JP2020143030A

JP2020143030A - マイクロｒｎａの発現亢進剤及びマイクロｒｎａ発現亢進用飲食品

Info

Publication number: JP2020143030A
Application number: JP2019042523A
Authority: JP
Inventors: 蔵嵩大塚; Kurataka OTSUKA; 孝広落谷; Takahiro Ochitani
Original assignee: QP Corp
Current assignee: QP Corp
Priority date: 2019-03-08
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2020-09-10
Anticipated expiration: 2039-03-08
Also published as: JP6830976B2; WO2020184390A1; US20220170014A1; CN113543847A

Abstract

【課題】マイクロＲＮＡの新規な発現亢進剤の提供。【解決手段】プテロスチルベンを含有する、マイクロＲＮＡの発現亢進剤であって、マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１９３ｂ、及びｌｅｔ−７ａからなる群より選択される少なくとも１種である、発現亢進剤。【選択図】なし

Description

本発明は、マイクロＲＮＡの発現亢進剤及びマイクロＲＮＡ発現亢進用飲食品に関する。

マイクロＲＮＡは、塩基対の長さが２２塩基程度のＲＮＡである。スチルベン誘導体であるレスベラトロール及びプテロスチルベンが、このようなマイクロＲＮＡのうち、所定のマイクロＲＮＡの発現を促進又は抑制することが知られている（非特許文献１及び２）。

ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓ，２，３１４，２０１２Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１５年，６巻，２９号，ｐｐ．２７２１４−２７２２６

近年、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１９３ｂ、及びｌｅｔ−７ａといったマイクロＲＮＡに関し、発現量の異常と、癌、骨粗鬆症、心筋梗塞、脳疾患、循環器疾患、認知症、歯周病等の疾患の発生との関係が分かってきており、上記マイクロＲＮＡの発現量を制御（亢進）し得る化合物は、各種疾患の治療剤及び／又は予防剤等として有用である。

そこで、本発明は、マイクロＲＮＡの新規な発現亢進剤の提供を目的とする。

本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
（１）プテロスチルベンを含有する、マイクロＲＮＡの発現亢進剤であって、マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１９３ｂ、及びｌｅｔ−７ａからなる群より選択される少なくとも１種である、発現亢進剤。
（２）経口投与用である、（１）に記載の発現亢進剤。
（３）プテロスチルベンを含有する、マイクロＲＮＡの経口投与用発現亢進剤であって、マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−２００ｃ、及びｍｉＲ−１４１からなる群より選択される少なくとも１種である、発現亢進剤。
（４）プテロスチルベンを含む、マイクロＲＮＡ発現亢進用飲食品であって、マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１９３ｂ、及びｌｅｔ−７ａからなる群より選択される少なくとも１種である、飲食品。

本発明によれば、マイクロＲＮＡの新規な発現亢進剤が提供される。

（Ａ）〜（Ｄ）はそれぞれｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−３４ａ、及びｍｉＲ−１６の発現量の測定結果を示すグラフである。（Ａ）〜（Ｃ）はそれぞれｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１９３ｂ、及びｌｅｔ−７ａの発現量の測定結果を示すグラフである。

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

＜本発明の特徴＞
（マイクロＲＮＡの発現亢進剤）
本発明は、プテロスチルベンを含有する、マイクロＲＮＡの発現亢進剤であって、マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１９３ｂ、及びｌｅｔ−７ａからなる群より選択される少なくとも１種である、発現亢進剤を提供することに特徴を有する。

（マイクロＲＮＡの経口投与用発現亢進剤）
本発明は、プテロスチルベンを含有する、マイクロＲＮＡの経口投与用発現亢進剤であって、マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−２００ｃ、及びｍｉＲ−１４１からなる群より選択される少なくとも１種である、発現亢進剤を提供することに特徴を有する。

（飲食品）
本発明はまた、プテロスチルベンを含む、マイクロＲＮＡ発現亢進用飲食品であって、マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１９３ｂ、及びｌｅｔ−７ａからなる群より選択される少なくとも１種である、飲食品を提供することに特徴を有する。

