WO2021033662A1

WO2021033662A1 - 歯肉組織破壊抑制剤

Info

Publication number: WO2021033662A1
Application number: PCT/JP2020/030991
Authority: WO
Inventors: 友美長谷川; 岡本　浩明; 牧中村
Original assignee: 小林製薬株式会社
Priority date: 2019-08-19
Filing date: 2020-08-17
Publication date: 2021-02-25
Also published as: JP7424770B2; JP2021031406A

Abstract

【課題】コラーゲン分解酵素による歯肉組織の破壊を抑制するために使用される口腔組成物を提供する。また、コラーゲン分解酵素による歯肉組織の破壊に起因する歯肉退縮を抑制または改善するために使用される口腔組成物を提供する。さらに、歯周組織における細菌感染によるコラーゲン分解酵素の産生を抑制するために使用される口腔組成物を提供する。【解決手段】ヒノキチオールを有効成分として配合し、歯肉組織破壊抑制剤、歯肉退縮抑制または改善剤、歯肉バリア機能亢進剤、または歯周組織におけるコラーゲン分解酵素の産生抑制剤として調製する。

Description

歯肉組織破壊抑制剤

　本発明は、コラーゲン分解酵素ＭＭＰ－１による歯肉組織の破壊を抑制するために使用される口腔組成物に関する。また本発明は、歯肉組織の破壊を抑制し、歯肉の退縮を抑制または改善するために使用される口腔組成物に関する。さらに本発明は、歯周組織におけるＭＭＰ－１の発現及び産生を抑制するために使用される口腔組成物に関する。

　歯周病は、歯周組織の炎症性疾患であり、細菌の組織内侵入及び感染に対する宿主応答がその原因となっている。特にポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）は、歯周病の中で最も多いとされる成人性歯周病の病原菌として有力視されている細菌である。

　歯肉（歯茎）組織は、歯牙を支持する歯周組織であり、歯肉細胞（歯肉上皮細胞や歯肉線維芽細胞等）及び当該歯肉細胞が産生するコラーゲン等の細胞外マトリックスによって構成されている。特に歯周組織の構成成分の約60％はコラーゲンであると言われている。細菌感染や炎症等によって歯肉細胞が損傷を受けると、歯肉線維芽細胞や免疫担当細胞が感染防御反応のためにコラーゲン分解酵素（コラゲナーゼ）を過剰に産生し、その結果、コラーゲンが分解されて、歯肉組織の破壊や歯肉の退縮（縮小、後退）が引き起こされる。また免疫応答などの感染防御反応から免れた細菌そのものもコラーゲン分解酵素やトリプシン様酵素を産生することが知られており、その結果、組織破壊とさらなる組織内侵入を可能にしている（非特許文献１）。こうしたコラーゲン分解酵素による歯肉組織の破壊や退縮は、歯周病の進行を招き、歯の喪失要因にもなる。

　コラーゲン等の細胞外マトリックスに作用してその分解を促す金属酵素群は、一般に、マトリックスメタロプロテアーゼ（本明細書において、単に「ＭＭＰ」とも称する）と呼ばれている。このうち、コラーゲンの分解を促すコラーゲン分解酵素（コラゲナーゼ：ＭＭＰ－１やＭＭＰ－８）は、歯周組織の付着上皮及び歯周ポケット上皮周辺に発現していることが報告されている（非特許文献２）。このことからも、ＭＭＰの発現及び産生量の増大や活性の上昇が、前述する歯肉組織の破壊や歯肉の退縮、及び歯周病の病態の進行に密接に関係していることがわかる。実際のところ、歯周病患者の口腔洗浄液、歯肉溝滲出液及び唾液内に含まれるＭＭＰ量は、歯周病患者の病態を反映しており、歯周病の治療処置を施すことにより、ＭＭＰ量が減少したことも報告されている（非特許文献３）。また歯肉炎患者と健常者のＭＭＰの量を測定したところ、歯肉炎患者が保有するＭＭＰ量は非常に多く、しかも歯周病患者に至っては著量であったことも報告されている（非特許文献４）。このことから、歯周組織におけるＭＭＰの産生を抑制する物質またはＭＭＰの酵素活性を阻害する物質は、局所的炎症やその増悪に伴う歯周組織の病態の進行を抑制するうえで有用であると考えられる。

