BR122022016119B1 - Métodos para aumentar o perfil nutricional de um inseto e para aumentar a taxa de desenvolvimento de um inseto e usos de bactérias - Google Patents

Abstract

São proporcionados aqui métodos e composições para aplicações alimentares e de rações, por exemplo, para visar um ou mais micro-organismos residentes em um inseto hospedeiro, a modulação resultando em um aumento da aptidão do hospedeiro. A invenção apresenta uma composição que inclui um agente modulador (por exemplo, fago, peptídeo, molécula pequena, antibiótico ou suas combinações) que pode alterar a microbiota do hospedeiro de um modo que é benéfico para o hospedeiro. Ao promover níveis microbianos, atividade microbiana, metabolismo microbiano e/ou diversidade microbiana favoráveis, o agente modulador descrito aqui pode ser usado para aumentar a aptidão de uma variedade de insetos utilizados nas indústrias de alimentos para humanos ou rações para animais.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório U.S. N° 62/450,038 depositado em 24 de janeiro de 2017, e Pedido Provisório U.S. N° 62/584,011 depositado em 9 de novembro de 2017, o conteúdo dos quais é incorporado aqui a título de referência na sua totalidade.

ANTECEDENTES

[0002] Artrópodes, como grilos, cigarras, gafanhotos, formigas, lar vas de insetos, lagartas, e escorpiões, têm muitos usos tradicionais e novos potenciais na produção de alimentos e rações para humanos e animais, respectivamente. Insetos como alimentos e rações emergem como uma questão especialmente relevante devido ao custo crescente de proteína animal, insegurança quanto a alimentos e rações, pressões ambientais, crescimento populacional, e demanda crescente de fontes acessíveis e sustentáveis de nutrientes para humanos e animais (por exemplo, gado). Para cultivar artrópodes benéficos para uso nas indústrias de alimentos e rações, são necessários na técnica modos de promover o crescimento e aptidão de tais artrópodes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0003] São revelados aqui composições e métodos para modular a aptidão de insetos para a fabricação de alimentos e rações. A composição inclui um agente que altera um nível, atividade ou metabolismo de um ou mais micro-organismos residentes em um hospedeiro, a alteração resultando em uma modulação da aptidão do hospedeiro.

[0004] Em um aspecto, é proporcionado aqui um método para au- mentar um perfil nutricional de um inseto, o método incluindo administrar ao inseto uma quantidade eficaz de bactérias produtoras de meti- onina.

[0005] Em algumas modalidades, o inseto é um grilo, um gafanho to, ou um acrídio.

[0006] Em algumas modalidades, o inseto pode ser, em termos de desenvolvimento, um embrião, larva, pupa, ou adulto.

[0007] Em algumas modalidades, a administração pode incluir administrar a composição a pelo menos um habitat onde o inseto cresce, vive, se reproduz, ou alimenta.

[0008] Em algumas modalidades, as bactérias produtoras de meti- onina podem ser administradas em uma composição comestível por insetos para ingestão pelo inseto.

[0009] Em algumas modalidades, as bactérias produtoras de meti- onina podem ser formuladas com um veículo agricolamente aceitável como uma composição líquida, sólida, de aerossol, pastosa, de gel ou gasosa.

[0010] Em algumas modalidades, o veículo pode ser um revesti mento de sementes.

[0011] Em um segundo aspecto, é proporcionado aqui um inseto modificado compreendendo bactérias exógenas produtoras de metio- nina residentes no inseto.

[0012] Em algumas modalidades do segundo aspecto, o inseto é, em termos de desenvolvimento, um embrião, uma larva, uma pupa, ou um adulto.

[0013] Em algumas modalidades do segundo aspecto, as bacté rias produtoras de metionina alteram a microbiota em um intestino e/ou hemocele do inseto.

[0014] Ainda em outro aspecto, a composição inclui um agente que altera um nível, atividade, ou metabolismo de um ou mais micro- organismos residentes em um hospedeiro de inseto, a alteração resultando em um aumento da aptidão do hospedeiro de inseto.

[0015] Em algumas modalidades de quaisquer das composições acima, o um ou mais micro-organismos podem ser uma bactéria ou fungo residente no hospedeiro. Em algumas modalidades, a bactéria residente no hospedeiro é pelo menos uma selecionada do grupo consistindo em Candidatus spp, Buchenera spp, Blattabacterium spp, Baumania spp, Wigglesworthia spp, Wolbachia spp, Rickettsia spp, Orientia spp, Sodalis spp, Burkholderia spp, Cupriavidus spp, Frankia spp, Snirhizobium spp, Streptococcus spp, Wolinella spp, Xylella spp, Erwinia spp, Agrobacterium spp, Bacillus spp, Paenibacillus spp, Streptomyces spp, Micrococcus spp, Corynebacterium spp, Acetobac- ter spp, Cyanobacteria spp, Salmonella spp, Rhodococcus spp, Pseudomonas spp, Lactobacillus spp, Enterococcus spp, Alcaligenes spp, Klebsiella spp, Paenibacillus spp, Arthrobacter spp, Corynebacterium spp, Brevibacterium spp, Thermus spp, Pseudomonas spp, Clostridium spp, e Escherichia spp. Em algumas modalidades, o fungo residente no hospedeiro é pelo menos um selecionado do grupo consistindo em Candida, Metschnikowia, Debaromyces, Starmerella, Pichia, Crypto-coccus, Pseudozyma, Symbiotaphrina bucneri, Symbiotaphrina kochii, Scheffersomyces shehatae, Scheffersomyces stipites, Cryptococcus, Trichosporon, Amylostereum areolatum, Epichloe spp, Pichia pinus, Hansenula capsulate, Daldinia decipien, Ceratocytis spp, Ophiostoma spp, e Attamyces bromatificus. Em certos casos, a bactéria é uma bactéria de ocorrência natural que é capaz de produzir nutrientes (por exemplo, aminoácidos, por exemplo, metionina).

[0016] Em quaisquer das composições acima, o agente, que daqui em diante também pode ser referido como agente modulador, pode alterar o crescimento, divisão, viabilidade, metabolismo, e/ou longevidade do micro-organismo residente no hospedeiro. Em quaisquer das modalidades acima, o agente modulador pode decrescer a viabilidade do um ou mais micro-organismos residentes no hospedeiro. Em algumas modalidades, o agente modulador aumenta o crescimento ou viabilidade do um ou mais micro-organismos residentes no hospedeiro.

[0017] Em quaisquer das modalidades acima, o agente modulador é um fago, um polipeptídeo, uma molécula pequena, um antibiótico, uma bactéria, ou qualquer combinação desses.

[0018] Em algumas modalidades, o fago se liga a uma proteína da superfície celular em uma bactéria residente no hospedeiro. Em algumas modalidades, o fago é virulento para uma bactéria residente no hospedeiro. Em algumas modalidades, o fago é pelo menos um selecionado do grupo consistindo em Myoviridae, Siphoviridae, Podoviri- dae, Lipothrixviridae, Rudiviridae, Ampullaviridae, Bicaudaviridae, Cla- vaviridae, Corticoviridae, Cystoviridae, Fuselloviridae, Gluboloviridae, Guttaviridae, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Plasmaviridae, e Tectiviridae.

[0019] Em algumas modalidades, o polipeptídeo é pelo menos um de uma bacteriocina, bacteriocina do tipo R, peptídeo rico em C específico para nódulos, peptídeo antimicrobiano, lisina, ou peptídeo regulador de bacteriócitos.

[0020] Em algumas modalidades, a molécula pequena é um me- tabólito.

[0021] Em algumas modalidades, o antibiótico é um antibiótico de largo espectro.

[0022] Em algumas modalidades, o agente modulador é uma bac téria de ocorrência natural. Em algumas modalidades, a bactéria é pelo menos uma selecionada do grupo consistindo em Bartonella apis, Parasaccharibacter apium, Frischella perrara, Snodgrassella alvi, Gilli- amela apicola, Bifidobacterium spp, e Lactobacillus spp. Em algumas modalidades, a bactéria é pelo menos uma selecionada do grupo con- sistindo em Candidatus spp, Buchenera spp, Blattabacterium spp, Baumania spp, Wigglesworthia spp, Wolbachia spp, Rickettsia spp, Orientia spp, Sodalis spp, Burkholderia spp, Cupriavidus spp, Frankia spp, Snirhizobium spp, Streptococcus spp, Wolinella spp, Xylella spp, Erwinia spp, Agrobacterium spp, Bacillus spp, Paenibacillus spp, Streptomyces spp, Micrococcus spp, Corynebacterium spp, Acetobac- ter spp, Cyanobacteria spp, Salmonella spp, Rhodococcus spp, Pseudomonas spp, Lactobacillus spp, Enterococcus spp, Alcaligenes spp, Klebsiella spp, Paenibacillus spp, Arthrobacter spp, Corynebacterium spp, Brevibacterium spp, Thermus spp, Pseudomonas spp, Clostridium spp, e Escherichia spp.

[0023] Em quaisquer das composições acima, a aptidão do hos pedeiro pode ser medida pela sobrevivência, reprodução, ou metabolismo do hospedeiro. Em algumas modalidades, o agente modu- lador modula a aptidão do hospedeiro por decréscimo da suscetibilidade a pesticidas do hospedeiro (por exemplo, suscetibilidade a um pesticida listado na Tabela 12). Em algumas modalidades, a suscetibilidade a pesticidas é suscetibilidade a bactericidas ou fungicidas. Em algumas modalidades, a suscetibilidade a pesticidas é suscetibilidade a inseticidas.

[0024] Em quaisquer das composições acima, a composição pode incluir uma pluralidade de diferentes agentes moduladores. Em algumas modalidades, a composição inclui um agente modulador e um agente pesticida (por exemplo, um pesticida listado na Tabela 12). Em algumas modalidades, o agente pesticida é um agente bactericida ou fungicida. Em algumas modalidades, o agente pesticida é um agente inseticida.

[0025] Em quaisquer das composições acima, o agente modulador pode ser ligado a uma segunda fração. Em algumas modalidades, a segunda fração é um agente modulador.

[0026] Em quaisquer das composições acima, o agente modulador pode ser ligado a um domínio de direcionamento. Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento dirige o agente modulador para um sítio-alvo no hospedeiro. Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento dirige o agente modulador para o um ou mais microorganismos residentes no hospedeiro.

[0027] Em quaisquer das composições acima, o agente modula- dor pode incluir uma pré- ou pró-sequência inativadora, desse modo formando um agente modulador precursor. Em algumas modalidades, o agente modulador precursor é convertido em uma forma ativa no hospedeiro.

[0028] Em quaisquer das composições acima, o agente modulador pode incluir um ligador. Em algumas modalidades, o ligador é um liga- dor clivável.

[0029] Em quaisquer das composições acima, a composição pode adicionalmente incluir um veículo. Em alguns casos, o veículo pode ser um veículo agricolamente aceitável.

[0030] Em quaisquer das composições acima, a composição pode adicionalmente incluir uma isca para o hospedeiro, um agente pegajoso, ou uma combinação desses. Em algumas modalidades, a isca para o hospedeiro é um agente comestível e/ou um quimioatrator.

[0031] Em quaisquer das composições acima, a composição pode estar a uma dose eficaz para modular a aptidão do hospedeiro.

[0032] Em quaisquer das modalidades acima, o agente modulador da composição pode ser eficaz para aumentar a produção de um nutriente no hospedeiro relativamente a um nível de referência. Em algumas modalidades, o agente modulador é um micro-organismo que produz o nutriente. Em algumas modalidades, o micro-organismo é uma bactéria. Em algumas modalidades, o nutriente é uma vitamina, um carboidrato, um aminoácido, ou um polipeptídeo. Em certas moda- lidades, o aminoácido é metionina.

[0033] Em quaisquer das composições acima, a composição pode ser formulada para administração a um micro-organismo habitando o intestino do hospedeiro. Em quaisquer das composições acima, a composição pode ser formulada para administração a um microorganismo habitando um bacteriócito do hospedeiro e/ou o intestino do hospedeiro. Em algumas modalidades, a composição pode ser formulada para administração a uma planta. Em algumas modalidades, a composição pode ser formulada para uso em uma estação de nutrição do hospedeiro.

[0034] Em quaisquer das composições acima, a composição pode ser formulada como um líquido, um pó, grânulos, ou nanopartículas. Em algumas modalidades, a composição é formulada como uma selecionada do grupo consistindo em um lipossomo, polímero, peptídeo de secreção bacteriana, e nanocápsula sintética. Em algumas modalidades, a nanocápsula sintética administra a composição em um sítio-alvo no hospedeiro. Em algumas modalidades, o sítio-alvo é o intestino do hospedeiro. Em algumas modalidades, o sítio-alvo é um bacteriócito no hospedeiro.

[0035] Em um aspecto adicional, também são proporcionados aqui hospedeiros que incluem quaisquer das composições acima. Em algumas modalidades, o hospedeiro é um inseto. Em algumas modalidades, o inseto é uma espécie pertencente à ordem Anoplura, Araneae, Blattodea, Coleoptera, Dermaptera, Dictyoptera, Diplura, Diptera, Embioptera, Ephemeroptera, Grylloblatodea, Hemiptera, Homoptera, Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera, Mantodea, Mecoptera, Neuroptera, Odonata, Orthoptera, Phasmida, Plecoptera, Protura, Psocoptera, Siphonaptera, Siphunculata, Thysanura, Strepsiptera, Thysanoptera, Trichoptera, ou Zoraptera. Em certas modalidades, o inseto é um grilo. Em certas modalidades, o inseto é um gafanhoto. Em certas modalidades, o inseto é um acrídio.

[0036] Ainda em outro aspecto, também é proporcionado aqui um sistema para modular a aptidão de um hospedeiro compreendendo um agente modulador que visa um micro-organismo que é requerido para a aptidão de um hospedeiro, em que o sistema é eficaz para modular a aptidão do hospedeiro, e em que o hospedeiro é um inseto. O agente modulador pode incluir quaisquer das composições descritas aqui. Em algumas modalidades, o agente modulador é formulado como um pó. Em algumas modalidades, o agente modulador é formulado como um solvente. Em algumas modalidades, o agente modulador é formulado como um concentrado. Em algumas modalidades, o agente modulador é formulado como um diluente. Em algumas modalidades, o agente modulador é preparado para administração por combinação de quais-quer das composições anteriores com um veículo.

[0037] Em outro aspecto, também são proporcionados aqui méto dos para modular a aptidão de um inseto usando quaisquer das composições descritas aqui. Em um caso, o método de modulação da aptidão de um hospedeiro de inseto inclui administrar a composição de qualquer uma das reivindicações anteriores ao hospedeiro, em que o agente modulador visa o um ou mais micro-organismos residentes no hospedeiro, e desse modo modula a aptidão do hospedeiro. Em outro caso, o método de modulação da diversidade microbiana em um hospedeiro de inseto inclui administrar a composição de qualquer uma das reivindicações anteriores ao hospedeiro, em que o agente modulador visa o um ou mais micro-organismos residentes no hospedeiro, e desse modo modula a diversidade microbiana no hospedeiro.

[0038] Em algumas modalidades de quaisquer dos métodos aci ma, o agente modulador pode alterar os níveis do um ou mais micro-organismos residentes no hospedeiro. Em algumas modalidades de quaisquer dos métodos acima, o agente modulador pode alterar a fun- ção do um ou mais micro-organismos residentes no hospedeiro. Em algumas modalidades, o um ou mais micro-organismos podem ser uma bactéria e/ou fungo. Em algumas modalidades, o um ou mais micro-organismos são requeridos para a aptidão do hospedeiro. Em algumas modalidades, o um ou mais micro-organismos são requeridos para a sobrevivência do hospedeiro.

[0039] Em algumas modalidades de quaisquer dos métodos acima, o passo de administração pode incluir proporcionar o agente modulador a uma dose e tempo suficientes para afetar o um ou mais microorganismos, desse modo modulando a diversidade microbiana no hospedeiro. Em algumas modalidades, o passo de administração inclui aplicação tópica de quaisquer das composições anteriores em uma planta. Em algumas modalidades, o passo de administração inclui proporcionar o agente modulador através de uma planta geneticamente manipulada. Em algumas modalidades, o passo de administração inclui proporcionar o agente modulador ao hospedeiro na forma de um produto comestível. Em algumas modalidades, o passo de administração inclui proporcionar um hospedeiro contendo o agente modulador. Em algumas modalidades, o hospedeiro contendo o agente modulador pode transmitir o agente mo- dulador a um ou mais hospedeiros adicionais.

[0040] Em algumas modalidades de quaisquer dos métodos aci ma, a composição é eficaz para aumentar a saúde e/ou sobrevivência do hospedeiro. Em algumas modalidades, a composição é eficaz para aumentar a aptidão do hospedeiro, aumentar a expectativa de vida do hospedeiro, aumentar uma polinização eficaz, aumentar a geração de um produto do hospedeiro, aumentar a reprodução do hospedeiro, ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, a composição é eficaz para decrescer a sensibilidade do hospedeiro a um agente pesticida (por exemplo, um pesticida listado na Tabela 12). Em algumas modalidades, o agente pesticida é um neonicotinoide. Em algumas modalidades, a composição é eficaz para aumentar a resistência do hospedeiro a um agente aleloquímico produzido por uma planta. Em algumas modalidades, o agente aleloquímico é tóxico para o hospedeiro antes da administração da composição. Em algumas modalidades, o agente aleloquímico é cafeína, cistatina de sementes de soja N, mo- noterpenos, ácidos de diterpenos, ou compostos fenólicos. Em algumas modalidades, a composição é eficaz para aumentar a produção de nutrientes no hospedeiro, desse modo aumentando o teor de nutrientes no produto derivado do hospedeiro. Em algumas modalidades, o nutriente é uma vitamina, um carboidrato, um aminoácido, ou um poli- peptídeo.

[0041] Em algumas modalidades de quaisquer dos métodos aci ma, pelo menos uma parte do hospedeiro pode ser usada na fabricação de um produto consumível. Em algumas modalidades de quaisquer dos métodos acima, o hospedeiro é um inseto. Em algumas modalidades, o inseto é uma espécie pertencente à ordem Anoplura, Ara- neae, Blattodea, Coleoptera, Dermaptera, Dictyoptera, Diplura, Dipte- ra, Embioptera, Ephemeroptera, Grylloblatodea, Hemiptera, Homopte- ra, Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera, Mantodea, Mecoptera, Neu- roptera, Odonata, Orthoptera, Phasmida, Plecoptera, Protura, Psocop- tera, Siphonaptera, Siphunculata, Thysanura, Strepsiptera, Thysanop- tera, Trichoptera, ou Zoraptera. Em certas modalidades, o inseto é um grilo. Em certas modalidades, o inseto é um gafanhoto. Em certas modalidades, o inseto é um acrídio. Em algumas modalidades, o produto inclui um produto alimentar para humanos. Em algumas modalidades, o produto inclui um suplemento nutricional que suplementa uma ração para animais ou produto alimentar para humanos. Em algumas modalidades, o produto inclui ração para animais. Em algumas modalidades, os animais consistem em gado ou animais de herdade.

[0042] Em outro aspecto, é proporcionado aqui um método para fabricar um produto alimentar para humanos ou animais, que inclui (a) proporcionar uma pluralidade (por exemplo, 2, >2, >5, >10, >100, >1000, >5 000, >10 000, > 50 000, >100 000) de insetos hospedeiros, (b) administrar uma composição que pode ser ingerida descrita aqui à pluralidade de insetos hospedeiros, em uma quantidade eficaz para modular um ou mais micro-organismos residentes na pluralidade, e (c) processar a pluralidade (por exemplo, triturar, opcionalmente misturar com um veículo ou outro componente alimentício) em um alimento, aditivo alimentar, ou suplemento alimentar. Em algumas modalidades, a composição que pode ser ingerida compreende um microorganismo. Em algumas modalidades, o micro-organismo produz um nutriente, e o micro-organismo é eficaz para aumentar a produção de nutrientes no hospedeiro relativamente a um nível de referência. Em algumas modalidades, o micro-organismo é uma bactéria. Em algumas modalidades, o nutriente é uma vitamina, um carboidrato, um aminoá- cido, ou um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o aminoácido é metionina.

[0043] Em algumas modalidades de quaisquer dos métodos aci ma, o passo de administração inclui administrar quaisquer das composições anteriores a uma planta. Em algumas modalidades, a planta é uma cultura agrícola. Em algumas modalidades, a cultura é uma cultura não colhida no momento da administração. Em algumas modalidades, a cultura é uma cultura colhida no momento da administração. As algumas modalidades, a cultura compreende frutos ou legumes colhidos. Em algumas modalidades, a composição é administrada em uma quantidade e durante um período de tempo eficaz para aumentar crescimento da cultura. Em algumas modalidades, a cultura inclui plantas de milho, soja, ou trigo.

[0044] Em outro aspecto, também são proporcionados aqui ensai os de rastreio para identificar um agente modulador que modula a ap- tidão de um hospedeiro. Em um caso, o ensaio de rastreio para identificar um agente modulador que modula a aptidão de um hospedeiro inclui os passos de (a) expor um micro-organismo que pode residir no hospedeiro a um ou mais agentes moduladores candidatos e (b) identificar um agente modulador que aumenta ou decresce a aptidão do hospedeiro.

[0045] Em algumas modalidades do ensaio de rastreio, o agente modulador é um micro-organismo residente no hospedeiro. Em algumas modalidades, o micro-organismo é uma bactéria. Em algumas modalidades, a bactéria, quando residente no hospedeiro, aumenta a aptidão do hospedeiro. Em algumas modalidades, a bactéria degrada um pesticida (por exemplo, um pesticida listado na Tabela 12). Em algumas modalidades, o pesticida é um neonicotinoide. Em algumas modalidades, a bactéria secreta um aminoácido. Em algumas modalidades, em que o aminoácido é metionina.

[0046] Em algumas modalidades do ensaio de rastreio, o agente modulador afeta um micro-organismo de degradação aleloquímica. Em algumas modalidades, o agente modulador é um fago, um antibiótico, ou um composto de teste. Em algumas modalidades, o antibiótico é timentina ou azitromicina.

[0047] Em algumas modalidades do ensaio de rastreio, o hospe deiro pode ser um invertebrado. Em algumas modalidades, o invertebrado é um inseto. Em algumas modalidades, o inseto é um grilo. Em certas modalidades, o inseto é um gafanhoto. Em certas modalidades, o inseto é um acrídio.

[0048] Em quaisquer das modalidades acima do ensaio de ras- treio, a aptidão do hospedeiro pode ser modulada por modulação da microbiota do hospedeiro.

Definições

[0049] Como usado aqui, o termo "bacteriocina" se refere a um peptídeo ou polipeptídeo que possui propriedades antimicrobianas. Bacteriocinas de ocorrência natural são produzidas por certos procariotas e atuam contra organismos relacionados com a estirpe produtora, mas não contra a própria estirpe produtora. Bacteriocinas contempladas aqui incluem, mas não se limitam a, bacteriocinas de ocorrência natural, como bacteriocinas produzidas por bactérias, e seus derivados, como bacteriocinas manipuladas, bacteriocinas recombinante- mente expressas, e bacteriocinas quimicamente sintetizadas. Em alguns casos, a bacteriocina é uma variante funcionalmente ativa das bacteriocinas descritas aqui. Em alguns casos, a variante da bacterio- cina tem pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo de uma região especificada ou ao longo de toda a sequência, com uma sequência de uma bacteriocina descrita aqui ou uma bacteriocina de ocorrência natural.

[0050] Como usado aqui, o termo "bacteriócito" se refere a uma célula especializada presente em certos insetos onde bactérias intracelulares residem com propriedades bacterianas simbióticas.

[0051] Como usado aqui, o termo "quantidade eficaz" se refere a uma quantidade de um agente modulador (por exemplo, um fago, lisina, bacteriocina, molécula pequena, ou antibiótico) ou composição incluindo o referido agente suficiente para efetivar o resultado indicado, por exemplo, para aumentar ou promover a aptidão de um organismo hospedeiro (por exemplo, inseto); para alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) da concentração de um agente modulador dentro de um hospedeiro-alvo; para alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) da concentração de um agente modulador dentro do intestino de um hospedeiro- alvo; para alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predetermi- nado ou limite) da concentração de um agente modulador dentro de um bacteriócito do hospedeiro-alvo; para modular o nível, ou uma atividade, de um ou mais micro-organismos (por exemplo, endossimbion- te) no hospedeiro-alvo.

[0052] Como usado aqui, o termo "aptidão" se refere à capacidade de um organismo hospedeiro para sobreviver, e/ou para produzir descendência sobrevivente. A aptidão de um organismo pode ser medida por um ou mais parâmetros, incluindo, mas não se limitando a, expectativa de vida, produção de nutrientes, taxa reprodutiva, mobilidade, peso do corpo, e taxa metabólica. A aptidão pode adicionalmente ser medida com base em medidas de atividade ou produção de produtos.

[0053] Como usado aqui, o termo "intestino" se refere a qualquer porção do intestino de um hospedeiro, incluindo o intestino anterior, intestino médio, ou intestino posterior do hospedeiro.

[0054] Como usado aqui, o termo "hospedeiro" se refere a um or ganismo (por exemplo, inseto) contendo micro-organismos residentes (por exemplo, micro-organismos endógenos, micro-organismos endos- simbióticos (por exemplo, endossimbiontes primários ou secundários), organismos comensais, e/ou micro-organismos patogênicos).

[0055] Como usado aqui, "aumentar a aptidão do hospedeiro" ou "promover a aptidão do hospedeiro" se refere a qualquer alteração favorável da fisiologia do hospedeiro, ou qualquer atividade realizada pelo referido hospedeiro, em consequência da administração de um agente modulador, incluindo, mas não se limitando a, qualquer um ou mais dos seguintes efeitos desejados: (1) aumentar a população de um hospedeiro em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (2) aumentar a taxa reprodutiva de um hospedeiro (por exemplo, inseto) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (3) aumentar a mobilidade de um hospedeiro (por exemplo, inseto) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (4) aumentar o peso do corpo de um hospedeiro (por exemplo, inseto) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (5) aumentar a taxa metabólica ou atividade de um hospedeiro (por exemplo, inseto) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (6) aumentar a produção de produtos secundários por um hospedeiro em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (7) aumentar o teor de nutrientes do hospedeiro (por exemplo, inseto) (por exemplo, proteína, ácidos graxos, ou aminoácidos) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; ou (8) aumentar a resistência do hospedeiro a pesticidas em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais. Um aumento da aptidão do hospedeiro pode ser determinado em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado.

[0056] O termo "inseto" inclui qualquer organismo pertencente ao filo Arthropoda e à classe Insecta ou à classe Arachnida, em qualquer estágio de desenvolvimento, isto é, insetos imaturos e adultos.

[0057] Como usado aqui, "lisina", também conhecido como endoli sina, autolisina, mureína hidrolase, peptídeoglicano hidrolase, ou hi- drolase da parede celular, se refere a uma enzima hidrolítica que pode proceder à lise de uma bactéria por clivagem de peptídeoglicano na parede celular da bactéria. Lisinas contempladas aqui incluem, mas não se limitam a, lisinas de ocorrência natural, como lisinas produzidas por fagos, lisinas produzidas por bactérias, e seus derivados, como lisinas manipuladas, lisinas recombinantemente expressas, e lisinas quimicamente sintetizadas. Uma variante funcionalmente ativa da bac- teriocina pode ter pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo de uma região especificada ou ao longo de toda a sequência, com uma sequência de uma bacteriocina sintética, recombinante ou naturalmente derivada, incluindo qualquer descrita aqui.

