JP2020526595A - 光増感剤、その誘導体および用途 - Google Patents

光増感剤、その誘導体および用途 Download PDF

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Abstract

【課題】光増感剤およびその誘導体、使用を提供する。
【解決手段】係る光増感剤は、一般式Ｉの構造を有する「ただし、ＸはＳまたはＳeであり、Ｙは有機または無機イオンであり、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立してＨ、アルキル基、アルコキシ基、アミド基、アルキルアジド基などであり、Ｒ３はＨ、アルキル基、アルコキシ基、アミノ基、スルホニル基、ヒドロキシ基およびカルボキシ基から選択されるものであり、Ｌ１はリンカーを表し、−（ＣＨ２）ｎ１−または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ２−である。」。係る誘導体は、前記光増感剤に抗癌化学療法剤分子または腫瘍標的機能を有する分子薬を結合したものである。前記光増感剤は、優れた近赤外特性を有し、暗所毒性が低く、光線力学的療法による腫瘍治療の分野に用いられる。係る誘導体は、腫瘍標的機能を有する分子をベンゾフェノチアジンまたはベンゾフェノセレナジンの構造に導入することにより腫瘍組織の光増感剤に対する特異的摂取を向上することができ、或いは臨床に使用される抗癌剤をベンゾフェノチアジンまたはベンゾフェノセレナジンの構造に導入することにより光線力学的療法と化学療法で相乗的に治療する目的を達成することができる。
【化１】

【選択図】なし

Description

本発明は、抗癌剤の設計、合成分野に属し、具体的にベンゾフェノチアジン類光増感剤の設計、製造方法および使用に関する。
世界保健機関（ＷＨＯ）の統計によると、２０世紀８０年代に、毎年世界中で癌患者は約７００万増加し、毎年癌で死亡する者は約５００万人である。癌は猛烈で阻むことができないほどの勢いで人間を攻撃している。光線力学的療法（ＰＤＴと略す）は、光化学、光物理学および光生物学的原理を疾患の診断・治療に応用する方法である。古くから光で皮膚病を治療できることは知られるが、１９世紀に紫外線照射を用いる方法が結核による顔損害に対して良好な治療効果を果たせることは偶然に発見された。医療技術の発展に伴い、光照射の方法は、例えば、紫外線で微生物を死滅させることや、太陽光または人工光を照射することでビタミンＤに乏しい疾患を治療・予防することなど、様々な面で利用できることも発見された。最近３０年間、レーザ技術、分子生物学および光ファイバ伝送光学信号技術の急速な発展に伴い、光線力学的療法はますます注目され、悪性腫瘍やその他の疾患を治療するための効率的で実用的な手法になりつつある。
光線力学的療法は、手術、放射線療法および化学療法と異なり、毒性が小さく、効き目が速く、繰り返し使用されても薬剤耐性が生じず、腫瘍組織に良好な選択性があり、正常組織を脅かさずに腫瘍を死滅させることができ、放射線療法または化学療法で腫瘍を治療している場合はこれらの治療方法と併用して相乗効果を果たせるなど多くの特徴を有する。従って、光線力学的療法は、従来の癌治療法と異なり、悪性腫瘍を治療するための新たな手段を提供できる。医療技術の進歩に伴い、この腫瘍治療法は、内上皮癌、扁平上皮癌、光線性角化症や、脳腫瘍、食道癌、皮膚癌、肺癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌等の癌の予防・治療に広く用いられ、世界腫瘍予防・治療科学における最も活発な研究分野の一つとなっている。
現在臨床に応用されている光増感剤は、主にポルフィリンやフタロシアニン系化合物に代表され、腫瘍治療に大きな成功を取得しているが、組成比率が不安定であり、代謝が遅く、最大励起波長が短く、光毒性の副作用が発生しやすいなど多くの欠点が依然として存在する。これらの欠点は、光線力学的療法の実際な効果およびその臨床での実用化を大きく制限する。また、現在臨床に応用されている光増感剤は一般的に標的性が低いとの欠点を有するから、病変部位へ正確に標的し正常組織への損傷を低減する適切な光増感剤を設計して光線力学的療法に用いることは早急に解決すべき課題である。
ベンゾフェノチアジンおよびベンゾフェノセレナジン系光増感剤は、フェノキサジン系誘導体として、モル吸光係数が高く、吸収波長が近赤外領域にあり、水溶性が良く、細胞毒性が低く、かつ細胞膜透過能が良好であるなどの利点を有しており、世に出てから、機能性材料分野において多くの注目を集めている。また、これらの誘導体は、理想的な薬理学的活性を有しており、抗マラリア、うつ病、ドーパミンおよびパーキンソン病などにも多く用いられる。しかしながら、光線力学的療法による腫瘍治療の分野では、これらの光増感剤に対する研究は比較的少ない。また、標的分子薬または臨床に使用される化学療法剤を光増感剤分子に結合し、癌の標的治療とイメージングができる診療一体化光増感剤系を構築することは、新規光増感剤の開発及び臨床での使用に重要な現実的意義を有する。
本発明の目的は、近赤外吸収を有し光線力学的活性を持つベンゾフェノチアジンおよびベンゾフェノセレナジン系光増感剤、これらの製造方法および用途を提供することである。当該光増感剤は、三重項収率が高く、最大吸収波長および最大発光波長がいずれも６００ｎｍを超える。また、本発明で合成した光増感剤は、暗所毒性が低く、光毒性が高く、腫瘍標的機能を有する分子をベンゾフェノチアジンまたはベンゾフェノセレナジンの構造に導入することにより腫瘍組織の特異的摂取を向上することができ、或いは臨床に使用される抗癌剤をベンゾフェノチアジンまたはベンゾフェノセレナジンの構造に導入することにより光線力学的療法と化学療法で相乗的に治療する目的を達成することができ、副作用を増すことなく治療効果を上げることができる。
本発明の技術目的は、下記の技術手段により実現される。
本発明の１つ目の技術目的は、構造が一般式Ｉで表される化合物である光増感剤を提供することである。
〔一般式Ｉにおいて、
Ｘは、ＳまたはＳeであり、
Ｙは、ハロゲンイオン、ＣｌＯ４ −、ＰＦ６ −、ＢＦ４ −、ＣＨ３ＣＯＯ−およびＯＴs−から選択される１種であり、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基、アルコキシ基、アルキルアミド基、アルキルアジド基、アルキルアルキニル基、アルキルアミノ基、アルキルスルホン酸基、アルキルヒドロキシ基およびアルキルカルボキシ基から選択される１種であり、
Ｒ３は、Ｈ、アルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、モルホリニル基、カルボニル基、アミド基、アジド基、アルキニル基、アミノ基、スルホン酸基、ヒドロキシ基およびカルボキシ基から選択される１種であり、
Ｌ１はリンカーを表し、−（ＣＨ２）ｍ−または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−であり、
ｍは５〜２０の整数であり、ｎは２〜２０の整数である。〕
本発明の２つ目の技術目的は、抗腫瘍剤の製造のための、前記光増感剤の使用を提供することである。
本発明の３つ目の技術目的は、前記光増感剤の誘導体であって、一般式ＩＩで表される構造を有する光増感剤誘導体を提供することである。
〔式ＩＩにおいて、Ｒ４は、抗癌化学療法剤分子または腫瘍標的機能を有する分子薬である。〕
本発明の４つ目の技術目的は、抗腫瘍剤の製造のための、前記光増感剤誘導体の使用を提供することである。
本発明は、下記の効果を奏する。
（１）本発明に係る前記光増感剤は、優れた近赤外特性を有し、生体イメージングに応用される際に、生体光漂白、光損傷および生体毒性が低く、かつ発生する蛍光シグナルが比較的深い生体組織を透過することができる。
（２）本発明に係る前記光増感剤は、波長６６０ｎｍ超の光照射下で、一重項酸素を発生することができる。
