KR102575838B1

KR102575838B1 - 곤충 장관 유래 미생물을 포함하는 사료 첨가용 조성물

Info

Publication number: KR102575838B1
Application number: KR1020210015890A
Authority: KR
Inventors: 김현범
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2021-02-04
Filing date: 2021-02-04
Publication date: 2023-09-07
Also published as: KR20220112400A

Abstract

본 발명은 곤충 장관에서 유래한 웨이셀라 사이베리아(Weissella cibaria), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 메타바실러스 할로사카로보란스(Meta bacillus halosaccharovorans), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토코커스 타이완엔시스(Lactococcus taiwanensis), 오베숨박테리움 프로테우스(Obesumbacterium proteus) 및 엔테로박터 쓰촨엔시스(Enterobacter sichuanensis)로 이루어진 혼합 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 돼지 사료 첨가용 조성물에 관한 것이다.

Description

곤충 장관 유래 미생물을 포함하는 사료 첨가용 조성물{Ingredients of feed additives including microorganisms derived from insect intestines}

본 발명은 곤충 장관 유래 미생물을 포함하는 사료 첨가용 조성물 및 이를 포함하는 사료 첨가제, 그리고 이를 돼지에 급여하여 돼지의 생산성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

양돈업계에서는, 돼지의 성장속도를 높이고, 성장률을 증가시키기 위한 다양한 사육 기술을 실질적으로 향상 및 개발하여 왔다. 사료 섭취량 대비 증체량을 더욱 증가시켜 사료효율을 높이고, 이로써 돼지 성장률을 향상시키는 방법은 꾸준하게 개발되고 있다.

돼지는 주로 곡물을 원료로 한 사료와 섬유질이 풍부한 사료를 먹는데, 사료의 가장 기본이 되는 곡류는 섬유성 다당류, 셀룰로스, 펙틴, 헤미셀룰로스, 글리코프로틴, 리그닌, 비전분성 다당류 등이 있다. 따라서, 상기 성분들의 분해가 가능하다면, 사료의 이용효율을 높여 돼지의 생산성을 증가시킬 수 있다. 특히 어린 돼지의 소화 장애를 막을 수 있어 그 활용성이 높다고 할 수 있다.

한편, 차세대 염기서열 분석법(Next-generation Gene Sequencing)을 이용한 16S ribosomal RNA genes(16S rRNA genes)의 서열분석 기술은 미생물을 배양, 동정하는 과정과는 달리 적은 연구비와 노동력, 시간에 비해 방대한 양의 박테리아 유전자 정보(DNA Sequence)를 산출함으로써 기존의 배양, 동정과정을 거치는 제한된 연구한계를 극복하고 모든 세균총을 분석할 수 있는 수단을 제공한다. 본 기술은 차세대 염기서열분석법을 이용하여 16S rRNA genes의 초 가변 영역 염기서열을 이용하여 각 돼지 장관내 모든 세균총을 분석할 수 있다. 나아가 염기서열을 이용한 생물정보학(bioinformatics)기법들을 활용하여 장관내 세균구성상 차이를 평가할 수 있다.

메타지노믹스(metagenomics)는 세균총의 총체적인 게놈(genome)을 분석하고 연구를 하는 생물정보학의 기법으로써 배양 가능한 세균의 게놈만을 연구하는 한계를 넘어서 난분리균들의 유전자 기능까지 분석할 수 있다. 차세대 염기서열 분석법(Next-generation Gene Sequencing)을 이용하여 장관내부의 세균총의 염기서열을 만들고 이러한 게놈을 다양한 Reference sequence와 비교하여 염기서열의 기능적 요소를 예측할 수 있다.

본 출원인은 양돈이 섬유소를 분해 이용하기 어려운 점을 해결하고, 생산성을 향상시키기 위해 곤충의 장관에서 섬유소 분해능을 가진 미생물을 분리 동정하여 급여가능한 사료 첨가용 조성물을 개발했으며, 이러한 연구는 농진청 (자돈 출혈성 장염 제어를 위한 천연소재 개발 및 회장염 생독백신 가이드라인 제시)의 지원을 통해 이루어 졌으며, 특허균주 기탁은 기업체 브이원바이오테라퓨틱스 (반려견 마이크로바이옴 분석연구 및 효능 평가시험)의 지원을 통해 이루어졌다.

