JP2020519906A - 免疫比濁法によるカルシウム結合タンパク質s100ファミリーメンバーの測定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
pHが5.0〜6.0の範囲内である20〜1000mmol/Lの有機緩衝液、
50〜300mmol/Lのナトリウム塩、カリウム塩、又はリチウム塩、
0.1〜1.5%のプロテアーゼ処理済み血清アルブミン、
0.01〜0.1%(w/v)のドデシル硫酸ナトリウム、及び
所望により、200mmosM/L以上の浸透圧を達成するためのβ−アルドース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、グルカン、デキストラン、及び/又は糖
を含む第1の試薬成分、並びに
S100A8及びS100A9のうちのいずれか一方又はカルプロテクチン(S100A8/A9)に結合する固定化モノクローナル抗体を担持する直径が150〜350nmであるラテックス粒子を0.01〜0.5%(w/v)含む第2の試薬成分
を含み得る。
例えばMERCK社、Bangs Laboratories社などのよく知られた製造業者のラテックス粒子を使用した。ラテックスはカルボキシル化ポリスチレン又はクロモメチルラテックスであった。ラテックス粒子は、表面電荷密度62μC/cm2、重合体1g当たりの表面電荷密度163μΕq、固形物含量9.0%のパラメーターを有し、0.05%のアジ化ナトリウムで安定化された。完全なリソソーム膜を有する顆粒球に由来する精製ヒトカルプロテクチンに対する精製モノクローナルマウス抗体(mAB 1062、1067、1069、1089;第1の反応成分中で結合)を共有結合することにより免疫粒子を調製した。カルボキシル化ポリスチレン粒子の粒径は、好ましくは均一な粒径(175nm)であった。あるいは、2種類の異なる粒径(160〜175nm及び250〜275nm)のナノ粒子を一種類のモノクローナル抗体で被覆した(図6参照)。また、単一粒径(175nm)のラテックス粒子を2種類の異なるモノクローナル抗体で被覆した。
以下のように大便試料を抽出処理した。15mgの大便を1.5mlの緩衝液中にそれぞれ1:100に希釈した。IgM抗血清を添加した、又は添加していない、1.5mlの検査緩衝液、すなわち50mMのマレイン酸(pH5.0)、150mMのNaCl、アジ化ナトリウム、0.1%のドデシル硫酸ナトリウム、ウシ血清アルブミンを空のサンプルチューブに充填した。比較のために調製済みのIDK Extract(登録商標)抽出緩衝液(カタログ番号K6967)及びビュールマンfCal Turbo(商標)抽出緩衝液も室温で使用して試料を抽出した。大便試料を採取し、2〜8℃で最大48時間保管した。長期間(最大12か月)については−20℃での保管が推奨される。比濁測定法開始時に凍結試料をゆっくりと、好ましくは2〜8℃で融解した。不均質な試料を機械的に均質化する場合もあった。試料採取のためにIDK(登録商標)Stool Sample Application System(SAS)(カタログ番号K6998SAS)を使用した。一定量の原材料を保持する切れ込みを有するSAS試験棒の先端を大便試料の中に差し込んだ。抽出緩衝液を含むチューブ中に試験棒を戻した。棒をチューブ中に入れると余分な材料が剥がれた。その後、試験棒に残っている15mgの大便試料を抽出緩衝液中に希釈した。チューブの蓋をきつく締め、切れ込みに大便試料が残らなくなるまでチューブを十分に振盪した。沈殿物を落ち着かせるために10分間が必要であった。沈殿物が再び分散しないことを確認し、抽出試料を検査緩衝液中に1:25に希釈した。例えば、40μlの抽出大便試料を960μlの検査緩衝液に添加した。
製造業者に従ってRoche Hitachi 912分析装置を使用する比濁測定のために、上記のようにいずれかの抽出緩衝液で抽出された試料を使用した。200μLの検査緩衝液、並びにpH5.0のクエン酸ナトリウム、ウシ血清アルブミン、Tween20、ショ糖、及びアジ化ナトリウムを含む50μLの貯蔵緩衝液に10μLの抽出試料を添加した。自動分析装置により37℃で5分間インキュベートしながら、抽出試料と免疫粒子を穏やかに混合した。固定化モノクローナル抗体を担持する粒子を含む第2の反応成分を穏やかに振盪しながら添加した。凝集に要する時間は37℃で5分間であり、その間に吸光度を測定した。測定を二連で実施した。570nmの波長で読み取りを行って吸光度値を得た。
本発明の比濁法との比較のためにELISA IDK(登録商標)カルプロテクチン(MRP8/14)を選択した。測定法はヒトカルプロテクチンに結合する2種類の選択されたモノクローナル抗体を使用する2部位サンドイッチ法を利用している。モノクローナル抗ヒトカルプロテクチン抗体で被覆されたマイクロプレートのウェルに校正物質、対照試料、及び希釈済み患者試料を添加する。1回目のインキュベーション工程の間に固定化された抗体分子が試料中のカルプロテクチンに結合する。その後、各ウェルにペルオキシダーゼ標識複合体を添加し、複合体が形成される。ペルオキシダーゼの基質としてテトラメチルベンジジン(TMB)を使用する。最後に酸性停止溶液を添加して反応を停止させる。カルプロテクチンの存在下で色が青色から黄色に変化する。
Claims (15)
- 患者の生物試料中のカルプロテクチンの存在を測定するインビトロの方法であって、
(a)所定量の前記生物試料を採取すること、
(b)(i)5.0〜6.0のpH、(ii)150mosmol/kg・H2O以上の浸透圧、(iii)0.01〜0.1重量%の陰イオン界面活性剤を有し、(iv)カルシウムイオン及び亜鉛イオンに配位し封鎖する有機緩衝液の所定量で前記生物試料を溶解及び抽出すること、及び(iv)所望により、前記生物試料のマトリックスをホモジナイズ及び抽出した後に存在する場合は粒子物質を除去して可溶化状態で存在する基本的にヘテロ二量体のカルプロテクチン(S100A8/A9)を含む試料溶液を得ること、
