JP2020505068A - 食品及び飼料を製造するための方法並びに関連する組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2017年1月24日に出願された米国仮特許出願第62/450,038号明細書及び2017年11月9日に出願された米国仮特許出願第62/584,011号明細書に対する優先権を主張し、これらの仮特許出願の内容は、本明細書によって全体として参照により本明細書に援用される。
本明細書で使用されるとき、用語「バクテリオシン」は、抗微生物特性を備えたペプチド又はポリペプチドを指す。天然に存在するバクテリオシンは、ある種の原核生物によって生産されるものであり、その生産株に関連する生物に対抗して作用するが、生産株自体に対抗しない。本明細書で企図されるバクテリオシンとしては、限定はされないが、天然に存在するバクテリオシン、例えば細菌によって生産されるバクテリオシン及びその誘導体、例えば改変バクテリオシン、組換え発現バクテリオシン及び化学合成バクテリオシンが挙げられる。一部の例では、バクテリオシンは、本明細書に記載されるバクテリオシンの機能的に活性な変異体である。一部の例では、バクテリオシンの変異体は、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載されるバクテリオシン又は天然に存在するバクテリオシンの配列と少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する。
i.昆虫
本明細書に記載される任意の組成物又は方法の宿主は、本明細書に記載の任意の節足動物を含め、節足動物門(Arthropoda)(例えば、昆虫)に属するあらゆる生物であり得る。一部の例では、宿主は、摂食可能な製品(例えば、食品又は飼料)のために飼育することができる昆虫又はクモ形類動物であり得る。例えば、宿主は、ガ、チョウ、ハエ、コオロギ、バッタ、イナゴ、クモ又は甲虫であり得る。一部の例では、宿主は、シラミ亜目(Anoplura)、クモ目(Araneae)、ゴキブリ目(Blattodea)、甲虫目(Coleoptera)、ハサミムシ目(Dermaptera)、網翅目(Dictyoptera)、コムシ目(Diplura)、ハエ目(Diptera)、シロアリモドキ目(Embioptera)、カゲロウ目(Ephemeroptera)、ガロアムシ目(Grylloblatodea)、カメムシ目(Hemiptera)、ヨコバイ亜目(Homoptera)、ハチ目(Hymenoptera)、等翅目(Isoptera)、チョウ目(Lepidoptera)、カマキリ目(Mantodea)、シリアゲムシ目(Mecoptera)、アミカゲロウ目(Neuroptera)、トンボ目(Odonata)、バッタ目(Orthoptera)、ナナフシ目(Phasmida)、カワゲラ目(Plecoptera)、カマアシムシ目(Protura)、チャタテムシ(Psocoptera)、ノミ目(Siphonaptera)、シラミ目(Siphunculata)、シミ目(Thysanura)、ネジレバネ目(Strepsiptera)、アザミウマ目(Thysanoptera)、トビケラ目(Trichoptera)又はジュズヒゲムシ目(Zoraptera)に属する。
本明細書に提供される方法及び組成物を使用して、本明細書に記載される任意の宿主の適応度を増加させることができる。適応度の増加は、宿主に常在する微生物における任意の変化から生じることができ、ここで、変化は、調節薬剤の投与がもたらす結果であり、宿主に有益又は有利な効果を及ぼし得る。
所望の生命段階に達したら、宿主を採集し、必要に応じて摂食可能な製品の製造に使用するために加工することができる。一部の例では、採集された昆虫は、摂食可能な製品として、完全な形態(例えば、完全な、未加工の昆虫)で流通され得る。一部の例では、採集された完全な昆虫を摂食可能な製品として加工(例えば、粉砕)して、流通させる。或いは、摂食可能な製品の製造に使用するために昆虫の1つ以上の部分(例えば、1つ以上の虫体部分又は1つ以上の物質)を昆虫から抽出し得る。
本明細書に記載される調節薬剤の標的となる微生物には、限定はされないが、本明細書に記載される任意の細菌及び/又は真菌を含め、宿主内又は宿主上に常在する任意の微生物が含まれ得る。宿主に常在する微生物には、例えば、共生微生物(例えば、宿主に有益な栄養素又は酵素を提供する内部共生微生物)、片利共生微生物、病原性微生物又は寄生性微生物が含まれ得る。共生微生物(例えば、細菌又は真菌)は、宿主の偏性共生体又は宿主の通性共生体であり得る。宿主に常在する微生物は、垂直伝播、水平伝播又は複数の伝播起源を含め、任意の伝播様式によって獲得され得る。
本明細書に提供される方法及び組成物において標的となり得る例示的細菌としては、限定はされないが、ゼノラブダス属種(Xenorhabdus spp)、フォトラブダス属種(Photorhabdus spp)、カンディダトゥス属種(Candidatus spp)、ブフネラ属種(Buchnera spp)、ブラッタバクテリウム属種(Blattabacterium spp)、バウマンニア属種(Baumania spp)、ウィグルスウォーチア属種(Wigglesworthia spp)、ボルバキア属種(Wolbachia spp)、リケッチア属種(Rickettsia spp)、オリエンティア属種(Orientia spp)、ソーダリス属種(Sodalis spp)、バークホルデリア属種(Burkholderia spp)、カプリアビダス属種(Cupriavidus spp)、フランキア属種(Frankia spp)、シノリゾビウム属種(Snirhizobium spp)、ストレプトコッカス属種(Streptococcus spp)、ウォリネラ属種(Wolinella spp)、キシレラ属種(Xylella spp)、エルウィニア属種(Erwinia spp)、アグロバクテリウム属種(Agrobacterium spp)、バチルス属種(Bacillus spp)、パエニバチルス属種(Paenibacillus spp)、ストレプトミセス属種(Streptomyces spp)、ミクロコッカス属種(Micrococcus spp)、コリネバクテリウム属種(Corynebacterium