＜マイクロＲＮＡの発現亢進剤＞
「マイクロＲＮＡの発現亢進剤」とは、マイクロＲＮＡの発現量が低下している状態から健常人（健常者）と同様の発現量までマイクロＲＮＡを増加させるものであってもよく、マイクロＲＮＡの発現量を健常人と同様の発現量に維持するものであってもよい。つまり、マイクロＲＮＡの発現亢進剤は、マイクロＲＮＡの、発現調節剤、発現制御剤、又は発現促進剤と言い換えることもできる。

＜マイクロＲＮＡ＞
本実施形態の発現亢進剤は、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１９３ｂ、及びｌｅｔ−７ａの発現を亢進させる。したがって、本実施形態の発現亢進剤は、上記マイクロＲＮＡ１種又は２種以上の発現亢進剤として用いることができる。

＜マイクロＲＮＡの発現亢進剤の用途＞
上述したマイクロＲＮＡの発現亢進剤は、癌、骨粗鬆症、心筋梗塞、脳疾患、循環器疾患、認知症、歯周病等の疾患の治療剤及び／又は予防剤として好適に用いることができる。

＜各マイクロＲＮＡの配列＞
上述したマイクロＲＮＡは、成熟した一本鎖のマイクロＲＮＡであり、それぞれ以下に示す配列を有する。
（１）ｍｉＲ−２００ｃ：ＵＡＡＵＡＣＵＧＣＣＧＧＧＵＡＡＵＧＡＵＧＧＡ（配列番号１）
（２）ｍｉＲ−１４１：ＵＡＡＣＡＣＵＧＵＣＵＧＧＵＡＡＡＧＡＵＧＧ（配列番号２）
（３）ｍｉＲ−３４ａ：ＵＧＧＣＡＧＵＧＵＣＵＵＡＧＣＵＧＧＵＵＧＵ（配列番号３）
（４）ｍｉＲ−１６：ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＧＵＡＡＡＵＡＵＵＧＧＣＧ（配列番号４）
（５）ｍｉＲ−１２６：ＵＣＧＵＡＣＣＧＵＧＡＧＵＡＡＵＡＡＵＧＣＧ（配列番号５）
（６）ｍｉＲ−１９３ｂ：ＡＡＣＵＧＧＣＣＣＵＣＡＡＡＧＵＣＣＣＧＣＵ（配列番号６）
（７）ｌｅｔ−７ａ：ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ（配列番号７）

＜プテロスチルベン＞
プテロスチルベン（Ｐｔｅｒｏｓｔｉｌｂｅｎｅ）は、下記式（１）により表される化合物である。

＜プテロスチルベンの含有量＞
本実施形態の発現亢進剤において、プテロスチルベンの含有量は、発現亢進剤全量基準で、０．０１質量％以上、若しくは０．１０質量％以上、又は、１０質量％以下、若しくは５質量％以下であってよい。

＜プテロスチルベンの入手方法＞
本実施形態において、プテロスチルベンは、市販品を用いてもよく、化学合成により得られたものを用いてもよい。

＜油脂＞
本実施形態の発現亢進剤は、油脂を更に含有していてもよい。この場合、発現亢進剤が経口投与用として、より一層好適なものとなる。

＜油脂の種類＞
本実施形態の発現亢進剤に含有していてもよい油脂は、動物油であってもよく、植物油であってもよい。油脂としては、例えば、コーン油、大豆油、ゴマ油、ナタネ油、サフラワー油、オリーブ油、ヒマシ油、綿実油、米油、ヒマワリ油、グレープシード油及び小麦胚芽油等の植物油、及び、卵黄油、魚油、鯨油、肝油等の動物油、又はこれらの精製油（サラダ油）、及びＭＣＴ（中鎖脂肪酸トリグリセリド）、ジグリセリドのように化学的あるいは酵素的処理を施して得られる食用油等が挙げられる。油脂は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

＜油脂の含有量＞
油脂の含有量は、発現亢進剤全量基準で、０．１質量％以上、若しくは１質量％以上、又は、１０質量％以下、若しくは８質量％以下であってよい。

＜添加剤＞
本実施形態の発現亢進剤は、添加剤（プテロスチルベン及び油脂を除く）を更に含有していてよい。添加剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤が挙げられる。

