JP2021058209A - ポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）ベースのガイドＲＮＡ発現のための方法および組成物 - Google Patents

ポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）ベースのガイドＲＮＡ発現のための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】細胞のゲノム中のヌクレオチドを編集し、かつ／または標的部位を変更する組成物および方法を提供する。【解決手段】単一ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合したＰｏｌ−ＩＩプロモーターを含む組み換えＤＮＡコンストラクトを使用し、前記ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成することができ、前記複合体は、細胞、例えば真核生物細胞のゲノム中の標的部位配列に結合することができ、かつこれを切断することができる方法および組成物である。さらに、非従来型酵母のゲノムを改変する方法および組成物を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１２月１８日出願の米国仮特許出願第６２／２６９１２２号明細
書の利益を主張する。この出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本開示は、分子生物学の分野に、特に、ガイドＲＮＡｓｅを作製する方法、および細胞
のゲノムを変更する方法に関する。
配列表の正式な写しは、２０１５年１２月１７日作成の２０１５１２１７＿ＣＬ６５６
３ＵＳＰＳＰ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔのファイル名を備え、２３２キ
ロバイトのサイズを有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介し
て電子的に提出され、本明細書と同時に提出されている。このＡＳＣＩＩフォーマットの
文書内に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組
み込まれる。
組み換えＤＮＡ技術により、標的のゲノム位置にＤＮＡ配列を挿入し、かつ／または特
定の内因性染色体配列を改変（編集）することが可能になり、それにより、生命体の表現
型を変えることが可能になった。部位特異的組み換えシステムを使用する部位特異的組み
込み技術は、他の組み換え技術と同様、様々な生命体における目的遺伝子の標的挿入の生
成に使用されてきた。デザイナージンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化
様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングメガヌクレアーゼ、操作された
ヌクレオチドなどのゲノム編集技術は、標的ゲノムパータベーションの生成に利用可能で
あるが、これらのシステムは、特異性が低く、各標的部位用に再設計することが必要であ
り、そのために作製に多額の費用と時間を要する設計ヌクレアーゼを使用する傾向がある
。ＣＲＩＳＰＲ−関連（Ｃａｓ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼシステムが、部位特異
的ＤＮＡ鎖切断を特定の標的部位に導入する手段として開発された。このヌクレアーゼベ
ースのシステムは、標的ヌクレオチド中に一本鎖切断または二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じ
させることができ、これにより、標的遺伝子座での相同組み換えの頻度が増大し得る。
遺伝子発現の阻害は、例えば、遺伝子のＤＮＡ配列を分断または欠失させて、遺伝子の
「ノックアウト」を生じさせることによって、達成され得る。遺伝子ノックアウトは、殆
どの場合、細菌から哺乳動物まで広範囲にわたる生物全体に適用可能な技術である相同組
み換え（ＨＲ）により実行されてきた。遺伝子機能を研究するための別のツールとして、
遺伝的「ノックイン」によるものがあり得、これもまた、通常、ＨＲによって実行される
。遺伝子ターゲティング（ノックアウトまたはノックイン）のためのＨＲは、標的部位と
相同性を有する、外来から供給されるＤＮＡの存在を用いてよい。ＨＲによる遺伝子ター
ゲティングは強力なツールであるが、複雑な、労力を要する手順となり得る。ＨＲを用い
た殆どの研究は一般に、経路中の複数遺伝子ではなく単一遺伝子のノックアウトに限定さ
れてきた。なぜなら、ＨＲは一般に、対費用効果を高くしてスケールアップするのが困難
なためである。この困難は、ＨＲが効率的でない生物において深刻化する。そのような低
い効率により、実務者は典型的に、所望のＨＲ事象が起こった細胞を同定するのを補助す
るための選択可能な表現型または外因性マーカーに頼ることを強いられる。
ゆえに、生物のゲノム内の複数の位置を標的とするのに手頃で、準備が容易で、スケー
ラブルで、かつ適用可能である、新しくてより効率的なゲノム操作技術が必要とされてい
る。
細胞のゲノム中のヌクレオチドを編集し、かつ／または標的部位を変更する組成物およ
び方法が提供される。当該方法および当該組成物は、単一ガイドＲＮＡをコードするポリ
ヌクレオチドに作動可能に結合したＰｏｌ−ＩＩプロモーターを含む組み換えＤＮＡコン
ストラクトを使用し、前記ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複
合体を形成することができ、前記複合体は、細胞、例えば微生物細胞のゲノム中の標的部
位配列に結合することができ、かつこれを切断することができる。本開示はさらに、前記
組み換えＤＮＡコンストラクトを使用して、非従来型酵母のゲノムを改変する方法および
組成物を記載する。
本開示の一実施形態において、本開示は、単一ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオ
チドに作動可能に結合したＰｏｌ−ＩＩプロモーターを含む組み換えＤＮＡコンストラク
トを含み、前記組み換えＤＮＡコンストラクトは、リボザイムをコードするヌクレオチド
配列を含まず、前記ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を
形成することができ、前記複合体は、非従来型酵母のゲノム中の標的部位配列に結合する
ことができ、かつこれを切断することができる。
また、提供されるのは、本明細書中に記載される組み換えＤＮＡコンストラクトのいず
れか１つを含む非従来型酵母である。非従来型酵母は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）
属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属
、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属
、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、
ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、チゴ
サッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇ
ｏｎｏｐｓｉｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドトルラ（
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属、スポロボロミセス（Ｓ
ｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、およびパキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属からな
る群から選択される属のメンバーであってよい。
本明細書に記載の方法によって作製された核酸コンストラクト、微生物細胞もまた提供
する。本開示の方法および組成物のさらなる実施形態を本明細書中に示す。
図面の簡単な説明および配列表
下記の詳細な説明、および本出願の一部を形成する添付図面および配列表から、本開示
をより完全に理解することができる。配列の記載および本明細書に添付した配列表は、３
７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２５に規定されている特許出願におけるヌクレオ
チド配列およびアミノ酸配列の開示に適用される規則に適合している。配列の記載は、３
７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２５（これは参照により本明細書に組み込まれる
）で定義されるアミノ酸の３文字コードを含む。
図１Ａは、ガイドＲＮＡ発現カセットを示す。図１Ａは、ターミネーター有り、そして無しのガイドＲＮＡ発現カセットをコードするＤＮＡに作動可能に結合したＰｏｌ−ＩＩプロモーターを示す。 図１Ｂは、ガイドＲＮＡ発現カセットを示す。図１Ｂは、Ｃｓｙ４認識ドメインをコードするＤＮＡに作動可能に結合したＰｏｌ−ＩＩプロモーター、ガイドＲＮＡ発現カセットをコードするＤＮＡ、およびＣｓｙ４認識ドメインをコードするＤＮＡを示す。 図２は、様々なｇＲＮＡ発現プラスミド形質転換体由来のｃａｎ１突然変異頻度を示す。ｃａｎ１突然変異頻度は、カナバニンプレート（ＣａｎＲ）上のコロニーの数とＣＭ−ｕｒａプレート上の形質転換体の総数とを比較することによって算出した。ＴＤＨ１：：２８ｎｔ−ｇＣＡＮ１−２８ｎｔ（ｐＹＲＨ３７６）、ＴＤＨ１：：ｇＣＡＮ１（ｐＹＲＨ３７８）、ＴＤＨ１：：ｇＣＡＮ１：：ターミネーター（ｐＹＲＨ３７９）、およびＦＢＡ１：：２８ｎｔ−ｇＣＡＮ１−２８ｎｔ（ｐＹＲＨ３８０）。 図３Ａは、４つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）ｇＲＮＡ発現カセットを示す図の１つである。白色のボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを示し、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（斜線のストライプ）は、５’非翻訳領域（垂直のストライプ）の末端に融合し得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの３’末端は、プロセシング要素（ドット）（例えば、ＨＤＶリボザイム）に直接融合し得る。 図３Ｂは、４つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）ｇＲＮＡ発現カセットを示す図の１つである。白色のボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを示し、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（斜線のストライプ）は、５’非翻訳領域（垂直のストライプ）の末端に融合し得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの３’末端は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写ターミネーター（黒色）に直接融合し得る。 図３Ｃは、４つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）ｇＲＮＡ発現カセットを示す図の１つである。白色のボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを示し、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（斜線のストライプ）は、プロモーターの５’末端（転写開始部位）に融合し得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの３’末端は、プロセシング要素（ドット）（例えば、ＨＤＶリボザイム）に直接融合し得る。 図３Ｄは、４つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）ｇＲＮＡ発現カセットを示す図の１つである。白色のボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを示し、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（斜線のストライプ）は、プロモーターの５’末端（転写開始部位）に融合し得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの３’末端は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写ターミネーター（黒色）に直接融合し得る。 異なるＤＮＡコンストラクトによるヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）一次形質転換体のパッチを含有するＬ−カナバニン含有アガープレートの画像を示す。コロニー増殖は、ＣＡＮ１遺伝子の機能の消失を示す。
Figure 2021058209
Figure 2021058209
Figure 2021058209
細胞のゲノム中のヌクレオチドを編集し、かつ／または標的部位を変更する組成物およ
び方法が提供される。当該方法および当該組成物は、単一ガイドＲＮＡをコードするポリ
ヌクレオチドに作動可能に結合したＰｏｌ−ＩＩプロモーターを含む組み換えＤＮＡコン
ストラクトを使用し、前記組み換えＤＮＡコンストラクトは、リボザイムをコードするヌ
クレオチド配列を含まず、前記ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアー
ゼ複合体を形成することができ、前記複合体は、細胞、例えば微生物細胞のゲノム中の標
的部位配列に結合することができ、かつこれを切断することができる。
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化等間隔短鎖回文リピート）遺伝子座は、例えば、外来ＤＮ
Ａを破壊するのに細菌細胞および古細菌細胞によって用いられる、クラスＩ、ＩＩ、また
はＩＩＩ ＤＮＡ切断システムの特定の遺伝的遺伝子座コーディング因子を指す（Ｈｏｒ
ｖａｔｈ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，２０１０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：１６７−
１７０）。ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素が、細胞におけるＤＮＡターゲティングに、
本明細書中で非相同的に利用される。
細菌由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮ
Ａ）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）を使用して、その
ＤＮＡ標的にＣａｓエンドヌクレアーゼをガイドする。ｃｒＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡ標的
の一方の鎖に相補的な領域と、ｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ
）と塩基対形成して、ＤＮＡ標的を切断するようにＣａｓエンドヌクレアーゼを導くＲＮ
Ａ二本鎖を形成する領域とを含有する。ＣＲＩＳＰＲシステムは様々なクラスに属し、リ
ピートパターン、遺伝子のセット、および種の範囲が異なる。所定のＣＲＩＳＰＲ遺伝子
座のＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子の数は、種間で変化し得る（Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．（２０
０５）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏ
ｌ １（６）：ｅ６０．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．００１０
０６０）。
本明細書中の用語「Ｃａｓ遺伝子」は、一般に、隣接するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に結合
し、関連し、またはこの近くにある遺伝子を指す。用語「Ｃａｓ遺伝子」、「ＣＲＩＳＰ
Ｒ関連（Ｃａｓ）遺伝子」は、本明細書中で互換的に用いられる。本明細書中の用語「Ｃ
ａｓエンドヌクレアーゼ」は、Ｃａｓ遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。本
明細書中のＣａｓエンドヌクレアーゼは、適切なポリヌクレオチド構成要素と複合体を形
成すると、特定のＤＮＡ標的配列の全てまたは一部を認識し、それに結合し、かつ場合に
よりニッキングまたは切断をすることができる。本明細書中に記載のＣａｓエンドヌクレ
アーゼは、１つ以上のヌクレアーゼドメインを含む。本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼ
としては、ＨＮＨもしくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインおよび／またはＲｕｖＣもしく
はＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを有するものが挙げられる。開示されるＣａｓエンド
ヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質
、Ｃ２ｃ２タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、Ｃａｓ３、Ｃａｓ５、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８
、Ｃａｓ１０、またはこれらの複合体が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアー
ゼ複合体」、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム」、「ガイ
ドポリヌクレオチド／Ｃａｓ複合体」、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓシステム」、
「誘導型Ｃａｓシステム」は、本明細書中で互換的に使用され、複合体を形成することが
できる、少なくとも１つのガイドポリヌクレオチド、および少なくとも１つのＣａｓエン
ドヌクレアーゼを指し、前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体
は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に誘導することができ、Ｃａｓエンドヌ
クレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、それに結合し、かつ任意選択によりそれをニッキ
ングまたは切断（一本鎖または二本鎖切断の導入）するのを可能にする。本明細書におけ
るガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、４つの既知のＣＲＩＳ
ＰＲシステム（Ｈｏｒｖａｔｈ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，２０１０，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ３２７：１６７−１７０）、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシ
ステムのいずれかのＣａｓタンパク質および好適なポリヌクレオチド構成要素を含んでよ
い。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ＣＡＳタンパク質と複合化したポリヌクレオチド（例
えば、限定はされないが、ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡ）により標的配列を認識して、
標的配列でＤＮＡ二本鎖をほどき、場合により、少なくとも１本のＤＮＡ鎖を切断する。
正確なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が、ＤＮＡ標的配列の３’末端に位置す
るか、またはＤＮＡ標的配列の３’末端に隣接するなら、そのようなＣａｓエンドヌクレ
アーゼによる標的配列の認識および切断は、通常、起こる。これ以外にも、Ｃａｓタンパ
ク質は、本明細書中で、適切なＲＮＡ構成要素と複合化する場合、ＤＮＡ切断活性または
ニッキング活性を欠くかもしれないが、ＤＮＡ標的配列に依然として特異的に結合するこ
とができる。（２０１５年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１５／００８２４７
８Ａ１号明細書、および２０１５年２月２６日公開の米国特許出願公開第２０１５／００
５９０１０Ａ１号明細書（両文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）もま
た参照されたい）。
ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＤＮＡ標的配列の一方
または双方の鎖を切断することができる。ＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断することがで
きるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、通常、エンドヌクレ
アーゼドメインの全てを機能的な状態で有するＣａｓタンパク質（例えば、各エンドヌク
レアーゼドメインの一部または全ての活性を保持する野生型エンドヌクレアーゼドメイン
またはその変異体）を含む。したがって、Ｃａｓタンパク質の各エンドヌクレアーゼドメ
インの一部または全ての活性を保持する野生型Ｃａｓタンパク質（例えば、本明細書中に
開示されるＣａｓ９タンパク質）またはその変異体が、ＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断
することができるＣａｓエンドヌクレアーゼの適切な例である。機能的なＲｕｖＣおよび
ＨＮＨヌクレアーゼドメインを含むＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ標的配列の双方の鎖を
切断することができるＣａｓタンパク質の例である。ＤＮＡ標的配列の一方の鎖を切断す
ることができるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、本明細書
において、ニッカーゼ活性（例えば、部分的切断能力）を有すると特徴付けられ得る。Ｃ
ａｓニッカーゼは、通常、ＣａｓがＤＮＡ標的配列の一方の鎖のみを切断する（すなわち
、ニックを入れる）ことを可能にする１つの機能的エンドヌクレアーゼドメインを含む。
例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼは、（ｉ）変異した、機能不全ＲｕｖＣドメイン、および（
ｉｉ）機能的ＨＮＨドメイン（例えば、野生型ＨＮＨドメイン）を含み得る。他の例とし
て、Ｃａｓ９ニッカーゼは、（ｉ）機能的ＲｕｖＣドメイン（例えば野生型ＲｕｖＣドメ
イン）、および（ｉｉ）突然変異した、機能不全ＨＮＨドメインを含んでよい。本明細書
での使用に好適なＣａｓ９ニッカーゼの非限定的例は、および米国特許出願公開第２０１
４／０１８９８９６号明細書（これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる）に開
示されている。
ＤＮＡターゲティングの特異性を高めるのに、一対のＣａｓ９ニッカーゼを用いること
ができる。一般に、これは、２つのＣａｓ９ニッカーゼを提供することによってなされ得
、これらが、異なるガイド配列を有するＲＮＡ構成要素との関連により、所望のターゲテ
ィング領域における反対側の鎖の近接するＤＮＡ配列を標的とし、そこにニックを入れる
。そのような各ＤＮＡ鎖の近くの切断は、二本鎖切断（すなわち、単鎖オーバーハングを
有するＤＳＢ）を引き起こし、これは、その後、非相同性末端結合ＮＨＥＪ（変異につな
がる不完全な修復になりやすい）、または相同組み換えＨＲの基質として認識される。こ
れらの実施形態における各ニックは、例えば、互いと少なくとも約５、１０、１５、２０
、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００（または５〜１００の任
意の整数）塩基、離れていてよい。本明細書においては、１つまたは２つのＣａｓ９ニッ
カーゼタンパク質が、Ｃａｓ９ニッカーゼ対に用いられてよい。例えば、変異したＲｕｖ
Ｃドメインを有するが、機能するＨＮＨドメインのないＣａｓ９ニッカーゼ（すなわち、
Ｃａｓ９ ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ−）が使用されるであろう（例えば、ストレプトコッカス
・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ−）。各Ｃａｓ９
ニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９ ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ−）は、各ニッカーゼをそれぞれの
特定のＤＮＡ部位に標的として向けるガイドＲＮＡ配列を有する本明細書中の適切なＲＮ
Ａ構成要素を用いることによって、互いに近い（最大で１００塩基対離れている）特定の
ＤＮＡ部位に導かれることになる。
Ｃａｓタンパク質は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、Ｃａｓタンパク質
に加えて１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のドメイン）を含む融合タンパク質の一部で
あってよい。そのような融合タンパク質は、任意のさらなるタンパク質配列を、そして、
任意選択により、任意の２つのドメイン間、例えばＣａｓと第１の異種ドメインとの間に
リンカー配列を含み得る。本明細書において、Ｃａｓタンパク質に融合し得るタンパク質
ドメインの例としては、限定されないが、エピトープタグ（例えば、ヒスチジン［Ｈｉｓ
］、Ｖ５、ＦＬＡＧ、インフルエンザヘマグルチニン［ＨＡ］、ｍｙｃ、ＶＳＶ−Ｇ、チ
オレドキシン［Ｔｒｘ］）、リポータ（例えば、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ
［ＧＳＴ］、ホースラディッシュペルオキシダーゼ［ＨＲＰ］、クロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ［ＣＡＴ］、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニ
ダーゼ［ＧＵＳ］、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］、ＨｃＲｅｄ、Ｄｓ
Ｒｅｄ、シアン色蛍光タンパク質［ＣＦＰ］、黄色蛍光タンパク質［ＹＦＰ］、青色蛍光
タンパク質［ＢＦＰ］）、および以下の活性の１つ以上を有するドメインが挙げられる：
メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性（例えば、ＶＰ１６またはＶＰ６４
）、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、および核酸
結合活性。Ｃａｓタンパク質はまた、ＤＮＡ分子または他の分子、例えばマルトース結合
タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、ＧＡＬ
４Ａ ＤＮＡ結合ドメイン、および単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）ＶＰ１６と結合する
タンパク質と融合し得る。
本明細書中のＣａｓタンパク質は以下の属のいずれか由来であり得る：アエロピルム（
Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、ピロバクルム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルホロブス（Ｓｕ
ｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アーキオグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロアーキュ
ラ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｎ）、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルシナ（Ｍｅｔｈａｎ
ｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノパイラス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、ピロコッカス（Ｐ
ｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィラス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、テルモプラズマ（
Ｔｈｅｒｎｉｏｐｌａｓｎｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクウィフェクス（Ａｑｕｉｆｒｘ）、ポルフィロモナス（Ｐ
ｏｒｐｈｖｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、サーマス（Ｔｈ
ｅｒｍｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタ
フィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイ
コプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
）、アゾアルカス（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ニトロソモナス（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａ
ｓ）、デスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ゲオバクター（Ｇｅｏｂａｃ
ｔｅｒ）ミロコッカス（Ｍｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、キャンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏ
ｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔ
ｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、キサントモナス（Ｘａｎ
ｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎ
ｃｉｓｅｌｌａ）またはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）。Ｃａｓタンパク質のより
多くの例について、２０１５年５月１５日出願の米国特許出願第６２／１６２３７７号明
細書および２０１５年５月１５日出願の米国特許出願第６２／１６２３５３号明細書（双
方の出願とも参照によって本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体
はＤＮＡ標的部位配列に結合することができるが、標的部位配列ではいかなる鎖も切断し
ない。そのような複合体は、全ヌクレアーゼドメインが、変異した、機能不全のＣａｓタ
ンパク質を含んでよい。例えば、ＤＮＡ標的部位配列に結合することができるが、標的部
位配列でいかなる鎖も切断しない本明細書におけるＣａｓ９タンパク質は、変異した、機
能不全ＲｕｖＣドメイン、および変異した、機能不全ＨＮＨドメインの双方を含んでよい
。標的ＤＮＡ配列に結合するがこれを切断しない本明細書中のＣａｓタンパク質は、遺伝
子発現を調整するために用いることができ、例えば、その場合、Ｃａｓタンパク質は、転
写因子（または、その一部）（例えば、リプレッサーまたは活性化因子、例えば本明細書
中に開示されるもののいずれか）と融合し得る。
本明細書中のＣａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、ＩＩ型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ
、例えば、限定はされないが、２００７年３月１日に公開され、参照により本明細書に組
み込まれる国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレットの配列番号４６２、４７４
、４８９、４９４、４９９、５０５および５１８に記載のＣａｓ９遺伝子をコードし得る
。他の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、微生物または最適化Ｃａｓ９
エンドヌクレアーゼ遺伝子である。Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、任意選択により
、Ｃａｓコドン領域のＳＶ４０核標的シグナル上流、およびＣａｓコドン領域の二分Ｖｉ
ｒＤ２核定位シグナル（Ｔｉｎｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７４４２−６）下流に作動可能に結合することがで
きる。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子として、原則として標的とされ得るＮ（１２−３０）
ＮＧＧ形態のあらゆるゲノム配列を認識することができる植物コドンまたは微生物コドン
最適化化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９遺伝子
、またはブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏ
ｓｐｏｒｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔ
ｅｒｉ）Ｍｌｃ３、ラクトバチルス・ロシアエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｓ
ｉａｅ）ＤＳＭ １５８１４、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＳＬ４、ラクトバチルス・ノデンシス（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｎｏｄｅｎｓｉｓ）ＪＣＭ １４９３２、スルフロスピリラム（Ｓｕｌｆ
ｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属種ＳＣＡＤＣ、ビフィドバクテリウム・サーモフィルム（
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）ＤＳＭ ２０２１０、ロ
クタネラ・ベストフォルデンシス（Ｌｏｋｔａｎｅｌｌａ ｖｅｓｔｆｏｌｄｅｎｓｉｓ
）、スフィンゴモナス・サンキサニゲネンス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓａｎｘａｎ
ｉｇｅｎｅｎｓ）ＮＸ０２、エピリソニモナス・テナックス（Ｅｐｉｌｉｔｈｏｎｉｍｏ
ｎａｓ ｔｅｎａｘ）ＤＳＭ １６８１１、スポロサイトファガ・ミクソコッコイデス（
Ｓｐｏｒｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｍｙｘｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）、およびサイクロフレク
サス・トークイス（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓ）ＡＴＣＣ ７００７
５５からなる群から選択される生物に由来するＣａｓ９エンドヌクレアーゼが挙げられ、
前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的配列の全てまたは一部を認識し、これに
結合し、かつ場合によってはこれにニックを入れ、またはこれを切断することができるガ
イドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成することができる。他のＣａｓエン
ドヌクレアーゼシステムは、２０１５年５月１５日出願の米国特許出願第６２／１６２３
７７号明細書および２０１５年５月１５日出願の米国特許出願第６２／１６２３５３号明
細書に記載されており、双方の出願とも参照によって本明細書に組み込まれる。
「Ｃａｓ９」（以前はＣａｓ５、Ｃｓｎ１、またはＣｓｘ１２と呼ばれた）は、本明細
書中で、ｃｒヌクレオチドおよびｔｒａｃｒヌクレオチドと、または単一のガイドポリヌ
クレオチドと複合体を形成して、ＤＮＡ標的配列の全てまたは一部を特異的に認識して切
断する、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＣａｓエンドヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９タン
パク質は、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン、およびＨＮＨ（Ｈ−Ｎ−Ｈ）ヌクレアーゼド
メインを含み、これらはそれぞれ、標的配列で一本鎖ＤＮＡを切断することができる（両
ドメインが協調して作用すると、ＤＮＡ二本鎖が切断されるが、一方のドメインの活性で
はニックに至る）。一般に、ＲｕｖＣドメインは、サブドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ
を含み、ドメインＩは、Ｃａｓ９のＮ末端近くに位置し、サブドメインＩＩおよびＩＩＩ
は、タンパク質の中央に位置し、ＨＮＨドメインにフランキングしている（Ｈｓｕ ｅｔ
ａｌ，Ｃｅｌｌ １５７：１２６２−１２７８）。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムとして
は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを少なくとも１つのポリヌクレオチド構成要素と複合さ