[0058] Como usado aqui, o termo "micro-organismo" se refere a bactérias ou fungos. Micro-organismos pode se referir microorganismos residentes em um organismo hospedeiro (por exemplo, micro-organismos endógenos, micro-organismos endossimbióticos (por exemplo, endossimbiontes primários ou secundários) ou microorganismos exógenos ao hospedeiro, incluindo os que podem atuar como agentes moduladores. Como usado aqui, o termo "micro- organismo-alvo" se refere a um micro-organismo que reside no hospedeiro e sofre impacto por um agente modulador, direta ou indiretamente.

[0059] Como usado aqui, o termo "agente modulador" ou "agente" se refere a um agente que é capaz de alterar os níveis e/ou funcionamento de micro-organismos residentes em um organismo hospedeiro (por exemplo, inseto), e desse modo modular (por exemplo, aumentar) a aptidão do organismo hospedeiro (por exemplo, inseto).

[0060] Como usado aqui, "aumentar o perfil nutricional de um inseto" se refere a produção aumentada de um nutriente que pode aumentar o teor proteico, massa corporal, e/ou valor nutricional global do inseto.

[0061] Como usado aqui, o termo "pesticida" ou "agente pesticida" se refere a uma substância que pode ser usada no controle de pragas agrícolas, ambientais, ou domésticas/domiciliares, como insetos, fungos, bactérias, ou vírus. É entendido que o termo "pesticida" abrange inseticidas de ocorrência natural ou sintéticos (larvicidas ou adultici- das), reguladores do crescimento de insetos, acaricidas (miticidas), nematicidas, ectoparasiticidas, bactericidas, fungicidas, ou herbicidas (substância que pode ser usada em agricultura para controlar ou modi- ficar o crescimento de plantas). Exemplos adicionais de pesticidas ou agentes pesticidas são listados na Tabela 12. Em alguns casos, o pesticida é um aleloquímico. Como usado aqui, "aleloquímico" ou "agente aleloquímico" é uma substância produzida por um organismo que pode efetivar uma função fisiológica (por exemplo, a germinação, crescimento, sobrevivência, ou reprodução) de outro organismo (por exemplo, um inseto hospedeiro).

[0062] Como usado aqui, o termo "peptídeo," "proteína," ou "poli- peptídeo" abrange qualquer cadeia de aminoácidos de ocorrência natural ou não natural (D- ou L-aminoácidos), independentemente do comprimento (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 40, 50, 100, ou mais aminoácidos), da presença ou ausência de modificações pós-tradução (por exemplo, glicosilação ou fosforilação), ou da presença, por exemplo, de um ou mais grupos não aminoacila (por exemplo, açúcar, lipídeo, etc.) covalentemente ligados ao peptídeo, e inclui, por exemplo, proteínas naturais, polipeptídeos e peptídeos sintéticos, ou recombinantes, moléculas híbridas, peptoides, ou peptideomiméticos.

[0063] Como usado aqui, "percentagem de identidade" entre duas sequências é determinada pelo algoritmo BLAST 2.0, que é descrito em Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Software para realizar análises de BLAST é publicamente disponibilizado pelo National Center for Biotechnology Information.

[0064] Como usado aqui, o termo "bacteriófago" ou "fago" se refe re a um vírus que infeta e se replica em bactérias. Bacteriófagos se replicam dentro de bactérias após a injeção do seu genoma no citoplasma e o fazem usando um ciclo lítico, que resulta em lise de células bacterianas, ou um ciclo lisogênico (não lítico), que deixa a célula bac- teriana intata. O fago pode ser um isolado de fago de ocorrência natural, ou um fago manipulado, incluindo vetores, ou ácidos nucleicos que codificam um genoma parcial do fago (por exemplo, incluindo pelo menos todos os genes essenciais necessários para conduzir o ciclo de vida do fago dentro de uma bactéria hospedeira) ou o genoma completo do fago.

[0065] Como usado aqui, o termo "planta" se refere a plantas completas, órgãos de plantas, tecidos de plantas, sementes, células de plantas, sementes, ou progênie das mesmas. Células de plantas incluem, sem limitação, células de sementes, culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calos, folhas, raízes, rebentos, gametófitos, esporófitos, pólen, ou microesporos. Partes de plantas incluem tecidos diferenciados ou indiferenciados incluindo, mas não se limitando aos seguintes: raízes, caules, rebentos, folhas, pólen, sementes, tecido tumoral, e várias formas de células e cultura (por exemplo, células isoladas, protoplastos, embriões, ou tecido de calos). O tecido de planta pode estar em uma planta ou em um órgão, tecido, ou cultura de células de planta. Adicionalmente, uma planta pode ser geneticamente manipulada para produzir uma proteína ou RNA heterólogo, por exemplo, de qualquer um dos agentes modulado- res nos métodos ou composições descritos aqui.

[0066] Os termos "obtenível por", "produzível por" ou similares são usados para indicar que uma reivindicação ou modalidade se refere a um composto, composição, produto, etc. per se, isto é, que o composto, composição, produto, etc. pode ser obtido ou produzido por um método que é descrito para a fabricação do composto, composição, produto, etc., mas que o composto, composição, produto, etc. também pode ser obtido ou produzido por outros métodos diferentes do descrito. Os termos "obtido por", "produzido por" ou similares indicam que o composto, composição, produto, é obtido ou produzido por um método específico apresentado. Deve ser entendido que os termos "obtenível por", "produzível por" e similares também revelam os termos "ob- tido por", "produzido por" e similares como uma modalidade preferencial de "obtenível por", "produzível por" e similares.

[0067] Outras características e vantagens da invenção serão cla ras a partir da seguinte Descrição Detalhada e das Reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0068] É pretendido que as figuras sejam ilustrativas de uma ou mais características, aspectos, ou modalidades da invenção e não é pretendido que sejam limitadoras.

[0069] A Figura 1 é um gráfico mostrando o tempo até alcançarem a fase adulta de embriões em Drosophila melanogaster. Embriões de Drosophila melanogaster foram criados em dieta semeada com Corynebac- terium glutamicum (uma estirpe que produz glutamato - C. glutamicum Glu) ou em dieta axênica sem quaisquer bactérias. A percentagem de adultos emergindo de suas pupas foi medida a cada 12 horas desde o tempo da emergência do primeiro adulto. Os organismos criados em dieta suplementada com bactérias alcançaram a fase adulta mais rapidamente do que os seus correspondentes sem bactérias.

[0070] A Figura 2A é um gráfico mostrando os efeitos do gênero masculino nas diferenças da taxa de desenvolvimento em Drosophila me- lanogaster. Os adultos emergindo da Figura 1 foram classificados quanto ao sexo e a sua taxa de emergência foi representada graficamente.

[0071] A Figura 2B é um gráfico mostrando os efeitos do gênero feminino nas diferenças da taxa de desenvolvimento em Drosophila melanogaster. Os adultos emergindo da Figura 1 foram classificados quanto ao sexo e a sua taxa de emergência foi representada graficamente. A intensificação da taxa de desenvolvimento nas fêmeas devido à presença de bactérias na dieta é significativamente maior do que em seus correspondentes machos. Os benefícios da presença de bactérias na dieta das moscas são mais elevados nas fêmeas em comparação com os machos.

[0072] A Figura 3 é um gráfico mostrando que estirpes de C. glu- tamicum promoveram a biomassa de larvas. Larvas criadas em dieta suplementada com estirpes de C. glutamicum produzindo glutamato ou metionina são maiores do que as criadas em dieta esterilizada ou dieta suplementada com Escherichia coli. As áreas das larvas são medidas como o número de píxeis nas imagens das larvas. As medianas e os intervalos de confiança de 95% são mostrados como linhas no gráfico.

[0073] A Figura 4 é um painel de gráficos mostrando os resultados de um ensaio de fluxo Seahorse quanto à respiração bacteriana. Bactérias cresceram até à fase logarítmica e foram carregadas em placas Seahorse XFe96 para medições temporais da taxa de consumo de oxigênio (OCR) e taxa de acidificação extracelular (ECAR) como descrito em métodos. Os tratamentos foram injetados nos poços após aproximadamente 20 minutos e as bactérias foram monitoradas para detectar alterações no crescimento. Rifampicina = 100 μg/mL; Cloram- fenicol = 25 μg/mL; Fagos (T7 para E. coli e ΦSmVL-C1 para Serratia marcescens) lisados foram diluídos 1:2 ou 1:100 em Tampão SM. Os marcadores em cada linha são apenas proporcionados como indicadores da condição a que cada linha corresponde, e não são indicadores dos pontos de dados.

[0074] A Figura 5 é um gráfico mostrando que um fago contra S. marcescens reduziu a mortalidade das moscas. As moscas que foram picadas com S. marcescens morreram todas em um período de um dia, ao passo que uma porção considerável das moscas que foram picadas com ambos de S. marcescens e o fago sobreviveu durante cinco dias após o tratamento. Quase todas as moscas de controle que não foram tratadas de modo nenhum sobreviveram até ao fim da experiência. O teste Log-rank foi usado para comparar as curvas para signi- ficância estatística, asterisco designa p<0,0001.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0075] São proporcionados aqui métodos e composições para aplicações alimentares e de rações, por exemplo, para alterar um nível, atividade, ou metabolismo de um ou mais micro-organismos residentes em um inseto hospedeiro, a alteração resultando em um aumento da aptidão do hospedeiro. A invenção apresenta uma composição que inclui um agente modulador (por exemplo, fago, peptídeo, molécula pequena, antibiótico, ou suas combinações) que pode alterar a microbiota do hospedeiro de um modo que é benéfico para o hospedeiro. Ao promover níveis microbianos, atividade microbiana, metabolismo microbiano, e/ou diversidade microbiana favoráveis, o agente modulador descrito aqui pode ser usado para aumentar a aptidão de uma variedade de insetos utilizados nas indústrias de alimentos para humanos e rações para animais.

[0076] Os métodos e composições descritos aqui são baseados, em parte, nos exemplos que ilustram como diferentes agentes, por exemplo, micro-organismos produtores de metionina, podem ser usados em hospedeiros de insetos como um grilo, uma mosca, um gafanhoto, ou um acrídio, para melhorar indiretamente a saúde (por exemplo, aumentar o teor de metionina, massa corporal, taxa de desenvolvimento, e/ou sobrevivência) destes hospedeiros por alteração do nível, atividade ou metabolismo de micro-organismos dentro destes hospedeiros. Micro-organismos produtores de metionina são um exemplo representativo de micro-organismos produtores de aminoácidos e mais geralmente são representativos de micro-organismos produtores de nutrientes, e outros micro-organismos deste tipo podem ser úteis na invenção. Nesta base, a presente revelação descreve uma variedade de diferentes abordagens para o uso de agentes que alteram um nível, atividade, ou metabolismo de um ou mais micro-organismos residentes em um hospedeiro, a alteração resultando em uma modulação da aptidão do hospedeiro.

I. Hospedeiros i. Insetos

[0077] O hospedeiro de quaisquer das composições ou métodos descritos aqui pode ser qualquer organismo pertencente ao filo Arthropo- da (por exemplo, insetos), incluindo quaisquer artrópodes descritos aqui. Em alguns casos, o hospedeiro pode ser um inseto ou um aracnídeo que pode ser cultivado para um produto consumível (por exemplo, alimento ou ração). Por exemplo, o hospedeiro pode ser uma traça, borboleta, mosca, grilo, gafanhoto, acrídio, aranha, ou besouro. Em alguns casos, o hospedeiro é da ordem Anoplura, Araneae, Blattodea, Coleoptera, Der- maptera, Dictyoptera, Diplura, Diptera, Embioptera, Ephemeroptera, Grylloblatodea, Hemiptera, Homoptera, Hymenoptera, Isoptera, Lepidop- tera, Mantodea, Mecoptera, Neuroptera, Odonata, Orthoptera, Phasmida, Plecoptera, Protura, Psocoptera, Siphonaptera, Siphunculata, Thysanura, Strepsiptera, Thysanoptera, Trichoptera, ou Zoraptera.

[0078] Em alguns exemplos, o hospedeiro é uma mosca soldado negro (Hermetia illucens), uma mosca doméstica comum, um besouro cascudinho, uma formiga tecedeira, um bicho-da-seda (Bombyx mori), um gafanhoto, um gafanhoto chinês (Acrida cinerea), um bagre africano (Clarias gariepinns), uma traça (Anaphe infracta ou Bombyx mori), Spodoptera littoralis, um grilo doméstico, uma térmita, um escaravelho das palmeiras (Rhynchophorus ferruginens), uma barata-de-água- gigante (Lethocerus indicus), um besouro aquático, uma térmita (Ma- crotermes subhyalinus), um besouro da farinha (Stegobium paniceum), Imbrasia belina, Rhynchophorus phoenicis, Oryctes rhinoceros, Macro- termes bellicosus, Ruspolia differens, Oryctes Monoceros, ou Oeco- phylla smaragdina.

[0079] Em casos particulares, os agentes moduladores revelados aqui podem ser usados para aumentar a aptidão de grilos, gafanhotos, ou acrídios.

[0080] O hospedeiro pode estar em qualquer estágio do desenvol vimento. Por exemplo, o hospedeiro pode ser um embrião, uma larva, uma pupa, ou um adulto.

ii. Aptidão de Hospedeiros

[0081] Os métodos e composições proporcionados aqui podem ser usados para aumentar a aptidão de quaisquer dos hospedeiros descritos aqui. O aumento da aptidão pode surgir de quaisquer alterações em micro-organismos residentes no hospedeiro, em que as alterações são uma consequência da administração de um agente modulador e têm efeitos benéficos ou vantajosos no hospedeiro.

[0082] Em alguns casos, o aumento da aptidão do hospedeiro po de se manifestar como uma melhoria da fisiologia do hospedeiro (por exemplo, saúde ou sobrevivência melhorada) em consequência da administração de um agente modulador. Em alguns casos, a aptidão de um organismo pode ser medida por um ou mais parâmetros, incluindo, mas não se limitando a, taxa reprodutiva, expectativa de vida, mobilidade, fecundidade, peso do corpo, taxa metabólica ou atividade, ou sobrevivência em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Por exemplo, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para melhorar a saúde global do hospedeiro ou para melhorar a sobrevivência global do hospedeiro em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, a sobrevivência melhorada do hospedeiro é cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% maior relativamente a um nível de referência (por exemplo, um nível presente em um hospedeiro que não recebe um agente mo- dulador). Em alguns casos, os métodos e composições são eficazes para aumentar a reprodução (por exemplo, taxa reprodutiva) do hospedeiro em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, os métodos e composições são eficazes para aumentar outros parâmetros fisiológicos, como mobilidade, peso do corpo, expectativa de vida, fecundidade, ou taxa metabólica, em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% relativamente a um nível de referência (por exemplo, um nível presente em um hospedeiro que não recebe um agente modulador).

[0083] Em alguns casos, o aumento da aptidão do hospedeiro po de se manifestar como um aumento da produção de um ou mais nutrientes no hospedeiro (por exemplo, vitaminas, carboidratos, aminoáci- dos, ou polipeptídeos) em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para aumentar a produção de nutrientes no hospedeiro (por exemplo, vitaminas, carboidratos, aminoácidos, ou polipeptídeos) em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% relativamente a um nível de referência (por exemplo, um nível presente em um hospedeiro que não recebe um agente modulador). Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem aumentar nutrientes no hospedeiro por aumento da produção de nutrientes por um ou mais micro-organismos (por exemplo, endossimbionte) no hospedeiro em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado.

[0084] Em alguns casos, o aumento da aptidão do hospedeiro pode se manifestar como um decréscimo da sensibilidade do hospedeiro a um agente pesticida (por exemplo, um pesticida listado na Tabela 12) e/ou um aumento da resistência do hospedeiro a um agente pesticida (por exemplo, um pesticida listado na Tabela 12) em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para decrescer a sensibilidade do hospedeiro a um agente pesticida em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% relativamente a um nível de referência (por exemplo, um nível presente em um hospedeiro que não recebe um agente modulador). O agente pesticida pode ser qualquer agente pesticida conhecido na técnica, incluindo agentes inseticidas. Em alguns casos, o agente pesticida é um neonicotinoide. Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem decrescer a sensibilidade do hospedeiro a um agente pesticida (por exemplo, um pesticida listado na Tabela 12) por aumento da capacidade do hospedeiro para metabolizar ou degradar o agente pesticida em substratos usáveis em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado.

[0085] Em alguns casos, o aumento da aptidão do hospedeiro po de se manifestar como um decréscimo da sensibilidade do hospedeiro a um agente aleloquímico e/ou um aumento da resistência do hospedeiro a um agente aleloquímico em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para aumentar a resistência do hospedeiro a um agente aleloquímico em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% relativamente a um nível de referência (por exemplo, um nível presente em um hospedeiro que não recebe um agente modulador). Em alguns casos, o agente alelo- químico é cafeína, cistatina de sementes de soja N, monoterpenos, ácidos de diterpenos, ou compostos fenólicos em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administra-do. Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem decrescer a sensibilidade do hospedeiro a um agente ale- loquímico por aumento da capacidade do hospedeiro para metabolizar ou degradar o agente aleloquímico em substratos usáveis em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado.

[0086] Em alguns casos, os métodos ou composições proporcio nados aqui podem ser eficazes para aumentar a resistência do hospedeiro a parasitas ou patógenos (por exemplo, patógenos fúngicos, bac- terianos, ou virais; ou ácaros parasitários) em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para aumentar a resistência do hospedeiro a um patógeno ou parasita (por exemplo, patógenos fúngicos, bacteria- nos, ou virais; ou ácaros parasitários) em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% relativamente a um nível de referência (por exemplo, um nível presente em um hospedeiro que não recebe um agente modulador).

[0087] Em alguns casos, o aumento da aptidão do hospedeiro po de se manifestar como outras vantagens de aptidão, como tolerância melhorada a certos fatores ambientais (por exemplo, uma tolerância a temperatura elevada ou baixa), capacidade melhorada para sobreviver em certos habitats, ou uma capacidade melhorada para manter uma certa dieta (por exemplo, uma capacidade melhorada para metabolizar soja versus milho) em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para aumentar a aptidão do hospedeiro em qualquer pluralidade de modos descritos aqui. Além disso, o agente modulador pode aumentar a aptidão do hospedeiro em qualquer número de classes, ordens, famílias, gêneros, ou espécies de hospedeiros (por exemplo, 1 espécie de hospedeiro, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 200, 250, 500, ou mais espécies de hospedeiros). Em alguns casos, o agente modulador atua em uma única classe, ordem, família, gênero, ou espécie de hospedeiro.

[0088] A aptidão do hospedeiro pode ser avaliada usando quais quer métodos padrão da técnica. Em alguns casos, a aptidão do hospedeiro pode ser avaliada por avaliação de um hospedeiro individual. Alternativamente, a aptidão do hospedeiro pode ser avaliada por avaliação de uma população de hospedeiros. Por exemplo, um aumento da aptidão do hospedeiro pode se manifestar como um aumento da competição bem-sucedida contra outros insetos, desse modo conduzindo a um aumento do tamanho da população do hospedeiro.

iii. Insetos hospedeiros na produção de rações/alimentos

[0089] Ao alcançar um estágio de vida desejado, o hospedeiro po de ser recolhido e, se desejado, processado para uso na fabricação de um produto consumível. Em alguns casos, o inseto recolhido pode ser distribuído em uma forma completa (por exemplo, como o inseto completo, não processado) como produto consumível. Em alguns casos, o inseto recolhido completo é processado (por exemplo, triturado) e distribuído como um produto consumível. Alternativamente, uma ou mais partes do inseto (por exemplo, uma ou mais partes do corpo ou uma ou mais substâncias) podem ser extraídas do inseto para uso na fabricação de um produto consumível.

[0090] O produto consumível pode ser qualquer produto seguro para consumo (por exemplo, ingestão) humano ou animal. Em alguns casos, o hospedeiro pode ser usado na fabricação de uma ração para um animal. Em alguns casos, o animal é gado ou um animal de herdade (por exemplo, galinha, vaca, cavalo, ou porco). Em alguns casos, o animal é um pássaro, réptil, anfíbio, mamífero, ou peixe. Em alguns casos, o hospedeiro pode ser usado na fabricação de um produto que substitui a ração normal de um animal. Alternativamente, o hospedeiro pode ser usado na fabricação de um produto que suplementa a ração normal de um animal. O hospedeiro também pode ser usado na fabricação de um alimento, aditivo alimentar, ou ingrediente alimentar para humanos. Em alguns casos, o hospedeiro é usado na fabricação de um suplemento nutricional (por exemplo, suplemento proteico) para humanos.

[0091] O hospedeiro pode ser um inseto selvagem ou domestica do. Adicionalmente, o hospedeiro pode estar em qualquer estágio do desenvolvimento no momento da administração ou aplicação das composições descritas aqui. Além disso, o hospedeiro pode estar em qualquer estágio do desenvolvimento no momento da recolha do hospedeiro para uso na fabricação de um produto consumível. Em alguns casos, o hospedeiro é uma larva, pupa, ou inseto adulto no momento da recolha, uso, processamento, ou fabricação. A administração do agente modulador e os passos de recolha podem ocorrer no mesmo momento ou em momentos diferentes.

[0092] Em alguns casos, uma espécie de inseto é selecionada com base em seu perfil nutricional natural. Em alguns casos, o agente modulador é usado para melhorar o perfil nutricional do inseto, em que o agente modulador conduz a uma produção acrescida de um nutriente em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Exemplos de nutrientes incluem vitaminas, carboidratos, aminoácidos, polipeptídeos, ou ácidos graxos. Em alguns casos, a produção aumentada pode surgir de produção aumentada de um nutriente por um micro-organismo residente no hospedeiro. Alternativamente, a produção aumentada pode surgir de produção aumentada de um nutriente pelo próprio inseto hospedeiro, em que o hospedeiro tem aptidão acrescida após distribuição ou administração de um agente modulador.

[0093] Em alguns casos, no processamento final, uma primeira espécie de inseto é combinada com uma segunda espécie de inseto cujo perfil nutricional proporciona um benefício complementar ao valor nutricional global do produto alimentício ou de ração. Por exemplo, uma espécie contendo um perfil elevado de proteínas pode ser combinada com uma espécie contendo um perfil elevado de ácidos graxos ômega 3/6. Deste modo, o alimento de proteínas do inseto pode ser combinado de modo personalizado para se adequar às necessidades de humanos ou diferentes espécies de animais.

II. Micro-organismos-Alvo

[0094] Os micro-organismos visados pelo agente modulador des crito aqui podem incluir qualquer micro-organismo residente em ou sobre o hospedeiro, incluindo, mas não se limitando a, quaisquer bactérias e/ou fungos descritos aqui. Micro-organismos residentes no hospedeiro podem incluir, por exemplo, micro-organismos simbióticos (por exemplo, micro-organismos endossimbióticos que proporcionam nutrientes ou enzimas benéficos para o hospedeiro), comensais, patogênicos, ou parasitários. Um micro-organismo simbiótico (por exemplo, bactérias ou fungos) pode ser um simbionte obrigatório do hospedeiro ou a simbionte facultativo do hospedeiro. Micro-organismos residentes no hospedeiro podem ser adquiridos por qualquer modo de transmissão, incluindo transmissão vertical, horizontal, ou múltiplas origens de transmissão.

I. Bactérias

[0095] Bactérias exemplificativas que podem ser visadas de acordo com os métodos e composições proporcionados aqui, incluem, mas não se limitam a, Xenorhabdus spp, Photorhabdus spp, Candidatus spp, Buchnera spp, Blattabacterium spp, Baumania spp, Wigglesworthia spp, Wolbachia spp, Rickettsia spp, Orientia spp, So- dalis spp, Burkholderia spp, Cupriavidus spp, Frankia spp, Snirhizo- bium spp, Streptococcus spp, Wolinella spp, Xylella spp, Erwinia spp, Agrobacterium spp, Bacillus spp, Paenibacillus spp, Streptomyces spp, Micrococcus spp, Corynebacterium spp, Acetobacter spp, Cyanobacteria spp, Salmonella spp, Rhodococcus spp, Pseudomonas spp, Lactobacillus spp, Enterococcus spp, Alcaligenes spp, Klebsiella spp, Paenibacillus spp, Arthrobacter spp, Corynebacterium spp, Bre- vibacterium spp, Thermus spp, Pseudomonas spp, Clostridium spp, e Escherichia spp. Exemplos não limitadores de bactérias que podem ser visadas pelos métodos e composições proporcionados aqui são mostrados na Tabela 1. Tabela 1: Exemplos de Bactérias-Alvo e Insetos Hospedeiros

[0096] Qualquer número de espécies bacterianas pode ser visado pelas composições ou métodos descritos aqui. Por exemplo, em alguns casos, o agente modulador pode visar uma única espécie bacte- riana. Em alguns casos, o agente modulador pode visar pelo menos cerca de quaisquer de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 500, ou mais espécies bacterianas distintas. Em alguns casos, o agente modulador pode visar qualquer uma de cerca de 1 até cerca de 5, cerca de 5 até cerca de 10, cerca de 10 até cerca de 20, cerca de 20 até cerca de 50, cerca de 50 até cerca de 100, cerca de 100 até cerca de 200, cerca de 200 até cerca de 500, cerca de 10 até cerca de 50, cerca de 5 até cerca de 20, ou cerca de 10 até cerca de 100 espécies bacterianas distintas. Em alguns casos, o agente modulador pode visar pelo menos cerca de quaisquer de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ou mais filos, classes, ordens, famílias, ou gêneros de bactérias.

[0097] Em alguns casos, o agente modulador pode aumentar uma população de uma ou mais bactérias (por exemplo, bactérias simbióticas) em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais no hospedeiro em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, o agente modulador pode reduzir a população de uma ou mais bactérias (por exemplo, bactérias patogênicas ou parasitárias) em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais no hospedeiro em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente mo- dulador não foi administrado. Em alguns casos, o agente modulador pode erradicar a população de uma bactéria (por exemplo, bactérias patogênicas ou parasitárias) no hospedeiro. Em alguns casos, o agente modulador pode aumentar o nível de uma ou mais bactérias simbióticas em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais no hospedeiro e/ou decresce o nível de uma ou mais bactérias patogênicas em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais no hospedeiro em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado.

[0098] Em alguns casos, o agente modulador pode alterar a diver sidade bacteriana e/ou composição bacteriana do hospedeiro. Em alguns casos, o agente modulador pode aumentar a diversidade bacteri- ana no hospedeiro relativamente a uma diversidade de partida em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, o agente modulador pode decrescer a diversidade bacteriana no hospedeiro relativamente a uma diversidade de partida em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado.

[0099] Em alguns casos, o agente modulador pode alterar a fun ção, atividade, crescimento, e/ou divisão de uma ou mais células bac- terianas. Por exemplo, o agente modulador pode alterar a expressão de um ou genes nas bactérias. Em alguns casos, o agente modulador pode alterar a função de uma ou mais proteínas nas bactérias. Em alguns casos, o agente modulador pode alterar a função de uma ou mais estruturas celulares (por exemplo, a parede celular, a membrana externa ou interna) nas bactérias. Em alguns casos, o agente modula- dor pode matar (por exemplo, efetuar a lise) as bactérias.