＜製剤形態＞
本実施形態の発現亢進剤は、固体（例えば、粉末）、液体（水溶性又は脂溶性の溶液又は懸濁液）、ペースト等のいずれの形状であってもよい。また、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤等のいずれの剤形であってもよい。

＜発現亢進剤の調製方法＞
上述の各種製剤は、プテロスチルベンと、必要に応じて、上記油脂及び添加剤と、を混和し、必要に応じて成形することによって調製することができる。
マイクロＲＮＡの発現亢進剤の調製方法に関して、剤形が液体の場合を以下に説明する。まず、品温５０〜９０℃に加温した油脂を準備する。加温した油脂に、プテロスチルベンを添加して、溶解させる。その後、プテロスチルベン及び油脂の混合物と、その他の成分と、を混合し、必要に応じて、滅菌処理等を行い、プテロスチルベンを含有する製剤を調製することができる。

＜投与方法＞
本実施形態の発現亢進剤は、経口投与により、上記マイクロＲＮＡの発現亢進作用を発揮することができるため、経口投与用として用いることができる。すなわち、本実施形態の発現亢進剤は、上記マイクロＲＮＡ１種又は２種以上の経口投与用発現亢進剤として用いることができる。通常、腹腔内投与等の非経口投与により、所望の効果を奏する製剤は、必ずしも経口投与によっても、所望の効果を奏するとは限らない。一方で、本実施形態の発現亢進剤は、非経口投与によって、マイクロＲＮＡの発現亢進効果が奏されることに加えて、経口投与によってもマイクロＲＮＡの発現亢進効果が奏される。マイクロＲＮＡの発現亢進剤の投与量、投与タイミング、投与期間については、適宜、設定することができる。

＜投与対象＞
本実施形態の発現亢進剤の投与対象となる生体は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。

＜投与量＞
具体的な投与量の一例として、例えば、ヒト成人男子（体重６０ｋｇ）に投与する場合、一日当たりの発現亢進剤の投与量は、０．０１ｍｇ〜５０００ｍｇ／日／人であってよく、０．０５ｍｇ〜１０００ｍｇ／日／人、より好ましくは０．１ｍｇ〜５００ｍｇ／日／人、さらに好ましくは０．５ｍｇ〜２５０ｍｇ／日／人である。発現亢進剤は、１日当たりの投与量が上記範囲内であれば、１日１回投与されてもよく、１日複数回（例えば、２回又は３回）に分けて投与されてもよい。なお、投与量は、発現亢進剤中の有効成分（すなわち、プテロスチルベン）の量を基準とした値である。

＜発現亢進剤の用途＞
本実施形態の発現亢進剤は、医薬品、医薬部外品、飲食品（飲料、食品）、飼料、飼料添加物等の製品の成分として使用することができる。飲料としては、例えば、水、清涼飲料水、果汁飲料、乳飲料、アルコール飲料、スポーツドリンク、栄養ドリンク等が挙げられる。食品としては、例えば、パン類、麺類、米類、豆腐、乳製品、醤油、味噌、菓子類、クリーム、ソース類、マヨネーズ、ドレッシング等が挙げられる。また、本実施形態の発現亢進剤は、健康食品、機能性表示食品、特別用途食品、栄養補助食品、サプリメント（例えば、ドクターズサプリメント）又は特定保健用食品等の成分として使用することもできる。

＜マイクロＲＮＡ発現亢進用飲食品＞
本実施形態の発現亢進剤は、飲食品の成分として使用することが可能である。すなわち、本発明の一実施形態として、プテロスチルベンを含む、マイクロＲＮＡ発現亢進用飲食品であって、マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１９３ｂ、及びｌｅｔ−７ａからなる群より選択される少なくとも１種である、飲食品（食品組成物）が提供される。

＜マイクロＲＮＡの発現を亢進させる方法＞
本発明の一実施形態は、プテロスチルベンを、それを必要とする対象に投与することを含む、マイクロＲＮＡの発現を亢進させる方法と捉えることもできる。当該方法において、投与方法、投与対象、投与量等については、上記の発現亢進剤におけるものと同様であってよい。対象は哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。

