JP2020132584A

JP2020132584A - エピゲノム状態を制御する融合タンパク質及びその利用

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Publication number: JP2020132584A
Application number: JP2019029415A
Authority: JP
Inventors: 田中　秀典; Hidenori Tanaka; 秀典田中; 池内　暁紀; Akinori Ikeuchi; 暁紀池内; 里沙小野田; Risa Onoda; 広樹杉本; Hiroki Sugimoto; 伸彦村本; Nobuhiko Muramoto
Original assignee: Toyota Central R&D Labs Inc
Current assignee: Toyota Central R&D Labs Inc
Priority date: 2019-02-21
Filing date: 2019-02-21
Publication date: 2020-08-31
Anticipated expiration: 2039-02-21
Also published as: JP7059965B2; US11479780B2; US20200270620A1

Abstract

【課題】広範囲にかつ複数種類の遺伝子発現を直接的に制御するのに適した方法の提供。【解決手段】ゲノムＤＮＡに対して配列特異的に複数個所に結合可能なポリペプチドを規定する第１の領域と、エピゲノム状態を制御可能なポリペプチドを規定する第２の領域と、を備える、融合タンパク質。【選択図】なし

Description

本明細書は、エピゲノム状態を制御する融合タンパク質及び及びその利用に関する。

植物のバイオマスを増産させることは、食料の増産のみならず、地球環境保全、地球温暖化防止、温室効果ガス排出低減の効果がある。従って、植物バイオマスを増産させる技術は産業上の重要性が高い。また、微生物は様々な産業において有効に利用されている。例えばセルロースなどの多糖を原料とするバイオエタノール製造においてはより低コストにエタノール発酵を行うために、高温耐性、高アルコール濃度耐性、高アルコール合成能などの特性を持った酵母を用いることが望ましい。

これらの植物や酵母の生産性やストレス耐性の向上に関する特性は、単一遺伝子ではなく多数の遺伝子発現の影響を受ける量的形質である。従来、こうした多数の遺伝子の影響下にある形質の改変には、何世代にもわたる繰り返し変異導入によってなされてきた。通常の塩基置換やＤＮＡの欠失の誘導においては一回の変異処理における形質変化が小さく、多数の形質を同時に扱うことは難しいからである。こうした数世代にわたる変異導入の場合、有用変異と同時に多数の不要な変異が蓄積し、必要な形質を喪失する場合も多いことが知られている。こうしたことから、多数の遺伝子により制御される形質を改変するためには、広範な遺伝子発現を直接的に制御できるシステムの開発が求められている。

これまでに遺伝子発現制御において中心的な働きを担う転写因子タンパク質に転写抑制ドメインを連結したキメラリプレッサーが開発されており(CRES-T法)（特許文献１、非特許文献１)、ノックアウト体と同様の表現型を誘導できることが報告されている。

また、個別の遺伝子発現を特異的に制御する方法としてはＤＮＡ配列認識分子としてTALENやCRISPR/dCas9/gRNAを用いて、ＤＮＡの切断を介してゲノムを編集する方法（特許文献２，３）が既に知られている。また、こうしたＤＮＡ配列認識分子と転写制御因子やエピゲノム状態制御因子とを連結して、特定のＤＮＡ配列を修飾してエピゲノム状態を制御する方法が報告されている（非特許文献2、３)。これらの技術では、ゲノム編集技術と同様に、特異的な遺伝子における発現調節を目的としている。

一方で、ゲノム間の大規模な再編成を効率的に実施できる方法として、実際に植物や真菌細胞において、ゲノムDNAにおける遺伝的組換えを人為的に誘発して、種々の変異体を取得する方法が報告されている（特許文献４〜６）。これらの方法によれば、植物細胞や真菌細胞で制限酵素を用いていわゆるゲノムシャッフリングを人為的に誘発することによってゲノムDNAの再編成を経た変異体を効率良く取得することができる。

特開2009-213426号公報国際公開WO2015020218号パンフレット米国特許明細書第9388430号特開2012-44883号公報特開2011-160798号公報特許第4158920号

化学と生物、52巻（2014）、7号、p．438−446 Nature Ｍethods, 2016, 13(2), 127 Nature Methods, 2017, 14(10), 963

しかし、転写因子タンパク質に転写抑制ドメインを連結したキメラリプレッサーの利用による遺伝子発現制御の作用原理については不明な部分が多く残されており、一番の短所としては転写因子の標的遺伝子が不明である限り、その効用を定量的に評価することが難しいことがあげられる。また、一般的に標的遺伝子が明確な転写因子は数が少ないことも知られている（非特許文献３）。

また、TALENやCRISPR/dCas9/gRNAを利用した遺伝子発現調節は、あくまで特定の遺伝子の発現調節を意図しているため、ゲノムの広範囲に亘る複数の遺伝子発現制御には不向きであると考えられる。さらに、この方法は、標的遺伝子が確定していない場合には利用が困難であるほか、依然としてオフターゲットの問題もある。

さらに、人為的なゲノムシャッフリングは、ゲノムの広範囲にわたり、ＤＮＡの切断及び再結合によって多様な変異が導入されるため、遺伝子発現制御以外にも多様な変異情報を生体内に蓄積してしまう可能性があった。さらにまた、ゲノムの切断と再結合は、細胞に対して大きな障害を付与する可能性もあった。

以上のとおり、現状においては、広範囲にかつ複数種類の遺伝子発現を直接的に制御するのに適した方法は見つかっていない。本明細書は、こうした遺伝子発現制御に好適な技術を提供する。

本発明者らは、ゲノムの広い領域にわたって人為的に、遺伝子情報を改変することなく、また、ＤＮＡ二本鎖を切断することなく、遺伝子発現制御をするには、エピゲノム状態の制御が有効であると考えた。さらに、エピゲノム状態を制御の対象とする場合、一定の配列特異性でゲノムの複数個所に結合するような足場の提供が重要であると考えた。さらにまた、かかるタンパク質を足場とした上でエピゲノム状態を制御することが、標的遺伝子が同定されてない場合に当該標的遺伝子の発現制御、量的形質の効率的な改変、新たな形質等の付与、エピゲノム状態の改変とその機能解析に有用であろうと考えた。

かかる着想のもと、本発明者らは、制限酵素に着目した。本発明者らは、ＤＮＡ切断活性が欠失しＤＮＡ結合能のみを持つポリペプチドがあれば、ゲノムの広範囲にわたって配列特異的に結合可能な足場タンパクとして機能することを期待できると考えた。種々の検討の結果、多頻度制限酵素からＤＮＡ切断活性を除去し、結合能のみを保持したポリペプチドがゲノムＤＮＡ上の配列特異的足場タンパクとして活用できるという知見を得た。さらに、本発明者らは、エピゲノム状態変化を誘発するポリペプチドをこのタンパク質に連結した融合タンパク質を細胞内で発現させることで、ＤＮＡを切断することなく、ゲノムの広い範囲にわたってエピゲノム状態を制御することができるという知見を得た。本明細書によれば、以下の手段が提供される。

［１］ゲノムＤＮＡに対して配列特異的に複数個所に結合可能なポリペプチドを規定する第１の領域と、エピゲノム状態を制御可能なポリペプチドを規定する第２の領域と、を備える、融合タンパク質。
［２］前記第１の領域が規定する前記ポリペプチドは、制限酵素に由来しＤＮＡ二本鎖切断活性を欠失している、［１］に記載の融合タンパク質。
［３］前記制限酵素は、多頻度制限酵素である、［２］に記載の融合タンパク質。
［４］前記第１の領域が規定する前記ポリペプチドは、４塩基配列認識の制限酵素に由来しＤＮＡ二本鎖切断活性を欠失している、［１］〜［３］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［５］前記第１の領域が規定する前記ポリペプチドは、ゲノムＤＮＡ中の回文配列を認識して結合する活性を備える、［１］〜［４］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［６］多頻度制限酵素に由来しゲノムＤＮＡ中の回文配列を認識して結合する活性を備え、ＤＮＡ二本鎖切断活性を欠失しているポリペプチドを規定する第１の領域と、エピゲノム状態を制御可能なポリペプチドを規定する第２の領域と、を備える、融合タンパク質。
［７］前記第２の領域が規定する前記ポリペプチドは、ＤＮＡメチル化活性、ＤＮＡ脱メチル化活性及び／又はヒストン化学修飾活性を備える、［１］〜［６］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［８］前記ヒストン化学修飾活性は、ヒストンアセチル化、ヒストン脱アセチル化、ヒストンメチル化、ヒストン脱メチル化、ヒストンユビキチン化及びヒストン脱ユビキチン化からなる群から選択される、［７］に記載の融合タンパク質。
［９］ゲノムＤＮＡに対して配列特異的に複数個所に結合可能なポリペプチドを規定する第１の領域と、エピゲノム状態を制御可能なポリペプチドを規定する第２の領域と、を備える、融合タンパク質をゲノムＤＮＡに対して作用可能に準備する工程と、
前記第１の領域の配列特異的結合性を利用して、前記融合タンパク質を前記配列特異的に認識される前記ゲノムＤＮＡ上の部位に供給し、前記第２の領域を前記ゲノムＤＮＡに対して作用させてエピゲノム状態を変化させる工程と、
を備える、方法。
［１０］ゲノムＤＮＡ上の複数個所のエピゲノム状態を同時的に変化させる、［９］に記載の方法。
［１１］前記融合タンパク質を誘導的に作用させる、［９］又は［１０］に記載の方法。
［１２］生物の形質を変化させる、［９］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］生物の量的形質を改変する、［９］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］前記生物は、植物である、［９］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］前記生物は、酵母である、［９］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
［１６］前記ゲノムＤＮＡは、ヒト由来の動物細胞内のゲノムＤＮＡである、［９］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
［１７］ヒト以外の生物の育種方法である、［９］〜［１５］のいずれかに記載の方法。
［１８］［１］〜［８］のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［１９］［１８］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［２０］［１８］に記載のポリヌクレオチド又は［１９］に記載のベクターを含む細胞。
［２１］［１］〜［８］のいずれかに記載の融合タンパク質、［１８］に記載のポリヌクレオチド、［１９］に記載のベクター又は［２０］に記載の細胞を備える、キット。