せて使用するＤＮＡ切断システムが挙げられる。例えば、Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ Ｒ
ＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と
複合させることができる。他の例では、Ｃａｓ９は、単一ガイドＲＮＡと複合させること
ができる。
本明細書中に記載のＣａｓ９タンパク質、および本明細書中の他のいくつかのＣａｓタ
ンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
）属種（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプ
トコッカス・ニューモニアエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・サー
モフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓ．ｐａｒａｓ
ａｎｇｕｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）、ストレプト
コッカス・サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・マカカエ
（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌ
ａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、スト
レプトコッカス・コンステラトゥス（Ｓ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ）、ストレプトコッ
カス・シュードポルシナス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス
・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属種（例えば
、リステリア・イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ））、スピロプラズマ（Ｓｐｉｒｏｐｌ
ａｓｍａ）属種（例えば、スピロプラズマ・アピス（Ｓ．ａｐｉｓ）、スピロプラズマ・
シルフィディコーラ（Ｓ．ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ））、ペプトストレプトコッカス（
Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）科種、アトポビウム（Ａｔｏｐｏｂｉｕ
ｍ）属種、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属種（例えば、ポルフィロ
モナス・カトニアエ（Ｐ．ｃａｔｏｎｉａｅ））、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）
属種（例えば、プレボテラ・インテルメディア（Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ベイロネ
ラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属種、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属種（例えば
、トレポネーマ・ソクランスキィ（Ｔ．ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ）、トレポネーマ・デンテ
ィコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ））、カプノシトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇ
ａ）属種、フィネゴルディア（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ）属種（例えば、フィネゴルディア
・マグナ（Ｆ．ｍａｇｎａ））、コリオバクテリア（Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ
ｅ）科種（例えば、Ｃ．バクテリウム（Ｃ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ））、オルセネラ（Ｏｌ
ｓｅｎｅｌｌａ）属種（例えば、オルセネラ・プロフューザ（Ｏ．ｐｒｏｆｕｓａ））、
ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属種（例えば、ヘモフィルス・スプトルム（Ｈ
．ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘモフィルス・ピットマニエ（Ｈ．ｐｉｔｔｍａｎｉａｅ））、
パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属種（例えば、パスツレラ・ベッティアエ（Ｐ．
ｂｅｔｔｙａｅ））、オリビバクター（Ｏｌｉｖｉｂａｃｔｅｒ）属種（例えば、オリビ
バクター・シティエンシス（Ｏ．ｓｉｔｉｅｎｓｉｓ））、エピリソニモナス（Ｅｐｉｌ
ｉｔｈｏｎｉｍｏｎａｓ）属種（例えば、エピリソニモナス・テナックス（Ｅ．ｔｅｎａ
ｘ））、メソニア（Ｍｅｓｏｎｉａ）属種（例えば、メソニア・モビリス（Ｍ．ｍｏｂｉ
ｌｉｓ））、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、バチルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ）属種（例えば、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ））、アクイマリーナ
（Ａｑｕｉｍａｒｉｎａ）属種（例えば、アクイマリーナ・ムエレリ（Ａ．ｍｕｅｌｌｅ
ｒｉ））、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種（例えば、
クリセオバクテリウム・パルストレ（Ｃ．ｐａｌｕｓｔｒｅ））、バクテロイデス（Ｂａ
ｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属種（例えば、バクテロイデス・グラミニソルベンス（Ｂ．ｇｒａ
ｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属種（例えば、ナイセ
リア・メニンジティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、フランシセラ（Ｆｒａ
ｎｃｉｓｅｌｌａ）属種（例えば、フランシセラ・ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））
、またはフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種（例えば、フラボバ
クテリウム・フリギダリウム（Ｆ．ｆｒｉｇｉｄａｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム・ソ
リ（Ｆ．ｓｏｌｉ））に由来のものであってよい。他の例として、Ｃａｓ９タンパク質は
、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：７２６−７３７
および２０１５年５月１５日出願の米国特許出願第６２／１６２３７７号明細書（これら
の文献は参照により本明細書に組み込まれる））に開示されるＣａｓ９タンパク質のいず
れかであり得る。
したがって、本明細書中のＣａｓ９タンパク質の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアク
セッション番号Ｇ３ＥＣＲ１（ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ））、ＷＰ＿０２６７０９４２２、ＷＰ＿０２７２０２６５５、ＷＰ＿０２
７３１８１７９、ＷＰ＿０２７３４７５０４、ＷＰ＿０２７３７６８１５、ＷＰ＿０２７
４１４３０２、ＷＰ＿０２７８２１５８８、ＷＰ＿０２７８８６３１４、ＷＰ＿０２７９
６３５８３、ＷＰ＿０２８１２３８４８、ＷＰ＿０２８２９８９３５、Ｑ０３ＪＩ６（ス
トレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、ＥＧＰ６６７
２３、ＥＧＳ３８９６９、ＥＧＶ０５０９２、ＥＨＩ６５５７８（ストレプトコッカス・
シュードポルシナス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ））、ＥＩＣ７５６１４（スト
レプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＩＤ２２０２７（ストレプトコッ
カス・コンステラトゥス（Ｓ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ））、ＥＩＪ６９７１１、ＥＪ
Ｐ２２３３１（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＪＰ２６００
４（ストレプトコッカス・アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ））、ＥＪＰ３０３２
１、ＥＰＺ４４００１（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、
ＥＰＺ４６０２８（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＱ
Ｌ７８０４３（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＱＬ７
８５４８（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＲＬ１０５
１１、ＥＲＬ１２３４５、ＥＲＬ１９０８８（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐ
ｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＡ５７８０７（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏ
ｇｅｎｅｓ））、ＥＳＡ５９２５４（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅ
ｎｅｓ））、ＥＳＵ８５３０３（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅ
ｓ））、ＥＴＳ９６８０４、ＵＣ７５５２２、ＥＧＲ８７３１６（ストレプトコッカス・
ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ））、ＥＧＳ３３７３２、ＥＧＶ０
１４６８（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＨＪ５２０６３（
ストレプトコッカス・マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ））、ＥＩＤ２６２０７（ストレプ
トコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＩＤ３３３６４、ＥＩＧ２７０１３（
ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓ．ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ））、ＥＪＦ
３７４７６、ＥＪＯ１９１６６（ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属
種ＢＳ３５ｂ）、ＥＪＵ１６０４９、ＥＪＵ３２４８１、ＹＰ＿００６２９８２４９、Ｅ
ＲＦ６１３０４、ＥＲＫ０４５４６、ＥＴＪ９５５６８（ストレプトコッカス・アガラク
ティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、ＴＳ８９８７５、ＥＴＳ９０９６７（ストレプ
トコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＳＲ４）、ＥＴＳ９２４３９、ＥＵＢ２
７８４４（ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＢＳ２１）、ＡＦＪ
０８６１６、ＥＵＣ８２７３５（ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属
種ＣＭ６）、ＥＷＣ９２０８８、ＥＷＣ９４３９０、ＥＪＰ２５６９１、ＹＰ＿００８０
２７０３８、ＹＰ＿００８８６８５７３、ＡＧＭ２６５２７、ＡＨＫ２２３９１、ＡＨＢ
３６２７３、Ｑ９２７Ｐ４、Ｇ３ＥＣＲ１、またはＱ９９ＺＷ２（ストレプトコッカス・
ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））（これらの文献は参照により組み込まれる）に開
示されるＣａｓ９アミノ酸配列のいずれかを含み得る。これらのＣａｓ９タンパク質配列
のいずれの変異体が用いられてもよいが、本明細書中のＲＮＡ構成要素と関連する場合に
、ＤＮＡに向けた特異的な結合活性を、そして場合によってはエンドヌクレアーゼ活性を
有さなければならない。そのような変異体は、基準Ｃａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも
約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％
、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または
９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。
あるいは、Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、前述のアミノ酸配列のいずれかと少なくと
も約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９
％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、また
は９９％同一であるアミノ酸配列を含んでよい。そのようなＣａｓ９タンパク質変異体は
、本明細書中のＲＮＡ構成要素と関連する場合に、ＤＮＡに向けた特異的な結合活性を、
そして場合によっては、切断またはニッキング活性を有さなければならない。
本明細書中のＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９は、異種の核局在化配列（ＮＬＳ）を
含み得る。本明細書中の異種ＮＬＳアミノ酸配列は、例えば、本明細書中の酵母細胞の核
内で検出可能な量のＣａｓタンパク質の蓄積を駆動するのに十分な強度を有し得る。ＮＬ
Ｓは、塩基性の、正に帯電する残基（例えば、リシンおよび／またはアルギニン）の１つ
（一分節）または複数（例えば、二分節）の短い配列（例えば、２〜２０残基）を含んで
よく、また、タンパク質表面に曝されるのであれば、Ｃａｓアミノ酸配列のどこに位置し
てもよい。ＮＬＳは、例えば、本明細書中のＣａｓタンパク質のＮ末端またはＣ末端に作
動可能に結合してもよい。例えば、２つ以上のＮＬＳ配列が、Ｃａｓタンパク質に、例え
ばＣａｓタンパク質のＮ末端およびＣ末端の両方に結合してもよい。本明細書中の適切な
ＮＬＳ配列の非限定的な例としては、米国特許第７，３０９，５７６号明細書に開示され
るものが挙げられる（これらの文献はいずれも参照によって本明細書に組み込まれる）。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドの改変された形態を含み得る。Ｃ
ａｓ９ポリペプチドの改変形態としては、Ｃａｓ９タンパク質の自然発生のヌクレアーゼ
活性を低下させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入または置換）を挙げることができる
。例えば、いくつかの例では、Ｃａｓ９タンパク質の改変形態が有するヌクレアーゼ活性
は、対応する野生型Ｃａｓ９ポリペプチドの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０
％未満、１０％未満、５％未満または１％未満である（２０１４年３月６日公開の米国特
許出願公開第２０１４／００６８７９７Ａ１号明細書）。いくつかの例では、Ｃａｓ９ポ
リペプチドの改変形態はヌクレアーゼ活性を実質的に有さず、触媒的に「不活化されたＣ
ａｓ９」または「失活したｃａｓ９（ｄＣａｓ９）」と呼ばれる。触媒的に不活化された
Ｃａｓ９変異体としては、ＨＮＨおよびＲｕｖＣヌクレアーゼドメインに変異を有するＣ
ａｓ９変異体が挙げられる。これらの触媒的に不活化されたＣａｓ９変異体は、ｓｇＲＮ
Ａと相互作用し、インビボで標的部位に結合することができるが、標的ＤＮＡの鎖はいず
れも切断することができない。
触媒的に不活性なＣａｓ９は、異種配列に融合することができる（２０１４年３月６日
公開の米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７Ａ１号明細書）。好適な融合パート
ナーとしては、限定はされないが、標的ＤＮＡ、または標的ＤＮＡに関連するポリペプチ
ド（例えば、ヒストンまたは他のＤＮＡ結合性タンパク質）に直接作用することによって
、転写を間接的に増加させる活性を示すポリペプチドが挙げられる。さらなる好適な融合
パートナーとしては、限定はされないが、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ
活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホフファ
ターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニ
ル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミ
リストイル化活性または脱ミリストイル化活性を提供するポリペプチドが挙げられる。さ
らに他の好適な融合パートナーとしては、限定はされないが、標的核酸の転写増加を直接
引き起こすポリペプチド（例えば、転写活性化因子またはその断片、転写活性化因子、小
分子／薬剤反応性転写調節因子などを誘導するタンパク質またはその断片）が挙げられる
。触媒的に不活性なＣａｓ９はまた、二本鎖切断を生成するＦｏｋＩヌクレアーゼに融合
することができる（Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、ｖｏｌｕｍｅ ３２、ｎｕｍｂｅｒ６、Ｊｕｎｅ ２０１４）。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼの「機能的断片」、「機能的に等価である断片」および「機
能的に等価な断片」という用語は、本明細書中で互換的に使用され、標的部位を認識し、
結合し、そして場合によりニッキングまたは切断を行う（一本鎖切断または二本鎖切断を
入れる）能力が保持されている本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼ配列の一部分またはサ
ブ配列を指す。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼの「機能的変異体」、「機能的に等価である変異体」および
「機能的に等価な変異体」という用語は、本明細書中で互換的に使用され、標的部位を認
識し、結合し、そして場合によりニッキングまたは切断を行う（一本鎖切断または二本鎖
切断を入れる）能力が保持されている本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼの変異体を指す
。断片および変異体は、部位特異的変異誘発法および合成構築法（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）により得ることができる。
ガイドされるあらゆるエンドヌクレアーゼが、本明細書中で開示される方法に用いられ
得る。そのようなエンドヌクレアーゼとして、以下に限定されないが、Ｃａｓ９エンドヌ
クレアーゼおよびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが挙げられる。現在まで、特定のＰＡＭ配
列を認識することができ（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ３３７ ｐ ８１６−８２１、２０１５年５月１５日出願の米国特許出願第６２／１
６２３７７号明細書および２０１５年５月１５日出願の米国特許出願第６２／１６２３５
３号明細書、ならびにＺｅｔｓｃｈｅ Ｂ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｃｅｌｌ １６３，
１０１３参照）、そして特定の位置にて標的ＤＮＡを切断することができる多くのエンド
ヌクレアーゼが記載されてきた。ガイドされるＣａｓシステムを利用する、本明細書中に
記載される方法および実施形態に基づいて、現在、これらの方法を、ガイドされるあらゆ
るエンドヌクレアーゼシステムを利用することができるように調整することができること
が理解される。
用語「オフターゲット部位効果」および「オフターゲット効果」は、互換的に用いられ
、そして、エンドヌクレアーゼ切断の活性に起因する、オフターゲット部位のあらゆる変
更を含み、当該変更として、例えば：（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉ
ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの
挿入、または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のあらゆる組み合わせ、および意図されない部
位での鋳型ＤＮＡまたはドナーＤＮＡのあらゆる統合が挙げられる。意図されない部位は
、標的部位でない、生物のゲノム中のあらゆる部位であってよい。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼの特異性を向上させ、かつオフターゲット部位効果を低下さ
せるいくつかのアプローチが探究されており、細胞中で活性がある酵素の量の引下げ、標
的と相補的なガイドＲＮＡの部分の短縮、操作されたニッキングＣａｓ９の対の配置（ｄ
ｅｐｌｏｙｉｎｇ）（Ｎｉｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａ
ｐｙ．２０１５，２６（７）：４２５−４３１）、および構造ガイドタンパク質工学（ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｇｕｉｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）（Ｓｌａ
ｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ＤＯＩ：１０
．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５２２７）を含む。これらのアプローチの多くは限
界があるままであり、これが多くの場合、オンターゲット編集効率を低下させている。
米国特許出願ｃｌ６５０１（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるのは
、残存しながら細胞中のオフターゲット部位効果を低下させ、かつ／またはＮＨＥＪイン
ヒビターもしくはＨＤＲエンハンサー等の小分子を用いてオンターゲット編集効率を増大
させる方法である。
エンドヌクレアーゼは、当該技術において知られているあらゆる方法、例えば、以下に
限定されないが、一過性導入法、形質移入、マイクロインジェクション、および／もしく
は局所的アプリケーションによって、または組み換えコンストラクトを介して間接的に、
細胞に提供されてよい。エンドヌクレアーゼは、タンパク質として、またはガイドされる
ポリヌクレオチド複合体として、細胞に直接的に、または組み換えコンストラクトを介し
て間接的に提供されてよい。エンドヌクレアーゼは、当該技術において知られているあら
ゆる方法を用いて、細胞中に一時的に導入されてもよいし、宿主細胞のゲノム中に組み込
まれてもよい。細胞中に吸収されるエンドヌクレアーゼおよび／またはガイドされるポリ
ヌクレオチドは、２０１４年１１月６日出願の米国特許出願第６２／０７５９９９号明細
書に記載される細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）により促進され得る。
エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のリン酸ジエステル結合を切断する酵素
であり、ＤＮＡを特定の部位にて、塩基を損傷させることなく切断する制限エンドヌクレ
アーゼが挙げられる。制限エンドヌクレアーゼは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ
型エンドヌクレアーゼを含み、これらはさらにサブタイプを含む。Ｉ型システムおよびＩ
ＩＩ型システムでは、メチル化酵素活性および制限活性の双方が、単一複合体に含有され
る。また、エンドヌクレアーゼとして、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥａｓｅ）と
しても知られているメガヌクレアーゼが挙げられ、これは、制限エンドヌクレアーゼのよ
うに、特定の認識部位に結合してこれを切断する。しかしながら、メガヌクレアーゼの認
識部位は、典型的に長く、約１８ｂｐ以上である（２０１２年３月２２日出願の国際特許
出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／３００６１号明細書）。メガヌクレアーゼは、保存配列モチーフ
に基づいて４つのファミリーに分類されており、当該ファミリーは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ
、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈ−Ｎ−Ｈ、およびＨｉｓ−Ｃｙｓボックスのファミリーである。こ
れらのモチーフは、金属イオンの配位およびリン酸ジエステル結合の加水分解に関与する
。ＨＥａｓｅは、その長い認識部位で、そしてＤＮＡ基質の一部の配列多型を許容するこ
とで、注目に値する。メガヌクレアーゼの命名規則は、他の制限エンドヌクレアーゼの規
則と類似している。メガヌクレアーゼはまた、フリースタンディングのＯＲＦ、イントロ
ン、およびインテインによってコードされる酵素について、それぞれ接頭語Ｆ−、Ｉ−、
またはＰＩ−によって特徴付けられる。組み換えプロセスにおける一工程が、認識部位ま
たはその近くにおけるポリヌクレオチド切断を含む。この切断活性は、二本鎖切断をもた
らすのに用いられ得る。部位特異的リコンビナーゼおよびその認識部位の総説について、
Ｓａｕｅｒ（１９９４）Ｃｕｒｒ Ｏｐ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５：５２１−７；およ
びＳａｄｏｗｓｋｉ（１９９３）ＦＡＳＥＢ ７：７６０−７を参照されたい。一部の例
では、リコンビナーゼは、インテグラーゼファミリーまたはリゾルバーゼファミリー由来
である。
ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、植物または他の生物のゲノム中の
特定の標的配列にて二本鎖切断を行うのに用いられ得る配列特異的ヌクレアーゼのクラス
である（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ２９：１４３−１４８）。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンク
フィンガーＤＮＡ結合ドメインおよび二本鎖切断誘発剤ドメインで構成される、操作され
た二本鎖切断誘発剤である。認識部位特異性は、ジンクフィンガードメインによって与え
られ、これは典型的に、例えばＣ２Ｈ２構造を有する、２、３、または４つのジンクフィ
ンガーを含む。しかしながら、他のジンクフィンガー構造が知られており、操作されてき
た。ジンクフィンガードメインは、選択されたポリヌクレオチド認識配列に特異的に結合
するポリペプチドを設計するのに適用可能である。ＺＦＮとして、非特異的エンドヌクレ
アーゼドメインに結合した、操作されたＤＮＡ結合ジンクフィンガードメイン、例えば、
ＦｏｋＩ等のＩＩ型エンドヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメインが挙げられる。追加
的な機能性がジンクフィンガー結合ドメインに融合されてよく、転写アクティベータドメ
イン、転写リプレッサードメイン、およびメチル化酵素が挙げられる。一部の例では、ヌ
クレアーゼドメインの二量化が、切断活性に必要とされる。各ジンクフィンガーが、標的
ＤＮＡ中の３つの連続する塩基対を認識する。例えば、３つのフィンガードメインが、９
個の連続するヌクレオチドの配列を認識し、ヌクレアーゼの二量化要求によって、２組の
ジンクフィンガートリプレットが用いられて、１８ヌクレオチドの認識配列に結合する。
本明細書で使用される用語「ガイドポリヌクレオチド」は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ
と複合体を形成することができ、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、
結合し、かつ場合により切断することを可能にするポリヌクレオチド配列に関連する。ガ
イドポリヌクレオチドは単分子または二重分子であり得る。ガイドポリヌクレオチド配列
は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、またはこれらの組み合わせ（ＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配
列）であり得る。任意選択により、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレ
オチド、ホスホジエステル結合または連結修飾、例えば、限定はされないが、Ｌｏｃｋｅ
ｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣ、２，６−ジアミノプリン、
２’−フルオロＡ、２’−フルオロＵ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ホスホロチオエート結
合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１
８（ヘキサエチレングリコール鎖）分子への連結、または環化をもたらす５’から３’へ
の共有結合的連結を含み得る。リボ核酸のみを含むガイドポリヌクレオチドはまた、「ガ
イドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と呼ばれる（２０１５年３月１９日公開の米国特許出願
公開第２０１５／００８２４７８Ａ１号明細書、および２０１５年２月２６日公開の米国
特許出願公開第２０１５／００５９０１０Ａ１号明細書、（両文献は参照によりその全体
が本明細書に組み込まれる）もまた参照されたい）。
ガイドポリヌクレオチドは、ｃｒヌクレオチド配列およびｔｒａｃｒヌクレオチド配列
を含む二重分子（二本鎖ガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）であり得る。ｃｒヌクレ
オチドは、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる第１のヌ
クレオチド配列ドメイン（可変標的ドメインまたはＶＴドメインと呼ばれる）、およびＣ
ａｓエンドヌクレアーゼ認識（ＣＥＲ）ドメインの一部である第２のヌクレオチド配列（
ｔｒａｃｒメイト配列とも呼ばれる）を含む。ｔｒａｃｒメイト配列は、ｔｒａｃｒヌク
レオチドに相補性領域に沿ってハイブリダイズし、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイ
ン、すなわちＣＥＲドメインを共に形成することができる。ＣＥＲドメインは、Ｃａｓエ
ンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用することができる。二本鎖ガイドポリヌクレオ
チドのｃｒヌクレオチドおよびｔｒａｃｒヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、および／ま
たはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であり得る。いくつかの実施形態では、二本鎖ガイド
ポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチド分子は、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで
構成されている場合には）「ｃｒＤＮＡ」と称され、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレ
ッチで構成されている場合には）「ｃｒＲＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮ
Ａヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「ｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」と称
される。ｃｒヌクレオチドは、細菌中および古細菌中に天然に存在するｃＲＮＡの断片を
含むことができる。本明細書で開示するｃｒヌクレオチド中に存在することができる、細
菌中および古細菌中に天然に存在するｃＲＮＡの断片のサイズは、限定はされないが、２
、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１
８、１９、２０またはそれ以上のヌクレオチド長の範囲をとることができる。いくつかの
実施形態では、ｔｒａｃｒヌクレオチドは、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構
成されている場合には）「ｔｒａｃｒＲＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ス
トレッチで構成されている場合には）「ｔｒａｃｒＤＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオ
チドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「ｔｒａｃｒＤＮ
Ａ−ＲＮＡ」と称される。一実施形態では、ＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体
を誘導するＲＮＡは、二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである。
ｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）は、５’から３’の方向に（
ｉ）ＣＲＩＳＰＲＩＩ型ｃｒＲＮＡの反復領域とアニールする配列と、（ｉｉ）ステムル
ープ含有部とを有する（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４７１：６
０２−６０７）。二本鎖ガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体
を形成することができ、前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体
（ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムとも呼ばれる）は、Ｃａ
ｓエンドヌクレアーゼをゲノム標的部位に誘導することができ、Ｃａｓエンドヌクレアー
ゼがその標的部位を認識し、それに結合し、かつ任意選択によりそれをニッキングまたは
切断（一本鎖または二本鎖切断の導入）するのを可能にする。（２０１５年３月１９日公
開の米国特許出願公開第２０１５／００８２４７８Ａ１号明細書、および２０１５年２月
２６日公開の米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０Ａ１号明細書（両文献は参照
によりその全体が本明細書に組み込まれる）もまた参照されたい）。
ガイドポリヌクレオチドはまた、ｔｒａｃｒヌクレオチド配列に結合したｃｒヌクレオ
チド配列を含む単一分子（単一ガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）であり得る。単一
ガイドポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列にハイブリダイズすること
ができる第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変標的ドメインまたはＶＴドメインと呼ば
れる）、およびＣａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用するＣａｓエンドヌク
レアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲドメイン）を含む。「ドメイン」は、ＲＮＡ、ＤＮＡおよ
び／またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であり得るヌクレオチドの連続ストレッチを意
味する。単一ガイドポリヌクレオチドのＶＴドメインおよび／またはＣＥＲドメインは、
ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含み得る。Ｃｒヌクレオ
チド由来の配列およびｔｒａｃｒヌクレオチド由来の配列で構成されている単一ガイドポ
リヌクレオチドを、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）
「単一ガイドＲＮＡ」と称することができ、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構
成されている場合には）「単一ガイドＤＮＡ」と称することができ、（ＲＮＡヌクレオチ
ドとＤＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「単一ガイドＲＮＡ
−ＤＮＡ」と称することができる。単一ガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓエンドヌクレ
アーゼと複合体を形成することができ、前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌク
レアーゼ複合体（ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムとも呼ば