1. 한국 특허 공개공보 10-2013-0129735호　

본 발명의 목적은 곤충 장관에서 유래한 웨이셀라 사이베리아(Weissella cibaria), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 메타바실러스 할로사카로보란스(Meta bacillus halosaccharovorans), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토코커스 타이완엔시스(Lactococcus taiwanensis), 오베숨박테리움 프로테우스(Obesumbacterium proteus) 및 엔테로박터 쓰촨엔시스(Enterobacter sichuanensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 돼지 사료 첨가용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는, 돼지 사료 첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 첨가제를 돼지에 급여하는 단계를 포함하는, 돼지의 생산성을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 곤충 장관에서 유래한 웨이셀라 사이베리아(Weissella cibaria), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 메타바실러스 할로사카로보란스(Meta bacillus halosaccharovorans), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토코커스 타이완엔시스(Lactococcus taiwanensis), 오베숨박테리움 프로테우스(Obesumbacterium proteus) 및 엔테로박터 쓰촨엔시스(Enterobacter sichuanensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 돼지 사료 첨가용 조성물이 제공된다.

일 측에 따르면, 상기 곤충은 메뚜기, 여치, 방아깨비, 풀무치 또는 베짱이 일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 균주는 섬유소 분해능을 가지는 것일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 조성물은 동결 건조시켜 분말화 된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는, 돼지 사료첨가제가 제공된다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 사료 첨가제를 돼지에 급여하는 단계를 포함하는, 돼지의 생산성을 향상시키는 방법이 제공된다.

본 발명의 돼지 사료 첨가용 조성물은 돼지의 섬유소 분해능을 향상시킴으로써, 양분 흡수율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 돼지 사료 첨가용 조성물을 돼지에게 급여하는 경우, 돼지의 생산성을 향상시키는 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 메뚜기 분변에서 분리한 균주를 동정한 결과로 호기와 혐기 환경으로 나누어 생물분류 체계 여러 수준에서 균주의 분포도를 분석한 결과이다.
도 2는 CMC를 첨가한 배지에서 배양 후 Congo red로 염색한 결과, Cellulase를 생산하는 균주의 경우 균주 집락 주변에 투명한 Clear zone을 형성한 것을 확인한 결과이다.
도 3은 호기 10종, 혐기 5종 균주별 산성 및 담즙에 대한 내성을 생존률로 확인한 결과이다.
도 4는 메뚜기 장관유래 미생물을 급여한 돼지와 대조군을 비교하여 생물분류학 분석을 통해 미생물총의 변화를 확인한 것이다. 특히, 탄수화물 분해능을 갖는 미생물의 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 메뚜기 장관유래 미생물을 급여한 돼지와 대조군을 비교하여 미생물총의 변화를 확인한 것이다. 특히, 탄수화물 분해기능과 돼지의 섭취량에 대하여 소화율을 높일 수 있는 기능을 갖는 미생물 Turicibater와 Ruminococcus의 변화를 확인한 결과이다.
도 6은 메뚜기 장관유래 미생물을 급여한 돼지의Beta-glucan, Pectin 등 섬유소 분해와 관련된 기능을 갖는 유전자들의 변화를 측정한 결과이다.
도 7은 곤충 장관 유래 미생물을 급여한 돼지의 일당증체량(ADG), 일당사료섭취량(ADFI), 사료효율(ADG/ADFI)이 변화됨을 측정한 결과이다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명자는 돼지 성장 저해 원인이 양분 흡수율을 낮추는 섬유소 등의 분해 효율이 낮은 점에 있다고 판단하였다.

이에, 섬유소 분해를 통하여 성장을 하는 곤충인 메뚜기를 선정한 후 차세대 염기서열 분석법(Next Generation Sequencing)과 생물정보학(bioinformatics)기법을 이용해 16S rRNA 염기서열을 분석함으로써 메뚜기 장관 내 미생물총을 규명하였고, Whole metagenome sequence 분석을 통해 미생물총의 기능을 예측하였다.

상기 방법을 이용하여 메뚜기 장관 내 미생물총으로부터 섬유소 분해능을 가진 미생물을 분리하고, 돼지에게 급여 시 장관에서의 생존 가능성을 확인하기 위해, 내산성 및 내담즙성을 평가하였다. 그 다음, 내산성 및 내담즙성이 있는 것으로 판정된 미생물을 돼지에 급여하고, In vivo 실험을 실시하였다. 그 결과, 상기 미생물이 돼지의 탄수화물 분해능, 섭취량 대비 소화율, 그리고 섬유소 분해능을 향상시켜 돼지 성장과 생산성을 향상시키는 효과를 가지는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 곤충 장관에서 유래한 웨이셀라 사이베리아(Weissella cibaria), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 메타바실러스 할로사카로보란스(Meta bacillus halosaccharovorans), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토코커스 타이완엔시스(Lactococcus taiwanensis), 오베숨박테리움 프로테우스(Obesumbacterium proteus) 및 엔테로박터 쓰촨엔시스(Enterobacter sichuanensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 돼지 사료 첨가용 조성물이 제공된다.

