CN114409687B - 一种可在肿瘤内切换光治疗模式的光敏药物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可在肿瘤内切换光治疗模式的智能光敏药物及其制备方法和应用，通过对一种含有N,N‑二甲基的氟硼二吡咯进行亲核取代修饰，引入了可与硝基还原酶反应的硝基基团。将可与硝基还原酶反应的硝基共价连接到衍生化的氟硼二吡咯光敏剂上，得到一种可在肿瘤内切换光治疗模式的智能光敏药物：对硝基苄基‑氟硼二吡咯缀合物。同时本发明以对硝基苄基‑氟硼二吡咯缀合物为研究对象，分别以人肝癌细胞HepG2、人宫颈癌细胞HeLa为受试细胞株，展开了其体外抗癌活性研究，为对硝基苄基‑氟硼二吡咯缀合物应用于癌症的联合治疗奠定了基础。本发明合成方法简单，原料易得，成本低，副反应少，产率较高，易提纯，有利于工业化生产。

Description

一种可在肿瘤内切换光治疗模式的光敏药物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于抗癌药物设计、合成领域，具体涉及一种可在肿瘤内切换光治疗模式的智能光敏药物的制备及其应用。
背景技术
光动力治疗是一种无创或者微创的新兴癌症治疗手段。光敏剂受特定波长光的激发，处于激发态的光敏剂与氧分子作用生成高浓度的活性氧。高浓度活性氧会诱导肿瘤细胞的凋亡或坏死，从而导致肿瘤的消融。光动力治疗具有广谱抗肿瘤活性、低毒副作用、低耐药性、可重复治疗等优点。这些优点使光动力治疗成为一种极具潜力的癌症治疗方法。
但在实际操作中光动力治疗却面临着不少的阻碍，其中一个不可忽视的阻碍就是肿瘤乏氧，肿瘤乏氧是大多数实体肿瘤的共同特征，表现为肿瘤组织氧水平下降，而肿瘤乏氧主要来源于肿瘤血管的扭曲和癌细胞的不规则增殖引起的耗氧和摄取之间的不平衡所致，而且PDT本身，通过快速使用细胞内的氧气储备，会进一步加剧这种缺氧状态，随着氧的快速消耗，异常和畸形的肿瘤血管进一步限制了氧的供应和肿瘤内扩散到肿瘤肿块的内部区域，从而降低了肿瘤组织中的氧水平，加重了肿瘤缺氧的状态。这种乏氧状态是递加的，即越靠近肿瘤内部，乏氧状态越严重。而且细胞内活性氧半衰期比较短，扩散距离有限，这导致内部肿瘤无法得到有效杀伤，导致肿瘤容易复发。从而限制了光动力治疗在临床上的进一步应用。
光热治疗是通过采用外部光源激发光热试剂，光热试剂吸收光能并将其转换为热能，从而在肿瘤部位诱导局部热疗，当局部温度超过43℃时，癌细胞会发生蛋白变性，通过热消融杀死癌细胞。但光热治疗所需光剂量较大，较高的温度也会对周围健康组织造成伤害。
协同治疗已经被越来越多的研究者所关注，与单一治疗模式相比，协同治疗具有更佳的抗肿瘤效果，更为重要的是，协同联合治疗可以通过不同的作用机制杀死肿瘤细胞，避免多药耐药引起的肿瘤复发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可在肿瘤内切换光治疗模式的智能光敏药物的制备及其应用。将含有硝基的化学基团和氟硼二吡咯光敏剂共价连接，得到一种可在肿瘤内切换光治疗模式的智能光敏药物。当药物分子处于含氧量相对较高的肿瘤外层时，光敏剂被激发与氧分子作用产生高浓度活性氧，诱导肿瘤细胞凋亡或坏死，从而进行光动力治疗：而当光敏剂进入肿瘤内部时，由于肿瘤内部乏氧，硝基还原酶过度表达，前药分子中硝基基团会被肿瘤细胞中高度表达的硝基还原酶还原，经分子内转化，对硝基苄基被脱去，由于强电子供体4-二甲氨基苯基与氟硼二吡咯核之间的光诱导电子转移(PET)效应，N,N-二甲基氟硼二吡咯的荧光被明显猝灭，确保非辐射跃迁处于最大概率，将N,N-二甲基氟硼二吡咯成为一种潜在的光热试剂。当处于光照条件下时，光热试剂吸收光能并将其转换为热能，从而进行光热治疗；最终达到光动力治疗-光热治疗协同治疗的目的(图1)。并且对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物有着很强的荧光，而其被硝基还原酶还原转化后荧光猝灭，可根据其荧光的变化来监测激活情况。本发明合成的化合物结构单一，不存在异构体，产品容易提纯；合成方法比较简单，副反应少，产率较高，原料易得，成本低，有利于工业化生产，是一种光动力-光热协同治疗的智能光敏药物。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种可在肿瘤内切换光治疗模式的智能光敏药物，其为对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物6a，其化学结构式为
上述化合物的制备方法包括以下步骤：
以化合物(对硝基苄溴)以及三氟甲烷磺酸银(AgOTf)起始原料，合成对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物
具体为：