（３）本発明に係る前記光増感剤は、暗所毒性が低く、生体適合性が良く、水溶性が良く、光安定性が良く、優れる光増感剤として光線力学的療法による腫瘍治療の分野に用いられる。
（４）本発明では、前記光増感剤に抗癌化学療法剤分子または腫瘍標的機能を有する分子薬を結合することにより、前記光増感剤に標的治療作用または光線力学的治療と化学治療との相乗治療作用を持たせる。腫瘍標的機能を有する分子をベンゾフェノチアジンまたはベンゾフェノセレナジンの構造に導入することにより腫瘍組織の光増感剤に対する特異的摂取を向上することができ、或いは臨床に使用される抗癌剤をベンゾフェノチアジンまたはベンゾフェノセレナジンの構造に導入することにより、光線力学的療法と化学療法で相乗的に治療する目的を達成することができる。
（５）本発明に係る前記光増感剤は、毒性の副作用が低く、分子構造が単一で安定であり、製造および精製が容易であり、原料の入手が容易であり、光線力学的療法による腫瘍治療剤を工業的に製造するのに有利である。
本明細書には、１２枚の図面が含まれる。
本発明に係るベンゾフェノチアジンおよびベンゾフェノセレナジン光増感剤１−１、１−２、２−１、２−２、１−１−ＩＭＣ、２−１−ＩＭＣのジクロロメタンにおける正規化紫外吸収スペクトルである。 本発明に係るベンゾフェノチアジンおよびベンゾフェノセレナジン光増感剤１−１、１−２、２−１、２−２、１−１−ＩＭＣ、２−１−ＩＭＣのジクロロメタンにおける正規化蛍光発光スペクトルである。 本発明に係るベンゾフェノチアジンおよびベンゾフェノセレナジン光増感剤１−１、１−２、２−１、２−２、１−１−ＩＭＣ、２−１−ＩＭＣがメタノール系に６６０ｎｍの光照射条件下で一重項酸素発生中におけるＤＰＢＦの吸光減衰曲線である。 本発明に係るベンゾフェノチアジン１−１、１−２のインビトロ抗癌試験結果である。ＭＣＦ−７を研究対象とし、細胞生存率で光増感剤の細胞毒性を示した。ｉｎ ｄａｒｋは光増感剤の暗所毒性を表し、ｉｎ ｌｉｇｈｔは光毒性を表す。 本発明に係るベンゾフェノセレナジン光増感剤２−１、２−２のインビトロ抗癌試験結果である。ＭＣＦ−７を研究対象とし、細胞生存率で光増感剤の細胞毒性を示した。ｉｎ ｄａｒｋは光増感剤の暗所毒性を表し、ｉｎ ｌｉｇｈｔは光毒性を表す。 本発明に係る光増感剤誘導体１−１−ＩＭＣ、２−１−ＩＭＣのインビトロ抗癌試験結果である。ＭＣＦ−７を研究対象とし、細胞生存率で光増感剤の細胞毒性を示した。ｉｎ ｄａｒｋは光増感剤の暗所毒性を表し、ｉｎ ｌｉｇｈｔは光毒性を表す。 本発明に係るベンゾフェノチアジンとビオチンが結合した誘導体１−１−Ｂｉｏｔｉｎのジクロロメタンにおける紫外吸収スペクトルである。 本発明に係るベンゾフェノチアジンとビオチンが結合した誘導体１−１−Ｂｉｏｔｉｎのジクロロメタンにおける蛍光スペクトルである。 本発明に係るベンゾフェノチアジンとビオチンが結合した誘導体１−１−Ｂｉｏｔｉｎがジクロロメタン系に６６０ｎｍの光照射条件下で一重項酸素発生中におけるＤＰＢＦの吸光減衰曲線である。 本発明に係るベンゾフェノチアジンとビオチンが結合した誘導体１−１−Ｂｉｏｔｉｎのインビトロ細胞暗所毒性試験結果である。ＨｅｐＧ２およびＣＯＳ−７を研究対象とし、細胞生存率で光増感剤の細胞毒性を示した。 本発明に係るベンゾフェノチアジンとビオチンが結合した誘導体１−１−Ｂｉｏｔｉｎのインビトロ細胞光毒性試験結果である。ＨｅｐＧ２およびＣＯＳ−７を研究対象とし、細胞生存率で光増感剤の細胞毒性を示した。 本発明に係るベンゾフェノチアジンとビオチンが結合した誘導体１−１−Ｂｉｏｔｉｎおよびベンゾフェノチアジン光増感剤１−１のインビトロ細胞選択性試験結果である。ＨｅｐＧ２およびＣＯＳ−７を研究対象とし、赤色蛍光の強度で細胞の光増感剤摂取量を示した。
以下、本発明を実施するための形態について詳しく説明するが、本発明はこれらの形態に限定されるものではない。
本発明の１つ目の技術目的は、構造が一般式Ｉで表される化合物である光増感剤を提供することである。
〔一般式Ｉにおいて、
Ｘは、ＳまたはＳeであり、
Ｙは、ハロゲンイオン、ＣｌＯ４ −、ＰＦ６ −、ＢＦ４ −、ＣＨ３ＣＯＯ−およびＯＴs−から選択される１種であり、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基、アルコキシ基、アルキルアミド基、アルキルアジド基、アルキルアルキニル基、アルキルアミノ基、アルキルスルホン酸基、アルキルヒドロキシ基およびアルキルカルボキシ基から選択される１種であり、
Ｒ３は、Ｈ、アルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、モルホリニル基、カルボニル基、アミド基、アジド基、アルキニル基、アミノ基、スルホン酸基、ヒドロキシ基およびカルボキシ基から選択される１種であり、
Ｌ１はリンカーを表し、−（ＣＨ２）ｍ−または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−であり、
ｍは５〜２０の整数であり、ｎは２〜２０の整数である。〕
前記光増感剤において、より具体的に、前記アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−オクチロキシ基およびｎ−ドデシルオキシ基が挙げられるが、これらに限定されない。前記アルキルアミド基としては、メチルカルボニルアミノ基、エチルカルボニルアミノ基、ジメチルカルボニルアミノ基、プロピルカルボニルアミノ基、ペンチルカルボニルアミノ基、シクロへキシルカルボニルアミノ基、２−エチルへキシルカルボニルアミノ基、オクチルカルボニルアミノ基およびドデシルカルボニルアミノ基が挙げられるが、これらに限定されない。前記アルキルアジド基としては、エチルアジド基、プロピルアジド基、ブチルアジド基およびへキシルアジド基が挙げられるが、これらに限定されない。前記アルキルアミノ基としては、エチルアミノ基、ジメチルアミノ基、ブチルアミノ基、シクロペンチルアミノ基、２−エチルへキシルアミノ基およびドデシルアミノ基が挙げられるが、これらに限定されない。前記アルキルスルホニル基としては、メチルスルホニル基、エチルスルホニル基、ブチルスルホニル基およびシクロへキシルスルホニル基が挙げられるが、これらに限定されない。
前記光増感剤において、前記ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素が挙げられる。
前記光増感剤において、好ましくは、前記Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜５アルキル基、Ｃ１〜５アルコキシ基、Ｃ２〜５アルキルアルキニル基、Ｃ２〜６アルキルスルホニル基およびＣ２〜６アルキルアジド基から選択される。より具体的な実施態様として、前記Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、メトキシ基およびエトキシ基から選択される。
前記光増感剤において、好ましくは、前記Ｒ３は、アミノ基、カルボキシ基、ヒドロキシ基およびアジド基から選択される。
前記光増感剤において、好ましくは、前記ｍまたはｎは、それぞれ独立して、５、６、７または８である。
前記光増感剤において、好ましくは、前記Ｙはハロゲンイオンである。
前記光増感剤において、より具体的な実施態様として、前記光増感剤は下記の化合物から選択される。
本発明は、さらに前記光増感剤を製造する方法を提供する。かかる方法は、アニリン誘導体を原料とし硫元素またはセレニウム元素含有縮合中間体を製造するステップ、ナフタレンアミン誘導体中間体を製造するステップ、および前記２種の中間体からベンゾフェノチアジンおよびベンゾフェノセレナジン系光増感剤を製造するステップを含む。具体的に下記の手順を含む。
ベンゾフェノチアジン光増感剤の製造：
（１）氷浴条件下で、Ｒ１とＲ２置換基を持つｐ−フェニレンジアミンを、三塩化アルミニウム、塩化亜鉛、チオ硫酸ナトリウムが存在する水溶液に２〜５時間撹拌し、単体固形塩を製造する。
（２）１−ナフタレンアミンまたは１−ブロモナフタレンとＮＨ２−Ｌ１−Ｒ３をアルカリ性触媒の存在下で２〜２４時間還流反応させ、ナフタレンアミン誘導体を製造する。