れる）は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをゲノム標的部位に誘導することができ、Ｃａｓエ
ンドヌクレアーゼがその標的部位を認識し、それに結合し、かつ任意選択によりそれをニ
ッキングまたは切断（一本鎖または二本鎖切断の導入）するのを可能にする。（２０１５
年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１５／００８２４７８Ａ１号明細書、および
２０１５年２月２６日公開の米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０Ａ１号明細書
（両文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）もまた参照されたい）。
用語「可変標的ドメイン」または「ＶＴドメイン」は本明細書中で互換的に使用され、
二本鎖ＤＮＡ標的部位の一方の鎖（ヌクレオチド配列）にハイブリダイズすることができ
る（相補的である）ヌクレオチド配列を含む。第１のヌクレオチド配列ドメイン（ＶＴド
メイン）と標的配列との間の相補性％は、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、
５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、
６３％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、
７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、
８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、
９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であり得る。可変標的
ドメインの長さは、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０
、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長で
あり得る。いくつかの実施形態では、可変標的ドメインは１２〜３０ヌクレオチドの連続
するストレッチを含む。可変標的ドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列
、改変ＲＮＡ配列、またはこれらの任意の組み合わせで構成され得る。
（ガイドポリヌクレオチドの）「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン」または「Ｃ
ＥＲドメイン」という用語は、本明細書中で互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアー
ゼポリペプチドと相互作用するヌクレオチド配列を含む。ＣＥＲドメインは、ｔｒａｃｒ
ヌクレオチドメイト配列に続いてｔｒａｃｒヌクレオチド配列を含む。ＣＥＲドメインは
、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列（例えば、２０１５年２月
２６日公開の米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０Ａ１号明細書（参照によりそ
の全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、またはこれらの任意の組み合わせ
で構成され得る。
単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結す
るヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を
含み得る。一実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃ
ｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列の長さは、少なくとも３、４、５、６、７
、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１
、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、
３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４
８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１
、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、
７５、７６、７７、７８、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８
７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または
１００ヌクレオチド長であり得る。他の実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドのｃ
ｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、限定はされ
ないが、ＧＡＡＡテトラループ配列などのテトラループ配列を含み得る。
ガイドポリヌクレオチド、ＶＴドメインおよび／またはＣＥＲドメインのヌクレオチド
配列改変は、限定はされないが、５’キャップ、３’ポリアデニル化テイル、リボスイッ
チ配列、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する配列、ガイドポリヌクレオチドの
標的を細胞内部位に設定する改変または配列、トラッキングが生じる改変または配列、タ
ンパク質用の結合部位が生じる改変または配列、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄ（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣヌクレオチド、２，６−ジアミノプリンヌクレオチド、２
’−フルオロＡヌクレオチド、２’−フルオロＵヌクレオチド；２’−Ｏ−メチルＲＮＡ
ヌクレオチド、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレング
リコール分子への連結、スペーサー１８分子への連結、５’から３’への共有結合的連結
、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができる。これらの改変
により、少なくとも１種の追加の有利な特徴がもたらされ得、この追加の有利な特徴は、
安定性の変更または調節、細胞内ターゲティング、トラッキング、蛍光標識、タンパク質
用またはタンパク質複合体用の結合部位、相補的な標的配列に対する結合親和性の変更、
細胞分解に対する耐性の変更、および細胞透過性の増加からなる群から選択される。
ガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡの「機能的断片」、「機能的に等価
である断片」および「機能的に等価な断片」という用語は、本明細書中で互換的に使用さ
れ、それぞれ本開示のガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡとして機能する
能力が保持されているガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡの一部分または
サブ配列を指す。
ガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ（それぞれ）の「機能的変異体」、
「機能的に等価である変異体」および「機能的に等価な変異体」という用語は、本明細書
中で互換的に使用され、それぞれ本開示のガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲ
ＮＡとして機能する能力が保持されているガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲ
ＮＡそれぞれの変異体を指す。
用語「単一ガイドＲＮＡ」および「ｓｇＲＮＡ」は、本明細書中で互換的に使用され、
２つのＲＮＡ分子の合成融合体、ｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮ
Ａ）に融合した、（ｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に連結
した）可変標的ドメインを含むｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）を指す。単一ガイド
ＲＮＡは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲ
ＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ断片、およびｔｒａｃｒＲＮＡ
またはｔｒａｃｒＲＮＡ断片を含み得、前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複
合体は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に誘導することができ、Ｃａｓエン
ドヌクレアーゼがそのＤＮＡ標的部位を認識し、それに結合し、かつ任意選択によりそれ
をニッキングまたは切断（一本鎖または二本鎖切断の導入）するのを可能にする。
細胞におけるガイドＲＮＡの発現システムの向上が必要とされている。本明細書中で記
載されるのは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをその標的部位にガイドすることができるガイ
ドＲＮＡを、Ｐｏｌ−ＩＩプロモーターを用いて発現する組成物および方法である。
本開示の一実施形態において、本開示は、単一ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオ
チドに作動可能に結合したＰｏｌ−ＩＩプロモーターを含む組み換えＤＮＡコンストラク
トを記載し、前記組み換えＤＮＡコンストラクトは、リボザイムをコードするヌクレオチ
ド配列を含まず、前記ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体
を形成することができ、前記複合体は、非従来型酵母のゲノム中の標的部位配列に結合す
ることができ、かつこれを切断することができる。
用語「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエ
ンドヌクレアーゼシステム」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ複合体」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａ
ｓシステム」、「ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体」、「ｇＲＮＡ／Ｃａｓシステム」、「ＲＮＡ
誘導型エンドヌクレアーゼ」、「ＲＧＥＮ」は、本明細書中で互換的に使用され、複合体
を形成することができる、少なくとも１つのＲＮＡ構成要素、および少なくとも１つのＣ
ａｓエンドヌクレアーゼを指し、前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は
、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に誘導することができ、Ｃａｓエンドヌク
レアーゼがそのＤＮＡ標的部位を認識し、それに結合し、かつ任意選択によりそれをニッ
キングまたは切断（一本鎖または二本鎖切断の導入）するのを可能にする。本明細書中の
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型ＣＲＩ
ＳＰＲシステムなどの、４つの既知のＣＲＩＳＰＲシステム（Ｈｏｒｖａｔｈ ａｎｄ
Ｂａｒｒａｎｇｏｕ、２０１０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：１６７−１７０）のいずれか
のＣａｓタンパク質および適切なＲＮＡ構成要素を含み得る。ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエン
ドヌクレアーゼ複合体は、ＩＩ型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと少なくとも１つのＲＮＡ
構成要素（例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｇＲＮＡ）を含み得る（
２０１５年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１５／００８２４７８Ａ１号明細書
、および２０１５年２月２６日公開の米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０Ａ１
号明細書（両文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）も参照されたい）。
ガイドポリヌクレオチドは、当該技術において知られているあらゆる方法、例えば、以
下に限定されないが、粒子撃込み、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
属形質転換、または局所的アプリケーションを用いて、一本鎖ポリヌクレオチドまたは二
本鎖ポリヌクレオチドとして細胞中に一時的に導入されてよい。また、ガイドポリヌクレ
オチドは、細胞中でガイドＲＮＡを転写することができる特定のプロモーターに作動可能
に結合されたガイドポリヌクレオチドをコードする非相同核酸断片を含む組み換えＤＮＡ
分子を（以下に限定されないが、粒子撃込みまたはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ）属形質転換等の方法によって）導入することによって、前記細胞中に間接
的に導入されてよい。
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（Ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーター）は、５’末端
および３’末端が正確に定義され、未改変であるＲＮＡの転写を可能にする（ＤｉＣａｒ
ｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１：４３３６−４３４３
；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３：ｅ１６１
；ＳＮＲ５２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｍａｒｃｋ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｎｕｃｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３４（６）：１８１６−１８３５）。
ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰ ＩＩおよびＰｏｌ−ＩＩ）は、真核生物の細胞中
に見出される酵素である。これは、ＤＮＡの転写を触媒して、ｍＲＮＡ、ならびに殆どの
ｓｎＲＮＡおよびマイクロＲＮＡの前駆体を合成する（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ Ｒ（１９９９
）．「Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ」。Ｔ
ｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９（１２）：Ｍ４６．ｄｏｉ：１０．１
０１６／Ｓ０９６２−８９２４（９９）０１６７９−７．ＰＭＩＤ １０６１１６８１；
Ｓｉｍｓ，Ｒ．Ｊ．３ｒｄ；Ｍａｎｄａｌ，Ｓ．Ｓ．；Ｒｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．（Ｊｕｎ
ｅ ２００４）．「Ｒｅｃｅｎｔ ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ ｏｆ ＲＮＡ−ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ−ＩＩ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」。Ｃｕｒｒｅｎｔ
ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １６（３）：２６３−２７１．ｄｏ
ｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｂ．２００４．０４．００４．ＩＳＳＮ ０９５５−０６
７４。
ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、当該技術において周知である（総説について
、Ｂｕｔｌｅｒ Ｊ．ａｎｄ Ｋａｄｏｎａｇａ Ｊ．２００２．Ｔｈｅ ＲＮＡ ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩ ｃｏｒｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ：ａ ｋｅｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎ
ｔ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｇ
ＥＮＥＳ ＆ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ １６：２５８３−２５９２参照）。ＲＮＡポリ
メラーゼＩＩプロモーターとして、ＦＢＡ１プロモーターが挙げられる（Ｈｏｎｇ ｅｔ
ａｌ．２０１２．Ｙｅａｓｔ．２９：５９−７２；２０１４年８月１３日出願の米国特
許出願第６２／０３６６５２号明細書も参照（その全体が参照によって本明細書に組み込
まれる））。
用語「Ｐｏｌ−ＩＩガイドＲＮＡ発現カセット」および「ポリメラーゼＩＩ−ｇＲＮＡ
発現カセット」は、本明細書中で互換的に用いられて、発現カセット（組み換えＤＮＡコ
ンストラクト）を指し、ポリメラーゼＩＩプロモーターは、ガイドＲＮＡをコードする。
用語「標的部位」、「標的配列」、「標的部位配列」、「標的ＤＮＡ」、「標的遺伝子
座」、「ゲノム標的部位」、「ゲノム標的配列」、「ゲノム標的遺伝子座」および「プロ
トスペーサー」は、本明細書中で互換的に使用され、限定はされないが、ガイドポリヌク
レオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体が認識し、結合し、かつ場合によりニッキン
グまたは切断をすることができる、細胞の、染色体、エピソーム、またはゲノム中のあら
ゆる他のＤＮＡ分子（例えば、染色体ＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プ
ラスミドＤＮＡ）上のヌクレオチド配列などのポリヌクレオチド配列を指す。標的部位は
細胞ゲノム中の内因性部位であり得、あるいは、標的部位は真菌細胞に対して異種であり
、そのため細胞のゲノム中に天然には存在していないか、または天然で生じる場所と比較
して異種のゲノム位置に見出すことができる。本明細書で使用される場合、用語「内因性
標的配列」および「天然標的配列」は、本明細書中で互換的に使用され、細胞のゲノムに
内在するか、または細胞のゲノムで生じ、細胞のゲノム中のその標的配列の内在位置また
は発生位置に存在する標的配列を指す。細胞としては、限定はされないが、ヒト、非ヒト
、動物、細菌、真菌、昆虫、酵母、非従来型酵母および植物の細胞、ならびに本明細書に
記載の方法によって作製された植物体および種子が挙げられる。「人工標的部位」または
「人工標的配列」は、本明細書中で互換的に使用され、細胞のゲノムに導入された標的配
列を指す。そのような人工標的配列は、細胞のゲノム中の内因性標的配列または天然標的
配列と配列は同一であるが、細胞のゲノム中の異なる位置（すなわち、非内在位置または
非発生位置）に位置し得る。
「変更標的部位」、「変更標的配列」、「改変標的部位」、「改変標的配列」は、本明
細書中で互換的に使用され、非変更標的配列と比較して少なくとも１つの変更を含む、本
明細書に開示の標的配列を指す。そのような「変更」としては、例えば、（ｉ）少なくと
も１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ
）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組
み合わせが挙げられる。
「標的部位を改変する」方法、および「標的部位を変更する」方法は、本明細書中で互
換的に用いられて、変更された標的部位を作製する方法を指す。
標的ＤＮＡ配列（標的部位）の長さは様々であってよく、例えば、少なくとも１２、１
３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６
、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のヌクレオチド長の標的部位が挙げられる。
標的部位は回文構造であり得る、すなわち、一方の鎖上の配列が相補鎖上で反対方向に同
じものを読み取ることがさらに可能である。ニッキング／切断部位は標的配列内に存在す
ることができる、またはニッキング／切断部位は標的配列の外側に存在する可能性がある
。別の変形では、切断は互いに直接向かい合ったヌクレオチド位置で起きて平滑末端切断
が起きる可能性があり、その他の場合では、切り込みがジグザグ状となり、５’オーバー
ハングまたは３’オーバーハングであり得る一本鎖オーバーハング（「粘着末端」とも呼
ばれる）を生じさせる可能性がある。ゲノム標的部位の活性変異体もまた使用することが
できる。そのような活性変異体は、所与の標的部位に対して少なくとも６５％、７０％、
７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、
９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を含むことができ、活性変異体は生
物学的活性を保持しており、したがってＣａｓエンドヌクレアーゼにより認識され切断さ
れ得る。エンドヌクレアーゼによる標的部位の一本鎖または二本鎖切断を測定するための
アッセイは、当該技術分野で知られており、一般には、認識部位を含むＤＮＡ基質への薬
剤の全体的な活性および特異性を測定する。
本明細書中の「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ））は、本明細書に記載のガ
イドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムにより認識される（標的とさ
れる）標的配列（プロトスペーサー）に隣接する短いヌクレオチド配列を指す。標的ＤＮ
Ａ配列の後にＰＡＭがなければ、その標的ＤＮＡ配列を正しく認識することはできない。
本明細書におけるＰＡＭの配列および長さは、用いるＣａｓタンパク質、またはＣａｓタ
ンパク質複合体に応じて異なり得る。ＰＡＭ配列は任意の長さであり得るが、一般には、
０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６
、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド長である。
用語「ターゲティング」、「遺伝子ターゲティング」および「ＤＮＡターゲティング」
は、本明細書中で互換的に使用される。本明細書中のＤＮＡターゲティングは、例えば細
胞の染色体またはプラスミド中の、特定のＤＮＡ配列でのノックアウト、編集、またはノ
ックインの特異的な導入であってよい。本明細書においては、ＤＮＡターゲティングは、
一般に、適切なポリヌクレオチド構成要素を伴ったエンドヌクレアーゼが、細胞中の特定
のＤＮＡ配列にて一方の鎖または双方の鎖を切断することによって実行され得る。そのよ
うなＤＮＡ切断は、二本鎖切断（ＤＳＢ）の場合、標的部位での改変に繋がり得るＮＨＥ
ＪまたはＨＤＲプロセスを引き起こすことができる。
本明細書中の標的方法は、例えば、２つ以上のＤＮＡ標的部位が、当該方法で標的とさ
れるように実行され得る。そのような方法は、場合によっては、多重化法として特徴付け
られ得る。２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の標的部位が、特定
の実施形態において、同時に標的とされ得る。多重化法は、典型的に、本明細書中で、ガ
イドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を特有のＤＮＡ標的部位にガイ
ドするようにそれぞれ設計されている複数の様々なＲＮＡ構成要素が提供される標的方法
によって実行される（２０１４年８月１３日出願の米国特許出願第６２／０３６６５２号
明細書（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。
用語「ノックアウト」、「遺伝子ノックアウト」および「遺伝的ノックアウト」は、本
明細書中で互換的に用いられる。ノックアウトは、Ｃａｓタンパク質によるターゲティン
グによって部分的に、または完全に無効とされた、細胞のＤＮＡ配列を表す；ノックアウ
ト前のそのようなＤＮＡ配列は、例えば、アミノ酸配列をコードすることができたか、ま
たは、調節機能（例えば、プロモーター）を有していたはずである。ノックアウトは、イ
ンデル（ＮＨＥＪによる標的ＤＮＡ配列中のヌクレオチド塩基の挿入または欠失）、また
は標的部位もしくはその近傍の配列の機能を低下もしくは喪失させる配列の特異的除去に
より産生し得る。
ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムは、共送達されるポリヌ
クレオチド改変鋳型と組み合わせて使用することができ、目的のゲノムヌクレオチド配列
の編集（改変）を可能にする。（２０１５年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１
５／００８２４７８Ａ１号明細書、および２０１５年２月２６日公開の国際公開第２０１
５／０２６８８６Ａ１号パンフレット（両文献は参照によりその全体が本明細書に組み込
まれる）。
「改変ヌクレオチド」または「編集ヌクレオチド」は、その非改変ヌクレオチド配列と
比較して少なくとも１つの変更を含む目的のヌクレオチド配列を指す。そのような「変更
」としては、例えば、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも
１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、または（
ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせが挙げられる。
用語「ポリヌクレオチド改変鋳型」には、編集されるべきヌクレオチド配列と比較して
、少なくとも１つのヌクレオチド改変を含むポリヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチド
改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、付加または欠失であり得る。場合により
、ポリヌクレオチド改変鋳型は、さらに、少なくとも１つのヌクレオチド改変にフランキ
ングする相同ヌクレオチド配列を含み得、そのフランキング相同ヌクレオチド配列は、編
集されるべき所望のヌクレオチド配列に十分な相同性を提供する。
ゲノム編集は利用可能な任意の遺伝子編集方法によって行うことができる。例えば、遺
伝子編集は、宿主細胞に、その宿主細胞のゲノム内の遺伝子に対する標的改変を含むポリ
ヌクレオチド改変鋳型（遺伝子修復オリゴヌクレオチドと呼ばれることもある）を導入す
ることによって行うことができる。そのような方法に使用するポリヌクレオチド改変鋳型
は、一本鎖または二本鎖であり得る。そのような方法の例は、広く、例えば、米国特許出
願公開第２０１３／００１９３４９号明細書などに記載れている。
いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、所望の変更部近傍のゲノムの所定の位置に二
本鎖切断（ＤＳＢ）を導入することによって促進され得る。ＤＳＢは、利用可能な任意の
ＤＳＢ導入剤、例えば、限定はされないが、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィ
ンガーヌクレアーゼ、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡシステム（細菌性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステ
ムの基づく）などを使用して導入することができる。いくつかの実施形態では、ＤＳＢの
導入は、ポリヌクレオチド改変鋳型の導入と組み合わせることができる。
ＤＳＢと改変鋳型を組み合わせるゲノム配列の編集プロセスは、一般に、染色体配列中
の標的配列を認識し、ゲノム配列にＤＳＢを導入することができる、ＤＳＢ誘発物質、ま
たはＤＳＢ誘発物質をコードする核酸、および、編集されるべきヌクレオチド配列と比較
して少なくとも１つのヌクレオチドの変更を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド改変
鋳型を、宿主細胞へ提供することを含む。ポリヌクレオチド改変鋳型は、さらに、少なく
とも１つのヌクレオチド変更部にフランキングするヌクレオチド配列を含み得る。そのフ
ランキング配列は、ＤＳＢにフランキングする染色体領域に実質的に相同である。Ｃａｓ
９−ｇＲＮＡ複合体などのＤＳＢ誘発物質を使用するゲノムの編集は、例えば、２０１５
年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１５−００８２４７８Ａ１号明細書、２０１
５年２月２６日公開の国際公開第２０１５／０２６８８６Ａ１号パンフレット、２０１４
年７月７日出願の米国特許出願第６２／０２３２４６号明細書、および２０１４年８月１
３日出願の米国特許出願第６２／０３６，６５２号明細書（これらは全て参照により本明
細書に組み込まれる）に記載されている。
用語「ノックイン」、「遺伝子ノックイン」、「遺伝子挿入」および「遺伝的ノックイ
ン」は、本明細書中で互換的に用いられる。ノックインは、（適切なドナーＤＮＡポリヌ
クレオチド配列もまた使用される場合、ＨＲによる）Ｃａｓタンパク質によるターゲティ
ングによる、細胞中の特定のＤＮＡ配列でのＤＮＡ配列の置換または挿入を表す。ノック
インの例としては、遺伝子のコード領域中の異種アミノ酸コード配列の特異的な挿入、ま
たは遺伝子座中への転写調節要素の特異的な挿入がある。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼの標的部位に挿入される目的ポリヌクレオチドを有する細胞
または生命体を得るために、様々な方法および組成物を使用することができる。そのよう
な方法は、標的部位に目的ポリヌクレオチドを組み込む相同組み換えを用いることができ
る。提示された１つの方法では、目的ポリヌクレオチドがドナーＤＮＡコンストラクトと
して生命体細胞に供給される。本明細書で使用される場合、「ドナーＤＮＡ」には、Ｃａ
ｓエンドヌクレアーゼの標的部位に挿入される目的ポリヌクレオチドを含むＤＮＡコンス
トラクトが含まれる。ドナーＤＮＡコンストラクトは、さらに、目的ポリヌクレオチドに
フランキングする第１および第２の領域を含む。ドナーＤＮＡの相同の第１および第２の
領域はそれぞれ、細胞または生命体ゲノムの標的部位に存在するかまたはフランキングす
る第１および第２のゲノム領域に対する相同性を共有する。「相同性」は、類似するＤＮ
Ａ配列を意味する。例えば、ドナーＤＮＡ上で見出される「ゲノム領域に対する相同領域
」とは、細胞または生命体ゲノムの所与の「ゲノム領域」と類似する配列を有するＤＮＡ
領域のことである。相同領域は、切断される標的部位での相同組み換えを促進するのに十
分な任意の長さであり得る。例えば、相同領域は、この相同領域が、対応するゲノム領域
との相同組み換えを受けるのに十分な相同性を有するように、少なくとも５〜１０、５〜
１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜
５５、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜
９５、５〜１００、５〜２００、５〜３００、５〜４００、５〜５００、５〜６００、５
〜７００、５〜８００、５〜９００、５〜１０００、５〜１１００、５〜１２００、５〜
１３００、５〜１４００、５〜１５００、５〜１６００、５〜１７００、５〜１８００、
５〜１９００、５〜２０００、５〜２１００、５〜２２００、５〜２３００、５〜２４０
０、５〜２５００、５〜２６００、５〜２７００、５〜２８００、５〜２９００、５〜３
０００、５〜３１００、またはそれ以上の塩基長を含むことができる。「十分な相同性」
は、２つのポリヌクレオチド配列が相同組み換え反応用の基質として作用するのに十分な
構造的類似性を有することを示す。この構造的類似性は、各ポリヌクレオチド断片の全長
とポリヌクレオチドの配列類似性とを含む。配列類似性は、配列の全長にわたる配列同一
性パーセント、ならびに／または１００％配列同一性を有する連続ヌクレオチドなどの局
在化した類似性を含む保存領域、および配列の長さの一部にわたる配列同一性パーセント
で説明することができる。
標的およびドナーポリヌクレオチドにより共有される相同性または配列同一性の量は多
様であり得、約１〜２０ｂｐ、２０〜５０ｂｐ、５０〜１００ｂｐ、７５〜１５０ｂｐ、
１００〜２５０ｂｐ、１５０〜３００ｂｐ、２００〜４００ｂｐ、２５０〜５００ｂｐ、
３００〜６００ｂｐ、３５０〜７５０ｂｐ、４００〜８００ｂｐ、４５０〜９００ｂｐ、
５００〜１０００ｂｐ、６００〜１２５０ｂｐ、７００〜１５００ｂｐ、８００〜１７５
０ｂｐ、９００〜２０００ｂｐ、１〜２．５ｋｂ、１．５〜３ｋｂ、２〜４ｋｂ、２．５
〜５ｋｂ、３〜６ｋｂ、３．５〜７ｋｂ、４〜８ｋｂ、５〜１０ｋｂの範囲で単位整数値
を有する全長および／もしくは全領域を含む、または最大で標的部位の全長を含む。これ
らの範囲には、この範囲内の全ての整数が含まれ、例えば１〜２０ｂｐの範囲には、１、
２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、
１８、１９および２０ｂｐが含まれる。相同性の量はまた、少なくとも約５０％、５５％
、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％
、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％
、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％
、９８％、９９％または１００％の配列同一性パーセントを含む２つのポリヌクレオチド
の完全にアラインされた長さ全体にわたる配列同一性パーセントで説明することもできる
。十分な相同性は、ポリヌクレオチドの長さと、全体的な配列同一性パーセントと、任意
選択で連続ヌクレオチドの保存領域または局所的な配列同一性パーセントとの任意の組み
合わせを含み、例えば、十分な相同性を、標的遺伝子座の領域に対して少なくとも８０％
の配列同一性を有する７５〜１５０ｂｐの領域として説明することができる。十分な相同
性はまた、高ストレンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズする２つのポリヌクレ
オチドの予測能力によって説明することができ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ
．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ，ＮＹ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ、（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎ
ｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）；および、Ｔｉｊｓｓｅｎ
（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「ゲノム領域」とは、標的部位のいずれかの側上に存在す
る、細胞のゲノム中の染色体のセグメントのことであるか、または標的部位の一部も含む
セグメントのことである。このゲノム領域は、このゲノム領域は、対応する相同領域との
相同組み換えを受けるのに十分な相同性を有するように、少なくとも５〜１０、５〜１５
、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５
、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５
、５〜１００、５〜２００、５〜３００、５〜４００、５〜５００、５〜６００、５〜７
００、５〜８００、５〜９００、５〜１０００、５〜１１００、５〜１２００、５〜１３
００、５〜１４００、５〜１５００、５〜１６００、５〜１７００、５〜１８００、５〜
１９００、５〜２０００、５〜２１００、５〜２２００、５〜２３００、５〜２４００、
５〜２５００、５〜２６００、５〜２７００、５〜２８００、５〜２９００、５〜３００
０、５〜３１００個、またはそれ以上の塩基を含むことができる。
目的ポリヌクレオチドおよび／または形質は、２０１３年１０月３日公開の米国特許出
願公開第２０１３／０２６３３２４−Ａ１号明細書および２０１３年１０月２４日公開の
ＰＣＴ／ＵＳ１３／２２８９１号明細書（両出願は参照により本明細書に組み込まれる）
に記載されるように、複合形質遺伝子座に共にスタッキングすることができる。本明細書
に記載のガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼシステムは、二重鎖切断
を効率よく生成するシステムを提供し、複合形質遺伝子座における形質のスタッキングを
可能にする。
所与のゲノム領域とドナーＤＮＡ上に見出される対応する相同領域との間の構造類似性
は、相同組み換えが起こることを可能にする任意の程度の配列同一性であることができる
。例えば、ドナーＤＮＡの「相同領域」および生命体ゲノムの「ゲノム領域」により共有
される相同性または配列同一性の量は、配列が相同組み換えを受けるように、少なくとも
５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、
８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、