[00100] A bactéria-alvo pode residir em uma ou mais partes do inseto. Além disso, as bactérias-alvo podem ser intracelulares ou extra- celulares. Em alguns casos, as bactérias residem em ou sobre uma ou mais partes do intestino do hospedeiro, incluindo, por exemplo, o intes- tino anterior, intestino médio, e/ou intestino posterior. Em alguns casos, as bactérias residem como bactérias intracelulares dentro de uma célula do inseto hospedeiro. Em alguns casos, as bactérias residem em um bacteriócito do inseto hospedeiro.

[00101] Alterações nas populações de bactérias no hospedeiro podem ser determinadas por quaisquer métodos conhecidos na técnica, como microarranjo, reação em cadeia de polimerase (PCR), PCR em tempo real, citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, microscopia eletrônica de transmissão, hibridação in situ por fluorescência (por exemplo, FISH), espectrofotometria, desorção/ionização com laser assistido por matriz-espectrometria de massa (MALDI-MS), e sequenciamento de DNA. Em alguns casos, uma amostra do hospedeiro tratado com um agente modulador é sequenciada (por exemplo, por sequenciamento me- tagenômico de rRNA ou rDNA 16S) para determinar o microbioma do hospedeiro após distribuição ou administração do agente modulador. Em alguns casos, uma amostra de um hospedeiro que não recebeu o agente modulador também é sequenciada para proporcionar uma referência.

II. Fungos

[00102] Fungos exemplificativos que podem ser visados de acordo com os métodos e composições proporcionados aqui incluem, mas não se limitam a Amylostereum areolatum, Epichloe spp, Pichia pinus, Hansenula capsulate, Daldinia decipien, Ceratocytis spp, Ophiostoma spp, e Attamyces bromatificus. Exemplos não limitadores de levedura e simbiontes do tipo levedura presentes em insetos incluem Candida, Metschnikowia, Debaromyces, Scheffersomyces shehatae e Scheffer- somyces stipites, Starmerella, Pichia, Trichosporon, Cryptococcus, Pseudozyma, e simbiontes do tipo levedura do subfilo Pezizomycotina (por exemplo, Symbiotaphrina bucneri e Symbiotaphrina kochii). Exemplos não limitadores de levedura que podem ser visados pelos métodos e composições aqui são listados na Tabela 2. Tabela 2

[00103] Qualquer número de espécies fúngicas pode ser visado pelas composições ou métodos descritos aqui. Por exemplo, em alguns casos, o agente modulador pode visar uma única espécie fúngica. Em alguns casos, o agente modulador pode visar pelo menos cerca de quaisquer de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 500, ou mais espécies fúngicas distintas. Em alguns casos, o agente modulador pode visar qualquer uma de cerca de 1 até cerca de 5, cerca de 5 até cerca de 10, cerca de 10 até cerca de 20, cerca de 20 até cerca de 50, cerca de 50 até cerca de 100, cerca de 100 até cerca de 200, cerca de 200 até cerca de 500, cerca de 10 até cerca de 50, cerca de 5 até cerca de 20, ou cerca de 10 até cerca de 100 espécies fúngicas distintas. Em alguns casos, o agente modulador pode visar pelo menos cerca de quaisquer de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ou mais filos, classes, ordens, famílias, ou gêneros de fungos.

[00104] Em alguns casos, o agente modulador pode aumentar uma população de um ou mais fungos (por exemplo, fungos simbióticos) em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais no hospedeiro em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, o agente modulador pode reduzir a população de um ou mais fungos (por exemplo, fungos patogênicos ou parasitários) em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais no hospedeiro em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, o agente modulador pode erradicar a população de um fungo (por exemplo, fungos patogênicos ou parasitários) no hospedeiro. Em alguns casos, o agente modulador pode aumentar o nível de um ou mais fungos simbióticos em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais no hospedeiro e/ou pode decrescer o nível de um ou mais fungos patogênicos em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais no hospedeiro em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado.

[00105] Em alguns casos, o agente modulador pode alterar a diversidade fúngica e/ou composição fúngica do hospedeiro. Em alguns casos, o agente modulador pode aumentar a diversidade fúngica no hospedeiro relativamente a uma diversidade de partida em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, o agente modulador pode decrescer a diversidade fúngica no hospedeiro relativamente a uma diversidade de partida em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modula- dor não foi administrado.

[00106] Em alguns casos, o agente modulador pode alterar a função, atividade, crescimento, e/ou divisão de um ou mais fungos. Por exemplo, o agente modulador pode alterar a expressão de um ou mais genes no fungo. Em alguns casos, o agente modulador pode alterar a função de uma ou mais proteínas no fungo. Em alguns casos, o agente modulador pode alterar a função de um ou mais componentes celulares no fungo. Em alguns casos, o agente modulador pode matar o fungo.

[00107] Além disso, o fungo-alvo pode residir em uma ou mais partes do inseto. Em alguns casos, o fungo reside em ou sobre uma ou mais partes do intestino do inseto, incluindo, por exemplo, o intestino anterior, intestino médio, e/ou intestino posterior. Em alguns casos, o fungo vive extracelularmente na hemolinfa, corpos adiposos ou em es- truturas especializadas no hospedeiro.

[00108] Alterações na população de fungos no hospedeiro podem ser determinadas por quaisquer métodos conhecidos na técnica, como microarranjo, reação em cadeia de polimerase (PCR), PCR em tempo real, citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, microscopia eletrônica de transmissão, hibridação in situ por fluorescência (por exemplo, FISH), espectrofotometria, desor- ção/ionização com laser assistido por matriz-espectrometria de massa (MALDI-MS), e sequenciamento de DNA. Em alguns casos, uma amostra do hospedeiro tratado com um agente modulador é sequenciada (por exemplo, por sequenciamento metagenômico) para determinar o microbioma do hospedeiro após distribuição ou administração do agente modulador. Em alguns casos, uma amostra de um hospedeiro que não recebeu o agente modulador também é sequenciada para proporcionar uma referência.

III. Agentes Moduladores

[00109] O agente modulador dos métodos e composições proporcionados aqui pode incluir um fago, um polipeptídeo, uma molécula pequena, um antibiótico, um metabólito secundário, uma bactéria, um fungo, ou qualquer combinação desses.

i. Fago

[00110] O agente modulador descrito aqui pode incluir um fago (por exemplo, um fago lítico ou um fago não lítico). Em alguns casos, uma concentração eficaz de qualquer fago descrito aqui pode alterar um nível, atividade, ou metabolismo de um ou mais micro-organismos (como descrito aqui) residentes em um hospedeiro descrito aqui, a alteração resultando em um aumento na aptidão do hospedeiro. Em alguns casos, o agente modulador inclui pelo menos um fago selecionado da ordem Tectiviridae, Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Caudovirales, Lipothrixviridae, Rudiviridae, ou Ligamenvirales. Em alguns casos, a composição inclui pelo menos um fago selecionado da família Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Lipothrixviridae, Ru- diviridae, Ampullaviridae, Bicaudaviridae, Clavaviridae, Corticoviridae, Cystoviridae, Fuselloviridae, Gluboloviridae, Guttaviridae, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Plasmaviridae, e Tectiviridae. Outros exemplos não limitadores de fagos úteis nos métodos e composições são listados na Tabela 3. Tabela 3: Exemplos de Fagos e Bactérias Visadas

[00111] Em alguns casos, um agente modulador inclui um fago líti- co. Assim, após a administração do fago lítico a uma célula bacteriana residente no hospedeiro, o fago causa lise na célula bacteriana-alvo. Em alguns casos, o fago lítico visa e mata uma bactéria residente em um inseto hospedeiro para aumentar a aptidão do hospedeiro. Alternativamente ou adicionalmente, o fago do agente modulador pode ser um fago não lítico (também referido como fago lisogênico ou temperado). Assim, após a administração do fago não lítico a uma célula bac- teriana residente no hospedeiro, a célula bacteriana pode permanecer viável e conseguir manter estavelmente a expressão de genes codificados no genoma do fago. Em alguns casos, um fago não lítico é usado para alterar a expressão genética em uma bactéria residente em um inseto hospedeiro para aumentar a aptidão do hospedeiro. Em alguns casos, o agente modulador inclui uma mistura de fagos lítico e não lítico.

[00112] O agente modulador descrito aqui pode incluir um fago com uma gama de alvos bacterianos estreita ou larga. Em alguns casos, o fago tem uma gama de alvos bacterianos estreita. Em alguns casos, o fago é um fago promíscuo com uma gama de alvos bacterianos larga. Por exemplo, o fago promíscuo pode visar pelo menos cerca de quaisquer de 5, 10, 20, 30, 40, 50, ou mais bactérias residentes no hospedeiro. Um fago com uma gama de alvos bacterianos estreita pode visar uma estirpe bacteriana específica no hospedeiro sem afetar outras bactérias, por exemplo, não visadas, no hospedeiro. Por exemplo, o fago pode visar não mais do que cerca de quaisquer de 50, 40, 30, 20, 10, 8, 6, 4, 2, ou 1 bactéria residente no hospedeiro.

[00113] As composições descritas aqui podem incluir qualquer número de fagos, como pelo menos cerca de qualquer um de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, ou mais fagos. Em alguns casos, a composição inclui fagos de uma ou mais famílias (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais famílias de fagos), uma ou mais ordens (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais fagos), ou uma ou mais espécies (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, ou mais fagos). Composições incluindo um ou mais fagos também são referidas aqui como "coquetéis de fagos". Coquetéis de fagos são úteis porque permitem visar uma gama mais larga de hospedeiros de bactérias. Além disso, permitem que cada estirpe bacteriana (isto é, subespécie) seja visada por múltiplos fagos ortogonais, desse modo prevenindo ou retardando significativamente o surgimento de resistência. Em alguns casos, um coquetel inclui múltiplos fagos visando uma espécie bacte- riana. Em alguns casos, um coquetel inclui múltiplos fagos visando múltiplas espécies bacterianas. Em alguns casos, um "coquetel" de um fago inclui um único fago promíscuo (isto é, um fago com uma gama larga de hospedeiros) visando muitas estirpes dentro de uma espécie.

[00114] Concentrações adequadas do fago no agente modulador descrito aqui dependem de fatores como a eficácia, taxa de sobrevivência, transmissibilidade do fago, número de fagos distintos, e/ou tipos de lisina nas composições, formulação, e métodos de aplicação da composição. Em alguns casos, o fago está em uma formulação líquida ou sólida. Em alguns casos, a concentração de cada fago em quaisquer das composições descritas aqui é pelo menos cerca de quaisquer de 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010 ou mais pfu/mL. Em alguns casos, a concentração de cada fago em quaisquer das composições descritas aqui é não mais do que cerca de quaisquer de 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 pfu/mL. Em alguns casos, a concentração de cada fago na composição é qualquer de cerca de 102 até cerca de 103, cerca de 103 até cerca de 104, cerca de 104 até cerca de 105, cerca de 105 até cerca de 106, cerca de 107 até cerca de 108, cerca de 108 até cerca de 109, cerca de 102 até cerca de 104, cerca de 104 até cerca de 106, cerca de 106 até cerca de 109, ou cerca de 103 até cerca de 108 pfu/mL. Em alguns casos, em que a composição inclui pelo menos dois tipos de fagos, a concentração de cada tipo dos fagos pode ser igual ou diferente. Por exemplo, em alguns casos, a concentração de um fago no coquetel é cerca de 108 pfu/mL e a concentração de um segundo fago no coquetel é cerca de 106 pfu/mL.

[00115] Um agente modulador incluindo um fago como descrito aqui pode ser contatado com o hospedeiro-alvo em uma quantidade e durante um tempo suficiente para: (a) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração do fago no interior de um hospedeiro-alvo; (b) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração do fago no interior do intestino de um hospedeiro-alvo; (c) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração do fago no interior de um bacteriócito de um hospedeiro-alvo; (d) modular o nível, ou uma atividade, de um ou mais micro-organismos (por exemplo, endossimbionte) no hospedeiro-alvo; ou/e (e) modular a aptidão do hospedeiro-alvo.

[00116] Como ilustrado pelos Exemplos 7 e 9, fagos podem ser usados como agentes moduladores por eliminação de patógenos bac- terianos, como Serratia marcescens, Erwinia catotovora, e Pseudomonas enzomophila, de hospedeiros de insetos, como grilos.

ii. Polipeptídeos

[00117] Numerosos polipeptídeos (por exemplo, uma bacteriocina, bacteriocina do tipo R, peptídeo rico em C específico para nódulos, peptídeo antimicrobiano, lisina, ou peptídeo regulador de bacteriócitos) podem ser usados nas composições e métodos descritos aqui. Em alguns casos, uma concentração eficaz de qualquer peptídeo ou poli- peptídeo descrito aqui pode alterar um nível, atividade, ou metabolismo de um ou mais micro-organismos (como descrito aqui) residentes em um hospedeiro, a alteração resultando em um aumento na aptidão do hospedeiro. Polipeptídeos incluídos aqui podem incluir polipeptí- deos de ocorrência natural ou variantes recombinantemente produzidas. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser uma variante funcionalmente ativa de quaisquer dos polipeptídeos descritos aqui com pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo de uma região especificada ou ao longo de toda a sequência, com uma sequência de um polipeptídeo descrito aqui ou um polipeptí- deo de ocorrência natural.

[00118] Um agente modulador compreendendo um polipeptídeo como descrito aqui pode ser contatado com o hospedeiro-alvo em uma quantidade e durante um tempo suficiente para: (a) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração no interior de um hospedeiro-alvo; (b) alcançar um nível- alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração no interior do intestino de um hospedeiro-alvo; (c) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de con-centração no interior de um bacteriócito de um hospedeiro-alvo; (d) modular o nível, ou uma atividade, de um ou mais micro-organismos (por exemplo, endossimbionte) no hospedeiro-alvo; ou/e (e) modular a aptidão do hospedeiro-alvo.

(a) Bacteriocinas

[00119] O agente modulador descrito aqui pode incluir uma bacte- riocina. Em alguns casos, a bacteriocina é naturalmente produzida por bactérias Gram-positivas, como Pseudomonas, Streptomyces, Bacillus, Staphylococcus, ou bactérias do ácido láctico (LAB, como Lactococcus lactis). Em alguns casos, a bacteriocina é naturalmente produzida por bactérias Gram-negativas, como Hafnia alvei, Citrobac- ter freundii, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumonia, Enterobacter cloacae, Serratia plymithicum, Xanthomonas campestris, Erwinia ca- rotovora, Ralstonia solanacearum, ou Escherichia coli. Bacteriocinas exemplificativas incluem, mas não se limitam a, antibióticos LAB de Classe I-IV (como lantibióticos), colicinas, microcinas, e piocinas. Exemplos não limitadores de bacteriocinas são listados na Tabela 4. Tabela 4: Exemplos de Bacteriocinas

[00120] Em alguns casos, a bacteriocina é uma colicina, uma pioci- na, ou uma microcina produzida por bactérias Gram-negativas. Em alguns casos, a bacteriocina é uma colicina. A colicina pode ser uma colicina do grupo A (por exemplo, usa o sistema Tol para penetrar na membrana externa de uma bactéria-alvo) ou uma colicina do grupo B (por exemplo, usa o sistema Ton para penetrar na membrana externa de uma bactéria-alvo). Em alguns casos, a bacteriocina é uma micro- cina. A microcina pode ser uma microcina de classe I (por exemplo, < 5 kDa, tem modificações pós-tradução) ou uma microcina de classe II (por exemplo, 5-10 kDa, com ou sem modificações pós-tradução). Em alguns casos, a microcina de classe II é uma microcina de classe IIa (por exemplo, requer mais do que um gene para sintetizar e montar peptídeos funcionais) ou uma microcina de classe IIb (por exemplo, peptídeos lineares com ou sem modificações pós-tradução no terminal C). Em alguns casos, a bacteriocina é uma piocina. Em alguns casos, a piocina é uma R-piocina, F-piocina, ou S-piocina.

[00121] Em alguns casos, a bacteriocina é uma bacteriocina de classe I, classe II, classe III, ou classe IV produzida por bactérias Gram- positivas. Em alguns casos, o agente modulador inclui uma bacteriocina de Classe I (por exemplo, antibióticos contendo lantionina (lantibióticos) produzidos por uma bactéria Gram-positiva). As bacteriocinas de classe I ou lantibiótico podem ser um peptídeo de baixo peso molecular (por exemplo, menos do que cerca de 5 kDa) e podem possuir resíduos de aminoácidos modificados de modo pós-tradução (por exemplo, lantioni- na, β-metil-lantionina, ou aminoácidos desidratados).

[00122] Em alguns casos, a bacteriocina é uma bacteriocina de Classe II (por exemplo, não lantibióticos produzidos por bactérias Gram-positivas). Muitas são peptídeos de carga positiva, não contendo lantionina, os quais, ao contrário dos lantibióticos, não sofrem modificação pós-tradução extensa. A bacteriocina de Classe II pode perten- cer a uma das seguintes subclasses: bacteriocinas "do tipo pediocina" (por exemplo, pediocina PA-1 e carnobacteriocina X (Classe IIa)); bac- teriocinas de dois peptídeos (por exemplo, lactacina F e ABP-118 (Classe IIb)); bacteriocinas circulares (por exemplo, carnociclina A e enterocina AS-48 (Classe IIc)); ou bacteriocinas não modificadas, lineares, não do tipo pediocina (por exemplo, epidermicina NI01 e lacto- coccina A (Classe IId)).

[00123] Em alguns casos, a bacteriocina é uma bacteriocina de Classe III (por exemplo, produzida por bactérias Gram-positivas). Bac- teriocinas de Classe III podem ter um peso molecular maior do que 10 kDa e podem ser proteínas instáveis ao calor. As bacteriocinas de Classe III podem ser adicionalmente subdivididas em bacteriocinas do Grupo IIIA e Grupo IIIB. As bacteriocinas do Grupo IIIA incluem enzimas bacteriolíticas que matam estirpes sensíveis por lise da parede celular, como Enterolisina A. Bacteriocinas do Grupo IIIB incluem proteínas não líticas, como Caseicina 80, Helveticina J, e lactacina B.

[00124] Em alguns casos, a bacteriocina é uma bacteriocina de Classe IV (por exemplo, produzida por bactérias Gram-positivas). Bac- teriocinas de Classe IV são um grupo de proteínas complexas, associadas a outras frações de lipídeos ou carboidratos, que aparentam ser requeridas para atividade. São relativamente hidrofóbicas e estáveis ao calor. Exemplos de bacteriocinas de Classe IV são leuconocina S, lactocina 27, e lactocina S.

[00125] Em alguns casos, a bacteriocina é uma bacteriocina do tipo R. Bacteriocinas do tipo R são complexos proteicos bacteriocidas contráteis. Algumas bacteriocinas do tipo R têm uma estrutura do tipo cauda de fago contrátil. A região C-terminal da proteína de fibra de cauda de fago determina a especificidade de ligação ao alvo. Podem se ligar a células-alvo através de uma proteína de ligação a receptores, por exemplo, uma fibra de cauda. A ligação é seguida de contra ção da bainha e inserção do núcleo através do envelope da bactéria- alvo. A penetração do núcleo origina uma despolarização rápida do potencial da membrana celular e morte celular imediata. O contato com uma única partícula de bacteriocina do tipo R pode resultar em morte celular. Uma bacteriocina do tipo R, por exemplo, pode ser termolábil, resistente a ácidos fracos, resistente à tripsina, sedimen- tável por centrifugação, resolúvel por microscopia eletrônica, ou uma combinação desses. Outras bacteriocinas do tipo R podem ser moléculas complexas incluindo múltiplas proteínas, polipeptídeos, ou su- bunidades, e podem se assemelhar a uma estrutura de cauda de bacteriófagos da família Myoviridae. Em bacteriocinas do tipo R de ocorrência natural, as estruturas de subunidade podem ser codificadas por um genoma bacteriano, como o de C. difficile ou P. aeruginosa e formam bacteriocinas do tipo R para atuarem como defesas naturais contra outras bactérias. Em alguns casos, a bacteriocina do tipo R é uma piocina. Em alguns casos, a piocina é uma R-piocina, F- piocina, ou S-piocina.

[00126] Em alguns casos, a bacteriocina é uma variante funcionalmente ativa das bacteriocinas descritas aqui. Em alguns casos, a variante da bacteriocina tem pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo de uma região especificada ou ao longo de toda a sequência, com uma sequência de uma bacteri- ocina descrita aqui ou uma bacteriocina de ocorrência natural.

[00127] Em alguns casos, a bacteriocina pode ser biomanipulada, de acordo com métodos padrão, para modular a sua bioatividade, por exemplo, aumentar ou decrescer ou regular, ou para especificar seus micro-organismos-alvo. Em outros casos, a bacteriocina é produzida pela maquinaria de tradução (por exemplo, um ribossomo, etc.) de uma célula microbiana. Em alguns casos, a bacteriocina é sintetizada quimicamente. Algumas bacteriocinas podem ser derivadas de um precursor polipeptídico. O precursor polipeptídico pode sofrer clivagem (por exemplo, processamento por uma protease) para originar o poli- peptídeo da própria bacteriocina. Como tal, em alguns casos, a bacte- riocina é produzida a partir de um polipeptídeo precursor. Em alguns casos diferentes, a bacteriocina inclui um polipeptídeo que sofreu modificações pós-tradução, por exemplo, clivagem, ou a adição de um ou mais grupos funcionais.

[00128] As bacteriocinas descritas aqui podem ser formuladas em uma composição para qualquer um dos usos descritos aqui. As composições reveladas aqui podem incluir qualquer número ou tipo (por exemplo, classes) de bacteriocinas, como pelo menos cerca de qualquer um de 1 bacteriocina, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, ou mais bacteriocinas. Concentrações adequadas de cada bacteriocina nas composições descritas aqui dependem de fatores como eficácia, estabilidade da bacteriocina, número de tipos distintos de bacteriocinas nas composições, formulação, e métodos de aplicação da composição. Em alguns casos, cada bacteriocina em uma composição líquida vai desde cerca de 0,01 ng/mL até cerca de 100 mg/mL. Em alguns casos, cada bacteriocina em uma composição sólida vai desde cerca de 0,01 ng/g até cerca de 100 mg/g. Em alguns casos, em que a composição inclui pelo menos dois tipos de bacteriocinas, a concentração de cada tipo das bacteriocinas pode ser igual ou diferente. Em alguns casos, a bacteriocina é proporcionada em uma composição incluindo uma célula bacteriana que secreta a bacteriocina. Em alguns casos, a bacteriocina é proporcionada em uma composição incluindo um polipeptídeo (por exemplo, um polipeptídeo isolado de uma célula bacteriana).

[00129] As bacteriocinas podem neutralizar (por exemplo, matar) pelo menos um micro-organismo diferente da célula bacteriana indivi dual na qual o polipeptídeo é produzido, incluindo células relacionadas de modo clonal com a célula bacteriana e outras células microbianas. Como tal, uma célula bacteriana pode exercer efeitos citotóxicos ou inibidores do crescimento em uma pluralidade de organismos microbianos por secreção de bacteriocinas. Em alguns casos, a bacteriocina visa e mata uma ou mais espécies de bactérias residentes no hospedeiro via formação de poros na membrana citoplasmática, interferência na parede celular (por exemplo, atividade de peptídeoglicanase), ou atividade de nuclease (por exemplo, atividade de DNase, atividade de rRNase 16S, ou atividade de tRNase).

[00130] Em alguns casos, a bacteriocina tem uma atividade neutra- lizadora. A atividade neutralizadora de bacteriocinas pode incluir, mas não se limita a, paragem da reprodução microbiana, ou citotoxicidade. Algumas bacteriocinas têm atividade citotóxica, e assim podem matar organismos microbianos, por exemplo, bactérias, levedura, algas, e similares. Algumas bacteriocinas podem inibir a reprodução de organismos microbianos, por exemplo, bactérias, levedura, algas, e similares, por exemplo, por paragem do ciclo celular.

[00131] Em alguns casos, a bacteriocina tem atividade extermina- dora. O mecanismo de morte de bacteriocinas é específico de cada grupo de bacteriocinas. Em alguns casos, a bacteriocina tem bioativi- dade de pequeno espectro. As bacteriocinas são conhecidas pela sua potência muito elevada contra suas estirpes-alvo. Alguma atividade de bacteriocinas é limitada a estirpes que estão proximamente relacionadas com a estirpe produtora da bacteriocina (bioatividade de pequeno espectro). Em alguns casos, a bacteriocina tem bioatividade de largo espectro contra uma gama ampla de gêneros.

[00132] Em alguns casos, bacteriocinas interagem com uma molécula receptora ou uma molécula de ancoragem na membrana celular bacteriana-alvo. Por exemplo, nisina é extremamente potente contra suas estirpes bacterianas-alvo, exibindo atividade antimicrobiana mesmo a uma concentração nanomolar de um único dígito. Foi mostrado que a molécula de nisina se liga ao lipídeo II, que é o principal veículo de subunidades de peptídeoglicano do citoplasma para a parede celular.

[00133] Em alguns casos, a bacteriocina tem atividade antifúngica. Foram identificadas algumas bacteriocinas com atividade antilevedura ou antifúngica. Por exemplo, foi mostrado que bacteriocinas de Bacillus têm atividade neutralizadora contra algumas estirpes de levedura (ver, por exemplo, Adetunji e Olaoye, Malaysian Journal of Microbiology 9:130-13, 2013). Em outro exemplo, foi mostrado que um peptí- deo de Enterococcus faecalis tem atividade neutralizadora contra espécies de Candida (ver, por exemplo, Shekh e Roy, BMC Microbiology 12:132, 2012). Em outro exemplo, foi mostrado que bacteriocinas de Pseudomonas têm atividade neutralizadora contra fungos, como Cur- vularia lunata, espécies de Fusarium, espécies de Helminthosporium, e espécies de Biopolaris (ver, por exemplo, Shalani e Srivastava, The Internet Journal of Microbiology Volume 5 Número 2, 2008). Em outro exemplo, foi mostrado que botricidina AJ1316 e alirina B1 de B. subtilis têm atividades antifúngicas.

[00134] Um agente modulador incluindo uma bacteriocina como descrito aqui pode ser contatado com o hospedeiro-alvo em uma quantidade e durante um período de tempo suficiente para: (a) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de bacteriocina no interior de um hospedeiro-alvo; (b) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de bacteriocina no interior do intestino de um hospedeiro-alvo; (c) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de bacteriocina no interior de um bacteriócito de um hospedeiro-alvo; (d) modular o nível, ou uma ativi- dade, de um ou mais micro-organismos (por exemplo, endossimbionte) no hospedeiro-alvo; ou/e (e) modular a aptidão do hospedeiro-alvo.

(b) Lisinas

[00135] O agente modulador descrito aqui pode incluir uma lisina (por exemplo, também conhecida como uma mureína hidrolase ou autolisina para peptídeoglicano). Qualquer lisina adequada para inibir uma bactéria residente no hospedeiro pode ser usada. Em alguns casos, a lisina é tal que pode ser naturalmente produzida por uma célula bacteriana. Em alguns casos, a lisina é tal que pode ser naturalmente produzida por um bacteriófago. Em alguns casos, a lisina é obtida de um fago que inibe uma bactéria residente no hospedeiro. Em alguns casos, a lisina é manipulada com base em uma lisina de ocorrência natural. Em alguns casos, a lisina é manipulada de modo a ser secre- tada por uma bactéria hospedeira, por exemplo, por introdução de um peptídeo sinal na lisina. Em alguns casos, a lisina é usada em combinação com uma holina de fago. Em alguns casos, a lisina é expressa por um hospedeiro de bactéria recombinante que não é sensível à lisina. Em alguns casos, a lisina é usada para inibir uma bactéria Gram- positiva ou Gram-negativa residente no hospedeiro.