（３）続いて、ステップ（１）で得られた固形塩とステップ（２）で得られたナフタレンアミン誘導体を重クロム酸カリウムの存在下でメタノールと希塩酸の混合溶媒に２〜１２時間反応させ、ベンゾフェノチアジン光増感剤を製造する。
ベンゾフェノセレナジン光増感剤の製造方法：
ＣｕＯを触媒とし、トリフルオロエタノールを溶媒とし、アニリンジセレニド単体と前記ステップ（２）で得られたナフタレンアミン誘導体を稀塩酸の存在下で２〜１２時間反応させ、ベンゾフェノセレナジン光増感剤を製造する。
前記ベンゾフェノチアジン光増感剤の製造方法において、ステップ（１）におけるＡｌ３+溶液は、塩化アルミニウムまたは硫酸アルミニウムである。
前記ベンゾフェノチアジン光増感剤の製造方法において、ステップ（２）における反応温度は３０〜１５０℃であり、反応時間は１〜２４時間であり、反応溶媒はジクロロメタン、エチレングリコールモノメチルエーテル、メタノール、ＤＭＦ、エタノール、アセトニトリルまたはこれらの混合物から選択され、１−ナフタレンアミンまたは１−ブロモナフタレンと（−Ｌ１−Ｒ３）鎖を持つ化合物とのモル比は１：１〜１：５である。好ましい実施態様として、反応温度は９０〜１４０℃であり、反応時間は１０〜２０時間であり、１−ナフタレンアミンまたは１−ブロモナフタレンと（−Ｌ１−Ｒ３）鎖を持つ化合物とのモル比は１：２〜１：４である。
前記ベンゾフェノチアジン光増感剤の製造方法において、ステップ（３）において、ステップ（２）の化合物とステップ（１）の化合物はモル比１：１〜１：５で反応され、反応温度は２０〜１２０℃であり、反応時間は４〜１２時間であり、反応溶媒はエタノール、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、塩酸水溶液、メタノール、ジクロロメタンまたはこれらの混合物から選択される。好ましい実施態様として、反応温度は２０〜８０℃であり、反応時間は２〜８時間であり、反応溶媒はエタノール、メタノール、ＤＭＦ、塩酸水溶液またはこれらの混合物から選択され、ステップ（２）の化合物とステップ（１）の化合物とのモルは１：１〜１：４である。
前記ベンゾフェノセレナジン光増感剤の製造方法において、ステップ（２）におけるナフタレンアミン誘導体とアニリンジセレニド単体とのモル比は１：１〜１：５であり、反応温度は５０〜１６０℃であり、反応時間は１〜１２時間であり、反応溶媒はトリフルオロエタノール、塩酸水溶液、メタノール、ジクロロメタンまたはこれらの混合物から選択される。好ましい実施態様として、反応温度は７５〜１１０℃であり、反応時間は２〜８時間であり、反応溶媒はトリフルオロエタノール、塩酸水溶液、メタノールまたはこれらの混合物から選択され、ステップ（２）におけるナフタレンアミン誘導体とアニリンジセレニド単体とのモル比は１：１〜１：４である。
より具体的な実施態様として、本発明は、前記光増感剤化合物１−１、１−２、２−１、２−２を製造する方法を提供する。具体的な操作手順は、下記の通りである。
１）１−ブロモナフタレンと１，６−ヘキサメチレンジアミンをモル比１：１〜１：５で反応させて、化合物Ｉを製造する。
反応温度は８０〜１５０℃であり、反応時間は１〜２４時間であり、反応溶媒はジクロロメタン、エチレングリコールモノメチルエーテル、メタノール、ＤＭＦまたはこれらの混合物から選択される。
好ましい実施態様において、反応温度は９０〜１４０℃であり、反応時間は１０〜２０時間であり、反応溶媒はエチレングリコールモノメチルエーテル、メタノール、ＤＭＦまたはこれらの混合物から選択され、１−ブロモナフタレンと１，６−ヘキサメチレンジアミンとのモル比は１：１〜１：４である。
より好ましい実施態様において、反応温度は１００〜１３０℃であり、反応時間は１２〜１８時間であり、反応溶媒はエチレングリコールモノメチルエーテル、ＤＭＦまたはこれらの混合物から選択され、１−ブロモナフタレンと１，６−ヘキサメチレンジアミンとのモル比は１：２〜１：４である。
最も好ましい実施態様において、反応温度は１１０〜１２５℃であり、反応時間は１５〜１８時間であり、反応溶媒はエチレングリコールモノメチルエーテルであり、１−ブロモナフタレンと１，６−ヘキサメチレンジアミンとのモル比は１：２〜１：３である。
２）１−ナフタレンアミンと６−ブロモヘキサン酸エチルをモル比１：１〜１：５で反応させて化合物Ｎ−ヘキサン酸エチル−１−ナフタレンアミンを製造した後、水酸化ナトリウム水溶液中に加水分解し、酸性化してＩＩを製造する。
化合物Ｎ−ヘキサン酸エチル−１−ナフタレンアミンの製造において、反応温度は３０〜１５０℃であり、反応時間は１〜２４時間であり、反応溶媒はジクロロメタン、エタノール、アセトニトリル、ＤＭＦ、水酸化ナトリウム水溶液から選択される。
好ましい実施態様において、反応温度は３０〜１２０℃であり、反応時間は１〜１２時間であり、反応溶媒はエタノール、アセトニトリル、ＤＭＦまたはこれらの混合物から選択され、１−ナフタレンアミンと６−ブロモヘキサン酸エチルとのモル比は１：１〜１：４である。
より好ましい実施態様において、反応温度は６０〜１２０℃であり、反応時間は４〜１２時間であり、反応溶媒はエタノール、ＤＭＦまたはこれらの混合物から選択され、１−ナフタレンアミンと６−ブロモヘキサン酸エチルとのモル比は１：１〜１：３である。
最も好ましい実施態様において、反応温度は６０〜１００℃であり、反応時間は８〜１２時間であり、反応溶媒はエタノールであり、１−ナフタレンアミンと６−ブロモヘキサン酸エチルとのモル比は１：１〜１：２である。
３）化合物ＩまたはＩＩと式iの化合物をモル比１：１〜１：５で反応させて、化合物１−１または１−２を製造する。
反応温度は２０〜１２０℃であり、反応時間は４〜１２時間であり、反応溶媒はエタノール、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、塩酸水溶液、メタノール、ジクロロメタンまたはこれらの混合物から選択される。
好ましい実施態様において、反応温度は２０〜８０℃であり、反応時間は２〜８時間であり、反応溶媒はエタノール、メタノール、ＤＭＦ、塩酸水溶液またはこれらの混合物から選択され、化合物ＩまたはＩＩと式iの化合物とのモル比は１：１〜１：４である。
より好ましい実施態様において、反応温度は２０〜６０℃であり、反応時間は２〜６時間であり、反応溶媒はメタノール、塩酸水溶液またはこれらの混合物から選択され、化合物ＩまたはＩＩと式iの化合物とのモル比は１：１〜１：３である。
最も好ましい実施態様において、反応温度は２０〜５０℃であり、反応時間は２〜３時間であり、反応溶媒はメタノールと塩酸水溶液の混合物であり、化合物ＩまたはＩＩと式iiの化合物とのモル比は１：１〜１：２である。
４）化合物ＩまたはＩＩと式iiの化合物をモル比１：１〜１：５で反応させて、化合物２−１および２−２を製造する。
反応温度は５０〜１６０℃であり、反応時間は１〜１２時間であり、反応溶媒はトリフルオロエタノール、塩酸水溶液、メタノール、ジクロロメタンまたはこれらの混合物から選択される。
好ましい実施態様において、反応温度は７５〜１１０℃であり、反応時間は２〜８時間であり、反応溶媒はトリフルオロエタノール、塩酸水溶液、メタノールまたはこれらの混合物から選択され、化合物ＩまたはＩＩと式iiとのモル比は１：１〜１：４である。
より好ましい実施態様において、反応温度は８０〜１００℃であり、反応時間は２〜６時間であり、反応溶媒はトリフルオロエタノール、塩酸水溶液またはこれらの混合物から選択され、化合物ＩまたはＩＩと式iiとのモル比は１：１〜１：３である。
最も好ましい実施態様において、反応温度は９０〜９５℃であり、反応時間は２〜３時間であり、反応溶媒はトリフルオロエタノール、塩酸水溶液またはこれらの混合物から選択され、化合物ＩまたはＩＩと式iiとのモル比は１：１〜１：２である。
本発明の２つ目の技術目的は、抗腫瘍剤の製造のための、前記光増感剤の使用を提供することである。
