DE102020122593A1

DE102020122593A1 - Diagnostisches Reagenz zum Nachweis von SARS-CoV-2 Antikörpern

Info

Publication number: DE102020122593A1
Application number: DE102020122593.8A
Authority: DE
Inventors: Thomas Masetto; Matthias GRIMMLER; Christian Kochem; Leoni Wey
Original assignee: Diasys Diagnostic Systems GmbH
Current assignee: GRIMMLER, MATTHIAS, DE; KOCHEM, CHRISTIAN, DE; MASETTO, THOMAS, DE; WEY, LEONI, DE
Priority date: 2020-08-28
Filing date: 2020-08-28
Publication date: 2022-03-03
Also published as: WO2022043147A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Diagnostisches Reagenz zum Nachweis von SARS-CoV-2 Antikörpern in einer Probe sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Reagenz.

Description

GEGENSTAND DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Reagenz zum Nachweis von SARS-CoV-2 Antikörpern einer Probe sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Reagenz.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
SARS-CoV-2 ist ein Ende 2019 entdecktes Virus, das beim Menschen die Infektionskrankheit COVID-19 auslösen kann. COVID-19 zeichnet sich durch eine unspezifische Symptomatik, eine relativ lange Inkubationszeit und eine hohe Übertragbarkeit von Mensch zu Mensch bereits vor dem Auftreten von Krankheitssymptomen aus. In vielen Fällen entsteht im Verlauf der COVID-19 Erkrankung eine lebensgefährliche Pneumonie.
SARS-CoV-2 gehört zur Virusfamilie der Coronaviridae (Coronaviren). Hierbei handelt es sich um RNA-Viren mit einer Virushülle und einem Kapsid.
Charakteristisch für das Aussehen der Coronaviren sind über die Oberfläche der Virushülle hinausragende Strukturen (Spikes). Das Spike-Protein von SARS-CoV-2 umfasst eine Untereinheit (S1; Aminosäuren 13-685), in welcher die Rezeptor-Bindungs-Domäne (RBD; Aminosäuren 319-541) enthalten ist, mit der das Virus an eine Zelle andocken kann, sowie eine Untereinheit (S2; Aminosäuren 686-1273), die als Fusions-Protein die Verschmelzung von Virushülle und Zellmembran bewirkt. Ein weiteres Membranprotein auf der Außenseite der Virushülle von SARS-CoV-2 ist das Envelope-Protein (Envelope small membrane protein).
Das ebenfalls in der Virushülle verankerte Membranprotein ist nach innen gerichtet. Im Inneren der Virushülle befindet sich ein Kapsid, das einen helikalen Nukleoproteinkomplex enthält. Dieser besteht aus dem Nukleocapsidprotein.
Die zuverlässige Identifizierung mit SARS-CoV-2 infizierter Personen durch diagnostische Tests ist eine Grundvoraussetzung für die Feststellung des akuten Infektionsgeschehens und damit einhergehend der Herausarbeitung geeigneter Maßnahmen zur Eindämmung der SARS-CoV-2 Pandemie. Die Tests sind außerdem Grundlage für die adäquate Diagnose und Behandlung von Betroffenen, das Meldewesen, die Überwachung sowie für Screeningmaßnahmen.
Neben dem direkten Virusnachweis mittels Polymerase-Kettenreaktionstest (PCR) kann eine Infektion auch indirekt mit Hilfe der im Körper gebildeten spezifischen Antikörper gegen SARS-CoV-2 nachgewiesen werden. Diese immunologischen Tests bieten den Vorteil, dass auch überstandene Infektionen nachgewiesen werden können, d.h. eine Aussage zum spezifischen Antikörperstatus getroffen werden kann. Dies kann beispielsweise dazu dienen, die Impfeffizienz bzw. den Impfstatus einer Person zu überprüfen.
Für den Nachweis von SARS-CoV-2 Antikörpern sind bereits Verfahren bekannt, die auf einer enzymatischen Farbreaktion basieren. Bei diesen sogenannten „Enzyme-Iinked Immunosorbent Assays“ (ELISA) wird zunächst eine Mikrotiterplatte mit einem Antigen des Virus versehen. Nach Zugabe der Probe koppeln darin enthaltene Antikörper gegen SARS-CoV-2 an das Antigen.
Im Anschluss erfolgt die Zugabe von sekundären Antikörpern, die eine Spezifität für die gebundenen Antikörper haben und an die ein Enzym gekoppelt ist. Abschließend erfolgt die Zugabe eines Substrats für das Sekundärantikörper gekoppelte Enzym. Die Konzentration des bei der Umsetzung des Substrats entstehenden Farbstoffes ermöglicht den Rückschluss auf die ursprüngliche Konzentration des gesuchten Antikörpers in der untersuchten Lösung durch photometrische Methoden.
Allerdings erfordern entsprechende ELISAs einen hohen Abarbeitungsaufwand, d.h. viele Pipettier- und Waschschritte, sodass diese zeitlich aufwändig sind. Darüber hinaus erfordern Sie eine Vielzahl spezieller Instrumente, sodass die Durchführung von ELISAs nicht in jedem Analyselabor ohne weiteres möglich ist. Zudem ist die Assayentwicklung verhältnismäßig aufwändig und es besteht das Risiko einer begrenzten Antikörperreaktivität, da die Bindung des Enzyms an den Antikörper die räumliche Verfügbarkeit von Stellen auf dem Antikörper, die an das Antigen binden sollen, einschränken kann.
Bekannt sind auch sogenannte „Elektrochemilumineszenz-Immunoassays“ (ECLIA), wie beispielsweise das Immunoassay Elecsys® der Firma Hoffmann La Roche AG, Basel, bei dem ein rekombinantes Antigen des Nukleocapsid-(N-)Proteins zum Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern eingesetzt wird.
Das Messprinzip von ECLIAs beruht auf chemischen Verbindungen, welche leicht an einer Elektrode zu oxidieren und im Anschluss mittels zyklischer Voltammetrie zu reduzieren sind. Bei geeigneter Spannung ist die Reduktion exotherm genug, um die Verbindung in einen angeregten, Photonen emittierenden Zustand zu versetzen. Diese Emission wird photometrisch verfolgt. Durch die Antikörperbindung wird der enge Kontakt an die Elektrode unterbunden und somit eine Veränderung der Emission erzielt. Zumeist werden an den zu bestimmenden Immunkomplex Rutheniumkomplexe wie Ruthenium-(II)-tris(bipyridyl)²⁺ als Tracer gebunden.
Die ECLIA-Reagenzien sind meist aufwändig und teuer herzustellen. Im Übrigen weisen die in ECLIA und/oder ELISA Immunoassays verwendeten sensiblen Reagenzien oft nur eine begrenzte Stabilität auf.
Sowohl die ELISA- als auch die ECLIA-Methode erfordern methodenspezifisches Equipment sowie einen hohen Personalaufwand. Beides steht in vielen klinisch-chemischen Laboren entweder gar nicht, oder angesichts eines hohen Probenaufkommens in der Pandemie nur in unzureichendem Umfang zur Verfügung.
AUFGABE
Vor diesem Hintergrund bestand die Aufgabe der vorliegenden Erfindung daher darin, einen Antikörpertest für den Nachweis von SARS-CoV-2 Antikörpern in einer Probe bereitzustellen, der in großen Mengen kostengünstig und reproduzierbar hergestellt werden kann, der kein methodenspezifisches Equipment und nur einen geringen Arbeitsaufwand erfordert, eine hohe Stabilität des Reagenzes sowie eine hohe Spezifität aufweist und in praktisch allen klinisch-chemischen Laboren eingesetzt werden kann.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein diagnostisches Reagenz zum Nachweis von SARS-CoV-2 Antikörpern in einer Probe, wobei das Reagenz eine wässrige Suspension von oberflächenmodifizierten Polymerpartikeln mit mindestens einem kovalent an diese gebundenem Protein aufweist, wobei das mindestens eine kovalent gebundene Protein einen zu einem

a) immunogenen Protein von SARS-CoV-2 oder
b) einem Fragment eines immunogenen Proteins von SARS-CoV-2, das
- b₁) einen homologen Sequenzabschnitt der Region Binding Domain oder der N-Terminal Domain des Spike-Proteins mit einer Sequenzübereinstimmung ≥ 80 % aufweist und/oder
- b₂) das mindestens 50 % der Anzahl der Aminosäuren des entsprechenden immunogenen Proteins von SARS-CoV-2 aufweist,