웨이셀라 사이베리아(Weisella cibaria)는 그람 양성균으로 비포자성 및 비운동성이며, 자당으로부터 비소화성 올리고당 생성을 통해 유산균 산업에 잠재적 가능성이 있다. 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)는 그람 양성균으로 젖산 외 헤테로발효성 당류에서 젖산을 생성하며, 발효 중에 bacteriocin 같은 강력한 면역물질을 생산한다. 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)는 그람 양성균으로 내산성이며, 박테리오신(Bacteriocin)을 생성한다. 메타바실러스 할로사카로보란스(Meta bacillus halosaccharovorans)는 그람 양성균으로 당을 소비하는 호염성 세균으로 알려져 있다. 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)는 그람 양성균으로 비포자성 및 비운동성이며, 젖산 및 유산을 생성하는 유산균이다. 락토코커스 타이완엔시스(Lactococcus taiwanensis)는 그람 양성균으로 당류로부터 젖산만을 생성하는 호모발효성을 띈다. 오베숨박테리움 프로테우스(Obesumbacterium proteus)는 그람 음성균으로 맥주 효모 발효와 관련 있는 것으로 알려져 있다. 그리고 엔테로박터 쓰촨엔시스(Enterobacter sichuanensis)는 그람 음성균으로 비포자성 및 비운동성이며, 그 외 기능에 대해서는 확인되지 않았다.

이 때, 상기 균종은 상기 혼합 균주로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁되었다(KCTC14412BP).

상기 미생물들은 하기 실시예에서 나타낸 바와 같이 메뚜기에서 채취한 분변 샘플에 16S rRNA gene sequencing 및 Whole metagenome sequence analysis를 수행하여 유전자 정보를 산출함으로써 메뚜기 장관 내 미생물총을 분석하여 선별된 것으로, 메뚜기에서 채취한 분변 샘플에서 분리된 미생물의 유전자의 발현 수준의 측정은 real-time PCR, RT-PCR 및 효소 결합 면역 침강분석법(ELISA) 중에서 선택되는 방법으로 수행되는 것일 수 있다. 이와 방법으로 선별된 미생물들은 섬유소 분해능을 가진다.

상기 곤충은 메뚜기, 여치, 방아깨비, 풀무치 또는 베짱이 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 돼지 사료 첨가용 조성물은 동결 건조시켜 분말화 된 것이 바람직하나, 액상 제형도 가능하고, 목적에 따라 당해 기술분야에 공지된 제형으로 이용 가능하다.

한편, 상기 돼지는 이유 자돈에게 적용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 용어, "이유 자돈"은 태어난 뒤 젖을 뗀 70일령까지의 새끼돼지로서 태어난 뒤 21일 내지 28일 이후부터 고형 사료를 먹는 새끼돼지를 의미한다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 돼지 사료 첨가용 조성물을 유효성분으로 포함하는, 돼지 사료 첨가제가 제공된다. 본 발명의 사료 첨가제에는 사료 첨가용 조성물 외에도 질병의 예방, 사료효율의 증진, 소화율 증진 및 성장촉진 효과, 기호성 증진 효과 등을 위해 비타민제, 영양 보충제, 효소제, 아미노산제, 항균제, 유기산제, 식물 추출물, 유화제, 감미제, 항곰팡이제, 기타 점토 광물질제 등을 더 포함할 수 있다.