本発明に係る前記光増感剤は、優れた近赤外特性を有し、生体イメージングに応用される際に、生体光漂白、光損傷および生体毒性が低く、かつ発生する蛍光シグナルが比較的深い生体組織を透過することができ、また波長６６０ｎｍ超の光照射下で一重項酸素を発生することができ、波長６６０ｎｍ超のレーザ光照射下で腫瘍細胞に対して光線力学的治療效果を有し、効率的に腫瘍細胞を死滅させることができる。
本発明の３つ目の技術目的は、前記光増感剤の誘導体であって、一般式ＩＩで表される構造を有する光増感剤誘導体を提供することである。
〔式ＩＩにおいて、Ｒ４は、抗癌化学療法剤分子または腫瘍標的機能を有する分子薬である。〕
前記光増感剤誘導体において、前記Ｒ４はａ１〜ａ１０から選択される。
前記式において、曲線は断裂結合を示し、母体と結合する箇所を表す。
より具体的な実施態様として、前記誘導体は下記の化合物から選択される。
本発明は、さらに前記光増感剤誘導体を製造する方法を提供する。係る方法は、請求項１に記載の光増感剤化合物と分子薬をモル比１：１〜１：３で反応させるステップを含む。
前記製造方法において、反応温度は０〜１００℃であり、反応時間は１２〜４８時間であり、反応溶媒はジクロロメタン、エタノール、酢酸エチル、ＤＭＦまたはこれらの混合物であり、反応は有機アルカリの存在下で行われ、４−ジメチルアミノピリジンを触媒とする。好ましい実施態様において、反応温度は１０〜８０℃であり、反応時間は１２〜３２時間である。最も好ましい実施態様において、反応温度は２５〜４０℃であり、反応時間は１２〜２４時間であり、反応溶媒はＤＭＦである。
より具体的な実施態様として、本発明は、化合物１−１−ＩＭＣおよび２−１−ＩＭＣを製造する具体的な方法を提供する。
化合物１−１または２−１と式ｉｉｉをモル比１：１〜１：３で反応させて、化合物１−１−ＩＭＣまたは２−１−ＩＭＣを製造する。
反応温度は０〜１００℃であり、反応時間は１２〜４８時間であり、反応溶媒はジクロロメタン、エタノール、酢酸エチル、ＤＭＦまたはこれらの混合物であり、反応は有機アルカリの存在下で行われ、４−ジメチルアミノピリジンを触媒とする。
好ましい実施態様において、反応温度は１０〜８０℃であり、反応時間は１２〜３２時間であり、反応溶媒はジクロロメタン、エタノール、ＤＭＦまたはこれらの混合物であり、反応は有機アルカリの存在下で行われ、４−ジメチルアミノピリジンを触媒とし、化合物１−１または２−１と式ｉｉｉのモルは１：１〜１：３である。
より好ましい実施態様において、反応温度は２０〜７０℃であり、反応時間は１２〜２８時間であり、反応溶媒はジクロロメタン、ＤＭＦまたはこれらの混合物であり、反応は有機アルカリの存在下で行われ、４−ジメチルアミノピリジンを触媒とし、化合物１−１または２−１と式ｉｉｉのモルは１：１〜１：２である。
最も好ましい実施態様において、反応温度は２５〜４０℃であり、反応時間は１２〜２４時間であり、反応溶媒はＤＭＦであり、反応は有機アルカリの存在下で行われ、４−ジメチルアミノピリジンを触媒とし、化合物１−１または２−１と式ｉｉｉのモルは１：１〜１：１.５である。
前記方法で合成した近赤外吸収を有し光線力学的活性を持つ本発明に係るベンゾフェノチアジンおよびベンゾフェノセレナジン系光増感剤、並びにこれらの誘導体について、核磁気共鳴スペクトルまたは質量分析スペクトルによりこれらの構造を確認し、炭素スペクトルによりこれらの構造を補助的に確認した。
本発明の４つ目の技術目的は、抗腫瘍剤の製造のための、前記光増感剤誘導体の使用を提供することである。
本発明に係る前記光増感剤誘導体は、前記光増感剤と類似する性質を有しており、優れた近赤外特性を有し、生体イメージングに応用される際に、生体光漂白、光損傷および生体毒性が低く、かつ発生する蛍光シグナルが比較的深い生体組織を透過することができ、また波長６６０ｎｍ超の光照射下で一重項酸素を発生することができ、波長６６０ｎｍ超のレーザ光照射下で腫瘍細胞に対して光線力学的治療效果を有し、効率的に腫瘍細胞を死滅させることができる。それに抗癌化学療法剤分子または腫瘍標的機能を有する分子薬を結合することにより標的治療作用または光線力学的治療と化学治療との相乗治療作用を持たせることができるから、抗腫瘍剤の製造に用いられる。
下記の非限定的実施例は、当業者に本発明をより深く理解させるためのものであり、いかなる態様で本発明を限定するものではない。
実施例１
ベンゾフェノチアジン光増感剤１−１、１−２の合成
（１）中間体iの合成
４−アミノ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン（６．０９ｍｍｏｌ）を、硫酸アルミニウム４．１１ｇを含有した水溶液１０ｍＬに加えた後、チオ硫酸ナトリウム（２．２１ｇ）および塩化亜鉛（０．８７２g）を順番にフラスコに加えて、氷浴条件下で、重クロム酸カリウム溶液（０．４２ｍＭ）４ｍＬをゆっくり滴下し、２時間撹拌し、灰黒色の固体を得た。少量のアセトンおよびエチルエーテルでろ過ケーキを洗浄後、メタノール１０ｍＬに加えて２０分間還流した。熱いうちにろ過して薄灰色の固体生成物i ０．７６ｇを得た。収率は４７％であった。
（２）中間体Ｉの合成
１−ブロモナフタレン（４．１２g）およびヘキサメチレンジアミン（４．６５g）を、エチレングリコールモノメチルエーテル溶液４０ｍＬを含有した丸底フラスコに加えて、さらにＣｕＩ（１９０ｍｇ）およびＣsＣＯ３（３．０ｇ）を加えて、溶液は黄褐色から青緑色となった。１２５℃に加熱し還流して２４ｈ反応させた後、反応を停止し、吸引ろ過により黄褐色のろ過液を得て、カラムクロマトグラフィにより分離して黄褐色の油状液体である中間体２を得た。收率５２％であった。
（３）中間体ＩＩの合成
５０ｍＬの一口瓶に、１−ナフタレンアミン（１．６ｇ）、６−ブロモヘキサン酸エチル（３．２ｇ）をエタノール６０ｍＬに溶かして、１２時間還流し反応させ、減圧によりエタノールを留去し、カラムクロマトグラフィにより分離して無色の油状物であるＮ−ヘキサン酸エチル−１−ナフタレンアミンを得た。続いて、これを１，４−ジオキサン４ｍＬに溶かして、１Ｍの水酸化ナトリウム１．５ｍＬを加え５時間撹拌して十分反応させた後、塩酸でｐＨを約３に調整した。ジクロロメタンで前記混合溶液を抽出し、スピンドライし、カラムクロマトグラフィにより分離して中間体ＩＩを得た。収率は５５％であった。
（４−１）ベンゾフェノチアジン１−１の合成
薄灰色の中間体i（１．０５２ｇ）および中間体Ｉ（１．５ｇ）をジメチルスルホキシド２０ｍＬに溶かして、室温で撹拌し十分溶解させた後、重クロム酸カリウム固体１．３ｇを加えて、２０分間攪拌し溶液は褐色となった後、２ｍｏｌ・Ｌ−１の塩酸１０ｍＬおよびメタノール２５０ｍＬを加えて、室温で１時間撹拌し溶液は青緑色となり、減圧で水およびメタノールを留去し、残液を飽和塩化ナトリウム水溶液１５０ｍＬにゆっくり注ぎ青色の固体を析出させ、ろ過し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して青色の固体生成物１−１を得た。収率は３０％であった。
核磁気1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 10.43 (s, 1H), 8.85 (d, J = 49.0 Hz, 2H), 8.20 (s, 3H), 7.90 (s, 2H), 7.52 (s, 1H), 7.34 (s, 2H), 3.65 (s, 6H), 2.78 (s, 2H), 1.78 (s, 2H), 1.63 (s, 2H), 1.44 (s, 4H), 1.24 (s, 6H). 13C NMR (126 MHz, DMSO) δ 153.04, 150.64, 139.70, 136.67, 133.75, 133.11, 131.83, 131.16, 129.49, 124.57, 123.96, 117.13, 105.36, 103.27, 45.07, 43.72, 39.89, 39.72, 39.56, 39.39, 39.22, 28.19, 26.76, 25.79, 25.46, 12.67.