Das hier beanspruchte diagnostische Reagenz ist zum Nachweis von SARS-CoV-2 Antikörpern mit einem photometrischen Detektionssystem geeignet. Vorzugsweise ist das diagnostische Reagenz zum Nachweis von SARS-CoV-2 Antikörpern nach dem PETIA-Verfahren geeignet.
Die Erfindung umfasst daher auch ein photometrisches Verfahren, vorzugsweise ein PETIA-Verfahren, zum Nachweis von SARS-CoV-2 Antikörpern unter Verwendung des erfindungsgemäßen diagnostischen Reagenzes.
Bei dem erfindungsgemäßen Assay handelt es sich um ein homogenes Assay, das zum Nachweis von SARS-CoV-2 mittels photometrischem Detektionssystem geeignet ist. Das erfindungsgemäße Assay kann daher im PETIA-Verfahren eingesetzt werden.
Beim „PETIA-Verfahren“ (Particle Enhanced Turbidimetric Immuno Assay) erfolgt eine turbidimetrische Auswertung über die Abnahme der Transmission von Licht durch die Reaktionsflüssigkeit. Je mehr Antikörper in einer Probe enthalten sind, desto stärker ist die zwischen den mit dem mindestens einen Protein besetzten Partikeln auftretende Agglutination, was zu einer stärkeren Trübung der Flüssigkeit und damit zu einer Abnahme der Transmission führt. Es ist also kein zusätzliches Enzym oder andere Hilfsmittel zur Detektion erforderlich, und die Messung kann mit einem einfachen Photometer-System, wie es in praktisch jedem diagnostischen Labor vorhanden ist, erfolgen. Andere heterogene Assay-Verfahren wie CLIA erfordern hingegen die Verwendung einer Vielzahl verschiedener Reagenzien und Aufarbeitungsschritte. Daher werden in diesen Verfahren üblicherweise Partikel einer Größe > 1000 nm eingesetzt, damit der Materialverlust bei den notwendigen mehrfachen Waschschritten gering ist.
Das hier beanspruchte diagnostische Reagenz dient zum Nachweis von SARS-CoV-2 Antikörpern. Dies umfasst sowohl den qualitativen als auch den quantitativen Nachweis, also zum einen den Nachweis, ob SARS-CoV-2-Antikörper in einer Probe enthalten sind und gegebenenfalls den Nachweis, wie hoch der Gesamtgehalt von SARS-CoV-2-Antikörpern in der Probe ist.
„Qualitativer Nachweis“ bedeutet in diesem Zusammenhang, dass über die Abnahme der Transmission bei Vermessung der Mischung aus diagnostischem Reagenz und Probe auf die Gegenwart von SARS-CoV-2 Antikörper-Molekülen, die an den Polymerpartikeln gebunden werden, geschlossen werden kann und hieraus Rückschlüsse auf die Gegenwart an SARS-CoV-2 spezifischem Antikörper in der Probe gezogen werden können.
„Quantitativer Nachweis“ bedeutet im Vergleich hierzu, dass über die Abnahme der Transmission auf die Menge an SARS-CoV-2 Antikörper-Molekülen, die an den Polymerpartikeln gebunden werden, geschlossen werden kann und hieraus Rückschlüsse auf die Menge an SARS-CoV-2 Antikörper in der Probe gezogen werden können. Besonders bevorzugt dient das erfindungsgemäße diagnostische Reagenz zum Nachweis des SARS-CoV-2 Gesamtantikörpergehalts einer Probe.
Unter einer „Probe“ wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung jedes für Zwecke der Analyse aufbereitete Material verstanden, das einen zu analysierenden Anteil an SARS-CoV-2 Antikörpern enthält oder enthalten könnte.
In den meisten Fällen wird es sich bei der Probe um eine Probe von frischem Vollblut handeln, das für Zwecke der Durchführung der Analyse gegebenenfalls entsprechend aufbereitet wurde. Von der vorliegenden Erfindung umfasst sind jedoch auch andere flüssige Proben, die SARS-CoV-2 Antikörper enthalten können, wie z.B. Standardlösungen und Kalibratoren.
Unter „immunogenen Proteinen von SARS-CoV-2“ werden im Sinne der Erfindung alle immunogenen viralen Proteine von SARS-CoV-2 verstanden, die in der Lage sind, eine Immunantwort im menschlichen Körper auszulösen.

Bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist das immunogene Protein von SARS-CoV-2 ausgewählt unter den in der folgenden Tabellen angegebenen Proteinen.

Name	Daten-	Alias	Zugang		Sequenz
	bank		Nummer	Version	Version
Replicase polyprotein 1a	UniProtKB	R1A_SARS2	P0DTC1	3 12.08.2020	1 22.04.2020
Spike-Protein	UniProtKB	SPlKE_SARS2	P0DTC2	3 12.08.2020	1 22.04.2020
Replicase polyprotein 1ab	UniProtKB	R1AB_SARS2	P0DTD1	3 12.08.2020	1 22.04.2020
ORF3a Protein	UniProtKB	AP3A_SARS2	P0DTC3	3 12.08.2020	1 22.04.2020
Membranprotein	UniProtKB	VME1_SARS2	P0DTC5	3 12.08.2020	1 22.04.2020
ORF7a Protein	UniProtKB	NS7A_SARS2	P0DTC7	3 12.08.2020	1 22.04.2020
Nucleocapsidprotein	UniProtKB	NCAP_SARS2	P0DTC9	3 12.08.2020	1 22.04.2020
Envelope small membrane protein	UniProtKB	VEMP_SARS2	P0DTC4	3 12.08.2020	1 22.04.2020
ORF6 Protein	UniProtKB	NS6_SARS2	P0DTC6	3 12.08.2020	1 22.04.2020
ORF9b Protein	UniProtKB	ORF9B_SARS2	P0DTD2	3 12.08.2020	1 22.04.2020
ORF8 Protein	UniProtKB	NS8_SARS2	P0DTC8	3 12.08.2020	1 22.04.2020
uncharacterized Protein 14	UniProtKB	Y14_SARS2	P0DTD3	3 12.08.2020	1 22.04.2020
ORF7b Protein	UniProtKB	NS7B_SARS2	P0DTD8	3 12.08.2020	1 22.04.2020
ORF10 protein (submitted name)	UniProtKB	A0A663DJA2_ SARS2	A0A663DJA2	3 12.08.2020	1 22.04.2020

Bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist das immunogene Protein ein virusspezifisches Strukturprotein, wobei unter virusspezifischen „Strukturproteinen“ hier virusspezifische Proteine mit Gerüstfunktion und/oder mit Andockfunktion verstanden werden. Im Sinne der Erfindung sind die virusspezifischen Strukturproteine bei SARS-CoV-2 das Spike-Protein, das Membran-Protein, das Envelope small membrane protein sowie das Nukleocapsidprotein.