９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性であるこ
とができる。
ドナーＤＮＡ上の相同領域は、標的部位にフランキングする任意の配列に対する相同性
を有することができる。いくつかの実施形態では、相同領域は、標的部位に直接フランキ
ングするゲノム配列に対して相当な配列相同性を共有するが、この相同領域を、標的部位
に対してさらに５’または３’であり得る領域に対して十分な相同性を有するように設計
することができることが認識される。さらに他の実施形態では、相同領域はまた、下流の
ゲノム領域に沿った標的部位の断片とも相同性を有し得る。一実施形態では、第１の相同
領域は標的部位の第１の断片をさらに含み、第２の相同領域は標的部位の第２の断片を含
み、これら第１の断片および第２の断片は異なる。
本明細書中で用いられる「相同組み換え」は、相同性の部位での２つのＤＮＡ分子間の
ＤＮＡ断片の交換を含む。相同組み換えの頻度は、いくつかの因子によって影響される。
異なる生物は、相同組み換えの量、および、相同組み換えの、非相同組み換えに対する割
合に関して、異なる。通常、相同性の領域の長さは、相同組み換え事象の頻度に影響を及
ぼす：相同性の領域が長いほど、頻度は高い。また、相同組み換えを観察するのに必要な
相同性領域の長さも、種によって変動する。多くの場合に、相同性の少なくとも５ｋｂが
利用されてきたが、相同組み換えは、相同性の僅か２５〜５０ｂｐでも観察された。例え
ば、Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｃｅｌｌ ３１：２５−３３；Ｓｈｅｎ
ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，（１９８６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１２：４４１−５７；Ｗａｔ
ｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２
：４７６８−７２，Ｓｕｇａｗａｒａ ａｎｄ Ｈａｂｅｒ，（１９９２）Ｍｏｌ Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｌ １２：５６３−７５，Ｒｕｂｎｉｔｚ ａｎｄ Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，
（１９８４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４：２２５３−８；Ａｙａｒｅｓ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５１９９−
２０３；Ｌｉｓｋａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１５：１６１
−７を参照されたい。
相同配向型修復（ＨＤＲ）は、二本鎖ＤＮＡ切断および一本鎖ＤＮＡ切断の細胞におけ
る修復機構である。相同配向型修復として、相同組み換え（ＨＲ）および一本鎖アニーリ
ング（ＳＳＡ）（Ｌｉｅｂｅｒ．２０１０ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９：
１８１−２１１）が挙げられる。ＨＤＲの最も一般的な形態は、相同組み換え（ＨＲ）と
呼ばれ、これは、ドナーＤＮＡとアクセプターＤＮＡとの最も長い配列相同性を要求する
。ＨＤＲの他の形態として、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）および切断誘導複製が挙げら
れ、これらは、ＨＲと比べて短い配列相同性を必要とする。ニック（一本鎖切断）に対す
る相同配向型修復は、二本鎖切断に対するＨＤＲと異なる機構で起こり得る（Ｄａｖｉｓ
ａｎｄ Ｍａｉｚｅｌｓ．（２０１４）ＰＮＡＳ（００２７−８４２４），１１１（１
０），ｐ．Ｅ９２４−Ｅ９３２）。
例えば、相同組み換え（ＨＲ）による植物細胞のゲノムの変更は、遺伝子工学にとって
強力なツールである。相同組み換えは、植物において（Ｈａｌｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，
（１９９２）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２３１：１８６−９３）、そして昆虫におい
て（Ｄｒａｙ ａｎｄ Ｇｌｏｏｒ，１９９７，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４７：６８９−９
９）実証されてきた。相同組み換えは、他の生物においても達成されてきた。例えば、相
同性の少なくとも１５０〜２００ｂｐが、寄生性の原虫リーシュマニアの相同組み換えに
必要とされた（Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｕ ａｎｄ Ｄｕｍａｓ，（１９９７）Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：４２７８−８６）。糸状菌アスペルギルス・ニデュ
ランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）では、遺伝子置換が、僅か５０ｂ
ｐのフランキング相同性でも達成された（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，（２０
００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８：ｅ９７）。標的遺伝子置換は、繊毛
虫テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）で
も実証されてきた（Ｇａｅｒｔｉｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：５３９１−８）。哺乳動物では、相同組み換えは、培養で増殖さ
れて、形質転換されて、選択されて、かつマウス胚中に導入され得る多能性胚性幹細胞株
（ＥＳ）を用いて、マウスにおいて最も良好であった（Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１
９９２，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，２ｎｄ Ｅｄ．，（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｂｙ ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ
＆ Ｃｏ．））。
エラーを起こしやすいＤＮＡ修復機構が、二本鎖切断部位にて突然変異をもたらし得る
。染色体の構造的完全性は、通常、修復によって保存されるが、欠失、挿入またはその他
の再配置は起こり得る。１つの二本鎖切断の２末端は、ＮＨＥＪの最も一般的な基質であ
る（Ｋｉｒｉｋ ｅｔ ａｌ．，（２０００）ＥＭＢＯ Ｊ １９：５５６２−６）が、
２つの異なる二本鎖切断が起きる場合、異なる切断のフリー端でライゲーションが起こり
、染色体の欠失（Ｓｉｅｂｅｒｔ ａｎｄ Ｐｕｃｈｔａ、（２００２）Ｐｌａｎｔ Ｃ
ｅｌｌ １４：１１２１−３１）、または異なる染色体間の染色体転座転移（Ｐａｃｈｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７５：２１−９）が生じる。マイ
クロホモロジー媒介末端結合ＭＭＥＨは、２０１４年８月２８日公開の米国特許出願公開
第２０１４／０２４２７０２号明細書に記載されており、その全体が本明細書に組み込ま
れる。
本明細書中に記載される方法に用いられるＣａｓエンドヌクレアーゼは、あらゆる二本
鎖切断誘導剤、例えば、以下に限定されないが、ＴＡＬヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、デ
ザイナージンクフィンガーヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、およびホーミン
グメガヌクレアーゼによって置換されてよいことが、当業者によって理解される。
エピソームＤＮＡ分子もまた、二本鎖切断中にライゲーションされ得、例えば、Ｔ−Ｄ
ＮＡの、染色体二本鎖切断中への組み込みがなされ得る（Ｃｈｉｌｔｏｎ ａｎｄ Ｑｕ
ｅ，（２００３）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １３３：９５６−６５；Ｓａｌｏｍｏｎ
ａｎｄ Ｐｕｃｈｔａ，（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ １７：６０８６−９５）。例えば
、二本鎖切断の成熟に関与するエクソヌクレアーゼ活性によって、二本鎖切断の周りの配
列が一旦変更されると、非分裂体細胞中の相同染色体、またはＤＮＡ複製後の姉妹染色分
体等の相同配列が利用できるならば、遺伝子変換経路が、本来の構造を修復し得る（Ｍｏ
ｌｉｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １６：３４２−５２
）。異所性ＤＮＡ配列および／または後成的ＤＮＡ配列もまた、相同組み換え用のＤＮＡ
修復鋳型として機能し得る（Ｐｕｃｈｔａ，（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５２：１
１７３−８１）。
ＤＮＡ中で二本鎖切断が誘発されると、細胞のＤＮＡ修復機構が活性化されて、切断を
修復する。エラーを起こしやすいＤＮＡ修復機構が、二本鎖切断部位にて突然変異をもた
らし得る。切断された末端を接合する最も一般的な修復機構は、非相同性末端結合（ＮＨ
ＥＪ）経路である（Ｂｌｅｕｙａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（２００６）ＤＮＡ Ｒｅｐａｉ
ｒ ５：１−１２）。染色体の構造的完全性は典型的に、修復によって保存されるが、欠
失、挿入、またはその他の再配置が起こり得る（Ｓｉｅｂｅｒｔ ａｎｄ Ｐｕｃｈｔａ
，（２００２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １４：１１２１−３１；Ｐａｃｈｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，（２００７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７５：２１−９）。
あるいは、二本鎖切断は、相同性ＤＮＡ配列間の相同組み換えによって修復することが
できる。二本鎖切断部分近傍の配列が、例えば、二本鎖切断の成熟に関与するエクソヌク
レアーゼ活性によって変わると、非分裂体細胞中の相同染色体、またはＤＮＡ複製後の姉
妹染色分体などの相同配列が利用できるなら、遺伝子変換経路が、元の構造に修復するこ
とができる（Ｍｏｌｉｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １
６：３４２−５２）。異所性および／または後成的ＤＮＡ配列もまた、相同組み換えのＤ
ＮＡ修復鋳型として機能し得る（Ｐｕｃｈｔａ，（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５２
：１１７３−８１）。
ＤＮＡ二本鎖切断は、相同組み換え経路を刺激する有効な因子のようである（Ｐｕｃｈ
ｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８：２８１−９２
；Ｔｚｆｉｒａ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ、（２００５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ ２３：５６７−９；Ｐｕｃｈｔａ、（２００５）Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ ５６：１−１
４）。ＤＮＡ−切断物質の使用により、植物の人工的に構築された相同ＤＮＡ反復配列間
の相同組み換えの２〜９倍の増加が観察された（Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９
５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８：２８１−９２）。トウモロコシのプロトプラ
ストにおける線状ＤＮＡ分子による実験で、プラスミド間の相同組み換えの増進が示され
た（Ｌｙｚｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２３０：
２０９−１８）。
ドナーＤＮＡは、当該技術において知られているあらゆる手段によって導入されてよい
。ドナーＤＮＡは、当該技術において知られているあらゆる形質転換法によって提供され
てよく、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属媒介形質転換、
バイオリスティック粒子撃込み、化学形質転換、プロトプラスト融合、またはエレクトロ
ポレーションが挙げられる。ドナーＤＮＡは、一時的に細胞内に存在してもよいし、細菌
、酵母、真菌、またはウィルスのレプリコンを介して導入されてもよい。Ｃａｓエンドヌ
クレアーゼおよび標的部位の存在下で、ドナーＤＮＡは、形質転換された細胞のゲノム中
に挿入される（ガイドの文言参照）。
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムのさらなる使用が報告されており（
２０１５年３月１５日公開の米国特許出願公開第２０１５−００８２４７８Ａ１号明細書
、２０１５年２月２６日公開の国際公開第２０１５／０２６８８６Ａ１号パンフレット、
２０１５年２月２６日公開の米国特許出願公開第２０１５−００５９０１０Ａ１、２０１
４年７月７日出願の米国特許出願第６２／０２３２４６号明細書、および２０１４年８月
１３日公開の米国特許出願第６２／０３６，６５２号明細書（これらは全て参照により本
明細書に組み込まれる）を参照されたい）、限定はされないが、目的ヌクレオチド配列（
調節要素など）の改変または置換、目的ポリヌクレオチドの挿入、遺伝子ノックアウト、
遺伝子ノックイン、スプライシング部位の改変および／または代替スプライシング部位の
導入、目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の改変、アミノ酸および／またはタ
ンパク質の融合、ならびに目的遺伝子への逆方向反復配列の発現による遺伝子サイレンシ
ングが挙げられる。
目的ポリヌクレオチドはさらに本明細書中に記載されており、商業市場、および作物の
開発に関係するそれらの関心を反映したポリヌクレオチドが挙げられる。目的ポリヌクレ
オチド／目的ポリペプチドとしては、限定はされないが、除草剤耐性コード配列、殺虫物
質コード配列、殺線虫物質コード配列、抗真菌性物質コード配列、抗ウィルス物質コード
配列、ならびに非生物的ストレスおよび生物的ストレス耐性コード配列、あるいは収穫量
、穀粒品質、栄養分、デンプンの品質もしくは量、窒素固定および／もしくは窒素利用、
脂肪酸および油分、ならびに／または組成などの微生物または植物形質を改変する配列が
挙げられる。
さらに、目的ポリヌクレオチドがまた、目的の標的遺伝子配列のメッセンジャーＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）の少なくとも一部に相補的なアンチセンス配列を含み得ることが確認されて
いる。アンチセンスヌクレオチドは、対応するｍＲＮＡとハイブリダイズするように構成
されている。アンチセンス配列は、対応するｍＲＮＡにハイブリダイズし、その発現を妨
げるなら、改変されていてもよい。このように、対応するアンチセンス配列と７０％、８
０％、または８５％の配列同一性を有するアンチセンス構成が使用され得る。さらに、ア
ンチセンスヌクレオチドの部分は、標的遺伝子の発現を妨げるために使用され得る。一般
に、少なくとも５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチドまたはそれ
以上からなる配列が使用され得る。
さらに、目的ポリヌクレオチドはまた、植物体および微生物の内因性遺伝子の発現を抑
制するセンス配向で使用され得る。センス配向のポリヌクレオチドによって植物体および
微生物の遺伝子の発現を抑制する方法は、当該技術分野で知られている。この方法には、
一般に、内因性の遺伝子の転写に対応するヌクレオチド配列の少なくとも一部に作動可能
に結合した、微生物または植物体内での発現を駆動するプロモーターを含むＤＮＡコンス
トラクトで植物体および微生物を形質転換することが含まれる。通常、そのようなヌクレ
オチド配列は、内因性遺伝子の転写配列に対し相当の配列同一性を、一般に、約６５％を
超える配列同一性を、約８５％を超える配列同一性を、または約９５％を超える配列同一
性を有する。米国特許第５，２８３，１８４号明細書および同第５，０３４，３２３号明
細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
注目するポリヌクレオチドは、表現型マーカーであってもよい。表現型マーカーは、ス
クリーニング可能なマーカー、または選択可能なマーカーであり、ポジティブ選択可能な
マーカーであるかネガティブ選択可能なマーカーであるかに拘らない、視覚によるマーカ
ーおよび選択可能なマーカーが挙げられる。あらゆる表現型マーカーが用いられ得る。具
体的に、選択可能なマーカーまたはスクリーニング可能なマーカーは、多くの場合特定の
条件下で、これを含有する分子または細胞を同定して、これらを選択し、または排除する
ことを可能にするＤＮＡセグメントを含む。これらのマーカーは、活性、例えば、以下に
限定されないが、ＲＮＡ、ペプチド、またはタンパク質の産生をコードしてもよいし、Ｒ
ＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機化合物および有機化合物、または組成物等に結合部位
を提供してもよい。
本明細書で使用する場合、「核酸」はポリヌクレオチドを意味しており、デオキシリボ
ヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリマーを
含む。核酸はまた、断片および改変ヌクレオチドを含んでよい。したがって、用語「ポリ
ヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」および「核酸断片」は、互換的に
使用され、一本鎖または二本鎖で、場合により合成ヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチ
ド塩基または改変ヌクレオチド塩基を含むＲＮＡおよび／またはＤＮＡのポリマーを示す
。ヌクレオチド（通常、５’−一リン酸塩形態で見出される）は、単一文字表示により、
以下のように称される：アデノシンまたはデオキシアデノシンに対し（それぞれ、ＲＮＡ
またはＤＮＡに対し）「Ａ」、シトシンまたはデオキシシトシンに対し「Ｃ」、グアノシ
ンまたはデオキシグアノシンに対し「Ｇ」、ウリジンに対し「Ｕ」、デオキシチミジンに
対し「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）に対し「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）に対し「Ｙ
」、ＧまたはＴに対し「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴに対し「Ｈ」、イノシンに対し「Ｉ」
、および任意のヌクレオチドに対し「Ｎ」。
「オープンリーディングフレーム」は、ＯＲＦと略される。
用語「機能的に等価である小断片」および「機能的に等価な小断片」は、本明細書で互
換的に使用される。これらの用語は、断片または小断片が活性酵素をコードしているか否
かに関わらず、遺伝子発現を変更し得る能力、またはある特定の表現型を生成する能力が
保持されている、単離核酸断片の一部またはサブ配列を指す。例えば、断片または小断片
は、形質転換植物に所望の表現型を生じさせる遺伝子の設計に使用することができる。遺
伝子は、その核酸断片または小断片を、それが活性酵素をコードするか否かに関わらず、
植物プロモーター配列に対してセンスまたはアンチセンス配向で結合させることにより、
抑制的に使用されるように設計することができる。
用語「保存ドメイン」または「モチーフ」は、進化的に関連したタンパク質のアライン
された配列に沿って特定の位置に保存される一連のアミノ酸を意味する。他の位置のアミ
ノ酸が相同タンパク質間で変動し得るが、一方、特定の位置に高度に保存されるアミノ酸
は、タンパク質の構造、安定性または活性に必須のアミノ酸を意味する。それらは、その
タンパク質相同体ファミリーのアラインされた配列の高い保存度によって同定されるため
、新しく決定された配列を有するタンパク質が予め同定されたタンパク質ファミリーに属
するか否かを決定する識別子または「シグネチャー」として使用することができる。
ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列、その変異体、ならびにこれらの配列の
構造的関係は、「相同」、「相同の」、「実質的に同一の」、「実質的に類似の」および
「実質的に対応する」という用語によって記載され、これらの用語は本明細書で互換的に
使用される。これらは、１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド塩基の変化が、分子の機
能、例えば、遺伝子の発現を仲介し、ある特定の表現型を生じさせる能力に影響すること
のないポリペプチド断片または核酸断片を指す。これらの用語はまた、得られる核酸断片
の機能特性が、所期の改変されていない断片と比較して実質的に変わらない核酸断片の改
変を指す。これらの改変には、核酸断片中の１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換および
／または挿入が含まれる。
実質的に類似の核酸配列に包含されるものは、（中度のストリンジェンシー条件下、例
えば、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃で）本明細書に例示した配列と、または
本明細書に開示したヌクレオチド配列の任意の部分にハイブリダイズする能力によって規
定することができ、それらは本明細書に開示した核酸配列のいずれかと機能的に等価であ
る。ストリンジェンシー条件を調節して、中度の類似性を有する断片、例えば遠縁の生命
体由来の相同配列を、高い類似性を有する断片、例えば近縁の生命体由来の機能酵素を複
製する遺伝子などに対しスクリーニングすることができる。ポストハイブリダイゼーショ
ン洗浄がストリンジェンシー条件を決定する。
用語「選択的にハイブリダイズする」には、ストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件下での、核酸配列の特定の核酸標的配列への、非標的核酸配列へのハイブリダイゼ
ーションより高い検出度（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）のハイブリダイ
ゼーション、および非標的核酸の実質的排除が含まれる。選択的にハイブリダイズする配
列は、通常、互いに少なくとも８０％または９０％、最大で１００％の（すなわち、完全
相補の）の配列同一性を有する。
用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件」には、インビトロのハイブリダイゼーション分析において、プローブがその標的配
列に選択的にハイブリダイズする条件が含まれる。ストリンジェントな条件は、配列に依
存し、また、環境が変わると異なるであろう。ハイブリダイゼーション条件および／また
は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することによって、プローブに対し１００％相補
的な標的配列を特定することができる（相同プロービング）。あるいは、配列の不一致を
許容し、より低い類似性が検出されるように配列の不一致を認めるように、ストリンジェ
ンシー条件を調節することができる（非相同プロービング）。一般に、プローブは長さが
約１０００ヌクレオチド未満であり、場合により５００ヌクレオチド未満である。
通常、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、短いプローブ（例えば、１
０〜５０ヌクレオチド）の場合、少なくとも約３０℃において、また、長いプローブ（例
えば、５０超のヌクレオチド）の場合、少なくとも約６０℃の温度において、塩濃度が、
約１．５Ｍ Ｎａイオン濃度、典型的には約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度である
ものである。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化物質の添加に
より形成することができる。低ストリンジェンシー条件の例としては、３７℃の、３０〜
３５％のホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）からな
る緩衝液によるハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃での１〜２×ＳＳＣ（２０
×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍ クエン酸酸ナトリウム）における洗浄が挙げ
られる。中度ストリンジェンシー条件の例としては、３７℃の、４０〜４５％のホルムア
ミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、および５５〜６０
℃での０．５〜１×ＳＳＣにおける洗浄が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例と
しては、３７℃の、５０％のホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおけるハイブ
リダイゼーション、および６０〜６５℃での０．１×ＳＳＣにおける洗浄が挙げられる。
核酸配列またはポリペプチド配列と関連する「配列同一性」または「同一性」は、特定
の比較窓全体にわたり最大の一致のためにアラインされた場合に同一である２種の配列に
おける核酸塩基またはアミノ酸残基を指す。
用語「配列同一性パーセンテージ」は、比較窓全体にわたり２種の適切にアラインされ
た配列を比較することにより決定される値を指し、比較窓内のポリヌクレオチド配列また
はポリペプチド配列の部分は、これら２種の配列の最適なアラインメントのために、参照
配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を
含む場合がある。このパーセンテージは、両方の配列内で同一の核酸塩基もしくはアミノ
酸残基が発生する位置の数を決定してマッチ位置数を得、このマッチ位置数を比較窓内の
位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性パーセンテージを得ることによ
って算出される。配列同一性パーセントの有用な例としてが、限定はされないが、５０％
、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％、
または５０％〜１００％の任意の整数パーセンテージが挙げられる。これらの同一性は、
本明細書に記載のプログラムのいずれかを使用して決定することができる。
配列アラインメント、および同一性または類似性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥ
ＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．
、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（これに限定されない
）などの、相同配列を検出するために設計された様々な比較方法を使用して決定すること
ができる。本願の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析に使用する場合、別途指定し
ない限り、分析結果は、言及したプログラムの「デフォルト値」をベースとすることは理
解されるであろう。本明細書で使用する場合、「デフォルト値」は、最初に初期化したと
き、ソフトウェアで最初にロードされる値またはパラメータの任意のセットを意味する。
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ方法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ（Ｈｉｇｇｉｎ
ｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉ
ｎｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ ８：１８９
−１９１に記載されている）とラベルされ、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティク
スコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の
ＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム中にあるアラインメント方法に対応する。多重アラ
インメントの場合、デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ ＬＥ
ＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ方法を使用するタンパク質
配列のペアワイズアラインメント用の、および同一性パーセント算出用のデフォルトパラ
メータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤ
ＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸の場合、これらのパラメータは、ＫＴＵ
ＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ
ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを使用した配列のアラインメン
トの後、同じプログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性パーセント」
を得ることができる。
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ方法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｈｉｇｇｉｎ
ｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉ
ｎｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ ８：１８９
−１９１に記載されている）とラベルされ、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティク
スコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の
ＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム中にあるアラインメント方法に対応する。
多重アラインメント用のデフォルトパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ
ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ（
％）＝３０、ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍ
ａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用した配列のアラインメント
の後、同じプログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性パーセント」を
得ることができる。
別途指定しない限り、本明細書に示される配列同一性／類似性値は、以下のパラメータ
を用いるＧＡＰＶｅｒｓｉｏｎ１０（ＧＣＧ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、
ＣＡ）を使用して得られた値を指す：ヌクレオチド配列の同一性％および類似性％は、ギ
ャップ生成ペナルティウエイト５０、ギャップ長伸長ペナルティウエイト３、およびｎｗ
ｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用；アミノ酸配列の同一性％およ
び類似性％は、ギャップ生成ペナルティウエイト８、ギャップ長伸長ペナルティ２、およ
びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅ
ｎｉｋｏｆｆ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１
０９１５）。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ
Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：４４３−５３のアルゴリズムを使用して、一致した数を最大化
し、ギャップ数を最小限に抑える２種の配列全体のアラインメントを見出す。ＧＡＰは、
全ての可能なアラインメントおよびギャップ位置を考慮し、一致した塩基の単位でギャッ
プ生成ペナルティおよびギャップ伸長ペナルティを使用して、一致した塩基の最大数およ
び最小のギャップを有するアラインメントを作成する。
「ＢＬＡＳＴ」は、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆ
ｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）によって提
供されている、生物学的配列の類似領域を見出すために使用される検索アルゴリズムであ
る。このプログラムでは、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列を配列データベースと
比較し、一致の統計学的有意性を計算して、問い合わせ配列に十分類似した配列を、類似
性がランダムに起こったと予想されないように特定する。ＢＬＡＳＴは特定された配列お
よびそれらの問い合わせ配列に対するローカルアライメントを報告する。
多くのレベルの配列同一性が、その他の種からのまたは天然にもしくは合成により改変
されているポリペプチド（そのようなポリペプチドは同一のまたは類似した機能または活
性を有する）の特定に有用であることは当業者によく理解されるであろう。同一性パーセ
ントの有用な例としては、限定はされないが、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％
、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％または５０％〜１００％の任意の整数
パーセンテージが挙げられる。実際に、５０％〜１００％の任意の整数のアミノ酸同一性
、例えば、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％
、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％
、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％
、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％
、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９
９％の同一性は、本開示の説明に有用であり得る。
「遺伝子」は、機能分子、例えば、限定はされないが、コード配列の前（５’非コード
配列）および後（３’非コード配列）の調節配列などの特定のタンパク質などを発現する
核酸断片を含む。「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出される遺伝子
を指す。
「変異遺伝子」は、ヒトが介入して改変された遺伝子である。そのような「変異遺伝子
」は、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失または置換によって、対応する非変異
遺伝子と異なる配列を有する。本開示のある特定の実施形態では、変異遺伝子は、本明細
書で開示するガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムの結果として
生じる変更を含む。変異植物体は、変異遺伝子を含む植物体である。
本明細書で使用する場合、「標的型変異」は、本明細書で開示する、または当該技術分
野で知られる標的配列のＤＮＡに二本鎖切断を導入することができる二本鎖切断誘導剤を
含む方法を使用して、天然遺伝子内の標的とされる配列を変更することによりなされた天
然遺伝子中の変異のことである。
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ誘導標的型変異は、Ｃａｓエンドヌクレアー
ゼによって認識され切断されるゲノム標的部位の中または外に位置するヌクレオチド配列
で起こり得る。
突然変異効率が、本明細書中に記載されるようにして計算されてよい（実施例参照）。
ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合した
Ｐｏｌ−ＩＩプロモーターを含む組み換えＤＮＡ発現カセットに由来し、前記ガイドＲＮ
Ａが、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成することができ、前記複合
体が、非従来型酵母のゲノム中の標的部位配列に結合することができ、かつこれを切断す
ることができるガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムによって引き起こされ
る突然変異効率は、ガイドＲＮＡが、Ｐｏｌプロモーターを含まない組み換えＤＮＡコン
ストラクトに由来するガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムによって引き起
こされる突然変異頻度と比較されてよい。
用語「ゲノム」は、植物、真菌の酵母に適用する場合、核内で見出される染色体ＤＮＡ
だけでなく、細胞の細胞内構成要素（例えば、ミトコンドリアまたはプラスチド）内で見
出される細胞小器官ＤＮＡも包含する。
「コドン改変遺伝子」または「コドン優先遺伝子」または「コドン最適化遺伝子」とは
、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するように設計されているコドン使用頻度を