ＴａｑＩ及びｎＴａｑＩをそれぞれ導入したプロトプラストにおけるＢＲＣＡ１の相対的発現量を示す図である。ＴａｑＩ及びｎＴａｑＩをそれぞれ導入したＤＮＡ組換え部位を示すＧＵＳスポット数を示す図である。酵母における融合タンパク質によるエピゲノム状態の変化を評価するためのコンストラクトの概念図である。酵母におけるエピゲノム状態の変化の評価結果をエピゲノム状態の制御因子ごとに示す図である。シロイヌナズナにおけるｎｔａｑＩ−ｐ３００導入の塩ストレスに対する影響を示す図である。シロイヌナズナにおけるｎｔａｑＩ−ｐ３００導入の塩ストレスに対する影響を示す図である。シロイヌナズナにおけるｎｔａｑＩ−ｐ３００導入の熱ストレスに対する影響を示す図である。シロイヌナズナにおけるｎｔａｑＩ−ｐ３００導入の熱応答性遺伝子の発現に対する影響を示す図である。

本明細書は、ゲノムＤＮＡのエピゲノム状態を人為的に制御するのに好適な融合タンパク質及びその利用を提供する。本明細書に開示される融合タンパク質（以下、本融合タンパク質ともいう。）は、ゲノムＤＮＡに対して配列特異的に複数個所に結合可能なポリペプチドを規定する第１の領域と、エピゲノム状態を制御可能なペプチドを規定する第２の領域と、を備えることができる。このため、本融合タンパク質は、広範囲にかつ複数種類の遺伝子発現を直接的に制御するのに適している。

こうしたエピゲノム状態の制御が可能な本融合タンパク質は、ゲノムＤＮＡの複数個所のエピゲノム状態を制御できるため、速やかにかつ遺伝子改変することなく効率的に遺伝子発現を制御することができる。

また、本融合タンパク質は、ゲノムＤＮＡにおいて効率的な遺伝子発現制御（増大又は減少など）が可能であるため、対象性物の速やかに形質を変化させることができる。また、本融合タンパク質は、ある形質に対する標的遺伝子が同定されてない場合における遺伝子制御、量的形質の効率的な改変、新たな形質等の付与、エピゲノム状態の改変とその機能解析に有用である。

本明細書において「ゲノムＤＮＡ」とは、原核生物が有するゲノムＤＮＡ、真核生物の細胞核におけるゲノムＤＮＡが挙げられる。

本明細書において「エピゲノム状態」とは、ゲノムＤＮＡにおけるＤＮＡ塩基配列の変化を伴わないが遺伝子の発現に関連するＤＮＡやヒストンなどの修飾状態をいうものとする。

本明細書において「生物」とは、原核生物及び真核生物を含む。原核生物としては、細菌等が挙げられる。真核生物としては、単細胞及び多細胞の真核生物が挙げられる。真核生物が多細胞生物であるときには、真核生物の一部（例えば、後述するように、細胞、組織、器官等）に対して利用できる。

真核生物としては、動物、植物、藻類、コケ類、真核性微生物が挙げられる。動物としては特に限定しないで、非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物及び各種の魚類、昆虫などの非哺乳動物が挙げられる。また、本開示を適用できる対象は、ヒト及び非ヒト動物由来の細胞を含む動物細胞、植物細胞、微生物細胞などの各種細胞、組織、器官、未受精、精子、受精卵などいずれの形態であってもよい。動物に適用する場合、受精卵など、完全な動物に再生する能力を保持しているものであれば、改変した動物を得るのに都合がよい。

本育種方法に適用される植物としても特に限定するものではないが、例えば、双子葉植物、単子葉植物、例えばアブラナ科、イネ科、ナス科、マメ科、ヤナギ科等に属する植物（下記参照）が挙げられる。

アブラナ科：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、アブラナ（Brassica rapa、Brassica napus）、キャベツ(Brassica oleracea var. capitata)、ハクサイ（Brassica rapa var. pekinensis）、チンゲンサイ又はパクチョイ（Brassica rapa var. chinensis）、カブ（Brassica rapa var. rapa）、ノザワナ（Brassica rapa var. hakabura）、ミズナ（Brassica rapa var. lanciniifolia）、コマツナ（Brassica rapa var. perviridis）、ダイコン（Raphanus sativus）、ワサビ（Wasabia japonica）など。
ナス科：タバコ（Nicotiana tabacum）、ナス(Solanum melongena)、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、トマト（Lycopersicon lycopersicum）、トウガラシ（Capsicum annuum）、ペチュニア（Petunia）など。
マメ科：ダイズ(Glycine max)、エンドウ（Pisum sativum）、ソラマメ（Vicia faba）、フジ（Wisteria floribunda）、ラッカセイ（Arachis hypogaea）、ミヤコグサ（Lotus corniculatus var. japonicus）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）、アズキ（Vigna angularis）、アカシア（Acacia）など。
キク科：キク（Chrysanthemum morifolium）、ヒマワリ（Helianthus annuus）など。
ヤシ科：アブラヤシ（Elaeis guineensis、Elaeis oleifera）、ココヤシ（Cocos nucifera）、ナツメヤシ（Phoenix dactylifera）、ロウヤシ（Copernicia）など。
ウルシ科：ハゼノキ（Rhus succedanea）、カシューナットノキ（Anacardium occidentale）、ウルシ（Toxicodendron vernicifluum）、マンゴー（Mangifera indica）、ピスタチオ（Pistacia vera）など。
ウリ科：カボチャ（Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbita pepo）、キュウリ（Cucumis sativus）、カラスウリ（Trichosanthes cucumeroides）、ヒョウタン（Lagenaria siceraria var. gourda）など。
バラ科：アーモンド（Amygdalus communis）、バラ（Rosa）、イチゴ（Fragaria）、サクラ（Prunus）、リンゴ（Malus pumila var. domestica）など。
ナデシコ科：カーネーション（Dianthus caryophyllus）など。
ヤナギ科：ポプラ(Populus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremula)など。
イネ科：トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativa)、オオムギ（Hordeum vulgare）、コムギ（Triticum aestivum）、タケ（Phyllostachys）、サトウキビ（Saccharum officinarum）、ネピアグラス（Pennisetum pupureum）、エリアンサス（Erianthus ravennae）、ミスキャンタス（ススキ）（Miscanthus virgatum）、ソルガム（Sorghum）スイッチグラス（Panicum）など。
ユリ科：チューリップ（Tulipa）、ユリ（Lilium）など。
フトモモ科：ユーカリ（Eucalyptus camaldulensis、Eucalyptus grandis）など。

本融合タンパク質等を適用できる植物としては、植物に由来するものであればよいが、完全な植物に再生する能力を保持しているものが好適である。したがって、植物としては、プロトプラスト、細胞、各種組織、器官、葉、幼芽、腋芽、側芽、不定芽、花芽などのシュート、シュート頂、茎、枝、茎、雌しべ又は胚珠などのその一部、雄しべ又は花粉などのその一部、種子又は胚などのその一部、根又はその一部、カルスなどいずれの形態であってもよい。

微生物としては、特に限定するものではないが、物質生産等を考慮すると、麹菌などのカビや酵母などの微生物細胞が挙げられる。麹菌としては、アスペルギルス・アキュリータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus orizae）等のアスペルギルス属が挙げられる。また、酵母としては、公知の各種酵母を利用できるが、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属の酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属の酵母、キャンディダ・シェハーテ（Candida shehatae）等のキャンディダ属の酵母、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）等のピキア属の酵母、ハンセヌラ（Hansenula）属の酵母、クロッケラ属（Klocekera）の酵母、スワニオマイセス属（Schwanniomyces）の酵母及びヤロイア属（Yarrowia）の酵母、トリコスポロン（Trichosporon）属の酵母、ブレタノマイセス（Brettanomyces）属の酵母、パチソレン（Pachysolen）属の酵母、ヤマダジマ（Yamadazyma）属の酵母、クルイベロマイセス・マーキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）等のクルイベロマイセス属の酵母、イサトケンキア・オリエンタリス（Issatchenkia orientalis）等のイサトケンキア属の酵母が挙げられる。なかでも、工業的利用性等の観点からサッカロマイセス属酵母が好ましい。なかでも、サッカロマイセス・セレビジエが好ましい。酵母としては、ヘテロタリズム性の酵母のほか、ホモタリズム性酵母であってもよい。

藻類としては、特に限定するものではないが、真核生物性で単細胞生物であるもの（珪藻、黄緑藻、渦鞭毛藻など）及び多細胞生物である海藻類（紅藻、褐藻、緑藻）等が挙げられる。

コケ類としては、特に限定するものではないが、植物性であり非維管束植物であるものが挙げられる。例えば、スギゴケやハイゴケなどの蘚類、ゼニゴケやツボミゴケなどの苔類、ツノゴケなどのツノゴケ類が挙げられる。

（融合タンパク質）
本融合タンパク質は、ゲノムＤＮＡに対して配列特異的に複数個所に結合可能なポリペプチドを規定する第１の領域と、エピゲノム状態を制御可能なポリペプチドを規定する第２の領域と、を備えることができる。第１の領域及び第２の領域はいずれも１種又は２種以上を備えることができる。ゲノムDNAに対する配列特異性やエピゲノム状態の制御を考慮すると、第１の領域及び第２の領域をそれぞれ１種類を一個備えることができる。