Die Polymerpartikel liegen bei dem erfindungsgemäßen Reagenz in einer wässrigen Suspension vor. Der Begriff „wässrige Suspension“ bezeichnet in diesem Zusammenhang eine Aufschlämmung der mit dem Protein beladenen Polymerpartikel in Wasser bzw. einer wässrigen Lösung, in der vorzugsweise Zucker, Zuckeralkohol und/oder Puffersubstanzen gelöst sind. Der Begriff „Suspension“ ist im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eng auszulegen und bedeutet, dass nahezu alle Partikel in der wässrigen Phase schweben und nicht sedimentiert sind. Eine Suspension im Sinne der vorliegenden Erfindung liegt daher dann vor, wenn wenigstens 95 %, wenigstens 96 %, wenigstens 97 %, wenigstens 98 % oder gar wenigstens 99 % der Polymerpartikel frei und monomer schwebend vorliegen.
Die erfindungsgemäßen diagnostischen Reagenzien können sehr einfach auf allen üblichen chemischen Analyzerplattformen eingesetzt werden, da die Bestimmung der Reaktivität lediglich die Messung der Absorption erfordert. Sie können daher in nahezu allen Analysenlabors, auch den weniger gut ausgestatteten ohne instrumentellen Mehraufwand, eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Reagenzien zeichnen sich durch einen über die Laufzeit des Reagenzes nahezu konstanten Reagenzleerwert aus. Beides wird durch die hohe kolloidale Stabilität der Partikel bedingt. Die erfindungsgemäßen Reagenzien können daher über längere Zeit problemlos gelagert werden. Aufgrund des vergleichsweise einfachen Herstellverfahrens können die erfindungsgemäßen Reagenzien zudem sehr kostengünstig und schnell in großer Stückzahl hergestellt werden.
Weiterhin zeichnet sich das erfindungsgemäße diagnostische Reagenz durch eine hohe Lagerstabilität aus.
Die hohe Lagerstabilität drückt sich unter anderem darin aus, dass die Trübung der Suspension auch nach mehreren Monaten im Vergleich zum Ausgangswert stabil ist. Insbesondere zeichnet sich die Suspension der vorliegenden Erfindung dadurch aus, dass die Absorption der Suspension bei 660 nm innerhalb von 20, 30, 60 oder gar 90 Tagen ab dem Zeitpunkt der Herstellung der Suspension um weniger als 5 % vom Ausgangswert am Tag Null abweicht. Bei bestimmten Ausführungsformen beträgt die Abweichung sogar weniger als 3 % oder gar weniger als 2 %. Bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist die geringe Abweichung im Trübungsgrad innerhalb der vorgenannten Zeiträume auch bei anderen Wellenlängen im Bereich von 340 bis 800 nm messbar.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das immunogene Protein von SARS-CoV-2 oder dessen Fragment, zu dem das mindestens eine kovalent gebundene Protein einen homologen Sequenzabschnitt mit einer Sequenzübereinstimmung ≥ 80 % aufweist, das Nucleocapsidprotein, das Membran-Protein, oder das Spike-Protein, vorzugsweise das Spike-Protein. Da das Spike-Protein besonders charakteristisch für SARS-CoV-2 ist, d.h. hier eine hohe Abweichung in der Sequenzfolge im Vergleich zu anderen Coronaviren besteht, sind erfindungsgemäße diagnostische Reagenzien, die auf Wechselwirkungen mit diesem Protein oder mit einem Fragment dieses Proteins basieren, besonders spezifisch.
Die Sequenzübereinstimmung des mindestens einen kovalent gebundenen Proteins zu dem immunogenen Protein von SARS-CoV-2 oder dessen Fragment ist vorzugsweise ≥ 80 %, vorzugsweise ≥ 85 %, noch bevorzugter ≥ 90 %, noch stärker bevorzugt ≥ 95 und am bevorzugtesten ≥ 98 %.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das mindestens eine kovalent gebundene Protein einen zu einem immunogenen Protein von SARS-CoV-2 homologen Sequenzabschnitt mit einer Sequenzübereinstimmung ≥ 80 %, vorzugsweise ≥ 85 %, noch bevorzugter ≥ 90 %, noch stärker bevorzugt ≥ 95 und am bevorzugtesten ≥ 98 % auf. Besonders bevorzugt weist das mindestens eine kovalent gebundene Protein einen zu dem Spike-Protein homologen Sequenzabschnitt mit einer Sequenzübereinstimmung ≥ 80 %, vorzugsweise ≥ 85 %, noch bevorzugter ≥ 90 %, noch stärker bevorzugt ≥ 95 und am bevorzugtesten ≥ 98 % auf. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsführungsform weist das mindestens eine kovalent gebundene Protein einen zu dem Nucleocapsidprotein homologen Sequenzabschnitt mit einer Sequenzübereinstimmung ≥ 80 %, vorzugsweise ≥ 85 %, noch bevorzugter ≥ 90 %, noch stärker bevorzugt ≥ 95 und am bevorzugtesten ≥ 98 % auf.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stimmt das mindestens eine kovalent gebundene Protein in der Sequenzlänge mit dem immunogenen Protein von SARS-CoV-2 oder dem Fragment des immunogenen Proteins von SARS-CoV-2, zu dem es einen homologen Sequenzabschnitt aufweist, im Wesentlichen überein, wobei im Wesentlichen übereinstimmen bedeutet, dass die Differenz der Anzahl der Aminosäuren bezogen auf die Anzahl der Aminosäuren des Proteins mit der höheren Anzahl von Aminosäuren ≤ 20 %, vorzugsweise ≤ 15 %, noch bevorzugter ≤ 10 %, noch stärker bevorzugt ≤ 5 %, und am bevorzugtesten ≤ 2 %, ist.
Besonders bevorzugt ist die Sequenzübereinstimmung in diesem Fall ≥ 80 %, vorzugsweise ≥ 85 %, noch bevorzugter ≥ 90 %, noch stärker bevorzugt ≥ 95 und am bevorzugtesten ≥ 98 %. Durch eine geringe Abweichung in Länge und Homologie wird die Erkennung der Antikörper verbessert und dadurch die Sensitivität des erfindungsgemäßen diagnostischen Reagenz erhöht.
Besonders bevorzugt ist das mindestens eine kovalent gebundene Protein im Wesentlichen in der Sequenzlänge mit dem Spike-Protein übereinstimmend und weist einen zu diesem Protein homologen Sequenzabschnitt mit einer Sequenzübereinstimmung ≥ 80 %, vorzugsweise ≥ 85 %, noch bevorzugter ≥ 90 %, noch stärker bevorzugt ≥ 95 % und am bevorzugtesten ≥ 98 % auf. Besonders bevorzugt ist das mindestens eine kovalent gebundene Protein das Spike-Protein.
Besonders bevorzugt stimmt das mindestens eine kovalent gebundene Protein in der Sequenzlänge mit dem Nucleocapsidprotein im Wesentlichen überein und weist weiter bevorzugt einen zu diesem Protein homologen Sequenzabschnitt mit einer Sequenzübereinstimmung ≥ 80 %, vorzugsweise ≥ 85 %, noch bevorzugter ≥ 90 %, noch stärker bevorzugt ≥ 95 % und am bevorzugtesten ≥ 98 % auf. Besonders bevorzugt ist das mindestens eine kovalent gebundene Protein das Nucleocapsidprotein.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das mindestens eine kovalent gebundene Protein einen zu einem Fragment eines immunogenen Proteins von SARS-CoV-2 homologen Sequenzabschnitt mit einer Sequenzübereinstimmung ≥ 80 %, vorzugsweise ≥ 85 %, noch bevorzugter ≥ 90 %, noch stärker bevorzugt ≥ 95 % und am bevorzugtesten ≥ 98 % auf.
Das Fragment weist in einer bevorzugten Ausführung einen zur Region Binding Domain (RBD; Aminosäuren 319-541) oder der N-Terminal Domain (NTD; Aminosäuren 1-290) des Spike-Proteins homologen Sequenzabschnitt mit einer Sequenzübereinstimmung ≥ 80 %, vorzugsweise ≥ 85 %, noch bevorzugter ≥ 90 % und am bevorzugtesten ≥ 95 % auf. Diese beiden Abschnitte sind besonders charakteristisch für SARS-CoV-2 und erfindungsgemäße diagnostische Reagenzien, die auf Wechselwirkungen mit diesen Sequenzabschnitten basieren, sind daher besonders spezifisch.
In einer anderen bevorzugten Ausführung weist das Fragment eine Mindestlänge auf, nämlich mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 60 %, bevorzugter mindestens 70 %, noch bevorzugter mindestens 80 %, und am bevorzugtesten mindestens 90 % der Anzahl der Aminosäuren des entsprechenden Fragments des immunogenen Proteins von SARS-CoV-2.
Besonders bevorzugt weist das mindestens eine kovalent gebundene Protein eines der immunogenen Proteine von SARS-CoV-2, vorzugsweise eines dessen Strukturproteine auf oder besteht aus diesen, wobei das Spike-Protein hierbei besonders bevorzugt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist der oberflächenmodifizierte Polymerpartikel ≥ 2 , vorzugsweise ≥ 3, noch bevorzugter ≥ 4 und am bevorzugtesten ≥ 5 kovalent gebundene, unterschiedliche Proteine auf.
Grundsätzlich gilt, dass je höher die Homologie des mindestens einen kovalent gebundenen Proteins zu einem immunogenen Protein von SARS-CoV-2 oder dessen Fragment ist, desto höher ist die Spezifität. Dies bedeutet, dass durch eine hohe Homologie die Anzahl falsch positiver Testungen aufgrund des Vorhandenseins von Antikörpern für ähnliche Coronaviren reduziert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen die Polymerpartikel eine durchschnittliche Partikelgröße im Bereich von 50 bis 600 nm, vorzugsweise 100 bis 500 nm, noch bevorzugter 150 bis 500 nm, noch stärker bevorzugt 150 bis 450 nm, und am bevorzugtesten 200 bis 400 nm, auf.
Die durchschnittliche Partikelgröße der Polymerpartikel liegt erfindungsgemäß im Bereich von 100 bis 500 nm. Bei bestimmten Ausführungsformen innerhalb des beanspruchten Bereiches ist die durchschnittliche Partikelgröße vorzugsweise > 190 nm, > 240 nm oder gar > 300 nm. Bei weiteren Ausführungsformen innerhalb des beanspruchten Bereiches ist die durchschnittliche Partikelgröße vorzugsweise < 410 nm, < 360 nm oder gar < 300 nm.