(1)将化合物与/>以及三氟甲基磺酸银(AgOTf)按摩尔比1:3:3混合后，加入到25mL的甲苯中，将上述所得混合物在50℃下加热搅拌3h。TLC板监测反应，待反应结束后，过滤反应液并用二氯甲烷(3×20mL)萃取滤渣，水洗三次，收集有机相；有机层经无水硫酸钠干燥，减压旋蒸除去溶剂，粗产物以二氯甲烷/甲醇(体积比为25:1)为洗脱剂，经硅胶柱色谱纯化得到对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物/>
所述化合物5a的制备方法包括以下步骤：
(1)以化合物为起始原料，合成化合物/>
具体为：
(1)将化合物按摩尔比1:9-10混合后与0.24mL哌啶、0.20mL冰醋酸共同溶解于25mL的甲苯中，混合液加热回流搅拌3h，反应过程中产生的水通过分水器除去。TLC板监测反应，待反应结束后，减压旋蒸除去溶剂，剩余物与饱和氯化钠水溶液混合，并用二氯甲烷萃取三次(3×20mL)，收集有机层；有机层经无水硫酸钠干燥后旋干除去溶剂，粗产物以乙酸乙酯/石油醚(体积比为1:1)为洗脱剂，经硅胶柱层析分离得到深绿色固体化合物/>
应用：所述对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
光疗法(Phototherapy)包括光动力疗法(Photodynamic Therapy，PDT)和光热疗法(Photothermal therapy,PTT)。光动力治疗(Photodynamic Therapy，PDT)由三部分组成：特定波长的光、光敏剂以及氧气。光敏剂作为光动力治疗必不可少的一部分，是光动力治疗的核心和催化剂。理想的光敏剂应满足以下几点：组分单一，结构明确，光化学性质稳定；光敏化能力强，单线态氧量子产率高；最长激发波长位于近红外区，皮肤穿透性较高。
光热疗法由光热试剂和特定波长的光两部分组成，理想的光热试剂应该满足良好的生物安全性；较高的摩尔消光系数；最大吸收处于近红外区域；杰出的光热转换效率；良好的光稳定性；良好的生物可降解性这几点。氟硼二吡咯(Boron dipyrromethene，BDP)类光敏剂具有许多优异特性(如较高摩尔消光系数与荧光量子产率，较强的光稳定性和化学稳定性，易进行化学修饰)而成为理想的光敏剂之一。本发明合成了一个含有N,N-二甲基的氟硼二吡咯衍生物。分子设计中，通过重原子溴修饰增加单线态氧量子产率，进而增强光敏剂光毒性；通过三乙二醇链修饰改善分子亲水性。
基于此，本发明通过可被硝基还原酶还原的对硝基苄溴与含有N,N-二甲基的氟硼二吡咯共价偶联合成了一种可在肿瘤内切换光治疗模式的智能光敏药物。当药物被摄取进入肿瘤细胞后，在特定的光照下，分布在肿瘤表面的光敏剂药物被激发，激发态的光敏剂与氧分子作用，产生高浓度活性氧，诱导肿瘤细胞凋亡或坏死，进行光动力治疗；而在肿瘤内部，药物的硝基被硝基还原酶还原，转变成光热试剂，光热试剂吸收光能并将其转换为热能，从而在肿瘤部位诱导局部热疗，当局部温度超过43℃时，癌细胞会蛋白变性，通过热消融杀死癌细胞。最终实现在肿瘤内切换光治疗模式的光动力疗法和光热疗法的协同治疗。
本发明的显著优点在于：
(1)此药物在肿瘤微中可自动转换光治疗模式，实现光动力和光热协同治疗，即避免了反复给药可能造成的身体伤害也避免了多药耐药性引起的肿瘤复发。
(2)硝基还原酶还原前后，即N,N-二甲基氟硼二吡咯和对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物最大吸收基本不变，不必调整治疗波长。
(3)目标化合物结构单一，不存在异构体，产物容易纯化；
(4)合成方法简单，副反应少，原料易得，成本低，有利于工业化生产。
附图说明
图1为对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物的作用机制；
图2中(a)对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物和N,N-二甲基氟硼二吡咯的归一化电子吸收光谱，(b)对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物和N,N-二甲基氟硼二吡咯的荧光发射光谱(λex＝610nm，化合物浓度均为10μM)；
图3中(a)对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物在缓冲溶液中(DMSO:PBS＝1：4)与NTR/NADH共同孵育后的吸收变化；(b)对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物在缓冲溶液中(DMSO:PBS＝1：4)与NTR/NADH共同孵育后的荧光变化；(c)对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物在缓冲溶液中(DMSO:PBS＝1：4)中的荧光变化；(d)有无NTR/NADH的情况下，对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物在718nm处荧光衰减率的比较；