（第１の領域）
第１の領域は、DNA上の特定の配列を認識してDNA結合活性を有し、かつ、前記特定配列を認識して複数個所に結合可能なポリペプチド（以下、第１のポリペプチドともいう。）を規定する。第１のポリペプチドは、配列特異的に有するポリペプチドである。本明細書において用いるポリペプチドは、ポリペプチド自体がＤＮＡ上の特定配列を認識してＤＮＡ結合活性を発揮するポリペプチドである。すなわち、ポリペプチド自身あるいはポリペプチド単独で、ゲノムＤＮＡ上で足場となりうるポリペプチドである。こうしたポリペプチドによれば、コンパクトでかつ精度よい配列特異的結合性を確保でき、オフターゲット作用を容易に回避できる。

例えば、類似のポリペプチドとして、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）を利用する、かかるガイドＲＮＡとＣａｓ９二重変異体又はＮｕｌｌ変異体との複合体などが挙げられる。しかしながら、かかる複合体のＤＮＡに対する特異的配列結合性は、ＤＮＡとＲＮＡとのハイブリダイゼーションに基づいている。このため、標的配列以外にも結合する非特異的な結合であるオフターゲット作用を免れないし、また、意図的に複数個所に結合可能に構成することもできない。また、かかる複合体は、本来的に、ゲノムＤＮＡ上の特定の標的部位に結合することを意図しているため、本開示が意図する、複数個所に結合可能であるポリペプチドとは異なる。

第１のポリペプチドは、例えば、Zinc Finger Nuclease(ZFN), Transcroption activator-like effetor Nuclease(TALEN)などのDNA結合タンパク質や、制限酵素に由来しＤＮＡ二本鎖切断活性を欠失しているポリペプチドが挙げられる。かかるポリペプチドは、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによらないで、ＤＮＡに特異的に結合可能であるとともに、ＤＮＡ二本鎖切断活性を欠失していることで、ＤＮＡの切断を生じさせないからである。

例えば、ZFNやTALENについては、そのDNAの認識部位を、所望の塩基配列を認識可能に改変することができる。また、制限酵素は、そのＤＮＡ二本鎖切断活性に必須又は貢献するアミノ残基を置換、欠失などすることにより、ＤＮＡ二本鎖切断活性を欠失させることができる。

第１のポリペプチドとしては、ＺＦＮやＴＡＬＥＮなどを用いることもできるが、本来的にゲノムＤＮＡに対してマルチに作用する点及び配列特異性に基づく結合精度が高い点などから、ＤＮＡ切断活性を欠失しＤＮＡ結合活性を有する制限酵素を用いることが好ましい。

かかる制限酵素としては、特に限定するものではなく、制限酵素の認識配列に基づくゲノムＤＮＡ上に対する結合予定数（頻度）や結合予定部位等のほか、至適温度、制限酵素のアミノ酸残基数等を適宜考慮して選択することができる。なお、エピゲノム状態を制御しようとする対象生物のゲノムＤＮＡの塩基配列が判明していれば、当業者は、用いようとする制限酵素の認識配列が、例えば遺伝子上流の１ｋｂの範囲に何個存在するかを容易に取得できる。制限酵素は、その認識配列は既に報告されているが、なかでも、ＤＮＡ二本鎖切断活性部位やＤＮＡ結合部位が既に報告されているＴａｑＩ、ＭｕｎＩ、ＲＡＧ１、ＥｃｏＲ１２４Ｉ、ＫｐｎＩ、Ｂｓｐ６Ｉ、ＰｖｕＩＩ等（後述する参考文献１〜８参照）を好ましく用いることができる。

制限酵素の認識配列は、特に限定するものではないが、制御効率の観点からは、ＤＮＡ二本鎖上の、例えば、４塩基〜６塩基程度を認識部位とする、いわゆる多頻度制限酵素と称されるＤＮＡ二本鎖切断酵素を用いることができる。例えば、４塩基又は５塩基の認識部位とする制限酵素を用いることができる。また例えば、４塩基の認識部位とする制限酵素を用いることができる。

例えば、４塩基の認識部位を有する場合、遺伝子の調節領域である遺伝子のコード領域の上流１ｋｂに、例えば、１個以上、また例えば、２個以上７個以下、また例えば、３個以上６個以下、また例えば、４個以上５個以下、また例えば、５個以上７個以下の認識部位が存在していることが認められる。例えば、４塩基の認識部位を有するＴａｑＩの場合、Arabidopsis thalianaのゲノムＤＮＡに対して、遺伝子上流の１ｋｂに存在において、１個の認識部位が存在する遺伝子数は、５０００個以上であり、２個の認識部位が存在する遺伝子数は、６０００個弱であり、３個の認識部位が存在する遺伝子数は、５０００個以上であり、４個の認識部位が存在する遺伝子数は、３５００個程度であり、５個の認識部位が存在する遺伝子数は、２０００個以上であり、６個の認識部位が存在する遺伝子数は、１０００個以上である。このように、４塩基〜５塩基の認識部位とする改変制限酵素を用いることで、多くの遺伝子について多様性を導入することができる。

また、配列特異性を向上させる観点から、制限酵素が有する認識配列は、ゲノムＤＮＡ中の回文配列を認識するものであることが好ましい。回文配列を認識することで、認識の精度が向上される。

認識部位の観点からは、特に限定されないが、例えば、ＡｐｅＫＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｔｓＣＩ、ＦａｔＩ、ＦａｕＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＰｈｏＩ、ＰｓｐＧＩ、ＳｍｌＩ、ＴａｑＩ、ＴｆｉＩ、ＴｓｅＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＴｓｐＲＩが挙げられる。また、Ｓｓｅ９Ｉ、ＭｓｅＩ、ＤｐｎＩ及びＣｖｉＡＩＩ等などの公知の各種の多頻度制限酵素を挙げることができる。

第１のポリペプチドに適用する制限酵素の至適温度も特に限定するものではない。例えば、好熱菌由来の制限酵素を用いることができる。好熱菌は、至適生育温度が４５℃以上又は生育限界温度が５５℃以上である細菌をいう。なお、好熱菌は概して古細菌である。また、好熱菌由来制限酵素は、概して、８０℃又はそれ以上の温度を失活温度としうる。さらに、好熱菌由来制限酵素は、至適温度が５０℃以上８０℃以下程度である。

好熱菌由来制限酵素は、生物の一般的な生育温度よりも高温領域にＤＮＡ二本鎖切断活性についての至適温度、すなわち、概ね最大のＤＮＡ二本鎖切断酵素活性を有する温度（インキュベーション温度ともいう。）を有する。こうした制限酵素に由来する第１のポリペプチドを用いることで、第１のポリペプチドの配列特異的結合性を確保しやすい傾向がある場合がある。また、こうした制限酵素に由来する第１のポリペプチドを用いることで、温度処理により任意のタイミングと強度で、本融合タンパク質の配列特異的結合活性を活性化、増強又は低減できる場合がある。また、こうした制限酵素を適用することで、温度により、配列特異的結合活性の調節も可能である。さらに、至適温度よりも低い温度でこうした制限酵素を用いることで、比較的緩やかに配列特異的結合活性を作用させることができる。

こうした制限酵素としては、例えば、至適温度が５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、及び７５℃（いずれも、カタログ値）が挙げられる。制限酵素の至適温度は、各種の販売会社のカタログ等に基づいて（カタログ値）等に基づいて選択することができる。至適温度は５０℃未満であると、配列特異的結合性が強くなりすぎる場合がある。至適温度が８０℃を超えると、配列特異的結合性が弱くなりすぎる場合がある。例えば、至適温度は、５５℃以上であり、また例えば、６０℃以上であり、６２℃以上であってもよく、６５℃程度であってもよい。また、例えば、至適温度は、７５℃以下であり、また例えば、７０℃以下であり、また例えば、６８℃以下である。

例えば、第１のポリペプチドが由来する制限酵素としては、以下の公知の制限酵素から適宜選択して用いることができる。

上記のうち、至適温度の観点からは、例えば、ＡｐｅＫＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＪＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＹＩ、ＦａｔＩ、ＦａｕＩ、ＭｗｏＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、ＰｓｐＧＩ、ＳｆｉＩ、ＳｍｌＩ、ＴａｑＩ、ＴｆｉＩ、ＴｌｉＩ、ＴｓｅＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＴｓｐＭＩ、ＴｓｐＲＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ等が挙げられる。

また、第１のポリペプチドが由来する制限酵素としては、５０℃未満のＤＮＡ二本鎖切断活性至適温度を有する制限酵素を用いることもできる。また例えば、４５℃未満に同至適温度を有する制限酵素を用いることもできる。

さらに、第１のポリペプチドが由来する制限酵素としては、常温域にＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度を有する酵素（常温型制限酵素）を用いることもできる。ここで、「常温域」とは、例えば、１５℃以上４２℃以下、また例えば、１５℃以上４０℃以下、さらに例えば、２５℃以上４０℃以下、また例えば、２５℃以上３７℃以下、さらに例えば、３０℃以上３７℃以下を意味するものとする。

常温型制限酵素は、２５℃以上４０℃以下程度（典型的には、２５℃又は３７℃）に至適温度を有している。また、常温型制限酵素は、概して、６０〜８０℃、１５分〜２０分のインキュベートにより不活性化されうる。１５分〜２０分のインキュベートによって酵素活性を失活する温度を失活温度というものとする。常温型制限酵素であっても、８０℃以上の失活温度を有する場合もある。