Die Partikelgröße der Polymerpartikel wird im Falle der vorliegenden Erfindung anhand dynamischer Lichtstreuung bei 25°C bestimmt, z.B. mit dem Zetasizer Pro von Malvern. Die durchschnittliche Partikelgröße bezieht sich auf das Zahlenmittel. Besonders bevorzugt ist es auch, eine Mischung von Partikeln mit unterschiedlicher durchschnittlicher Partikelgröße einzusetzen, z.B. eine Mischung von Partikeln eines niedrigeren Durchmessers im Bereich von 150-200 nm und Partikeln eines höheren Durchmessers von 400 bis 500 nm.
Überraschenderweise konnte mit der vorliegenden Erfindung erreicht werden, dass trotz der für ein homogenes Assay hohen Partikelgröße eine bessere Lagerstabilität erzielt wird als zu erwarten gewesen wäre. Üblicherweise neigen größere Partikel stärker zur Sedimentation und sind somit nach längerer Lagerzeit schlechter zu resuspendieren. Insbesondere durch den Zusatz von Zucker bzw. Zuckeralkohol und die Einstellung eines basischen pH-Werts kann jedoch auch bei relativ großen Partikeln überraschenderweise eine äußerst lagerstabile Suspension bei gleichbleibender Reaktivität erhalten werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Suspension eine Konzentration von darin gelöstem Zucker oder Zuckeralkohol im Bereich von 25 bis 250 g/l auf. Bei bestimmten Ausführungsformen liegt die Konzentration an Zucker und/oder Zuckeralkohol im Bereich von 50 bis 200 g/l. Bei manchen Ausführungsformen beträgt die Konzentration 50 bis 150 g/l, bei anderen Ausführungsformen 150 bis 250 g/l.
Der Zucker oder Zuckeralkohol ist vorzugsweise ausgewählt unter Saccharose, Mannitol, Sorbitol, Xylitol, Maltitol, Raffinose, Rhamnose, Threalose und Kombinationen hiervon. Sofern eine Kombination von Zuckern/Zuckeralkoholen eingesetzt wird, beziehen sich die obigen Mengenangaben auf die Summe der Anteile der Zucker/Zuckeralkohole dieser Kombination. Durch die Zuckermoleküle wird eine Stabilisierung der Partikel erzielt.
Die Lagerstabilität des diagnostischen Reagenz kann noch durch weitere Zusätze erhöht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist das diagnostische Reagenz Detergenzien zur Stabilisierung auf, besonders bevorzugt sind hierbei nicht-ionische oder zwitteronische Detergenzien. Besonders bevorzugt sind tert-Octylphenylpolyoxyethylen (Triton-X-100) oder 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonium]-1-propansulfonat (CHAPS).
Dem diagnostischen Reagenz können weiterhin sogenannte „Blocker“ hinzugefügt werden, die unspezifische Interaktionen mit dem oberflächenmodifizierten Polymerpartikel und dem mindestens einen an diesen kovalent gebundenen Protein verhindern. Dies können beispielsweise Süßstoffe wie Acesulfam, Advantam, Aspartam sein. Auch die Zugabe eines Serums, das andere Coronaviren als SARS-CoV-2 aufweist, kann dazu dienen, die Sensitivität zu erhöhen, da hierdurch entsprechende Interaktionsstellen blockiert werden und der Reagenzleerwert entsprechend angepasst wird. Sofern zu einem solchen Reagenz erneut ein Coronavirenpositives Serum gegeben wird, ist daher keine Veränderung der Reaktivität mehr festzustellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das diagnostische Reagenz Proteaseinhibitoren, nämlich Serienproteaseinhibitoren und/oder Cysteinproteaseninhibitoren und/oder Metalloproteaseinhibitoren und/oder Asparatproteaseninhibitoren, auf.
Vorteilhaft kann auch die Zugabe chaotroper Verbindungen sein, d.h. chemischer Substanzen, die die Ordnung der Wasserstoffbrückenbindungen im Wasser stören. Besonders bevorzugt sind hier KSCN, KCl, Harnstoff, Guanidinium-HCl, (NH4)₂SO₄ oder CaCl₂.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthält das diagnostische Reagenz hingegen kosmotrope Salze wie Na₂SO₄. Durch kosmotrope Salze wird die Reaktivität des diagnostischen Reagenz erhöht.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Zusammensetzung eine Thiolkomponente auf, die vorzugsweise ausgewählt ist unter DTT (Di-Thio-Treitol), beta-Mercaptoethanol, Thiobernsteinsäure, Aminosäuren wie Prolin, Arginin oder Leucin, oder Mischungen der vorgenannten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist das diagnostische Reagenz einen pH-Wert im Bereich von 8 bis 10 auf. Bei bestimmten Ausführungsformen liegt der pH-Wert des diagnostischen Reagenz bei 9,0 ± 0,5. Der pH-Wert des diagnostischen Reagenz wirdvorzugsweise durch Zugabe eines Puffers zu den Partikeln, wie z.B. eines Puffers ausgewählt aus EPPS, HEPPS, Tricin, Tris, Glycylglycin, Bicin, TAPS, Borsäure, Ethanolamin, CHES, Glycin und CAPS, eingestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Polymer des Polymerpartikels ausgewählt unter (Meth)Acrylatpolymer, Dextran-Epichlorhydrin-Copolymer, Polystyrol, Melaminharz und Silica. Besonders bevorzugt ist Polystyrol, da dieses eine geringe Eigenabsorption aufweist und für dieses eine Vielzahl von verschiedenen Oberflächenfunktionalisierungen auf dem Markt verfügbar ist. Bei bestimmten Ausführungsformen bestehen die Polymerpartikel durchgehend aus einem Polymermaterial oder Gemischen hiervon. Bei anderen Ausführungsformen bestehen die Partikel aus mehreren Schichten unterschiedlicher Polymere.
Bei speziellen Ausführungsformen können die Partikel einen Kern aufweisen und eine oder mehrere auf diesen Kern aufgeschichtete Schichten. Der Kern und eine oder mehrere darauf aufgeschichtete Schichten können aus einem Polymermaterial, verschiedenen Polymermaterialien oder einem nicht-polymerischen Material bestehen, vorausgesetzt, dass die Polymerpartikel überwiegend aus Polymermaterial bestehen.
Ein Polymerpartikel im Sinne der vorliegenden Erfindung liegt dann vor, wenn die Partikel zu wenigstens 80 Gew.-%, wenigstens 90 Gew.-%, wenigstens 95 Gew.-% oder zu 100 Gew.-% aus einem Polymermaterial oder aus einer Kombination verschiedener Polymermaterialien bestehen.
Die Dichte des Polymerpartikels liegt insgesamt vorzugsweise im Bereich von 0,9 bis 1,1 g/cm³ und besonders bevorzugt im Bereich von 1,0 ± 0,5 g/cm³.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die kovalente Bindung des Proteins durch direkte Verknüpfung des Proteins mit den funktionellen Oberflächengruppen der oberflächenfunktionalisierten Polymerpartikel ausgebildet, wobei die funktionellen Gruppen vorzugsweise ausgewählt sind unter einer Carboxylgruppe (-COOH), primären Amingruppe (-RNH2), aromatischen Amingruppe (-ArNH2), Chlormethylgruppe (-CH2CI), einer aromatischen Chlormethylgruppe (-ArCH2CI), Amidgruppe (-CONH2), Hydrazidgruppe (-CONHNH2), Aldehydgruppe (-CHO), Hydroxylgruppe (-OH), Thiolgruppe (-SH), Epoxygruppe und Biotin-Avidin.
Direkte Verknüpfung im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass das mindestens eine kovalent gebundene Protein direkt an die Oberflächengruppe des Polymerpartikels gebunden ist, d.h. dass kein Linker zwischen der Oberflächengruppe des Partikels und dem mindestens einen kovalent gebundenen Protein vorhanden ist.
Mit dem Verzicht auf einen solchen Linker kann die Herstellung diagnostischer Reagenzien deutlich vereinfacht werden und es werden auf schnelle und kostengünstige Weise partikelverstärke Assays erhalten.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist zwischen dem mindestens einen kovalent gebundenen Protein und der Oberflächengruppe des Polymerpartikels mindestens ein Linker angeordnet. Der Linker ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lysin, Silan und Glykol.
Durch die Verwendung eines Linkers kann eine höhere Dynamik und/oder Bewegungsfähigkeit des gebundenen Proteins erreicht werden. Darüber hinaus kann durch den Linker auch eine Verzweigung und damit eine Multiplikation der Bindung erzielt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das mindestens eine an die Polymerpartikel kovalent gebundene Protein ein rekombinantes Protein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist das mindestens eine an die Polymerpartikel kovalent gebundene Protein einen Protein-Tag, vorzugsweise ein His-Tag, einen GST-Tag oder mFc-Tag, auf. Tags können dazu dienen, Nachweismethoden zu unterstützen, die zusätzlich oder alternativ zur Absorptionsspektrometrie verwendet werden können (z.B. Fluoreszenzmarkierung mit GFP- oder Flash-Tag), sie können aber auch weitere Funktionen erfüllen, wie beispielsweise eine bestimmte Reaktivität in das Protein einführen (z.B. GST-Tag).
Das erfindungsgemäße diagnostische Reagenz kann weiterhin Teil eines Satzes von Chemikalien sein, der als weitere Komponente einen Reaktionspuffer aufweisen kann. In diesem Reaktionspuffer können Substanzen enthalten sein, die beispielsweise die Reaktivität beeinflussen, aber nicht zusammen mit der Suspension der Partikel gelagert werden sollen, da diese die Lagerfähigkeit der Partikel beeinflussen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines diagnostischen Reagenz, umfassend nachfolgende Schritte:

A) Zurverfügungstellung von
1. a) oberflächenfunktionalisierten Polymerpartikeln, vorzugsweise in Form einer wässrigen Suspension, und
2. b) einer Lösung oder Suspension mindestens eines Proteins, das eine zu einem immunogenen Protein von SARS-CoV-2 oder einem Fragment eines immunogenen Proteins von SARS-CoV-2 homologe Sequenz mit einer Sequenzübereinstimmung ≥ 80%, vorzugsweise ≥ 90%, aufweist, wobei das Fragment einen zur Region Binding Domain oder der N-Terminal Domain des Spike-Proteins homologen Sequenzabschnitt mit einer Sequenzübereinstimmung ≥ 80 % aufweist und/oder mindestens 50 % der Anzahl der Aminosäuren des entsprechenden immunogenen Proteins von SARS-CoV-2 aufweist,
B) Vermischen der Komponenten a) und b), um eine Suspension zu erhalten,
C) Reagieren der Suspension aus Schritt B) bei einem pH-Wert im Bereich von 3 bis 8 vorzugsweise im Bereich von 5 bis 7, um das Protein kovalent an die Polymerpartikel zu binden.

Bei bestimmten Ausführungen kann es notwendig sein, dass die Oberflächengruppen des oberflächenmodifzierten Partikels zunächst aktiviert werden müssen, damit diese eine für die Reaktion mit dem mindestens einen Protein, das kovalent gebunden werden soll, ausreichende Reaktivität aufweisen. Da Carbonsäure und Amine aufgrund des konkurrierenden Säure/Base-Protonenaustauschs nur eine geringe Umsetzungsrate aufweisen, wird eine Säuregruppe beispielsweise in eine aktivierte, d.h. elektrophile Form, wie z.B. das Acylchlorid, Anhydrid oder einen Aktivester, umgewandelt. Zur Bildung eines Aktivesters können Carbodiimide oder Hydroxy-benzo-triazol Aminium/Uronium oder Phosphoniumsalze genutzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt das Reagieren der oberflächenfunktionalisierten Polymerpartikel mit dem mindestens einen Protein in Schritt C) bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 29°C, im Bereich von 30 bis 34°C oder im Bereich von 35 bis 45°C, bevorzugt ist eine Reaktion im Bereich zwischen 30 bis 45°C.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt das Reagieren der oberflächenfunktionalisierten Polymerpartikel mit dem mindestens einen Protein in einem definierten pH-Bereich und bei einer definierten Temperatur über einen Zeitraum von 20 bis 100 Stunden. Bei bestimmten Ausführungsformen erfolgt die Reaktion über einen Zeitraum von > 30, > 40, > 50 oder gar > 60 Stunden.
Vorzugsweise erfolgt die kovalente Bindung des mindestens einen Proteins über die funktionellen Gruppen an der Oberfläche der Polymerpartikel bei einem pH-Wert von 3 bis 6. Bei bestimmten Ausführungsformen erfolgt die kovalente Bindung bei einem pH-Wert von 3 bis 5 oder 5 bis 7. Bei bestimmten Ausführungsformen liegt der pH-Wert bei der Reaktion, die zur kovalenten Bindung der Antikörper über die funktionellen Gruppen an der Oberfläche der Polymerpartikel führt, bei 4,0 ± 0,5.
Die Einstellung des pH-Werts bei der Reaktion, die zur kovalenten Bindung des mindestens einen Proteins über die funktionellen Gruppen an der Oberfläche der Polymerpartikel führt, erfolgt vorzugsweise unter Verwendung von anorganischen oder organischen Puffersubstanzen, wie z.B. Borat, Citrat, Phosphat, Malat, Maleat, Succinat, Essigsäure/Acetat. Zum Einstellen/Justieren des pH-Werts wird vorzugsweise Salzsäure /Natronlauge verwendet.
Nach Ablauf der oben angegebenen Zeiträume wird der pH-Wert der Suspension der nun mit dem mindestens einen Protein beladenen oberflächenfunktionalisierten Polymerpartikel auf den Bereich von 8 bis 10 erhöht. Hierfür kann eines oder mehrere der oben angegebenen Alkalisierungsmittel bzw. Puffersubstanzen zugegeben werden.
Die Einstellung des pH-Werts in der Suspension erfolgt vorzugsweise unter Verwendung von Puffersubstanzen mit Amingruppen, wie z.B. EPPS, HEPPS, Tricin, Tris, Glycylglycin, Bicin, TAPS, Borsäure, Ethanolamin, CHES, Glycin und CAPS. Zum Einstellen/Justieren des pH-Werts wird vorzugsweise Salzsäure /Natronlauge verwendet.
Die Erfindung betrifft auch ein diagnostisches Reagenz, das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist.
BEISPIELE
Die Erfindung wird nun anhand von konkreten Ausführungsformen von erfindungsgemäßen diagnostischen Reagenzien und anhand der angefügten Figuren weiter erläutert.
Ausführungsbeispiele
1. Herstellung erfindungsgemäßer diagnostischer Reagenzien
Im Folgenden werden verschiedene Versuche präsentiert, bei denen Partikel für erfindungsgemäße diagnostische Reagenzien hergestellt wurden.
Hierfür wurde mindestens ein Protein gemäß Anspruch 1 an mindestens einen Polymerpartikel aus Polystyrol unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens kovalent gebunden. Die erfolgreich an die Partikel gekoppelten Proteine sind Tabelle 1 zu entnehmen. Die entsprechenden Proteine wurden z.B. von den Herstellern Biozol, Sino Biological, Shanxi Kangjianen Biotechnology, Eurofins Genomic, Sekbio, Hytest, Invivo oder Icosagen erhalten.
1.1. Herstellung erfindungsgemäßer diagnostischer Reagenzien aus Carboxyl-modifizierten Polystyrolpartikeln