有する遺伝子のことである。
［アレル」は、染色体の所与の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態の１つで
ある。染色体の所与の遺伝子座に存在する全てのアレルが同じである場合、その細胞はそ
の遺伝子座でホモ接合性である。染色体の所与の遺伝子座に存在するアレルが異なってい
るなら、その細胞はその遺伝子座でヘテロ接合性である。
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を指す。「
調節配列」は、コード配列の上流（５’−非コード配列）、コード配列内、またはコード
配列の下流（３’−非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、それは関連する
コード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を及ぼす。調
節配列としては、限定はされないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、５’非翻訳配列
、３’非翻訳配列、イントロン、ポリアデニル化標的配列、ＲＮＡプロセシング部位、エ
フェクター結合部位およびステム−ループ構造を挙げることができる。
「植物最適化ヌクレオチド配列」は、植物における発現が増大するように、特に、注目
する１つ以上の植物における発現が増大するように最適化されたヌクレオチド配列である
。例えば、植物最適化ヌクレオチド配列は、例えば、本明細書に開示する二本鎖切断誘導
物質（例えば、エンドヌクレアーゼ）などのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を
、発現を改善するための１つ以上の植物優先コドンを用いて改変することにより、合成す
ることができる。例えば、宿主優先コドンの利用についての考察には、Ｃａｍｐｂｅｌｌ
ａｎｄ Ｇｏｗｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１を参照
されたい。
植物優先遺伝子を合成する方法は、当該技術分野で利用可能である。例えば、米国特許
第５，３８０，８３１号明細書および同第５，４３６，３９１号明細書、ならびにＭｕｒ
ｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７
−４９８（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。植物宿主において遺伝
子発現を高めるためのさらなる配列の改変は知られている。これらの改変としては、例え
ば、疑似のポリアデ二ル化シグナルをコードする１つ以上の配列の除去、１つ以上のエク
ソン−イントロンスプライス部位シグナル、１つ以上のトランスポゾン様反復、および遺
伝子発現に有害なおそれのあるそうしたよく特徴付けられた他の配列が挙げられる。配列
のＧＣ含量は、所与の植物宿主の平均レベル（その宿主植物細胞で発現する既知の遺伝子
を参照して計算される）に調整することができる。可能であれば、１つ以上のｍＲＮＡの
予測されるヘアピン二次構造を避けるために配列を改変する。したがって、本開示の「植
物最適化ヌクレオチド配列」は、そのような配列の改変を１つ以上含む。
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写開始タンパク質の認識および結合
に関与するＤＮＡ領域である。プロモーター配列は近位およびより遠位の上流エレメント
からなり、後者のエレメントはエンハンサーと称されることが多い。「エンハンサー」は
プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーター固有のエレメ
ントであってもよいし、プロモーターのレベルまたは組織特異性を増強するために挿入さ
れた異種エレメントであってもよい。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来して
いてもよいし、天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成
され、かつ／または合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。様々なプロモーターが、
様々な組織型もしくは細胞型で、または様々な発達段階で、または様々な環境条件に応じ
て、遺伝子の発現を誘導し得ることは当業者に理解されている。さらに、殆どの場合に調
節配列の正確な境界が完全には定義されていないことから、いくつかのバリエーションの
ＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有する場合があることは認識されている。殆どの
細胞型で最も多く遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に、「構成型プロモー
ター」と呼ばれている。ある特定のプロモーターが他のものよりより高率でＲＮＡの合成
を誘導することができることが示された。これらは「強力なプロモーター」と呼ばれてい
る。ある特定の他のプロモーターが、特定の細胞型または組織型でのみ高いレベルでＲＮ
Ａの合成を誘導することが示され、プロモーターがある特定の組織で好適にＲＮＡ合成を
誘導し、他の組織では低いレベルでＲＮＡ合成を誘導するなら、「組織特異性プロモータ
ー」または「組織優勢プロモーター」としばしば呼ばれている。植物体に導入されたキメ
ラ遺伝子（または、遺伝子群）の発現パターンはプロモーターによって制御され、特定の
組織型または特定の植物成長段階においてある特定のレベルでキメラ遺伝子または（遺伝
子群）の発現を制御することができる新規なプロモーターを単離することへの関心が依然
存在している。
化学調節プロモーターが用いられて、外因性の化学調節剤の使用により、植物における
遺伝子の発現を調節することができる。当該プロモーターは、化学物質の使用が遺伝子発
現を誘導する化学誘導性プロモーターであってもよいし、化学物質の使用が遺伝子発現を
抑制する化学抑制性プロモーターであってもよい（Ｄｅ Ｖｅｙｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．
，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：５６８−７７）。組織優
先プロモーターが利用されて、特定の植物組織内での発現の増強を標的とすることができ
る（Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ ３８：７９２−８０３）。種子優先プロモーターとして、種子発育中に活性がある
種子特異的プロモーター、および種子発芽中に活性がある種子発芽プロモーターの双方が
挙げられる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ １０：
１０８）。
用語「誘導性プロモーター」は、例えば化学物質（化学誘導剤）による内因性または外
因性刺激に応じて、あるいは、環境シグナル、ホルモンシグナル、化学物質シグナルおよ
び／または発生シグナルに応じて、コード配列または機能性ＲＮＡを選択的に発現するプ
ロモーターを指す。誘導性または調節プロモーターとしては、例えば、光、熱、ストレス
、フラッディングもしくは乾燥、塩ストレス、浸透圧ストレス、植物ホルモン、創傷、ま
たはエタノール、アブシジン酸（ＡＢＡ）、ジャスモネート、サリチル酸もしくは毒性緩
和剤などの化学物質によって誘導または調節されるプロモーターが挙げられる。
本明細書中の特定の態様（例えば、真菌および／または酵母細胞）に有用な強いプロモ
ーターの例として、本明細書中で、米国特許出願公開第２０１２／０２５２０７９号明細
書（ＤＧＡＴ２）、米国特許出願公開第２０１２／０２５２０９３号明細書（ＥＬ１）、
米国特許出願公開第２０１３／００８９９１０号明細書（ＡＬＫ２）、米国特許出願公開
第２０１３／００８９９１１号明細書（ＳＰＳ１９）、米国特許出願公開第２００６／０
０１９２９７号明細書（ＧＰＤおよびＧＰＭ）、米国特許出願公開第２０１１／００５９
４９６号明細書（ＧＰＤおよびＧＰＭ）、米国特許出願公開第２００５／０１３０２８０
号明細書（ＦＢＡ、ＦＢＡＩＮ、ＦＢＡＩＮｍ）、米国特許出願公開第２００６／００５
７６９０号明細書（ＧＰＡＴ）、および米国特許出願公開第２０１０／００６８７８９号
明細書（ＹＡＴ１）に開示されるものが挙げられ、これらの出願は、参照によって本明細
書に組み込まれる。強いプロモーターの他の例として、ＸＰＲ２（米国特許第４９３７１
８９号明細書；ＥＰ２２０８６４号明細書）、ＧＰＤ、ＧＰＭ（米国特許第７２５９２５
５号明細書および米国特許第７４５９５４６号明細書）、ＴＥＦ（米国特許第６２６５１
８５号明細書）、ＧＰＤＩＮ（米国特許第７４５９５４６号明細書）、ＧＰＭ／ＦＢＡＩ
Ｎ（米国特許第７２０２３５６号明細書）、ＦＢＡ、ＦＢＡＩＮ、ＦＢＡＩＮｍ（米国特
許第７２０２３５６号明細書）、ＧＰＡＴ（米国特許第７２６４９４９号明細書）、ＹＡ
Ｔ１（米国特許出願公開第２００６／００９４１０２号明細書）、およびＥＸＰ１（米国
特許第７９３２０７７号明細書）が挙げられる。特定の実施形態に有用な強いプロモータ
ーの他の例として、本明細書中で、ＰＧＫ１、ＡＤＨ１、ＴＤＨ３、ＴＥＦ１、ＰＨＯ５
、ＬＥＵ２、およびＧＡＬ１プロモーター、ならびにＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ
．（Ｃｅｌｌ ８８：２４３−２５１）（参照によって本明細書中に組み込まれる）に開
示される強い酵母プロモーターが挙げられる。
ｔＲＮＡプロモーターとして、当該技術において知られているあらゆるｔＲＮＡ、例え
ば、以下に限定されないが、ｔＲＮＡ−リジン（ｔＲＮＡ−Ｌｙｓ；Ａｃｋｅｒ ｅｔ
ａｌ． ２００８．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓ．３６（１８）：５８３２−５８
４４参照）、ｔＲＮＡ−グルタミン（ｔＲＮＡ−Ｇｌｕ）、ｔＲＮＡ−バリン（ｔＲＮＡ
Ｖａｌ；Ｍａｒｃｋ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｎｕｃｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３４
（６）：１８１６−１８３５）、または細胞中で活性がある他のあらゆるｔＲＮＡ、ｔＲ
ＮＡ−ロイシン（ｔＲＮＡ Ｌｅｕ、ｔＲＮＡ−ｌｅｕ（２）、ｔＲＮＡ−ｌｅｕ（３）
）、ｔＲＮＡ−イソロイシン（ｔＲＮＡ−ｉｌｅ）、ｔＲＮＡ−トリプトファン（ｔＲＮ
Ａ−ｔｒｐ）、ｔＲＮＡ−チロシン（ｔＲＮＡ−ｔｙｒ）、ｔＲＮＡ−ヒスチジン（ｔＲ
ＮＡ−ｈｉｓ；ｔＲＮＡ−ｈｉｓ）をコードするＤＮＡが挙げられる。
「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコード配列との間に位置決めさ
れているポリヌクレオチド配列を指す。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡにおいて、翻訳開
始配列の上流に存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡへの一次転写物のプロセシング
、ｍＲＮＡの安定性、または翻訳効率に影響し得る。５’非翻訳領域とも呼ばれる。翻訳
リーダー配列の例が記載されている（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ ａｎｄ Ｆｏｓｔｅｒ，（
１９９５）Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３：２２５−２３６）。
「３’非コード配列」、「転写ターミネーター」または「終止配列」は、コード配列の
下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセシン
グまたは遺伝子の発現に影響を及ぼすことができる、調節シグナルをコードする他の配列
を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル
酸系の付加に影響することによって特徴付けられる。異なる３’非コード配列の使用は、
Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．、（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：６７
１−６８０に例示されている。
「ＲＮＡ転写物」は、ＲＮＡポリメラーゼにより触媒されるＤＮＡ配列の転写により得
られる産物を指す。ＲＮＡ転写物が、ＤＮＡ配列の完全に相補的なコピーである場合、こ
れは一次転写物またはプレｍＲＡと呼ばれる。ＲＮＡ転写物は、それが一次転写物プレｍ
ＲＮＡｔの転写後のプロセシングで得られたＲＮＡである場合、成熟ＲＮＡまたはｍＲＮ
Ａと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」は、イントロンを有してお
らず、細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ鋳
型に相補的であり、かつ逆転写酵素を使用してｍＲＮＡ鋳型から合成されるＤＮＡを指す
。ｃＤＮＡは単鎖であってよく、あるいはＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片を使
用して、二本鎖形態に変換することができる。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含むＲＮ
Ａ転写物を指し、細胞内またはインビトロでタンパク質に翻訳され得る。「アンチセンス
ＲＮＡ」は、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に対して相補的であり、か
つ標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（例えば米国特許第５，１０７，
０６５号明細書を参照）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物の任意の
部分、すなわち５’末端非コーディング配列、３’末端非コーディング配列、イントロン
またはコーディング配列との相補性であり得る。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮ
Ａ、リボザイムＲＮＡまたはポリペプチドに翻訳され得ないがそれにもかかわらず細胞内
プロセスに影響を及ぼすその他のＲＮＡを指す。用語「相補体」および「逆相補体」はｍ
ＲＮＡ転写物に関して本明細書において互換的に使用され、メッセージのアンチセンスＲ
ＮＡを定義することが意図されている。
本明細書で使用する場合、「作動可能に結合される」という用語は、一方の機能が他方
により調節されるような、単一の核酸断片上の核酸配列の結合を指す。例えば、プロモー
ターは、コード配列の発現を調節することができる場合には、このコード配列に作動可能
に連結されている（すなわち、このコード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コ
ード配列は、センスまたはアンチセンス方向に、作動可能に調節配列と結合することがで
きる。別の例では、相補的ＲＮＡ領域は、直接または間接的に、標的ｍＲＮＡの５’末端
、もしくは標的ｍＲＮＡの３’末端と、または標的ｍＲＮＡ内で作動可能に結合すること
ができるか、あるいは最初の相補的領域は５’末端であり、その相補体は標的ｍＲＮＡの
３’末端である。
本明細書で使用される、標準の遺伝子組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、
当該技術分野ではよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、
ＮＹ（１９８９）に、より詳しく説明されている。形質転換法は当業者にはよく知られて
おり、以下で説明する。
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は特定のＤＮＡセグメントの合成技術であ
り、一連の反復的な変性サイクル、アニーリングサイクルおよび伸長サイクルからなる。
通常、二本鎖ＤＮＡは熱変性を起こし、標的セグメントの３’末端バウンダリーに相補的
な２つのプライマーが低い温度でＤＮＡにアニーリングされ、その後、中間温度で伸長す
る。これら３つの連続した工程の１セットを「サイクル」と呼ぶ。
用語「組み換え」は、例えば化学合成による、または、遺伝子工学技術による核酸の単
離セグメントの操作による、配列の２つの、通常であれば分離しているセグメントの人工
的な結合を指す。
用語「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」は、細胞の中央代謝の一部でな
い遺伝子をしばしば運ぶ、追加の染色体要素を指し、通常、二本鎖ＤＮＡの形態をとる。
そのような要素は、多くのヌクレオチド配列が、目的のポリヌクレオチドを細胞に導入す
ることができる固有の構築物に連結されている、または組み換えられている任意の起源に
由来する、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの、線状のまたは環状の、自律的に
複製する配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であることができ
る。「形質転換カセット」は、遺伝子を含み、かつ、遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の
形質転換を促進する要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、遺伝子を
含み、かつ、遺伝子に加えて、宿主にその遺伝子を発現させることのできる要素を有する
特定のベクターを指す。
用語「組み換えＤＮＡ分子」、「組み換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」
、「コンストラクト」、「コンストラクト」および「組み換えＤＮＡコンストラクト」は
、本明細書では互換的に使用される。組み換えコンストラクトは、自然界では一緒に見出
されるとは限らない、核酸断片、例えば、調節配列およびコード配列の人工的な組み合わ
せを含む。例えば、コンストラクトは、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列
を含み得るか、または同一起源に由来するが、自然界に見出されるのとは異なる方法で配
列された調節配列およびコーディング配列を含み得る。そのようなコンストラクトは、そ
れだけで使用し得るか、またはベクターと共に使用し得る。ベクターが使用される場合、
ベクターの選択は、当業者にはよく知られているように、宿主細胞を形質転換するために
使用する方法に依存する。例えばプラスミドベクターを使用することができる。熟練した
職人は、宿主細胞を成功裡に形質転換し、選択し、そして増殖させるために、ベクター上
に存在しなければならない遺伝要素をよく知っている。熟練した職人は、また、異なる、
独立した形質転換イベントは、異なる発現レベルとパターンをもたらすこと（Ｊｏｎｅｓ
ｅｔ ａｌ．，（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ ４：２４１１−２４１８；Ｄｅ Ａｌｍｅ
ｉｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１８：７８
−８６）、したがって、所望の発現レベルとパターンを示す系統を得るためには、多重イ
ベントは通常スクリーニングされることも認識するであろう。そのようなスクリーニング
は、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、ＰＣＲ、実時間定量ＰＣＲ（ｑ
ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、タンパク質発現の免疫ブロッティング、酵素
もしくは活性分析、および／または表現型分析を含む、標準の分子生物学的、生化学的お
よび他の分析法により行い得る。
用語「発現」は、本明細書で使用する場合、前駆体または成熟型のいずれかの形態の機
能的最終産物（例えばｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡまたはタンパク質）の産生を指す。
用語「提供」は、核酸（例えば発現コンストラクト）、またはペプチド、ポリペプチド
もしくはタンパク質を細胞に提供することを含む。提供は、核酸またはポリペプチドの、
真核生物または原核生物の細胞中への組み込みであって、核酸が細胞のゲノム中に組み込
まれ得る組み込みへの言及を含み、そして核酸またはタンパク質の、細胞への一過性の提
供への言及を含む。提供は、安定した、または一過性の形質転換法、形質移入、形質導入
、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ウィルス法、アグロバクテリウ
ム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属媒介形質転換、弾道粒子加速、および有性交雑への
言及を含む。ゆえに、核酸断片（例えば、組み換えＤＮＡコンストラクト／発現コンスト
ラクト、ガイドＲＮＡ、ガイドＤＮＡ、鋳型ＤＮＡ、ドナーＤＮＡ）を細胞中に挿入する
という文脈での「提供」は、「形質移入」、「形質転換」、または「形質導入」を含み、
そして真核または原核細胞の細胞中への核酸断片の組み込みへの言及を含み、ここで核酸
断片は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリ
アＤＮＡ）中に組み込まれてもよいし、自律性レプリコンに変換されてもよいし、一時的
に発現されてもよい（例えば、形質移入されるｍＲＮＡ）。
組成物（例えばヌクレオチド配列、ペプチド、またはポリペプチド）を生物に接触させ
、提供し、かつ／または導入する種々の方法が知られており、安定形質転換法、一過性形
質転換法、ウィルス媒介法、有性交雑、および有性育種が挙げられる。安定形質転換は、
導入されたポリヌクレオチドが、生物のゲノム中に組み込まれて、その後代によって遺伝
され得ることを示す。一過性形質転換は、導入された組成物が、生物中で一時的にしか発
現されない、または存在しないことを示す。
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの細胞または生命体への接触、提供、導入のため
のプロトコルは知られており、マイクロインジェクション法（Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ
ａｌ．，（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：３２０−３４および米国特許第
６，３００，５４３号明細書）、分裂組織形質転換法（米国特許第５，７３６，３６９号
明細書）、エレクトロポレーション法（Ｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５６０２−６、アグロバクテリウム（
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属媒介形質転換法（米国特許第５，５６３，０５５号明細
書および同第５，９８１，８４０号明細書）、遺伝子直接導入法（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ
ｅｔ ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯＪ３：２７１７−２２）および弾道粒子加速法（
米国特許第４，９４５，０５０号明細書；同第５，８７９，９１８号明細書；同第５，８
８６，２４４号明細書；同第５，９３２，７８２号明細書；Ｔｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，
（１９９５）”Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｐ
ｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅ
ｎｔ” ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．Ｇａｍｂｏｒｇ ＆ Ｐｈｉｌ
ｌｉｐｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３−６；Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ２２：４２１−７７；Ｓ
ａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：２７−３７（ｏｎｉｏｎ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅ
ｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８７：６７１−４（ｓｏｙｂｅ
ａｎ）；Ｆｉｎｅｒ ａｎｄ ＭｃＭｕｌｌｅｎ，（１９９１）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅ
ｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２７Ｐ：１７５−８２（ｓｏｙｂｅａｎ）；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ
ａｌ，（１９９８）Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ９６：３１９−２４（ｓｏｙ
ｂｅａｎ）；Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８
：７３６−４０（ｒｉｃｅ）；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４３０５−９（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎ
ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：５５９−６３（トウモロ
コシ）；米国特許第５，２４０，８５５号明細書；同第５，３２２，７８３号明細書およ
び同第５，３２４，６４６号明細書；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｌａｎ
ｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ９１：４４０−４（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．，
（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３−９（トウモロコシ）；Ｈｏｏｙ
ｋａａｓ−Ｖａｎ Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３
１１：７６３−４；米国特許第５，７３６，３６９号明細書（穀草類）；Ｂｙｔｅｂｉｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４
：５３４５−９（ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ））；Ｄｅ Ｗｅｔ ｅｔ ａｌ，（１９
８５）ｉｎ Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏ
ｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ，ｅｄ．Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｌｏｎｇｍａｎ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．１９７−２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．
，（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ９：４１５−８）およびＫａｅｐｐｌｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ８４：５６０−６
（ウィスカー媒介形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａ
ｎｔ Ｃｅｌｌ４：１４９５−５０５（エレクトロポレーション）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．
，（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １２：２５０−５；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ
ａｎｄ Ｆｏｒｄ（１９９５）Ａｎｎａｌｓ Ｂｏｔａｎｙ ７５：４０７−１３（コメ
）ならびにＯｓｊｏｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
１４：７４５−５０（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）経由トウモロコシ）が含まれる。
あるいは、ポリヌクレオチドは、細胞または生命体とウィルスまたはウィルス性核酸と
を接触させることにより、細胞または生命体に導入され得る。一般に、そうした方法は、
ポリヌクレオチドをウィルス性ＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に組み込むことを含む。いくつ
かの実施例では、目的のポリペプチドは、最初、ウィルス性ポリタンパク質の一部として
合成され、これは、後でインビボまたはインビトロのタンパク質分解処理を受けて、所望
の組み換えタンパク質を生成し得る。ウィルス性ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含む、ポリヌ
クレオチドを植物体に導入し、そこにコードされているタンパク質を発現させる方法は知
られており、例えば、米国特許第５，８８９，１９１号明細書、同第５，８８９，１９０
号明細書、同第５，８６６，７８５号明細書、同第５，５８９，３６７号明細書および同
第５，３１６，９３１号明細書を参照されたい。一過性形質転換法は、限定はされないが
、二本鎖切断誘発剤などのポリペプチドの生命体への直接導入、ＤＮＡおよび／またはＲ
ＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドの導入、および二本鎖切断誘発剤をコード
するｍＲＮＡなどのＲＮＡ転写物の生命体への導入を含む。そのような方法は、例えば、
マイクロインジェクション法または粒子撃ち込み法を含む。例えば、Ｃｒｏｓｓｗａｙ
ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２０２：１７９−８５；Ｎｏ
ｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ ４４：５３−８；Ｈｅｐｌ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９
１：２１７６−８０；およびＨｕｓｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃ
ｉ １０７：７７５−８４を参照されたい。
ガイドされたＣａｓシステムの、いずれかのまたは全ての構成要素（タンパク質および
／または核酸）の摂取を容易にする分子を使用する方法、例えば細胞貫通ペプチドおよび
ナノキャリアを含む任意の方法で、核酸およびタンパク質を、細胞に提供することができ
る。米国特許出願公開第２０１１／００３５８３６号明細書 Ｎａｎｏｃａｒｉｅｒ ｂ
ａｓｅｄ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ
、および欧州特許出願公開第２８２１４８６Ａ１号明細書Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｉｎｔｒ
ｏｄｕｃｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｉｎｔｏ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ（参照
により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
細胞へのガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の提供は、細胞への前記複合
体の個々の構成要素の直接的な、または組み換えコンストラクトを介した提供を含み、そ
して細胞への複合体全体の同様の提供を含む。
「安定な形質転換」は、核酸断片が、核ゲノムおよび細胞小器官ゲノムの両者を含む、
宿主生命体のゲノムへ移動し、遺伝子的に安定な継承をもたらすことを指す。対照的に「
一過性形質転換」は、核酸断片が、宿主生命体の核または他のＤＮＡ含有細胞小器官へ移
動し、組み込まれることなく、あるいは安定に継承されずに発現することを指す。形質転
換された核酸断片を含む宿主生命体を「トランスジェニック」生命体と称する。
用語「細胞」は、本明細書中で、あらゆるタイプの細胞、例えば原核生物または真核生
物の細胞を指す。真核生物の細胞は、核および他の膜包囲構造（細胞小器官）を有するが
、原核生物の細胞は、核を欠く。特定の実施形態における細胞は、哺乳動物細胞であって
も非哺乳動物細胞であってもよい。非哺乳動物細胞は、真核生物の細胞であっても原核生
物の細胞であってもよい。例えば、非哺乳動物細胞は、本明細書中で、微生物の細胞、ま
たは非哺乳動物多細胞生物、例えば植物、昆虫、線虫、鳥類種、両生類、爬虫類もしくは
魚類の細胞を指し得る。
用語「対照細胞」および「適切な対照細胞」は、本明細書中で互換的に用いられて、特
定の改変（例えば、ポリヌクレオチドの過剰発現、ポリヌクレオチドのダウンレギュレー
ション）がなされる細胞（すなわち「実験細胞」）に対して言及され得る。対照細胞は、
実験細胞の特定の改変を有してもいないし発現もしないあらゆる細胞であってよい。ゆえ
に、対照細胞は、非形質転換野生型細胞であってもよいし、遺伝的に形質転換されていて
もよいが、遺伝的形質転換を発現しない。例えば、対照細胞は、実験細胞の直接の親であ
ってよく、この直接の親細胞は、実験細胞中に存在する特定の改変を有していない。これ
以外にも、対照細胞は、一世代以上によって除去される実験細胞の親であってもよい。こ
れ以外にも、対照細胞は、実験細胞のきょうだいであってもよく、このきょうだいは、実
験細胞中に存在する特定の改変を含まない。
微生物細胞は、本明細書中で、例えば、真菌細胞（例えば酵母細胞）、原核生物細胞、
原生生物細胞（例えば藻類細胞）、ユーグレナ細胞、ストラメノパイル細胞、または卵菌
綱細胞を指し得る。原核生物細胞は、本明細書中で、例えば、細菌細胞または古細菌細胞
を指し得る。真菌細胞（例えば酵母細胞）、原生生物細胞（例えば藻類細胞）、ユーグレ
ナ細胞、ストラメノパイル細胞、および卵菌綱細胞は、真核生物の微生物細胞の例を示す
。真核生物の微生物細胞は、核および他の膜包囲構造（細胞小器官）を有するが、原核生
物の細胞は、核を欠く。
用語「酵母」は、本明細書中で、単細胞の形態で主に存在する真菌種を指す。酵母は代
わりに「酵母細胞」と呼ばれ得る。特定の態様の酵母は、本明細書中で、無性生殖（アナ
モルフィック）または有性生殖（テレオモルフィック）で繁殖する酵母であってよい。酵
母は、本明細書中で典型的に、単細胞の形態で存在する一方、当該酵母の特定のタイプは
、場合によっては、偽菌糸（連結された出芽性細胞のストリング）を形成することができ
る。さらなる態様において、酵母は、半数体であっても二倍体であってもよく、かつ／ま
たはこれらの倍数性形態のいずれでも存在する能力を有してもよい。酵母は、本明細書中
で、例えば、従来型酵母または非従来型酵母のいずれかとして特徴付けられ得る。
用語「従来型酵母」（「モデル酵母」）は、本明細書中で、一般にサッカロミセス（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属またはシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ）属の酵母種を指す。従来型酵母として、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によ
って媒介される修復プロセスよりも、相同組み換え（ＨＲ）ＤＮＡ修復プロセスを優先す
る酵母が挙げられる。従来型酵母の例として、本明細書中で、サッカロミセス（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の種（例えば、出芽酵母、パン酵母、および／または醸造酵母と
しても知られているサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；サッカ
ロミセス・バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）；サッカロミセス・ボウラルディイ（Ｓ．ｂ
ｏｕｌａｒｄｉｉ）；サッカロミセス・ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）；サッカロミセ
ス・カリオカヌス（Ｓ．ｃａｒｉｏｃａｎｕｓ）；サッカロミセス・カリオカス（Ｓ．ｃ
ａｒｉｏｃｕｓ）；サッカロミセス・チェバリエリ（Ｓ．ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）；サッ
カロミセス・ダイレネンシス（Ｓ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）；サッカロミセス・エリプ
ソイデウス（Ｓ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）；サッカロミセス・ユーバヤヌス（Ｓ．ｅ
ｕｂａｙａｎｕｓ）；サッカロミセス・エクシグウス（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）；サッカロ
ミセス・フロレンティヌス（Ｓ．ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ）；サッカロミセス・クルイベ
リ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）；サッカロミセス・マティニアエ（Ｓ．ｍａｒｔｉｎｉａｅ
）；サッカロミセス・モナケンシス（Ｓ．ｍｏｎａｃｅｎｓｉｓ）；サッカロミセス・ノ
ルベンシス（Ｓ．ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）；サッカロミセス・パラドクスス（Ｓ．ｐａｒａ