常温型制限酵素は、必要に応じて、当該制限酵素の量（発現量）、作用タイミング、作用温度、作用時間及びその他の作用条件を調節することにより、生物への作用条件（特に温度など）の悪影響を回避しつつ効率的に細胞内においてＤＮＡを切断することができる。

また、常温型制限酵素は、生物に一般的に適用される温度（生育温度）の温度域においてその配列特異的結合活性をある程度有するため、作用温度や作用時間等の条件の調節を簡略化することができる場合がある。

常温型制限酵素としては、至適温度が２５℃以上４０℃以下程度（典型的には、２５℃又は３７℃）として商業的に入手可能な制限酵素を用いることができる。例えば、こうした至適温度を備え、さらに、失活温度が６０℃以上８０℃以下として商業的に入手可能な制限酵素を用いることができる。

また、非好熱菌由来制限酵素としては、公知の非好熱菌由来制限酵素を適宜選択して用いることができる。

こうした制限酵素としては、特に限定しないが、例えば、ＡｌｕＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＭｓｅＩ、ＭｂｏＩ、ＨａｅＩＩＩ等が挙げられる。これらの至適温度はいずれも３７℃とされている。また、例えば、ＢｆａＩ、ＢｆｕＩ、Ｂｓｈ１２３６Ｉ、ＢｓｕＲＩ、ＤｐｎＩ、ＤｐｎＩＩ、ＦｓｐＢＩ、Ｈｉｎ１Ｉ、Ｈｉｎ６Ｉ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｙＣＨ４IＶ、ＭｓｐＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＲｓａＩ、Ｓａｕ３ＡＩ等が挙げられる。以上列挙した制限酵素は、いずれも、至適温度が約３７℃である。また、ＡｐａＩ、ＢａｅＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＣｖｉＡＩＩ、ＣｖｉＱＩ、ＳｍａＩ及びＳｗａＩが挙げられる。これらの制限酵素は、至適温度はいずれも約２５℃とされている。

なお、制限酵素などのＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質の当該活性の至適温度は、当該酵素の入手先のプロトコールに記載されるほか、当該酵素に好適とされているバッファ中、所定の基質の所定濃度存在下、各種温度で酵素反応評価した結果に基づくことができる。

例えば、制限酵素の至適温度の測定方法としては、文献（Greene, P.J., Poonian, M.S., Nussbaum, A.L., Tobias, L., Garfin, D.E., Boyer, H. W., & Goodman, H. M (1975), Restriction and modification of a self-complementary octanucleotide containing the Eco RI substrate. Journal of molecular biology, 99(2), 237-261）の方法が挙げられる。具体的には、制限酵素による、ＳＶ４０ＤＮＡ（³²Ｐ標識）の切断に関して定量解析する。すなわち、全量５０μｌの反応液（０．１ＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ、ＭｇＣｌ₂、０．０５ｍＭＭｇＣｌ２、０．０５ＭＮａＣｌ、１．６ｐＭ、ＳＶ４０ＤＮＡ）に５μｌ制限酵素溶液（０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．０２ＭＮａＣｌ、０．０２％ＮＰ４０, ０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．７ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．７ｐＭ制限酵素）を加え、各温度（０℃〜８０℃程度において適度な温度間隔に設定された温度）において、制限酵素処理を数分間程度適切な時間行う。１％ＳＤＳを添加して反応を停止後、アガロース電気泳動により、supercoil DNA（フォームＩ）、open circle DNA（フォームＩＩ）及び線状ＤＮＡ（フォームＩＩＩ）に分離する。各フォームの線量（ｃｐｍ）を測定し、制限酵素処理により切り出されたホスホジエステル結合数（ｐｍｏｌ）を下記計算式で求める。各温度において切り出されたホスホジエステル結合数をグラフ化して、ピーク値近傍をその酵素の至適温度（ＤＮＡ二本鎖切断活性の）とすることができる。

ホスホジエステル結合数（ｐｍｏｌ）＝
[２×（フォームIIIの線量（ｃｐｍ）＋フォームIIの線量（ｃｐｍ））／（フォームＩ、II及びIIIの合計線量（ｃｐｍ））]×ＤＮＡ量（ｐｍｏｌ）

また、例えば、制限酵素などのＤＮＡ二本鎖切断活性を有するタンパク質の失活温度は、当該酵素を、各種温度で１５分〜２０分程度維持する熱処理の前後の活性を測定することにより得ることができる。活性が検出できなくなる温度が失活温度である。

第１のポリペプチドとして制限酵素を用いる場合において、その制限酵素のDNA二本鎖切断活性に必要であるが、DNA結合活性への影響が抑制されている又は当該影響がないアミノ酸残基を改変することが好適である。例えば、アミノ酸残基の改変は、アミノ酸の置換、欠失、挿入の変異を導入することが挙げられる。改変の態様や個数は、特に限定するものではないが、配列特異的結合活性を低下させすぎないようにし、また、その他のＤＮＡ結合のために必要とされる条件に大きく影響を与えないようにすることが好適である。

多数の制限酵素について、DNA二本鎖切断活性部位やＤＮＡ結合部位について解析されている。例えば、ＴａｑＩ、ＭｕｎＩ、ＲＡＧ１、ＥｃｏＲ１２４Ｉ、ＫｐｎＩ、Ｂｓｐ６Ｉ、ＰｖｕＩＩ等について、以下の参考文献１〜８に報告がある。なお、これらの参考文献の全ての記載内容は、引用により本明細書に組み込まれるものとする。

ＴａｑＩについて
参考文献１：The Journal of Biological Chemistry, Vol. 273, No. 49, p. 33002（1998）
ＭｕｎＩについて
参考文献２：Biochemictry, 1997, 36(37), 11086
SfiIについて
参考文献３：Nucleic Acids Res. 2009 Sep;37(16):5443-53. doi: 10.1093/nar/gkp569. Epub 2009 Jul 13.
ＲＡＧ１について
参考文献４：J Mol Biol. 2009 Jul 31;390(5):863-78. doi: 10.1016/j.jmb.2009.05.076. Epub 2009 Jun 3
EcoR124Iについて
参考文献５：J.Mol Biol. 2008 Feb 15;376(2):438-52. doi: 10.1016/j.jmb.2007.11.024. Epub 2007 Nov 17.
KｐｎＩについて
参考文献６：Nucleic Acids Res. 2007;35(8):2777-86. Epub 2007 Apr 11.Ｂｓｐ６Ｉ、ＰｖｕＩＩについて
参考文献７
Nucleic Acids Res. 2005 Jan 31;33(2):661-71. Print 2005.
総説
参考文献８
Nucleic Acids Res. 2001 Sep 15;29(18):3705-27. Review.

例えば、ＴａｑＩについては、Ｄ１３７位が、ＤＮＡ二本鎖切断活性に必須であり、しかも、ＤＮＡ結合活性に影響が小さいか抑制されていることが報告されており、例えばＤ１３７Ａ、Ｄ１３７Ｖ及びＤ１３７Ｇへのアミノ酸残基置換変異が、配列特異的結合活性を維持しつつ、ＤＮＡ二本鎖切断活性を欠損させることができる（参考文献１）。

当業者であれば、こうした報告がない制限酵素においても、部位特異的変異の導入や類似の制限酵素との立体構造の比較等から、配列特異的結合活性を有しつつ、ＤＮＡ二本鎖結合活性を抑制又は欠失させることができる。なお、部位特異的変異導入によるポリペプチドの改変技術は、当業者において周知である。

（第２の領域）
本融合タンパク質の第２の領域は、エピゲノム状態を制御可能なポリペプチドを規定することができる。生物やその個体の状態は、ゲノムＤＮＡの塩基配列に基づく遺伝子及びその発現制御のほか、ゲノムＤＮＡの塩基配列によらない状態、すなわち、ゲノムＤＮＡに対する化学修飾、染色体を構成するヒストンへの化学修飾の状態（エピゲノム状態）によって特徴付けられる。第２の領域は、ＤＮＡの化学修飾又はヒストンに対する化学修飾を行うポリペプチド（以下、第２のポリペプチドともいう。）を規定している。

第２のポリペプチドは、例えば、ＤＮＡメチル化活性を有するポリペプチドである。ＤＮＡメチル化は、例えば、シトシンのピリミジン環の５位炭素原子又はアデニンのプリン環の６位窒素原子へのメチル化付加反応が挙げられる。ＤＮＡのメチル化は、哺乳類では、シトシンについては、通常、ＣｐＧサイトで生じるとされ、植物においては、シトシンについては、ＣｐＧサイトほか、ＣｐＨｐＧサイト、ＣｐＨｐＨサイトで生じるとされている。

ＤＮＡメチル化活性を有するポリペプチドは、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼが挙げられる。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼとしては、例えば、哺乳類に関し、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ２等が挙げられる。

また、植物に関しては、例えば、ＤＲＭ２（de novo型ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）、ＭＥＴ１（ＣｐＧ配列の維持型DNAメチルトランスフェラーゼ）、ＣＭＴ３（非ＣｐＧ配列の維持型ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）が挙げられる。ＤＲＭ２およびＭＥＴ１タンパク質は、ほ乳類のメチルトランスフェラーゼＤＮＭＴ３およびＤＮＭＴ１とそれぞれ高い相同性を有しているが、ＣＭＴ３タンパク質は植物に固有のタンパク質である。

また、第２のポリペプチドは、ＤＮＡ脱メチル化活性を有するポリペプチドである。かかるポリペプチドとしては、例えば、哺乳類に関し、ＴＥＴ１（ＤＮＡデメチラーゼ、）、植物に関し、ＲＯＳ１（ＤＮＡデメチラーゼ）、ＤＭＥ（ＤＮＡデメチラーゼ）等が挙げられる。