　ところで、ヒノキチオールは従来より、抗菌作用、抗炎症作用、及び組織の収斂作用などが知られており、歯肉炎や歯槽膿漏の予防や治療を目的として口腔組成物に配合されている。また、毛包機能賦活作用を有すること（特許文献１）、またサイコサポニンが有する皮膚細胞増殖作用を増強する作用を有すること（特許文献２）などが知られている。しかし、ヒノキチオールに、マトリックスメタロプロテアーゼの一種であるコラゲナーゼ分解酵素（線維芽細胞コラゲナーゼ：ＭＭＰ－１）の産生を抑制する作用があること、特に成人性歯周病の病原菌として有力視されているポルフィロモナス・ジンジバリス（P. gingivalis）の感染に起因するＭＭＰ－１の産生増加を抑制する作用があることについては、知られていなかった。

特開２００２－４７１４５号公報特開平５－２６２６３５号公報

菊池毅ら「歯周病における組織破壊に関する免疫学的考察」、日歯周誌、59（4）：185-190、2017 M. Kylmaniemi et al., J. Dent Res., 75, pp.919-926 (1996) M. Makela et al., J. Dent Res., 73, pp.1397-1406 (1994) A. Haerian et al., J. Clin Periodontol., 22, pp.505-509 (1995)

　本発明は、ヒノキチオールについて見出した新たな作用に基づいて、新たな用途を提供手することを目的とする。具体的には、ヒノキチオールが有する作用に基づいて、歯肉組織破壊抑制剤、歯肉退縮抑制または改善剤、及び歯周組織におけるＭＭＰ－１の産生抑制剤としての用途を提供することを目的とする。

　本発明者らは、日々の研究の中で、歯周組織において歯周病菌の感染等に起因して生じるＭＭＰ－１の産生量の増大が、ヒノキチオールで処理することで抑制されて低減することを新たに見出した。ヒノキチオールのこうした作用によれば、歯肉組織をＭＭＰ－１による破壊から守り、また歯肉の退縮（縮小や後退）を予防または改善することができると考えられる。また、歯肉組織をＭＭＰ－１による破壊から守ることで、歯周炎や歯周病の増悪を予防することも可能である。本発明は、かかる知見に基づいて完成したものであり、下記の実施形態を含有するものである。

項１．ヒノキチオールを有効成分として含有することを特徴とする、歯肉組織破壊抑制剤。
項２．ヒノキチオールを有効成分として含有することを特徴とする、歯肉退縮抑制または改善剤。
項３．ヒノキチオールを有効成分として含有することを特徴とする、歯周組織におけるコラーゲン分解酵素ＭＭＰ－１の産生抑制剤。
項４．ヒノキチオールを口腔組成物に配合することにより、当該口腔組成物に対して、歯肉組織破壊抑制作用、歯肉退縮抑制または改善作用、及び歯周組織におけるコラゲナーゼ分解酵素ＭＭＰ－１の産生抑制作用よりなる群から選択される少なくとも１つの作用を付与することを特徴とする、ヒノキチオールの使用方法。なお、当該使用方法は、歯肉組織破壊抑制剤、歯肉退縮抑制または改善剤、及び歯周組織におけるＭＭＰ－１の産生抑制剤よりなる群から選択される少なくとも１つの口腔組成物を製造するための、ヒノキチオールの使用と言い換えることもできる。

　本発明の歯肉組織破壊抑制剤で口腔内を処理することで、歯周組織におけるＭＭＰ－１の産生増大を抑制することができ、その結果、歯肉組織の破壊を抑制することができる。また本発明の歯肉退縮抑制または改善剤で口腔内を処理することで、ＭＭＰ－１による歯肉組織の破壊を抑制することができ、その結果、歯肉の縮小や後退を抑制し、または改善することができる。さらに本発明のＭＭＰ－１産生抑制剤で口腔内を処理することで、歯周病菌の感染等に起因する歯周組織におけるＭＭＰ－１の産生増大を抑制することができ、その結果、歯肉組織の破壊を抑制することができる。また、歯肉の縮小や後退を抑制し、または改善することができる。このように、本発明の各種用途の口腔組成物によれば、ＭＭＰ－１に起因する歯肉組織の炎症（歯肉炎を含む）や、その増悪に伴う歯周組織の病態（歯周病を含む）の進行を抑制し、改善するうえで有用である。