Zur Kopplung wurden Carboxyl-modifzierte Polystyrolpartikel in wässriger Suspension (Konzentration 2-20 mg/ml) mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von -250 nm zunächst durch Zentrifugation und Resuspendierung in 0,05 M 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure Puffer mit pH-Wert 5-7 (im Folgenden „MES Puffer“) mehrfach gewaschen. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt wurde das Zentrifugat in 0,05 M MES Puffer resuspendiert (Konzentration 2-20 mg/ml) und Carbodiimid (Zielkonzentration 24 mg/ml) zugegeben. Nach 1 h Inkubationszeit bei Raumtemperatur wurden die Partikel erneut mit 0,05 M MES Puffer gewaschen und abschließend in 0,05 M MES Puffer resuspendiert. Zu dieser Suspension wurden die in Tabelle 1 aufgelisteten Proteine/Proteinfragmente bei 25-40°C zugegeben (Zielkonzentration 20-120 mg/ml). Der Fortschritt der Reaktion wurde durch Zentrifugation und Analyse des Überstands mittels eines Western Blot, SDS-Page kontrolliert. Sofern der Überstand noch Protein/Proteinfragmente aufwies, wurde die Reaktion fortgeführt. Die Partikel mit daran gekoppelten Proteinen wurden nach Beendigung der Reaktion zentrifugiert und in 0,025 M Glycinpuffer (pH 5-7) mit 0,5-1 Gew-% Tensid (Tween-20, Thermo Fisher) resuspendiert und nochmals abschließend für 1 h inkubiert. Die fertigen Partikel wurden dann zentrifugiert und in einem geeigneten Puffer (z.B: Glycin- oder 2-Ethansulfonsäurepuffer) suspendiert (Ziel-pH 6-10), um eine Zielkonzentration des Partikels im diagnostischen Reagenz von 0,5-20 mg/ml zu erreichen. Die Lagerung der Partikel erfolgte bei 2-8 °C. Tabelle 1: Übersicht der an Polystyrolpartikel gekoppelten Proteine

#	Name	Zelllinie	PI (theoretisch)	Mol. Masse [kDa]	Aufreinigung	Tag
1	RP-N(Rekombinantes Nucleocapsid-Protein)	E. coli	10,11	49	Ni(Ni-sepharosepurification)	His
2	RP-N(Rekombinantes Nucleocapsid-Protein)	E. coli	7,38	99	IE(Ion exchange column)	GST
3	RP-N(Rekombinantes Nucleocapsid-Protein)	E. coli	5,78	62	IE(Ion exchange column)	A acid Tag
4	RP-N(Rekombinantes Nucleocapsid-Protein)	E. coli	10,11	49	Ni(Ni-sepharosepurification)+IE(Ion exchange column)	His
5	RP-S (RBD)(Rekombinantes Spike-Protein (RBD))	HEK293 Cells	7,91	51,5	Ni(Ni-sepharosepurification)	mFc
6	RP-S (RBD)(Rekombinantes Spike-Protein (RBD))	HEK293 Cells	8,51	75	Ni(Ni-sepharosepurification)	mFc tag at C-terminus
7	RP-S (RBD)(Rekombinantes Spike-Protein (RBD))	HEK293 Cells	8,47	31,4	Ni(Ni-sepharosepurification)	6 His Tag at C-terminus
8	N(Nucleocapsidprotein)	CHO Cells	10,11	ca. 50	Ni(Ni-sepharosepurification)	His-Tag
9	Protein S1 RBD (331-524)	CHO Cells	8,91 (Expasy)	ca. 33	Ni(Ni-sepharosepurification)5	His-Tag
10	Protein S1 RBD2 (319-541)	CHO Cells		ca. 35	Ni(Ni-sepharosepurification)	His-Tag
11	Protein Spike S1	CHO Cells	8,24 (Expasy)	ca. 130	Ni(Ni-sepharosepurification)	His-Tag
12	S1(S1-Receptor Binding Domain (319-541))	HEK		26 (glycos. forms 44-55)	Ni(Ni-sepharosepurification)+ SEC	His-Tag at C-term
13	S1(S1-Receptor Binding Domain (319-541))	CHO		26	Ni(Ni-sepharosepurification)+ SEC	His-Tag at C-term
14	RP-S (RBD)(Rekombinantes Spike-Protein (RBD))	Mammalian Cell Line	8,91	25,921	Ni(Ni-sepharosepurification)	His-Tag

1.2 Herstellung erfindungsgemäßer diagnostischer Reagenzien aus Chloromethyl-modifizierten Polystyrolpartikeln
Zur Kopplung wurden Chloromethyl-modifzierte Polystyrolpartikel (Konzentration 2-20 mg/ml) mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von -250 nm zunächst durch Zentrifugation und Resuspendierung in 0,05 M 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure Puffer mit pH-Wert 6-8 (im Folgenden „MES Puffer“) mehrfach gewaschen. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt wurde das Zentrifugat in 0,05 M MES Puffer resuspendiert (Konzentration 2-20 mg/ml). Zu dieser Suspension wurden die in Tabelle 1 aufgelisteten Proteine/Proteinfragmente bei 23 °C zugegeben (Zielkonzentration 20-120 mg/ml). Der Fortschritt der Reaktion wurde durch Zentrifugation und Analyse des Überstands mittels eines Western Blot, SDS-Page kontrolliert. Sofern der Überstand noch Protein/Proteinfragmente aufwies, wurde die Reaktion fortgeführt. Die Partikel mit daran gekoppelten Proteinen wurden nach Beendigung der Reaktion zentrifugiert und in 0,025 M Glycinpuffer (pH 5-7) mit 0,5-1 Gew-% Tensid (Tween-20, Thermo Fisher), resuspendiert und nochmals abschließend für 1 h inkubiert. Die fertigen Partikel wurden dann zentrifugiert und in einem geeigneten Puffer (z.B: Glycin- oder 2-Ethansulfonsäurepuffer) suspendiert (Ziel-pH 6-10), um eine Zielkonzentration des Partikels im diagnostischen Reagenz von 0,5-20 mg/ml zu erreichen. Die Lagerung der Partikel erfolgte bei 2-8 °C.
2. Bestimmung der Reaktivität - Nachweis von SARS-CoV-2 Antikörpern
Die unter 1 hergestellten diagnostischen Reagenzien wurden in der Folge zum Nachweis von SARS-CoV-2 Antikörpern eingesetzt. Hierzu wurde als Probe ein Serum eines mit SARS-CoV-2 infizierten Patienten und als Kontrollversuch das Serum eines nicht mit SARS-CoV-2 infizierten Patienten genutzt. Ein Beispiel für eine Kalibrationskurve ist 1 zu entnehmen.