또한, 상기 사료 첨가제는 사료에 직접 혼합하거나 사료와 별도로 경구 급여할 수 있다. 사료 첨가제를 사료와 별도로 투여하는 경우, 당해 기술분야에 공지된 식용 담체와 조합하여 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 추출물의 투여형은 정제, 캡슐제, 산제, 토로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 연 젤라틴 캡슐제, 또는 시럽제 또는 액체 현탁액제, 에멀젼제 또는 용액제의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여 형태는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 사료 첨가제를 돼지에 급여하는 단계를 포함하는, 돼지의 생산성을 향상시키는 방법이 제공된다. 아래 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 사료 첨가제를 기존 돼지 사료에 일정량 첨가하여 돼지에 급여하는 경우, 돼지 성장과 생산성을 향상시키는 효과를 가진다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해서 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 분변 샘플링 및 균주 분리

분변 샘플은 200마리의 메뚜기를 수령하여, 개별 사육을 통해 개체별로 진행하여 채취하고, 채취한 분변 샘플은 멸균된 테스트 튜브에 담겨 -80℃에 보관하였다. 상기 분변 샘플을 37°C의 호기 및 혐기 상태에서 Bacto Brain Heart Infusion(BHI, BD, 241830), Luria-Bertani Agar(LB, MBcell, MB-L4487), Difco Nutrient Agar(NA, BD, 213000), Trypton Soya Agar (TSA, Oxoid, CM0131) 총 4가지 배지를 사용해서 24시간 배양 후 세균을 분리하였다.

실시예 2: 메뚜기 균주 16S rRNA gene sequencing

상기 분리된 세균의16S rRNA gene의 초 가변영역인 V1 - V9을 타겟으로 이부분을 증폭하기 위해 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') 와 27F (5' -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') 프라이머(Universal Primer)를 사용하였다. PCR(Polymerase Chain Reaction)의 조성 및 조건은 하기 표1 및 2에 나타낸 바와 같다.

PCR 조성	㎕
5X PrimeSTAR Buffer	10
dNTP	4
Primer (forward)	1
Primer (reverse)	1
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (Takara社)	1
D.W	31
Template	2
Final volume(PCR tube)	50

PCR 조건
Step	Temperature	Time	Cycle
Initiation	95℃	1min	1
Denaturation	95℃	30sec	35
Annealing	58℃	1min
Extension	72℃	1.5min
Termination	72℃	5min	1
	4℃	∞

PCR 사이클링은 다음과 같다: 초기 Initiation 과정은 95 °C에서 1분간 진행하며, 이어서 95°C에서 30초, 58°C에서 1분, 그리고 72°C에서 1분 30초간 35회 반복을 한다. 마지막으로 Termination 과정은 72°C에서 5분간 진행하였다.

상기 실시예 1에서 채취한 분변 샘플에 상기 PCR방법으로 16S rRNA gene sequence analysis를 수행하여 분리된 균주를 동정한 결과, Phylum 수준에서 퍼미큐티스(Firmicutes)와 프로테오박테리아(Proteobacteria)가 우점종으로 호기, 혐기에서 분포하였고, 분리된 균주의 95% 이상을 구성하고 있었다(도 1. a 및 b). Genus 수준에서 분석한 결과는 락토코커스(Lactococcus)가 우점종으로 혐기 및 호기상태에서 존재함을 보여주고 있었다(도 1. c 및 d). Species 수준에서는 호기에서 28종이 동정되었으며, 혐기에서는 16종이 동정되었다. 호기와 혐기에서 모두 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)가 각각 전체의 21%, 30%로 우점하였다(도 1. e 및 f).

실시예 3: Cellulase 생산 균주 선별

상기 실시예 1의 메뚜기 장관 내 균주를 배양하기 위해서 만든 배지(Bacto Brain Heart Infusion(BHI, BD, 241830), Luria-Bertani Agar(LB, MBcell, MB-L4487), Difco Nutrient Agar(NA, BD, 213000), Trypton Soya Agar (TSA, Oxoid, CM0131), 총 4가지 배지의 성상에 0.2%의 Carboxymethylcellulose sodium salt(CMC, SIGMA, C5678)를 첨가하여 준비한 후, 상기 실시예 2에서 동정하여 분리해둔 균주를 접종하여 37℃, 48시간 동안 배양시켰다. Colony를 확인한 후, 0.1% Congo Red로 20분간 염색시키고, 1M NaCl로 20분간 탈색시켰다. 그 결과, 탈색과 동시에 바로 Clear zone을 형성하는 것을 관찰하고, Cellulase를 생산하는 균주의 경우 균주 집락 주변에 투명한 Clear zone을 형성하는 것을 확인하였다 (도 2). 상기 실시예 3의 실험결과 Cellulase를 생산하는 균주 17종을 선별하였고, 하기 표3에 나타낸 바와 같다.