（４−２）ベンゾフェノチアジン１−２の合成
薄灰色の中間体i（１．０５２ｇ）および中間体ＩＩ（１．７ｇ）をジメチルスルホキシド２０ｍＬに溶かして、室温で撹拌し十分溶解させた後、重クロム酸カリウム固体１．４ｇを加えて、２０分間攪拌し溶液は紫褐色となった後、２ｍｏｌ・Ｌ−１の塩酸１０ｍＬおよびメタノール２５０ｍＬを加えて、室温で１時間撹拌し溶液は深緑色となり、減圧で水およびメタノールを留去し、残液を飽和塩化ナトリウム水溶液１５０ｍＬにゆっくり注ぎ青色の固体を析出させ、ろ過し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して青色の固体生成物１−２を得た。収率は３５％であった。
核磁気1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 12.01 (s, 1H), 10.15 (s, 1H), 8.95 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.66 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.03 ‐ 7.88 (m, 2H), 7.84 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.37 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 3.67 (dt, J = 21.1, 6.7 Hz, 6H), 2.25 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.82 ‐ 1.72 (m, 2H), 1.65 ‐ 1.54 (m, 2H), 1.44 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 1.23 (t, J = 6.9 Hz, 6H). 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 174.80, 153.41, 147.48, 139.36, 137.11, 133.83, 133.63, 132.21, 131.67, 131.57, 127.88, 125.01, 124.79, 124.41, 120.59, 109.04, 105.74, 46.75, 44.97, 34.01, 29.08, 28.54, 27.25, 13.07.
化合物１−１、１−２の性能測定
（１）ベンゾフェノチアジン光増感剤１−１、１−２の吸光および蛍光スペクトル測定
最終濃度が５Ｍとなったように前記実施例１で合成した化合物１−１、１−２を溶媒メタノール３ｍＬに加えて、これらの紫外吸収スペクトルおよび蛍光発光スペクトルを測定した。測定結果から分かるように、ベンゾフェノチアジン光増感剤１−１および１−２の最大吸収波長は６５５ｎｍ（図１に示す）、最大発光波長は６９４ｎｍ（図２に示す）であり、いずれも近赤外領域にあり、近赤外線で励起される光増感剤として使用することができる。使用する機器は、それぞれAgIIlent 8453紫外分光光度計およびAgIIlent Cary EclIIpse蛍光分光光度計であった。
（２）ベンゾフェノチアジン光増感剤１−１、１−２の一重項酸素発生測定
最終濃度が５Ｍとなったように前記実施例１で合成した化合物１−１、１−２を溶媒メタノール３ｍＬに加えて、さらに、溶液における１，３−ジフェニルイソベンゾフラン（ＤＰＢＦ）の吸光度が約１．０となったようにＤＰＢＦを加えて、均一に混合した。続いて６６０ｎｍの赤色光を照射し、速やかにその紫外線吸収曲線を測定した。４１１ｎｍにおけるＤＰＢＦの吸光度値の変化から吸光度と時間の関係曲線を描いた。対照としてメチレンブルー（ＭＢ）を用い、下記式により一重項酸素量子収率を算出した。
光増感剤１−１、１−２の一重項酸素量子収量はいずれも０．０４であると算出した。図３は、光増感剤がメタノール溶媒に６６０ｎｍの光照射条件下で一重項酸素発生中におけるＤＰＢＦの吸光減衰曲線である。使用する機器はAgIIlent 8453紫外分光光度計であり、光源は３００Ｗキセノンランプ光源であった。
（３）ベンゾフェノチアジン光増感剤１−１、１−２のインビトロ抗癌細胞試験
ＭＣＦ−７（ヒト乳癌細胞）を０．２５％のトリプシンで消化した後、１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ液体培地を用いて単一細胞の懸濁液を調製し、１ウェルあたりの液体培地体積が１００μＬ、１ウェルあたりの細胞密度が５０００個となったように９６ウェルの培養プレートに接種した。続いて、培養プレートを細胞インキュベーターに入れ２４時間インキュベートした。インキュベーターの環境は、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％、飽和湿度であった。各ウェルにそれぞれ濃度（５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３２、０．１６、０．０８、０．０４、０．０２μＭ）の１−１または１−２ １００μＬを加えて、同条件でさらに１時間インキュベートした。光毒性の測定について、９６ウェルプレートに６６０ｎｍの光源を１０分間照射後、前記培養環境においてさらに１２時間培養した。暗所毒性の測定について、光照射せずにそのまま１２時間培養した。続いて、各ウェルに濃度５ｍｇ/ｍＬのＭＴＴ溶液２０μＬを加えて、インキュベーターにおいてさらに４時間インキュベートした。ウェル中の液体培地を除去し、染料をＤＭＳＯ溶液２００μＬに溶かし、シャーレに移し、シェーカーで１０分間振とうした後、マイクロプレートリーダーで波長４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。下記式により細胞生存率を算出し、１−１および１−２の細胞に対する生体毒性を評価した。結果は図４に示す。
Cell Viability（%）＝［Σ（Ai/Acontrol×100)]/n
前記式において、Aiは第ｉ群データの吸光度（i＝１、２、．．．、ｎ）であり、Acontrolは光増感剤添加なしの対照ウェルの平均吸光度である。同様の実験は３回以上行った。
実施例２
ベンゾフェノセレナジン光増感剤２−１、２−２の合成
（１）中間体iiの合成
４０％の水酸化ナトリウム水溶液１０ｍＬに３−ヨードアニリン０．７ｇ、ヨードエタン１．７ｍＬ、ＰＥＧ２０００ １．８gを加えて、十分撹拌し均一となった後、４５℃に昇温して１２時間反応させ、反応終了後、前記反応物を室温に冷却し、水およびエチルエーテルで抽出し、エチルエーテル層を収集し、減圧によりエチルエーテルを留出し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して黒色の油状物を得た。収率は５５％であった。
前記黒色の油状物１ｇ、酸化銅０．８g、セレニウム粉０．６g、水酸化カリウム０．５gをジメチルスルホキシド１５ｍＬに溶かして、窒素雰囲気下で、１１０℃で撹拌して一晩反応させ、反応終了後、室温に冷却し、酢酸エチルおよび水で抽出し、酢酸エチル層を収集し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧により溶媒を留去し、薄赤色の液体を得た。
氷浴条件下で、前記薄赤色の液体１．２ｇを１ｍｏｌ・Ｌ−１の塩酸６０ｍＬに溶かして、６ｍｍｏｌの亜硝酸ナトリウム水溶液５ｍＬを加えた。撹拌した際に、溶液は徐々に黄色からオレンジ赤色となり且つ固体が多く現れ、１０分間反応後、ろ過し、ろ過液をジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧により溶媒を留去し、粗生成物をイソプロパノールで再結晶してオレンジ色の固体を得た。収率は７０％であった。
（２−１）ベンゾフェノセレナジン２−１の合成
中間体Ｉ ０．３１５ｇおよび中間体ii ０．２５ｇをトリフルオロエタノール５ｍＬに加えて、十分撹拌して溶解させた後、１ｍｏｌ・Ｌ−１の塩酸溶液４ｍＬを加えて、９０℃で２．５時間反応させ、減圧により溶媒を留去した後、エチルエーテルで粗生成物を洗浄して未反応の中間体Ｉを除去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより洗浄後の粗生成物を精製して青色の固体を得た。収率は４５％であった。
核磁気1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.73 (s, 1H), 8.41 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 21.7 Hz, 4H), 7.26 (s, 1H), 6.98 (s, 1H), 3.57 (d, J = 45.7 Hz, 6H), 2.24 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.80 ‐ 1.66 (m, 2H), 1.65 ‐ 1.53 (m, 2H), 1.50 ‐ 1.38 (m, 2H), 1.18 (dd, J = 18.4, 11.5 Hz, 6H). 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 174.88, 158.72, 153.56, 151.24, 140.26, 137.26, 134.21, 133.69, 132.47, 131.72, 131.67, 130.03, 125.18, 124.74, 124.09, 123.54, 117.72, 105.85, 103.69, 45.57, 44.34, 34.08, 28.61, 26.46, 24.69, 13.14.