[00136] A lisina pode consistir em qualquer classe de lisina e pode ter uma ou mais especificidades para substratos. Por exemplo, a lisina pode ser uma glicosidase, uma endopeptidase, uma carboxipeptidase, ou uma combinação desses. Em alguns casos, a lisina procede à clivagem da ligação β -1-4 glicosídica na fração de açúcar da parede celular, da ligação amida conectando as frações de açúcar e peptídica da parede da célula bacteriana, e/ou das ligações peptídicas entre as frações peptídicas da parede celular. A lisina pode pertencer a um ou mais grupos específicos de lisina, dependendo do sítio de clivagem dentro do peptideoglicano. Em alguns casos, a lisina é uma N-acetil-β- D-muramidase (por exemplo, lisozima), transglicosilase lítica, N-acetil- β-D-glucosaminidase, N-acetilmuramil-L-alanina amidase, L,D-endo- peptidase, D,D-endopeptidase, D,D-carboxipeptidase, L,D-carboxi- peptidase, ou L,D-transpeptidase. Exemplos não limitadores de lisinas e suas atividades são listados na Tabela 5. Tabela 5: Exemplos de Lisinas

[00137] Em alguns casos, a lisina é uma variante funcionalmente ativa das lisinas descritas aqui. Em alguns casos, a variante da lisina tem pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo de uma região especificada ou ao longo de toda a sequência, com uma sequência de uma lisina descrita aqui ou uma lisina de ocorrência natural.

[00138] Em alguns casos, a lisina pode ser biomanipulada para modular a sua bioatividade, por exemplo, aumentar ou decrescer ou regular, ou para especificar um micro-organismo-alvo. Em alguns casos, a lisina é produzida pela maquinaria de tradução (por exemplo, um ribossomo, etc.) de uma célula microbiana. Em alguns casos, a lisina é sintetizada quimicamente. Em alguns casos, a lisina é derivada de um precursor polipeptídico. O precursor polipeptídico pode sofrer clivagem (por exemplo, processamento por uma protease) para originar o polipeptídeo da própria lisina. Como tal, em alguns casos, a lisina é produzida a partir de um polipeptídeo precursor. Em alguns casos, a lisina inclui um polipeptídeo que sofreu modificações pós- tradução, por exemplo, clivagem, ou a adição de um ou mais grupos funcionais.

[00139] As lisinas descritas aqui podem ser formuladas em uma composição para qualquer um dos usos descritos aqui. As composições reveladas aqui podem incluir qualquer número ou tipo (por exemplo, classes) de lisinas, como pelo menos cerca de qualquer um de 1 lisina, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, ou mais lisinas. Uma concentração adequada de cada lisina na composição depende de fatores como eficácia, estabilidade da lisina, número de lisinas distintas, a formulação, e métodos de aplicação da composição. Em alguns casos, cada lisina em uma composição líquida vai desde cerca de 0,1 ng/mL até cerca de 100 mg/mL. Em alguns casos, cada lisina em uma composição sólida vai desde cerca de 0,1 ng/g até cerca de 100 mg/g. Em alguns casos, em que a composição inclui pelo menos dois tipos de lisinas, a concentração de cada tipo de lisina pode ser igual ou diferente.

[00140] Um agente modulador incluindo uma lisina como descrito aqui pode ser contatado com o hospedeiro-alvo em uma quantidade e durante um período de tempo suficiente para: (a) alcançar um nível- alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de lisina no interior de um hospedeiro-alvo; (b) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de lisina no interior do intestino de um hospedeiro-alvo; (c) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de lisina no interior de um bacteriócito de um hospedeiro-alvo; (d) modular o nível, ou uma atividade, de um ou mais micro-organismos (por exemplo, endossimbionte) no hospedeiro-alvo; ou/e (e) modular a aptidão do hospedeiro-alvo.

(c) Peptídeos Antimicrobianos

[00141] O agente modulador descrito aqui pode incluir um peptídeo antimicrobiano (AMP). Qualquer AMP adequado para inibir um microorganismo residente no hospedeiro pode ser usado. AMP são um grupo diversificado de moléculas, que são divididas em subgrupos com base na sua composição de aminoácidos e estrutura. O AMP pode ser derivado ou produzido a partir de qualquer organismo que produza naturalmente AMP, incluindo AMP derivados de plantas (por exemplo, copsina), insetos (por exemplo, drosocina, peptídeo de escorpião (por exemplo, Uy192, UyCT3, D3, D10, Uy17, Uy192), mastoparano, pone- ratoxina, cecropina, moricina, melitina), rãs (por exemplo, magainina, dermaseptina, aureína), e mamíferos (por exemplo, catelicidinas, de- fensinas e protegrinas). Por exemplo, o AMP pode ser um peptídeo de escorpião, como Uy192 (5'- FLSTIWNGIKGLL-3'; SEQ ID NO: 221), UyCT3 (5'- LSAIWSGIKSLF-3; SEQ ID NO: 222), D3 (5'- LWGKLWEGVKSLI-3'; SEQ ID NO: 223), e D10 (5'- FPFLKLS- LKIPKSAIKSAIKRL-3'; SEQ ID NO: 224), Uy17 (5'- ILSAIWSGIKGLL- 3'; SEQ ID NO: 225), ou uma combinação desses. Outros exemplos não limitadores de AMP são listados na Tabela 6. Tabela 6: Exemplos de Peptídeos Antimicrobianos

[00142] O AMP pode ser ativo contra qualquer número de micro- organismos-alvo. Em alguns casos, o AMP pode ter atividades anti- bacterianas e/ou antifúngicas. Em alguns casos, o AMP pode ter uma bioatividade de pequeno espectro ou uma bioatividade de largo espectro. Por exemplo, alguns AMP visam e matam apenas algumas espécies de bactérias ou fungos, ao passo que outros são ativos contra bactérias gram-negativas e gram-positivas bem como fungos.

[00143] Além disso, o AMP pode atuar através de alguns mecanismos de ação conhecidos. Por exemplo, a membrana citoplasmá- tica é um alvo frequente de AMP, mas AMP também podem interferir na síntese de DNA e proteínas, dobramento de proteínas, e síntese de paredes celulares. Em alguns casos, AMP com carga líquida ca- tiônica e natureza anfipática procedem à disrupção de membranas bacterianas, conduzindo a lise celular. Em alguns casos, AMP podem entrar em células e interagir com um alvo intracelular para interferir na síntese de DNA, RNA, proteínas, ou paredes celulares. Para além de matarem micro-organismos, AMP demonstraram possuir algumas funções imunomoduladoras que estão envolvidas na eliminação de uma infecção, incluindo a capacidade de alterar a expressão genética do hospedeiro, atuar como quimiocinas e/ou induzir produção de quimiocinas, inibir a produção de citocinas pró- inflamatórias induzidas por lipopolissacarídeos, promover a cura de feridas, e modular as respostas de células dendríticas e células da resposta imune adaptativa.

[00144] Em alguns casos, o AMP é uma variante funcionalmente ativa dos AMP descritos aqui. Em alguns casos, a variante do AMP tem pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo de uma região especificada ou ao longo de toda a sequência, com uma sequência de um AMP descrito aqui ou um AMP derivado naturalmente.

[00145] Em alguns casos, o AMP pode ser biomanipulado para modular a sua bioatividade, por exemplo, aumentar ou decrescer ou regular, ou para especificar um micro-organismo-alvo. Em alguns casos, o AMP é produzido pela maquinaria de tradução (por exemplo, um ri- bossomo, etc.) de uma célula. Em alguns casos, o AMP é sintetizado quimicamente. Em alguns casos, o AMP é derivado de um precursor polipeptídico. O precursor polipeptídico pode sofrer clivagem (por exemplo, processamento por uma protease) para originar o polipeptí- deo do próprio AMP. Como tal, em alguns casos, o AMP é produzido a partir de um polipeptídeo precursor. Em alguns casos, o AMP inclui um polipeptídeo que sofreu modificações pós-tradução, por exemplo, clivagem, ou a adição de um ou mais grupos funcionais.

[00146] Os AMPs descritos aqui podem ser formulados em uma composição para qualquer um dos usos descritos aqui. As composições reveladas aqui podem incluir qualquer número ou tipo (por exemplo, classes) de AMP, como pelo menos cerca de qualquer um de 1 AMP, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, ou mais AMP. Por exemplo, as composições podem incluir um coquetel de AMP (por exemplo, um coquetel de peptídeos de escorpião, por exemplo, UyCT3, D3, D10 e Uy17). Uma concentração adequada de cada AMP na composição depende de fatores como eficácia, estabilidade do AMP, número de AMP distintos na composição, a formulação e métodos de aplicação da composição. Em alguns casos, cada AMP em uma composição líquida vai desde cerca de 0,1 ng/mL até cerca de 100 mg/mL. Em alguns casos, cada AMP em uma composição sólida vai desde cerca de 0,1 ng/g até cerca de 100 mg/g. Em alguns casos, em que a composição inclui pelo menos dois tipos de AMP, a concentração de cada tipo de AMP pode ser igual ou diferente.

[00147] Um agente modulador incluindo um AMP como descrito aqui pode ser contatado com o hospedeiro-alvo em uma quantidade e durante um período de tempo suficiente para: (a) alcançar um nível- alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de AMP no interior de um hospedeiro-alvo; (b) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de AMP no interior do intestino de um hospedeiro-alvo; (c) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de AMP no interior de um bacteriócito de um hospedeiro-alvo; (d) modular o nível, ou uma atividade, de um ou mais microorganismos (por exemplo, endossimbionte) no hospedeiro-alvo; ou/e (e) modular a aptidão do hospedeiro-alvo.

(d) Peptídeos ricos em C Específicos para Nódulos

[00148] O agente modulador descrito aqui pode incluir um peptídeo rico em C específico para nódulos (peptídeo NCR). Peptídeos NCR são produzidos em certas plantas leguminosas e desempenham um papel importante na simbiose mutualista, fixadora de nitrogênio das plantas com bactérias da família Rhizobiaceae (rizóbios), resultando na formação de nódulos radiculares onde células de plantas contêm milhares de endossimbiontes intracelulares. Peptídeos NCR possuem propriedades antimicrobianas que dirigem um processo de diferenciação irreversível, terminal de bactérias, por exemplo, para permeabilizar a membrana bacteriana, proceder à disrupção da divisão celular, ou inibir a síntese de proteínas. Por exemplo, em células de nódulos de Medicago truncatula infectadas com Sinorhizobium meliloti, centenas de peptídeos NCR são produzidos que dirigem a diferenciação irreversível das bactérias para grandes bacteroides fixadores de nitrogênio poliploides. Exemplos não limitadores de peptídeos NCR são listados na Tabela 7. Tabela 7: Exemplos de Peptídeos NCR

[00149] Qualquer peptídeo NCR conhecido na técnica é adequado para uso nos métodos ou composições descritas aqui. Plantas produtoras de peptídeos NCR incluem mas não se limitam a Pisum sativum (ervilha), Astragalus sinicus (legumes IRLC), Phaseolus vulgaris (feijão), Vigna unguiculata (feijão-frade), Medicago truncatula (luzerna- cortada), e Lotus japonicus. Por exemplo, mais de 600 peptídeos NCR potenciais são previstos a partir da sequência do genoma de M. trun- catula e quase 150 peptídeos NCR diferentes foram detectados em células isoladas de nódulos radiculares por espectrometria de massa.

[00150] Os peptídeos NCR descritos aqui podem ser peptídeos NCR maduros ou imaturos. Os peptídeos NCR imaturos têm um peptí- deo sinal C-terminal que é requerido para translocação para o interior do retículo endoplasmático e clivado após a translocação. O terminal N de um peptídeo NCR inclui um peptídeo sinal, que pode ser clivável, para direcionamento para uma via secretora. Os peptídeos NCR são geralmente peptídeos pequenos com pontes dissulfeto que estabilizam a sua estrutura. Os peptídeos NCR maduros têm um comprimento situado no intervalo de cerca de 20 até cerca de 60 aminoácidos, cerca de 25 até cerca de 55 aminoácidos, cerca de 30 até cerca de 50 ami- noácidos, cerca de 35 até cerca de 45 aminoácidos, ou qualquer intervalo entre esses. Os peptídeos NCR podem incluir uma sequência conservada de resíduos cisteína com o restante da sequência peptídi- ca sendo altamente variável. Os peptídeos NCR têm geralmente cerca de quatro ou oito cisteínas.

[00151] Os peptídeos NCR podem ser aniônicos, neutros, ou catiô- nicos. Em alguns casos, peptídeos NCR catiônicos sintéticos tendo um pI maior do que cerca de oito possuem atividades antimicrobianas. Por exemplo, NCR247 (pI = 10,15) (RNGCIVDPRCPYQQCRRPLYCRRR; SEQ ID NO: 198) e NCR335 (pI = 11,22) (MAQFLLFVYSLIIFLSLFF- GEAAFERTETRMLTIPCTSDDNCPKVISPCHTKCFDGFCGWYIE- GSYEGP; SEQ ID NO: 199) são ambos eficazes contra bactérias gram-negativas e gram-positivas bem como fungos. Em alguns casos, peptídeos NCR neutros e/ou aniônicos, como NCR001, não possuem atividades antimicrobianas a um pI maior do que cerca de 8.

[00152] Em alguns casos, o peptídeo NCR é eficaz para matar bactérias. Em alguns casos, o peptídeo NCR é eficaz para matar S. meli- loti, Xenorhabdus spp, Photorhabdus spp, Candidatus spp, Buchnera spp, Blattabacterium spp, Baumania spp, Wigglesworthia spp, Wolba- chia spp, Rickettsia spp, Orientia spp, Sodalis spp, Burkholderia spp, Cupriavidus spp, Frankia spp, Snirhizobium spp, Streptococcus spp, Wolinella spp, Xylella spp, Erwinia spp, Agrobacterium spp, Bacillus spp, Paenibacillus spp, Streptomyces spp, Micrococcus spp, Coryne- bacterium spp, Acetobacter spp, Cyanobacteria spp, Salmonella spp, Rhodococcus spp, Pseudomonas spp, Lactobacillus spp, Enterococcus spp, Alcaligenes spp, Klebsiella spp, Paenibacillus spp, Arthrobac- ter spp, Corynebacterium spp, Brevibacterium spp, Thermus spp, Pseudomonas spp, Clostridium spp, ou Escherichia spp.

[00153] Em alguns casos, o peptídeo NCR é uma variante funcionalmente ativa de um peptídeo NCR descrito aqui. Em alguns casos, a variante do peptídeo NCR tem pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo de uma região especificada ou ao longo de toda a sequência, com uma sequência de um peptídeo NCR descrito aqui ou peptídeo NCR derivado naturalmente.

[00154] Em alguns casos, o peptídeo NCR pode ser biomanipulado para modular a sua bioatividade, por exemplo, aumentar ou decrescer ou regular, ou para especificar um micro-organismo-alvo. Em alguns casos, o peptídeo NCR é produzido pela maquinaria de tradução (por exemplo, um ribossomo, etc.) de uma célula. Em alguns casos, o pep- tídeo NCR é sintetizado quimicamente. Em alguns casos, o peptídeo NCR é derivado de um precursor polipeptídico. O precursor polipeptí- dico pode sofrer clivagem (por exemplo, processamento por uma protease) para originar o próprio peptídeo NCR. Como tal, em alguns casos, o peptídeo NCR é produzido a partir de um polipeptídeo precursor. Em alguns casos, o peptídeo NCR inclui um polipeptídeo que sofreu modificações pós-tradução, por exemplo, clivagem, ou a adição de um ou mais grupos funcionais.

[00155] O peptídeo NCR descrito aqui pode ser formulado em uma composição para qualquer um dos usos descritos aqui. As composições reveladas aqui podem incluir qualquer número ou tipo de peptí- deos NCR, como pelo menos cerca de qualquer um de 1 peptídeo NCR, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, ou mais peptídeos NCR. Uma concentração adequada de cada peptídeo NCR na composição depende de fatores como eficácia, estabilidade do peptídeo NCR, número de peptídeos NCR distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição. Em alguns casos, cada peptídeo NCR em uma composição líquida vai desde cerca de 0,1 ng/mL até cerca de 100 mg/mL. Em alguns casos, cada peptídeo NCR em uma composição sólida vai desde cerca de 0,1 ng/g até cerca de 100 mg/g. Em alguns casos, em que a composição inclui pelo menos dois tipos de peptídeos NCR, a concentração de cada tipo de peptídeo NCR pode ser igual ou diferente.

[00156] Um agente modulador incluindo um peptídeo NCR como descrito aqui pode ser contatado com o hospedeiro-alvo em uma quantidade e durante um período de tempo suficiente para: (a) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de peptídeo NCR no interior de um hospedeiro-alvo; (b) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limi- te) de concentração de peptídeo NCR no interior do intestino de um hospedeiro-alvo; (c) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de peptídeo NCR no interior de um bacteriócito de um hospedeiro-alvo; (d) modular o nível, ou uma atividade, de um ou mais micro-organismos (por exemplo, endos- simbionte) no hospedeiro-alvo; ou/e (e) modular a aptidão do hospedeiro-alvo.

(e) Peptídeos Reguladores de Bacteriócitos

[00157] O agente modulador descrito aqui pode incluir um peptídeo regulador de bacteriócitos (BRP). BRP são peptídeos expressos nos bacteriócitos de insetos. Estes genes são expressos primeiramente em um momento do desenvolvimento coincidente com a incorporação de simbiontes e a sua expressão específica em bacteriócitos é mantida ao longo da vida do inseto. Em alguns casos, o BRP tem um domínio do terminal amino hidrofóbico, que se prevê ser um peptídeo sinal. Adicionalmente, alguns BRP têm um domínio rico em cisteína. Em alguns casos, o peptídeo regulador de bacteriócitos é uma proteína rica em cisteína específica de bacteriócitos (BCR). Os peptídeos reguladores de bacteriócitos têm um comprimento situado entre cerca de 40 e 150 aminoácidos. Em alguns casos, o peptídeo regulador de bacterió- citos tem um comprimento situado no intervalo de cerca de 45 até cerca de 145, cerca de 50 até cerca de 140, cerca de 55 até cerca de 135, cerca de 60 até cerca de 130, cerca de 65 até cerca de 125, cerca de 70 até cerca de 120, cerca de 75 até cerca de 115, cerca de 80 até cerca de 110, cerca de 85 até cerca de 105, ou qualquer intervalo entre esses. Exemplos não limitadores de BRP e suas atividades são listados na Tabela 8.Tabela 8: Exemplos de Peptídeos Reguladores de Bacteriócitos

[00158] Em alguns casos, o BRP altera o crescimento e/ou atividade de uma ou mais bactérias residentes no bacteriócito do hospedeiro. Em alguns casos, o BRP pode ser biomanipulado para modular a sua bioatividade (por exemplo, aumentar, decrescer, ou regular) ou para especificar um micro-organismo-alvo. Em alguns casos, o BRP é pro-duzido pela maquinaria de tradução (por exemplo, um ribossomo, etc.) de uma célula. Em alguns casos, o BRP é sintetizado quimicamente. Em alguns casos, o BRP é derivado de um precursor polipeptídico. O precursor polipeptídico pode sofrer clivagem (por exemplo, processa-mento por uma protease) para originar o polipeptídeo do próprio BRP. Como tal, em alguns casos, o BRP é produzido a partir de um polipep- tídeo precursor. Em alguns casos, o BRP inclui um polipeptídeo que sofreu modificações pós-tradução, por exemplo, clivagem, ou a adição de um ou mais grupos funcionais.

[00159] Variantes funcionalmente ativas dos BRP como descrito aqui também são úteis nas composições e métodos descritos aqui. Em alguns casos, a variante do BRP tem pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo de uma região especificada ou ao longo de toda a sequência, com uma sequência de um BRP descrito aqui ou BRP derivado naturalmente.

[00160] O BRP descrito aqui pode ser formulado em uma composição para qualquer um dos usos descritos aqui. As composições reveladas aqui podem incluir qualquer número ou tipo (por exemplo, classes) de BRP, como pelo menos cerca de qualquer um de 1 BRP, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, ou mais BRP. Uma concentração adequada de cada BRP na composição depende de fatores como eficácia, estabilidade do BRP, número de BRP distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição. Em alguns casos, cada BRP em uma composição líquida vai desde cerca de 0,1 ng/mL até cerca de 100 mg/mL. Em al-guns casos, cada BRP em uma composição sólida vai desde cerca de 0,1 ng/g até cerca de 100 mg/g. Em alguns casos, em que a composição inclui pelo menos dois tipos de BRP, a concentração de cada tipo de BRP pode ser igual ou diferente.

[00161] Um agente modulador incluindo um BRP como descrito aqui pode ser contatado com o hospedeiro-alvo em uma quantidade e durante um período de tempo suficiente para: (a) alcançar um nível- alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de BRP no interior de um hospedeiro-alvo; (b) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de BRP no interior do intestino de um hospedeiro-alvo; (c) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de BRP no interior de um bacteriócito de um hospedeiro-alvo; (d) modular o nível, ou uma atividade, de um ou mais microorganismos (por exemplo, endossimbionte) no hospedeiro-alvo; ou/e (e) modular a aptidão do hospedeiro-alvo.

iii. Moléculas Pequenas

[00162] Numerosas moléculas pequenas (por exemplo, um antibiótico ou um metabólito) podem ser usadas nas composições e métodos descritos aqui. Em alguns casos, uma concentração eficaz de qualquer molécula pequena descrita aqui pode alterar o nível, atividade, ou metabolismo de um ou mais micro-organismos (como descrito aqui) residentes em um hospedeiro, a alteração resultando em um aumento na aptidão do hospedeiro.

[00163] Um agente modulador compreendendo uma molécula pequena como descrito aqui pode ser contatado com o hospedeiro-alvo em uma quantidade e durante um período de tempo suficiente para: (a) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) da concentração de uma molécula pequena no interior de um hospedeiro-alvo; (b) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) da concentração de uma molécula pequena no interior do intestino de um hospedeiro-alvo; (c) alcançar um nível- alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) da concentração de uma molécula pequena no interior de um bacteriócito de um hospedeiro-alvo; (d) modular o nível, ou uma atividade, de um ou mais micro-organismos (por exemplo, endossimbionte) no hospedeiro-alvo; ou/e (e) modular a aptidão do hospedeiro-alvo.

(a) Antibióticos

[00164] O agente modulador descrito aqui pode incluir um antibiótico. Qualquer antibiótico conhecido na técnica pode ser usado. Antibióticos são usualmente classificados com base no seu mecanismo de ação, estrutura química, ou espectro de atividade.

[00165] O antibiótico descrito aqui pode visar qualquer função ou processos de crescimento bacterianos e pode ser bacteriostático (por exemplo, abranda ou previne o crescimento bacteriano) ou bactericida (por exemplo, mata bactérias). Em alguns casos, o antibiótico é um antibiótico bactericida. Em alguns casos, o antibiótico bactericida é um que visa a parede da célula bacteriana (por exemplo, penicilinas e ce- falosporinas); um que visa a membrana celular (por exemplo, polimixi- nas); ou um que inibe enzimas bacterianas essenciais (por exemplo, rifamicinas, lipiarmicinas, quinolonas e sulfonamidas). Em alguns casos, o antibiótico bactericida é um aminoglicosídeo. Em alguns casos, o antibiótico é um antibiótico bacteriostático. Em alguns casos, o anti-biótico bacteriostático visa a síntese de proteínas (por exemplo, ma- crólidos, lincosamidas e tetraciclinas). Classes adicionais de antibióticos que podem ser usados aqui incluem lipopeptídeos cíclicos (como daptomicina), glicilciclinas (como tigeciclina), oxazolidinonas (como linezolida), ou lipiarmicinas (como fidaxomicina). Exemplos de antibió-ticos incluem oxitetraciclina, doxiciclina, rifampicina, ciprofloxacina, ampicilina e polimixina B. Outros exemplos não limitadores de antibió-ticos se encontram na Tabela 9.Tabela 9: Exemplos de Antibióticos

[00166] O antibiótico descrito aqui pode ter qualquer nível de espe-cificidade para alvos (por exemplo, espectro pequeno ou largo). Em alguns casos, o antibiótico é um antibiótico de pequeno espectro, e assim visa tipos específicos de bactérias, como bactérias gram- negativas ou gram-positivas. Alternativamente, o antibiótico pode ser um antibiótico de largo espectro que visa uma gama ampla de bactérias.

[00167] Os antibióticos descritos aqui podem ser formulados em uma composição para qualquer um dos usos descritos aqui. As composições reveladas aqui podem incluir qualquer número ou tipo (por exemplo, classes) de antibióticos, como pelo menos cerca de qualquer um de 1 antibiótico, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, ou mais antibióticos (por exemplo, uma combinação de rifampicina e doxiciclina, ou uma combinação de ampicilina e rifampicina). Uma concentração adequada de cada antibiótico na composição depende de fatores como eficácia, estabilidade do antibiótico, número de antibióticos distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição. Em alguns casos, em que a composição inclui pelo menos dois tipos de antibióticos, a concentração de cada tipo de antibiótico pode ser igual ou diferente.

[00168] Um agente modulador incluindo um antibiótico como descrito aqui pode ser contatado com o hospedeiro-alvo em uma quantidade e durante um período de tempo suficiente para: (a) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de antibiótico no interior de um hospedeiro-alvo; (b) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de antibiótico no interior do intestino de um hospedeiro- alvo; (c) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de antibiótico no interior de um bacteriócito de um hospedeiro-alvo; (d) modular o nível, ou uma atividade, de um ou mais micro-organismos (por exemplo, endossimbionte) no hospedeiro-alvo; ou/e (e) modular a aptidão do hospedeiro-alvo.

(b) Metabólitos Secundários

[00169] Em alguns casos, o agente modulador das composições e métodos descritos aqui inclui um metabólito secundário. Metabólitos secundários são derivados de moléculas orgânicas produzidas por um organismo. Metabólitos secundários podem atuar (i) como agentes competitivos usados contra bactérias, fungos, amibas, plantas, insetos e animais grandes; (ii) como agentes veículoes de metais; (iii) como agentes de simbiose entre micróbios e plantas, insetos e animais su-periores; (iv) como hormônios sexuais; e (v) como efetores de diferen-ciação. Exemplos não limitadores de metabólitos secundários se en-contram na Tabela 10. Tabela 10: Exemplos de Metabólitos Secundários

[00170] O metabólito secundário usado aqui pode incluir um meta- bólito de qualquer grupo conhecido de metabólitos secundários. Por exemplo, metabólitos secundários podem ser classificados nos seguintes grupos: alcaloides, terpenoides, flavonoides, glicosídeos, fenóis naturais (por exemplo, ácido gossipol-acético), enais (por exemplo, trans-cinamaldeído), fenazinas, bifenóis e dibenzofuranos, policetídeos, peptídeos de ácido graxo sintase, peptídeos não ribossômicos, peptí- deos ribossomicamente sintetizados e modificados de modo pós- tradução, polifenóis, polissacarídeos (por exemplo, quitosana), e bio- polímeros. Para uma revisão profunda de metabólitos secundários ver, por exemplo, Vining, Annu. Rev. Microbiol. 44:395-427, 1990.