spp)、アセトバクター属種(Acetobacter spp)、シアノバクテリア属種(Cyanobacteria spp)、サルモネラ属種(Salmonella spp)、ロドコッカス属種(Rhodococcus spp)、シュードモナス属種(Pseudomonas spp)、ラクトバチルス属種(Lactobacillus spp)、エンテロコッカス属種(Enterococcus spp)、アルカリゲネス属種(Alcaligenes spp)、クレブシエラ属種(Klebsiella spp)、パエニバチルス属種(Paenibacillus spp)、アルスロバクター属種(Arthrobacter spp)、コリネバクテリウム属種(Corynebacterium spp)、ブレビバクテリウム属種(Brevibacterium spp)、サーマス属種(Thermus spp)、シュードモナス属種(Pseudomonas spp)、クロストリジウム属種(Clostridium spp)及び大腸菌属種(Escherichia spp)が挙げられる。本明細書に提供される方法及び組成物による標的となり得る細菌の非限定的な例を表1に示す。
本明細書に提供される方法及び組成物において標的となり得る例示的真菌としては、限定はされないが、アミロステレウム・アレオラツム(Amylostereum areolatum)、エピクロエ属種(Epichloe spp)、ピキア・ピヌス(Pichia pinus)、ハンゼヌラ・カプスラタ(Hansenula capsulate)、ダルディニア・デシピエンス(Daldinia decipien)、セラトシスチス属種(Ceratocytis spp)、オフィオストマ属種(Ophiostoma spp)及びアッタマイセス・ブロマティフィカス(Attamyces bromatificus)が挙げられる。昆虫に見られる酵母及び酵母様共生体の非限定的な例としては、カンジダ属(Candida)、メチニコウイア属(Metschnikowia)、デバロマイセス属(Debaromyces)、シェフェルソマイセス・シェハテ(Scheffersomyces shehatae)及びシェフェルソマイセス・スティピティス(Scheffersomyces stipites)、スターメレラ属(Starmerella)、ピキア属(Pichia)、トリコスポロン属(Trichosporon)、クリプトコッカス属(Cryptococcus)、シュードジマ属(Pseudozyma)及びチャワンタケ亜門(Pezizomycotina)からの酵母様共生者(例えば、シンビオタフリナ・ブクネリ(Symbiotaphrina bucneri)及びシンビオタフリナ・コッホイ(Symbiotaphrina kochii))が挙げられる。本明細書の方法及び組成物による標的となり得る酵母の非限定的な例を表2に挙げる。
本明細書に提供される方法及び組成物の調節薬剤には、ファージ、ポリペプチド、小分子、抗生物質、二次代謝産物、細菌、真菌又はこれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
本明細書に記載される調節薬剤は、ファージ(例えば、溶菌性ファージ又は非溶菌性ファージ)を含み得る。一部の例では、本明細書に記載される任意のファージの有効濃度は、本明細書に記載される宿主に常在する1つ以上の微生物(本明細書に記載されるとおり)のレベル、活動又は代謝を変化させることができ、この変化が宿主の適応度の増加をもたらし得る。一部の例では、調節薬剤は、テクティウイルス科(Tectiviridae)、マイオウイルス科(Myoviridae)、サイフォウイルス科(Siphoviridae)、ポドウイルス科(Podoviridae)、カウドウイルス目(Caudovirales)、リポスリクスウイルス科(Lipothrixviridae)、ルディウイルス科(Rudiviridae)又はリガメンウイルス目(Ligamenvirales)の目から選択される少なくとも1つのファージを含む。一部の例では、本組成物は、マイオウイルス科(Myoviridae)、サイフォウイルス科(Siphoviridae)、ポドウイルス科(Podoviridae)、リポスリクスウイルス科(Lipothrixviridae)、ルディウイルス科(Rudiviridae)、アンピュラウイルス科(Ampullaviridae)、ビカウダウイルス科(Bicaudaviridae)、クラバウイルス科(Clavaviridae)、コルチコウイルス科(Corticoviridae)、シストウイルス科(Cystoviridae)、フセロウイルス科(Fuselloviridae)、グロブロウイルス科(Gluboloviridae)、グッタウイルス科(Guttaviridae)、イノウイルス科(Inoviridae)、レビウイルス科(Leviviridae)、ミクロウイルス科(Microviridae)、プラズマウイルス科(Plasmaviridae)及びテクティウイルス科(Tectiviridae)から選択される少なくとも1つのファージを含む。本方法及び組成物において有用なファージの更なる非限定的な例を表3に挙げる。
多数のポリペプチド(例えば、バクテリオシン、R型バクテリオシン、根粒Cリッチペプチド、抗微生物ペプチド、溶解素又はバクテリオサイト調節性ペプチド)を、本明細書に記載される組成物及び方法に使用し得る。一部の例では、本明細書に記載される任意のペプチド又はポリペプチドの有効濃度は、宿主に常在する1つ以上の微生物(本明細書に記載されるとおり)のレベル、活動又は代謝を変化させることができ、この変化が宿主の適応度の増加をもたらし得る。本明細書に含まれるポリペプチドには、天然に存在するポリペプチド又は組換え産生された変異体が含まれ得る。例えば、ポリペプチドは、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載されるポリペプチド又は天然に存在するポリペプチドの配列と少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する本明細書に記載される任意のポリペプチドの機能的に活性な変異体であり得る。