（２−２）ベンゾフェノセレナジン２−２の合成
中間体ＩＩ ０．４gおよび中間体ii ０．２５gをトリフルオロエタノール５ｍＬに加えて、十分撹拌して溶解させた後、１ｍｏｌ・Ｌ−１の塩酸溶液４ｍＬを加えて、９０℃で２．５時間反応させ、減圧により溶媒を留去した後、エチルエーテルで粗生成物を洗浄して未反応の中間体ＩＩを除去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより洗浄後の粗生成物を精製して青色の固体を得た。収率は４０％であった。
核磁気1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8.73 (s, 1H), 8.41 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 21.7 Hz, 4H), 7.26 (s, 1H), 6.98 (s, 1H), 3.57 (d, J = 45.7 Hz, 6H), 2.24 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.80 ‐ 1.66 (m, 2H), 1.65 ‐ 1.53 (m, 2H), 1.50 ‐ 1.38 (m, 2H), 1.18 (dd, J = 18.4, 11.5 Hz, 6H). 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 174.88, 158.72, 153.56, 151.24, 140.26, 137.26, 134.21, 133.69, 132.47, 131.72, 131.67, 130.03, 125.18, 124.74, 124.09, 123.54, 117.72, 105.85, 103.69, 45.57, 44.34, 34.08, 28.61, 26.46, 24.69, 13.14.
ベンゾフェノセレナジン光増感剤２−１、２−２の性能測定
（１）ベンゾフェノセレナジン光増感剤２−１、２−２の吸光および蛍光スペクトル測定
最終濃度が５Ｍとなったように前記実施例２で合成した化合物２−１、２−２を溶媒メタノール３ｍＬに加えて、これらの紫外吸収スペクトルおよび蛍光発光スペクトルを測定した。測定結果から分かるように、ベンゾフェノセレナジン光増感剤２−１および２−２の最大吸収波長は６６１ｎｍ（図１に示す）、最大発光波長は７０２ｎｍ（図２に示す）であり、いずれも近赤外領域にあり、近赤外線で励起される光増感剤として使用することができる。使用する機器は、それぞれAgIIlent 8453紫外分光光度計およびAgIIlent Cary EclIIpse蛍光分光光度計であった。
（２）ベンゾフェノセレナジン光増感剤２−１、２−２の一重項酸素発生測定
最終濃度が５Ｍとなったように前記実施例２で合成した化合物２−１、２−２を溶媒メタノール３ｍＬに加えて、さらに、溶液における１，３−ジフェニルイソベンゾフラン（ＤＰＢＦ）の吸光度が約１．０となったようにＤＰＢＦを加えて、均一に混合した。続いて６６０ｎｍの赤色光を照射し、速やかにその紫外線吸収曲線を測定した。４１１ｎｍにおけるＤＰＢＦの吸光度値の変化から吸光度と時間の関係曲線を描いた。対照としてメチレンブルー（ＭＢ）を用い、下記式により一重項酸素量子収率を算出した。
光増感剤２−１、２−２の一重項酸素量子収量はそれぞれ０．７８、０．７３であると算出した。図３は、光増感剤がメタノール溶媒に６６０ｎｍの光照射条件下で一重項酸素発生中におけるＤＰＢＦの吸光減衰曲線である。使用する機器はAgIIlent 8453紫外分光光度計であり、光源は３００Ｗキセノンランプ光源であった。
（３）ベンゾフェノセレナジン光増感剤２−１、２−２のインビトロ抗癌細胞試験
ＭＣＦ−７（ヒト乳癌細胞）を０．２５％のトリプシンで消化した後、１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ液体培地を用いて単一細胞の懸濁液を調製し、１ウェルあたりの液体培地体積が１００μＬ、１ウェルあたりの細胞密度が５０００個となったように９６ウェルの培養プレートに接種した。続いて、培養プレートを細胞インキュベーターに入れ２４時間インキュベートした。インキュベーターの環境は、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％、飽和湿度であった。各ウェルにそれぞれ濃度（５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３２、０．１６、０．０８、０．０４、０．０２μＭ）の２−１または２−２ １００μＬを加えて、同条件でさらに１時間インキュベートした。光毒性の測定について、９６ウェルプレートに６６０ｎｍの光源を１０分間照射後、前記培養環境においてさらに１２時間培養した。暗所毒性の測定について、光照射せずにそのまま１２時間培養した。続いて、各ウェルに濃度５ｍｇ/ｍＬのＭＴＴ溶液２０μＬを加えて、インキュベーターにおいてさらに４時間インキュベートした。ウェル中の液体培地を除去し、染料をＤＭＳＯ溶液２００μＬに溶かし、シャーレに移し、シェーカーで１０分間振とうした後、マイクロプレートリーダーで波長４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。下記式により細胞生存率を算出し、２−１および２−２の細胞に対する生体毒性を評価した。結果は図５に示す。
Cell Viability（%）＝［Σ（Ai/Acontrol×100)]/n
前記式において、Aiは第ｉ群データの吸光度（i＝１、２、．．．、ｎ）であり、Acontrolは光増感剤添加なしの対照ウェルの平均吸光度である。同様の実験は３回以上行った。
実施例３
ベンゾフェノチアジンまたはベンゾフェノセレナジン光増感剤とＣＯＸ−２阻害剤インドメタシンが結合した誘導体１−１−ＩＭＣ、２−１−ＩＭＣの合成
（１）ベンゾフェノチアジン光増感剤１−１とＣＯＸ−２阻害剤インドメタシンが結合した誘導体１−１−ＩＭＣの合成
ベンゾフェノチアジン１−１（１２０ｍｇ）、インドメタシン（１１０．２３ｍｇ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）（７０ｍｇ）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（７０ｍｇ）および４−メチルピリジン（４５ｍｇ）をＤＭＦ溶液１０ｍＬに加えて、室温で２４時間撹拌して反応させ、反応を停止し、減圧により多くの溶媒を留去し、カラムクロマトグラフィにより分離して深青色の固体製品を得た。收率は６６％であった。
核磁気H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 10.94 (s, 1H), 9.02 (s, 1H), 8.92 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.41 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.34 (s, 1H), 7.09 (s, 2H), 6.95 (s, 1H), 6.85 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.58 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.71 (s, 4H), 3.59 (d, J = 7.0 Hz, 4H), 3.25 (s, 2H), 2.35 (s, 3H), 1.81 (s, 2H), 1.50 (s, 2H), 1.42 (s, 4H), 1.33 (t, J = 7.0 Hz, 7H). 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 170.83, 168.32, 156.12, 154.50, 150.41, 140.30, 139.02, 137.00, 135.96, 135.69, 134.08, 133.51, 132.10, 131.46, 131.14, 130.99, 130.89, 130.51, 130.22, 129.04, 128.69, 126.04, 125.15, 125.09, 125.01, 115.87, 114.89, 114.14, 111.92, 111.22, 104.50, 102.90, 101.49, 65.86, 55.87, 45.63, 43.86, 39.08, 32.08, 29.71, 28.79, 28.45, 27.18, 25.85, 25.65, 15.24, 14.15, 13.65, 12.75, 0.00.