图4中(a)HepG2细胞中，对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物在正常氧；中度乏氧；乏氧以及双香豆素情况下胞内荧光强度成像图；(b)是(a)的荧光强度量化数据(**表示P<0.01，***表示P<0.001)；(c)HepG2细胞中，对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物在正常氧；中度乏氧；乏氧以及双香豆素情况下胞内荧光强度成像图；(d)是(c)的荧光强度量化数据(**表示P<0.01，***表示P<0.001)；
图5在不同条件下，硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物在乏氧和常氧状态下对HepG2和HeLa两种细胞的MTT柱状图(660nm,0.6W,2min)；
图6为化合物5a在CDCl3中的1HNMR谱图；
图7为化合物5a在CDCl3中的13C NMR谱图；
图8为化合物5a的HRMS谱图；
图9为化合物6a在CDCl3中的1HNMR谱图；
图10为化合物6a在DMSO-d6中的13C NMR谱图；
图11为化合物6a的HRMS谱图。
具体实施方式
具有可在肿瘤内切换光治疗模式的智能光敏药物对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物的具体制备过程包括：
(1)将化合物按摩尔比1:9-10混合后与0.24mL哌啶、0.20mL冰醋酸共同溶解于25mL的甲苯中，混合液加热回流搅拌3h，反应过程中产生的水通过分水器除去。TLC板监测反应，待反应结束后，减压旋蒸除去溶剂，剩余物与饱和氯化钠水溶液混合，并用二氯甲烷萃取三次(3×20mL)，收集有机层；有机层经无水硫酸钠干燥后旋干除去溶剂，粗产物以乙酸乙酯/石油醚(体积比为1:1)为洗脱剂，经硅胶柱层析分离，得到深绿色固体化合物5a，其化学结构式为/>产率为45％-70％。
(4)将化合物与/>以及三氟甲烷磺酸银(AgOTf)按摩尔比1:3:3混合后，加入到25mL的甲苯中，将上述所得混合物在50℃下加热搅拌3h。TLC板监测反应，待反应结束后，过滤反应液并用二氯甲烷(3×20mL)萃取滤渣，水洗三次，收集有机相；有机层经无水硫酸钠干燥，减压旋蒸除去溶剂，粗产物以二氯甲烷/甲醇(体积比为25:1)为洗脱剂，经硅胶柱色谱纯化得到对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物6a，其化学结构式为：
产率为20-29％。
以上实施例进一步阐述本发明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
(1)将化合物(0.022g，0.042mmol)、/>(0.113g，0.420mmol)与0.24mL哌啶、0.2mL冰醋酸溶解25mL的甲苯中，混合液加热回流搅拌3h，反应过程中产生的水通过分水器除去。TLC板监测反应，待反应结束后，减压旋蒸除去溶剂，剩余物与饱和氯化钠水溶液混合，并用二氯甲烷萃取三次(3×20mL)，收集有机层；有机层经无水硫酸钠干燥后旋干除去溶剂，粗产物以乙酸乙酯/石油醚(体积比为1:1)为洗脱剂，经硅胶柱层析分离，得到深绿色固体化合物/>(0.031g，70％)。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.08(d,J＝17Hz,2H,CH＝CH),7.63–7.59(m,6H,ArH and CH＝CH),7.06(d,J＝8.5Hz,2H,ArH),6.97(d,J＝8.5Hz,4H,ArH),6.79(d,J＝8.5Hz,2H),4.20(t,J＝5.0Hz,4H,OCH2),3.92–3.88(m,4H,OCH2),3.79–3.75(m,4H,OCH2),3.72–3.69(m,4H,OCH2),3.68–3.65(m,4H,OCH2),3.58–3.56(m,4H,OCH2),3.39(s,6H,OCH3),3.05(s,6H,N(CH3)2),1.53(s,6H,CH3).13C NMR(151MHz,CDCl3):δ159.87,150.57,148.00,141.12,140.26,138.40,132.67,130.07,130.00,129.34,129.19,116.26,114.95,112.89,109.87,71.94,70.88,70.67,70.59,69.69,67.54,59.07,40.69,14.08.HRMS(ESI):C49H58BBr2F2N3NaO8理论计算值(m/z[M+Na]+)为1048.2524,实际测量值为1048.2501。化合物5a在CDCl3中的1H NMR谱图如图6所示，化合物5a在CDCl3中的13C NMR谱图如图7所示，化合物5a的HRMS谱图如图8所示。