また、第２のポリペプチドは、ヒストン化学修飾活性を備えるポリペプチドである。ヒストン化学修飾活性としては、特に限定するものではないが、ヒストンアセチル化、ヒストン脱アセチル化、ヒストンメチル化、ヒストン脱メチル化、ヒストンユビキチン化及びヒストン脱ユビキチン化、ヒストンリン酸化、ヒストン脱リン酸化等からなる群から選択されるいずれかとすることができる。なかでも、ヒストンアセチル化、ヒストン脱アセチル化、ヒストンメチル化、ヒストン脱メチルか、ヒストンユビキチン化が挙げられる。

ヒストンアセチル基転移酵素（ＨＡＴ）として、ＣＢＰ／ｐ３００（ＣＲＥＢ binding protein）ファミリーのｐ３００（ヒト〜線虫）、ＣＢＰ（ヒト〜線虫）、ＧＮＡＴファミリーであるＧｃｎ５（ヒト〜酵母）、ＰＣＡＦ（ヒトｍマウス）、Ｈａｔ１（ヒト〜酵母）、Ｅｌｐ３（ヒト〜酵母）、ＡＴＦ−２（ヒト〜酵母）、ＭＹＳＴファミリーのＥｓａ１（酵母）、ＭＯＦ（症状ｂａｅ）、Ｓａｓ２（酵母）、Ｓａｓ３（酵母）、ＭＯＲＦ（ヒト）、Ｔｉｐ６０（ヒト）、Ｈｂｏ１（ヒト）、ＳＲＣファミリーのＳＲＣ１（ヒト、マウス）、ＡＣＴＲ（ヒト、マウス）等が挙げられる。

また、ヒストン脱アセチル化活性を有するポリペプチドとしては、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）であり、には５つのファミリーがあり、それぞれＣＬＡＳＳI（ＨＤＡＣ１、２、３、８）、ＣＬＡＳＳIIａ（ＨＤＡＣ４、５、７、９）、ＣＬＡＳIIｂ（ＨＤＡＣ６、１０）、ＣＬＡＳＳIII（ＳＩＲＴ１〜７）、ＣＬＡＳＳIV（ＨＤＡＣ１１）が挙げられる。

また、ヒストンメチル化活性を有するポリペプチドとしては、ヒストンメチル化酵素（ＨＭＴ）が挙げられ、Ｓｕｖ３９Ｈ１（ヒト、マウス）、Ｓｕｖ３９Ｈ２（ヒト、マウス）、Ｇ９ａ（ヒト）、Ｓｅｔ９（ヒト）、ＥＺＨ２（ヒト）、ＤＯＴＩＬ（ヒト）、ＳＥＴＤＢ（ヒト）、ＫＹＰ（シロイヌナズナ）、ＤＩＭ５（アカパンカビ）、Ｃｌｒ４（分裂酵母）、Ｓｅｔ１（出芽酵母）等が挙げられる。

また、ヒストン脱メチル化活性を有するポリペプチドとしては、ＬＳＤ１（ヒト）、ＫＤＭ６Ａ／ＵＴＸ（ヒト）、ＫＤＭ６Ｂ／ＪＭＪＤ３（日と）、ＫＤＭ２／７ＪＭＪＣサブファミリー（ヒト）、ＪＭＪＣドメイン含有ヒストンデメチラーゼ（ヒト）等が挙げられる。

また、ヒストンユビキチン化活性を有するポリペプチドとしては、例えば、Ｒａｄ６（酵母）、ＵＳＰ／ＵＢＰ（シロイヌナズナ）、ＵＢＰ２６、ＯＴＬＤ１等が挙げられる。

こうした各種のエピゲノム状態を制御可能なポリペプチドのアミノ酸配列及び当該アミノ酸配列をコードする塩基配列は、当業者であれば、ＮＣＢＩ等において適宜探索することにより、取得することができる。

本融合タンパク質は、特に限定しない態様で、第１及び第２の領域をその一部に備えることができる。例えば、第１の領域を、本融合タンパク質のＮ末端側、Ｃ末端側、又はそれ以外に備えていてもよい。また、第２の領域を、本融合タンパク質のＮ末端側、Ｃ末端側又はそれ以外に備えていてもよい。

本融合タンパク質は、適宜、他のポリペプチドを備えることができる。例えば、核内移行シグナル（例えば、-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-）を備えることもできる。

本融合タンパク質は、例えば、研究用途等として、標識ポリペプチドや公知の標識物質と結合可能なポリペプチドを備えていてもよい。かかる標識等を備えることで、本融合タンパク質がゲノムＤＮＡに配列特異的結合する状態等を把握観察したり、あるいは、当該標識を用いて、ゲノムＤＮＡを分離することができる。

本融合タンパク質は、必要に応じて、その分離や回収などのために、Ｈｉｓタグなどのアフィニティー結合のためのポリペプチドや抗体又はその一部や抗原を備えることもできる。

本融合タンパク質は、第１の領域と第２の領域とを備える人工タンパク質として取得することができる。例えば、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、化学的にあるいは遺伝子工学に本融合タンパク質を取得することができる。当業者であれば、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドのアミノ酸配列及び塩基配列を取得したら、適切な方法で本融合タンパク質を取得できる。なお、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの連結には、公知のペプチドリンカーを適宜用いることができる。

本融合タンパク質によれば、配列特異的にゲノムＤＮＡに対して複数個所結合する第１のポリペプチドを有するために、１種類の第１のポリペプチドにより、ゲノムＤＮＡの複数個所において一挙にエピゲノム状態を変化させることができる。

第１のポリペプチドとして制限酵素を用いる場合には、その高い配列特異的結合精度に基づき、高い再現性でエピゲノム状態を変化させることができる。また例えば、制限酵素を利用する場合には、極めて多数のゲノムＤＮＡの部位においてエピゲノム状態を変化させることができるため、遺伝子発現の制御を大幅に及び／又は速やかに変化（増大、減少等）させることができる。

また、制限酵素を用いる場合、既に多数の認識配列の制限酵素が知られている。こうした制限酵素の配列特異的結合性とその精度を利用することで、多様なエピゲノム状態を多様に変化させることも可能である。

（ポリヌクレオチド）
本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、本融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、本ポリヌクレオチドともいう。）である。本ポリヌクレオチドは、それ自体、エピゲノム状態の制御剤として有用である。本ポリヌクレオチドは、一本鎖DNA、二本鎖ＤＮＡのほか、一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ等が挙げられる。結果として、本ポリペプチドのアミノ酸配列を情報としてコードできるものであればよい。本ポリヌクレオチドは、例えば、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの形態や一本鎖又は二本鎖ＲＮＡの形態が挙げられる。

本ポリヌクレオチドは、本融合タンパク質のアミノ酸配列をコードするコード領域ほか、本融合タンパク質をタンパク質（ポリペプチド）として発現させるための制御領域を備える、発現ベクターなどのコンストラクトの形態をとることができる。

（ベクター）
本明細書によれば、本ポリヌクレオチドを備える発現ベクター（以下、本発現ベクターともいう。）が提供される。本発現ベクターは、本ポリヌクレオチドによってコードされる情報（本融合タンパク質のアミノ酸配列）を発現させることを意図するものである。本発現ベクターは、本ポリヌクレオチドを備えるとともに、本ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現させるための１又は２以上の制御領域を備えることができる。制御領域としては、プロモーターのほか、ターミネーター、選抜マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。

プロモーターは、対象とする真核生物内で本融合タンパク質を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、植物体については、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、各種アクチン遺伝子プロモーター、各種ユビキチン遺伝子プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニット遺伝子プロモーター、ナピン遺伝子プロモーター等を挙げることができる。

後述するように、例えば、シロイヌナズナのシグマ因子由来のＳＩＧ２（ＡｔＳＩＧ２）プロモーターなどの発現強度が３５Ｓプロモーターよりも低いプロモーターは、本ポリペプチドを低レベルで定常的に発現させるための低発現型構成的プロモーターとして好ましい場合がある。また、シロイヌナズナのHSP18.2プロモーターなど、後述する誘導的プロモーターも、誘導温度よりも低い温度で制御下にある遺伝子に発現を誘導することができる場合があり、低発現型構成的プロモーターとして、本融合タンパク質の発現に有用である場合がある。

プロモーターとしては、誘導的プロモーターを用いることもできる。誘導的プロモーターは、本融合タンパク質を真核生物内において所定の発現誘導を経て誘導的に作用させることができる。こうすることで、意図したタイミングで、本融合タンパク質の作用を発現させることができる。こうした誘導的プロモーターとしては、例えば、ガラクトース、銅イオンなどの化学物質又はその濃度、光、熱、浸透圧などの外部条件によって誘導される誘導性プロモーターが挙げられる。こうした各種の誘導的プロモーターは、対象とする真核生物の種類に応じて適宜選択される。例えば、例えば、銅イオン応答性プロモーターなどのメタロチオネインプロモーター、ガラクトース誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ＤＥＸ誘導性プロモーター、HSP18.2プロモーター等のヒートショックタンパク質プロモーター等の公知の誘導性プロモーター又は公知の転写因子等を用いた誘導システムから適宜選択される。

部位特異的プロモーター及び時期特異的プロモーター等を用いることもできる。本ポリペプチドの発現を部位特異的又は時期特異的に誘導することで、意図的なタイミングや目的とする部位で本融合タンパク質を発現させてその活性を発揮させることができる。また、誘導を停止したり、あるいは一定期間経過することでおおよそその作用を低下又は停止することができる。こうした部位特異的プロモーターや時期特異的プロモーターは、植物体の特定の組織や時期、動物における特定の組織が時期において特定遺伝子を発現するプロモーター等が挙げられる。例えば、植物においては、種子特異的プロモーター、花卉特異的プロモーター、篩部組織特異的プロモーター等が挙げられる。また、動物においては、生殖細胞特異的プロモーター、時期、臓器などの種々の特異的プロモーター等が挙げられる。