(c)S100A8及びS100A9のうちのいずれか一方又はカルプロテクチン(S100A8/A9)に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその断片が2種類以上固定化されたナノ粒子を含む特定量の試薬と所定量の工程(b)の前記試料溶液とを混合して、所定の分子状態で存在しているカルプロテクチン(S100A8/A9)との粒子結合抗体と抗原との反応を得ること、
(d)特定の時間にわたって工程(c)の前記混合物をインキュベートすること、及び
(e)前記混合物の光学特性を取得し、前記混合物の前記光学特性に基づいてカルプロテクチン(S100A8/A9)の含有量を示すシグナルを決定すること、
(f)前記含有量を校正後の対照に関連付け、前記生物試料中の前記測定されたカルプロテクチン(S100A8/A9)の存在に基づいて前記患者の臨床状態を評価すること
を含む前記方法。 - 決定された量が完全なリソソームコンパートメントを有する顆粒球から単離され、且つ、ポリクローナル単一特異性抗体によって決定された、カルプロテクチン標準物質に対する計量計測学的なトレーサビリティを有する、請求項1に記載のカルプロテクチン測定方法。
- 光学特性を取得する工程(e)が吸光度、透過率、反射率、光散乱、蛍光、又はシンチレーション値を決定することを含む、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 比濁免疫測定法又は比濁分析免疫測定法である、請求項3に記載の方法。
- 工程(b)及び工程(c)が2種類の試薬成分を使用することを含む粒子増強比濁免疫測定法(PETIA)である、請求項4に記載の方法。
- 感度の向上のために直径が150〜350nmであるナノ粒子を使用することを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記抗体が、測定範囲の向上のため、それぞれ(i)150〜200nm及び(ii)250〜350nmの範囲内で均一な直径を有する2種類の粒子に結合している、請求項6に記載の方法。
- 前記粒子がカルボキシル化ポリスチレン粒子又はクロロメチル活性化ポリスチレン粒子である、請求項1〜請求項7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物試料が糞便又は糞便抽出物である、請求項1〜請求項8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記緩衝液組成物がポリカルボン酸、トリカルボン酸、アコニット酸、トリカルバリル酸、ジカルボン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、α−ヒドロキシカルボン酸、β−ヒドロキシカルボン酸、γ−ヒドロキシカルボン酸、ヒドロキシジカルボン酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、マロン酸、グルコン酸、5−ケトグルコン酸、2−ケトグルコン酸、ジヒドロキシマレイン酸、マレイン酸、フマル酸、ニトリロ三酢酸、乳酸、及び/又はアスコルビン酸からなる群より選択される少なくとも1種類の塩から構成される、請求項1〜請求項9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粒子結合抗体と抗原との反応が5.0〜6.0のpHを有し、且つ、陰イオン界面活性剤又はドデシル硫酸ナトリウム及びCa2+配位緩衝剤分子を含む混合物中で実施される、請求項1〜請求項10のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(b)の前記カルシウム封鎖緩衝液が、クエン酸塩、酢酸塩、又はマレイン酸塩のうちの少なくとも1種類の塩、プロテアーゼ処理済み血清アルブミン、及び0.01〜0.1重量%の陰イオン界面活性剤を含む、請求項11に記載の方法。
- 非特異的なIgM抗血清を添加すること又は非特異的なIgM抗血清が存在することを含む、請求項1〜請求項12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物試料が血液、血清、又は血漿である、請求項1〜請求項8及び請求項10から請求項13のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜請求項14のいずれか一項に記載の粒子増強比濁免疫測定法により生物試料中のカルプロテクチンの存在を測定するための検査キットであって、
pHが5.0〜6.0の範囲内である20〜1000mmol/Lの有機緩衝液、
50〜300mmol/Lのナトリウム塩、カリウム塩、又はリチウム塩、
0.1〜1.5%のプロテアーゼ処理済み血清アルブミン、
0.01〜0.1%(w/v)のドデシル硫酸ナトリウム、及び
所望により、200mmosM/L以上の浸透圧を達成するためのβ−アルドース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、グルカン、デキストラン、及び/又は糖
を含む第1の水性試薬成分、並びに
S100A8及びS100A9のうちのいずれか一方又はカルプロテクチン(S100A8/A9)に結合する固定化モノクローナル抗体を担持する直径が150〜350nmであるラテックス粒子を0.01〜0.5%(w/v)の濃度で含む第2の試薬成分
を含む前記検査キット。
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