[00171] Metabólitos secundários úteis para composições e métodos descritos aqui incluem os que alteram uma função natural de um en- dossimbionte (por exemplo, endossimbionte primário ou secundário), bacteriócito, ou simbionte extracelular. Em alguns casos, um ou mais metabólitos secundários descritos aqui são isolados de um rastreio de alto rendimento (HTS) quanto a compostos antimicrobianos. Por exemplo, um rastreio HTS identificou 49 extratos antibacterianos que têm especificidade contra bactérias gram-positivas e gram-negativas de mais de 39 000 extratos brutos de organismos crescendo em diversos ecossistemas de uma região específica. Em alguns casos, o me- tabólito secundário é transportado no interior de um bacteriócito.

[00172] Em alguns casos, a molécula pequena é um inibidor da síntese de vitaminas. Em alguns casos, o inibidor da síntese de vitaminas é um análogo de um precursor de vitamina. Em certos casos, o análogo de um precursor de vitamina é pantotenol.

[00173] Em alguns casos, a molécula pequena é um análogo de ami- noácido. Em certos casos, o análogo de aminoácido é L-canvanina, D- arginina, D-valina, D-metionina, D-fenilalanina, D-histidina, D-triptofano, D-treonina, D-leucina, L-NG-nitroarginina, ou uma combinação desses.

[00174] Em alguns casos, a molécula pequena é um composto an- timicrobiano natural, como ácido propiônico, ácido levulínico, trans- cinemaldeído, nisina, ou quitosana de baixo peso molecular. O meta- bólito secundário descrito aqui pode ser formulado em uma composição para qualquer um dos usos descritos aqui. As composições reveladas aqui podem incluir qualquer número ou tipo (por exemplo, classes) de metabólitos secundários, como pelo menos cerca de qualquer um de 1 metabólito secundário, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, ou mais metabóli- tos secundários. Uma concentração adequada de cada metabólito secundário na composição depende de fatores como eficácia, estabilidade do metabólito secundário, número de metabólitos secundários distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição. Em alguns casos, em que a composição inclui pelo menos dois tipos de me- tabólitos secundários, a concentração de cada tipo de metabólito secundário pode ser igual ou diferente.

[00175] Um agente modulador incluindo um metabólito secundário como descrito aqui pode ser contatado com o hospedeiro-alvo em uma quantidade e durante um período de tempo suficiente para: (a) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de metabólito secundário no interior de um hospedeiro- alvo; (b) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de metabólito secundário no interior do intestino de um hospedeiro-alvo; (c) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de metabólito secundário no interior de um bacteriócito de um hospedeiro-alvo; (d) modular o nível, ou uma atividade, de um ou mais micro-organismos (por exemplo, endossimbionte) no hospedeiro-alvo; ou/e (e) modular a aptidão do hospedeiro-alvo.

iv. Bactérias como agentes moduladores

[00176] Em alguns casos, o agente modulador descrito aqui inclui uma ou mais bactérias. Numerosas bactérias são úteis nas composições e métodos descritos aqui. Em alguns casos, o agente é uma espécie bacteriana endogenamente presente no hospedeiro. Em alguns casos, o agente modulador bacteriano é uma espécie bacteriana en- dossimbiótica. Exemplos não limitadores de bactérias que podem ser usadas como agentes moduladores incluem todas as espécies bacte- rianas descritas aqui na Seção II da descrição detalhada e aquelas listadas na Tabela 1. Por exemplo, o agente modulador pode ser uma espécie bacteriana de quaisquer filos bacterianos presentes nos intes-tinos e/ou hemocele de insetos, incluindo Gammaproteobacteria, Al- phaproteobactera, Betaproteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes (por exemplo, Lactobacillus e Bacillus spp.), Clostridia, Actinomycetes, Spi-rochetes, Verrucomicrobia e Actinobacteria.

[00177] Em alguns casos, o agente modulador é uma bactéria que promove a diversidade microbiana ou altera de qualquer outro modo a microbiota do hospedeiro de um modo favorável. Em um caso, bactérias podem ser proporcionadas para promover o desenvolvimento do microbioma em insetos.

[00178] Os agentes moduladores bacterianos discutidos aqui podem ser usados para alterar o nível, atividade, ou metabolismo de micro-organismos-alvo como indicado nas seções para aumentar a aptidão de insetos, como grilos, gafanhotos ou acrídios.

[00179] Em alguns casos, tais agentes moduladores bacterianos são bactérias que são capazes de produzir nutrientes, incluindo ami- noácidos (por exemplo, metionina). As bactérias produtoras de nutrientes podem ser bactérias de ocorrência natural, por exemplo, bactérias de ocorrência natural exógenas ao hospedeiro de inseto. Tais bactérias podem ser isoladas de uma população de bactérias, como as presentes em uma amostra ambiental. Podem ser isoladas bactérias que produzem um ou mais aminoácidos de um modo que aumenta a pro- dução de aminoácidos no hospedeiro relativamente a um hospedeiro ao qual não foram administradas as bactérias produtoras de aminoáci- dos. Aminoácidos que podem ser produzidos pelas bactérias no hospedeiro incluem metionina, alanina, arginina, asparagina, ácido aspár- tico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glutamato, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treo- nina, triptofano, tirosina, ou valina. Em certos casos, as bactérias pro-dutoras de aminoácidos são bactérias produtoras de metionina.

[00180] Em alguns casos, as bactérias produtoras de nutrientes (por exemplo, bactérias produtoras de aminoácidos, por exemplo, bactérias produtoras de metionina) estão presentes a uma concentração de pelo menos 100 000 células/mL (por exemplo, pelo menos cerca de 100 000 células/mL, pelo menos cerca de 150 000 células/mL, pelo menos cerca de 200 000 células/mL, pelo menos cerca de 250 000 células/mL, pelo menos cerca de 300 000 células/mL, pelo menos cerca de 350 000 células/mL, pelo menos cerca de 400 000 células/mL, pelo menos cerca de 450 000 células/mL, ou pelo menos cerca de 500 000 células/mL).

[00181] Os Exemplos 1 a 4 e 8 descrevem como podem ser identificados micro-organismos produtores de metionina que então podem ser usados como agentes moduladores em hospedeiros de insetos, como grilos, ou no organismo-modelo Drosophila, para aumentar a aptidão dos hospedeiros (por exemplo, aumentar o teor de aminoácidos (por exemplo, teor de metionina)). Por exemplo, em certos casos, o teor de nutrientes é aumentado no hospedeiro antes do uso do hospedeiro na fabricação de alimentos ou rações.

[00182] Em alguns casos, tais agentes moduladores bacterianos são bactérias que são capazes de degradar pesticidas como apresentados na Tabela 12 incluindo inseticidas. Tais inseticidas incluem neo- nicotinoides como imidacloprida, ou inseticidas organofosforados, co mo fenitrotion. Em alguns casos, as bactérias metabolizadoras de pes-ticidas estão presentes a uma concentração de pelo menos 100 000 células/mL (por exemplo, pelo menos cerca de 100 000 células/mL, pelo menos cerca de 150 000 células/mL, pelo menos cerca de 200 000 células/mL, pelo menos cerca de 250 000 células/mL, pelo menos cerca de 300 000 células/mL, pelo menos cerca de 350 000 célu- las/mL, pelo menos cerca de 400 000 células/mL, pelo menos cerca de 450 000 células/mL, ou pelo menos cerca de 500 000 células/mL).

[00183] Os Exemplos 5 e 6 descrevem como podem ser identificados micro-organismos que degradam imidacloprida e fenitrotion que então podem ser usados como agentes moduladores em hospedeiros de insetos, como grilos, dotando os hospedeiros de insetos tratados de uma vantagem competitiva. É entendido que a administração de tais micro-organismos que degradam pesticidas, por exemplo, microorganismos que degradam imidacloprida ou fenitrotion, a hospedeiros de insetos como abelhas melíferas está abrangida pela alteração de um nível, atividade, ou metabolismo de um ou mais micro-organismos residentes no hospedeiro.

v. Modificações em agentes moduladores (a) Fusões

[00184] Quaisquer dos agentes moduladores descritos aqui podem ser fundidos ou ligados a uma fração adicional. Em alguns casos, o agente modulador inclui uma fusão de uma ou mais frações adicionais (por exemplo, 1 fração adicional, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais frações adicionais). Em alguns casos, a fração adicional é qualquer um dos agentes moduladores descritos aqui (por exemplo, um peptídeo, polipeptídeo, molécula pequena, ou antibiótico). Alternativamente, a própria fração adicional pode não atuar como agente modulador mas, ao invés, pode ter uma função secundária. Por exemplo, a fração adicional pode ajudar o agente modulador a acessar, se ligar, ou ficar ati- vado em um sítio-alvo no hospedeiro (por exemplo, no intestino de um hospedeiro ou bacteriócito de um hospedeiro) ou em um micro-orga-nismo-alvo residente no hospedeiro (por exemplo, um grilo, um gafa-nhoto, ou um acrídio).

[00185] Em alguns casos, a fração adicional pode ajudar o agente modulador a penetrar em uma célula hospedeira-alvo ou micro- organismo-alvo residente no hospedeiro. Por exemplo, a fração adicional pode incluir um peptídeo penetrador de células. Peptídeos pene- tradores em células (CPP) podem ser sequências naturais derivadas de proteínas; peptídeos quiméricos que são formados pela fusão de duas sequências naturais; ou CPP sintéticos, que são sequências sinteticamente planejadas com base em estudos de estrutura-atividade. Em alguns casos, CPP têm a capacidade de atravessar ubiquamente membranas celulares (por exemplo, membranas celulares procarióti- cas e eucarióticas) com toxicidade limitada. Além disso, CPP podem ter a capacidade para atravessar membranas celulares via mecanismos dependentes e/ou independentes da energia, sem a necessidade de um reconhecimento quiral por receptores específicos. CPP podem ser ligados a quaisquer dos agentes moduladores descritos aqui. Por exemplo, um CPP pode ser ligado a um peptídeo antimicrobiano (AMP), por exemplo, um peptídeo de escorpião, por exemplo, UY192 fundido a um peptídeo penetrador de células (por exemplo, YGRK- KRRQRRRFLSTIWNGIKGLLFAM; SEQ ID NO: 226). Exemplos não limitadores de CPP são listados na Tabela 11.Tabela 11: Exemplos de Peptídeos Penetradores em Células (CPP)

[00186] Em outros casos, a fração adicional ajuda o agente modu- lador a se ligar a um micro-organismo-alvo (por exemplo, um fungo ou bactéria) residente no hospedeiro. A fração adicional pode incluir um ou mais domínios de direcionamento. Em alguns casos, o domínio de direcionamento pode dirigir o agente modulador para um ou mais micro-organismos (por exemplo, bactéria ou fungo) residentes no intestino do hospedeiro. Em alguns casos, o domínio de direcionamento pode dirigir o agente modulador para uma região específica do hospedeiro (por exemplo, intestino ou bacteriócito do hospedeiro) para acessar micro-organismos que estão geralmente presentes na referida região do hospedeiro. Por exemplo, o domínio de direcionamento pode dirigir o agente modulador para o intestino anterior, intestino médio, ou intes- tino posterior do hospedeiro. Em outros casos, o domínio de direcio-namento pode dirigir o agente modulador para um bacteriócito no hos-pedeiro e/ou uma ou mais bactérias específicas residentes em um bacteriócito do hospedeiro.

(b) Pré- ou Pró-domínios

[00187] Em alguns casos, o agente modulador pode incluir uma pré- ou pró-sequência de aminoácido. Por exemplo, o agente modula- dor pode ser uma proteína ou peptídeo inativo que pode ser ativado por clivagem ou modificação pós-tradução de uma pré- ou pró-sequência. Em alguns casos, o agente modulador é manipulado com uma pré- ou pró-sequência inativadora. Por exemplo, a pré- ou pró-sequência pode obscurecer um sítio de ativação no agente modulador, por exemplo, um sítio de ligação a receptores, ou pode induzir uma alteração conformacional no agente modulador. Assim, por clivagem da pré- ou pró-sequência, o agente modulador é ativado.

[00188] Alternativamente, o agente modulador pode incluir uma pré- ou pró-molécula pequena, por exemplo, um antibiótico. O agente mo- dulador pode ser uma molécula pequena inativa descrita aqui que pode ser ativada em um ambiente-alvo no interior do hospedeiro. Por exemplo, a molécula pequena pode ser ativada ao ser alcançado um certo pH no intestino do hospedeiro. Por exemplo, o domínio de direcionamento pode ser lectina ou aglutinina de Galanthus nivalis (GNA) ligado a um agente modulador descrito aqui, por exemplo, um AMP, por exemplo, um peptídeo de escorpião, por exemplo, Uy192.

(c) Ligadores

[00189] Em casos em que o agente modulador é conectado a uma fração adicional, o agente modulador pode adicionalmente incluir um ligador. Por exemplo, o ligador pode ser uma ligação química, por exemplo, uma ou mais ligações covalentes ou ligações não covalentes. Em alguns casos, o ligador pode ser um ligador peptídico (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 25, 30, 35, 40, ou mais aminoácidos de comprimento). O ligador pode incluir quaisquer ligado- res flexíveis, rígidos, ou cliváveis descritos aqui.

[00190] Um ligador peptídico flexível pode incluir quaisquer dos habi-tualmente usados na técnica, incluindo ligadores tendo sequências que têm maioritariamente resíduos Gly e Ser (ligador "GS"). Ligadores flexí-veis podem ser úteis para unir domínios que requerem um certo grau de movimento ou interação e podem incluir aminoácidos pequenos, não polares (por exemplo, Gly) ou polares (por exemplo, Ser ou Thr).

[00191] Alternativamente, um ligador peptídico pode ser um ligador rígido. Ligadores rígidos são úteis para manter uma distância fixa entre frações e para manter suas funções independentes. Ligadores rígidos também podem ser úteis quando uma separação espacial dos domínios é crítica para conservar a estabilidade ou bioatividade de um ou mais componentes da fusão. Ligadores rígidos podem, por exemplo, ter uma estrutura em hélice alfa ou sequência rica em Pro, (XP)n, com X designando qualquer aminoácido, preferencialmente Ala, Lys ou Glu.

[00192] Ainda em outros casos, um ligador peptídico pode ser um ligador clivável. Em alguns casos, ligadores podem ser clivados sob condições específicas, como a presença de reagentes redutores ou proteases. Ligadores cliváveis in vivo podem utilizar a natureza reversível de uma ligação dissulfeto. Um exemplo inclui uma sequência sensível a trombina (por exemplo, PRS) entre dois resíduos Cys. O tratamento com trombina in vitro de CPRSC resulta na clivagem da sequência sensível a trombina, enquanto a ligação dissulfeto reversível permanece intata. Tais ligadores são conhecidos e descritos, por exemplo, em Chen et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 65(10):1357-1369, 2013. A clivagem de ligadores em fusões também pode ser efetuada por proteases que são expressas in vivo sob condições em células ou tecidos específicos do hospedeiro ou micro-organismos residentes no hospedeiro. Em alguns casos, a clivagem do ligador pode liberar um agente modulador livre funcional ao alcançar um sítio ou célula-alvo.

[00193] Fusões descritas aqui podem alternativamente ser ligadas por uma molécula ligadora, incluindo um ligador hidrofóbico, como um grupo sulfonato de carga negativa; lipídeos, como cadeias poli(--CH2-- )hidrocarbonadas, como o grupo polietilenoglicol (PEG), suas variantes insaturadas, suas variantes hidroxiladas, suas variantes amidadas ou de outro modo contendo N, ligadores não carbonados; ligadores de carboidratos; ligadores fosfodiéster, ou outra molécula capaz de ligar covalentemente duas ou mais moléculas, por exemplo, dois agentes moduladores. Ligadores não covalentes podem ser usados, como gló-bulos lipídicos hidrofóbicos aos quais o agente modulador é ligado, por exemplo, através de uma região hidrofóbica do agente modulador ou uma extensão hidrofóbica do agente modulador, como uma série de resíduos ricos em leucina, isoleucina, valina, ou talvez também alani- na, fenilalanina, ou mesmo tirosina, metionina, glicina, ou outro resíduo hidrofóbico. O agente modulador pode ser ligado usando química à base da carga, de modo que uma fração com carga positiva do agente modulador é ligada a uma carga negativa de outro agente modulador ou uma fração adicional.

IV. Formulações e Composições

[00194] As composições descritas aqui podem ser formuladas em forma pura (por exemplo, a composição contém apenas o agente mo- dulador) ou juntamente com um ou mais agentes adicionais (como ex- cipiente, veículo de administração, veículo, diluente, estabilizador, etc.) para facilitar a aplicação ou administração das composições. Exemplos de excipientes e diluentes adequados incluem, mas não se limitam a, lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amidos, goma acácia, fosfato de cálcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, água, so- lução salina, xarope, metilcelulose, hidroxibenzoatos de metila e propila, talco, estearato de magnésio e óleo mineral.

[00195] Em alguns casos, a composição inclui um veículo de admi-nistração ou veículo. Em alguns casos, o veículo de administração inclui um excipiente. Excipientes exemplificativos incluem, mas não se limitam a, materiais veículoes sólidos ou líquidos, solventes, estabilizadores, excipientes de liberação lenta, corantes e substâncias com atividade de superfície (surfactantes). Em alguns casos, o veículo de administração é um veículo estabilizador. Em alguns casos, o veículo estabilizador inclui um excipiente estabilizador. Excipientes estabilizadores exemplificativos incluem, mas não se limitam a, óleos vegetais epoxidados, agentes antiespumantes, por exemplo, óleo de silicone, conservantes, reguladores da viscosidade, agentes de ligação e taqui- ficantes. Em alguns casos, o veículo estabilizador é um tampão adequado para o agente modulador. Em alguns casos, a composição é microencapsulada em um veículo de administração de esférulas poli- méricas. Em alguns casos, o veículo estabilizador protege o agente modulador contra UV e/ou condições acídicas. Em alguns casos, o veículo de administração contém um tampão do pH. Em alguns casos, a composição é formulada de modo a ter um pH situado no intervalo de cerca de 4,5 até cerca de 9,0, incluindo, por exemplo, intervalos de pH de cerca de qualquer um de 5,0 até cerca de 8,0, cerca de 6,5 até cerca de 7,5, ou cerca de 6,5 até cerca de 7,0.

[00196] Dependendo dos objetivos pretendidos e circunstâncias prevalecentes, a composição pode ser formulada em concentrados emulsificáveis, concentrados em suspensão, soluções diretamente pulverizáveis ou diluíveis, pastas revestíveis, emulsões diluídas, pós para pulverização, pós solúveis, pós dispersíveis, pós molháveis, poei-ras, grânulos, encapsulações em substâncias poliméricas, microcápsu- las, espumas, aerossóis, preparações com dióxido de carbono gasoso, comprimidos, preparações de resina, preparações de papel, preparações de artigos não tecidos, ou preparações de artigos tricotados ou tecidos. Em alguns casos, a composição é um líquido. Em alguns casos, a composição é um sólido. Em alguns casos, a composição é um aerossol, como em uma lata de aerossol pressurizado. Em alguns casos, a composição está presente nos resíduos (como fezes) da praga. Em alguns casos, a composição está presente em ou sobre uma praga viva.

[00197] Em alguns casos, o veículo de administração é o alimento ou água do hospedeiro. Em outros casos, o veículo de administração é uma fonte de alimento para o hospedeiro. Em alguns casos, o veículo de administração é uma isca alimentar para o hospedeiro. Em alguns casos, a composição é um agente comestível consumido pelo hospedeiro. Em alguns casos, a composição é administrada pelo hospedeiro a um segundo hospedeiro e é consumida pelo segundo hospedeiro. Em alguns casos, a composição é consumida pelo hospedeiro ou um segundo hospedeiro e a composição é liberada nas redondezas do hospedeiro ou do segundo hospedeiro via os resíduos (como fezes) do hospedeiro ou do segundo hospedeiro. Em alguns casos, o agente modulador é incluído em uma isca alimentar destinada a ser consumida por um hospedeiro ou transportada de novo para a sua colônia.

[00198] Em alguns casos, o agente modulador pode perfazer cerca de 0,1% até cerca de 100% da composição, como qualquer um de cerca de 0,01% até cerca de 100%, cerca de 1% até cerca de 99,9%, cerca de 0,1% até cerca de 10%, cerca de 1% até cerca de 25%, cerca de 10% até cerca de 50%, cerca de 50% até cerca de 99% ou cerca de 0,1% até cerca de 90% de ingredientes ativos (como fago, lisina ou bacteriocina). Em alguns casos, a composição inclui pelo menos quaisquer de 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais de ingredientes ativos (como fago, lisina ou bacteriocina). Em alguns casos, os agentes concentrados são pre-ferenciais como produtos comerciais, o usuário final normalmente usa agentes diluídos, que têm uma concentração substancialmente menor de ingrediente ativo.

[00199] Quaisquer das formulações descritas aqui podem ser usadas na forma de uma isca, uma espira, uma esteira elétrica, uma preparação fumígena, um fumigante, ou uma folha.

i. Formulações Líquidas

[00200] As composições proporcionadas aqui podem estar em uma formulação líquida. Formulações líquidas são geralmente misturadas com água, mas em alguns casos podem ser usadas com Crop Oil, combustível diesel, querosene ou outro óleo leve como veículo. A quantidade de ingrediente ativo muitas vezes varia desde cerca de 0,5 até cerca de 80 por cento em peso.

[00201] Uma formulação de concentrado emulsificável pode conter um ingrediente ativo líquido, um ou mais solventes à base de petróleo e um agente que permite que a formulação seja misturada com água para formar uma emulsão. Tais concentrados podem ser usados em formulações para pragas agrícolas, ornamentais e de grama, silvicultura, estruturais, de processamento de alimentos, gado e saúde pública. Estes podem ser adaptáveis a equipamento de aplicação desde pequenos pulverizadores portáteis até pulverizadores hidráulicos, pulverizadores terrestres de baixo volume, sopradores de névoa e pulverizadores aéreos de baixo volume. Alguns ingredientes ativos são prontamente dissolvidos em um veículo líquido. Quando misturados com um veículo, formam uma solução que não sedimenta nem se separa, por exemplo, uma solução homogênea. Formulações destes tipos podem incluir um ingrediente ativo, um veículo e um ou mais ingredientes diferentes. Soluções podem ser usadas em qualquer tipo de pulverizador, dentro de portas e ao ar livre.

[00202] Em alguns casos, a composição pode ser formulada como uma emulsão inversa. Uma emulsão inversa é um ingrediente ativo solúvel em água disperso em um veículo oleoso. Emulsões inversas requerem um emulsificador que permite que o ingrediente ativo seja misturado com um grande volume de veículo à base de petróleo, usualmente óleo combustível. Emulsões inversas ajudam a reduzir a deriva. Com outras formulações ocorre alguma deriva de pulverização quando gotículas de água começam a evaporar antes de alcançarem superfícies-alvo; em resultado, as gotículas se tornam muito pequenas e leves. Uma vez que o óleo evapora mais lentamente do que a água, gotículas de emulsões inversas encolhem menos e mais ingrediente ativo alcança o alvo. O óleo ajuda adicionalmente a reduzir o escoamento e melhora a resistência à chuva. Também serve como fixador- espalhador ao melhorar a cobertura e absorção da superfície. Uma vez que gotículas são relativamente grandes e pesadas, é difícil obter uma cobertura extensa nos lados inferiores da folhagem. Emulsões inversas são muito habitualmente usadas ao longo de vias onde derivas para áreas diferentes alvo suscetíveis podem ser um problema.

[00203] Uma formulação fluida ou líquida combina muitas das ca-racterísticas de concentrados emulsificáveis e pós molháveis. Os fa-bricantes usam estas formulações quando o ingrediente ativo é um sólido que não se dissolve em água ou em óleo. O ingrediente ativo, impregnado em uma substância como argila, é triturado em um pó muito fino. O pó é então suspenso em uma pequena quantidade de líquido. O produto líquido resultante é bastante espesso. Fluidos e líquidos partilham muitas das características de concentrados emulsifi- cáveis e têm desvantagens similares. Requerem agitação moderada para ajudar a manter os mesmos em suspensão e deixam resíduos visíveis, similares aos de pós molháveis.

[00204] Fluidos/líquidos são fáceis de manejar e aplicar. Uma vez que são líquidos, estão sujeitos a derramamentos e salpicos. Contêm partículas sólidas, de modo que contribuem para o desgaste abrasivo de bocais e bombas. Suspensões fluidas e líquidas sedimentam em seus recipientes. Uma vez que formulações fluidas e líquidas tendem a sedimentar, o embalamento em recipientes de cinco galões ou menos facilita a remistura.

[00205] Formulações em aerossol contêm um ou mais ingredientes ativos e um solvente. A maior parte dos aerossóis contém uma baixa percentagem de ingredientes ativos. Há dois tipos de formulações em aerossol—o tipo pronto-a-usar habitualmente disponível em recipientes selados pressurizados e aqueles produtos usados em geradores de aerossóis elétricos ou alimentados a gasolina que liberam a formulação como um fumo ou nevoeiro.

[00206] Formulações em aerossol prontas a usar são usualmente unidades pequenas, autocontidas que liberam a formulação quando a válvula do bocal é acionada. A formulação é conduzida através de uma abertura fina por um gás inerte sob pressão, criando gotículas finas. Estes produtos são usados em estufas, em pequenas áreas no interior de edifícios, ou em áreas exteriores localizadas. Os modelos comerciais, que contêm cinco até 5 libras de ingrediente ativo, usualmente podem ser reabastecidos.

[00207] Formulações em aerossol de fumo ou nevoeiro não estão sob pressão. São usadas em máquinas que separam a formulação líquida em uma névoa ou nevoeiro fino (aerossol) usando um disco ou superfície aquecida rodopiando rapidamente.

ii. Formulações Secas ou Sólidas

[00208] As formulações secas podem ser divididas em dois tipos: prontas-a-usar e concentrados que devem ser misturados com água para serem aplicados como uma pulverização. A maior parte das formulações em poeiras são prontas a usar e contêm uma baixa percen- tagem de ingredientes ativos (menos de cerca de 10 por cento em peso), mais um veículo inerte muito fino, seco feito de talco, giz, argila, cascas de nozes, ou cinza vulcânica. O tamanho das partículas de poeiras individuais varia. Algumas formulações em poeiras são concentrados e contêm uma elevada percentagem de ingredientes ativos. Misturar estas com veículoes inertes secos antes da aplicação. As poeiras são sempre usadas secas e podem facilmente sofrer deriva para sítios diferentes do alvo.

iii. Formulações em Grânulos ou Péletes

[00209] Em alguns casos, a composição é formulada como grânulos. Formulações granulares são similares a formulações em poeiras, com a exceção de as partículas granulares serem maiores e mais pesadas. As partículas grossas podem ser feitas de materiais como argila, sabugos de milho, ou cascas de nozes. O ingrediente ativo reveste o exterior dos grânulos ou é absorvido naqueles. A quantidade de ingrediente ativo pode ser relativamente baixa, usualmente variando desde cerca de 0,5 até cerca de 15 por cento em peso. Formulações granulares são muito frequentemente usadas para aplicação no solo, insetos vivendo no solo, ou absorção em plantas através das raízes. Formulações granulares são por vezes aplicadas por avião ou helicóptero para minimizar a deriva ou para penetrar em vegetação densa. Depois de aplicados, os grânulos podem liberar o ingrediente ativo lentamente. Alguns grânulos requerem umidade do solo para liberar o ingrediente ativo. Formulações granulares também são usadas para controlar mosquitos larvares e outras pragas aquáticas. Grânulos são usados em operações de controle de pragas agrícolas, estruturais, ornamentais, de gramados, aquáticas, vias e saúde pública (insetos mordedores).