本明細書に記載される調節薬剤は、バクテリオシンを含み得る。一部の例では、バクテリオシンは、シュードモナス属(Pseudomonas)、ストレプトミセス属(Streptomyces)、バチルス属(Bacillus)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)又は乳酸菌(LAB、例えばラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis))などのグラム陽性細菌によって天然に生産される。一部の例では、バクテリオシンは、ハフニア・アルベイ(Hafnia alvei)、シトロバクター・フロインディ(Citrobacter freundii)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumonia)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・プリミチクム(Serratia plymithicum)、キサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)、エルウィニア・カロトボラ(Erwinia carotovora)、ラルストニア・ソラナケアルム(Ralstonia solanacearum)又は大腸菌(Escherichia coli)などのグラム陰性細菌によって天然に生産される。例示的バクテリオシンとしては、限定はされないが、クラスI〜IV LAB抗生物質(ランチビオティックなど)、コリシン、ミクロシン及びピオシンが挙げられる。バクテリオシンの非限定的な例を表4に挙げる。
本明細書に記載される調節薬剤は、溶解素(例えば、ムレイン加水分解酵素又はペプチドグリカン自己溶解素としても知られる)を含み得る。宿主に常在する細菌の阻害に好適な任意の溶解素を使用し得る。一部の例では、溶解素は、細菌細胞によって天然に生産され得るものである。一部の例では、溶解素は、バクテリオファージによって天然に生産され得るものである。一部の例では、溶解素は、宿主に常在する細菌を阻害するファージから入手される。一部の例では、溶解素は、天然に存在する溶解素をベースとして改変される。一部の例では、溶解素は、例えば、溶解素にシグナルペプチドを導入することにより、宿主細菌によって分泌されるように改変される。一部の例では、溶解素は、ファージホリンとの組み合わせで使用される。一部の例では、溶解素は、溶解素に敏感でない組換え細菌宿主によって発現される。一部の例では、溶解素を使用して、宿主に常在するグラム陽性又はグラム陰性細菌が阻害される。
本明細書に記載される調節薬剤は、抗微生物ペプチド(AMP)を含み得る。宿主に常在する微生物を阻害するのに好適な任意のAMPを使用し得る。AMPは、多様な分子の群であり、そのアミノ酸組成及び構造に基づいてサブ群に分けられる。AMPは、植物(例えば、コプシン)、昆虫(例えば、ドロソシン、サソリペプチド(例えば、Uy192、UyCT3、D3、D10、Uy17、Uy192)、マストパラン、ポネラトキシン、セクロピン、モリシン、メリチン)、カエル(例えば、マガイニン、ダーマセプチン、オーレイン)及び哺乳類(例えば、カテリシジン類、デフェンシン類及びプロテグリン類)に由来するAMPを含め、天然でAMPを生産する任意の生物に由来するか又はそれから生産され得る。例えば、AMPは、Uy192(5’−FLSTIWNGIKGLL−3’;配列番号221)、UyCT3(5’−LSAIWSGIKSLF−3;配列番号222)、D3(5’−LWGKLWEGVKSLI−3’;配列番号223)及びD10(5’−FPFLKLSLKIPKSAIKSAIKRL−3’;配列番号224)、Uy17(5’−ILSAIWSGIKGLL−3’;配列番号225)など、サソリペプチド又はそれらの組み合わせであり得る。AMPの他の非限定的な例を表6に挙げる。
本明細書に記載される調節薬剤は、根粒Cリッチペプチド(NCRペプチド)を含み得る。NCRペプチドは、ある種のマメ科植物で生産され、植物細胞が何千もの細胞内内部共生体を含有する根粒の形成をもたらすリゾビウム科(Rhizobiaceae)の細菌(根粒菌)との植物の相利共生的窒素固定共生において重要な役割を果たす。NCRペプチドは、細菌の不可逆的な最終分化過程を指図する抗微生物特性を備え、それにより例えば細菌膜を透過処理し、細胞分裂を破綻させるか又はタンパク質合成を阻害する。例えば、アルファルファ根粒菌(Sinorhizobium meliloti)に感染したメディカゴ・トルンカトゥラ(Medicago truncatula)根粒細胞では、高い倍数性の窒素固定バクテロイドへの細菌の不可逆的な分化を指図する何百ものNCRペプチドが生産される)。NCRペプチドの非限定的な例を表7に挙げる。
本明細書に記載される調節薬剤は、バクテリオサイト調節性ペプチド(BRP)を含み得る。BRPは、昆虫のバクテリオサイトに発現するペプチドである。この遺伝子は、初めに発育時点で共生体の取り込みと同時に発現し、そのバクテリオサイト特異的発現が昆虫の生涯にわたって維持される。一部の例では、BRPは、疎水性アミノ末端ドメインを有し、これは、シグナルペプチドであると予想されている。加えて、一部のBRPは、システインリッチドメインを有する。一部の例では、バクテリオサイト調節性ペプチドは、バクテリオサイト特異的システインリッチ(BCR)タンパク質である。バクテリオサイト調節性ペプチドは、長さが約40〜150アミノ酸である。一部の例では、バクテリオサイト調節性ペプチドは、長さが約45〜約145、約50〜約140、約55〜約135、約60〜約130、約65〜約125、約70〜約120、約75〜約115、約80〜約110、約85〜約105の範囲又はその間にある任意の範囲である。BRP及びその活性の非限定的な例を表8に挙げる。
多くの小分子(例えば、抗生物質又は代謝産物)を、本明細書に記載される組成物及び方法において使用し得る。一部の例では、本明細書に記載される小分子の有効濃度は、宿主に常在する1つ以上の微生物(本明細書に記載されるとおり)のレベル、活動又は代謝を変化させることができ、この変化が宿主の適応度の増加をもたらし得る。
本明細書に記載される調節薬剤は、抗生物質を含み得る。当該技術分野において公知の任意の抗生物質を使用し得る。抗生物質は、通常、その作用機構、化学構造又は活性スペクトルに基づいて分類される。