ｄｏｘｕｓ）；サッカロミセス・パストリアヌス（Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）；サッ
カロミセス・スペンケロルム（Ｓ．ｓｐｅｎｃｅｒｏｒｕｍ）；サッカロミセス・トゥリ
センシス（Ｓ．ｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ）；サッカロミセス・ウニスポルス（Ｓ．ｕｎｉｓ
ｐｏｒｕｓ）；サッカロミセス・ウバルム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）；サッカロミセス・ゾナ
ツス（Ｓ．ｚｏｎａｔｕｓ））、およびシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ）属の種（例えば、分裂酵母としても知られているシゾサッカロミセス・
ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）；シゾサッカロミセス・クリオフィルス（Ｓ．ｃｒｙｏｐｈｉ
ｌｕｓ）；シゾサッカロミセス・ジャポニクス（Ｓ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）；シゾサッカ
ロミセス・オクトスポルス（Ｓ．ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ））が挙げられる。
用語「非従来型酵母」は、本明細書中で、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ）属の酵母種（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））
またはシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母種では
ないあらゆる酵母を指す。非従来型酵母は、Ｎｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｙｅａ
ｓｔｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ．Ｗｏｌｆ，Ｋ．Ｄ．Ｂｒ
ｅｕｎｉｇ，Ｇ．Ｂａｒｔｈ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉ
ｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００３）に記載されており、この文献は参照によって本明細書に
組み込まれる。特定の実施形態における非従来型酵母は、追加的に（または代わりに）、
相同組み換え（ＨＲ）によって媒介される修復プロセスよりも、非相同末端結合（ＮＨＥ
Ｊ）ＤＮＡ修復プロセスを優先する酵母であってよい。
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびシゾサッカロミセス
・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）等の従来型酵母は、典型的に、ドナーＤＮＡの、短いフラン
キング相同アーム（３０〜５０ｂｐ）との特異的な統合を示し、効率はルーチン的に７０
％を超える。一方、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・
スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａ
ｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉ
ａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、およびクルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）等の非従来型酵母は、通常、類似した構造のドナーＤＮＡと
の特異的な統合を示し、効率は１％未満である（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏ
ＮＥ ８：ｅ５７９５２）。ゆえに、ＨＲプロセスの優先度が、例えば、酵母を適切なド
ナーＤＮＡで形質転換して、ドナーＤＮＡによって標的とされると予測されるゲノム部位
と特異的に組み換えられる程度を判定することによって、評価され得る。そのようなアッ
セイにより、酵母ゲノムにおけるドナーＤＮＡのランダムな統合の程度が高いならば、例
えば、ＮＨＥＪの優先度が明らかであろう（すなわちＨＲの優先度が低い）。酵母におけ
るＤＮＡの特異的な（ＨＲ媒介）、かつ／またはランダムな（ＮＨＥＪ媒介）統合の割合
を判定するアッセイが、当該技術において知られている（例えば、Ｆｅｒｒｅｉｒａ ａ
ｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１８：２２４９−２２５４；Ｃｏｒｒｉｇａ
ｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８：ｅ６９６２８；Ｗｅａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：６３５４−６３５８；Ｋ
ｅｅｎｅｙ ａｎｄ Ｂｏｅｋｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３６：８４９−８５６）。
ＨＲ活性の低いレベルを考えると、本明細書中の非従来型酵母は、（ｉ）３０〜５０ｂ
ｐのフランキング相同アームを有する適切なドナーＤＮＡによる特異的なターゲティング
率が、例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、もしくは８％未満である
ことを示し得、かつ／または（ｉｉ）前述のドナーＤＮＡのランダムな統合率が、例えば
、約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４
％、もしくは７５％超であることを示し得る。適切なドナーＤＮＡのこれらの（ｉ）特異
的なターゲティング率、および／または（ｉｉ）ランダムな統合率は、非従来型酵母を特
徴付けることができる。というのも、本明細書中に開示されるＲＧＥＮが提供されるより
も前から存在するためである。特定の実施形態においてＲＧＥＮを非従来型酵母に提供す
る目的は、特定の部位にて酵母をＨＲに偏らせるための部位特異的ＤＮＡ一本鎖切断（Ｓ
ＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせることである。ゆえに、非従来型酵母にお
いて適切なＲＧＥＮを提供することで、典型的に、酵母は、特定のドナーＤＮＡとのＨＲ
率の増大を示すことができるはずである。そのような率の増大は、適切な対照（例えば、
適切なＲＧＥＮを欠く以外は同じドナーＤＮＡで形質転換された同じ非従来型酵母）のＨ
Ｒ率よりも少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍高くなり得る。
非従来型酵母は、本明細書中で、当該技術において知られるあらゆる手段に従って培養
されてよく、例えば、Ｎｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｙｅａｓｔｓ ｉｎ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ．Ｗｏｌｆ，Ｋ．Ｄ．Ｂｒｅｕｎｉｇ，Ｇ．Ｂａ
ｒｔｈ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，
２００３）、Ｙｅａｓｔｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｈ
ａｂｉｔａｔｓ（Ｊ．Ｆ．Ｔ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｅｄｓ．，Ｓ
ｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９７）、および／
またはＹｅａｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ Ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｔ．Ｓａｔｙａｎａｒａｙａｎａ，Ｇ．Ｋｕｎｚｅ，Ｅｄｓ．，Ｓ
ｐｒｉｎｇｅｒ，２００９）に記載されており、これらの文献は全て、参照によって本明
細書に組み込まれる。
本明細書中の非従来型酵母の非限定的な例として、以下の属の酵母が挙げられる：ヤロ
ウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シュワニオミセス（Ｓｃｈ
ｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ア
ルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、カンデ
ィダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トルロプシス（Ｔｏ
ｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属
、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ
）属、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、パキソレン（Ｐａｃｈｙ
ｓｏｌｅｎ）属、およびモニリエラ（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ）属。ヤロウイア（Ｙａｒｒ
ｏｗｉａ）属種の適切な例として、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａ）がある。ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属種の適切な例として、ピキア・パストリス（Ｐ．
ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・ス
ティピティス（Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ピキア・アノマーラ（Ｐ．ａｎｏｍａｌａ）、
およびピキア・アングスタ（Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ）が挙げられる。シュワニオミセス（Ｓ
ｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属種の適切な例として、シュワニオミセス・カステリィ（
Ｓ．ｃａｓｔｅｌｌｉｉ）、シュワニオミセス・アルビウス（Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ）、
シュワニオミセス・ホミニス（Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、シュワニオミセス・オキシデンタ
リス（Ｓ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、シュワニオミセス・カプリオッティ（Ｓ．ｃａ
ｐｒｉｏｔｔｉｉ）、シュワニオミセス・エチェルシィ（Ｓ．ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ）、
シュワニオミセス・ポリモルファス（Ｓ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ）、シュワニオミセス
・シュードポリモルファス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ）、シュワニオミ
セス・バンリジエ（Ｓ．ｖａｎｒｉｊｉａｅ）、およびシュワニオミセス・ヤマダエ（Ｓ
．ｙａｍａｄａｅ）が挙げられる。クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属
種の適切な例として、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロ
ミセス・マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイベロミセス・フラギリス（
Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロミセス・ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉ
ｌａｒｕｍ）、クルイベロミセス・サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎ
ｓ）、クルイベロミセス・ファゼオロスポラス（Ｋ．ｐｈａｓｅｏｌｏｓｐｏｒｕｓ）、
クルイベロミセス・バヌデニィ（Ｋ．ｖａｎｕｄｅｎｉｉ）、クルイベロミセス・ワルテ
ィ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）、クルイベロミセス・アフリカヌス（Ｋ．ａｆｒｉｃａｎｕｓ）
、およびクルイベロミセス・ポリスポラス（Ｋ．ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｓ）が挙げられる。
アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属種の適切な例として、アルクスラ・アデニニボランス（Ａ
．ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）およびアルクスラ・テレストレ（Ａ．ｔｅｒｒｅｓｔｒ
ｅ）が挙げられる。トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属種の適切な例として
、トリコスポロン・クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、トリコスポロン・キャピタト
ゥム（Ｔ．ｃａｐｉｔａｔｕｍ）、トリコスポロン・インキン（Ｔ．ｉｎｋｉｎ）、およ
びトリコスポロン・ビーメリ（Ｔ．ｂｅｅｍｅｒｉ）が挙げられる。カンディダ（Ｃａｎ
ｄｉｄａ）属種の適切な例として、カンディダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）
、カンディダ・アスカラフィダルム（Ｃ．ａｓｃａｌａｐｈｉｄａｒｕｍ）、カンディダ
・アムフィキシエ（Ｃ．ａｍｐｈｉｘｉａｅ）、カンディダ・アンタークティカ（Ｃ．ａ
ｎｔａｒｃｔｉｃａ）、カンディダ・アピコーラ（Ｃ．ａｐｉｃｏｌａ）、カンディダ・
アルゲンティア（Ｃ．ａｒｇｅｎｔｅａ）、カンディダ・アトランティカ（Ｃ．ａｔｌａ
ｎｔｉｃａ）、カンディダ・アトモスファェリカ（Ｃ．ａｔｍｏｓｐｈａｅｒｉｃａ）、
カンディダ・ブラッテ（Ｃ．ｂｌａｔｔａｅ）、カンディダ・ブロメリアセアルム（Ｃ．
ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｒｕｍ）、カンディダ・カルポフィラ（Ｃ．ｃａｒｐｏｐｈｉｌ
ａ）、カンディダ・カルバジャリス（Ｃ．ｃａｒｖａｊａｌｉｓ）、カンディダ・セラム
ビシダルム（Ｃ．ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｒｕｍ）、カンディダ・チャウリオデス（Ｃ．
ｃｈａｕｌｉｏｄｅｓ）、カンディダ・コリダリ（Ｃ．ｃｏｒｙｄａｌｉ）、カンディダ
・ドッセイ（Ｃ．ｄｏｓｓｅｙｉ）、カンディダ・デュブリニエンシス（Ｃ．ｄｕｂｌｉ
ｎｉｅｎｓｉｓ）、カンディダ・エルガテンシス（Ｃ．ｅｒｇａｔｅｎｓｉｓ）、カンデ
ィダ・フルクトゥス（Ｃ．ｆｒｕｃｔｕｓ）、カンディダ・グラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒ
ａｔａ）、カンディダ・フェルメンタティ（Ｃ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、カンディダ・
ギリエルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンディダ・ハエムロニィ（
Ｃ．ｈａｅｍｕｌｏｎｉｉ）、カンディダ・インセクタメンス（Ｃ．ｉｎｓｅｃｔａｍｅ
ｎｓ）、カンディダ・インセクトルム（Ｃ．ｉｎｓｅｃｔｏｒｕｍ）、カンディダ・イン
テルメディア（Ｃ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、カンディダ・イェフレシィ（Ｃ．ｊｅｆｆ
ｒｅｓｉｉ）、カンディダ・ケフィア（Ｃ．ｋｅｆｙｒ）、カンディダ・ケロセニエ（Ｃ
．ｋｅｒｏｓｅｎｅａｅ）、カンディダ・クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、カンディダ・
ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンディダ・リキソソフィラ（Ｃ．ｌｙｘｏ
ｓｏｐｈｉｌａ）、カンディダ・マルトーサ（Ｃ．ｍａｌｔｏｓａ）、カンディダ・マリ
ーナ（Ｃ．ｍａｒｉｎａ）、カンディダ・メンブラニファシエンス（Ｃ．ｍｅｍｂｒａｎ
ｉｆａｃｉｅｎｓ）、カンディダ・ミレリ（Ｃ．ｍｉｌｌｅｒｉ）、カンディダ・モギィ
（Ｃ．ｍｏｇｉｉ）、カンディダ・オレオフィラ（Ｃ．ｏｌｅｏｐｈｉｌａ）、カンディ
ダ・オレゴネンシス（Ｃ．ｏｒｅｇｏｎｅｎｓｉｓ）、カンディダ・パラシローシス（Ｃ
．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンディダ・クエルシトルーサ（Ｃ．ｑｕｅｒｃｉｔｒ
ｕｓａ）、カンディダ・ルゴサ（Ｃ．ｒｕｇｏｓａ）、カンディダ・サケ（Ｃ．ｓａｋｅ
）、カンディダ・シェハテア（Ｃ．ｓｈｅｈａｔｅａ）、カンディダ・テムノキラエ（Ｃ
．ｔｅｍｎｏｃｈｉｌａｅ）、カンディダ・テヌイス（Ｃ．ｔｅｎｕｉｓ）、カンディダ
・テアエ（Ｃ．ｔｈｅａｅ）、カンディダ・トレランス（Ｃ．ｔｏｌｅｒａｎｓ）、カン
ディダ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンディダ・ツチヤエ（Ｃ．ｔｓ
ｕｃｈｉｙａｅ）、カンディダ・シノラボランティウム（Ｃ．ｓｉｎｏｌａｂｏｒａｎｔ
ｉｕｍ）、カンディダ・ソーヤ（Ｃ．ｓｏｊａｅ）、カンディダ・サブハシィ（Ｃ．ｓｕ
ｂｈａｓｈｉｉ）、カンディダ・ビスワナシィ（Ｃ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）、カンデ
ィダ・ユティリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、カンディダ・ウバトゥベンシス（Ｃ．ｕｂａｔ
ｕｂｅｎｓｉｓ）、およびカンディダ・ゼプリニナ（Ｃ．ｚｅｍｐｌｉｎｉｎａ）が挙げ
られる。ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属種の適切な例として、ウスティラゴ・アヴ
ェナエ（Ｕ．ａｖｅｎａｅ）、ウスティラゴ・エスクレンタ（Ｕ．ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）
、ウスティラゴ・ホルデイ（Ｕ．ｈｏｒｄｅｉ）、ウスティラゴ・マイジス（Ｕ．ｍａｙ
ｄｉｓ）、ウスティラゴ・ヌーダ（Ｕ．ｎｕｄａ）、およびウスティラゴ・トリティク（
Ｕ．ｔｒｉｔｉｃ）が挙げられる。トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属種の適切な
例として、トルロプシス・ゲオチャレス（Ｔ．ｇｅｏｃｈａｒｅｓ）、トルロプシス・ア
ジマ（Ｔ．ａｚｙｍａ）、トルロプシス・グラブラータ（Ｔ．ｇｌａｂｒａｔａ）、およ
びトルロプシス・カンディダ（Ｔ．ｃａｎｄｉｄａ）が挙げられる。チゴサッカロミセス
（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種の適切な例として、チゴサッカロミセス・
バイリィ（Ｚ．ｂａｉｌｉｉ）、チゴサッカロミセス・ビスポラス（Ｚ．ｂｉｓｐｏｒｕ
ｓ）、チゴサッカロミセス・シドリ（Ｚ．ｃｉｄｒｉ）、チゴサッカロミセス・フェルメ
ンタティ（Ｚ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、チゴサッカロミセス・フロレンティヌス（Ｚ．
ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ）、チゴサッカロミセス・コンブチャエンシス（Ｚ．ｋｏｍｂｕ
ｃｈａｅｎｓｉｓ）、チゴサッカロミセス・レントゥス（Ｚ．ｌｅｎｔｕｓ）、チゴサッ
カロミセス・メリス（Ｚ．ｍｅｌｌｉｓ）、チゴサッカロミセス・ミクロエリプソイデス
（Ｚ．ｍｉｃｒｏｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｓ）、チゴサッカロミセス・ムラキィ（Ｚ．ｍｒ
ａｋｉｉ）、チゴサッカロミセス・シュードルーキシィ（Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ
）、およびチゴサッカロミセス・ルーキシィ（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）が挙げられる。トリゴ
ノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属種の適切な例として、トリゴノプシス・バリアビ
リス（Ｔ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）が挙げられる。クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ）属種の適切な例として、クリプトコッカス・ローレンティ（Ｃ．ｌａｕｒｅｎ
ｔｉｉ）、クリプトコッカス・アルビダス（Ｃ．ａｌｂｉｄｕｓ）、クリプトコッカス・
ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クリプトコッカス・ガッティ（Ｃ．ｇ
ａｔｔｉｉ）、クリプトコッカス・ユニグトゥラトゥス（Ｃ．ｕｎｉｇｕｔｔｕｌａｔｕ
ｓ）、クリプトコッカス・アデリエンシス（Ｃ．ａｄｅｌｉｅｎｓｉｓ）、クリプトコッ
カス・アエリウス（Ｃ．ａｅｒｉｕｓ）、クリプトコッカス・アルビドシミリス（Ｃ．ａ
ｌｂｉｄｏｓｉｍｉｌｉｓ）、クリプトコッカス・アンタルクティカス（Ｃ．ａｎｔａｒ
ｃｔｉｃｕｓ）、クリプトコッカス・アクアティカス（Ｃ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、クリ
プトコッカス・アーテル（Ｃ．ａｔｅｒ）、クリプトコッカス・ブータネンシス（Ｃ．ｂ
ｈｕｔａｎｅｎｓｉｓ）、クリプトコッカス・コンソルティオニス（Ｃ．ｃｏｎｓｏｒｔ
ｉｏｎｉｓ）、クリプトコッカス・カルバトゥス（Ｃ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、クリプトコ
ッカス・フェノリカス（Ｃ．ｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ）、クリプトコッカス・スキンネリ（
Ｃ．ｓｋｉｎｎｅｒｉ）、クリプトコッカス・テレウス（Ｃ．ｔｅｒｒｅｕｓ）、および
クリプトコッカス・ビシュニアッシ（Ｃ．ｖｉｓｈｎｉａｃｃｉ）が挙げられる。ロドト
ルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属種の適切な例として、ロドトルラ・アケニオルム（Ｒ
．ａｃｈｅｎｉｏｒｕｍ）、ロドトルラ・トゥラ（Ｒ．ｔｕｌａ）、ロドトルラ・アクタ
（Ｒ．ａｃｕｔａ）、ロドトルラ・アメリカーナ（Ｒ．ａｍｅｒｉｃａｎａ）、ロドトル
ラ・アラウカリエ（Ｒ．ａｒａｕｃａｒｉａｅ）、ロドトルラ・アークティカ（Ｒ．ａｒ
ｃｔｉｃａ）、ロドトルラ・アルメニアカ（Ｒ．ａｒｍｅｎｉａｃａ）、ロドトルラ・ア
ウランティアカ（Ｒ．ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、ロドトルラ・アウリクラリエ（Ｒ．ａｕ
ｒｉｃｕｌａｒｉａｅ）、ロドトルラ・バカルム（Ｒ．ｂａｃａｒｕｍ）、ロドトルラ・
ベンチカ（Ｒ．ｂｅｎｔｈｉｃａ）、ロドトルラ・ビオウルゲイ（Ｒ．ｂｉｏｕｒｇｅｉ
）、ロドトルラ・ボゴリエンシス（Ｒ．ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ブロン
キアリス（Ｒ．ｂｒｏｎｃｈｉａｌｉｓ）、ロドトルラ・ブフォニィ（Ｒ．ｂｕｆｆｏｎ
ｉｉ）、ロドトルラ・カリプトゲナエ（Ｒ．ｃａｌｙｐｔｏｇｅｎａｅ）、ロドトルラ・
チュングナメンシス（Ｒ．ｃｈｕｎｇｎａｍｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・クラディエンシ
ス（Ｒ．ｃｌａｄｉｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・コラリナ（Ｒ．ｃｏｒａｌｌｉｎａ）、
ロドトルラ・クレゾリカ（Ｒ．ｃｒｅｓｏｌｉｃａ）、ロドトルラ・クロセア（Ｒ．ｃｒ
ｏｃｅａ）、ロドトルラ・シクロクラスティカ（Ｒ．ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃａ）、ロ
ドトルラ・ダイレネンシス（Ｒ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ディフルエン
ス（Ｒ．ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ）、ロドトルラ・エベルグラディエンシス（Ｒ．ｅｖｅｒｇ
ｌａｄｉｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・フェルリカ（Ｒ．ｆｅｒｕｌｉｃａ）、ロドトルラ
・
フォリオルム（Ｒ．ｆｏｌｉｏｒｕｍ）、ロドトルラ・フラガリア（Ｒ．ｆｒａｇａｒｉ
ａ）、ロドトルラ・フジサネンシス（Ｒ．ｆｕｊｉｓａｎｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・フ
トロネンシス（Ｒ．ｆｕｔｒｏｎｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ゲラティノーサ（Ｒ．ｇｅ
ｌａｔｉｎｏｓａ）、ロドトルラ・グラシアリス（Ｒ．ｇｌａｃｉａｌｉｓ）、ロドトル
ラ・グルティニス（Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グラシリス（Ｒ．ｇｒａｃｉ
ｌｉｓ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グリンベル
グシィ（Ｒ．ｇｒｉｎｂｅｒｇｓｉｉ）、ロドトルラ・ヒマライエンシス（Ｒ．ｈｉｍａ
ｌａｙｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ヒヌレア（Ｒ．ｈｉｎｎｕｌｅａ）、ロドトルラ・ヒ
ストリティカ（Ｒ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ロドトルラ・ヒロフィラ（Ｒ．ｈｙｌｏ
ｐｈｉｌａ）、ロドトルラ・インカルナタ（Ｒ．ｉｎｃａｒｎａｔａ）、ロドトルラ・イ
ンゲニオサ（Ｒ．ｉｎｇｅｎｉｏｓａ）、ロドトルラ・ジャバニカ（Ｒ．ｊａｖａｎｉｃ
ａ）、ロドトルラ・コイシカウェンシス（Ｒ．ｋｏｉｓｈｉｋａｗｅｎｓｉｓ）、ロドト
ルラ・ラクトーサ（Ｒ．ｌａｃｔｏｓａ）、ロドトルラ・ラメリブラキエ（Ｒ．ｌａｍｅ
ｌｌｉｂｒａｃｈｉａｅ）、ロドトルラ・ラリンギス（Ｒ．ｌａｒｙｎｇｉｓ）、ロドト
ルラ・リグノフィラ（Ｒ．ｌｉｇｎｏｐｈｉｌａ）、ロドトルラ・リニ（Ｒ．ｌｉｎｉ）
、ロドトルラ・ロンギッシマ（Ｒ．ｌｏｎｇｉｓｓｉｍａ）、ロドトルラ・ルドウィギィ
（Ｒ．ｌｕｄｗｉｇｉｉ）、ロドトルラ・リシノフィラ（Ｒ．ｌｙｓｉｎｏｐｈｉｌａ）
、ロドトルラ・マリーナ（Ｒ．ｍａｒｉｎａ）、ロドトルラ・マルチニエ−フラガンティ
ス（Ｒ．ｍａｒｔｙｎｉａｅ−ｆｒａｇａｎｔｉｓ）、ロドトルラ・マトリテンシス（Ｒ
．ｍａｔｒｉｔｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・メリ（Ｒ．ｍｅｌｉ）、ロドトルラ・ミヌタ
（Ｒ．ｍｉｎｕｔａ）、ロドトルラ・ムシラギノーサ（Ｒ．ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）
、ロドトルラ・ニテンス（Ｒ．ｎｉｔｅｎｓ）、ロドトルラ・ノトファギ（Ｒ．ｎｏｔｈ
ｏｆａｇｉ）、ロドトルラ・オリザエ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）、ロドトルラ・パシフィカ（
Ｒ．ｐａｃｉｆｉｃａ）、ロドトルラ・パリダ（Ｒ．ｐａｌｌｉｄａ）、ロドトルラ・ペ
ネウス（Ｒ．ｐｅｎｅａｕｓ）、ロドトルラ・フィリラ（Ｒ．ｐｈｉｌｙｌａ）、ロドト
ルラ・フィロプラナ（Ｒ．ｐｈｙｌｌｏｐｌａｎａ）、ロドトルラ・ピラティ（Ｒ．ｐｉ
ｌａｔｉｉ）、ロドトルラ・ピリマネ（Ｒ．ｐｉｌｉｍａｎａｅ）、ロドトルラ・ピニコ
ラ（Ｒ．ｐｉｎｉｃｏｌａ）、ロドトルラ・ピリカタ（Ｒ．ｐｌｉｃａｔａ）、ロドトル
ラ・ポリモルファ（Ｒ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ロドトルラ・シクロフェノリカ（Ｒ．
ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃａ）、ロドトルラ・シクロフィラ（Ｒ．ｐｓｙｃｈｒｏ
ｐｈｉｌａ）、ロドトルラ・パストゥラ（Ｒ．ｐｕｓｔｕｌａ）、ロドトルラ・レティノ
フィラ（Ｒ．ｒｅｔｉｎｏｐｈｉｌａ）、ロドトルラ・ロザケア（Ｒ．ｒｏｓａｃｅａ）
、ロドトルラ・ロスラータ（Ｒ．ｒｏｓｕｌａｔａ）、ロドトルラ・ルベファシエンス（
Ｒ．ｒｕｂｅｆａｃｉｅｎｓ）、ロドトルラ・ルベラ（Ｒ．ｒｕｂｅｌｌａ）、ロドトル
ラ・ルベスセンス（Ｒ．ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）、ロドトルラ・ルブラ（Ｒ．ｒｕｂｒａ）
、ロドトルラ・ルブロルゴサ（Ｒ．ｒｕｂｒｏｒｕｇｏｓａ）、ロドトルラ・ルフラ（Ｒ
．ｒｕｆｕｌａ）、ロドトルラ・ルティラ（Ｒ．ｒｕｔｉｌａ）、ロドトルラ・サングイ
ネア（Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅａ）、ロドトルラ・サニエイ（Ｒ．ｓａｎｎｉｅｉ）、ロド
トルラ・サルトリィ（Ｒ．ｓａｒｔｏｒｙｉ）、ロドトルラ・シルベストリス（Ｒ．ｓｉ
ｌｖｅｓｔｒｉｓ）、ロドトルラ・シンプレックス（Ｒ．ｓｉｍｐｌｅｘ）、ロドトルラ
・シネンシス（Ｒ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・スルーフィエ（Ｒ．ｓｌｏｏｆｆ
ｉａｅ）、ロドトルラ・ソンクキィ（Ｒ．ｓｏｎｃｋｉｉ）、ロドトルラ・ストラミネア
（Ｒ．ｓｔｒａｍｉｎｅａ）、ロドトルラ・スベリコラ（Ｒ．ｓｕｂｅｒｉｃｏｌａ）、
ロドトルラ・スガニィ（Ｒ．ｓｕｇａｎｉｉ）、ロドトルラ・タイワネンシス（Ｒ．ｔａ
ｉｗａｎｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・タイワニアナ（Ｒ．ｔａｉｗａｎｉａｎａ）、ロド
トルラ・テルペノイダリス（Ｒ．ｔｅｒｐｅｎｏｉｄａｌｉｓ）、ロドトルラ・テッレア
（Ｒ．ｔｅｒｒｅａ）、ロドトルラ・テキセンシス（Ｒ．ｔｅｘｅｎｓｉｓ）、ロドトル
ラ・トキョエンシス（Ｒ．ｔｏｋｙｏｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ウルザメ（Ｒ．ｕｌｚ
ａｍａｅ）、ロドトルラ・バニリカ（Ｒ．ｖａｎｉｌｌｉｃａ）、ロドトルラ・ブイレミ
ニィ（Ｒ．ｖｕｉｌｌｅｍｉｎｉｉ）、ロドトルラ・ヤロウィ（Ｒ．ｙａｒｒｏｗｉｉ）
、ロドトルラ・ユナネンシス（Ｒ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）、およびロドトルラ・ゾル
ティ（Ｒ．ｚｓｏｌｔｉｉ）が挙げられる。ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属種の適切な
例として、ファフィア・ロドジマ（Ｐ．ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）が挙げられる。スポロボロ
ミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属種の適切な例として、スポロボロミセス・ア
ルボルベスセンス（Ｓ．ａｌｂｏｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）、スポロボロミセス・バナエンシ
ス（Ｓ．ｂａｎｎａｅｎｓｉｓ）、スポロボロミセス・ベイジンゲンシス（Ｓ．ｂｅｉｊ
ｉｎｇｅｎｓｉｓ）、スポロボロミセス・ビスフォフィエ（Ｓ．ｂｉｓｃｈｏｆｉａｅ）
、スポロボロミセス・クラバトゥス（Ｓ．ｃｌａｖａｔｕｓ）、スポロボロミセス・コプ
ロスメ（Ｓ．ｃｏｐｒｏｓｍａｅ）、スポロボロミセス・コプロスミコーラ（Ｓ．ｃｏｐ
ｒｏｓｍｉｃｏｌａ）、スポロボロミセス・コラリヌス（Ｓ．ｃｏｒａｌｌｉｎｕｓ）、
スポロボロミセス・ディメネ（Ｓ．ｄｉｍｍｅｎａｅ）、スポロボロミセス・ドラコフィ
リィ（Ｓ．ｄｒａｃｏｐｈｙｌｌｉ）、スポロボロミセス・エロンガトゥス（Ｓ．ｅｌｏ
ｎｇａｔｕｓ）、スポロボロミセス・グラシリス（Ｓ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、スポロボロ
ミセス・イノシトフィルス（Ｓ．ｉｎｏｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ）、スポロボロミセス・ジ
ョンソニィ（Ｓ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、スポロボロミセス・コアラエ（Ｓ．ｋｏａｌａ
ｅ）、スポロボロミセス・マグニスポラス（Ｓ．ｍａｇｎｉｓｐｏｒｕｓ）、スポロボロ
ミセス・ノボゼアランディカス（Ｓ．ｎｏｖｏｚｅａｌａｎｄｉｃｕｓ）、スポロボロミ
セス・オドラス（Ｓ．ｏｄｏｒｕｓ）、スポロボロミセス・パタゴニカス（Ｓ．ｐａｔａ
ｇｏｎｉｃｕｓ）、スポロボロミセス・プロダクトゥス（Ｓ．ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ）、ス
ポロボロミセス・ロセウス（Ｓ．ｒｏｓｅｕｓ）、スポロボロミセス・サシコーラ（Ｓ．
ｓａｓｉｃｏｌａ）、スポロボロミセス・シバタヌス（Ｓ．ｓｈｉｂａｔａｎｕｓ）、ス
ポロボロミセス・シンギュラリス（Ｓ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）、スポロボロミセス・ス
ブルンネウス（Ｓ．ｓｕｂｂｒｕｎｎｅｕｓ）、スポロボロミセス・シンメトリカス（Ｓ
．ｓｙｍｍｅｔｒｉｃｕｓ）、スポロボロミセス・シジギィ（Ｓ．ｓｙｚｙｇｉｉ）、ス
ポロボロミセス・タウポエンシス（Ｓ．ｔａｕｐｏｅｎｓｉｓ）、スポロボロミセス・ツ
ガエ（Ｓ．ｔｓｕｇａｅ）、スポロボロミセス・キサンツス（Ｓ．ｘａｎｔｈｕｓ）、お
よびスポロボロミセス・ユナネンシス（Ｓ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）が挙げられる。パ
キソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属種およびモニリエラ（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ）属種
の適切な例としてそれぞれ、パキソレン・タノフィルス（Ｐ．ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）
およびモニリエラ・ポリニス（Ｍ．ｐｏｌｌｉｎｉｓ）が挙げられる。本明細書中の非従
来型酵母のさらに他の例として、シュードジーマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属種（例えば
シュードジーマ・アンタルクティカ（Ｓ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ））、トドトルラ（Ｔｈ
ｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属種（例えばトドトルラ・ボゴリエンシス（Ｔ．ｂｏｇｏｒｉｅｎ
ｓｉｓ））、ウィケルハミエラ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ）属種（例えばウィケル
ハミエラ・ドメルクキアエ（Ｗ．ｄｏｍｅｒｃｑｉａｅ））、およびスタルメレラ（Ｓｔ
ａｒｍｅｒｅｌｌａ）属種（例えばスタルメレラ・ボムビコラ（Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ
））が挙げられる。
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が、本明細書
中に開示される特定の実施形態において好ましい。適切なヤロウイア・リポリティカ（Ｙ
．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の例として、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能な以下の単離
物が挙げられる：株名称ＡＴＣＣ＃２０３６２、＃８８６２、＃８６６１、＃８６６２、
＃９７７３、＃１５５８６、＃１６６１７、＃１６６１８、＃１８９４２、＃１８９４３
、＃１８９４４、＃１８９４５、＃２０１１４、＃２０１７７、＃２０１８２、＃２０２
２５、＃２０２２６、＃２０２２８、＃２０３２７、＃２０２５５、＃２０２８７、＃２
０２９７、＃２０３１５、＃２０３２０、＃２０３２４、＃２０３３６、＃２０３４１、
＃２０３４６、＃２０３４８、＃２０３６３、＃２０３６４、＃２０３７２、＃２０３７
３、＃２０３８３、＃２０３９０、＃２０４００、＃２０４６０、＃２０４６１、＃２０
４６２、＃２０４９６、＃２０５１０、＃２０６２８、＃２０６８８、＃２０７７４、＃
２０７７５、＃２０７７６、＃２０７７７、＃２０７７８、＃２０７７９、＃２０７８０
、＃２０７８１、＃２０７９４、＃２０７９５、＃２０８７５、＃２０２４１、＃２０４
２２、＃２０４２３、＃３２３３８、＃３２３３９、＃３２３４０、＃３２３４１、＃３
４３４２、＃３２３４３、＃３２９３５、＃３４０１７、＃３４０１８、＃３４０８８、
＃３４９２２、＃３４９２２、＃３８２９５、＃４２２８１、＃４４６０１、＃４６０２
５、＃４６０２６、＃４６０２７、＃４６０２８、＃４６０６７、＃４６０６８、＃４６
０６９、＃４６０７０、＃４６３３０、＃４６４８２、＃４６４８３、＃４６４８４、＃
４６４３６、＃６０５９４、＃６２３８５、＃６４０４２、＃７４２３４、＃７６５９８
、＃７６８６１、＃７６８６２、＃７６９８２、＃９０７１６、＃９０８１１、＃９０８
１２、＃９０８１３、＃９０８１４、＃９０９０３、＃９０９０４、＃９０９０５、＃９
６０２８、＃２０１２４１、＃２０１２４２、＃２０１２４３、＃２０１２４４、＃２０
１２４５、＃２０１２４６、＃２０１２４７、＃２０１２４９、および／または＃２０１
８４７。