[00210] Em alguns casos, a composição é formulada como péletes. A maior parte das formulações em péletes são muito similares a for- mulações granulares; os termos são usados alternadamente. No entanto, em uma formulação em péletes, todas as partículas têm o mesmo peso e formato. A uniformidade das partículas permite o uso com equipamento de aplicação de precisão.

iv. Pós

[00211] Em alguns casos, a composição é formulada como um pó. Em alguns casos, a composição é formulada como um pó molhável. Pós molháveis são formulações secas, finamente trituradas que parecem poeiras. Usualmente devem ser misturadas com água para aplicação como uma pulverização. No entanto, alguns produtos podem ser aplicados como uma poeira ou como um pó molhável—a escolha é deixada ao aplicador. Pós molháveis têm cerca de 1 até cerca de 95 por cento de ingrediente ativo em peso; em alguns casos mais do que cerca de 50 por cento. As partículas não se dissolvem em água. Sedimentam rapidamente a menos que sejam constantemente agitadas para as manter suspensas. Podem ser usadas para a maior parte dos problemas de pragas e na maior parte dos tipos de equipamento de pulverização onde a agitação é possível. Os pós molháveis têm excelente atividade residual. Devido às suas propriedades físicas, a maior parte da formulação permanece na superfície de materiais porosos tratados como concreto, reboco e madeira não tratada. Em tais casos, somente a água penetra no material.

[00212] Em alguns casos, a composição é formulada como um pó solúvel. Formulações em pó solúvel parecem ser pós molháveis. No entanto, quando misturadas com água, os pós solúveis se dissolvem prontamente e formam uma verdadeira solução. Depois de serem ex-tensamente misturados, não é necessária nenhuma agitação adicional. A quantidade de ingrediente ativo em pós solúveis varia desde cerca de 15 até cerca de 95 por cento em peso; em alguns casos mais do que cerca de 50 por cento. Os pós solúveis têm todas as vantagens dos pós molháveis e nenhuma das desvantagens, excetuando o perigo de inalação durante o processo de mistura.

[00213] Em alguns casos, a composição é formulada como um grânulo dispersível em água. Grânulos dispersíveis em água, também co-nhecidos como fluidos secos, são como pós molháveis, com a exceção de, em vez de serem do tipo poeiras, serem formulados como pequenos grânulos facilmente medidos. Os grânulos dispersíveis em água devem ser misturados com água para serem aplicados. Uma vez em água, os grânulos se separam em partículas finas similares a pós molháveis. A formulação requer agitação constante para a manter suspensa em água. A percentagem de ingrediente ativo é elevada, muitas vezes tanto quanto 90 por cento em peso. Os grânulos disper- síveis em água partilham muitas das mesmas vantagens e desvantagens dos pós molháveis, com a exceção de serem mais facilmente medidos e misturados. Devido ao fraco empoeiramento, têm menos perigo de inalação para o aplicador durante o manejo.

v. Isca

[00214] Em alguns casos, a composição inclui uma isca. A isca pode estar em qualquer forma adequada, como um sólido, pasta, pélete ou forma em pó. A isca também pode ser transportada pelo hospedeiro de novo para uma população do referido hospedeiro (por exemplo, uma colônia ou colmeia). A isca pode então atuar como fonte de alimento para outros membros da colônia, desse modo proporcionando um agente modulador eficaz para um grande número de hospedeiros e potencialmente uma colônia completa de hospedeiros.

[00215] As iscas podem ser proporcionadas em um "compartimento" ou "armadilha" adequado. Tais compartimentos e armadilhas estão disponíveis no mercado e as armadilhas existentes podem ser adaptadas para incluírem as composições descritas aqui. O compartimento ou armadilha pode ter o formato de uma caixa, por exemplo, e pode ser proporcionado em um estado pré-formado ou pode ser formado por cartão dobrável, por exemplo. Materiais adequados para um com-partimento ou armadilha incluem plásticos e cartão, particularmente cartão corrugado. As superfícies internas das armadilhas podem ser revestidas com uma substância pegajosa para restringir o movimento do hospedeiro depois de estar dentro da armadilha. O compartimento ou armadilha pode conter uma depressão adequada cujo interior pode manter a isca no devido lugar. Uma armadilha é distinta de um com-partimento pois o hospedeiro não pode abandonar facilmente uma ar-madilha depois de ter entrado, ao passo que um compartimento atua como uma "estação de nutrição" que dota o hospedeiro de um ambiente preferido onde pode se alimentar e sentir-se seguro de predadores.

vi. Atratores

[00216] Em alguns casos, a composição inclui um atrator (por exemplo, um quimioatrator). O atrator pode atrair um hospedeiro adulto ou hospedeiro imaturo (por exemplo, larva) para a vizinhança da composição. Atratores incluem feromônios, um químico que é secreta- do por um animal, especialmente um inseto, que influencia o compor-tamento ou desenvolvimento de outros da mesma espécie. Outros atratores incluem açúcar e xaropes de hidrolisados de proteínas, leve-duras e carne podre. Os atratores também podem ser combinados com um ingrediente ativo e pulverizados sobre folhagem ou outros itens na área de tratamento.

[00217] São conhecidos vários atratores que influenciam o compor-tamento do hospedeiro, como a busca de um hospedeiro por alimento, oviposição ou locais de acasalamento, ou parceiros de acasalamento. Atratores úteis nos métodos e composições descritas aqui incluem, por exemplo, eugenol, propionato de fenetila, dimetilisobutil-ciclopropano- carboxilato de etila, benzodioxancarboxilato de propila, cis-7,8-epoxi-2- metiloctadecano, trans-8,trans-0-dodecadienol, cis-9-tetradecenal (com cis-11-hexadecenal), trans-11-tetradecenal, cis-11-hexadecenal, (Z)-11,12-hexadecadienal, acetato de cis-7-dodecenila, acetato de cis- 8-dodecenila, acetato de cis-9-dodecenila, acetato de cis-9-tetradece- nila, acetato de cis-11-tetradecenila, acetato de trans-11-tetradecenila (com cis-11), acetato de cis-9,trans-11-tetradecadienila (com cis-9, trans-12), acetato de cis-9,trans-12-tetradecadienila, acetato de cis- 7,cis-11-hexadecadienila (com cis-7,trans-11), acetato de cis-3,cis-13- octadecadienila, acetato de trans-3,cis-13-octadecadienila, anetol e salicilato de isoamila.

[00218] Meios diferentes de quimioatratores também podem ser usados para atrair insetos, incluindo luzes de vários comprimentos de onda ou cores.

vii. Nanocápsulas/Microencapsulação/Lipossomos

[00219] Em alguns casos, a composição é proporcionada em uma formulação microencapsulada. Formulações microencapsuladas são misturadas com água e pulverizadas do mesmo modo de outras for-mulações pulverizáveis. Após a pulverização, o revestimento de plástico se degrada e libera lentamente o ingrediente ativo.

viii. Veículoes

[00220] Quaisquer das composições descritas aqui podem ser for-muladas de modo a incluírem o agente modulador descrito aqui e um veículo inerte. Tal veículo pode ser um veículo sólido, um veículo líquido, veículo em gel e/ou um veículo gasoso. Em certos casos, o veículo pode ser um revestimento de sementes. O revestimento de sementes é qualquer formulação de ocorrência não natural que adere, na totalidade ou em parte, à superfície da semente. A formulação pode adicionalmente incluir um adjuvante ou surfactante. A formulação também pode incluir um ou mais agentes moduladores para alargar o espectro de ação.

[00221] Um veículo sólido usado para formulação inclui pó finamen- te dividido ou grânulos de argila (por exemplo, argila caulim, terra dia- tomácea, bentonita, argila Fubasami, argila ácida, etc.), óxido de silício hidratado sintético, talco, cerâmicas, outros minerais inorgânicos (por exemplo, sericita, quartzo, enxofre, carbono ativado, carbonato de cálcio, sílica hidratada, etc.), uma substância que pode ser sublimada e está na forma sólida à temperatura ambiente (por exemplo, 2,4,6-tri- isopropil-1,3,5-trioxano, naftaleno, p-diclorobenzeno, cânfora, adaman- tano, etc.); lã; seda; algodão; cânhamo; polpa; resinas sintéticas (por exemplo, resinas de polietileno como polietileno de baixa densidade, polietileno linear de baixa densidade e polietileno de alta densidade; copolímeros de etileno-éster de vinila como copolímeros de etileno- acetato de vinila; copolímeros de etileno-éster do ácido metacrílico como copolímeros de etileno-metacrilato de metila e copolímeros de etileno-metacrilato de etila; copolímeros de etileno-éster do ácido acrílico como copolímeros de etileno-acrilato de metila e copolímeros de etileno-acrilato de etila; copolímeros de etileno-ácido vinilcarboxílico como copolímeros de etileno-ácido acrílico; copolímeros de etileno- tetraciclododeceno; resinas de polipropileno como homopolímeros de propileno e copolímeros de propileno-etileno; poli-4-metilpenteno-1, polibuteno-1, polibutadieno, poliestireno; resinas de acrilonitrila-estireno; elastômeros de estireno como resinas de acrilonitrila-butadieno-estireno, copolímeros de bloco de dieno conjugado com estireno e hidretos de copolímeros de bloco de dieno conjugado com estireno; fluororresinas; resinas acrílicas como poli(metacrilato de metila); resinas de poliamida como náilon 6 e náilon 66; resinas de poliéster como tereftalato de po- lietileno, naftalato de polietileno, tereftalato de polibutileno e tereftalato de policiclo-hexilenodimetileno; policarbonatos, poliacetais, poliacrilsul- fonas, poliarilatos, poliésteres do ácido hidroxibenzoico, polieterimidas, carbonatos de poliéster, resinas de éter de polifenileno, cloreto de poli- vinila, cloreto de polivinilideno, poliuretano, e resinas porosas (como espuma de poliuretano, espuma de polipropileno, ou espuma de etile- no, etc.), vidros, metais, cerâmicas, fibras, panos, tecidos tricotados, folhas, papéis, fio, espuma, substâncias porosas e multifilamentos.

[00222] Um veículo líquido pode incluir, por exemplo, hidrocarbona- tos aromáticos ou alifáticos (por exemplo, xileno, tolueno, alquilnafta- leno, fenilxililetano, querosene, gasóleo, hexano, ciclo-hexano, etc.), hidrocarbonatos halogenados (por exemplo, clorobenzeno, diclorome- tano, dicloroetano, tricloroetano, etc.), álcoois (por exemplo, metanol, etanol, álcool de isopropila, butanol, hexanol, álcool de benzila, etile- noglicol, etc.), éteres (por exemplo, éter de dietila, éter de dimetila de etilenoglicol, éter de monometila de dietilenoglicol, éter de monoetila de dietilenoglicol, éter de monometila de propilenoglicol, tetra- hidrofurano, dioxano, etc.), ésteres (por exemplo, acetato de etila, acetato de butila, etc.), cetonas (por exemplo, acetona, metiletilcetona, metilisobutilcetona, ciclo-hexanona, etc.), nitrilas (por exemplo, aceto- nitrila, isobutironitrila, etc.), sulfóxidos (por exemplo, dimetilsulfóxido, etc.), amidas (por exemplo, N,N-dimetilformamida, N,N-dimetilaceta- mida), imidas cíclicas (por exemplo, N-metilpirrolidona), carbonatos de alquilideno (por exemplo, carbonato de propileno, etc.), óleo vegetal (por exemplo, óleo de soja, óleo de sementes de algodão, etc.), essências vegetais (por exemplo, essência de laranja, essência de his- sopo, essência de limão, etc.), ou água.

[00223] Um veículo gasoso pode incluir, por exemplo, gás butano, gás Flon, gás de petróleo liquefeito (LPG), éter de dimetila e dióxido de carbono gasoso.

ix. Adjuvantes

[00224] Em alguns casos, a composição proporcionada aqui pode incluir um adjuvante. Adjuvantes são químicos que não possuem atividade. Adjuvantes são pré-misturados na formulação ou adicionados ao tanque de pulverização para melhorar o processo de mistura ou apli- cação ou para intensificar o desempenho. São extensamente usados em produtos planejados para aplicações foliares. Adjuvantes podem ser usados para customizar a formulação a necessidades específicas e compensar condições locais. Adjuvantes podem ser planejados para desempenhar funções específicas, incluindo umedecimento, espalha-mento, aderência, redução da evaporação, redução da volatilização, tamponamento, emulsificação, dispersão, redução da deriva da pulve-rização e redução da formação de espuma. Nenhum adjuvante único pode desempenhar todas estas funções, mas adjuvantes compatíveis podem ser muitas vezes combinados para desempenhar simultaneamente múltiplas funções.

[00225] Entre exemplos não limitadores de adjuvantes incluídos na formulação se encontram ligantes, dispersantes e estabilizadores, es-pecificamente, por exemplo, caseína, gelatina, polissacarídeos (por exemplo, amido, goma arábica, derivados de celulose, ácido algínico, etc.), derivados de lignina, bentonita, açúcares, polímeros sintéticos solúveis em água (por exemplo, álcool de polivinila, polivinilpirrolidona, ácido poliacrílico, etc.), PAP (fosfato de isopropila acídico), BHT (2,6- di-t-butil-4-metilfenol), BHA (uma mistura de 2-t-butil-4-metoxifenol e 3- t-butil-4-metoxifenol), óleos vegetais, óleos minerais, ácidos graxos e ésteres de ácidos graxos.

x. Surfactantes

[00226] Em alguns casos, a composição proporcionada aqui inclui um surfactante. Surfactantes, também denominados agentes molhan- tes e agentes de espalhamento, alteram fisicamente a tensão superficial de uma gotícula de pulverização. Para que uma formulação desempenhe a sua função apropriadamente, uma gotícula de pulverização deve ser capaz de molhar a folhagem e se espalhar uniformemente sobre uma folha. Os surfactantes aumentam a área de cobertura da formulação, desse modo aumentando a exposição da praga ao quími- co. Os surfactantes são particularmente importantes quando se aplica uma formulação a folhas cerosas ou pilosas. Sem umedecimento e espalhamento apropriados, as gotículas de pulverização muitas vezes escorrem ou não conseguem cobrir adequadamente as superfícies fo-liares. No entanto, demasiado surfactante pode causar escoamento excessivo e reduzir a eficácia.

[00227] Os surfactantes são classificados pelo modo como são ionizados ou se separam em átomos ou moléculas eletricamente carregados denominados íons. Um surfactante com uma carga negativa é aniônico. Um com uma carga positiva é catiônico e um sem carga elétrica é não iônico. A atividade de uma formulação na presença de um surfactante não iônico pode ser bastante diferente da atividade na presença de um surfactante catiônico ou aniônico. A seleção do surfac- tante errado pode reduzir a eficácia de um produto pesticida e danificar a planta-alvo. Os surfactantes aniônicos são muito eficazes quando usados com pesticidas de contato (pesticidas que controlam a praga por contato direto em vez de serem absorvidos sistemicamente). Sur- factantes catiônicos nunca devem ser usados como surfactantes autônomos porque usualmente são fitotóxicos.

[00228] Os surfactantes não iônicos, muitas vezes usados com pes-ticidas sistêmicos, ajudam pulverizações pesticidas a penetrar em cu-tículas de plantas. Os surfactantes não iônicos são compatíveis com a maior parte dos pesticidas e a maior parte dos pesticidas registrados na EPA que requerem um surfactante recomendam um tipo não iônico. Adjuvantes incluem, mas não se limitam a, adesivos, extensores, pe- netradores em plantas, agentes de compatibilidade, tampões ou modi-ficadores do pH, aditivos de controle da deriva, agentes antiespuman- tes e espessantes.

[00229] Entre exemplos não limitadores de surfactantes incluídos nas composições descritas aqui se contam sais de ésteres de alqui- lsulfato, alquilsulfonatos, alquilarilsulfonatos, éteres de alquilarila e seus produtos polioxietilenados, éteres de polietilenoglicol, ésteres de álcoois polivalentes e derivados de álcoois de açúcares.

xi. Combinações

[00230] Em formulações e nas formas de uso preparadas a partir destas formulações, o agente modulador pode estar em uma mistura com outros compostos ativos, como agentes pesticidas (por exemplo, inseticidas, esterilizantes, acaricidas, nematicidas, moluscicidas, ou fungicidas; ver, por exemplo, pesticidas listados na Tabela 12), atrato- res, substâncias reguladoras do crescimento, ou herbicidas. Como usado aqui, o termo "agente pesticida" se refere a qualquer substância ou mistura de substâncias destinada a prevenir, destruir, repelir, ou mitigar qualquer praga. Um pesticida pode ser uma substância química ou agente biológico usado contra pragas incluindo insetos, patógenos, ervas daninhas e micróbios que competem com humanos por alimento, destroem propriedades, disseminam doenças, ou são um incômodo. O termo "agente pesticida” pode abranger adicionalmente outras moléculas bioativas como antibióticos, pesticidas antivirais, antifúngi- cos, anti-helmínticos, nutrientes, pólen, sacarose e/ou agentes que atordoam ou abrandam o movimento dos insetos.

[00231] Em casos em que o agente modulador é aplicado em plantas, também é possível uma mistura com outros compostos conhecidos, como herbicidas, fertilizantes, reguladores do crescimento, fito- protetores, semioquímicos, ou então com agentes para melhorar pro-priedades das plantas.

V. Administração

[00232] Um hospedeiro descrito aqui pode ser exposto a quaisquer das composições descritas aqui em qualquer modo adequado que permita distribuir ou administrar a composição ao inseto. O agente modulador pode ser administrado isoladamente ou em combinação com outras substâncias ativas ou inativas e pode ser aplicado, por exemplo, por pulverização, microinjeção, através de plantas, derra-mamento, imersão, na forma de líquidos concentrados, géis, soluções, suspensões, pulverizações, pós, péletes, briquetes, tijolos e similares, formulado para administrar uma concentração eficaz do agente modu- lador. Quantidades e localizações para aplicação das composições descritas aqui são geralmente determinadas pelos hábitos do hospedeiro, o estágio do ciclo de vida em que os micro-organismos do hospedeiro podem ser visados pelo agente modulador, o sítio onde a aplicação deverá ser efetuada e as características físicas e funcionais do agente modulador. Os agentes moduladores descritos aqui podem ser administrados ao inseto por ingestão oral, mas também podem ser administrados por meios que permitam a penetração através da cutícula ou penetração no sistema respiratório do inseto.

[00233] Em alguns casos, o inseto pode ser simplesmente "embebido" ou "pulverizado" com uma solução incluindo o agente modulador. Alternativamente, o agente modulador pode ser ligado a um componente alimentar (por exemplo, comestível) do inseto para facilidade de administração e/ou para aumentar a captação do agente modulador pelo inseto. Métodos para introdução oral incluem, por exemplo, mistura direta de um agente modulador com o alimento do inseto, pulverização do agente modulador no habitat ou campo do inseto, bem como abordagens manipuladas em que uma espécie que é usada como alimento é manipulada para expressar um agente modulador, então o inseto a ser afetado é alimentado com aquela. Em alguns casos, por exemplo, a composição do agente modulador pode ser incorporada em, ou sobreposta sobre, a dieta do inseto. Por exemplo, a composição do agente modulador pode ser pulverizada sobre um campo de culturas que um inseto habita.

[00234] Em alguns casos, a composição é pulverizada diretamente sobre uma planta, por exemplo, culturas, por exemplo, por pulverização dorsal, pulverização aérea, pulverização/empoeiramento de culturas, etc. Em casos em que o agente modulador é administrado a uma planta, a planta que recebe o agente modulador pode estar em qualquer estágio do crescimento da planta. Por exemplo, agentes modula- dores formulados podem ser aplicados como um revestimento de sementes ou tratamento radicular em estágios precoces do crescimento da planta ou como um tratamento total da planta em estágios mais tardios do ciclo da cultura. Em alguns casos, o agente modulador pode ser aplicado como um agente tópico em uma planta, de modo que o inseto hospedeiro ingere ou contata de qualquer outro modo com a planta por interação com a planta.

[00235] Além disso, o agente modulador pode ser aplicado (por exemplo, no solo onde uma planta cresce, ou na água que é usada para regar a planta) como um agente sistêmico que é absorvido e distribuído através dos tecidos (por exemplo, caules ou folhas) de um hospedeiro vegetal ou animal, de modo que um inseto que se alimenta daqueles obterá uma dose eficaz do agente modulador. Em alguns casos, plantas ou organismos alimentares podem ser geneticamente transformados para expressar o agente modulador de modo que um hospedeiro que se alimenta da planta ou organismo alimentar irá ingerir o agente modulador.

[00236] Liberação retardada ou contínua também pode ser alcançada por revestimento do agente modulador ou de uma composição contendo o(s) agente(s) modulador(es) com uma camada de revestimento dissolúvel ou bioerodível, como gelatina, cujo revestimento se dissolve ou sofre erosão no ambiente do uso, para então disponibilizar o agente modulador, ou por dispersão do agente em uma matriz disso- lúvel ou erodível. Tais dispositivos de liberação e/ou administração contínua podem ser vantajosamente empregues para manter consis- tentemente uma concentração eficaz de um ou mais dos agentes mo- duladores descritos aqui em um habitat de um hospedeiro específico.

[00237] O agente modulador também pode ser incorporado no meio onde o inseto cresce, vive, se reproduz, alimenta, ou infesta. Por exemplo, um agente modulador pode ser incorporado em um recipiente de alimentos, estação de nutrição, envoltório protetor, ou uma colmeia. Para algumas aplicações, o agente modulador pode ser ligado a um suporte sólido para aplicação em forma de pó ou em uma "armadilha" ou "estação de nutrição". Como exemplo, para aplicações em que a composição se destina a ser usada em uma armadilha ou como isca para um inseto hospedeiro particular, as composições também podem ser ligadas a um suporte sólido ou encapsuladas em um material de liberação temporal. Por exemplo, as composições descritas aqui podem ser administradas por administração da composição a pelo menos um habitat onde o inseto cresce, vive, se reproduz, ou alimenta.

VI. Rastreio

[00238] São incluídos aqui ensaios de rastreio para identificar um agente modulador, em que o agente modulador é eficaz para alterar a microbiota de um hospedeiro e desse modo aumentar a aptidão do hospedeiro (por exemplo, aptidão do inseto). Por exemplo, o ensaio de rastreio pode ser usado para identificar um ou mais agentes modula- dores que visam micro-organismos específicos e/ou hospedeiros específicos. Além disso, os ensaios de rastreio podem ser usados para identificar um ou mais micro-organismos com funcionalidades intensificadas. Por exemplo, o ensaio de rastreio pode ser eficaz para isolar um ou mais micro-organismos com uma capacidade intensificada para metabolizar (por exemplo, degradar) um pesticida (por exemplo, inseticida, por exemplo, neonicotinoide) ou aleloquímico de planta (por exemplo, cafeína, cistatina de sementes de soja, monoterpenos, ácidos de diterpenos, ou compostos fenólicos). A administração e coloni zação de um micro-organismo isolado no hospedeiro podem aumentar a resistência do hospedeiro ao pesticida ou aleloquímico de planta, desse modo aumentando a aptidão do hospedeiro. Os métodos também podem ser úteis para o isolamento de micro-organismos com uma capacidade intensificada para colonizar quaisquer dos hospedeiros descritos aqui.

[00239] Por exemplo, para rastrear quanto a micro-organismos que aumentam a resistência de um hospedeiro a um pesticida, pode ser usada uma cultura de partida que inclui micro-organismos (por exemplo, bactérias) e concentrações elevadas de um pesticida (por exemplo, um pesticida listado na Tabela 12 ou um pesticida conhecido na técnica, por exemplo, um neonicotinoide). Em alguns casos, o pesticida pode ser proporcionado na forma de uma amostra ambiental enriquecida com o pesticida (por exemplo, uma amostra de solo). Alternativamente, o pesticida (por exemplo, um pesticida listado na Tabela 12) pode ser proporcionado em forma pura ou em combinação com outros veículoes. Além disso, o um ou mais isolados de micro-organismo podem ser inoculados diretamente no meio (por exemplo, de uma estirpe laboratorial) ou podem ser uma amostra ambiental incluindo uma ou mais espécies de micro-organismos. O meio de crescimento pode ser líquido ou sólido. Em alguns casos, o pesticida de interesse é a única fonte de carbono ou nitrogênio para os micro-organismos presentes no meio. A cultura pode ser subcultivada (por exemplo, inoculada em meio fresco com níveis elevados do pesticida) qualquer número de vezes para enriquecer quanto a e/ou isolar estirpes microbianas (por exemplo, estirpes bacterianas) capazes de metabolizar o pesticida. A cultura original ou as subculturas podem ser avaliadas usando quaisquer métodos conhecidos na técnica para testar quanto a alterações (por exemplo, decréscimo) dos níveis do pesticida na amostra (por exemplo, usando HPLC). Isolados que reduzem a concentração do pesticida (por exemplo, um pesticida listado na Tabela 12 ou um pesticida conhecido na técnica, por exemplo, neonicotinoide) podem ser isolados para uso como agente modulador em quaisquer dos métodos ou composições descritos aqui.

[00240] Os métodos podem ser usados para selecionar adicionalmente quanto a micro-organismos descritos aqui, incluindo os isolados de um ensaio de rastreio, com capacidade intensificada para colonizar e sobreviver em um hospedeiro (por exemplo, inseto). Por exemplo, um hospedeiro pode ser inoculado com um isolado bacteriano (por exemplo, um com a capacidade de degradar um pesticida). O hospedeiro pode então ser testado em intervalos regulares quanto à presença do isolado bacteriano (por exemplo, via cultura ou RNA 16s de intestinos isolados do hospedeiro). Isolados bacterianos que sobrevivem no hospedeiro (por exemplo, no intestino médio de um inseto) podem ser isolados para uso como agente modulador em quaisquer dos métodos ou composições descritos aqui.Tabela 12. Pesticidas

EXEMPLOS

[00241] O seguinte é um exemplo dos métodos da invenção. É entendido que várias modalidades diferentes podem ser praticadas, dada a descrição geral proporcionada acima.

Exemplo 1: Geração de uma biblioteca de micróbios naturais

[00242] Este Exemplo demonstra o isolamento de bactérias do solo que produzem naturalmente o aminoácido metionina.

[00243] O meio usado para o isolamento de micro-organismos é ágar Amido-Caseína-Nitrato (Amido, 10,0 g; Caseína, 0,003 g; KNO3, 0,02 g; NaCl, 0,02 g; MgSO4, 0,5 mg; CaCO3, 0,2 mg; FeSO4, 0,1 mg; Ágar, 12,0 g; H2O, 1 L; pH 7,0) (Kuster e Williams, 1964). Cada amostra de solo ambiental (1,0 g) é suspensa em 9 mL de água esterilizada, e 1 mL da suspensão é diluído em série dez vezes em água destilada esterilizada. Um mililitro da diluição 10-5 é inoculado no meio de ágar e incubado durante 7 dias a 30 °C. No final deste período, as placas são observadas quanto ao crescimento. Colônias brancas discretas e semelhantes a couro são triadas e cultivadas em novas placas de ágar Amido-Caseína-Nitrato para criar uma biblioteca de isolados. Após 7 dias de crescimento a 30 °C, as placas são mantidas a 4 °C.

Exemplo 2: Rastreio quanto a isolados que produzem metionina

[00244] Este Exemplo demonstra o ensaio de rastreio de isolados do Exemplo 1 que produzem naturalmente o aminoácido metionina.