ヒト歯肉線維芽細胞（ＨＧＦ－１）を、ポルフィロモナス・ジンジバリス由来のリポポリサッカライド（ＬＰＳ－ＰＧ）の存在下、ヒノキチオールの非存在（比較例）または存在（実施例１：１ｐｐｍ、実施例２：５ｐｐｍ）の条件で培養して、２４時間及び４８時間後に１型ヒト線維芽細胞コラゲナーゼ（ＭＭＰ－１）の産生量（ｐｇ／ｍＬ）を測定し、その結果を、生細胞数あたりに換算した結果を示す図である。図はｎ＝６の平均値を示す。

　本発明の歯肉組織破壊抑制剤、歯肉退縮抑制または改善剤、及び歯周組織におけるＭＭＰ－１の産生抑制剤は、いずれもヒノキチオールを有効成分として含有することを特徴とする。

　ヒノキチオールは、下式で示される化合物である。

　ヒノキチオール（2-ヒドロキシ-4-イソプロピルシクロヘプタ-2,4,6-トリエン-1-オン、別名として「β－ツヤプリシン（Thujaplicin）」とも称される）は、タイワンヒノキや青森ヒバ等の精油中に含まれる天然物であり、低毒性であるものの、広い抗菌スペクトルを有し、優れた抗菌作用を有する結晶性物質である。金属イオンと接触すると塩を形成するが、本発明ではその塩も含めてヒノキチオールと総称する。ヒノキチオールは前述するタイワンヒノキやヒバから抽出された精油から単離することもできるが、最近では、化学合成によっても製造されて提供されてもいる。本発明で使用されるヒノキチオールは、天然由来および合成品の別を問わない。また、本発明の効果を損なわないことを限度として、精製品に拘らず、精油または精油の粗精製物であってもよい。

　本発明の歯肉組織破壊抑制剤、歯肉退縮抑制または改善剤、または歯周組織におけるＭＭＰ－１の産生抑制剤（以下、これらを総称して「本剤」とも称する。）におけるヒノキチオールの配合量は、各剤を口腔組成物として口腔内に適用した場合に、各々の効果を奏するヒノキチオール量であればよく、その限りにおいて特に制限されるものではない。例えば、本剤がそのまま口腔内に適用される口腔用組成物である場合は、０．００５～０．５質量％の範囲から適宜選択設定することができる。好ましくは０．０１～０．３質量％であり、より好ましくは０．０２～０．２質量％である。また本剤が、用時に水で希釈して口腔内に適用される口腔用組成物である場合は、希釈後の濃度が前記範囲になるようにヒノキチオールを含有するものであればよい。例えば、制限されないものの、一例を挙げると、用時に水で１０倍に希釈して使用する場合、例えばヒノキチオールを０．０５～５質量％の濃度で含むように口腔用組成物を調製することができる。さらに本剤が、前述する口腔用組成物（そのまま使用、用時希釈使用のものを含む）に歯肉組織破壊抑制作用、歯肉退縮抑制若しくは改善作用、または歯周組織におけるＭＭＰ－１の産生抑制作用を付与するための添加剤として使用されるものである場合、前記口腔用組成物が調製できることを限度としてヒノキチオールの含有量は特に制限されることなく、例えば０．１～１００質量％の範囲から適宜設定することができる。ちなみに、歯肉組織破壊抑制が有する歯肉組織の破壊抑制効果は、歯周病菌感染による歯周組織におけるＭＭＰ－１産生増大を低減し抑制するヒノキチオールの作用に起因するものであり、後述する実験例１に示すように、対象とするヒト歯肉線維芽細胞をP．gingivalisまたはそのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）の存在下、歯肉上皮細胞活性化剤で処理することで評価することができる。ヒト歯肉線維芽細胞において発現産生されるＭＭＰ－１の量が、歯肉組織破壊抑制で処理することで、歯肉組織破壊抑制で処理しない場合と比較して低減している場合は、歯肉組織破壊抑制により歯周病菌感染による歯周組織におけるＭＭＰ－１産生増大が低減抑制されたとして、当該歯肉組織破壊抑制は、ＭＭＰ－１による歯肉組織の破壊を抑制することができる、つまり、歯肉組織破壊抑制効果を奏するとして判断することができる。また歯肉退縮抑制または改善剤が有する歯肉退縮抑制または改善効果も同様な方法で判断することができる。なお、改善効果は、歯肉退縮が抑制されることで、経時的に歯肉組織が健常な状態に戻る（回復）ことにより得られる効果である。歯肉の退縮には、歯肉の縮小または／及び後退が含まれる。また、本発明の歯周組織におけるＭＭＰ－１の産生抑制剤が有するＭＭＰ－１の産生抑制効果も同様な方法で判断することができる。