一部の例では、本明細書に記載される組成物及び方法の調節薬剤は、二次代謝産物を含む。二次代謝産物は、生物によって生産される有機分子に由来する。二次代謝産物は、(i)細菌、真菌、アメーバ、植物、昆虫及び大型動物に対して使用される競合薬剤;(ii)金属運搬薬剤;(iii)微生物と植物、昆虫及び高等動物との間の共生薬剤;(iv)性ホルモン;及び(v)分化エフェクターとして作用し得る。二次代謝産物の非限定的な例を表10に掲載する。
一部の例では、本明細書に記載される調節薬剤は、1つ以上の細菌を含む。多くの細菌は、本明細書に記載される組成物及び方法に有用である。一部の例では、薬剤は、宿主に内因的に見られる細菌種である。一部の例では、細菌性調節薬剤は、内部共生細菌種である。調節薬剤として使用し得る細菌の非限定的な例としては、本明細書で詳細な説明の第II節に記載されるあらゆる細菌種及び表1に挙げられるものが含まれる。例えば、調節薬剤は、ガンマプロテオバクテリア綱(Gammaproteobacteria)、アルファプロテオバクテリア(Alphaproteobacteria)、ベータプロテオバクテリア(Betaproteobacteria)、バクテロイデス門(Bacteroidetes)、フィルミクテス門(Firmicutes)(例えば、ラクトバチルス属(Lactobacillus)及びバチルス属種(Bacillus spp.))、クロストリジウム綱(Clostridia)、放線菌類(Actinomycetes)、スピロヘータ門(Spirochetes)、ウェルコミクロビウム門(Verrucomicrobia)及び放線菌門(Actinobacteria)を含め、昆虫の腸及び/又は血体腔内に存在する任意の細菌門からの細菌種であり得る。
(a)融合
本明細書に記載される調節薬剤のいずれも追加的な部分に融合又は連結し得る。一部の例では、調節薬剤には、1つ以上の追加的な部分(例えば、1つの追加的な部分、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれを超える追加的な部分)の融合物が含まれる。一部の例では、追加的な部分は、本明細書に記載される調節薬剤(例えば、ペプチド、ポリペプチド、小分子又は抗生物質)のいずれか1つである。或いは、追加的な部分は、調節薬剤自体として作用しなくてもよく、代わりに二次的機能を果たし得る。例えば、追加的な部分は、宿主の標的部位(例えば、宿主の腸又は宿主のバクテリオサイト)において又は宿主(例えば、コオロギ、バッタ又はイナゴ)に常在する標的微生物において調節薬剤の到達、結合又は活性化を促進し得る。
一部の例では、調節薬剤は、プレ又はプロアミノ酸配列を含み得る。例えば、調節薬剤は、プレ配列又はプロ配列の切断又は翻訳後修飾によって活性化され得る不活性なタンパク質又はペプチドであり得る。一部の例では、調節薬剤は、不活性化プレ配列又はプロ配列によって操作される。例えば、プレ配列又はプロ配列は、調節薬剤上の活性化部位、例えば受容体結合部位を隠し得るか又は調節薬剤のコンホメーション変化を誘導し得る。従って、プレ配列又はプロ配列の切断を受けると、調節薬剤が活性化される。
調節薬剤が追加的な部分に結び付いている例では、調節薬剤は、リンカーを更に含み得る。例えば、リンカーは、化学結合、例えば1つ以上の共有結合又は非共有結合であり得る。一部の例では、リンカーは、ペプチドリンカー(例えば、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、20、25、30、35、40アミノ酸又はそれを超えて長い)であり得る。リンカーには、本明細書に記載される任意のフレキシブルリンカー、リジッドリンカー又は切断可能リンカーが含まれ得る。
本明細書に記載される組成物は、純粋な形態で製剤化されるか(例えば、組成物は調節薬剤のみを含む)、又は組成物の施用若しくは送達を促進するため1つ以上の追加的な薬剤(賦形剤、送達媒体、担体、希釈剤、安定剤など)と共に製剤化され得る。好適な賦形剤及び希釈剤の例としては、限定はされないが、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、生理食塩水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル及びプロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油が挙げられる。
本明細書に提供される組成物は、液体製剤であり得る。液体製剤は、概して水と混合されるが、一部の例では、担体としての作物油、ディーゼル燃料、灯油又は他の軽油と共に使用され得る。活性成分の量は、多くの場合に約0.5〜約80重量パーセントの範囲である。
乾燥製剤は、2つのタイプ:即時使用型及び散布剤として施用するために水と混合しなければならない濃縮物に分けることができる。ほとんどのダスト製剤は、即時使用型であり、低率の活性成分(約10重量パーセント未満)と、加えてタルク、チョーク、粘土、堅果の殻又は火山灰で作られた超微細な乾燥不活性担体とを含有する。個々のダスト粒子のサイズは、様々である。少数のダスト製剤は、濃縮物であり、高率の活性成分を含有する。これらを施用前に乾燥不活性担体と混合する。ダストは、常に乾燥して使用され、標的外の部位にドリフトし易い。
一部の例では、本組成物は、顆粒として製剤化される。顆粒状製剤は、ダスト製剤と同様であり、但し顆粒状粒子の方が大きくて重い。粗粒子は、粘土、トウモロコシの穂軸又はクルミ殻などの材料から作られ得る。活性成分は、顆粒の外面を被覆するか、又はその中に吸収されるかのいずれかである。活性成分の量は、比較的少ないことができ、通常、約0.5〜約15重量パーセントの範囲である。顆粒状製剤は、ほとんどの場合、土壌、土壌中で生活する昆虫への施用に使用されるか、又は根から植物中に吸収される。顆粒状製剤は、時に、ドリフトを最小限に抑えるか、又は高密度の植生に浸透させるため、飛行機又はヘリコプターによって施用される。施用後、顆粒は、活性成分を徐々に放出し得る。一部の顆粒は、活性成分の放出に土壌水分を必要とする。顆粒状製剤は、幼虫のカ及び他の水生病害虫の防除にも使用される。顆粒は、農業、構造物、鑑賞植物、芝生、水生、道路用地及び公衆衛生(刺咬昆虫)のための病害虫防除活動において使用される。