호기성 균	혐기성 균
Metabacillus halosaccharovorans	Hafnia alvei
Leclercia adecarboxylata	Lactococcus garvieae
Enterobacteriaceae bacterium	Latilactobacillus sakei
Kluyvera intermedia	Lactococcus taiwanensis
Obesumbacterium proteus	Weissella cibaria
Pluralibacter pyrinus
Lactococcus lactis
Bacillus sp.
Enterobacter sichuanensis
Enterobacter sichuanensis
Bacterium Amlc10
Pediococcus pentosaceus

실시예 4: 내산성 및 내담즙성 검사

상기 실시예 3에서 선별한 17종의 균주 중 병원성이 있다고 잠정되는 균 8종(호기 6종, 혐기 2종)을 제외하고, 내산성 및 내담즙성 검사를 수행하였다.

내산성 및 내담즙성 검사는 상기 균주를 돼지에게 공급하였을 때 돼지의 소화기 환경에 대한 안정성을 확인하기 위해 진행하였다. 선별된 균주를 MRS broth에서 37℃, 20hr동안 배양한 후, pH에 대한 안정성을 확인하기 위해, pH2, pH4, pH6으로 설정한 modified MRS broth와 pH7 (non-modified, Control)　MRS broth 10ml에 배양시킨 세포현탁액을 다시 접종 후 37℃, 20hr동안 배양하였다. 내담즙성 평가를 위해서는, 0.3% (w/v) bile salt를 첨가한 MRS broth에 pH를 조정한 broth에서 배양시킨 현탁액을 접종 및 배양하였다. 37℃에서 6시간 동안 배양시킨 후 MRS agar plate에 도말하여 20시간 이상 배양한 후 생균수를 측정하고, 내산성 및 내담즙성을 나타내기 위한 생존율(%)*을 이하에 나타낸 식을 이용하여 계산하였다.

*생존율(%) = (cell number in MRS containing 0.3% HCl or bile salt ÷ cell number in MRS) × 100

결과적으로 대부분의 균주가 pH6에서도 생존하였으며, 몇몇 균주의 경우는 pH2에서도 약하지만 생존한 것을 확인할 수 있었다. 0.3% bile salt가 있는 배지에서도 생존한 균주를 확인하였다 (도 3).

도 3의 결과를 바탕으로 돼지에게 이식할 호기성 혐기성 균주를 표 4와 같이 선별하였으며, 모두 TBS(Tris-Buffered Saline)에서 37℃, 24hr 호기배양(혐기 배양도 무관)하고 미생물 조성을 구축하였다.

	분리균주	샘플 균주	비고
1	Weissella cibaria	LADI 012	Firmicutes
2	Latilactobacillus sakei	LADI 009	Firmicutes
3	Pediococcus pentosaceus	LADI 011	Firmicutes
4	Metabacillus halosaccharovorans	LADI 006	Firmicutes
5	Lactococcus lactis	LADI 008	Firmicutes
6	Lactococcus taiwanensis	LADI 005	Firmicutes
7	Obesumbacterium proteus	LADI 004	Proteobacteria
8	Enterobacter sichuanensis	LADI 007	Proteobacteria
9	Enterobacter sichuanensis	LADI 010	Proteobacteria

아울러, 표 4에 기재된 상기 9종의 균주를 혼합하여 2020년 12월 15일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 혼합균주로 기탁되었다(기탁번호 KCTC 14412BP).

실시예 5: 16S rRNA gene sequencing

돼지 분변 샘플 0.25g으로부터 DNA를 추출하였고(QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit QIAGEN社), 16S rRNA gene을 target으로 하는 Primer를 이용하여 16S rRNA gene amplicon을 제작하였다. 16S rRNA gene amplicon cleaning을 실시한 후 (Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System, Promega社) Illumina MiSeq chemistry를 기반으로 16S rRNA gene amplicon sequencing을 실시하였다.

실시예 5 실험 결과 처리군(CPB)에서 급여 균주였던 락토바실러스(Lactobacillus)의 증가와 프리보텔라(Prevotella)의 비교적 적은 감소를 확인하였다. 프리보텔라(Prevotella)는 탄수화물을 분해하는 미생물로 이유 자돈에서 대폭 감소하는 것으로 알려진 미생물로, 대조군(CON)에서는 6주차에서 대폭 감소하는 양상을 보이나, 상기 실시예 4에서 선별한 균주를 이식한 돼지(CPB)에서는 6주차에서 적게 감소하는 양상을 보였다 (도 4. a, b).