本明細書中の真菌細胞は、酵母（例えば、先に記載される）、または糸状菌等の他のあ
らゆる真菌型の細胞であってよい。例えば、本明細書中の真菌として、担子菌（Ｂａｓｉ
ｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、接合菌（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ツボカビ菌（Ｃｈｙｔｒ
ｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、または子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）があり得る。本明
細書中の糸状菌の例として、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、クリソスポリ
ウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、ネウロ
スポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属（例えば、ネウロスポラ・クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓ
ａ）、ネウロスポラ・シトフィラ（Ｎ．ｓｉｔｏｐｈｉｌａ））、クリオネクトリア（Ｃ
ｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）属（例えばクリオネクトリア・パラシチカ（Ｃ．ｐａｒａｓ
ｉｔｉｃａ））、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属（例えばアウレ
オバシジウム・プルランス（Ａ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ））、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉ
ｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒ
ｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、トリポクラジ
ウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）属、スキタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）属
、スキゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒ
ｉｃｈｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属（例えば、ペニシリウム・
ビライアエ（Ｐ．ｂｉｌａｉａｅ）、ペニシリウム・カメムベルチ（Ｐ．ｃａｍｅｍｂｅ
ｒｔｉ）、ペニシリウム・カンディドゥム（Ｐ．ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ペニシリウム・ク
リソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・エクスパンスム（Ｐ．ｅｘ
ｐａｎｓｕｍ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐ．ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシ
リウム・グラウクム（Ｐ．ｇｌａｕｃｕｍ）、ペニシリウム・マルネフェイ（Ｐ．ｍａｒ
ｎｅｆｆｅｉ）、ペニシリウム・ロケフォルチ（Ｐ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、ペニシリ
ウム・ベルコスム（Ｐ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）、ペニシリウム・ヴリジカツム（Ｐ．ｖ
ｉｒｉｄｉｃａｔｕｍ））、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属（例えば、ギベレラ・
アクミナタ（Ｇ．ａｃｕｍｉｎａｔａ）、ギベレラ・アベナケア（Ｇ．ａｖｅｎａｃｅａ
）、ギベレラ・バカタ（Ｇ．ｂａｃｃａｔａ）、ギベレラ・キルキナタ（Ｇ．ｃｉｒｃｉ
ｎａｔａ）、ギベレラ・シアノゲナ（Ｇ．ｃｙａｎｏｇｅｎａ）、ギベレラ・フジクロイ
（Ｇ．ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、ギベレラ・イントリカンス（Ｇ．ｉｎｔｒｉｃａｎｓ）、
ギベレラ・プリカリス（Ｇ．ｐｕｌｉｃａｒｉｓ）、ギベレラ・スティボイデス（Ｇ．ｓ
ｔｉｌｂｏｉｄｅｓ）、ギベレラ・トリキンクタ（Ｇ．ｔｒｉｃｉｎｃｔａ）、ギベレラ
・ゼアエ（Ｇ．ｚｅａｅ））、ミケリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ム
コール（Ｍｕｃｏｒ）属（例えば、ムコール・ロウキシィ（Ｍ．ｒｏｕｘｉｉ）、ムコー
ル・キルキネロイデス（Ｍ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ））、アスペルギルス（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属（例えば、アスペルギルス・ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペ
ルギルス・オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄ
ｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・フラヴス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・レン
ツルス（Ａ．ｌｅｎｔｕｌｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）、
アスペルギルス・クラバツス（Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・フミガツス（
Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ））、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属（例えば、フサリウム
・グラミネアルム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウム・オキシスポルム（Ｆ．
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ブビゲヌム（Ｆ．ｂｕｂｉｇｅｎｕｍ）、フサリウ
ム・ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）、フサリウム・オキシスポルム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕ
ｍ）、フサリウム・ベルチシリオイデス（Ｆ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）、フサ
リウム・プロリフェラツム（Ｆ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）、フサリウム・ベネナツム
（Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ））、およびフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ならびにそ
れらのアナモルフおよびテレモルフのものが挙げられる。本明細書中の真菌の属および種
は、所望される場合、Ｂａｒｎｅｔｔ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ（Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ
Ｇｅｎｅｒａ ｏｆ Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ Ｆｕｎｇｉ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂ
ｕｒｇｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９７２）に開示される形態論
によって定義され得る。真菌は、場合によっては、特定の実施形態において、植物または
動物（例えばヒト）の有害生物／病原体と特徴付けられ得る。
本明細書中の特定の態様におけるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属種として
、トリコデルマ・アグレッシバム（Ｔ．ａｇｇｒｅｓｓｉｖｕｍ）、トリコデルマ・アマ
ゾニクム（Ｔ．ａｍａｚｏｎｉｃｕｍ）、トリコデルマ・アスペレルム（Ｔ．ａｓｐｅｒ
ｅｌｌｕｍ）、トリコデルマ・アトロビリデ（Ｔ．ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデル
マ・アウレオビリデ（Ｔ．ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・アウストロコニン
ギィ（Ｔ．ａｕｓｔｒｏｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ブレビコンパクトゥム（Ｔ
．ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）、トリコデルマ・カンディドゥム（Ｔ．ｃａｎｄｉｄ
ｕｍ）、トリコデルマ・カリッベウム（Ｔ．ｃａｒｉｂｂａｅｕｍ）、トリコデルマ・カ
トプトロン（Ｔ．ｃａｔｏｐｔｒｏｎ）、トリコデルマ・クレメウム（Ｔ．ｃｒｅｍｅｕ
ｍ）、トリコデルマ・セラミクム（Ｔ．ｃｅｒａｍｉｃｕｍ）、トリコデルマ・セリヌム
（Ｔ．ｃｅｒｉｎｕｍ）、トリコデルマ・クロロスポルム（Ｔ．ｃｈｌｏｒｏｓｐｏｒｕ
ｍ）、トリコデルマ・クロモスペルマム（Ｔ．ｃｈｒｏｍｏｓｐｅｒｍｕｍ）、トリコデ
ルマ・シナモメウム（Ｔ．ｃｉｎｎａｍｏｍｅｕｍ）、トリコデルマ・シトリノビリデ（
Ｔ．ｃｉｔｒｉｎｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・クラッスム（Ｔ．ｃｒａｓｓｕｍ）
、トリコデルマ・クレメウム（Ｔ．ｃｒｅｍｅｕｍ）、トリコデルマ・ジングレエアエ（
Ｔ．ｄｉｎｇｌｅｙｅａｅ）、トリコデルマ・ドロテアエ（Ｔ．ｄｏｒｏｔｈｅａｅ）、
トリコデルマ・エフスム（Ｔ．ｅｆｆｕｓｕｍ）、トリコデルマ・エリナセウム（Ｔ．ｅ
ｒｉｎａｃｅｕｍ）、トリコデルマ・エストニクム（Ｔ．ｅｓｔｏｎｉｃｕｍ）、トリコ
デルマ・フェルティル（Ｔ．ｆｅｒｔｉｌｅ）、トリコデルマ・ゲラティノサス（Ｔ．ｇ
ｅｌａｔｉｎｏｓｕｓ）、トリコデルマ・グハネンセ（Ｔ．ｇｈａｎｅｎｓｅ）、トリコ
デルマ・ハマトゥム（Ｔ．ｈａｍａｔｕｍ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔ．ｈａｒ
ｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・ヘリクム（Ｔ．ｈｅｌｉｃｕｍ）、トリコデルマ・イン
トリカトゥム（Ｔ．ｉｎｔｒｉｃａｔｕｍ）、トリコデルマ・コニラングブラ（Ｔ．ｋｏ
ｎｉｌａｎｇｂｒａ）、トリコデルマ・コニンギィ（Ｔ．ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデ
ルマ・コニンギオプシス（Ｔ．ｋｏｎｉｎｇｉｏｐｓｉｓ）、トリコデルマ・ロンギブラ
チアトゥム（Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・ロンギピレ（Ｔ．
ｌｏｎｇｉｐｉｌｅ）、トリコデルマ・ミヌティスポルム（Ｔ．ｍｉｎｕｔｉｓｐｏｒｕ
ｍ）、トリコデルマ・オブロンギスポルム（Ｔ．ｏｂｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ）、トリコ
デルマ・オバリスポルム（Ｔ．ｏｖａｌｉｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・ペテルセニィ
（Ｔ．ｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ）、トリコデルマ・フィロスタヒディス（Ｔ．ｐｈｙｌｌｏ
ｓｔａｈｙｄｉｓ）、トリコデルマ・ピルリフェルム（Ｔ．ｐｉｌｕｌｉｆｅｒｕｍ）、
トリコデルマ・プレウロティコラ（Ｔ．ｐｌｅｕｒｏｔｉｃｏｌａ）、トリコデルマ・プ
レウロトゥム（Ｔ．ｐｌｅｕｒｏｔｕｍ）、トリコデルマ・ポリスポルム（Ｔ．ｐｏｌｙ
ｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・シュードコニンギィ（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｋｏｎｉｎｇｉ
ｉ）、トリコデルマ・プベスセンス（Ｔ．ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）、トリコデルマ・レーセ
イ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ロゲルソニィ（Ｔ．ｒｏｇｅｒｓｏｎｉｉ）、
トリコデルマ・ロシクム（Ｔ．ｒｏｓｓｉｃｕｍ）、トリコデルマ・サトゥルニスポルム
（Ｔ．ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・シネンシス（Ｔ．ｓｉｎｅｎｓｉ
ｓ）、トリコデルマ・シヌオスム（Ｔ．ｓｉｎｕｏｓｕｍ）、トリコデルマ・スピラレ（
Ｔ．ｓｐｉｒａｌｅ）、トリコデルマ・ストラミネウム（Ｔ．ｓｔｒａｍｉｎｅｕｍ）、
トリコデルマ・ストリゴスム（Ｔ．ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ）、トリコデルマ・ストロマティ
クム（Ｔ．ｓｔｒｏｍａｔｉｃｕｍ）、トリコデルマ・スロトゥンドゥム（Ｔ．ｓｕｒｒ
ｏｔｕｎｄｕｍ）、トリコデルマ・タイワネンセ（Ｔ．ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ）、トリコ
デルマ・タイランディクム（Ｔ．ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｍ）、トリコデルマ・テレフォ
リコルム（Ｔ．ｔｈｅｌｅｐｈｏｒｉｃｏｌｕｍ）、トリコデルマ・セオブロミコラ（Ｔ
．ｔｈｅｏｂｒｏｍｉｃｏｌａ）、トリコデルマ・トメントスム（Ｔ．ｔｏｍｅｎｔｏｓ
ｕｍ）、トリコデルマ・ベルティヌム（Ｔ．ｖｅｌｕｔｉｎｕｍ）、トリコデルマ・ビレ
ンス（Ｔ．ｖｉｒｅｎｓ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）、およびトリコ
デルマ・ビリデスセンス（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓ）が挙げられる。本明細書中のト
リコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属種は、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ：Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐ．Ｋ．Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ ｅｔ
ａｌ．，Ｅｄｓ．，ＣＡＢＩ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ，２０１３）に記載される
ように培養され、かつ／または操作され得、この文献は参照によって本明細書に組み込ま
れる。
特定の実施形態における微生物細胞は、藻類細胞である。例えば、藻類細胞は、以下の
いずれに由来してもよい：緑藻植物（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）門（緑藻類）、紅藻植物
（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）門（紅藻類）、褐藻植物（Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ）綱（褐
藻類）、珪藻植物（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃａｅａｅ）綱（珪藻類）、および渦鞭
毛虫（Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）門（渦鞭毛虫類）。藻類細胞は、他の態様におい
て、微細藻類（例えば、植物プランクトン、微細植物、またはプランクトン藻類）の細胞
であっても大型藻類（ケルプ、海草）の細胞であってもよい。さらなる例として、本明細
書中で藻類細胞は、アマノリ（Ｐｏｒｐｈｙｒａ）属（アサクサノリ）、ダルス（Ｐａｌ
ｍａｒｉａ）属種、例えばダルス（Ｐ．ｐａｌｍａｔａ）、アルトロスピラ（Ａｒｔｈｒ
ｏｓｐｉｒａ）属種、例えばスピルリナ（Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、クロレラ（Ｃｈｌ
ｏｒｅｌｌａ）属（例えばクロレラ（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ））、ツノマタ
（Ｃｈｏｎｄｒｕｓ）属種、例えばトチャカ（Ｃ．ｃｒｉｓｐｕｓ）、アファニゾメノン
（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ）属、ホンダワラ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ）属、コチャユヨ
（Ｃｏｃｈａｙｕｙｏ）属、ボツリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば
ボツリオコッカス・ブラウニィ（Ｂ．ｂｒａｕｎｉｉ））、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅ
ｌｌａ）属（例えばドナリエラ・テルティオレクタ（Ｄ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ））、
グラシラリア（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）属、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓ
ｉｓ）属（例えばプレウロクリシス・カルテレ（Ｐ．ｃａｒｔｅｒａｅ））、アンキスト
ロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）属、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）
属、ハンチア（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）属、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ
）属、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、ニッチア（Ｎｉｔｚ
ｓｃｈｉａ）属、フェオダクチルム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属（例えばフェオダ
クチルム・トリコルヌトゥム（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ））、セネデスムス（Ｓｃｅ
ｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、スティココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、テトラセル
ミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）属（例えばテトラセルミス・スエシカ（Ｔ．ｓｕｅｃｉ
ｃａ））、タラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属（例えばタラシオシラ・シュ
ードナナ（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ））、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏ
ｄｉｎｉｕｍ）属（例えばクリプテコディニウム・コーニィ（Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ））、ネ
オクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属（例えばネオクロリス・オレオアブンダンス（Ｎ
．ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ））、またはシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ
）属のものであってよい。本明細書中で藻類種は、例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（Ａｌｇａ
ｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｕｐｐ
ｏｒｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＯＬＳＳ），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ １、ｅｏ
ｌｓｓ．ｎｅｔ／ｓａｍｐｌｅ−ｃｈａｐｔｅｒｓインターネットサイトにて入手可能）
に記載されるように培養され、かつ／または操作され得、この文献は参照によって本明細
書に組み込まれる。
本明細書中の原生生物細胞は、例えば、繊毛虫（Ｃｉｌｉａｔａ）綱（例えば、テトラ
ヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）属、ゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ）属、コルピ
ディウム（Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍ）属、コルポダ（Ｃｏｌｐｏｄａ）属、グラウコマ（Ｇｌ
ａｕｃｏｍａ）属、プラティオフリア（Ｐｌａｔｙｏｐｈｒｙａ）属、ボルチセラ（Ｖｏ
ｒｔｉｃｅｌｌａ）属、ポトマカス（Ｐｏｔｏｍａｃｕｓ）属、シュードコニレンブス（
Ｐｓｅｕｄｏｃｏｈｎｉｌｅｍｂｕｓ）属、エウプロテス（Ｅｕｐｌｏｔｅｓ）属、エン
ゲルマニエラ（Ｅｎｇｅｌｍａｎｉｅｌｌａ）属、およびスチロニキア（Ｓｔｙｌｏｎｉ
ｃｈｉａ）属）、マスチゴフォラ（Ｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒａ）亜門（フラゲラーテ（ｆ
ｌａｇｅｌｌａｔｅｓ））、フィトマスチゴフォレア（Ｐｈｙｔｏｍａｓｔｉｇｏｐｈｏ
ｒｅａ）綱（例えば、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属、アスタシア（Ａｓｔａｓｉａ）
属、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびクリプテコディニウム（
Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属）、鞭毛虫（Ｚｏｏｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒｅａ）
綱、リゾポーダ（Ｒｈｉｚｏｐｏｄａ）上綱、ロボセア（Ｌｏｂｏｓｅａ）綱（例えばア
メーバ（Ａｍｏｅｂａ）属）、およびエウミケトゾエア（Ｅｕｍｙｃｅｔｏｚｏｅａ）綱
（例えば、ディクチオステリウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）属およびフィサルム（
Ｐｈｙｓａｒｕｍ）属）から選択され得る。本明細書中の特定の原生生物種は、例えば、
ＡＴＣＣ（登録商標）Ｐｒｏｔｉｓｔｏｌｏｇｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｇｕｉｄｅ：ｔｉｐ
ｓ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｏｚｏ
ａ ａｎｄ ａｌｇａｅ（２０１３，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎインターネットサイトにて入手可能）に記載されるように培養され、
かつ／または操作され得、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。原生生物は
、場合によっては、特定の実施形態において、植物または動物（例えばヒト）の有害生物
／病原体と特徴付けられ得る。
特定の実施形態における細菌細胞は、球菌、桿菌、スピロヘータ、スフェロプラスト、
プロトプラスト等の形態のものであってよい。細菌の他の非限定的な例として、グラム陰
性菌およびグラム陽性菌であるものが挙げられる。細菌のさらに他の非限定的な例として
、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属（例えば、サルモネラ・ティフィ（Ｓ．ｔｙｐ
ｈｉ）、サルモネラ・エンテリティデス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ））、シゲラ（Ｓ
ｈｉｇｅｌｌａ）属（例えばシゲラ・ディセンテリアエ（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）
）、エケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、エン
テロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロ
テウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、シトロバクター（Ｃ
ｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エドワードシエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）属、プロビ
デンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ハ
フニア（Ｈａｆｎｉａ）属、エウィンゲラ（Ｅｗｉｎｇｅｌｌａ）属、クライベラ（Ｋｌ
ｕｙｖｅｒａ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、プラノコッカス（Ｐｌａｎ
ｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストマトコッカス（Ｓｔｏｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ミクロコッ
カス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属（
例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス
（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ））、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属（例えばコレラ菌（Ｖ
．ｃｈｏｌｅｒａｅ））、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、プレシオモナス（Ｐ
ｌｅｓｓｉｏｍｏｎａｓ）属、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属（例えばイン
フルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）属、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏ
ｐｌａｓｍａ）属（例えばマイコプラズマ・ニューモニア（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ））
、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）属、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属
、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）属、ロシャリメア（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）属、エ
ーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）属、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属（例え
ば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．
ｍｕｔａｎｓ）、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、エンテロコッカス（Ｅｎｔ
ｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えばエンテロコッカス・ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉ
ｓ））、アエロコッカス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ゲメラ（Ｇｅｍｅｌｌａ）属、ラ
クトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えばラクトコッカス・ラクチス（Ｌ．ｌ
ａｃｔｉｓ））、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属（例えばロイコノスト
ック・メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ））、ペディコッカス（Ｐｅ
ｄｉｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えば、セレウス菌（Ｂ．ｃ
ｅｒｅｕｓ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂ．
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ））、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）属（例えばコリネバクテリウム・ジフテリアエ（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ））、
アルカノバクテリウム（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクチノミセス（Ａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、ロードコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、リステリア（Ｌ
ｉｓｔｅｒｉａ）属（例えばリステリア菌（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））、エリ
シペロスリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）属、ガードネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒ
ｅｌｌａ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属（例えば、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉ
ｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ））、カンピロバクター（Ｃａ
ｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、アクロバクター（Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ）属、ウォリネラ
（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）属、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属（例えばピ
ロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ））、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、
アキネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えばアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ．ｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓ））、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、クリセオモナス（Ｃ
ｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属、エイケネラ（Ｅｉ
ｋｅｎｅｌｌａ）属、フラビモナス（Ｆｌａｖｉｍｏｎａｓ）属、フラボバクテリウム（
Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）属、オリゲラ（
Ｏｌｉｇｅｌｌａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（例えば緑膿菌（
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、シュワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属、ウィークセラ
（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、ボルデテラ
（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属、フランシエセラ（Ｆｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ）属、ブルセ
ラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、アフピア（Ａｆｉ
ｐｉａ）属、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）属、カリマトバクテリウム（Ｃａｌｙ
ｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カルディオバクテリウム（Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）属、ストレプトバチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、スピリルム
（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ）属、ペプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、サルキニア（Ｓａｒｃｉ
ｎｉａ）属、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉ
ｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
）属、モビルンカス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラクトバチ
ルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えば、ラクトバチルス・ラクチス（Ｌ．ｌａ
ｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ））、ロチ
ア（Ｒｏｔｈｉａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属（例えば、ボツ
リヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃ．ｐｅ
ｒｆｒｉｎｇｅｎｓ））、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、ポルフィロモ
ナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属、フソ
バクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ビロフィラ（Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ）属
、レプトトリキア（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）属、ウォリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）
属、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、メガスフェラ（Ｍｅｇ
ａｓｐｈａｅｒａ）属、ヴェイロネラ（Ｖｅｉｌｏｎｅｌｌａ）属、ノルカルディア（Ｎ
ｏｒｃａｒｄｉａ）属、アクチノマドゥラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）属、ノルカルデ
ィオプシス（Ｎｏｒｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ）属、ミクロポリスポラス（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｓ）属、サーモアクチ
ノミセテス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）属、ミコバクテリウム（Ｍｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えば、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ミコバ