（２）ベンゾフェノセレナジン光増感剤２−１とＣＯＸ−２阻害剤インドメタシンが結合した誘導体２−１−ＩＭＣの合成
ベンゾフェノセレナジン２−１（１２６ｍｇ）、インドメタシン（１１０．２３ｍｇ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）（７０ｍｇ）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（７０ｍｇ）および４−メチルピリジン（４５ｍｇ）をＤＭＦ溶液１０ｍＬに加えて、室温で２４時間撹拌して反応させ、反応を停止し、減圧により多くの溶媒を留去し、カラムクロマトグラフィにより分離して深青色の固体製品を得た。收率は８０％であった。
核磁気1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.85 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.80 (s, 1H), 7.92 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.67 ‐ 7.63 (m, 1H), 7.59 (d, J = 8.3 Hz, 3H), 7.40 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.21 (dd, J = 13.2, 6.7 Hz, 2H), 7.05 (s, 2H), 7.00 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.57 (dd, J = 9.0, 2.2 Hz, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.69 (s, 2H), 3.55 (d, J = 7.0 Hz, 4H), 3.22 (s, 2H), 2.33 (s, 3H), 1.75 (s, 2H), 1.44 (d, J = 16.5 Hz, 2H), 1.31 (t, J = 7.0 Hz, 11H). 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 168.29, 156.10, 153.80, 150.14, 143.73, 139.05, 138.69, 135.99, 134.59, 134.53, 134.02, 132.21, 132.00, 131.12, 130.94, 130.87, 129.91, 129.04, 125.72, 125.42, 124.87, 124.60, 117.76, 115.47, 114.89, 114.02, 111.87, 111.07, 107.55, 106.82, 101.45, 55.82, 45.61, 44.08, 39.12, 32.05, 29.70, 28.83, 28.53, 25.86, 25.67, 13.59, 12.80, 0.00.
光増感剤誘導体１−１−ＩＭＣ、２−１−ＩＭＣの性能測定
（１）光増感剤誘導体１−１−ＩＭＣ、２−１−ＩＭＣの吸光および蛍光スペクトル測定
最終濃度が５Ｍとなったように前記実施例３で合成した化合物１−１−ＩＭＣ、２−１−ＩＭＣを溶媒メタノール３ｍＬに加えて、これらの紫外吸収スペクトルおよび蛍光発光スペクトルを測定した。測定結果から分かるように、１−１−ＩＭＣおよび２−１−ＩＭＣの最大吸収波長はそれぞれ６５４ｎｍ、６６２ｎｍ（図１）、最大発光波長はそれぞれ６９２ｎｍ、７０３ｎｍ（図２）であり、いずれも近赤外領域にあり、近赤外線で励起される光増感剤として使用することができる。使用する機器は、それぞれAgIIlent 8453紫外分光光度計およびAgIIlent Cary EclIIpse蛍光分光光度計であった。
（２）光増感剤誘導体１−１−ＩＭＣ、２−１−ＩＭＣの一重項酸素発生測定
最終濃度が５Ｍとなったように前記実施例３で合成した化合物１−１−ＩＭＣ、２−１−ＩＭＣを溶媒メタノール３ｍＬに加えて、さらに、溶液における１，３−ジフェニルイソベンゾフラン（ＤＰＢＦ）の吸光度が約１．０となったようにＤＰＢＦを加えて、均一に混合した。続いて６６０ｎｍの赤色光を照射し、速やかにその紫外線吸収曲線を測定した。４１１ｎｍにおけるＤＰＢＦの吸光度値の変化から吸光度と時間の関係曲線を描いた。対照としてメチレンブルー（ＭＢ）を用い、下記式により一重項酸素量子収率を算出した。
光増感剤１−１−ＩＭＣ、２−１−ＩＭＣの一重項酸素量子収量はそれぞれ０．０４、０．８２であると算出した。図３は、光増感剤がメタノール溶媒に６６０ｎｍの光照射条件下で一重項酸素発生中におけるＤＰＢＦの吸光減衰曲線である。使用する機器はAgIIlent 8453紫外分光光度計であり、光源は３００Ｗキセノンランプ光源であった。
（３）光増感剤誘導体１−１−ＩＭＣ、２−１−ＩＭＣのインビトロ抗癌細胞試験
ＭＣＦ−７（ヒト乳癌細胞）を０．２５％のトリプシンで消化した後、１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ液体培地を用いて単一細胞の懸濁液を調製し、１ウェルあたりの液体培地体積が１００μＬ、１ウェルあたりの細胞密度が５０００個となったように９６ウェルの培養プレートに接種した。続いて、培養プレートを細胞インキュベーターに入れ２４時間インキュベートした。インキュベーターの環境は、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％、飽和湿度であった。各ウェルにそれぞれ濃度（５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３２、０．１６、０．０８、０．０４、０．０２μＭ）の１−１−ＩＭＣまたは２−１−ＩＭＣ １００μＬを加えて、同条件でさらに１時間インキュベートした。光毒性の測定について、９６ウェルプレートに６６０ｎｍの光源を１０分間照射後、前記培養環境においてさらに１２時間培養した。暗所毒性の測定について、光照射せずにそのまま１２時間培養した。続いて、各ウェルに濃度５ｍｇ/ｍＬのＭＴＴ溶液２０μＬを加えて、インキュベーターにおいてさらに４時間インキュベートした。ウェル中の液体培地を除去し、染料をＤＭＳＯ溶液２００μＬに溶かし、シャーレに移し、シェーカーで１０分間振とうした後、マイクロプレートリーダーで波長４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。下記式により細胞生存率を算出し、１−１−ＩＭＣおよび２−１−ＩＭＣの細胞に対する生体毒性を評価した。結果は図６に示す。
Cell Viability（%）＝［Σ（Ai/Acontrol×100)]/n
前記式において、Aiは第i群データの吸光度（i＝１、２、．．．、ｎ）であり、Acontrolは光増感剤添加なしの対照ウェルの平均吸光度である。同様の実験は３回以上行った。
実施例４
ベンゾフェノチアジン光増感剤とビオチンが結合した誘導体１−１−Ｂｉｏｔｉｎの合成
標的ベンゾフェノチアジン光増感剤誘導体１−１−Ｂｉｏｔｉｎの合成
ベンゾフェノチアジン１−１（１２０ｍｇ）、ビオチン（１２５ｍｇ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）（７０ｍｇ）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（７０ｍｇ）および４−メチルピリジン（４５ｍｇ）をＤＭＦ溶液１０ｍＬに加えて、室温で２４時間撹拌して反応させ、反応を停止し、減圧により多くの溶媒を留去し、カラムクロマトグラフィにより分離して深青色の固体製品を得た。收率は５２％であった。
核磁気1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 10.62 (s, 1H), 8.90 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.70 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.90 (dd, J = 12.8, 7.4 Hz, 2H), 7.82 (dd, J = 13.8, 6.2 Hz, 2H), 7.48 (s, 1H), 7.32 (s, 2H), 6.38 (d, J = 23.4 Hz, 2H), 4.41 ‐ 4.21 (m, 1H), 4.10 (s, 1H), 3.80 ‐ 3.54 (m, 6H), 3.15 (s, 1H), 3.04 (d, J = 5.6 Hz, 3H), 2.78 (dd, J = 12.3, 4.9 Hz, 1H), 2.56 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.05 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.75 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 1.60 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 1.54 ‐ 1.38 (m, 7H), 1.35 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 1.22 (d, J = 7.0 Hz, 6H). 13C NMR (126 MHz, DMSO) δ 171.82, 162.66, 153.06, 150.63, 139.45, 136.60, 133.92, 133.13, 131.81, 131.12, 130.90, 129.49, 124.61, 123.75, 116.98, 106.90, 105.34, 103.37, 61.02, 59.17, 55.41, 45.03, 44.07, 40.03, 39.95, 39.86, 39.79, 39.69, 39.62, 39.52, 39.36, 39.19, 39.02, 38.22, 35.18, 29.07, 28.41, 28.17, 28.02, 26.10, 26.07, 25.32, 12.63.