一部の例では、本組成物は、粉末として製剤化される。一部の例では、本組成物は、水和性粉末として製剤化される。水和性粉末は、ダストに類似した微粉砕された乾燥製剤である。これは、通常、散布剤として施用するため、水と混合しなければならない。しかしながら、少数の製品は、ダストとしても、又は水和性粉末としても施用し得る − その選択は、施用者次第である。水和性粉末は、活性成分を約1〜約95重量パーセント;場合により約50パーセント超有する。粒子は、水に溶解しない。粒子は、絶えず撹拌して懸濁しない限り直ちに沈降する。粒子は、ほとんどの病害虫問題及び撹拌が可能なほとんどのタイプの散布機器で使用することができる。水和性粉末は、優れた残効性を有する。その物理的特性を理由として、大部分の製剤は、加工された多孔質材料、例えばコンクリート、石膏及び未加工木材などの表面上に留まる。そのような場合、水のみが材料に浸透する。
一部の例では、本組成物は、ベイトを含む。ベイトは、固体、ペースト、ペレット又は粉末状形態など、任意の好適な形態であり得る。ベイトは、宿主によって運び去られ、前記宿主の個体群(例えば、コロニー又は巣箱)に持ち帰られることもある。ベイトは、次にコロニーの他のメンバーの飼料供給源としての役割を果たすことができ、従って多数の宿主、潜在的に宿主のコロニー全体に有効な調節薬剤を付与し得る。
一部の例では、本組成物は、誘引剤(例えば、化学誘引剤)を含む。誘引剤は、組成物の近傍に成虫宿主又は幼若宿主(例えば、幼虫)を誘引し得る。誘引剤としては、動物、特に昆虫によって分泌される、同じ種の他の動物の行動又は発育に影響を及ぼす化学物質であるフェロモン類が挙げられる。他の誘引剤としては、糖及びタンパク質加水分解物のシロップ、酵母及び腐りかけの肉が挙げられる。誘引剤は、活性成分と組み合わされ、茎葉又は処理範囲にある他の物品にも噴霧され得る。
一部の例では、本組成物は、マイクロカプセル化製剤で提供される。マイクロカプセル化製剤は、水と混合され、他の噴霧可能製剤と同じように噴霧される。噴霧後、プラスチックコーティングが破れ、活性成分が徐々に放出される。
本明細書に記載される組成物のいずれも、本明細書に記載される調節薬剤と不活性担体とを含むように製剤化され得る。かかる担体は、固体担体、液体担体、ゲル担体及び/又はガス担体であり得る。特定の例では、担体は、種子コーティングであり得る。種子コーティングは、種子の表面に全面的に又は部分的に付着する任意の天然に存在しない製剤である。製剤は、アジュバント又は界面活性剤を更に含み得る。製剤は、作用域を拡大するために1つ以上の調節薬剤も含み得る。
一部の例では、本明細書に提供される組成物は、アジュバントを含み得る。アジュバントは、活性を有しない化学物質である。アジュバントは、混合又は施用の向上のため、又はパフォーマンスの増強のため、製剤中に予め混合されるか又は噴霧タンクに加えられるかのいずれかである。アジュバントは、葉面施用向けに設計された製品に広く使用されている。アジュバントを使用すると、製剤を具体的な必要性に合わせてカスタマイズし、局所的条件を補うことができる。アジュバントは、濡れ、展着、粘着、蒸発の低減、揮発の低減、緩衝、乳化、分散、散布ドリフトの低減及び起泡の低減を含め、特定の機能を果たすように設計され得る。単一のアジュバントがこれらの全ての機能を果たすことはできず、多くの場合、適合性のあるアジュバントが組み合わされて複数の機能を同時に果たし得る。
一部の例では、本明細書に提供される組成物は、界面活性剤を含む。界面活性剤は、濡れ剤及び展着剤とも称され、噴霧液滴の表面張力を物理的に変化させる。製剤がその機能を正しく果たすには、噴霧液滴が茎葉を濡らし、葉の全面にわたって均一に広がることが可能でなければならない。界面活性剤は、製剤被覆面積を拡大し、それにより病害虫の化学物質への曝露を増加させる。界面活性剤は、製剤を蝋質の葉又は有毛の葉に施用するときに特に重要である。適切な濡れ性及び展着性がないと、往々にして噴霧液滴が流亡するか、又は葉の表面を十分に被覆することができない。しかしながら、界面活性剤が多過ぎると過剰な流亡が引き起こされ、有効性が低下し得る。
製剤において及びこれらの製剤から調製される使用形態において、調節薬剤は、農薬用薬剤(例えば、殺虫剤、滅菌剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、殺軟体動物剤又は殺真菌剤;例えば、表12に挙げる農薬を参照されたい)、誘引剤、成長調整物質又は除草剤など、他の活性化合物との混合物であり得る。本明細書で使用されるとき、用語「農薬用薬剤」は、任意の病害虫を予防、駆逐、忌避又は軽減することを意図した任意の物質又は物質の混合物を指す。農薬は、食物に関してヒトと競合するか、所有物を破壊するか、疾患を蔓延させるか、又は不快害虫である昆虫、病原体、雑草及び微生物を含め、病害虫に対して使用される化学的物質又は生物学的薬剤であり得る。用語「農薬用薬剤」は、抗生物質、抗ウイルス薬 農薬、抗真菌薬、駆虫薬、栄養素、花粉、ショ糖及び/又は昆虫の動きを止める又は遅くする薬剤など、他の生物活性分子を更に包含し得る。
本明細書に記載される宿主は、昆虫への組成物の送達又は投与を可能にする任意の好適な方法において、本明細書に記載される組成物のいずれかに曝露され得る。調節薬剤は、単独で送達され得るか、或いは他の活性又は不活性物質と組み合わせて送達され得、有効濃度の調節薬剤を送達するように製剤化された濃縮液、ゲル、溶液、懸濁液、散布液、粉末、ペレット、ブリケット、ブリックなどの形態で例えば噴霧、マイクロインジェクション、植物経由、注入、浸漬によって施用され得る。本明細書に記載される組成物の施用量及び施用部位は、概して、宿主の習性、宿主の微生物が調節薬剤の標的となり得るのがいずれの生活環ステージであるか、施用が行われる部位並びに調節薬剤の物理的及び機能的特性によって決まる。本明細書に記載される調節薬剤は、昆虫に経口摂取によって投与され得るが、クチクラを通じた浸透又は昆虫の呼吸器系への浸透を可能にする手段によっても投与され得る。