또 다른 실험 결과로, 도 5에 나타낸 바와 같이 처리군(Treatment))에서 투리시박터(Turicibacter)와 루미노코커스(Ruminococcus) 미생물이 2배 이상 증가한 것을 확인하였다. 투리시박터(Turicibacter)는 탄수화물 분해능을 가지고 있으며, 항균 특성을 가지고 있어 장 염증 질병의 감소를 도와 이유자돈의 장 안정성을 향상시킬 수 있다. 또한, 루미노코커스(Ruminococcus)는 당분 흡수 능력이 우수하여 이유자돈의 섭취량에 대해 소화율을 높일 수 있다. 두 균주 모두 탄수화물 분해능과 돼지의 섭취량에 대하여 소화율을 높일 수 있는 기능을 가지고 있어, 돼지의 성장 및 생산성을 증가시킬 수 있는 효과를 확인할 수 있었다(도 5).

실시예 6: Whole metagenome sequence analysis

상기 실시예 4의 실험결과에 따라 선별한 섬유소 분해능을 갖는 메뚜기 장관 유래 미생물을 돼지에 급여하고, In vivo 실험을 통해 섬유소 분해능이 개선된 돼지 장관 미생물을 검증하였다. 상기 돼지 장관 내 미생물의 기능적인 측면은 Whole metagenome sequencing을 수행하여 분석하였다.

그 결과, 처리군(Treatment)에서 대조군(Control)과 비교하여 탄수화물과 아미노산 및 그의 유도체의 기능에 관련된 유전자의 증가를 확인하였다. 특히, 처리군에서 섬유소 분해와 관련된 기능을 갖는 유전자의 증가를 확인하였다. 보다 상세하게는 식물의 세포벽을 구성하는 베타글루칸(beta-glucan)을 분해하는 베타글루코시데이즈(beta-glucosidase) 관련 유전자의 증가와 식물체의 주요 성분인 펙틴(Pectin)을 구성하는 갈락투로네이트(Galacturonate)와 갈락투로네이트 (galacturonate)의 전구체인 글루쿠로네이트(glucuronate)의 분해를 돕는 유전자의 증가를 확인하였다(도 6).

실시예 7: 메뚜기 장관 유래 미생물 이식(xenotransplantation) 돼지의 생산성 평가

메뚜기 장관 유래 미생물 급여에 따른 돼지의 생산성을 평가하기 위해, 대조군과 처리군으로 나누어 생산량을 평가했으며, 처리군은 상기 실시예 4의 실험결과에 따라 선별한 섬유소 분해능을 갖는 메뚜기 장관 유래 미생물(표 4의 혼합균주)를 돼지에 급여하였다. 급여한 결과, 도 7과 같이 곤충 장관 유래 미생물을 급여한 돼지의 일당증체량(ADG), 일당사료섭취량(ADFI), 사료효율(ADG/ADFI)이 변화된 것으로 나타났다. 도 7의 A는 대조군(con)과 처리군(cellulase producing bacteria)의 ADG 및 ADFI를 각각 측정한 것으로, 처리군의 ADG는 약 456g/d, ADF는 약 713g/d로 대조군의 ADG(약430g/d) 및 ADF(약693g/d) 에 비해 다소 증가한 것으로 나타났다.

도 7의 B는 A의 측정값을 기초로, 대조군(con)과 처리군(cellulase producing bacteria)의 사료효율(ADG/ADFI)을 그래프로 나타낸 것으로, 처리군의 사료 효율은 약 0.63g/g로 대조군의 사료 효율 약 0.60g/g에 비해 효율이 높은 것을 확인하였다. 즉, 상기 선별한 메뚜기 장관 유래 미생물을 돼지에게 급여하는 경우 돼지의 성장 및 생산성이 증가한다는 효과를 규명할 수 있었다.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

한국생명공학연구원

KCTC14412BP

20201215

Claims

기탁번호 KCTC14412BP로 기탁된 혼합균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하고, 상기 혼합균주는 곤충 장관에서 유래한 것인, 돼지 사료 첨가용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 곤충은 메뚜기, 여치, 방아깨비, 풀무치 또는 베짱이인, 돼지 사료 첨가용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 혼합균주는 섬유소 분해능을 가지는, 돼지 사료 첨가용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 돼지 사료 첨가용 조성물은 동결 건조시켜 분말화 된 것인, 돼지 사료 첨가용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 돼지 사료 첨가용 조성물을 유효성분으로 포함하는, 돼지 사료 첨가제.
제5항의 돼지 사료 첨가제를 돼지에 급여하는 단계를 포함하는, 돼지의 생산성을 향상시키는 방법.