また、プロモーターやターミネーター等の制御要素による本融合タンパク質の発現強度の制御も、本融合タンパク質の結合活性や制御活性に影響する。したがって、用いるプロモーターやターミネーターによって供される本融合タンパク質の発現強度も考慮してプロモーター等が選択される。

ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。この中でもＮｏｓターミネーターをより好ましく用いることができる。

その他、選抜マーカー及び翻訳効率を高めるための塩基配列としては、公知の要素を適宜選択して用いることができる。発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに対して、必要とする要素を適宜導入すればよい。さらに、発現ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。

例えば、植物体の細胞内において、タンパク質を発現させるための発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の植物体のための種々のベクターを用いることができる。例えば、ウイルスベクターとしては、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、プラムボックスウイルス（ＰＰＶ）、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）、アルファルファモザイクウイルス（ＡＩＭＶ）、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）、カウピーモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）、ズッキーニイエローモザイクウイルス（ＺＹＭＶ）など植物ウイルスベクターが挙げられる。また、ベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、上記した植物ウイルスベクターのほか、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。また、公知の一過性遺伝子発現系のベクターも用いることができる。

本融合タンパク質を植物体、哺乳類及び魚類などの動物や酵母などの真核微生物内で発現させることを意図するベクターは、当業者であれば、従来公知の手法により適宜生物の種類や形質転換手法に応じて構築することができる。導入する生物に応じたベクターを適宜入手可能であるほか、適切なプロモーター、ターミネーター、エンハンサーなども適宜選択可能であり、必要に応じて所望の発現カセットを構築することができる。

本発現ベクターの作製にあたっては、当業者は、適用する生物の種類や本融合タンパク質の発現等に関して意図する条件に応じて、各種の組換え操作に、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた方法等、標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照のこと。）を利用することができる。

本ポリヌクレオチド及び本発現ベクターは、本融合タンパク質をコードするものであることから、本融合タンパク質と同様、ゲノムＤＮＡのエピゲノム状態の制御剤として有用である。本融合タンパク質や本発現ベクターは、生物や細胞の種類に応じて、エレクトポレーション法、ウイルス感染法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム感染法、ペプチド法、塩化カルシウム法、マイクロインジェクション法、リポソーム法、ポリエチレングリコール法、細胞融合法など公知の遺伝子導入方法を用いて真核生物などの生物に導入され、本融合タンパク質を合成させることで、本融合タンパク質が有するポリペプチドの有する機能を発揮させることができる。

（細胞）
本明細書によれば、本ポリヌクレオチド又は本ベクターを含む細胞（以下、本細胞ともいう。）も提供される。かかる細胞によれば、ゲノムＤＮＡのエピゲノム状態を制御することができるため、その細胞において、効率的に遺伝子の発現制御が可能であり、形質を速やかに変化させることができる。なお、特に限定するものではないが、本融合タンパク質の発現が細胞分裂後も維持されるように、本ポリヌクレオチド又は本ベクターが染色体内あるいは染色体外に維持されるように構成されていることが好ましい。

細胞としては、特に限定するものではないが、既述の生物の細胞が挙げられる。また、細胞の種類も特に限定するものではないが、体細胞、生殖細胞、受精卵、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞等が挙げられる。また、細胞は、既に説明した真核生物などの細胞のほか、真核生物の個体又はその一部が挙げられる。例えば、動物としては、個体のほか、器官、組織等が挙げられる。植物としては、個体のほか、カルス、幼苗、葉、花蕾、茎頂、側芽、花芽、花粉、子房、胚乳及び胚、種子などの繁殖材料などが挙げられる。

本細胞によれば、ゲノムＤＮＡのエピゲノム状態が制御されているため、有用形質など希望する形質を発揮することもできる。こうした細胞又はその細胞を含む組織体（個体含む。）から有用形質に基づいてスクリーニングすることで、効率的に形質が改変された真核生物などを得ることができる。

当業者であれば、本融合タンパク質、本ポリペプチド、本ベクターを取得できることから、当業者に周知である細胞の種類に応じて形質転換技術を用いて本細胞を取得することができる。

（キット）
本明細書によれば、本融合タンパク質、本ポリヌクレオチド、本ベクター及び本細胞のいずれかを備える、キットも提供される。本キットによれば、効率的に遺伝子の発現制御が可能であり、細胞等の形質を速やかに変化させることができる。

（エピゲノム状態の制御方法）
本明細書によれば、本融合タンパク質をゲノムＤＮＡに対して作用可能に準備する工程と、本融合タンパク質を利用してエピゲノム状態を変化させる工程と、を備える、エピゲノム状態の制御方法（以下、本制御方法ともいう。）が提供される。本制御方法によれば、本融合タンパク質をゲノムＤＮＡに対する足場及びゲノムＤＮＡの修飾要素として利用して、ゲノムＤＮＡのエピゲノム状態を直接的にかつ効率的に制御することができる。

（準備工程）
準備工程では、本融合タンパク質をゲノムＤＮＡに対して作用可能に準備する。本融合タンパク質については、既に説明した第１の領域、第２の領域及び本融合タンパク質各種態様を適用できる。また、本融合タンパク質をゲノムＤＮＡに対して作用可能に準備するとは、例えば、本融合タンパク質をコードする本ポリヌクレオチドを含む本ベクターを、エピゲノム状態を制御しようとする生物に合致した方法で準備することをいう。典型的には、生物の種類等に応じたベクターを作製することが挙げられる。本ポリヌクレオチド及び本ベクターについては、既に説明した各種態様を採ることができる。

（エピゲノム状態を変化させる工程）
エピゲノム状態の変化工程では、本融合タンパク質の第１の領域の配列特異的結合性を利用して、本融合タンパク質を配列特異的に認識されるゲノムＤＮＡ上の部位に供給し、第２の領域をゲノムＤＮＡに対して作用させてエピゲノム状態を変化させる。本融合タンパク質を細胞内で発現させることで、本融合タンパク質は、ゲノムＤＮＡに対してその配列特異性に基づいて結合し、そして、その部位又はその近傍においてゲノムＤＮＡのエピ状態を変化させる。

本融合タンパク質の第１の領域による配列特異的結合能を発揮させるためには、特に限定するものではないが、必要に応じて、細胞の培養温度や生物の生育環境の温度を設定することができる。すなわち、第１の領域が制限酵素由来の場合において、その配列特異的結合能が、制限酵素に規定されるＤＮＡ二本鎖切断活性の至適温度に影響される場合があるからである。

本制御方法によって得られた、エピゲノム状態が変化された細胞や生物について、その変化の程度は、公知のエピゲノム状態の解析手法や実施例に開示される表現型の観察等を用いて適宜評価することができる。

本制御方法は、エピゲノム状態が下人工的に制御された真核生物等の生産方法としても実施できる。また、その場合には、前記変化工程によって得られた細胞又は真核生物若しくはその一部から、個体としての植物体を再生したり、動物を取得することができる。かかる方法については、従来公知の方法を適用することができる。

本制御方法によれば、本融合タンパク質の第２の領域の作用により、ＤＮＡのメチル化／脱メチル化、ヒストンのアセチル化／脱アセチル化、ヒストンのメチル化／脱メチル化、ヒストンのユビキチン化／脱ユビキチン化等が生じる。これらの化学修飾は、ゲノムＤＮＡを切断することなく、また、改変することなく、遺伝子の発現等を調節する。かかる変化は、速やかな遺伝子の転写レベルの制御（増大又は減少）などの発現制御が可能であるため、形質変化も速やかに確認することができる。また、本融合タンパク質の配列特異性に基づき、ゲノムＤＮＡ上の複数個所に結合可能であるため、生物の形質（表現形質）を変化させやすい。

また、本制御方法によれば、本融合タンパク質の配列特異性に基づき、エピゲノム状態の複数個所を同時的に修飾して変化させることができる。したがって、１種類の本融合タンパク質の作用であっても、一挙に生物の形質を変化させたり、大きく変化させたりすることができる。複数個所を同時的に改変するため、生物の量的形質の改変に有利である。

また、本融合タンパク質の第１のポリペプチドとして、制限酵素由来のポリペプチドを用いる場合には、その認識配列の高い特異性により、ゲノムＤＮＡに対する精度の高い配列特異的結合を実現できるため、確度の高い遺伝子発現制御が可能となる。

また、既に、存在している多数の制限酵素の配列特異的結合能を利用することで、多様にゲノムＤＮＡのエピゲノム状態をマルチに修飾し変化させ、遺伝子の発現制御が可能である。

本制御方法は、生物のゲノムＤＮＡの複数個所において高い配列特異性でエピゲノム状態を制御して、生物の形質を変化させることができる。こうして得られた生物やその一部を用いて、公知の方法でエピゲノム状態の解析、すなわち、ＤＮＡやヒストンの修飾状態を解析することで、得られた形質に関連する遺伝子を探索することもできる。

（その他）
本融合タンパク質における第１のポリペプチドである、制限酵素の配列特異的結合性を有しつつ、ＤＮＡ二本鎖切断活性を有しないポリペプチドは、他の標識ポリペプチドや標識物質と結合するポリペプチドを連結する融合タンパク質として用いることで、ゲノムＤＮＡの配列特異的に標識することができる。制限酵素の高い精度の配列特異性を利用することで、高い精度でゲノムＤＮＡの複数個所を確実に標識することができる。