　本発明の歯肉組織破壊抑制剤、歯肉退縮抑制または改善剤、または歯周組織におけるＭＭＰ－１の産生抑制剤は、おのおの歯肉組織破壊抑制用口腔組成物、歯肉退縮抑制または改善用口腔組成物、または歯周組織におけるＭＭＰ－１の産生抑制用口腔組成物として、口腔内に適用されることで、各々の効果を発揮することができる。前述するように、本剤はそのまままたは水で希釈して口腔内に適用される口腔用組成物として使用されるものであってもよいし、またこれらの口腔用組成物に添加して歯肉組織破壊抑制作用、歯肉退縮抑制若しくは改善作用、または歯周組織におけるＭＭＰ－１の産生抑制作用を有する口腔用組成物を調製するための添加剤として使用されるものであってもよい。つまり、本剤は最終的には口腔組成物の形態で使用されるものであればよく、それに適した形態に調製されて提供することができる。

　なお、ヒノキチオールは水に微溶性の結晶であるため、例えば本剤を口腔用組成物への添加剤として使用する場合は、ヒノキチオールをエタノールまたはプロピレングリコール等の可溶性溶媒に溶解した液剤の状態に調製されることが好ましい。

口腔組成物の形態としては、錠剤、丸剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤、乳液剤、シート剤、ゲル剤、フォーム剤及びペースト剤等のいずれの形態をも挙げることができる。これらの形態には、具体的には、歯磨き剤（粉末状、液体状、クリーム状、ペースト状の製剤を含む）、洗口剤（液体状、フォーム状の製剤を含む）、軟膏剤、パスタ剤、歯肉クリーム、歯肉ゲル、義歯安定剤、トローチ剤、咀嚼剤（チューインガム、グミ等を含む）、貼付剤（フィルム、パック）、アメ類（キャンディ、錠菓［清涼菓子、ミントタブレット、サプリメントを含む］等を含む）等が含まれる。こうした形態に調製して口腔内で適用することで、効果的にＭＭＰ－１産生増大を抑止し、その結果ＭＭＰ－１による歯肉組織の破壊が抑制され、歯肉の退縮抑制または改善することができる。これらの作用により、歯肉の炎症や歯周疾患の増悪を阻止し、健常化することで、歯周炎、歯肉炎、歯根膜炎、智歯周囲炎、インプラント周囲炎、等の歯周組織に関する口腔内疾患の予防または治療に有効に対処することが可能になる。

　これらの口腔組成物は、各形態に応じて、当該分野で使用される各種の成分を配合することができ、本発明の効果を妨げない限り、それを制限するものではない。例えば、歯磨き剤の場合、本発明の効果を妨げない範囲で、研磨剤、湿潤剤、粘結剤、発泡剤、粘稠剤、界面活性剤、甘味剤、香料、着色料、防腐剤、その他の薬用成分（例えば、抗炎症剤など）を配合することができる。

［研磨剤］沈降性シリカ、シリカゲル、アルミノシリケート、ジルコノシリケート等のシリカ系研磨剤、歯磨用リン酸水素カルシウム、第二リン酸カルシウム２水和物、第二リン酸カルシウム無水和物、ピロリン酸カルシウム等のリン酸系研磨剤、水酸化アルミニウム、アルミナ、二酸化チタン、結晶性ジルコニウムシリケート、ポリメチルメタアクリレート、不溶性メタリン酸カルシウム、軽質炭酸カルシウム、重質炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、第三リン酸マグネシウム、ゼオライト、ケイ酸ジルコニウム、ハイドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、カルシウム欠損アパタイト、第三リン酸カルシウム、第四リン酸カルシウム、第八リン酸カルシウム、合成樹脂系研磨剤。

［湿潤剤］グリセリン、濃グリセリン、ジグリセリン、ソルビット、マルチトール、ジプロピレングリコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、キシリトール等の多価アルコール等。

［粘結剤］カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルエチルセルロース、メチルセルロースなどのセルロース系粘結剤、キサンタンガム、カラギーナン、グアガム、アルギン酸ナトリウム、カチオン化セルロース、モンモリロナイト、ゼラチン、ポリアクリル酸ナトリウム等。