本明細書では、調節薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイが含まれ、ここで、調節薬剤は、宿主の微生物叢を変化させ、それにより宿主適応度(例えば、昆虫適応度)を増加させるのに有効である。例えば、スクリーニングアッセイを使用して、特定の微生物及び/又は特定の宿主を標的とする1つ以上の調節薬剤を同定し得る。更に、スクリーニングアッセイを使用して、機能が増進した1つ以上の微生物を同定し得る。例えば、スクリーニングアッセイは、農薬(例えば、殺虫剤、例えばネオニコチノイド)又は植物アレロケミカル(例えば、カフェイン、大豆シスタチンN、モノテルペン類、ジテルペン酸類又はフェノール化合物)を代謝(例えば、分解)する能力が増進した1つ以上の微生物を分離するのに有効であり得る。宿主に分離微生物を送達し、コロニーが形成されることにより、農薬又は植物アレロケミカルに対する宿主の抵抗性が増加し、それにより宿主適応度が増加し得る。本方法は、本明細書に記載される宿主のいずれかに定着する能力が増進した微生物の分離にも有用であり得る。
本実施例は、アミノ酸のメチオニンを天然で生産する細菌の土壌からの分離を実証する。
本実施例は、アミノ酸のメチオニンを天然で生産する実施例1からの分離株のスクリーニングアッセイを実証する。
ショ糖(20.0g)及びNH4Cl(10.0g)を含有する変法基礎培地(K2HPO4、0.3g;KH2PO4、0.7g;Na2CO3、1.0g;CaCl2、5.0mg;MgSO4、0.3g;FeSO4、1.0mg;H2O、1L)を発酵に使用する(Chay,B.P.,Galvez,F.C.F.,and Padolina,W.G.P.U.L.B.P.(1992).Methionine production by batch fermentation from various carbohydrates.ASEAN Food Journal(Malaysia))。培地のpHは、7.2である。
本実施例は、メチオニン生産細菌を用いてコオロギを処理することにより、栄養分を改善する能力を実証する。
コオロギを飼育する実験ユニットは、改変ゲイロード出荷用ケースであり、これは、標準国際出荷用パレット(1.2m(L)×1.0m(W)×0.61m(H))の設置痕(footprint)を有する。各ケースの内部は、4mmの透明なプラスチック製ライナーで裏打ちされ、侵入又は排出の物理的バリアの役割を果たす122cm×137cmのナイロン製蚊帳で覆われている。共食い及びストレス関連死を予防するために、各ケース周縁付近の端にサイズ30cm×30cmの96個の鶏卵箱を配置する。これは、約172800cm2の可動表面積を賦与する。給水は、新たに孵化した幼虫の溺死を防ぐため、給水鉢に綿と砂利を詰めた2クォートサイズの家禽用給水器により提供される。給水器の側面には、コオロギが垂直に這うことができるように砂を撒く。各ケース内部の上部に、滴下を防ぐチェックバルブ付きの噴霧チップを取り付ける。許容可能な湿度を維持すると共に、コオロギの大きい集団への分散した代替水源を提供するために、これらのチップは、自動間隔でケースの中心に向けた水の瞬間噴霧をもたらした。温室内の温度(T)及び相対湿度(RH)は、実験期間にわたり、それぞれ29.0±2.1標準偏差(SD)℃及び67.2±14.7SD%に維持する。照明は、24時間/日提供する。
本実施例は、メチオニンが乏しい餌で飼育したドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)をメチオニン生産細菌で処理することにより、その体重、発育速度及び生存を増加させる能力を実証する。この実験計画は、メチオニンが豊富な動物飼料を生産するために使用することができるコオロギなどの他の昆虫の栄養分を増加する目的でも適用可能である。
メチオニンを生産する実施例2で単離された菌株並びにメチオニンを生産しない菌株を栄養ブロスにおいて30℃で成長させる。
1日目、実施例1に記載する109のメチオニン生産細菌又はメチオニンを生産しない細菌(対照)を100μLのリン酸緩衝食塩水に再懸濁させてから、CD−Mハエ飼料に添加する。これらの2つのコホートを25℃で24時間放置して乾燥させる。
1日目の12日前に、既述したように滅菌胚を作製し、滅菌CDハエ飼料で飼育する。滅菌成虫は、25℃、12時間の明期及び12時間の暗期サイクルで飼育すると、胚を収集した時点から11日でその蛹から羽化を開始する。
本例は、有機リン系殺虫剤のフェニトロチオンを分解可能な微生物のライブラリの取得を実証する。
過去に昆虫防除のためフェニトロチオンが利用された様々な地域から土壌サンプルを入手する。フェニトロチオン分解細菌は、(Microbes Environ.Vol.21,No.1,58−64,2006に記載されるとおり土壌サンプルから分離されることになる。簡潔に言えば、1gの土壌サンプルを9mlの滅菌蒸留水と徹底的に混合する。次に、土壌粒子を1000rcfで5分間遠心し、次に無機塩培地によるフェニトロチオン(0.4g/lの酵母エキス、0.4g/lフェニトロチオン、15g/l細菌学用寒天)上に100μlの上清をプレーティングする。フェニトロチオンをエマルションとして調製したとき、プレートは濁っている。
本実施例は、より頑健な昆虫を生産するために、その食餌中の殺虫剤、より具体的にはフェニトロチオンの1つ以上の負の効果に対して耐性である昆虫モデル、ドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)を生産する能力を実証する。以下の手法は、本明細書に開示されるコオロギ又は他の昆虫、例えばタンパク質が豊富な動物飼料を生産するのに有用な昆虫源など、他の昆虫の代わりとなるものである。フェニトロチオンを含む殺虫剤の多くは、コオロギにとって有毒であることが示されている。
治療計画:実施例5で選択された細菌分離株をフェニトロチオン含有及び不含の100μlのハエ飼料培地中109匹の生物で製剤化する。
1日目、実施例5に記載される109個のフェニトロチオン分解細菌を100μlリン酸緩衝生理食塩水又は等容積の生理食塩水(陰性対照)に懸濁し、フェニトロチオン含有又は不含の滅菌ハエ飼料培地に加える。Appl.Environ.Microbiol.Vol.82,No.20,6204−6213,2016に記載されるとおり、全て25℃で1日放置して乾燥させる。
1日目の約12日前、先述のとおり滅菌胚を作成し、滅菌ハエ飼料で育てる。フェニトロチオンを含まない滅菌ハエ飼料において12時間明期及び12時間暗期サイクル下25℃で育てたとき、成虫は、胚採取から11日でその蛹から羽化し始める。1日目、リン酸緩衝生理食塩水中の109個のフェニトロチオン分解細菌を前の実施例に記載されるとおりの滅菌ハエ飼料培地に加える。