＜発現亢進剤の製造のための、プテロスチルベンの使用＞
本発明の一実施形態として、マイクロＲＮＡの発現亢進剤の製造のための、プテロスチルベンの使用が提供される。なお、当該実施形態における、投与方法、投与対象、投与量等については、上記の発現亢進剤におけるものと同様であってよい。

＜マイクロＲＮＡの発現亢進に使用するための、プテロスチルベン＞
本発明の一実施形態として、マイクロＲＮＡの発現亢進に使用するための、プテロスチルベンが提供される。なお、当該実施形態における、投与方法、投与対象、投与量等については、上記の発現亢進剤におけるものと同様であってよい。

以下、実施例等に基づいて、本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

（統計解析）
以下の実施例において、統計解析はKaleida Graph4.5（HULINKS社）を用いて、分散分析（One-Way ANOVA）を行った後、多重比較（Tukey’s HSD Test）で検定した。

〔試験例１：マイクロＲＮＡの発現量の評価〕
（粉末飼料用の試薬）
試験用の粉末飼料の調製には、以下の試薬を用いた。
カゼイン（オリエンタル酵母株式会社）
ＤＬ−メチオニン（和光純薬工業株式会社）
β−コーン澱粉（オリエンタル酵母株式会社）
スクロース（ＫＨ１精上白糖）（和田製糖株式会社）
セルロースパウダー（オリエンタル酵母株式会社）
コーン油（胚芽の恵みコーン油）（株式会社Ｊ−オイルミルズ）
ミネラルミックス（ＡＩＮ−９３Ｇミネラル混合）（オリエンタル酵母株式会社）
ビタミンミックス（ＡＩＮ−９３ビタミン混合）（オリエンタル酵母株式会社）
重酒石酸コリン（和光純薬工業株式会社）（Ｌｏｔ．Ｎｏ．：ＰＤＱ０５７５、ＣＴＫ０２４１）
９０％プテロスチルベン（シルビトール）（サビンサジャパンコーポレーション製）

（プテロスチルベン含有粉末飼料の調製）
試験用の飼料（プテロスチルベン含有粉末飼料）は、以下の方法により調製した。すなわち、まず、コーン油を５０ｇ秤量し、加温して７０℃とした。加温したコーン油にプテロスチルベンを添加して溶解させた。コーン油及びプテロスチルベン以外の試薬（その他の試薬）は乳鉢ですり潰し、混合した。その他の試薬の混合物に、プテロスチルベンを溶解させたコーン油を添加し、乳鉢で十分にすり潰して混合した。その後、攪拌機で約３０分間更に混合して、試験用の飼料を調製した。試験用の飼料に含まれる各種成分の組成は、表１に示すとおりである。試験用の飼料はビニール袋に入れ、株式会社コーガアイソトープでガンマ線滅菌を行った後、後述する動物実験に用いた。また、表１に示す組成の馴化食（プテロスチルベンの含有量：０質量％）を用意した。

（実験動物）
実験動物としては、５週齢のメスのヌードマウス（BALB/c-nu/nu, CAnN.Cg-Foxn1<nu>/CrlCjlj）（日本チャールズリバー社）を用いた。

（試薬）
試薬としては、以下のものを用いた。
ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swam murine sarcoma（Invitrogen社）
エスカイン（登録商標）吸入麻酔液（Pfizer社）
Beetle Luciferin, Potassium Salt（Promega社）
プロピレングリコール（Sigma-Aldrich社）

（飼育方法）
温度２０〜２５℃、湿度４０〜６０％の条件下に保持された環境下で、上記の実験動物を飼育した。給餌器としては、吊り下げ型の給餌器を用いた。

（試験群）
１群当たり８匹又は１０匹として、（ｉ）コントロール群（０％（ｗ／ｗ）プテロスチルベン群、ｎ＝１８）、及び（ｉｉ）０．２５％（ｗ／ｗ）プテロスチルベン群（ｎ＝１８）の２群の試験区を設定した。