［発泡剤］ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、アルキルスルホコハク酸ナトリウム、ヤシ油脂肪酸モノグリセリンスルホン酸ナトリウム、α-オレフィンスルホン酸ナトリウム、N-アシルグルタメート等のN-アシルアミノ酸塩、2-アルキル-N-カルボキシメチル-N-ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、マルチトール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、アルキルグリコシド等。

［粘稠剤］グリセリン、ソルビット、プロピレングリコール、分子量２００～６０００のポリエチレングリコール、エチレングリコール、１，３－ブチレングリコール、還元でんぷん糖化物等。

［界面活性剤］アニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤、両性界面活性剤、カチオン性界面活性剤等を配合できる。アニオン性界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸ナトリウム、Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ－ミリストイルサルコシンナトリウム等のＮ－アシルサルコシンナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、水素添加ココナッツ脂肪酸モノグリセリドモノ硫酸ナトリウム、ラウリルスルホ酢酸ナトリウム、Ｎ－パルミトイルグルタミン酸ナトリウム等のＮ－アシルグルタミン酸塩、Ｎ－メチル－Ｎ－アシルタウリンナトリウム、Ｎ－メチル－Ｎ－アシルアラニンナトリウム、α－オレフィンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。ノニオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ショ糖脂肪酸エステル、アルキロールアマイド、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、アルキルグルコシド、ラウリン酸デカグリセリル等が用いられる。両性界面活性剤としては、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインや、Ｎ－ヤシ油脂肪酸アシル－Ｎ－カルボキシメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン等。

［甘味剤］サッカリンナトリウム、アスパルテーム、ステビオサイド、ステビアエキス、パラメトキシシンナミックアルデヒド、ネオヘスペリジルジヒドロカルコン、ペリラルチン、スクラロース、キシリトール、還元パラチノース、エリスリトール、マルチトール等。

［香料］ペパーミント油、スペアミント油、アニス油、ユーカリ油、ウィンターグリーン油、カシア油、クローブ油、タイム油、セージ油、レモン油、オレンジ油、ハッカ油、カルダモン油、コリアンダー油、マンダリン油、ライム油、ラベンダー油、ローズマリー油、ローレル油、カモミル油、キャラウェイ油、マジョラム油、ベイ油、レモングラス油、オリガナム油、パインニードル油、ネロリ油、ローズ油、ジャスミン油、イリスコンクリート、アブソリュートペパーミント、アブソリュートローズ、オレンジフラワー等の天然香料、及び、これら天然香料の加工処理（前溜部カット、後溜部カット、分留、液液抽出、エッセンス化、粉末香料化等）した香料や、メントール、カルボン、アネトール、シネオール、サリチル酸メチル、シンナミックアルデヒド、オイゲノール、３－ｌ－メントキシプロパン－１，２－ジオール、チモール、リナロール、リナリールアセテート、リモネン、メントン、メンチルアセテート、Ｎ－置換－パラメンタン－３－カルボキサミド、ピネン、オクチルアルデヒド、シトラール、プレゴン、カルビールアセテート、アニスアルデヒド、エチルアセテート、エチルブチレート、アリルシクロヘキサンプロピオネート、メチルアンスラニレート、エチルメチルフェニルグリシデート、バニリン、ウンデカラクトン、ヘキサナール、プロピルアルコール、ブタノール、イソアミルアルコール、ヘキセノール、ジメチルサルファイド、シクロテン、フルフラール、トリメチルピラジン、エチルラクテート、メチルラクテート、エチルチオアセテート等の単品香料、更に、ストロベリーフレーバー、アップルフレーバー、バナナフレーバー、パイナップルフレーバー、グレープフレーバー、マンゴーフレーバー、バターフレーバー、ミルクフレーバー、フルーツミックスフレーバー、トロピカルフルーツフレーバー等の調合香料等。

［着色料］青色１号、黄色４号、緑色３号等。

［防腐剤］メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン等のパラベン類、安息香酸ナトリウム、フェノキシエタノール、塩酸アルキルジアミノエチルグリシン等。