[00245] Rastreio quanto à produção de metionina:

[00246] Um meio basal modificado (K2HPO4, 0,3 g; KH2PO4, 0,7 g; Na2CO3, 1,0 g; CaCl2, 5,0 mg; MgSO4, 0,3 g; FeSO4, 1,0 mg; H2O, 1 L) contendo sacarose (20,0 g) e NH4Cl (10,0 g) é usado para a fermentação (Chay, B.P., Galvez, F.C.F., e Padolina, W.G.P.U.L.B.P. (1992). "Methionine production by batch fermentation from various carbohy-drates". ASEAN Food Journal (Malásia)). O pH do meio é 7,2.

[00247] Condições de cultivo: Duas alças calibradas da cultura de isolados durante 7 dias do Exemplo 1 são inoculadas em um balão Er- lenmeyer de 250 mL contendo 30 mL do meio de fermentação. A pro-dução de metionina é avaliada após incubação do balão durante 5 dias em um agitador rotativo (160 rpm) a 30 °C. Balões duplicados são pre-parados e balões não inoculados serviram de controle em todas as experiências.

[00248] A presença de metionina nos caldos de cultura dos isolados é examinada por cromatografia em papel seguindo um método modificado de Khanna e Nag (Khanna et al., "Production of amino acids in vitro tissue culture", Indian Journal of Experimental Biology (1973)). O caldo de cultura é centrifugado a 5000 x g durante 20 min e 2 μL do sobrenadante são aplicados 1,5 cm acima de uma extremidade do filtro de papel Whatman N°1, com dimensões de 18 cm x 22 cm. 1 μL de volume de uma solução padrão de metionina (0,1 mg/mL) é aplicado juntamente com o sobrenadante, e o cromatograma é desenvolvido em uma mistura de solventes de n-butanol, ácido acético e água (4: 1: 1) durante 18 h. O cromatograma é seco ao ar à temperatura ambiente, pulverizado com solução de ninidrina 0,15% em butanol e seco novamente antes de aquecimento a 60 °C durante 5 min em um forno. O valor da mancha positiva para ninidrina (violeta azulado) do sobrena- dante que corresponde ao valor da solução padrão de metionina indica a presença de metionina na cultura em caldo. A concentração de meti- onina produzida na cultura em caldo do isolado é estimada do modo seguinte. A mancha positiva para ninidrina do sobrenadante do isolado no cromatograma elui em etanol 10% e a leitura espectrofotométrica do eluato a 520 nm é registrada. A concentração de metionina no so- brenadante é determinada a partir de uma curva padrão. Um gráfico dos valores de densidades ópticas contra concentrações variáveis (0,1 até 0,9 mg/mL) de uma solução de metionina serve como curva padrão de metionina.

[00249] Isolados que produzem metionina são mantidos em placas de ágar frescas e uma solução de estoque é criada suspendendo duas alças calibradas de micro-organismo em uma alíquota de solução de glicerol 50%.

Exemplo 3: Administração de isolados produtores de metionina para aumentar o teor de aminoácidos de grilos

[00250] Este exemplo demonstra a capacidade para tratar grilos com bactérias produtoras de metionina para melhorar o seu teor nutricional.

[00251] O apetite mundial para carne está crescendo, e a produção de rações para animais é uma tensão crescente na terra e água. Insetos podem proporcionar muitas das proteínas de que animais necessitam com um custo ambiental muito menor; muitas espécies de insetos podem se alimentar de adubo, como gusanos de Grant, ou outros tipos de desperdícios orgânicos, como restos de alimentos, entranhas de animais, e grãos descartados pelas fábricas de cerveja. Os insetos produzem massa corporal a uma velocidade impressionante, em parte porque, sendo animais de sangue frio, não gastam energia na regulação da sua temperatura corporal. Os grilos, por exemplo, Acheta domesticus, necessitam somente de 1,7 quilogramas de ração para ganharem um quilograma de peso corporal; uma galinha dos E.U.A. típica consome 2,5 quilogramas, porcos 5 quilogramas, e gado 10 quilogramas. Outra vantagem: a maior parte dos insetos podem ser comidos inteiros. Apenas cerca de metade de uma galinha ou de um porco é comestível; para uma vaca, a fração é ainda menor. Em resultado, produzir um quilograma de proteína de inseto produz menos CO2 do que a criação de porcos ou gado, e ocupa somente um décimo da terra.

[00252] Farelo de insetos pode substituir entre 25% e 100% do farelo de soja ou farelo de peixe nas dietas dos animais sem nenhuns efeitos adversos, mas a maior parte dos farelos de insetos é deficiente nos aminoácidos metionina e lisina. A produção sintética de metionina requer químicos perigosos e o seu uso está banido na agricultura biológica. Por introdução de bactérias produtoras de metionina no microbi- oma dos grilos, é esperado que os grilos aumentem naturalmente o seu teor nutricional.

[00253] Planejamento terapêutico: Bactérias isoladas identificadas como produtoras de metionina do Exemplo 2 são formuladas com uma solução de 107 células/mL misturada com o substrato de ração, por exemplo, ração iniciadora de aviário e farelo de arroz (Poultry Feed- PF), para grilos.

Planejamento experimental:

[00254] As unidades experimentais onde os grilos são criados são caixas de expedição Gaylord modificadas, que têm a pegada do padrão internacional para paletes de expedição (1,2 m (C) x 1,0 m (L) x 0,61 m (A)). O interior de cada compartimento é revestido com um revestimento de plástico transparente de 4 mm e coberto com 122 cm x 137 cm de rede de náilon para mosquitos para servir de barreira física à entrada ou saída. Para evitar o canibalismo e mortalidade relacionada com estresse, 96 caixas de ovos, 30 cm x 30 cm de tamanho, são colocadas nas bordas em redor da periferia de cada caixa. Tal proporciona aproximadamente 172800 cm2 de área superficial para rastejar. O acesso à água é proporcionado por 2 dispensadores de água para aviário de um quarto de galão com algodão e cascalho inseridos no reservatório dos dispensadores para evitar o afogamento de ninfas chocadas de novo. Os lados dos dispensadores de água são areados para proporcionar apoios para os grilos rastejarem verticalmente. Pontas de nebulização com válvulas de regulação para evitar o gotejamen- to são fixadas no teto interior de cada compartimento. Para manter uma umidade aceitável e proporcionar uma fonte de água dispersa, alternativa para a grande população de grilos, estas pontas proporcionaram pulsos de água dirigidos para o centro do compartimento em intervalos automatizados. A temperatura (T) e umidade relativa (UR) dentro da estufa são mantidas a 29,0 ± 2,1 desvio padrão (DP) °C e 67,2 ± 14,7 DP %, respectivamente, durante a experiência. É proporcionada luz 24 hr/dia.

[00255] Um substrato de ovos da Timberline Fisheries (http://timber- linefresh.com) consistindo em aproximadamente 50 000 ovos de Ache- ta domesticus com uma taxa de eclosão de 70% é colocado em cada um dos compartimentos. O substrato de ovos é mantido entre 80-90% de umidade até à eclosão. Depois de observada eclosão, o substrato é nebulizado duas vezes ao dia até as ninfas emergirem totalmente. O crescimento da população é monitorado a cada 3 até 4 dias por contagem e pesagem de uma amostra aleatória de 70 indivíduos de cada unidade experimental.

[00256] Desde os 14 dias após a eclosão até serem recolhidas ou terem sofrido mortalidade completa, às populações de Acheta domes- ticus são administrados os seguintes: 2 tratamentos de ração ad libitum: 1) uma razão 5:1 de ração iniciadora de aviário não medicada e farelo de arroz (Poultry Feed-PF), como controle; 2) uma razão 5:1 de ração iniciadora de aviário não medicada e farelo de arroz (Poultry Feed-PF) pulverizada com 100 mL de uma solução de 109 células/mL das bactérias isoladas descritas no Exemplo 2 diluída em meio de crescimento descrito aqui.

[00257] Uma vez por semana, durante cinco semanas de cultura, os insetos são recolhidos. Os insetos são armazenados durante meia hora no congelador a -50 °C. Em seguida, os insetos congelados são submer-sos em nitrogênio líquido e subsequentemente triturados usando um mis-turador durante 15 minutos (Braun Multiquick 5, 600 W, Kronberg, Ale-manha). A composição de aminoácidos do pó de insetos liofilizados é analisada usando cromatografia de troca iônica, seguindo o Padrão in-ternacional ISO 13903:2005 seguindo a técnica de Yi, L. et al. (2013).

[00258] É esperado que grilos alimentados com os micróbios produtores de metionina identificados no Exemplo 2 tenham um teor maior de metionina do que grilos alimentados com a ração de controle.

Exemplo 4: Administração de estirpes de bactérias produtoras de me- tionina a Drosophila melanogaster criadas com ração deficiente em metionina para aumentar a sua massa corporal, taxa de desenvolvimento, e sobrevivência

[00259] Este exemplo demonstra a capacidade para tratar Drosophila melanogaster criadas em dieta pobre em metionina com bactérias produtoras de metionina para aumentar a massa corporal, taxa de desenvolvimento, e sobrevivência. Este planejamento experimental também é aplicável para aumentar o teor nutricional de outros insetos, como grilos, que podem ser usados para produzir ração para animais rica em metionina.

Planejamento experimental:

[00260] Estirpes bacterianas isoladas no Exemplo 2 que produzem metionina, bem como as estirpes que não produzem metionina, são cultivadas em caldo nutriente a 30 °C.

[00261] Ração para moscas quimicamente definida (CD) é preparada como descrito em Nature, Vol. 11, No. 1, 100-105, 2014. É preparada ração CD que não tem metionina, e é referida como CD-M. As formulações de ração para moscas são usadas para todas as experi-ências descritas neste Exemplo.

Ensaios de taxa de desenvolvimento e massa corporal

[00262] No dia um, 109 das bactérias produtoras de metionina como descrito Exemplo 1, ou bactérias que não produzem metionina (controle), são ressuspensas 100 μL de solução salina tamponada com fosfato e adicionadas a ração para moscas CD-M. Estes dois coortes são deixados secar durante 24 hrs a 25 °C.

[00263] No dia dois, embriões fertilizados recolhidos de moscas são tratados com solução de hipoclorito 2% durante 5 min e então lavados com água esterilizada para remover quaisquer micróbios extracelula- res dos embriões. 10 μL da suspensão de embriões em água (suspensão 1:3 embriões:água) são adicionados a ambas as amostras semeadas com bactérias e de controle. Os coortes de ração para moscas com os embriões são mantidos a 25 °C com ciclo de 12 h de luz e 12 de escuridão durante o resto da experiência.

[00264] O tempo até à formação do pupário e o número de pupas formadas são medidos em cada coorte. O tempo até à emergência de adultos e a taxa de emergência são medidos em cada amostra. Desde o tempo em que o primeiro adulto emerge da pupa, o número de moscas adultas emergentes é contado a cada 12 horas e a taxa de emergência é calculada.

[00265] Para o ensaio da massa corporal, dez larvas são recolhidas de ambos os coortes e seus pesos, áreas, e o teor total de proteína são medidos.

[00266] É esperado que embriões na ração para moscas CD-M semeada com bactérias produtoras de metionina identificadas no Exemplo 2 se desenvolvam mais rapidamente e tenham um teor proteico maior do que os embriões na ração para moscas CD-M com bactérias não produtoras de metionina.

Ensaio de sobrevivência

[00267] 12 dias antes do dia um, embriões esterilizados são gera dos como descrito previamente e criados em ração para moscas CD esterilizada. Adultos esterilizados começam a emergir de suas pupas 11 dias desde o momento em que os embriões são recolhidos quando criados a 25 °C com ciclo de 12 h de luz e 12 h de escuridão.

[00268] No dia um, 109 das bactérias produtoras de metionina, ou bactérias que não produzem metionina (controle), são ressuspensas 100 μL de solução salina tamponada com fosfato e adicionadas a ração para moscas CD-M. Estes dois coortes são deixados secar durante 24 hrs a 25 °C.

[00269] 10 machos e fêmeas adultos esterilizados que emergiram de novo são introduzidos em ração para moscas CD-M com bactérias produtoras de metionina ou controle no dia dois da experiência. A ração para moscas com as moscas é mantida a 25 °C com ciclo de 12 h de luz e 12 de escuridão durante o resto da experiência. O número de moscas machos e fêmeas sobreviventes é contado a cada dia até todas as moscas estarem mortas. A análise de sobrevivência é efetuada para avaliar o benefício para a aptidão das bactérias produtoras de metionina na sobrevivência das moscas.

[00270] É esperado que moscas criadas em ração para moscas CD-M semeada com micróbios produtores de metionina identificados no Exemplo 2 sobrevivam durante mais tempo do que o controle.

Exemplo 5: Isolamento de micro-organismos que degradam fenitrotion, um inseticida organofosforado

[00271] Este Exemplo demonstra a aquisição de uma biblioteca de micro-organismos capazes de degradar fenitrotion, um inseticida organofosforado.

Planejamento experimental

[00272] Amostras de solo são obtidas de várias regiões onde feni- trotion foi previamente utilizado para o controle de insetos. Bactérias que degradam fenitrotion serão isoladas das amostras de solo como descrito em (Microbes Environ. Vol. 21, No. 1, 58-64, 2006). Em resumo, 1 g da amostra de solo é extensamente misturado com 9 mL de água destilada esterilizada. As partículas de solo são então centrifugadas a rcf de 1000 durante 5 min, e 100 μL do sobrenadante são então plaqueados sobre fenitrotion com meio de sais minerais (0,4 g/L de extrato de levedura, 0,4 g/L de fenitrotion, 15 g/L de ágar bacteriológico). As placas estão turvas quando são preparadas pois o fenitrotion é uma emulsão.

[00273] Colônias que desenvolvem zonas claras em seu redor e é provável que estejam degradando ou metabolizando fenitrotion, e estas colônias são isoladas e novamente cultivadas em ágar LB, ágar nutriente, ágar levedura glicose, ágar TSA, ágar BHI, ou ágar MRS. Depois de identificadas colônias bacterianas únicas, seus genomas são extraídos usando um kit de extração de DNA genômico (Qiagen, Kit DNeasy Blood and Tissue) seguindo o protocolo do fabricante.

[00274] O gene rRNA 16S é amplificado usando iniciadores bacteri- anos universais 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'; SEQ ID NO: 227) e 1492R (5’-TACCTTGTTACGACTT-3’; SEQ ID NO: 228), e usando condições de PCR de 94 °C durante 2 min, 30 ciclos de 94 °C durante 1 min, 56 °C durante 1 min, e 72 °C durante 2 min, e uma extensão final de 72 °C durante 5 min. Eletroforese em gel é usada para confirmar que os amplicons têm o tamanho correto (~1500 pb), e os produtos são excisados do gel e purificados usando um kit de extração de gel (Qiagen, QIAquick) seguindo o protocolo do fabricante. Os amplicons de tamanho correto são sequenciados por Sanger e BLAST é usado para fazer corresponder a sequência contra vários repositórios de sequências de genes rRNA 16s para identificar as bactérias.

[00275] Para determinar se as bactérias isoladas degradam fenitro- tion, ~107 células bacterianas são incubadas em 1 mL de tampão de fosfato de sódio-potássio 20 mM (pH 7) com fenitrotion 1 mM, como descrito em PNAS, Vol. 109, N° 22, 8618-8622, 2012. Após 30 min de incubação a 30 °C, a reação é terminada por adição de um volume igual de metanol. Então fenitrotion e seu metabólito, 3-metil-4-nitrofenol, são analisados por HPLC. Os tempos de retenção e áreas dos picos dos perfis de HPLC são comparados com padrões conhecidos.

[00276] Isolados bacterianos únicos que têm capacidades de degradação de fenitrotion são então armazenados congelados em gli- cerol a -80 °C.

Exemplo 6: Aumento da resistência de Drosophila melanogaster ao feni- trotion através da administração de bactérias que degradam fenitrotion

[00277] Este Exemplo demonstra a capacidade para produzir um modelo de inseto, Drosophila melanogaster, que é resistente a um ou mais efeitos negativos de inseticidas em sua dieta, mais especificamente fenitrotion, para produzir um inseto mais robusto. A seguinte abordagem é um substituto para outros insetos, como grilos ou outros insetos revelados aqui, por exemplo, fontes de insetos úteis para produzir ração para animais rica em proteína. Foi mostrado que muitos inseticidas incluindo fenitrotion são tóxicos para grilos.

[00278] Planejamento experimental:

[00279] Planejamento terapêutico: Os isolados bacterianos selecio nados no Exemplo 5 são formulados a 109 organismos em 100 μL de meio de ração para moscas com e sem fenitrotion.

[00280] O meio usado para criar moscas é meio de farelo de milho, melaço e levedura (11 g/L de levedura, 54 g/L de farelo de milho amarelo, 5 g/L de ágar, 66 mL/L de melaço, e 4,8 mL/L de ácido propiôni- co). Para procedimentos experimentais, fenitrotion a 0, 10, e 100 p.p.m. ou solução salina tamponada com fosfato como controles negativos são infundidos em meio de ração para moscas esterilizado.

Ensaio da taxa de desenvolvimento

[00281] No dia um, 109 bactérias que degradam fenitrotion descritas no Exemplo 5 são suspensas em 100 μL de solução salina tamponada com fosfato ou volumes iguais de solução salina (controles negativos) são adicionados a meio de ração para moscas esterilizado com ou sem fenitrotion. Todas são deixadas secar durante um dia a 25 °C como des-crito em Appl. Environ. Microbiol. Vol. 82, N° 20, 6204-6213, 2016.

[00282] No dia dois, embriões fertilizados recolhidos de moscas são tratados com solução de hipoclorito 2% durante 5 min e então lavados com água esterilizada para remover quaisquer micróbios extracelula- res dos embriões. 10 μL da suspensão de embriões em água (suspensão 1:3 de embriões:água) são adicionados à ração para moscas semeada com bactérias ou de controle negativo com ou sem o fenitro- tion. Os coortes de ração para moscas com os embriões são mantidos a 25 °C com ciclo de 12 h de luz e 12 de escuridão durante o resto da experiência.

[00283] O tempo até à formação do pupário e o número de pupas formadas são medidos em cada coorte. O tempo até à emergência de adultos e a taxa de emergência são medidos em cada amostra. Desde o tempo em que o primeiro adulto emerge da pupa, o número de moscas adultas emergentes é contado a cada 12 horas e a taxa de emergência é calculada.

[00284] É esperado que embriões na ração para moscas infundida com fenitrotion semeada com bactérias que degradam Fenitrotion se desenvolvam mais rapidamente do que os embriões em ração infundida com fenitrotion sem as bactérias que degradam fenitrotion.

Ensaio de sobrevivência

[00285] Cerca de 12 dias antes do dia um, embriões esterilizados são gerados como descrito previamente e criados em ração para moscas esterilizada. Adultos começam a emergir de suas pupas 11 dias desde a recolha de embriões quando criados em ração para moscas esterilizada sem fenitrotion a 25 °C com ciclo de 12 h de luz e 12 h de escuridão.

[00286] No dia um, 109 das bactérias que degradam fenitrotion em solução salina tamponada com fosfato são adicionadas a meio de ração para moscas esterilizado como descrito em um Exemplo anterior.

[00287] No dia dois, 10 machos e fêmeas adultos esterilizados que emergiram de novo são introduzidos em ração para moscas semeada com bactérias ou de controle negativo com ou sem fenitrotion. A ração para moscas com as moscas é mantida a 25 °C com ciclo de 12 h de luz e 12 de escuridão durante o resto da experiência. O número de moscas machos e fêmeas sobreviventes é contado a cada dia até todas as moscas estarem mortas. A análise de sobrevivência é efetuada para avaliar o benefício para a aptidão de bactérias que degradam fe- nitrotion na sobrevivência das moscas.

[00288] É esperado que moscas criadas em ração para moscas infundida com fenitrotion semeada com bactérias que degradam fenitro- tion sobrevivam mais tempo do que moscas criadas em ração infundida com fenitrotion sem as bactérias que degradam fenitrotion.

Exemplo 7: Eliminação de bactérias entomopatogênicas de Drosophila melanogaster usando fagos de ocorrência natural

[00289] Este Exemplo demonstra a capacidade para eliminar pató- genos bacterianos de insetos (como Serratia marcescens, Erwinia ca- rotovora, e Pseudomonas entomophila) de Drosophila melanogaster usando fagos de ocorrência natural. Este procedimento pode ser útil como ensaio substituto para eliminar bactérias em outras espécies de insetos, como em abelhas.

[00290] Planejamento experimental:

[00291] Planejamento terapêutico: São usadas coleções de biblio tecas de fagos tendo as seguintes famílias de fagos: Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Lipothrixviridae, Rudiviridae, Ampullaviridae, Bicaudaviridae, Clavaviridae, Corticoviridae, Cystoviridae, Fuselloviri- dae, Gluboloviridae, Guttaviridae, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Plasmaviridae, Tectiviridae.

[00292] Múltiplas amostras ambientais (solo, sedimentos de lagoas, e água de esgoto) são recolhidas em balões esterilizados de 1 L ao longo de um período de 2 semanas e são imediatamente processadas após a recolha e seguidamente armazenadas a 4 °C. Amostras sólidas são homogeneizadas em caldo Luria (LB) Difco de dupla potência esterilizado ou caldo de soja tríptica (TSB) suplementado com CaCl2 2 mM para um volume final de 100 mL. O pH e níveis de fosfato são medidos usando tiras de teste de fosfato. Para a purificação, todas as amostras são centrifugadas a 3000-6000 g durante 10-15 min a 4 °C, e filtradas através de filtros com baixa ligação de proteína de 0,2 μm para remover todas as células bacterianas remanescentes. O sobre- nadante que contém a biblioteca de fagos é então armazenado a 4 °C na presença de clorofórmio em uma garrafa de vidro.

[00293] 20-30 mL da biblioteca de fagos são diluídos para um vo lume de 30-40 mL com caldo LB. A estirpe bacteriana-alvo (por exemplo, Serratia marcescens, Erwinia carotovora, e Pseudomonas ento- mophila) é adicionada (50-200 μL de cultura durante a noite cultivada em caldo LB) para enriquecer fagos que visam esta estirpe bacteriana específica na cultura. Esta cultura é incubada durante a noite a 37 °C, agitada a 230 rpm. Bactérias desta cultura de enriquecimento são removidas por centrifugação (3000-6000 g, 15-20 min, 4 °C) e filtradas (filtro de 0,2 ou 0,45 μm). 2,5 mL da cultura sem bactérias são adicionados a 2,5 mL de caldo LB e 50-100 μL das bactérias-alvo são adicionadas de novo à cultura para enriquecer adicionalmente os fagos. A cultura de enriquecimento é cultivada durante a noite como acima. Uma amostra desta cultura de enriquecimento é centrifugada a 13 000 g durante 15 min à temperatura ambiente e 10 μL do sobrenadante são plaqueados em uma placa de Petri com LB-ágar juntamente com 100-300 μL das bactérias-alvo e 3 mL de ágar mole 0,7% fundido. As placas são incubadas durante a noite a 37 °C.

[00294] Cada uma das placas observadas no gramado bacteriano é selecionada e transferida para 500 μL de caldo LB. Uma amostra deste estoque de placas é adicionalmente plaqueada nas bactérias-alvo. A purificação de placas é efetuada três vezes para todos os fagos veri-ficados para isolar um único fago homogêneo da mistura heterogênea de fagos.

[00295] Lisados de placas com fagos em título elevado (>1x 10A10 PFU/mL) são preparados por recolha de placas revestidas de uma estirpe de bactéria hospedeira exibindo lise confluente. Depois de ser inundado com 5 mL de tampão, o revestimento de ágar mole é macerado, clarificado por centrifugação, e filtrado de modo esterilizado. Os lisados resultantes são armazenados a 4 °C. Lisados de fagos em título elevado são adicionalmente purificados por centrifugação isopícnica com CsCl, como descrito em Summer et al., J. Bacteriol. 192:179-190, 2010.

[00296] DNA é isolado de suspensões de fagos purificadas com CsCl como descrito em Summer, Methods Mol. Biol. 502:27-46, 2009. Um fago individual isolado é sequenciado como parte de duas reuniões de genomas de fagos usando um método de pirossequenciamento 454. Em resumo, DNA genômico de fagos é misturado em quantidades equimolares para uma concentração final de cerca de 100 ng/L. O DNA reunido é cisalhado, ligado com uma marca identificadora de multiplex (MID) específica para cada uma das reuniões, e sequenciado por pirossequenciamento usando uma reação de placa completa em um sequenciador (Roche) de acordo com os protocolos do fabricante. O DNA fágico reunido está presente em duas reações de sequencia- mento. O resultado correspondente a cada uma das reuniões é montado individualmente usando software (454 Life Sciences), por ajustamento dos parâmetros de modo a incluir somente leituras com uma única MID por montagem. A identidade de contigs individuais é determinada por PCR usando iniciadores gerados contra sequências de contigs e preparações DNA genômico de fagos individuais como modelo. Software para sequências (Gene Codes Corporation) é usado para a montagem e edição de sequências.

[00297] Estruturas terminais cromossômicas de fagos são determinadas experimentalmente. Extremidades coesivas (cos) para fagos são determinadas por sequenciamento das extremidades do genoma do fago e sequenciamento dos produtos de PCR derivados por amplificação através da junção ligada de DNA genômico circularizado, como descrito em Summer, Methods Mol. Biol. 502:27-46, 2009. Regiões codificadoras de proteínas são inicialmente previstas usando software de previsão genética (Lukashin et al. Nucleic Acids Res. 26:11071115, 1998), refinadas através de análise manual em Artemis (Rutherford et al., Bioinformatics 16:944-945, 2000), e analisadas usando BLAST (valor limite E de 0,005) (Camacho et al., BMC Bioinformatics 10:421, 2009). Proteínas de interesse particular são adicionalmente analisadas por software de pesquisa de sequências (Hunter et al., Nucleic Acids Res. 40:D306-D312, 2012).

[00298] Microscopia eletrônica de fagos purificados com CsCl (>1 x10A11 PFU/mL) que procederam à lise das espécies bacterianas patogênicas de Drosophila é realizada diluindo estoque de fagos com o tampão de caldo de soja tríptica. Os fagos são aplicados em grelhas finas revestidas com carbono de 400 de malha, corados com acetato de uranila 2% (peso/vol), e secos ao ar. Os espécimes são observados em um microscópio eletrônico de transmissão operando a uma voltagem de aceleração de 100 kV. Cinco vírions de cada fago são medidos para calcular valores médios e desvios padrão para as dimensões do capsídeo e cauda, quando apropriado.

Incorporando fagos em uma ração

[00299] O meio usado para criar moscas é meio de farelo de milho, melaço e levedura (11 g/L de levedura, 54 g/L de farelo de milho amarelo, 5 g/L de ágar, 66 mL/L de melaço, e 4,8 mL/L de ácido propiôni- co). Soluções de fagos são infundidas na ração para moscas para se obterem concentrações finais de fagos entre 0 e 108 pfu/mL.

[00300] As bactérias S. Marcescens, Erwinia carotovora, e Pseudomonas entomphila são cultivadas a 30 °C em caldo nutriente ou caldo LB.

[00301] Embriões de moscas esterilizados são gerados por tratamento de embriões fertilizados recolhidos de moscas com solução de hipoclorito 2% durante 5 min e então lavados com água esterilizada para remover quaisquer micróbios extracelulares. Larvas de moscas com as bactérias-alvo são geradas por semeadura de 109 CFU de bactérias em ração para moscas esterilizada e adição de embriões de moscas esterilizados a esta ração. Após 2 dias, dez larvas de moscas de primeiro instar infectadas com S. marcescens são adicionadas à ração para moscas com uma gama (0-108 pfu/mL) de concentrações de fagos. As larvas são deixadas crescer na ração com os fagos durante 3 dias até atingirem o terceiro instar. As larvas são então recolhidas e individual-mente homogeneizadas em caldo nutriente ou caldo LB, e plaqueadas em placas de ágar nutriente ou ágar LB, e incubadas a 30 °C. É registrado o número de CFU de S. marcescens obtidas de larvas em ração para moscas com concentrações variáveis de fagos. Tal mostra o número de bactérias vivas que estavam presentes nas moscas.

