスルホキシド５０ｐｐｍ、ＰＯＥ硬化ヒマシ油５０ｐｐｍ

２．実験方法
歯肉上皮細胞を、培地を入れた９６ウェルプレートに、５×１０^３個／ウェルの割合で播種し、インキュベーター（３７℃、５％ ＣＯ_２）内で、２４時間培養した。初期サンプルについては、ウェルから培地を除去し、歯肉上皮細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＣＣＫキット付属のＣＣＫ希釈溶液（ＣＣＫ溶液：培地＝１：１０）を１００μＬ添加し、インキュベーター（３７℃、５％ ＣＯ_２）内にて1時間静置した後、波長４５０ｎｍ及び６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。また、培養サンプルについては、ウェルから培地を除去した後、表１に記載する被験試料液を添加して、インキュベーター（３７℃、５％ ＣＯ_２）で２４時間、４８時間、または７２時間培養した。次いで、培地と被験試料液を除去して、歯肉上皮細胞をＰＢＳで洗浄し、ＣＣＫ希釈溶液(同上)を１００μＬ添加して、インキュベーター（３７℃、５％ ＣＯ_２）内にて1時間静置した後、波長４５０ｎｍ及び６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

培養サンプル（比較例、実施例１〜３）における生細胞数は、波長４５０ｎｍの吸光度と６５０ｎｍの吸光度の差（吸光度_450nm−吸光度_650nm）について、初期サンプルにおける当該差（吸光度_450nm−吸光度_650nm）と比較して、算出した。

３．結果
結果を表２及び図１に示す。なお、表２及び図１は、いずれも初期サンプルの生細胞数を１とした相対比で示す。

表２及び図１に示すように、ヒノキチオール不存在下で培養した歯肉上皮細胞の生細胞数（比較例）と比較して、ヒノキチオール存在下で培養した歯肉上皮細胞の生細胞数（実施例１〜３）はいずれも増加していた。また、２４時間の培養では、実施例１は実施例２及び３よりも高い増殖傾向を示し、４８時間以降では実施例１及び２は、実施例３よりも高い亢進作用を発揮することが確認された。以上のことから、ヒノキチオールには、歯肉上皮細胞を活性化して、その細胞増殖を亢進する作用があることが判明した。

下記の処方により、歯磨剤（表３）、洗口液（表４）、及びゲル剤（表５）の形態を有する本発明の製剤を調製することができる。

Claims (5)

1. ヒノキチオールを有効成分として含有することを特徴とする、歯肉上皮細胞活性化剤。
2. ヒノキチオールを有効成分として含有することを特徴とする、歯肉上皮細胞増殖亢進剤。
3. ヒノキチオールを有効成分として含有することを特徴とする、歯肉バリア機能亢進剤。
4. ヒノキチオールを有効成分として含有することを特徴とする、歯周組織修復剤。
5. ヒノキチオールを口腔組成物に配合することにより、当該口腔組成物に対して、歯肉上皮細胞活性化作用、歯肉上皮細胞増殖亢進作用、歯肉バリア機能亢進作用、及び歯周組織修復作用よりなる群から選択される少なくとも１つの作用を付与することを特徴とする、ヒノキチオールの使用方法。