Zur Bestimmung der Reaktivität wurden 90 µl eines Reaktionspuffers mit 30 µl einer der in Tabelle 1 gelisteten Reagenzien und 10 µl der Probe vermischt und mit einem BioMajesty® 6010 (Jeol®, Japan) die Absorption bei 658 nm bestimmt. Der in Tabelle 2 angegebene Wert für die Absorption (Abs 0 h bzw. Abs 96 h) gibt die Differenz der Absorption zwischen der Probe des SARS-CoV-2 infizierten Patienten und dem Kontrollversuch an. Wie der Tabelle zu entnehmen ist, ist die Reaktivität der erfindungsgemäßen diagnostischen Reagenzien auch noch nach 96 h nahezu unverändert gegeben. Tabelle 2: Übersicht der Reaktivitäten erfindungsgemäßer diagnostischer Reagenzien

#	Reagenz	Abs 0 h [mili abs]	Abs 96 h [mili abs]	Δ [%]
1	#1	184,12	184,54	+0,2
2	#2	94,95	100,26	+6,6
3	#3	31,94	30,46	-4,6
4	#4	191,38	194,38	+1,6
5	#5	153,31
6	#7	99,55	106,87	+7,4

Auch die Veränderung des Reagenzleerwertes, d.h. die Eigenfarbe des Reagenziengemisches der Kontrollversuche, wurde über die Zeit analysiert. Sofern die Partikel eines diagnostischen Reagenz über die Zeit agglutinieren, verstärkt sich die Absorption der Reagenzien und die Partikel können nicht mehr für einen zuverlässigen Nachweis genutzt werden. Wie nachfolgender Tabelle zu entnehmen ist, weisen die erfindungsgemäßen Reagenzien einen über die Zeit nahezu konstanten Reagenzleerwert auf, d.h. die erfindungsgemäßen diagnostischen Reagenzien sind kolloidal stabil und ohne Probleme über längere Zeit einsetzbar. Tabelle 3: Übersicht der Reagenzleerwerte erfindungsgemäßer diagnostischer Reagenzien

#	Reagenz Nr. 1	Abs 0 h [mili abs]	Abs 96 h [mili abs]	Δ [%]
1	#1	512,01	518,09	+1,2%
2	#2	516,35	519,30	+0,6%
3	#3	501,97	501,63	-0,1%
4	#4	480,40	489,10	+1,8%
5	#5	1131,88
6	#7	1048,09	1046,3	-0,20%

3. Verwendung von Partikeln mit unterschiedlichem Partikeldurchmesser

Erfindungsgemäße Reagenzien wurden nach dem oben ausgeführten Protokoll hergestellt, wobei das Protein S - RBD, HP811-60, mit Carboxyl-modifizierten Polystyrol-Latizes eines mittleren Durchmessers von 95 nm, 258 nm und 351 nm gekoppelt wurde. Die Reaktivität wurde wie in obigem Beispiel bestimmt. Allerdings wurde die Absorption bei verschiedenen Wellenlängen gemessen. Die Ergebnisse sind nachfolgender Tabelle zu entnehmen. Es wird deutlich, dass ohne weiteres verschiedene Wellenlängen zur Bestimmung der Reaktivität genutzt werden können. Tabelle 4: Proben mit unterschiedlichen mittleren Partikeldurchmessern

#	Ø Durchmesser	571 nm [mili abs]	596 [mili abs]	658 [mili abs]	694 [mili abs]	751 [mili abs]
1	351	15,36	15,98	14,31	13,30	11,84
2	258	11,40	10,96	8,98	8,03	6,55
3	195	6,12	6,25	5,34	4,88	4,30

4. Bestimmung der Langzeitstabilität
Zur Bestimmung der Langzeitstabilität wurde die Reaktivität sowie der Reagenzleerwert des diagnostisches Reagenz gemäß Tabelle 1, Eintraq #7 über einen Zeitraum > 25 Tage bestimmt. Wie den 2 und 3 zu entnehmen ist, sind sowohl die Reaktivität als auch der Reagenzleerwert nahezu konstant.
5. Vergleich mit Elektrochemilumineszenz-Immunoassav

Zum Vergleich der erfindungsgemäßen diagnostischen Reagenzien mit bekannten Elektrochemilumineszenz-Immunoassays („ECLIA“) wurden 30 mit dem von Hoffmann La-Roche AG, Basel, entwickelten ECLIA Assay Elecsys als positiv getesteten Proben mit erfindungsgemäßen diagnostischen Reagenzien versetzt und die Reaktivität bestimmt. Beim Elecsys Assay wird ein rekombinantes Antigen des Nukleocapsid-Proteins zum Nachweis von SARS-CoV-2 Antikörpern eingesetzt. Nachfolgende Tabelle zeigt den Vergleich der Diagnoseergebnisse.

Probe #	Referenztest [Cut-Off =1]	Diagnose Referenztest	Erfindung [Cut-Off = 2]	Diagnose Erfindung
Ds001	43,30	Positiv	33,25	Positiv
Ds002	58,40	Positiv	28,17	Positiv
Ds003	67,10	Positiv	23,24	Positiv
Ds004	42,20	Positiv	31,73	Positiv
Ds005	< 1	Negativ	< 2	Negativ
Ds009	13,90	Positiv	25,24	Positiv
Ds010	110,00	Positiv	29,29	Positiv
Ds011	6,22	Positiv	3,35	Positiv
Ds012	8,55	Positiv	2,01	Positiv
Ds013	89,10	Positiv	30,7	Positiv
Ds014	101,00	Positiv	10,29	Positiv
Ds015	8,60	Positiv	2,26	Positiv
Ds016	81,90	Positiv	33,75	Positiv
Ds017	18,60	Positiv	19,83	Positiv
Ds018	15,00	Positiv	13,47	Positiv
Ds019	97,90	Positiv	35,34	Positiv
Ds020	30,90	Positiv	31,19	Positiv
Ds021	97,80	Positiv	29,87	Positiv
Ds022	103,00	Positiv	31,4	Positiv
Ds023	111,00	Positiv	25,43	Positiv
Ds024	109,00	Positiv	30,33	Positiv
Ds026	32,90	Positiv	28,86	Positiv
Ds027	2,41	Positiv	19,63	Positiv
Ds028	84,70	Positiv	7,9	Positiv
Ds029	98,10	Positiv	5,34	Positiv
Ds030	< 1	Negativ	< 2	Negativ
Ds036	50,80	Positiv	25,08	Positiv
Ds037	44,90	Positiv	26,47	Positiv
Ds038	84,10	Positiv	31,2	Positiv
Ds039	57,90	Positiv	32,59	Positiv
Ds040	49,10	Positiv	5,65	Positiv
Ds041	60,30	Positiv	29,65	Positiv
Ds042	24,80	Positiv	21,35	Positiv
Ds043	81,00	Positiv	29,18	Positiv
Ds044	83,80	Positiv	31,67	Positiv
Ds046	89,70	Positiv	31,27	Positiv
Ds112	< 1	Negativ	< 2	Negativ
Ds152	36,36	Positiv	32,55	Positiv
Ds157	13,52	Positiv	26,2	Positiv
DS166	46,01	Positiv	9,12	Positiv
Ds168	12,85	Positiv	6,53	Positiv
Ds169	< 1	Negativ	< 2	Negativ
Ds170	< 1	Negativ	< 2	Negativ
Ds171	132,70	Positiv	28,66	Positiv
Ds174	123,80	Positiv	32,45	Positiv
Ds175	123,20	Positiv	23,2	Positiv
Ds176	134,70	Positiv	28,41	Positiv
PCT26	Vor COVID-19 gesammelt		< 2	Negativ
PCT28	Vor COVID-19 gesammelt		< 2	Negativ
PCT29	Vor COVID-19 gesammelt		< 2	Negativ
PCT52	Vor COVID-19 gesammelt		< 2	Negativ
PCT53	Vor COVID-19 gesammelt		< 2	Negativ
PCT56	Vor COVID-19 gesammelt		< 2	Negativ
PCT65	Vor COVID-19 gesammelt		< 2	Negativ
PCT77	Vor COVID-19 gesammelt		< 2	Negativ
PCT87	Vor COVID-19 gesammelt		< 2	Negativ
PCT91	Vor COVID-19 gesammelt		< 2	Negativ
PCT107	Vor COVID-19 gesammelt		< 2	Negativ
PCT108	Vor COVID-19 gesammelt		< 2	Negativ
PCT146	Vor COVID-19 gesammelt		< 2	Negativ
PCT155	Vor COVID-19 gesammelt		< 2	Negativ
PCT159	Vor COVID-19 gesammelt		< 2	Negativ
PCT161	Vor COVID-19 gesammelt		< 2	Negativ
PCT162	Vor COVID-19 gesammelt		< 2	Negativ
PCT163	Vor COVID-19 gesammelt		< 2	Negativ
PCT164	Vor COVID-19 gesammelt		< 2	Negativ
PCT169	Vor COVID-19 gesammelt		< 2	Negativ