かかる融合タンパク質は、公知の標識ポリペプチドや標識結合性のポリペプチドを公知の方法で融合することにより得ることができる。

以下、本明細書の開示を具現化した実施例について説明する。なお、以下の実施例は、本開示を説明するものであってその範囲を限定するものではない。

＜植物nTaqＩ（ＤＮＡ二本鎖切断活性欠損TaqＩ）発現ベクターの作製＞
pGEM-Tベクター（プロメガ社）に連結されたTaqI配列（特開2011-160798号公報参照。）を鋳型とし、文献（Cao, W., and Barany, F. (1998) Identification of TaqI endonuclease active site residues by Fe2+-mediated oxidative cleavage. J.Biol. Chem. 273, 33002-33010）に開示される目的の塩基置換（TaqＩのＤＮＡ二本鎖切断活性を不活性化させる塩基置換として、Ｄ１３７Ａ）が導入される相補的なプライマーセット（配列番号１及び２）を用いて、PrimeStar（タカラバイオ社）によりPCR反応を行いベクター全配列を増幅した。

nTaqI-1_F：gccacctgggagttggCcgcccaggggatagat（配列番号1）
nTaqI-1_R：atctatcccctgggcgGccaactcccaggtggc（配列番号2）

得られたPCR産物についてDpnI（NEB社）処理により残存する鋳型ベクターを37℃で一晩消化し、エタノール沈殿により精製した。精製DNＡ試料をECOS Competent E. coli DH5α（ニッポンジーン社）へ形質転換を行い、LB+100μｇ/mlカルベシニリン含有固体培地に塗布し、37℃一晩生育後、形質転換体を得た。これらの形質転換大腸菌コロニーを複数ピックアップして液体培養後、プラスミド抽出機によりプラスミドを抽出した。

得られたプラスミドからM13RプライマーおよびM13Fプライマー（配列番号３及び４）を用いてシーケンス反応（BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitを使用、Applied Biosystems社）を行いエタノール沈殿により精製した後、3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社）を用いてシーケンス配列を解析し、目的位置に塩基置換が導入されたことを確認した。

M13F：cgccagggttttcccagtcacgac（配列番号３）
M13R：tcacacaggaaacagctatgac（配列番号４）

さらに、植物細胞内で発現できるようにpBI121ベクター（プロモーターとしてカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを備える。）にnTaqI配列を導入した。

＜プロトプラストへのnTaqI導入によるゲノム切断や相同組換え効果の解析＞
実施例１で作製したベクターを用いてシロイヌナズナの形質転換体を作製した。方法は、アグロバクテリウム法を用いた。なお、アグロバクテリウム法は、特開2011-160798で使用されている、Cloughらによる湿潤法（Steven J. Clough and Andrew F. Bent, 1998, The Plant Journal 16, 735-743）であり、Ｔ１種子まで得た。

＜形質転換体におけるＢＲＣＡ１の相対的発現量の確認＞
制限酵素によるDNA二本鎖切断（double strand break; DSB）効果を確認するため、上記で得られたシロイヌナズナＴ１種子を発芽させた後１週間の植物体を３７℃で２４時間それぞれ熱処理した植物体からRNAを抽出し、DNA切断修復の重要因子であるBRCA1（Kim, S. A., Punshon, T., Lanzirotti, A., Li, L., Alonso, J. M., Ecker, J. R., Kaplan, J., and Guerinot, M. L. (2006). Localization of iron in Arabidopsis seed requires the vacuolar membrane transporter VIT1. Science, 314(5803), 1295-1298）の遺伝子発現を解析した。RNA抽出にはRNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）を用いてメーカーの指示するプロトコル通りに行った。逆転写キットにより抽出RNAから cDNAを合成したのち、Power SYBR Green PCR master mix（ライフテクノロジー）により、リアルタイムPCR解析を行った。逆転写反応およびリアルタイムPCR解析においてもメーカーが指示する手順に従って行った。内部標準として18rRNA（検出プライマー；配列番号５及び６）を測定し、DSB修復遺伝子BRCA1 （検出プライマー；配列番号７及び８）についても遺伝子発現量を相対的発現量として解析した。結果を図１に示す。

18SrRNA-F：CGGCTACCACATCCAAGGAA（配列番号５）
18SrRNA-R：TGTCACTACCTCCCCGTGTCA（配列番号６）
BRCA1-F：CCATGTATTTTGCAATGCGTG（配列番号７）
BRAC1-R：TGTGGAGCACCTCGAATCTCT（配列番号８）

図１には、BRCA1の発現量は相対値（サンプル中のBRCA1発現量/サンプル中の18SrRNA発現量）として示す。nTaqIの過剰発現及び熱処理（３７℃で２４時間）によっては、BRCA1の発現がベクターコントロールと大きく変わらなかった。一方、ｎTaqＩに替えてTaqＩを保持する点以外は同一であるTaqI発現株においてはBRCA1の発現量が大きく上昇した。nTaqI発現植物においては、DSBに伴うDNA修復系が活性化されていないことが示唆された。

＜シロイヌナズナｎＴａｑＩ導入株におけるＤＮＡ組換え頻度の確認＞
次に、上記で得られたシロイヌナズナＴ１種子を滅菌、春化処理後1%ショ糖を含むMS寒天培地に播種した。播種後22℃長日条件下で2週間生育した全植物体を用いてGUS染色を行った。なお、発芽後１週間で、３７℃で３時間又は２４時間の熱処理を行った。GUS染色は既述のKimらの方法に従った。まず90% アセトンを1.5 mlマイクロチューブに分注し4℃にあらかじめ冷やしておいた。植物体を90% アセトンに浸し、サンプリングが終了するまで氷上で静置した。すべてのサンプリングが終了後、室温で20分静置した。この間に２，３回チューブを反転させ、アセトン溶液とサンプルを穏やかに攪拌した。その後、50 mM リン酸緩衝液（pH 7.0）で3回リンスし、その後、X-Gluc溶液(1.9 mM X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-glucuronide-cyclohexylammonium salt), 0.5 mM K₃Fe(CN)₆, 0.5 mM K₄[Fe(CN)₆]・3H₂O, 0.3% Triton X-100, 50 mM Phosphate buffer, pH 7.0) に置換した。

次に0.075MPaの圧力でサンプルを減圧し (10秒、2回)、X-Gluc Solution をサンプル内に浸潤させた後、37℃で一晩静置した。染色された組織は青色を呈する。染色が確認されたら、70% EtOHで置換し、染色反応を停止するとともに、クロロフィルなどの脱色を行った。十分な脱色を行った後、染色された植物体の観察を行った。結果を図２に示す。

図２に示すように、nTaqIの過剰発現及び熱処理（３７℃で３時間又は２４時間）によっては、GUSスポット数がベクターコントロールと大きく変わらなかった。一方、TaqI発現株においてはGUSスポット数が大幅に増えた。nTaqI発現植物においては、DSBに伴うDNA組換えが活性化されていないことが示唆された。

＜nTaqIとエピゲノム状態制御因子の融合タンパク質によるエピゲノム状態変化の原理検証＞
nTaqIとエピゲノム状態制御因子（Epigenetic Regulator：ER）の融合タンパク質（Epigenetic Inducer：EI）により、生体内でエピゲノム状態変化による遺伝子発現変動を誘発できるかを調べるために、出芽酵母を用いたGFPレポーターアッセイを行った。概要を図３に示す。具体的には、TaqI認識配列（TCGA）を8か所持つ人工配列とCYC1遺伝子の上流240bpをベースにした人工プロモーター（TCGA×8）（配列番号９）、GFP遺伝子、CYC1遺伝子の下流270bpのTCGA配列のTをAに置換することでTCGA配列を2か所削除した人工ターミネーター（配列番号１０）を持つレポーター遺伝子を作製した。また、比較としてTaqI認識配列を持たない人工プロモーター（TCGA×0）（配列番号１１）を使用したレポーター遺伝子を作製した。作製したレポーター遺伝子を出芽酵母BY4742株のゲノムに挿入し、評価用酵母（BY4742+GFP）を作製した。

人工プロモーター（TCGA×8）（配列番号９）
CGACATCGTCGAATATGATTACTCACCAATCGATTTACCGGTTCCTTTGTCGATATCATGTTGGGACGCTCGAAGGCTTTATTTAGTTGTCGACTGATACTTGACTTCATCGAGACTTTCAGACCACGATCGATGGTCACTAATCCTCGAGCAGATCCGCCAGGCGTGTATATATAGCGTGGATGGCCAGGCAACTTTAGTGCTGACACATACAGGCATATATATATGTGTGCGACGACACATGATCATATGGCATGCATGTGCTCTGTATGTATATAAAACTCTTGTTTTCTTCTTTTCTCTAAATATTCTTTCCTTATACATTAGGACCTTTGCAGCATAAATTACTATACTTCTATAGACACACAAACACAAATACACACACTAAAT

人工ターミネーター（配列番号１０）
ACAGGCCCCTTTTCCTTTGACGATATCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCTCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTTAATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAAACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCACGAAGGCTTTAA

人工プロモーター（TCGA×0）（配列番号１１）
GCAGATCCGCCAGGCGTGTATATATAGCGTGGATGGCCAGGCAACTTTAGTGCTGACACATACAGGCATATATATATGTGTGCGACGACACATGATCATATGGCATGCATGTGCTCTGTATGTATATAAAACTCTTGTTTTCTTCTTTTCTCTAAATATTCTTTCCTTATACATTAGGACCTTTGCAGCATAAATTACTATACTTCTATAGACACACAAACACAAATACACACACTAAAT

nTaqIと融合するERとしては、出芽酵母由来のヒストンアセチル化酵素：HAT（SWC4、RTT109）、クロマチンリモデリング複合体因子：CR（CHD1、TTI1）を用いた。