[00302] É esperado que o número de bactérias vivas seja reduzido nas larvas que cresceram em ração para moscas com os fagos contra as bactérias.

Exemplo 8: Administração de estirpe de bactéria produtora de aminoá- cido a Drosophila melanogaster através da dieta para aumentar a sua taxa de desenvolvimento

[00303] Este Exemplo demonstra a capacidade para tratar o inseto Drosophila melanogaster com bactérias produtoras de aminoácidos para melhorar o seu teor nutricional. Este planejamento experimental pode ser estendido para reduzir o tempo de crescimento e produzir mais biomassa de outros insetos, como grilos, que podem ser usados para produzir ração para animais rica em proteína.

[00304] O apetite mundial para carne está crescendo, e a produção de rações para animais é uma tensão crescente na terra e água. Insetos podem proporcionar muitas das proteínas de que humanos e animais necessitam com um custo ambiental muito menor; muitas espécies de insetos podem se alimentar de adubo, como gusanos de Grant, ou outros tipos de desperdícios orgânicos, como restos de ali- mentos, entranhas de animais, e grãos descartados pelas fábricas de cerveja. Os insetos produzem massa corporal a uma velocidade im-pressionante, em parte porque, sendo animais de sangue frio, não gastam energia na regulação da sua temperatura corporal. Os grilos, por exemplo, Acheta domesticus, necessitam somente de 1,7 quilogramas de ração para ganharem um quilograma de peso corporal; uma galinha dos E.U.A. típica consome 2,5 quilogramas, porcos 5 quilogramas, e gado 10 quilogramas. Outra vantagem: a maior parte dos insetos podem ser comidos inteiros. Apenas cerca de metade de uma galinha ou de um porco é comestível; para uma vaca, a fração é ainda menor. Em resultado, produzir um quilograma de proteína de inseto produz menos CO2 do que a criação de porcos ou gado, e ocupa somente um décimo da terra.

[00305] Farelo de inseto pode substituir entre 25% e 100% de farelo de soja ou farelo de peixe em dietas de animais sem efeitos adversos. No entanto, a maior parte dos farelos de inseto é deficiente nos aminoácidos metionina e lisina. A produção sintética de metioni- na requer químicos perigosos e o seu uso está banido na agricultura biológica. Neste Exemplo, a introdução de bactérias produtoras de metionina no microbioma de um inseto aumentou naturalmente o seu teor nutricional.

Planejamento terapêutico:

[00306] Bactérias isoladas Corynebacterium glutamicum que são produtoras de glutamato ou metionina são formuladas com uma solução de 109 unidades formadoras de colônias (CFU) misturada com o substrato de ração para moscas Drosophila.

Planejamento experimental:

[00307] Estirpes de Corynebacterium glutamicum que produzem glutamato ou metionina foram cultivadas em caldo nutriente a 30 °C.

[00308] O meio usado para criar moscas é meio de farelo de milho, melaço e levedura (11 g/L de levedura, 54 g/L de farelo de milho amarelo, 5 g/L de ágar, 66 mL/L de melaço, e 4,8 mL/L de ácido propiôni- co). Todos os componentes da dieta excetuando o ácido propiônico são aquecidos em conjunto para 80 °C em água desionizada com mistura constante durante 30 minutos e deixados esfriar para 60 °C. O ácido propiônico é então misturado no sistema e 50 mL da dieta são transferidos em alíquotas para garrafas individuais e deixados esfriar e solidificar. As moscas são criadas a 26 °C, ciclo de 16:8 horas de luz:escuridão, a cerca de 60% de umidade.

[00309] Para a montagem experimental para medir a taxa de crescimento larvar foi usada dieta definida (Piper et al., 2014, Nature Methods). A dieta definida elimina os efeitos da variação lote para lote nos ingredientes usados para a dieta à base de farelo de milho. Adici-onalmente, a dieta definida permite a exclusão de componentes indivi-duais para testar seus efeitos no desenvolvimento de moscas.

Ensaio da taxa de desenvolvimento

[00310] No dia um, 100 uL de uma suspensão de Corynebacterium glutamicum em caldo de nutrientes consistindo em 109 unidades for-madoras de colônias (CFU) foram adicionados a cinco repetições de ração para moscas. Como controles, caldo de nutrientes sem as bac-térias foi adicionado a mais cinco garrafas de ração para moscas. Em-briões fertilizados recolhidos de moscas da fruta foram tratados com solução de hipoclorito 2% durante cinco minutos e então lavados com água esterilizada para remover quaisquer micróbios extracelulares dos embriões. 10 uL da suspensão de embriões em água (suspensão um:três embriões:água) foram adicionados a todas as garrafas de ração para moscas com bactérias semeadas e de controle. A ração para moscas com os embriões foi mantida a 26 °C, ciclo de 16:8 horas de luz:escuridão, a cerca de 60% de umidade durante o resto da experiência. O tempo até à emergência de adultos e a taxa de emergência foram medidos em cada repetição. Desde o tempo em que o primeiro adulto emerge da pupa, o número de moscas adultas emergentes foi contado a cada 12 horas e a taxa de emergência foi calculada.

Ensaio da massa larvar

[00311] Para testar se a presença de bactérias produtoras de ami- noácidos pode aumentar a massa corporal de larvas em desenvolvimento quando criadas com dieta definida, produzimos larvas que são axênicas, e monoassociadas a uma única estirpe de bactéria. Para estes ensaios, três bactérias diferentes foram usadas, Corynebacte- rium glutamicum - uma estirpe que produz glutamato, Corynebacterium glutamicum - uma estirpe que produz metionina, e E. coli.

[00312] Em primeiro lugar, foram gerados embriões axênicos. Embriões fertilizados foram recolhidos de moscas da fruta ao longo de um período de 6 horas em placas de ágar de sumo de uva com levedura. Para eliminar qualquer contaminação bacteriana, os embriões foram tratados com solução de hipoclorito 2% durante cinco minutos e então lavados três vezes com água esterilizada. Um volume de embriões foi então suspenso em 3 volumes de água.

[00313] A dieta definida foi transferida em alíquotas para frascos e nove repetições foram usadas para cada condição sendo testada. As condições foram: 1. Nenhumas bactérias adicionadas à ração 2. Ração contendo C. glutamicum, estirpe que produz gluta- mato (C.glu-Glu) 3. Ração contendo C. glutamicum, uma estirpe que produz metionina (C.glu-Met) 4. Ração contendo E. coli

[00314] A cada frasco das rações que estavam nas condições 2, 3, e 4, 100 uL de culturas em fase estacionária durante a noite foram adi-cionados.

[00315] A cada uma das nove repetições em cada condição, 10 uL da suspensão de embriões esterilizados+água foram adicionados. Os frascos foram então incubados a 26 °C, 60% de umidade, ciclo de 16:8 de luz:escuridão.

[00316] Após 13 dias, 10-15 larvas escolhidas aleatoriamente de cada repetição foram submetidas à amostragem, e suas áreas foram medidas, como uma aproximação à sua biomassa e peso. As larvas foram recolhi-das da ração com uma espátula esterilizada, enxaguadas em água para limpar a ração de seus corpos, e uma imagem de cada uma das larvas submetidas a amostragem foi adquirida individualmente para cada repe-tição em cada condição. Foi usado um script de Image J para identificar, delinear, e medir a área das larvas em cada imagem.

[00317] Tratamento com bactérias produtoras de aminoácidos aumenta a taxa de desenvolvimento de insetos.

[00318] Embriões que se desenvolveram em dieta que foi semeada com a estirpe de bactéria produtora de aminoácido alcançaram a fase adulta de modo significativamente mais rápido do que aqueles que foram criados na dieta esterilizada (Figura 1). Além disso, este efeito foi ligeiramente mais forte em moscas fêmeas do que em moscas machos (Figuras 2A e 2B).

[00319] Tratamento com bactérias produtoras de aminoácidos aumenta a massa corporal larvar.

[00320] Larvas da dieta suplementada com C. glu-Met exibiram o maior tamanho do corpo em média, seguido daquelas em dieta com C.glu-Glu, E. coli, e nenhumas bactérias (Figura 3). Tal mostra que o acréscimo da dieta de insetos com bactérias que produzem aminoáci- dos produziu biomassa de insetos mais rapidamente do que dieta não suplementada.

[00321] Em conjunto, estes dados demonstram que o acréscimo da dieta de insetos com bactérias que foram capazes de produzir amino- ácidos produziu biomassa de insetos mais rapidamente do que dieta não suplementada. A extensão disto a outros insetos, como grilos, su-plementando sua dieta com bactérias que são capazes de produzir metionina, pode aumentar a sua biomassa e teor proteico.

Exemplo 9: Insetos tratados com uma solução de fago purificado

[00322] Este Exemplo demonstra o isolamento e purificação de fa- gos de amostras ambientais que visaram bactérias de insetos específicas. Este Exemplo também demonstra a eficácia de fagos isolados contra as bactérias-alvo in vitro por ensaios em placas, por medição da sua taxa de consumo de oxigênio, e da taxa de acidificação extracelu- lar. Por fim, este Exemplo demonstra a eficácia dos fagos in vivo, por medição da capacidade do fago para as bactérias-alvo de moscas por tratamento das mesmas com um fago isolado contra as bactérias. Este Exemplo demonstra que uma bactéria patogênica que decresceu a aptidão de um inseto pode ser eliminada usando um fago para visar as bactérias. Especificamente, Serratia marcescens, que é uma bactéria patogênica em moscas, pode ser eliminada com o uso de um fago que foi isolado de adubo de jardim.

[00323] Existem vários insetos benéficos e comercialmente úteis que são afetados por patógenos bacterianos de ocorrência natural.

Planejamento experimental Isolamento de bacteriófagos específicos a partir de amostras naturais:

[00324] Bacteriófagos contra bactérias-alvo foram isolados de material de uma fonte ambiental. Em resumo, uma cultura saturada de Ser- ratia marcescens foi diluída em caldo de soja tríptica (TSB) de dupla potência fresco e cultivada durante ~120 minutos para a fase log inicial a 24-26 °C, ou em caldo Luria-Bertani (LB) de dupla potência e cultivada durante ~90 min a 37 °C. Adubo de jardim foi preparado por homogeneização em PBS e esterilizado por filtração a 0,2 μm. Detritos brutos foram esterilizados por filtração a 0,2 μm. Um volume de mate- rial de fonte filtrado foi adicionado a culturas bacterianas em fase log e a incubação foi continuada durante 24 h. Material de fonte enriquecido foi preparado por peletização de culturas e filtração do fluido do sobre- nadante através de membranas de 0,45 μm.

[00325] Os fagos foram isolados plaqueando amostras sobre gramados bacterianos em ágar duplo. Culturas bacterianas estacionárias foram combinadas com LB ou TSB ágar 0,6% fundido e derramadas sobre placas de LB ou TSB ágar 1,5%. Após a solidificação, 2,5 μL de diluições de amostras de fagos foram dispostos em manchas sobre placas de duplo ágar e deixados absorver. As placas foram então embrulhadas e incubadas durante a noite a 25 °C (TSA) ou 37 °C (LB), então foram avaliadas quanto à formação de placas visíveis. Placas isoladas de novo foram purificadas por passagem em série de placas individuais na estirpe-alvo por triagem de placas para Tampão SM (Tris-HCl 50 mM [pH 7,4], MgSO4 10 mM, NaCl 100 mM) e incubação durante 15 min a 55 °C, então repetindo o método de disposição em manchas em duplo ágar de acima usando a suspensão de placas.

[00326] Bacteriófagos foram isolados com êxito de detritos e adubo, como detalhado acima. A formação de placas foi claramente evidente após disposição em manchas de amostras sobre gramados das bactérias S. marcescens usados para os enriquecimentos.

[00327] Passagem, quantificação, e propagação de bacteriófagos:

[00328] A propagação e geração de lisados de fagos para uso em experiências subsequentes foram realizadas usando bacteriófagos iso-lados e purificados como acima. Em resumo, culturas bacterianas sa-turadas foram diluídas 100 vezes em meio fresco e cultivadas durante 60-120 minutos para alcançar um estado de crescimento logarítmico inicial para infecção eficaz com fagos. Suspensões ou lisados de fagos foram adicionados a culturas em fase log inicial e a incubação foi continuada até eliminação da turvação do caldo, indicadora de propaga- ção dos fagos e lise bacteriana, ter sido observada, ou até às 24 h pós-infecção. Os lisados foram recolhidos por peletização de células a 7 197 x g durante 20 min, então filtração do fluido do sobrenadante através de membranas de 0,45 ou 0,2 μm. Os lisados filtrados foram armazenados a 4 °C.

[00329] A enumeração de partículas de fagos infecciosas foi realizada usando o método de disposição em manchas em duplo ágar. Em resumo, uma série de diluições 1:10 de amostras foi realizada em PBS e as diluições foram dispostas em manchas sobre placas de duplo ágar solidificado preparadas com as bactérias hospedeiras como acima. Unidades formadoras de placas (PFU) foram contadas após incubação durante a noite para determinar o título aproximado das amostras.

[00330] Análise in vitro de fagos isolados medindo a respiração bacteriana:

[00331] Um Analisador Seahorse XFe96 (Agilent) foi usado para medir os efeitos de fagos em bactérias por monitoração da taxa de consumo de oxigênio (OCR) e taxa de acidificação extracelular (ECAR) durante a infecção. Placas XFe96 foram revestidas no dia antes das experiências por 15 μL de um estoque de 1 mg/mL de poli-L- lisina por poço e foram secas durante a noite a 28 °C, e sondas XFe96 foram equilibradas por colocação em poços contendo 200 μL de Calibrador XF e incubação no escuro à temperatura ambiente. No dia seguinte, placas revestidas com poli-L-lisina foram lavadas duas vezes com ddH2O. Culturas durante a noite saturadas de E. coli BL21 (LB, 37 °C) ou S. marcescens (TSB, 25 °C) foram subcultivadas a 1:100 no mesmo meio e cresceram com arejamento durante ~2,5 h a 30 °C. As culturas foram então diluídas para O.D. 600 nm ~ 0,02 usando o mesmo meio. Os tratamentos foram preparados por diluição de estoques em Tampão SM a 10x concentração final e carga de 20 μL das soluções 10x nos portos de injeção apropriados da placa de sonda. Enquanto as sondas estavam equilibrando no Analisador de Fluxo XFe96, placas bacterianas foram preparadas por adição de 90 μL de suspensões bacterianas ou controles de meio e rotação a 3 000 rpm durante 10 min. Após centrifugação, mais 90 μL do meio apropriado foram adicionados suavemente aos poços de modo a não perturbar a aderência bacteriana, perfazendo o volume total para 180 μL por poço.

[00332] O Analisador de Fluxo XFe96 foi operado a ~30 °C, após uma aplicação de ciclos de Mistura, Espera, Leitura de 1:00, 0:30, 3:00. Quatro ciclos foram completados para permitir a equilibra- ção/normalização de bactérias, então os tratamentos de 20 μL foram injetados e a aplicação de ciclos continuou como acima, durante um período de tempo total de aproximadamente 6 h. Os dados foram ana-lisados usando o pacote de software Seahorse XFe96 Wave.

[00333] Os efeitos de bacteriófagos isolados foram avaliados medindo a taxa de consumo de oxigênio (OCR) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR) de bactérias com um Analisador Seahorse XFe96. Quando E. coli foi infectada com fago T7 e S. marcescens infectada com o isolado de novo ΦSmVL-C1, decréscimos dramáticos da OCR foram observados após breves jatos desta taxa (Figura 4). Para ambos os fagos com os dois organismos hospedeiros, o ensaio Seahorse permitiu a detecção de infecção com fagos bem-sucedida sem a necessidade de ensaios de placas. Assim, este método é aplicável para detectar a infecção com fagos de um organismo hospedeiro não propício a métodos de detecção com fagos tradicionais.

[00334] Ensaio de transdução com SYBR Gold para identificação de infecção:

[00335] Preparações de bacteriófago foram produzidas para coloração por pré-tratamento com nucleases com o propósito de remover ácidos nucleicos extravirais que podem interferir na interpretação de sinais fluorescentes. Em resumo, MgCl2 foi adicionado a 10 mL de li- sado de fagos à concentração final de 10 mM, e RNase A (Qiagen) e DNase I (Sigma) foram ambas adicionadas para concentrações finais de 10 μg/mL. As amostras foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente. Após tratamento com nucleases, 5 mL de lisados foram combinados com 1 μL de SYBR Gold (Thermo, 10 000x) e incubados à temperatura ambiente durante ~1,5 h. O corante em excesso foi sub-sequentemente removido de amostras usando colunas de ultrafiltração Amicon. Em resumo, colunas Amicon (15 mL, limite de peso molecular 10 k) foram lavadas por adição de 10 mL de Tampão SM e rotação a 5 000 x g, 4 °C durante 5 min. Amostras de fagos etiquetadas foram então submetidas a rotação através das colunas a 5 000 x g, 4 °C até o volume ter decrescido em aproximadamente 10 vezes (15-30 min). Para lavar amostras, 5 mL de Tampão SM foram adicionados a cada reservatório e a rotação foi repetida, seguida de mais duas lavagens. Após a terceira lavagem, as amostras retidas foram pipetadas dos reservatórios Amicon e perfeitas para aproximadamente 1 mL usando Tampão SM. Para remover contaminantes maiores, amostras de fagos lavados e etiquetados foram submetidas a rotação a 10 000 x g durante 2 min, e os sobrenadantes foram subsequentemente filtrados através de membranas de 0,2 μm para microtubos negros e armazenados a 4 °C.

[00336] Culturas bacterianas saturadas (E. coli MG1655 cultivada em LB a 37 °C, S. marcescens e S. symbiotica cultivadas em TSB a 26 °C) foram preparadas por rotação de alíquotas de 1 mL e lavagem uma vez com 1 mL de PBS antes de uma ressuspensão final usando 1 mL de PBS. Bactérias etiquetadas de controle positivo foram coradas por combinação de 500 μL de bactérias lavadas com 1 μL de SYBR Gold e incubação durante 1 h no escuro à temperatura ambiente. As bactérias foram peletizadas por rotação a 8 000 x g durante 5 min e lavadas duas vezes com um volume igual de PBS, seguido de ressus- pensão em um volume final de 500 μL de PBS. Um volume de 25 μL de bactérias coradas foi combinado com 25 μL de Tampão SM em um microtubo negro, ao qual 50 μL de formalina 10% (volume final de 5%, formaldeído ~2%) foram adicionados e misturados com um movimento súbito. As amostras foram fixadas à temperatura ambiente durante ~3 h e então lavadas usando colunas de ultrafiltração Amicon. Em resumo, 500 μL de água picopura foram adicionados a colunas Amicon (0,5 mL, limite de peso molecular de 100 k) e submetidos a rotação a 14 000 x g durante 5 min para lavar membranas. As amostras fixadas foram diluídas por adição de 400 μL de PBS e então transferidas para colunas de rotação pré-lavadas e submetidas a rotação a 14 000 x g durante 10 min. As colunas foram transferidas para tubos de recolha frescos, e 500 μL de PBS foram adicionados para diluir fixador remanescente no retentado. Subsequentemente, duas diluições adicionais com PBS foram realizadas, para um total de três lavagens. Os reten- tados finais foram diluídos para aproximadamente 100 μL, então as colunas foram invertidas para tubos de recolha frescos e o sistema foi submetido a rotação a 1 000 x g durante 2 min para recolher amostras. As amostras lavadas foram transferidas para microtubos negros e armazenadas a 4 °C.

[00337] Para as experiências de transdução e controles, 25 μL de bactérias (ou PBS) e 25 μL de fagos etiquetados com SYBR Gold (ou Tampão SM) foram combinados em microtubos negros e incubados de modo estático durante 15-20 min à temperatura ambiente para permitir a adsorção dos fagos e injeção em bactérias recebedoras. Imediatamente após a incubação, 50 μL de formalina 10% foram adicionados a amostras e a fixação foi realizada à temperatura ambiente durante ~4 h. As amostras foram lavadas com PBS usando colunas Amicon, como acima.

[00338] Foi requerida injeção de ácido nucleico de bacteriófago para que um fago infectasse com êxito uma célula bacteriana hospedeira. Colifago P1kc etiquetado com SYBR Gold e coincubado com S. marcescens revelou a presença de bactérias fluorescentes por micros- copia, validando o uso deste ensaio em uma arquitetura encadeada de isolamento de fagos. Tal como com o ensaio Seahorse, esta abordagem proporcionou uma alternativa a métodos tradicionais com fagos para permitir a expansão para organismos não propícios a um ensaio de placas. Adicionalmente, o ensaio de transdução com SYBR Gold não requereu crescimento bacteriano, logo é aplicável à análise de fa- gos visando organismos de cultura difícil ou mesmo não cultiváveis, incluindo endossimbiontes como Buchnera. Teste in vivo da eficácia dos fagos contra S. marcescens em moscas Drosophila melanogaster

[00339] Culturas de S. marcescens cresceram em Caldo de Soja Tríptica (TSB) a 30 °C com agitação constante a 200 rpm.

[00340] O meio usado para criar estoques de moscas foi meio de farelo de milho, melaço e levedura (11 g/L de levedura, 54 g/L de farelo de milho amarelo, 5 g/L de ágar, 66 ml/L de melaço e 4,8 ml/L de ácido propiônico). Todos os componentes da dieta excetuando o ácido propiônico foram aquecidos em conjunto para 80 °C em água desioni- zada com mistura constante durante 30 minutos e deixados esfriar para 60 °C. O ácido propiônico foi então misturado no sistema e 50 mL da dieta foram transferidos em alíquotas para garrafas individuais e deixados esfriar e solidificar. As moscas foram criadas a 26 °C, ciclo de 16:8 horas de luz:escuridão, a cerca de 60% de umidade.

[00341] Para infectar as moscas com S. marcescens, uma agulha fina (Ponta com cerca de 10 um de largo) foi imersa em uma cultura de fase estacionária densa durante a noite e o tórax das moscas foi pun- cionado. Para esta experiência, quatro repetições de 10 machos e 10 fêmeas cada foram infectados com S. marcescens usando o método de punção com agulha como controle positivo para a mortalidade das moscas. Para o grupo de tratamento, quatro repetições de 10 machos e 10 fêmeas cada foram picados com S. marcescens e uma solução de fagos contendo cerca de 108 partículas de fagos/mL. Por fim, duas repetições de 10 machos e 10 fêmeas cada que não foram picados nem tratados de modo nenhum foram usadas como controle negativo para a mortalidade.

[00342] Moscas em todas as condições foram colocadas em garrafas de alimento e incubadas a 26 °C, ciclo de 16:8 luz:escuridão, a 60% de umidade. Os números de moscas vivas e mortas foram contados em cada dia durante quatro dias após as picadas. Todas as moscas picadas com S. marcescens isoladamente estavam mortas em um período de 24 horas do tratamento. Em comparação, mais de 60% das moscas no grupo de tratamento com fagos, e todas as moscas no grupo de controle não tratado estavam vivas nesse momento (Figura 5). Além disso, a maior parte das moscas no grupo de tratamento com fagos e no grupo de controle negativo sobreviveram durante mais quatro dias quando a experiência foi terminada.

[00343] Para averiguar o motivo da morte das moscas, moscas mortas de ambas as moscas picadas com S. marcescens e S. mar- cescens + fago foram homogeneizadas e plaqueadas. Quatro moscas mortas de cada uma das quatro repetições de ambos os tratamentos com S. marcescens e S. marcescens + fago foram homogeneizadas em 100 uL de TSB. Uma diluição 1:100 também foi produzida por diluição do homogenado em TSB. 10 uL do homogenado concentrado bem como a diluição 1:100 foram plaqueados em placas TSA, e incubados durante a noite a 30 °C. Por inspeção das placas quanto ao crescimento de bactérias, todas as placas das moscas mortas picadas com S. marcescens exibiram um gramado de bactérias crescendo so- bre as mesmas, ao passo que as placas das moscas mortas picadas com S. marcescens + fago não exibiram bactérias sobre as mesmas. Isto mostra que, na ausência do fago, S. marcescens provavelmente induziu choque séptico nas moscas, conduzindo à sua fatalidade. No entanto, na presença do fago, a mortalidade pode ter sido devida a lesão causada pela picada com a agulha.

OUTRAS MODALIDADES

[00344] Apesar de a invenção anterior ter sido descrita em algum detalhe a título de ilustração e exemplo para propósitos de clareza da compreensão, as descrições e exemplos não devem ser considerados limitadores do escopo da invenção. As revelações de todas as patentes e literatura científica citadas aqui são expressamente incorporadas na sua totalidade a título de referência.

Claims (5)

1. Método para aumentar o perfil nutricional de um inseto, o método caracterizado pelo fato de que compreende: entregar uma quantidade eficaz de uma bactéria produtora de metionina ao inseto, em que (i) a bactéria produtora de metionina é formulada como uma composição comestível de inseto para ingestão pelo inseto; e/ou (ii) a bactéria produtora de metionina é formulada com um transportador agricolamente aceitável como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou uma composição gasosa.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o veículo é um revestimento de sementes.

3. Método para aumentar a taxa de desenvolvimento de um inseto, o método caracterizado pelo fato de que compreende: suplementar a dieta do inseto com uma bactéria produtora de aminoácido, em que o aminoácido é metionina ou glutamato, e em que (i) a taxa de desenvolvimento do inseto é aumentada em relação a um inseto de controle cuja dieta não é suplementada com a bactéria produtora de aminoácidos, em que a taxa de desenvolvimento aumentada compreende uma redução no tempo de maturidade, um aumento no ganho de biomassa ou ambos; e/ou (ii) o inseto é Drosophila melanogaster, uma mosca soldado negra, um bicho-da-farinha, um bicho-da-seda, um grilo, um gafanhoto, um cupim ou um gafanhoto; e/ou (iii) a dieta do inseto é suplementada com cerca de 109 unidades formadoras de colônia da bactéria produtora de aminoácidos por 50 mL de volume de alimento; e/ou (iv) a dieta do inseto é suplementada com a bactéria produ- tora de aminoácidos durante a fase larval de crescimento..

4. Uso de uma bactéria produtora de metionina, caracteri-zado pelo fato de ser na preparação de uma formulação para aumentar o perfil nutricional de um inseto, em que: (i) o inseto é um grilo, um gafanhoto ou um gafanhoto; e/ou (ii) o inseto é, em desenvolvimento, um embrião, larva, pupa ou adulto; e/ou (iii) a bactéria produtora de metionina é formulada com um transportador agricolamente aceitável como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou uma composição gasosa.

5. Uso de uma bactéria produtora de aminoácido, caracteri-zado pelo fato de ser na preparação de uma formulação para aumentar a taxa de desenvolvimento de um inseto, em que: (i) o inseto é um grilo, um gafanhoto ou um gafanhoto; e/ou (ii) o inseto é, em desenvolvimento, um embrião, larva, pupa ou adulto; e/ou (iii) a bactéria produtora de metionina é formulada com um transportador agricolamente aceitável como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou uma composição gasosa.