True Positives (TP) = 42	False Positives (FP) = 0
Falls Negatives (FN) = 0	True Negatives (TN) = 25

Für die True Positive Rate (TPR, Sensitivität) ergibt sich hieraus: $TP/TP + FN \times 100 = 42 / 43 \times 100 = 100,0 %$
Für die False Positive Rate (FPR) und die Spezifität ergibt sich hieraus: $FP/FP + TN \times 100 = 0 / 5 = 0 % (Spezifit \ddot{a} t = 100 - FPR = 100 %)$
6. Verdünnung einer erfindungsgemäßen Probe
Eine Probe DS018 wurde jeweils im Verhältnis 1:2, 1:4, 1:8 und 1:16 verdünnt und der durch Bestimmung der Absorption und Vergleich mit der Kalibrationskurve erhaltene Wert für die Konzentration von SARS-CoV-2 Antikörpern mit dem Sollwert abgeglichen. Die in 4 dargestellte Korrelation zeigt das lineare Verhalten bei Verdünnung.
7. Bestimmung der Messgenauigkeit

Hierzu wurde die Konzentration der SARS-CoV-2 Antikörper für die Probe DS011, 20-mal hintereinander bestimmt. Die Ergebnisse sind nachfolgender Tabelle zu entnehmen. Der Variationskoeffizient [VK %] war 3,79 %.

Messung	Konzentration SARS-CoV-2 Antikörper mit dem erfindunisemäßen Reanenz [Col]
1	3,23
2	3,35
3	3,36
4	3,12

5	3,30
6	3,31
7	3,27
8	3,33
9	3,27
10	3,37
11	3,39
12	3,26
13	3,24
14	3,3
15	3,3
16	3,3
17	3,51
18	3,05
19	3,4
20	2,93
Mittelwert	3,2795
Std. Abweichung	0,12
VK [%]	3,79

Claims

Diagnostisches Reagenz zum Nachweis von SARS-CoV-2 Antikörpern in einer Probe, wobei das Reagenz eine wässrige Suspension von oberflächenmodifizierten Polymerpartikeln mit mindestens einem kovalent an diese gebundenen Protein aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine kovalent gebundene Protein einen zu einem a) immunogenen Protein von SARS-CoV-2 oder b) einem Fragment eines immunogenen Proteins von SARS-CoV-2, das b₁) einen zur Region Binding Domain oder der N-Terminal Domain des Spike-Proteins homologen Sequenzabschnitt mit einer Sequenzübereinstimmung ≥ 80 % aufweist und/oder b₂) das mindestens 50 % der Anzahl der Aminosäuren des entsprechenden immunogenen Proteins von SARS-CoV-2 aufweist, homologen Sequenzabschnitt mit einer Sequenzübereinstimmung ≥ 80 % aufweist.
Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 1, wobei das immunogene Protein von SARS-CoV-2 ein Strukturprotein ist, vorzugsweise das Nucleocapsidprotein oder das Spike-Protein, vorzugsweise das Spike-Protein.
Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 1, wobei das Fragment eines immunogenen Proteins von SARS-CoV-2 die S₁-Subunit des Spike-Proteins oder die Region Binding Domain der S₁-Subunit oder die N-Terminal Domain des Spike-Proteins ist.
Diagnostisches Reagenz nach einem der vorausgehenden Ansprüche, wobei die Polymerpartikel eine durchschnittliche Partikelgröße im Bereich von 100 bis 500 nm, vorzugsweise 150 bis 400nm, aufweisen.
Diagnostisches Reagenz nach einem der vorausgehenden Ansprüche, wobei die Suspension einen pH-Wert im Bereich von 8 bis 10 aufweist.
Diagnostisches Reagenz nach einem der vorausgehenden Ansprüche, wobei das Polymer der Polymerpartikel ausgewählt ist unter (Meth)Acrylatpolymer, Dextran-Epichlorhydrin-Copolymer, Polystyrol, Melaminharz und Silica.
Diagnostisches Reagenz nach einem der vorausgehenden Ansprüche, wobei die kovalente Bindung des Proteins durch direkte Verknüpfung des Proteins mit den funktionellen Oberflächengruppen der oberflächenfunktionalisierten Polymerpartikel ausgebildet ist und wobei die funktionellen Gruppen ausgewählt sind unter einer Carboxylgruppe (-COOH), primären Amingruppe (-RNH2), aromatischen Amingruppe (-ArNH2), Chlormethylgruppe (-CH2CI), einer aromatischen Chlormethylgruppe (-ArCH2CI), Amidgruppe (-CONH2), Hydrazidgruppe (-CONHNH2), Aldehydgruppe (-CHO), Hydroxylgruppe (-OH), Thiolgruppe (-SH), Epoxygruppe und Biotin-Avidin.
Diagnostisches Reagenz nach einem der vorausgehenden Ansprüche, wobei das mindestens eine an die Polymerpartikel kovalent gebundene Protein ein rekombinantes Protein ist.
Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 8, wobei das mindestens eine an die Polymerpartikel kovalent gebundene Protein einen Protein-Tag aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines diagnostischen Reagenz nach einem der vorausgehenden Ansprüche, umfassend nachfolgende Schritte: A) Zurverfügungstellung von a) oberflächenfunktionalisierten Polymerpartikeln, vorzugsweise in Form einer wässrigen Suspension, und b) einer Lösung oder Suspension mindestens eines Proteins, das eine zu einem immunogenen Protein von SARS-CoV-2 oder einem Fragment eines immunogenen Proteins von SARS-CoV-2 homologe Sequenz mit einer Sequenzübereinstimmung ≥ 80%, vorzugsweise ≥ 90%, aufweist, wobei das Fragment einen zur Region Binding Domain oder der N-Terminal Domain des Spike-Proteins homologen Sequenzabschnitt mit einer Sequenzübereinstimmung ≥ 80 % aufweist und/oder mindestens 50 % der Anzahl der Aminosäuren des entsprechenden immunogenen Proteins von SARS-CoV-2 aufweist, B) Vermischen der Komponenten a) und b), um eine Suspension zu erhalten, C) Reagieren der Suspension aus Schritt B) bei einem pH-Wert im Bereich von 3-6, um das Protein kovalent an die Polymerpartikel zu binden.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Reagieren der oberflächenfunktionalisierten Polymerpartikel mit dem mindestens einen Protein bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 29°C, im Bereich von 30 bis 34°C oder im Bereich von 35 bis 45°C erfolgt.
Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, wobei das Reagieren der oberflächenfunktionalisierten Polymerpartikel mit dem mindestens einen Protein in einem definierten pH-Bereich und bei einer definierten Temperatur über einen Zeitraum von 20 bis 100 Stunden erfolgt.
Diagnostisches Reagenz zum Nachweis von SARS-CoV-2 Antikörpern in einer Probe, wobei das Reagenz nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12 erhältlich ist.