(2)将化合物(0.040g,0.040mmol)、/>(0.025g,0.12mmol)和三氟甲基磺酸银(AgOTf)(0.030g,0.12mmol)置于圆底烧瓶中，加入到25mL的甲苯使其充分溶解中，将上述所得混合物在50℃下加热搅拌3h。TLC板监测反应，待反应结束后，过滤反应液并用二氯甲烷(3×20mL)萃取滤渣，水洗三次收集有机相；有机层经无水硫酸钠干燥，减压旋蒸除去溶剂，粗产物以二氯甲烷/甲醇(体积比为25:1)为洗脱剂，经硅胶柱色谱纯化得到深绿色固体化合物/>(0.013g，29％)。1 NMR(500MHz,CDCl3):δ8.15(d,J＝16Hz,2H,CH＝CH),8.09(d,J＝8.0Hz,2H,ArH),7.86(d,J＝8.0Hz,2H,ArH),7.63–7.58(m,8H,ArH,CH＝CH),7.41(d,J＝8.0Hz,2H,ArH),6.99(d,J＝8.0Hz,4H,ArH),5.54(s,2H,CH2),4.20(m,4H,OCH2),3.91–3.87(m,10H,N(CH3)2and OCH2),3.79-3.75(m,4H,OCH2),3.73-3.69(m,4H,OCH2),3.70-3.66(m,4H,OCH2),1483.59-3.55(m,4H,OCH2),3.39(s,6H,OCH3),1.51(s,6H,CH3).13C NMR(151MHz,DMSO-d6):δ160.26,148.64,147.88,140.76,139.02,134.28,131.44,130.63,129.26,128.75,123.94,123.59,123.16,121.81,119.67,117.54,115.43,114.99,109.96,71.34,70.04,69.86,69.67,68.90,67.51,58.12,53.88,43.85,14.01.HRMS-ESI(m/z):C56H64BBr2F2N4O10理论计算值(m/z[M+H]+)为1161.3024,实际测量值为1161.3039。化合物6a在CDCl3中的1H NMR谱图如图9所示，化合物6a在CDCl3中的13C NMR谱图如图10所示，化合物6a的HRMS谱图如图11所示。
应用实例1
对对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物吸收和荧光光谱进行研究。此部分实验通过对药物的吸收和荧光进行研究，根据吸收找到合适的激发波长，为后续的实验进行提供研究基础。
取对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物和N,N-二甲基氟硼二吡咯母液稀释到1.5mL二甲基亚砜(DMSO)中，收集300-750nm的吸收光谱，归一化处理。再量取20μL对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物母液(1mM)，稀释到2mL的DMSO中，得到10μM的样品，以610nm为激发波长，收集620-900nm的荧光光谱。
测定了对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物和N,N-二甲基氟硼二吡咯在DMSO中的电子吸收光谱。如图2中(a)所示，对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物和N,N-二甲基氟硼二吡咯显示出强烈的Q带吸收，最大值分别约为676nm和663nm，归因于相同的π-共轭骨架，确保在光疗治疗期间，相同波长的光源有效激发光敏剂。此外，它们保留了出色的摩尔消光系数，最大限度地利用了光子能量，是理想的光敏剂。还测定了荧光发射光谱，如同预期的那样，图2中(b)中，对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物有着强烈的荧光，而在N,N-二甲基氟硼二吡咯中由于PET效应荧光被显著猝灭。对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物和N,N-二甲基氟硼二吡咯荧光的差异，为后续在细胞中的激活提供了依据。
应用实例2
在体外模拟肿瘤环境中，针对对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物对硝基还原酶的响应进行研究，此部分实验可为药物后续在肿瘤内部的响应提供依据。在上述化合物中，N,N-二甲基氟硼二吡咯由于N,N-二甲基的存在，发生PET效应，无法发生系间蹿越，所以N,N-二甲基氟硼二吡咯作为一种光热试剂，荧光也被显著猝灭。而对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物由于N原子被质子化，PET效应消失，所以对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物作为一种光敏剂，在特定激发波长下能产生很强的荧光。通过荧光强度的变化，可以得出对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物对硝基还原酶的响应情况。