［薬用成分］フッ化ナトリウム、モノフルオロリン酸ナトリウム、フッ化スズなどのフッ素化合物、正リン酸のカリウム塩、ナトリウム塩等の水溶性リン酸化合物、ポリリン酸ナトリウム、トラネキサム酸、イプシロン－アミノカプロン酸、アラントイン、アラントインクロルヒドロキシアルミニウム、アスコルビン酸、酢酸ｄｌ－α－トコフェロール、ニコチン酸ｄｌ－α－トコフェロール、塩酸ピリドキシン、ジヒドロコレステロール、α－ビサボロール、クロルヘキシジン塩類、アズレンスルホン酸ナトリウム、グァイアズレンスルホン酸、グリチルレチン、グリチルレチン酸、グルコン酸銅等の銅化合物、乳酸アルミニウム、塩化ストロンチウム、硝酸カリウム、ベルベリン、ヒドロキサム酸及びその誘導体、ゼオライト、メトキシエチレン無水マレイン酸共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、エピジヒドロコレステリン、塩化セチルピリジウム、塩化ベンゼトニウム、イソプロピルメチルフェノール、ラウロイルサルコシンナトリウム、ジヒドロコレステロール、トリクロロカルバニリド、クエン酸亜鉛、トウキ軟エキス、オウバクエキス、カミツレ、チョウジ、ローズマリー、オウゴン、ベニバナ等の抽出物、塩化リゾチーム、塩化ナトリウム等。

なお、これら任意成分の配合量は、本発明の効果を妨げない範囲で、当業界で使用される通常の量とすることができる。

　斯くして口腔組成物の形態に調製される本剤は、その形態に応じて通常の使用をすることで、対象とする被験者の口腔内を処理することができる。例えば、歯磨き剤の形態を有する場合、本剤を用いて被験者の歯を磨くことで本剤の各々の効果を発揮することができる。また、洗口剤の形態を有する場合、本剤を用いて被験者の口腔を洗浄（リンス）することで本剤の各々の効果を発揮することができる。本剤が前述するその他の形態を有する場合も同様である。なお、制限されないが、本発明の効果をより発揮するうえでは、口腔内に適用される際に、唾液を含む口腔内でのヒノキチオールの濃度が１ｎＭ～２０ｍＭの範囲、好ましくは１０ｎＭ～１０ｍＭ、より好ましくは１０ｎＭ～５ｍＭになるように、調製されることが好ましい。

本剤を口腔内に適用する回数は特に制限されず、１日に１回乃至複数回、好ましくは食後、または／及び就寝前後に実施することができる。

　以上、本明細書において、「含む」及び「含有する」の用語には、「からなる」及び「から実質的になる」という意味が含まれる。

　以下、本発明の構成及び効果について、その理解を助けるために、実験例を用いて本発明を説明する。但し、本発明はこれらの実験例によって何ら制限を受けるものではない。以下の実験は、特に言及しない限り、室温（約２５℃）、及び大気圧条件下で実施した。

　実験例１　ヒノキチオールの歯肉上皮細胞の増殖に対する作用
　ヒト歯肉線維芽細胞（ＨＧＦ－１）を、ポルフィロモナス・ジンジバリス由来のリポポリサッカライド（ＬＰＳ－ＰＧ）の存在下、ヒノキチオールの存在または非存在の条件で培養して、経時的に１型ヒト線維芽細胞コラゲナーゼ（ＭＭＰ－１）の産生量を測定し、歯肉細胞におけるコラーゲン分解酵素の発現及び産生に対するヒノキチオールの作用を評価した。

１．材料
　細胞：正常ヒト歯肉線維芽細胞（ＨＧＦ－１細胞）（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－２０１４）
　培地：Ｄ－ＭＥＭ　Ｈｉｇｈ　Ｇｌｕｃｏｓｅ（富士フイルム和光純薬株式会社製）
　生細胞測定用試薬：
　（1）ＭＭＰ－１　ＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ　Ｔｏｔａｌ　ＭＭＰ－１　Ｄｕｏ　Ｓｅｔ　ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄシステムズ社製）
　（2）Ｃｅｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８Ｃｅｌ（株式会社同仁化学研究所製）
　ＬＰＳ－ＰＧ：ポルフィロモナス・ジンジバリス［Pg］由来のリポポリサッカライド（ナカライテスク株式会社製）
　ヒノキチオール：東京化成工業株式会社
　ヒノキチオール用溶媒：ジメチルスルホキシド５０ｐｐｍ、ＰＯＥ硬化ヒマシ油５０ｐｐｍ