誘導体１−１−Ｂｉｏｔｉｎの性能測定
（１）誘導体１−１−Ｂｉｏｔｉｎの吸光および蛍光スペクトル測定
最終濃度が５Ｍとなったように前記実施例４で合成した化合物１−１−Ｂｉｏｔｉｎを溶媒ジクロロメタン３ｍＬに加えて、その紫外吸収スペクトルおよび蛍光発光スペクトルを測定した。測定結果から分かるように、１−１−Ｂｉｏｔｉｎの最大吸収波長は６５２ｎｍ（図７に示す）、最大発光波長は６８１ｎｍ（図８に示す）であり、いずれも近赤外領域にあり、近赤外線で励起される光増感剤として使用することができる。使用する機器は、それぞれAgIIlent 8453紫外分光光度計およびAgIIlent Cary EclIIpse蛍光分光光度計であった。
（２）ベンゾフェノチアジンとビオチンが結合した誘導体１−１−Ｂｉｏｔｉｎの一重項酸素発生測定
最終濃度が５Ｍとなったように前記実施例４で合成した化合物１−１−Ｂｉｏｔｉｎを溶媒ジクロロメタン３ｍＬに加えて、さらに、溶液における１，３−ジフェニルイソベンゾフラン（ＤＰＢＦ）の吸光度が約１．０となったようにＤＰＢＦを加えて、均一に混合した。続いて６６０ｎｍの赤色光を照射し、速やかにその紫外線吸収曲線を測定した。４１１ｎｍにおけるＤＰＢＦの吸光度値の変化から吸光度と時間の関係曲線を描いた。対照としてメチレンブルー（ＭＢ）を用い、下記式により一重項酸素量子収率を算出した。
光増感剤１−１−Ｂｉｏｔｉｎの一重項酸素量子収量は０.０４であると算出した。図９は、光増感剤がメタノール溶媒に６６０ｎｍの光照射条件下で一重項酸素発生中におけるＤＰＢＦの吸光減衰曲線である。使用する機器はAgIIlent 8453紫外分光光度計であり、光源は３００Ｗキセノンランプ光源であった。
（３）ベンゾフェノチアジンとビオチンが結合した誘導体１−１−Ｂｉｏｔｉｎのインビトロ抗癌細胞試験
ＨｅｐＧ２（肝癌細胞、細胞表面におけるビオチン受容体が過剰に発現される）およびＣＯＳ−７（アフリカ緑猿の腎細胞、細胞表面におけるビオチン受容体が低く発現される）を０．２５％のトリプシンで消化した後、１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ液体培地を用いて単一細胞の懸濁液を調製し、１ウェルあたりの液体培地体積が１００μＬ、１ウェルあたりの細胞密度が５０００個となったように９６ウェルの培養プレートに接種した。続いて、培養プレートを細胞インキュベーターに入れ２４時間インキュベートした。インキュベーターの環境は、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％、飽和湿度であった。各ウェルにそれぞれ濃度の１−１−Ｂｉｏｔｉｎ １００μＬを加えて、同条件でさらに３０分間インキュベートした。光毒性の測定について、９６ウェルプレートに６６０ｎｍの光源を１０分間照射後、前記培養環境においてさらに１２時間培養した。暗所毒性の測定について、光照射せずにそのまま１２時間培養した。続いて、各ウェルに濃度５ｍｇ/ｍＬのＭＴＴ溶液２０μＬを加えて、インキュベーターにおいてさらに４時間インキュベートした。ウェル中の液体培地を除去し、染料をＤＭＳＯ溶液２００μＬに溶かし、シャーレに移し、シェーカーで１０分間振とうした後、マイクロプレートリーダーで波長４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。下記式により細胞生存率を算出し、１−１−Ｂｉｏｔｉｎの細胞に対する生体毒性を評価した。
Cell Viability（%）＝［Σ（Ai/Acontrol×100)]/n
前記式において、Aiは第ｉ群データの吸光度（i＝１、２、．．．、ｎ）であり、Acontrolは光増感剤添加なしの対照ウェルの平均吸光度である。同様の実験は３回以上行った。
図１０からわかるように、１−１−Ｂｉｏｔｉｎは、ＨｅｐＧ２（肝癌細胞）およびＣＯＳ−７（アフリカ緑猿の腎細胞）のいずれかに対しても暗所毒性が低いが、光毒性が大きく異なり、６６０ｎｍのＬＥＤ光源で１０分間照射後、ＨｅｐＧ２細胞が大量に死亡したのに対し、ＣＯＳ−７細胞の生存率が依然として高かった（図１１に示す）。結果からわかるように、１−１−Ｂｉｏｔｉｎは、ビオチン受容体を過剰に発現するＨｅｐＧ２細胞に対する死滅効果が明らかにビオチン受容体を低く発現するＣＯＳ−７細胞よりも高い。これは、ベンゾフェノチアジンとビオチンが結合した誘導体１−１−Ｂｉｏｔｉｎが、ビオチン受容体を過剰に発現する細胞に対して選択性を有し、腫瘍細胞を標的にして死滅させる効果を達成できることを示している。
（４）ベンゾフェノチアジンとビオチンが結合した誘導体１−１−Ｂｉｏｔｉｎのインビトロ細胞選択性試験
まず、生きているＨeｐＧ２細胞およびＣＯＳ−７細胞をシャーレにおいて２４ｈ共培養した後、１μＭの１−１−Ｂｉｏｔｉｎまたは１−１を加え、さらに１ｈインキュベートした。染色終了後、無血清培地で３回洗浄し、新鮮な培地２ｍＬを加え、共焦点レーザ走査顕微鏡によって蛍光を観察した。励起波長は６３５ｎｍ、蛍光受け取りチャネル（fluorescent receiving channel）は６５５ｎｍ〜７５５ｎｍであった。図１２は試験結果を示す。図から分かるように、１−１−Ｂｉｏｔｉｎはビオチン受容体を過剰に発現するＨeｐＧ２細胞に特異的に入ることができたが、ＣＯＳ−７細胞への１−１−Ｂｉｏｔｉｎ摂取は少なかった。なお、ベンゾフェノチアジン光増感剤１−１はこのような選択性を有さなかった。これは、ビオチンの結合が癌細胞を標的する效果を果たすことを示している。

Claims (10)

  1. 構造が一般式Ｉで表される化合物である光増感剤。
    〔一般式Ｉにおいて、
    Ｘは、ＳまたはＳeであり、
    Ｙは、ハロゲンイオン、ＣｌＯ４ −、ＰＦ６ −、ＢＦ４ −、ＣＨ３ＣＯＯ−およびＯＴs−から選択される１種であり、
    Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル基、アルコキシ基、アルキルアミド基、アルキルアジド基、アルキルアルキニル基、アルキルアミノ基、アルキルスルホン酸基、アルキルヒドロキシ基およびアルキルカルボキシ基から選択される１種であり、
    Ｒ３は、Ｈ、アルキル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、モルホリニル基、カルボニル基、アミド基、アジド基、アルキニル基、アミノ基、スルホン酸基、ヒドロキシ基およびカルボキシ基から選択される１種であり、
    Ｌ１はリンカーを表し、−（ＣＨ２）ｍ−または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−であり、
    ｍは５〜２０の整数であり、ｎは２〜２０の整数である。〕
  2. 前記Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜５アルキル基、Ｃ１〜５アルコキシ基、Ｃ２〜５アルキルアルキニル基、Ｃ２〜６アルキルスルホニル基およびＣ２〜６アルキルアジド基から選択される請求項１に記載の光増感剤。
  3. 前記Ｒ３は、アミノ基、カルボキシ基、ヒドロキシ基およびアジド基から選択される請求項１に記載の光増感剤。
  4. 前記ｍおよびｎは、それぞれ独立して、５、６、７または８である請求項１に記載の光増感剤。
  5. 前記一般式Ｉの化合物は、下記化合物から選択される請求項１に記載の光増感剤。
  6. 抗腫瘍剤の製造のための、請求項１に記載の光増感剤の使用。
  7. 請求項１に記載の光増感剤の誘導体であって、一般式ＩＩで表される構造を有する光増感剤誘導体。
    〔式ＩＩにおいて、Ｒ４は、抗癌化学療法剤分子または腫瘍標的機能を有する分子薬である。〕
  8. 前記Ｒ４は、ａ１〜ａ１０から選択される請求項７に記載の光増感剤誘導体。
  9. 下記の化合物から選択される請求項７に記載の光増感剤誘導体。
  10. 抗腫瘍剤の製造のための、請求項７に記載の光増感剤誘導体の使用。
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