对硝基还原酶(NTR)的响应实验：准确称取1.16mg对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物溶于1mLDMSO中，配置成浓度为1mM的母液。移取母液102μL、DMSO 1000μL于小烧瓶、PBS4000μL溶解分装好的NTR 15μg、NADH 1.8mg，加入反应瓶得5mL反应液，得到NTR浓度3μg/mL)，NADH(500μM)，对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物(20μM)的溶液。放入已经恒温37℃的油浴锅，塞好塞子，开始计时。5分钟后移取0.5mL于比色皿，加入1.5mL DMSO，吹打均匀测试荧光及紫外。
如图3中(a)和(b)所示，随着反应时间的延长，荧光稳步降低，而吸收光谱蓝移，伴随着NADH的消耗，300-400nm吸光度降低，这清楚地表明了从对硝基苄基-氟硼二吡咯到N,N-二甲基氟硼二吡咯的转化过程。此外还研究了在相同条件下不含NTR和NADH的对照组，如图3中(c)所示，在相同时间段内几乎没有减弱荧光。而且，图3中(d)所示，718nm处的荧光强度迅速下降，证实对硝基苄基-氟硼二吡咯离易受硝基还原酶的影响。全部的这些结果表明，硝基还原酶低氧切换光治疗模式的理想开关。
应用实例3
对对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物进行不同条件处理后，在不同细胞株中对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物响应情况进行研究。此部分实验对药物的激活在细胞中进行验证，为后续的细胞毒性实验进行提供研究基础。对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物被硝基还原酶还原后，经分子内转化形成N,N-二甲基氟硼二吡咯，此过程伴随着对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物荧光的消失。基于此，可以借助激光共聚焦显微镜监测细胞内对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物的荧光来说明该缀合物对硝基还原酶的响应。
细胞内药物释放：取生长状态良好的人肝癌细胞HepG2、人宫颈癌细胞HeLa，用0.25％胰蛋白酶消化后用DMEM培养基(含10％胎牛血清)配制1×105cells/mL细胞悬液，吹打均匀后平铺于激光共聚焦皿中，置于细胞培养箱中培养过夜使细胞贴壁；除去激光共聚焦皿中的培养基，用PBS清洗两次；其中加双香豆素的组，准确量取10μL双香豆素母液(10mM)，稀释到1mL的DMEM中，得到10μM的样品，加入到激光共聚焦皿中孵育6h。再量取10μL药物母液(1mM)，稀释到1mL的DMEM中，得到10μM的样品，加入已经配置好的药物样品，使细胞在乏氧或常氧浓度下孵育6h(使用0.1％和9％pO2有氧安全气囊产生所需的大气)，除去旧的培养基，用PBS清洗两遍，向激光共聚焦培养皿中加入1mL无血清无酚红的培养基，在激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
我们使用激光共聚焦显微镜探究了在不同条件处理后，对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物在人肝癌细胞株HepG2以及人宫颈癌细胞株HeLa中的响应情况。如图4中(a)和(b)所示，HepG2细胞内观察到氧气浓度依赖性的荧光，随着常氧浓度降低到低氧，细胞内的荧光信号减弱。这说明随着细胞内氧气浓度的降低，癌细胞内硝基还原酶过度表达，使得对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物中的硝基被还原，对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物转化为N,N-二甲基氟硼二吡咯，此过程伴随着荧光的消失。而且进一步发现，在经加入硝基还原酶(NTR)抑制剂双香豆素预处理的乏氧孵育细胞组中，荧光强度远高于未经双香豆素预处理的组，表明激活过程与细胞内氧气缺乏导致的内源性硝基还原酶表达高度相关。而且在相同的实验条件下，如图4中(c)和(d)所示，HeLa细胞也观察到了类似的结果。这说明我们所合成的硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物具有乏氧响应的性质，而且其激活过程可以通过观察荧光进行监测。
应用实例4