本例は、天然に存在するファージを使用してドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)から昆虫細菌病原体(セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、エルウィニア・カロトボラ(Erwinia carotovora)及びシュードモナス・エントモフィラ(Pseudomonas entomophila)など)を除去する能力を実証する。この手順は、ハチなどの他の昆虫種における細菌の除去に関する代用アッセイとして有用であり得る。
治療計画:以下のファージ科を有するファージライブラリコレクションを使用する:マイオウイルス科(Myoviridae)、サイフォウイルス科(Siphoviridae)、ポドウイルス科(Podoviridae)、リポスリクスウイルス科(Lipothrixviridae)、ルディウイルス科(Rudiviridae)、アンピュラウイルス科(Ampullaviridae)、ビカウダウイルス科(Bicaudaviridae)、クラバウイルス科(Clavaviridae)、コルチコウイルス科(Corticoviridae)、シストウイルス科(Cystoviridae)、フセロウイルス科(Fuselloviridae)、グロブロウイルス科(Gluboloviridae)、グッタウイルス科(Guttaviridae)、イノウイルス科(Inoviridae)、レビウイルス科(Leviviridae)、ミクロウイルス科(Microviridae)、プラズマウイルス科(Plasmaviridae)、テクティウイルス科(Tectiviridae)。
ハエを育てるために使用される培地は、コーンミール、糖蜜及び酵母培地(11g/l酵母、54g/lイエローコーンミール、5g/l寒天、66ml/l糖蜜及び4.8ml/lプロピオン酸)である。ファージの最終濃度が0〜108pfu/mlに達するようにハエ飼料にファージ溶液を注入する。
本実施例は、アミノ酸生産細菌を用いて昆虫ドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)を処理することにより、その栄養分を改善する能力を実証する。この実験計画は、タンパク質が豊富な動物飼料を生産するために使用することができる、コオロギなどの他の昆虫の成長時間の短縮と共に、それらのバイオマスの生産増加に拡張することができる。
ショウジョウバエ属(Drosophila)のハエのための餌基質に混合した109コロニー形成単位(CFU)の溶液を用いて、グルタミン酸又はメチオニン生産株である分離した細菌コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)を製剤化する。
グルタミン酸又はメチオニンを生産するコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)株を栄養ブロス中30℃で成長させた。
1日目、109コロニー形成単位(CFU)からなる栄養ブロス中100ulのコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)懸濁液を5つのハエ飼料レプリケートに加えた。対照として、細菌を含まない栄養ブロスを5つの更なるハエ飼料ボトルに加えた。ショウジョウバエから採取した受精胚を2%次亜塩素酸塩溶液で5分間処理し、次に滅菌水で洗浄して、胚からあらゆる細胞外微生物を除去した。細菌を播種した及び対照のハエ飼料ボトルの全てに10ulの水中胚懸濁液(1:3胚:水懸濁液)を加えた。胚を含むハエ飼料は、実験の残りにわたって26℃、16:8時間の明期:暗期サイクル、約60%湿度で維持した。全てのレプリケートで成虫羽化までの時間及び羽化率を測定した。蛹から最初の成虫が羽化した時点から、12時間毎に成虫ハエの羽化数をカウントし、羽化率を計算した。
アミノ酸を生産する細菌の存在が、規定食で育てたときに発育中の幼虫の体重を増加させ得るかどうかを試験するため、本発明者らは、純粋培養の、単一の細菌株が単独定着した幼虫を作製した。これらのアッセイには、3つの異なる細菌、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum) − グルタミン酸を生産する株、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum) − メチオニンを生産する株及び大腸菌(E.coli)を使用した。
1.飼料への細菌の添加なし
2.グルタミン酸を生産する株であるC.グルタミクム(C.glutamicum)を含有する飼料(C.glu−Glu)
3.メチオニンを生産する株であるC.グルタミクム(C.glutamicum)を含有する飼料(C.glu−Met)
4.大腸菌(E.coli)を含有する飼料
アミノ酸生産細菌株を播種した食餌で発育させた胚は、無菌食餌で育てた胚と比べて有意に速く成虫期に達した(図1)。更に、この効果は、雄ハエと比べて雌ハエでやや強かった(図2A及び図2B)。
C.glu−Metを補充した食餌からの幼虫は、平均して体のサイズが最も大きく、その後にC.glu−Glu含有、大腸菌(E.coli)含有及び細菌なしの食餌が続いた(図3)。これは、アミノ酸を生産する細菌で昆虫の食餌を増強すると、補充していない食餌よりも速く昆虫生物量が生じたことを示す。
本実施例は、特定の昆虫細菌を標的とした環境サンプルからのファージの分離及び精製を実証する。本実施例は、プラークアッセイにより、その酸素消費速度及び細胞外酸性化速度を測定することにより、分離されたファージのインビトロでの標的細菌に対する有効性も実証する。最後に、本実施例は、細菌に対して分離されたファージでハエを処理することによるハエからの標的細菌に対するファージの能力を測定することにより、インビボでのファージの有効性を実証する。本実施例は、昆虫の適応度を低下させた病原性細菌の標的化にファージを使用してその細菌を除去し得ることを実証する。具体的には、園芸コンポストから分離されたファージを使用して、ハエの病原性細菌であるセラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)を除去することができる。
天然サンプルからの特異的バクテリオファージの分離:
標的細菌に対するバクテリオファージを環境由来材料から分離した。簡潔に言えば、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)の飽和培養物を新鮮な2倍濃度トリプトソイブロス(TSB)に希釈して24〜26℃で対数期初期まで約120分間成長させるか、又は2倍濃度ルリア−ベルターニ(LB)ブロスに希釈して37℃で約90分間成長させた。園芸コンポストをPBS中にホモジナイズすることにより調製し、0.2μmろ過によって滅菌した。未処理の下水を0.2μmろ過によって滅菌した。1容積のろ過した原材料を対数期細菌培養物に加え、インキュベーションを24時間継続した。培養物をペレット化し、上清液を0.45μmメンブレンでろ過することにより、集積原材料を調製した。
上記のとおり分離及び精製したバクテリオファージを使用して、後続の実験に用いるファージライセートの増殖及び生成を実施した。簡潔に言えば、飽和細菌培養物を新鮮培地に100倍希釈し、60〜120分間成長させて、有効なファージ感染のための初期対数増殖状態を実現した。対数期初期培養物にファージ懸濁液又はライセートを加え、ファージ増殖及び溶菌の指標である澄明なブロスが観察されるまで又は感染後最長24時間までインキュベーションを継続した。細胞を7,197×gで20分間ペレット化し、次に0.45又は0.2μmメンブレンで上清液をろ過することによりライセートを回収した。ろ過したライセートを4℃で保存した。
Seahorse XFe96アナライザー(Agilent)を使用して、感染中に酸素消費速度(OCR)及び細胞外酸性化速度(ECAR)をモニタすることによりファージが細菌に及ぼす効果を測定した。実験前日に、1ウェル当たり15μLの1mg/mL ポリ−L−リジンストックでXFe96プレートをコーティングし、28℃で一晩乾燥させ、及び200μLのXF Calibrantが入ったウェルに入れて暗所下室温でインキュベートすることによりXFe96プローブを平衡化した。翌日、ポリ−L−リジンでコートしたプレートをddH2Oで2回洗浄した。大腸菌(E.coli)BL21(LB、37℃)又はS.マルセセンス(S.marcescens)(TSB、25℃)の飽和一晩培養物を同じ培地に1:100で継代培養し、曝気しながら30℃で約2.5時間成長させた。次に、同じ培地を使用して培養物をO.D.600nm 約0.02に希釈した。処理液は、ストックをSM緩衝液に10×最終濃度で希釈し、20μLの10×溶液をプローブプレートの適切な注入ポートにロードすることにより調製した。XFe96フラックスアナライザーでプローブを平衡化している間、90μLの細菌懸濁液又は培地対照を加えることにより細菌プレートを調製し、3,000rpmで10分間スピンした。遠心後、ウェルに更なる90μLの適切な培地を、細菌付着を妨げないように静かに加え、1ウェル当たりの総容積を180μLにした。
ヌクレアーゼで前処理して、蛍光シグナル解釈を妨げ得るウイルス外核酸を取り除くことにより、バクテリオファージ調製物を染色のため調製した。簡潔に言えば、10mLのファージライセートに10mMの最終濃度でMgCl2を加え、RNase A(Qiagen)及びDNase I(Sigma)を両方とも10μg/mLの最終濃度となるように加えた。サンプルを室温で1時間インキュベートした。ヌクレアーゼ処理後、5mLのライセートを1μLのSYBR Gold(Thermo、10,000×)と合わせ、室温で約1.5時間インキュベートした。続いて、Amicon限外ろ過カラムを使用してサンプルから過剰な色素を取り除いた。簡潔に言えば、10mLのSM緩衝液を加え、5,000×g、4℃で5分間スピンすることにより、Amiconカラム(15mL、10k MWCO)を洗浄した。次に、標識したファージサンプルを、カラムを通じて5,000×g、4℃でスピンして、最終的に容積を約10倍低下させた(15〜30分)。サンプルを洗浄するため、各リザーバに5mL SM緩衝液を加えてスピンを繰り返し、続いて更に2回洗浄した。3回目の洗浄後、Amiconリザーバから保持サンプルをピペッティングにより取り除き、SM緩衝液を使用して約1mLにした。より大きい夾雑物を取り除くため、洗浄及び標識したファージサンプルを10,000×gで2分間スピンし、続いて上清を0.2μmメンブレンでろ過して黒色マイクロチューブに入れ、4℃で保存した。
S.マルセセンス(S.marcescens)培養物をトリプトソイブロス(TSB)中30℃において200rpmで絶えず振盪しながら成長させた。
前述の本発明は、理解を明確にするために説明及び例として幾らか詳細に記載されているが、そうした記載及び例が本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、全体として参照により明示的に援用される。
Claims (10)
- 昆虫の栄養プロフィールを増加させる方法であって、有効量のメチオニン生産細菌を前記昆虫に送達することを含む方法。
- 前記昆虫は、コオロギ、バッタ又はイナゴである、請求項1に記載の方法。
- 前記昆虫は、発生段階として胚、幼虫、蛹又は成虫である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記送達は、前記昆虫が成長、生活、繁殖又は摂餌する少なくとも1つの生息場所に組成物を送達することを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記メチオニン生産細菌は、前記昆虫による摂取のために昆虫が摂食可能な組成物中において送達される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記メチオニン生産細菌は、液体、固体、エアロゾル、ペースト、ゲル又は気体組成物として、農業的に許容可能な担体と共に製剤化される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体は、種子コーティングである、請求項6に記載の方法。
- 前記昆虫に常在する外性メチオニン生産細菌を含む修飾された昆虫。
- 発生段階として胚、幼虫、蛹又は成虫である、請求項8に記載の昆虫。
- 前記メチオニン生産細菌は、前記昆虫の腸及び/又は血体腔内の微生物叢を変化させる、請求項8又は9に記載の昆虫。
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