（試験方法及び評価結果）
まず、５週齢のメスのヌードマウスを、実験開始前に１週間ほど環境に順応させた。
プテロスチルベン含有粉末飼料の経口投与によるマイクロＲＮＡの発現量への影響の検討として、まず、コントロール食（馴化食）を吊り下げ型給餌器で約１週間与えた後に、（ｉ）コントロール群、及び（ｉｉ）０．２５％（ｗ／ｗ）プテロスチルベン群の２群に群分けした。コントロール群では、馴化食を経口投与し、プテロスチルベン群では、プテロスチルベン含有粉末飼料（プテロスチルベンの含有量：０．２５質量％）を経口投与した。

群分けしてから１週間経過時点で、各群のマウスに対して、癌細胞の移植実験を行った。癌細胞の移植実験では、まず、移植する癌細胞（MM-231-luc-D3H2LN）をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に懸濁し、マトリゲル（ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swammurine sarcoma）と１：１の比率で混ぜ合わせて、移植用の懸濁液（細胞数：１×１０^５ｃｅｌｌ／ｍｌ）を準備した。次いで、イソフルラン（エスカイン（登録商標）吸入麻酔液）による麻酔下にて、マウスの乳腺に１×１０^４ｃｅｌｌｓの癌細胞を移植（上記の移植用の懸濁液（細胞数：１×１０^５ｃｅｌｌ／ｍｌ）を１００μｌ導入）した。癌細胞が移植されていることの確認は、移植後にしばらく放置し、１５０ｍｇ／ｋｇの量で、１５ｍｇ／ｍｌルシフェリン溶液(Beetle Luciferin, Potassium Salt、Promega社)を腹腔内に投与し、約１０分後にＩＶＩＳＳｐｅｃｔｒｕｍ（Perkin Elmer社）で細胞由来の発光（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性）を測定することにより行った。試験用の飼料及びマウスの状態は、毎日適切に管理した。マウスの体重は適時計測した。投与開始日（０日目）は、癌細胞（腫瘍）を移植した日とした。そして、投与開始日から一週間おきにＩＶＩＳｓｐｅｃｔｒｕｍにて発光を経時観察した。

投与開始から、２１日経過時点で、イソフルラン麻酔下にて腫瘍を摘出し、安楽死を行った。各群（コントロール群又はプテロスチルベン群）で摘出した腫瘍を測定用の試料として、以下に示す方法により、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１９３ｂ、及びｌｅｔ−７ａの発現量の定量解析をおこなった。なお、本試験例は独立した試験を２回繰り返し行ったものである。

まず、miRNeasy（登録商標） Mini Kit を用いて、製造元推奨のプロトコールに従い、測定用の試料から、ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡは、TaqMan（登録商標） MicroRNA assay とTaqMan（登録商標） MicroRNA Reverse TranscriptionKitとを用いて、それぞれ製造元推奨のプロトコールに従い、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換した。そのｃＤＮＡを鋳型にして、TaqMan（登録商標） Universal PCR Master Mix,NoAmpErase（登録商標） UNG を用いて、StepOne Plus^TMReal-Time PCR System（AppliedBiosystems）により、ｍｉＲＮＡの定量解析を行った。結果を図１〜２に示す。図１〜２中、エラーバーは、標準誤差を示す。

（評価結果）
図１〜２に示すとおり、プテロスチルベンを経口投与した群（プテロスチルベン群）では、コントロール群と比べて、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１９３ｂ、及びｌｅｔ−７ａの発現が亢進していた。

Claims

プテロスチルベンを含有する、マイクロＲＮＡの発現亢進剤であって、
前記マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１９３ｂ、及びｌｅｔ−７ａからなる群より選択される少なくとも１種である、発現亢進剤。
請求項１に記載の発現亢進剤において、
経口投与用である、
発現亢進剤。
プテロスチルベンを含有する、マイクロＲＮＡの経口投与用発現亢進剤であって、
前記マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−２００ｃ、及びｍｉＲ−１４１からなる群より選択される少なくとも１種である、発現亢進剤。
プテロスチルベンを含む、マイクロＲＮＡ発現亢進用飲食品であって、
前記マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１９３ｂ、及びｌｅｔ−７ａからなる群より選択される少なくとも１種である、飲食品。