对对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物的体外抗肿瘤活性进行探究，该实验能为后续药物在体内抗肿瘤活性研究提供一定的理论基础。光敏剂的细胞毒性实验通常包括光毒性和暗毒性两部分，采用MTT法测定。检测原理MTT是种黄绿色染料，其化学名称为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶将外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪测试其490nm处吸光度值(OD值)，根据测得的OD值，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。
MTT实验：取生长状态良好的人肝癌细胞HepG2和人宫颈癌细胞HeLa，用0.25％胰蛋白酶消化后用DMEM培养基(含10％胎牛血清)配制8×104cells/mL细胞悬液，每个实验组设置6个平行孔，每孔100μL细胞悬液接种于96孔培养板内，置于培养箱内培养过夜使细胞贴壁后，除去培养基。加维生素C(Vc)组准确量取40μL Vc母液(20mM)，稀释到4mL的DMEM中，得到200μM的样品，吹打均匀，向Vc组每个孔中加入100μL孵育2h。再量取152μL药物母液(1mM)，稀释到10mL的DMEM中，得到15μM的样品，吹打均匀后向每个孔中加入100μL。加药后，使细胞在乏氧或常氧浓度下孵育6h。光毒实验：去除含药液的培养基，每孔换上100μL新鲜培养基，然后用LED灯板对细胞进行光照，激发波长为660nm，Light 1能量密度为72J·cm-2；Light 2能量密度为6J·cm-2，光照完毕，将96孔板重置于培养箱内继续培养。暗毒实验：在换完新鲜培养基后直接放入培养箱中继续培养；孵育24小时后，每孔加入MTT的PBS溶液(5mg·mL-1，10μL)，孵育4小时后小心吸去细胞培养基，每孔加入100μL DMSO并置于摇床上使细胞裂解并溶解甲瓒颗粒，用酶标仪测定570nm波长下OD值。
我们采用MTT法测定了实施例制备的对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物在不同条件处理后，在光照和无光照条件下，对人肝癌细胞HepG2人宫颈癌细胞HeLa的杀伤效果，光照波长为660nm，Light 1能量密度为72J·cm-2；Light 2能量密度为6J·cm-2。由图5可知：15μM的对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物在未经光照处理时，对HepG2及HeLa细胞不造成损伤，基本没有细胞毒性。但从常氧或乏氧条件下细胞存活率来看，对两种细胞都有较高的光毒性。当引入Vc(抑制活性氧的产生)后，光照后发现细胞在乏氧条件下存活率基本不变，而在常氧条件下存活率明显上升；而当光照时冰浴处理后，发现细胞在常氧条件下存活率变化很小，而在乏氧条件下存活率明显上升。引入Vc会抑制光动力疗法过程中产生的活性氧，而冰浴能吸收光热疗法过程中产生的热量，这充分体现了常氧和乏氧状态下光动力疗法和光热疗法的切换，即乏氧状态下对硝基苄基-氟硼二吡咯向N,N-二甲基氟硼二吡咯的切换。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种可在肿瘤内切换光治疗模式的光敏药物，其特征在于：所述的光敏药物为对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物，其化学结构式为：
。
2.一种如权利要求1所述的可在肿瘤内切换光治疗模式的光敏药物的制备方法，其特征在于：以化合物、/>以及三氟甲烷磺酸银为起始原料，合成对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物/>。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将化合物与/>以及三氟甲烷磺酸银按摩尔比1:3:3混合后，加入甲苯中，然后在50℃下加热搅拌3 h，待反应结束后，过滤反应液并用二氯甲烷萃取滤渣，水洗三次，收集有机相；有机层经无水硫酸钠干燥，减压旋蒸除去溶剂，经纯化得到对硝基苄基-氟硼二吡咯缀合物/>。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述化合物是以化合物/>、/>为起始原料合成的。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述化合物的制备方法，包括以下步骤：
将化合物、/>按摩尔比1:9-10混合后再与哌啶、冰醋酸一起溶解于甲苯中，混合液加热回流搅拌3 h，反应过程中产生的水通过分水器除去，待反应结束后，减压旋蒸除去溶剂，剩余物与饱和氯化钠水溶液混合，并用二氯甲烷萃取三次，收集有机层；有机层经无水硫酸钠干燥后旋干除去溶剂，经纯化得到深绿色固体化合物/>。
6.如权利要求1所述的光敏药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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