ガラクトース誘導型プロモーターの下流に、nTaqIと各種ERを融合した各EI、Saccharomyces cerevisiae由来DIT1タンパク質の3’UTRをターミネーターとして配置した酵母用発現誘導ベクターを作製した。本ベクターを評価用酵母（BY4742+GFP）に、Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit（ザイモリサーチ）を用いて形質転換し、形質転換体を得た。各形質転換体をYPD培地（10 g/L Yeast extract、20 g/L Peptone、20 g/L Glucose）＋1.0 mg/L オーレオバシジンA（AbA）を用いて、30℃で終夜培養後、YPG（10 g/L Yeast extract、20 g/L Peptone、20 g/L Galactose）＋1.0 mg/L AbA培地に培地交換し、25℃で18時間誘導培養することで、各EIの発現誘導を行った。

誘導前後の培養液をPI（propidium iodide）染色し、SONY製フローサイトメーター（SH800）で酵母1×10⁵細胞のPI、GFP蛍光強度を測定した。PI蛍光無しの集団（生細胞）中のGFP蛍光強度の平均値を算出し、発現誘導前後、TCGA配列の有無におけるGFP蛍光強度を比較した。結果を図４に示す。

図４に示すように、nTaqIのみの発現誘導ではGFP蛍光強度の変化は見られなかったのに対して、HAT（SWC4、RTT109）とCR（CHD1、TTI1）では、発現誘導有り（＋Ｇａｌ）でかつTCGA配列有り（ＴＣＧＡ×８）の時のみ、GFP蛍光強度が上昇した。この結果から、nTaqIにより、TaqI認識配列付近にリクルートされたHAT、CRにより、ゲノム構造が緩みGFPの発現量が向上したことが予測され、EIによりエピゲノム状態変化を誘発出来る事が分かった。

＜植物体への導入による成長への影響の確認＞
表２に示すように、植物nTaqI発現ベクターに対して、nTaqI配列の3’端にエピゲノム状態修飾因子を連結したプラスミドを作成し、実施例２で実施した方法に準じてシロイヌナズナに導入した。表２に示す修飾因子は、主にDNAメチル化・脱メチル化、ヒストンアセチル化・脱アセチル化・メチル化・脱メチル化の酵素である。なお、由来は、ヒトやシロイヌナズナ、酵母など真核生物から広く選択可能であると考えられる。これらの発現ベクターをシロイヌナズナに導入して植物体を得てその葉の形態変化等を観察した。

DNA脱メチル化酵素のTET1やヒストン脱メチル化酵素LSD1、ヒストン脱アセチル化酵素HDA6、DNAメチル化酵素MET1とnTaqIを融合した人工遺伝子が植物内で発現すると、葉の形態変化（Growth）や花成の遅れ（late flowering）などが認められた。nTaqIと種々のエピゲノム制御因子の融合タンパク質が植物体内において発現するだけで、遺伝子発現を始め量的形質の変化にも寄与することが示唆された。

＜植物体への融合タンパク質導入による塩ストレス耐性への影響＞
次に、nTaqI-p300（ヒト由来ヒストンアセチル化酵素）を恒常的に発現させた植物体を用いて、塩ストレスに対する応答性を解析した。通常生育条件（MS培地）においては良好な生育を見せた。これはnTaqIもしくはp300をそれぞれ単独で恒常的に発現させた時も同様であった。したがって、どちらか単独の発現では、植物の生育に大きな影響を及ぼさないことが確認できた。

通常生育条件（Ms培地）にて播種後1週間生育させた形質転換後の実生を200 mMの塩化ナトリウムを含むMS培地に移植し、その後の生育を観察することでストレス応答性を解析した。結果を、図５及び図６に示す。

図５及び図６に示すように、nTaqI-p300を恒常的に発現する植物体においては、コントロールと比較して良好な生育を示した。nTaqI-p300の発現がストレス耐性の付与に貢献できることが示唆された。

＜植物体への融合タンパク質導入による熱ストレス耐性への影響＞
実施例５と用いたのと同じ植物系統を用いて熱ストレスに対する応答性も評価した。MS培地にて播種後2週間生育させ、その後一過的に45℃、1時間の熱処理を施したのち22℃の生育条件で1週間生育させた。結果を、図７に示す。

図７に示すように、nTaqI-p300を恒常的に発現する植物体においては、コントロールと比較して良好な生育を示した。nTaqI-p300の発現が塩以外にも熱ストレス耐性の付与に貢献できることが示唆された。

＜植物体への融合タンパク質導入による熱ストレス応答性遺伝子発現への影響＞
熱ストレス条件における熱応答性遺伝子群の発現挙動を確認するため、熱処理時の植物体からRNAを抽出し、熱応答性遺伝子の代表的な因子であるAt3g09640, At5g05410, At5g12020 （Proceedings of the National Academy of Sciences, 103(49), 18822-18827）の遺伝子発現を解析した。RNA抽出にはRNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）を用いてメーカーの指示するプロトコル通りに行った。逆転写キットにより抽出RNAから cDNAを合成したのち、Power SYBR Green PCR master mix（ライフテクノロジー）により、リアルタイムPCR解析を行った。逆転写反応およびリアルタイムPCR解析においてもメーカーが指示する手順に従って行った。内部標準として18rRNA（検出プライマー；配列番号３，４）を測定し、熱応答性遺伝子（検出プライマー；配列番号１２〜１７）についても遺伝子発現量を解析した。BRCA1の発現量は相対値（サンプル中のBRCA1発現量/サンプル中の18SrRNA発現量）として定量した後、無処理時に対する熱処理時の変化量を相対的に示した。結果を図８に示す。

At3g09640 -F： tttcatcctggtagactggaca （配列番号１２）
At3g09640 -R： cacatctcttagatgatccacacc （配列番号１３）
At5g05410 -F： gattttcaaatttcgtcccc （配列番号１４）
At5g05410 -R： ctccactctgatcataaactgc （配列番号１５）
At5g12020 -F： acccttcacgagtttacatgc （配列番号１６）
At5g12020 -R： gcgttagggtgctcgatg （配列番号１７）

図８に示すように、nTaqI-p300の過剰発現および熱処理によって、熱応答性遺伝子の発現がベクターコントロールと大きく上昇していた。さらに、コントロールと比較しての発現上昇度は、各遺伝子のプロモーター領域（500bp）におけるTaqIサイト数に依存していた。nTaqI-p300発現植物においては、TaqIサイトを介して遺伝子発現が広範に調節されていることが示唆された。

なお、本明細書に記載される公報及び論文は、引用によりその全文が本明細書に取り込まれるものとする。

配列番号１〜８、１２〜１７：プライマー
配列番号９〜１１：人工プロモーター

Claims

ゲノムＤＮＡに対して配列特異的に複数個所に結合可能なポリペプチドを規定する第１の領域と、エピゲノム状態を制御可能なポリペプチドを規定する第２の領域と、を備える、融合タンパク質。
前記第１の領域が規定する前記ポリペプチドは、制限酵素に由来しＤＮＡ二本鎖切断活性を欠失している、請求項１に記載の融合タンパク質。
前記制限酵素は、多頻度制限酵素である、請求項２に記載の融合タンパク質。
前記第１の領域が規定する前記ポリペプチドは、４塩基配列認識の制限酵素に由来しＤＮＡ二本鎖切断活性を欠失している、請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質。
前記第１の領域が規定する前記ポリペプチドは、ゲノムＤＮＡ中の回文配列を認識して結合する活性を備える、請求項１〜４のいずれかに記載の融合タンパク質。
多頻度制限酵素に由来しゲノムＤＮＡ中の回文配列を認識して結合する活性を備え、ＤＮＡ二本鎖切断活性を欠失しているポリペプチドを規定する第１の領域と、エピゲノム状態を制御可能なポリペプチドを規定する第２の領域と、を備える、融合タンパク質。
前記第２の領域が規定する前記ポリペプチドは、ＤＮＡメチル化活性、ＤＮＡ脱メチル化活性及び／又はヒストン化学修飾活性を備える、請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質。
前記ヒストン化学修飾活性は、ヒストンアセチル化、ヒストン脱アセチル化、ヒストンメチル化、ヒストン脱メチル化、ヒストンユビキチン化及びヒストン脱ユビキチン化からなる群から選択される、請求項７に記載の融合タンパク質。
ゲノムＤＮＡに対して配列特異的に複数個所に結合可能なポリペプチドを規定する第１の領域と、エピゲノム状態を制御可能なポリペプチドを規定する第２の領域と、を備える、融合タンパク質をゲノムＤＮＡに対して作用可能に準備する工程と、
前記第１の領域の配列特異的結合性を利用して、前記融合タンパク質を前記配列特異的に認識される前記ゲノムＤＮＡ上の部位に供給し、前記第２の領域を前記ゲノムＤＮＡに対して作用させてエピゲノム状態を変化させる工程と、
を備える、方法。
ゲノムＤＮＡ上の複数個所のエピゲノム状態を同時的に変化させる、請求項９に記載の方法。
前記融合タンパク質を誘導的に作用させる、請求項９又は１０に記載の方法。
生物の形質を変化させる、請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
生物の量的形質を改変する、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
前記生物は、植物である、請求項９〜１３のいずれかに記載の方法。
前記生物は、酵母である、請求項９〜１３のいずれかに記載の方法。
前記ゲノムＤＮＡは、ヒト由来の動物細胞内のゲノムＤＮＡである、請求項９〜１３のいずれかに記載の方法。
ヒト以外の生物の育種方法である、請求項９〜１５のいずれかに記載の方法。
請求項１〜８のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
請求項１８に記載のポリヌクレオチド又は請求項１９に記載のベクターを含む細胞。
請求項１〜８のいずれかに記載の融合タンパク質、請求項１８に記載のポリヌクレオチド、請求項１９に記載のベクター又は請求項２０に記載の細胞を備える、キット。