２．実験方法
（１）ＭＭＰ－１量の測定
　正常ヒト歯肉線維芽細胞（ＨＧＦ－１細胞）を、培地を入れた９６ウェルプレートに、１×１０^４個／ウェルの割合で播種し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内で、２４時間培養（初期培養）した。初期培養（２４時間）後に、培地を除去し、表１に記載する被験試料液（比較例、実施例１及び２）、及びＬＰＳ－ＰＧ（終濃度１０μｇ／ｍＬ）を添加して、さらにインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）で２４時間、または４８時間培養した（曝露培養）。培養から２４時間及び４８時間後に、それぞれ検体液（培養液）を回収して、ＭＭＰ－１ＥＬＩＳＡキットのマニュアルに従って、ＥＬＩＳＡ法により培養液中のＭＭＰ－１量（ｐｇ／ｍＬ）を測定した。

（２）生細胞数の測定
　前記培養２４時間及び４８時間後に回収した検体液（培養液）中の生細胞数は、前記ＣＣＫキットを用いて測定した。具体的には、まず前記初期培養により得られたサンプル（初期サンプル）について、ウェルから培地を除去し、歯肉線維芽細胞をＰＢＳで洗浄し、ＣＣＫキット付属のＣＣＫ希釈溶液（ＣＣＫ溶液：培地＝１:１０）を１００μＬ添加して、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内にて１時間静置した後、波長４５０ｎｍ及び６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。また、前記曝露培養により得られたサンプル（曝露サンプル）については、ウェルから回収した検体液から培地と被験試料液を除去して、歯肉線維芽細胞をＰＢＳで洗浄し、ＣＣＫ希釈溶液（同上）を１００μＬ添加して、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内にて１時間静置した後、波長４５０ｎｍ及び６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。曝露サンプル（検体液）中の生細胞数は、測定した波長４５０ｎｍの吸光度と６５０ｎｍの吸光度の差（吸光度_450nm－吸光度_650nm）を、初期サンプルについて測定した当該差（吸光度_450nm－吸光度_650nm）と比較して、算出した。

３．結果
　比較例、並びに実施例１及び２について、検体液（培養液）中のＭＭＰ－１量（ｐｇ／ｍＬ）を表２及び図１に示す。なお、表２及び図１に示す値は、いずれも比較例のサンプルを２４時間または４８時間培養した後のサンプルに含まれる生細胞数を１として、生細胞数（相対値）あたりのＭＭＰ－１量（ｐｇ／ｍＬ）に換算したものである。また、結果は試験数（ｎ＝６）の平均値である。

　表２及び図１に示すように、ヒト歯肉線維芽細胞にポルフィロモナス・ジンジバリス由来のリポポリサッカライド（ＬＰＳ－ＰＧ）を添加し培養したところ、ヒノキチオール非存在下では、ヒト歯肉線維芽細胞中のコラーゲン分解酵素ＭＭＰ－１の発現産生量が経時的に増加することが確認された（比較例）。これに対して、ヒト歯肉線維芽細胞をヒノキチオール存在下で培養することで（実施例１及び２）、ヒノキチオール不存在下で培養したＭＭＰ－１量（比較例）と比較して、ＭＭＰ－１産生量は顕著に減少することが確認された。このことから、ヒノキチオールには、歯肉組織において細菌感染によって産生が増大するＭＭＰ－１の量を抑制し低減する作用があることが判明した。このことから、ヒノキチオールによれば、細菌感染によるコラーゲン分解酵素の過剰産生を抑制することで、コラーゲン分解酵素による歯周組織の破壊や歯肉退縮を予防ないし改善することができると考えられる。

［処方例］
　下記の処方に従って、歯磨剤（表３）、洗口液（表４）、及びゲル剤（表５）の形態を有する本発明の製剤を調製することができる。

Claims

　ヒノキチオールを有効成分として含有することを特徴とする、歯肉組織破壊抑制剤。
　ヒノキチオールを有効成分として含有することを特徴とする、歯肉退縮抑制または改善剤。
　ヒノキチオールを有効成分として含有することを特徴とする、歯周組織におけるコラーゲン分解酵素ＭＭＰ－１の産生抑制剤。
　ヒノキチオールを口腔組成物に配合することにより、当該口腔組成物に対して、歯肉組織破壊抑制作用、歯肉退縮抑制または改善作用、及びコラーゲン分解酵素ＭＭＰ－１の発現または産生抑制作用よりなる群から選択される少なくとも１つの作用を付与することを特徴とする、ヒノキチオールの使用方法。