クテリウム・ボヴィス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、ミコバクテリウム・レプラエ（Ｍ．ｌｅｐｒ
ａｅ））、トレポネマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属（例
えばボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レプトスピラ（Ｌｅ
ｐｔｏｓｐｉｒａ）、およびクラミジアエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）属のものが挙げられ
る。細菌は、場合によっては、特定の実施形態において、植物または動物（例えばヒト）
の有害生物／病原体と特徴付けられ得る。細菌は、特定の実施形態において、混合微生物
集団（例えば、他の細菌を含有し、または酵母および／もしくは他の細菌を含有する）に
含まれてよい。
特定の実施形態における古細菌細胞は、ユリ古細菌（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）門
、クレン古細菌（Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ）門、ナノ古細菌（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅ
ｏｔａ）門、コル古細菌（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）門、アイガー古細菌（Ａｉｇａｒ
ｃｈａｅｏｔａ）門、またはタウム古細菌（Ｔｈａｕｍａｒｃｈａｅｏｔａ）門等のあら
ゆる古細菌門に由来してよい。本明細書中の古細菌細胞は、例えば、好極限性（例えば、
殆どの生命にとって有害となる、物理的または地球化学的に極限の条件において増殖かつ
／または繁殖することができる）であってよい。好極限性古細菌の一部の例として、好熱
性（例えば、４５〜１２２℃の温度で増殖することができる）、超好熱性（例えば、８０
〜１２２℃の温度にて増殖することができる）、好酸性（例えば、３以下のｐＨレベルに
て増殖することができる）、好アルカリ性（例えば、９以上のｐＨレベルにて増殖するこ
とができる）、かつ／または好塩性（例えば、高塩濃度［例えば２０〜３０％ＮａＣｌ］
において増殖することができる）であるものが挙げられる。古細菌種の例として、ハロバ
クテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えば、ハロバクテリウム・ウォルカニ
イ（Ｈ．ｖｏｌｃａｎｉｉ））、スルフォロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属（例えば、
スルフォロブス・ソルファタリクス（Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、スルフォロブス
・アシドカルダリウス（Ｓ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ））、テルモコッカス（Ｔｈ
ｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、テルモコッカス・アルカリフィルス（Ｔ．ａｌｃａ
ｌｉｐｈｉｌｕｓ）、テルモコッカス・セレール（Ｔ．ｃｅｌｅｒ）、テルモコッカス・
キトノファグス（Ｔ．ｃｈｉｔｏｎｏｐｈａｇｕｓ）、テルモコッカス・ガンマトレラン
ス（Ｔ．ｇａｍｍａｔｏｌｅｒａｎｓ）、テルモコッカス・ヒドロテルマリス（Ｔ．ｈｙ
ｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）、テルモコッカス・コダカレンシス（Ｔ．ｋｏｄａｋａｒｅ
ｎｓｉｓ）、テルモコッカス・リトラリス（Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、テルモコッカス
・ペプトノフィルス（Ｔ．ｐｅｐｔｏｎｏｐｈｉｌｕｓ）、テルモコッカス・プロフンド
ゥス（Ｔ．ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ）、テルモコッカス・ステッテリ（Ｔ．ｓｔｅｔｔｅｒｉ
））、メタノカルドコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、メ
タノカルドコッカス・サーモリソトロフィカス（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈ
ｉｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ヤナシィ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ））、メタノ
コッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えばメタノコッカス・マリパルディス（
Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ））、メタノサーモバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏ
ｂａｃｔｅｒ）属（例えば、メタノサーモバクター・マルブルゲンシス（Ｍ．ｍａｒｂｕ
ｒｇｅｎｓｉｓ）、メタノサーモバクター・サーマオートトロフィクス（Ｍ．ｔｈｅｒｍ
ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ））、アーケオグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）属
（例えばアーケオグロブス・フルギドゥス（Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ））、ニトロソプミル
ス（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ）属（例えば、ニトロソプミルス・マリティムス（Ｎ
．ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）、メタロスファエラ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ）属（例え
ばメタロスファエラ・セドゥラ（Ｍ．ｓｅｄｕｌａ））、フェロプラズマ（Ｆｅｒｒｏｐ
ｌａｓｍａ）属、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）属、メタノブレビバクタ
ー（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）属（例えばメタノブレビバクター・スミチ
ィ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ））、およびメタノスフェラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ）
属（例えばメタノスフェラ・スタットマナエ（Ｍ．ｓｔａｄｔｍａｎａｅ））のものが挙
げられる。
本明細書中の昆虫細胞の例として、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅ
ｒｄａ）細胞、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）細胞、カイコ（
Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）細胞等が挙げられる。ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒ
ｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞として、例えば、Ｓｆ９およびＳｆ２１が挙げられる。イラクサ
ギンウワバ（Ｔ．ｎｉ）卵巣細胞として、例えば、ＨＩＧＨ ＦＩＶＥ細胞（別名ＢＴＩ
−ＴＮ−５Ｂ１−４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）が挙げられる。カイコ（Ｂ．ｍｏｒｉ）
細胞として、例えば、Ｎ４が挙げられる。本明細書中の特定の昆虫細胞は、例えば、Ｇｒ
ｏｗｔｈ ａｎｄ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ Ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ
ｓ（２０１０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍａｎｕａｌ ｐａｒｔ ｎｏ．２５−０１２７
，ＭＡＮ０００００３０に記載されるように培養され、かつ／または操作され得、この文
献は参照によって本明細書に組み込まれる。他の態様において、昆虫細胞は、植物の病害
虫／病原体、例えば、ヨトウムシ、タマナヤガ、アメリカタバコガ、コーンノミハムシ、
コーンリーフアリマキ、コーンルートアリマキ、ヨーロッパアワノメイガ、ツマジロクサ
ヨトウ、グラニュレートカットワーム、マメコガネ、マダラメイガ、トウモロコシゾウム
シ、メラノータス・コムニス（ｍｅｌａｎｏｔｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、シードコーン
マゴット、ソッドウェブワーム、ソルガムミッジ、ソルガムウェブワーム、サザンコーン
ゾウムシ、サザンコーンルートワーム、サザンコーンストークボーラー、サザンポテトワ
イヤーワーム、ハダニ、ストークボーラー、シュガーケーンビートル、タバコワイヤーワ
ーム、ホワイトグラブ、アリマキ、ワタミゾウムシ、ボールワームコンプレックス、イラ
クサキンウワバ、ミドリメクラガメ、アザミウマ、ナミハダニ、イエローストライプトア
ーミーワーム、アルファルファゾウムシ、クローバーゾウムシ、クローバールートカーキ
ュリオ、ツマジロクサヨトウ、バッタ、ホソアワフキ、エンドウヒゲナガアブラムシ、ヒ
メヨコバイ、ツトガ、ニセタマナヤガ、マダラメイガ、タバコアザミウマ、ハリガネムシ
、シリアルハムシ、ナガカメムシ、イングリッシュグレインアフィド、アブラムシ、ヘシ
アンバエ、マメハムシ、シロイチモジヨトウ、ツチハンミョウ、グレープコラスピス、グ
リーンクローバーワーム、マダラテントウムシ、ソイビーンルーパー、ソイビーンステム
ボーラー、クサギカメムシ、スリーコーナードアルファルファホッパー、ベルベットビー
ンキャタピラー、ハマキガ、イラクサキンウワバ、ヨトウムシ、グリーンジューンビート
ル、モモアカアブラムシ、スズメガ（ｈｏｒｎｗｏｒｍ）、ジャガイモキバガ、サザーン
モールクリケット、サックフライ（ｓｕｃｋｆｌｙ）、タバコノミハムシ、ヤサイゾウム
シ、またはホワイトフリンジドビートルの細胞であってよい。これ以外にも、昆虫細胞は
、動物（例えばヒト）の病害虫／病原体の細胞であってよい。
線虫細胞は、例えば、以下の属のいずれかに由来する線虫のものであってよい：メロイ
ドギネ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）属（ネコブセンチュウ）、プラティレンチュス（Ｐｒ
ａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）属（ネグサレセンチュウ（ｌｅｓｉｏｎ ｎｅｍａｔｏｄｅ））
、ヘテロデラ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）属（シストセンチュウ）、グローボデラ（Ｇｌｏ
ｂｏｄｅｒａ）属（シストセンチュウ）、ジチレンチュス（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）属
（ナミクキセンチュウ）、ティレンチュルス（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ）属（カンキツセ
ンチュウ）、シピネーマ（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ）属（オオハリセンチュウ）、ラドフォル
ス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ）属（ネモグリセンチュウ）、ロチレンチュルス（Ｒｏｔｙｌ
ｅｎｃｈｕｌｕｓ）属（レニフォーム（ｒｅｎｉｆｏｒｍ）センチュウ）、ヘリコティレ
ンチュス（Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）属（ラセンセンチュウ）、またはベロノラ
イムス（Ｂｅｌｏｎｏｌａｉｍｕｓ）属（スティング（ｓｔｉｎｇ）センチュウ）。線虫
は、場合によっては、特定の実施形態において、植物または動物（例えばヒト）の有害生
物／病原体と特徴付けられ得る。線虫は、他の態様において、カエノラブディティス・エ
レガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）であってよい。
本明細書中の魚類細胞は、例えば、米国特許第７４０８０９５号明細書および米国特許
第７２１７５６４号明細書、ならびにＴｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｆｉｓｈ
Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ（Ｔ．Ｏｔｔ，ＮＷＦＨＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄ
ｕｒｅｓ Ｍａｎｕａｌ−Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ １０，２０
０４）に開示される細胞のいずれかであってよく、これらは参照によって本明細書に組み
込まれる。これらの参考文献はまた、魚類細胞の培養および／または操作に関する情報を
開示している。魚類細胞の非限定的な例として、ゼブラフィッシュ、メダカ、ジャイアン
トレリオ（Ｇｉａｎｔ ｒｅｒｉｏ）、またはフグ等の硬骨類魚に由来するものがあり得
る。
特定の実施形態における哺乳類細胞として、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル、類人
猿）、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、ウサギ、イヌ、
ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、またはヒツジの細胞があり得る。本明細書中の哺乳動物
細胞の他の例として、一次上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、子宮頸部上皮細胞、気管
支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞、網膜上皮細胞）；樹立細胞株（例えば、２９
３胚性腎細胞、ＨｅＬａ子宮頸部上皮細胞、ＰＥＲ−Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ、ＣＲＦＫ
、ＭＤＣＫ、ＣＨＯ、ＢｅＷｏ、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２、Ｈｅｐ−２
、ＫＢ、ＬＳ １８０、ＬＳ １７４Ｔ、ＮＣＩ−Ｈ−５４８、ＲＰＭＩ ２６５０、Ｓ
Ｗ−１３、Ｔ２４、ＷＩ−２８ ＶＡ１３、２ＲＡ、ＷＩＳＨ、ＢＳ−Ｃ−Ｉ、ＬＬＣ−
ＭＫ２、Ｃｌｏｎｅ Ｍ−３、ＲＡＧ、ＴＣＭＫ−１、ＬＬＣ−ＰＫ１、ＰＫ−１５、Ｇ
Ｈ１、ＧＨ３、Ｌ２、ＬＬＣ−ＲＣ ２５６、ＭＨ１Ｃ１、ＸＣ、ＭＤＯＫ、ＶＳＷ、Ｔ
Ｈ−Ｉ、Ｂ１細胞）；あらゆる組織または臓器由来のあらゆる上皮、間葉（例えば線維芽
細胞）、神経、または筋肉細胞（例えば、皮膚、心臓；肝臓；腎臓；結腸；腸；食道；胃
；神経組織、例えば、脳または脊髄；肺；血管組織；リンパ組織、例えばリンパ腺、アデ
ノイド、扁桃腺、骨髄、または血液；脾臓）；および線維芽細胞または線維芽細胞様細胞
株（例えば、ＴＲＧ−２、ＩＭＲ−３３、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ−２１、ｃｉｔｒｕｌｌｉ
ｎｅｍｉａ細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５５１、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５１
０、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５２５、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５２９、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５３２、Ｄｅ
ｔｒｏｉｔ ５３９、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５４８、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５７３、ＨＥＬ ２９
９、ＩＭＲ−９０、ＭＲＣ−５、ＷＩ−３８、ＷＩ−２６、ＭｉＣｌ１、ＣＶ−１、ＣＯ
Ｓ−１、ＣＯＳ−３、ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、ＤＢＳ−ＦｒｈＬ−２、ＢＡＬＢ／３Ｔ３
、Ｆ９、ＳＶ−Ｔ２、Ｍ−ＭＳＶ−ＢＡＬＢ／３Ｔ３、Ｋ−ＢＡＬＢ、ＢＬＯ−１１、Ｎ
ＯＲ−１０、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２、ＨＳＤＭ１Ｃ３、ＫＬＮ２０５、ＭｃＣｏｙ細胞、
マウスＬ細胞、ＳＣＣ−ＰＳＡ１、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、インドホエジカ細胞、ＳＩ
ＲＣ、Ｊｅｎｓｅｎ細胞が挙げられる。哺乳動物細胞株の培養および操作方法は、当該技
術において知られている。
用語「植物体」は、植物体全体、植物器官、植物組織、種子、植物細胞、種子およびそ
の子孫を指す。植物細胞としては、限定はされないが、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織
領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉および小胞子の細胞が挙げ
られる。植物体の部分には、分化組織および未分化組織が含まれ、それらの組織としては
、限定はされないが、根、茎、シュート、葉、花粉、種子、腫瘍組織、および様々な形態
の細胞および培養物（例えば、単細胞、プロトプラスト、胚およびカルス組織）が挙げら
れる。植物組織は、植物体中に、または植物器官、組織、もしくは細胞培養物中に存在し
得る。用語「植物器官」は、形態的にも機能的にも区別された植物体の部分を構成する、
植物組織または組織群を指す。用語「ゲノム」は、生命体の各細胞、またはウィルスもし
くは細胞小器官に存在する遺伝物質（遺伝子および非コード配列）の相補体の全体；なら
びに／あるいは１つの親から１つの（ハプロイド）単位として受け継いだ一式の染色体を
指す。「子孫」は、植物体のその後の世代を含む。
トランスジェニック植物体としては、例えば、形質転換工程によって導入された異種ポ
リヌクレオチドをゲノム内に含む植物体が挙げられる。異種ポリヌクレオチドは、そのポ
リヌクレオチドが後代に継承されるよう、ゲノムに安定に組み込むことができる。異種ポ
リヌクレオチドは、ゲノムに単独で、または組み換えＤＮＡコンストラクトの一部として
組み込んでもよい。トランスジェニック植物体はまた、ゲノム内に複数の異種ポリヌクレ
オチドを含むことができる。各異種ポリヌクレオチドは、トランスジェニック植物体に異
なる形質を付与してもよい。異種ポリヌクレオチドとして、外来種を起源とする配列を挙
げることができ、あるいは、同種からの配列であれば、その天然形態から大幅に改変する
ことができる。トランスジェニック体としては、異種の核酸の存在によってその遺伝子型
を変化させた、任意の細胞、細胞系統、カルス、組織、植物体の部分または植物体（初め
からそのように変更されたトランスジェニック体、および初めのトランスジェニック体か
ら有性交雑または無性増殖によって作られたものを含む）を挙げることができる。従来の
植物育種方法による、外来ポリヌクレオチドが挿入されない本明細書に記載のゲノム編集
手順による、または自然に発生するイベント（ランダム交雑受精、非組み換えウィルス感
染、非組み換え細菌形質転換、非組み換え転位もしくは自然変異など）による、ゲノム（
染色体または染色体外の）の変化を、トランスジェニックと見なすことは意図されていな
い。
稔性植物は、生存可能な雄性配偶子および雌性配偶子を生み出し、かつ自家稔性の植物
である。そのような自家稔性植物は、他のあらゆる植物の配偶子、およびそこに含有され
る遺伝物質の貢献によらずに、後代植物を生み出すことができる。雄性不稔植物は、生存
可能な、またはそうでなければ稔性可能な雄性配偶子を生み出さない植物である。雌性不
稔植物は、生存可能な、またはそうでなければ稔性可能な雌性配偶子を生み出さない植物
である。雄性不稔植物および雌性不稔植物はそれぞれ、雌性稔性および雄性捻性であり得
ることが認められている。さらに、雄性稔性（しかし雌性不稔である）植物は、雌性稔性
植物と交雑すると、生存可能な後代を生み出すことができること、そして雌性稔性（しか
し雄性不稔である）植物は、雄性稔性植物と交雑すると、生存可能な後代を生み出すこと
ができることが認められている。
単子葉植物および双子葉植物が挙げられるあらゆる植物が用いられてよい。用いられ得
る単子葉植物の例として、以下に限定されないが、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、
イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、ソル
ガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ヒエ（例
えばトウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ））、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ
ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、シコクビエ（Ｅｌ
ｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、
サトウキビ（サトウキビ属種（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．））、エンバク（カラスム
ギ（Ａｖｅｎａ）属）、オオムギ（オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ）属）、スイッチグラス（
Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）
、バナナ（ムサ属種（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．））、ヤシ、観賞植物、芝草、および他のイネ
科植物が挙げられる。用いられ得る双子葉植物の例として、以下に限定されないが、ダイ
ズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、キャノーラ（セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎ
ａｐｕｓ）およびブラシカ・カンペストリス（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））、アルファ
ルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃ
ｕｍ）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄ
ｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）
、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ａｒｂｏｒｅｕｍ）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙ
ｐｏｇａｅａ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、およびジャガ
イモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）等が挙げられる。
用語「双子葉植物」は、「双子葉類（ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｅａｅ）」としても知ら
れている、被子植物の亜綱を指し、植物体全体、植物器官（例えば、葉、茎、根等）、種
子、植物細胞、およびその後代への言及が挙げられる。本明細書中で用いられる植物細胞
として、以下に限定されないが、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織部位、カルス組織、葉
、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子が挙げられる。
用語「５’キャップ」および「７−メチルグアニレート（ｍ７Ｇ）キャップ」は、本明
細書中で互換的に用いられる。７−メチルグアニレート残基は、真核生物において、ＲＮ
ＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）によって転写されたＲＮＡの５’末端上に位置決め
される。本明細書中のキャップＲＮＡは、５’キャップを有するが、キャップ離脱ＲＮＡ
は、そのようなキャップを有していない。
用語「キャップ離脱」、「５’キャップを有していない」等は、本明細書中では互換的
に用いられ、５’キャップを欠いており、場合によっては、例えば、５’キャップの代わ
りに５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡを指す。５’キャッピングされたＲＮＡは、核外
輸出を受けるため、キャップ離脱ＲＮＡは、転写後、核内により十分に蓄積することがで
きる。
用語「リボザイム」、「リボ核酸酵素」、および「自己切断リボザイム」は、本明細書
中で互換的に用いられる。リボザイムは、特定の部位にて、特にリボザイム配列に対する
シス部位にて、ＲＮＡを切断することができる（すなわち、自己触媒的である、または自
己切断する）二次構造、三次構造、および／または四次構造を形成する１つ以上のＲＮＡ
配列を指す。リボザイム核酸分解活性の一般的な性質が記載されてきた（例えば、Ｌｉｌ
ｌｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３９：６４１−６４６）。「ハンマーヘ
ッドリボザイム」（ＨＨＲ）は、塩基対形成された３つのステム、および触媒反応に関与
する高度に保存された非相補的ヌクレオチドのコアで構成される、小さな触媒的ＲＮＡモ
チーフを含んでよい。Ｐｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３７２：６８−７４）、
およびＨａｍｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（ＲＮＡ １８：８７１−８８５）（これらの文献
は参照によって本明細書に組み込まれる）が、ハンマーヘッドリボザイムの構造および活
性を開示している。ハンマーヘッドリボザイムは、例えば、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（
Ｃｅｌｌ ８１：９９１−１００２（参照によって本明細書に組み込まれる））によって
開示される「最小ハンマーヘッド」配列を含んでよい。
本明細書中で用いられる用語「増大」は、量または活性の増大が比較されることになる
量または活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％
、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％
、２０％、５０％、１００％、または２００％超える量または活性に言及し得る。用語「
増大」、「上昇」、「強化」、「超」、および「向上」は、本明細書中で互換的に用いら
れる。用語「増大」は、例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を特徴
付けるために用いられ得、「発現の増大」は、「過剰発現」を意味することもある。
標的部位またはその近傍に変更されたゲノムを有する、それらの細胞を、スクリーンマ
ーカー表現型を使用せずに同定するには、様々な方法が利用できる。そうした方法は、標
的配列中の変化を検出するための、標的配列の直接分析と見なすことができ、限定はされ
ないが、ＰＣＲ法、配列決定法、ヌクレアーゼ消化法、サザンブロット法およびこれらの
任意の組み合わせが挙げられる。
標準のＤＮＡ分離、精製、分子クローニング、ベクターコンストラクションおよび検証
／キャラクタリゼーションの方法は十分に確立されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）を参照されたい。ベクターおよびコンストラクトには、環状プラ
スミドおよび線形ポリヌクレオチドが含まれ、これらには目的のポリヌクレオチド、およ
び場合によりリンカー、アダプター、調節要素または分析要素を含む、他の構成要素が含
まれる。いくつかの実施例では、認識部位および／または標的部位は、イントロン、コー
ド配列、５’末端ＵＴＲ、３’末端ＵＴＲおよび／または調節領域内に含有させることが
できる。
略語の意味は以下の通りである：「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、
「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「
ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」マイクロモル濃度
を意味し、「ｍＭ」ミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」は
ミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、
「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意
味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、そして「ｋｂ」キロベースを意味する。
本明細書中で開示される組成物および方法の非限定的な例として、以下がある：
１．単一ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合したポリメラーゼ
ＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）プロモーターを含む組み換えＤＮＡコンストラクトであって、前記
組み換えＤＮＡコンストラクトは、リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含まず、
前記ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成することが
でき、前記複合体は、真核生物のゲノム中の標的部位配列に結合することができ、かつこ
れを切断することができる、組み換えＤＮＡコンストラクト。
２．実施形態１の組み換えＤＮＡを含む非従来型酵母。
３．前記酵母は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シュ
ワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒ
ｏｍｙｃｅｓ）属、アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐ
ｏｒｏｎ）属、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属
、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、クリプトコッカ
ス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ファフ
ィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、お
よびパキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属からなる群から選択される属のメンバーであ
る、実施形態２の非従来型酵母。
４．実施形態１の組み換えＤＮＡによってコードされる単一ガイドＲＮＡ。
５．実施形態１の少なくとも１つの組み換えＤＮＡを含む発現ベクター。
６．Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチドをさらに含む、実施形態５の発
現ベクター。
７．ベクターはさらに、ポリヌクレオチド改変鋳型ＤＮＡまたはドナーＤＮＡをコードす
る少なくとも１つのヌクレオチドを含む、実施形態５の発現ベクター。
８．非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位を改変する方法であって、非
従来型酵母に、実施形態１の少なくとも第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、およびＣ
ａｓエンドヌクレアーゼをコードする第２の組み換えＤＮＡコンストラクトを提供するこ
とを含み、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、前記標的部位に一本鎖切断または二本鎖切断を
導入する、方法。
９．実施形態１の少なくとも第１の組み換えＤＮＡコンストラクトおよび第２の組み換え
ＤＮＡコンストラクトは、同じポリヌクレオチドまたは別個のポリヌクレオチドの上に位
置決めされている、実施形態８の方法。
１０．前記標的部位に改変を有する少なくとも１つの非従来型酵母細胞を同定することを
さらに含み、改変は、前記標的部位において、１つ以上のヌクレオチドの少なくとも１つ
の欠失、付加、または置換を含む、実施形態８または９の方法。
１１．ドナーＤＮＡを前記酵母に提供することをさらに含み、前記ドナーＤＮＡは、注目
するポリヌクレオチドを含む、実施形態８または９の方法。
１２．前記標的部位に統合された注目するポリヌクレオチドを染色体またはエピソーム中
に含む少なくとも１つの酵母細胞を同定することをさらに含む、実施形態１１の方法。
１３．前記非従来型酵母における突然変異効率を同定することをさらに含む、実施形態８
または９の方法。
１４．非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上のヌクレオチド配列を編集する方法で
あって、非従来型酵母に、ポリヌクレオチド改変鋳型ＤＮＡ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ
をコードするＤＮＡ配列を含む第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および実施形態１
の第２の組み換えＤＮＡコンストラクトを提供することを含み、Ｃａｓエンドヌクレアー
ゼは、前記酵母の染色体またはエピソーム中の標的部位に、一本鎖切断または二本鎖切断
を導入し、前記ポリヌクレオチド改変鋳型ＤＮＡは、前記ヌクレオチド配列の少なくとも
１つのヌクレオチド改変を含む、方法。
１５．非従来型酵母の染色体またはエピソーム上のヌクレオチド配列をサイレンシングす
る方法であって、非従来型酵母に、不活化ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ
配列を含む少なくとも第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および実施形態１の少なく
とも第２の組み換えＤＮＡコンストラクトを提供することを含み、前記ガイドＲＮＡ分子
および不活化Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、前記酵母の染色体またはエピソーム中の前記
ヌクレオチド配列に結合することによって、前記ヌクレオチド配列の転写を阻止する複合
体を形成することができる、方法。
１６．デュアルガイドＲＮＡ（別々の分子上のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）をコ
ードするポリヌクレオチドに作動可能に結合したポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）プロ
モーターを含む組み換えＤＮＡコンストラクトであって、デュアルガイドＲＮＡは、ガイ
ドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成することができ、前記複合体は、真核
生物のゲノム中の標的部位配列に結合することができ、かつこれを切断することができる
、組み換えＤＮＡコンストラクト。
１７．真核生物は、微生物、酵母、非従来型酵母、真菌、植物、古細菌細胞、ヒト以外の
動物、昆虫、および線虫の群から選択される、実施形態１および１６の組み換えＤＮＡコ
ンストラクト。
１８．実施形態１または１６の組み換えＤＮＡによってコードされるデュアルガイドＲＮ
Ａ。
下記の実施例では、別途明記しない限り、部および割合は重量によるものであり、度は
摂氏である。これらの実施例は、本開示の実施形態を示すものであるが、例示のみを目的
として提示されることを理解すべきである。上記の議論およびこれらの実施例から、当業
者は本開示の様々な変更および改変を行って本開示を様々な用法および条件に適合させる
ことができる。そのような改変も、添付した特許請求の範囲に含まれるものとする。
実施例１
Ｃｓｙ４またはＮＬＳ−Ｃｓｙ４は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属において機能的
である
本実施例は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属におけるＣＡＮ１遺伝子の不活化のた
めに、２８ヌクレオチドＣｓｙ４認識部位が隣接するＣＡＮ１ターゲティングｓｇＲＮＡ
をコードするＤＮＡ組み換えＤＮＡを含むＣａｓ９発現プラスミド中に、Ｃｓｙ４（Ｃａ
ｓ６としても知られている）コーディング遺伝子をクローニングすることを記載する。Ｎ
末端核局在化配列（ＮＬＳ）の存在下または不在下でＣｓｙ４発現を可能にする、２つの
異なる組み換えコンストラクトを作製した。
ｐＹＲＨ２８６は、ＦＢＡ１プロモーター（配列番号２）の下でＮＬＳ−Ｃａｓ９エン
ドヌクレアーゼ（配列番号１）を、そしてＦＢＡ１プロモーター（配列番号２）の下でＣ
ｓｙ４（配列番号３）発現についてコドン最適化されたヤロウイア・リポリティカ（Ｙａ
ｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子を発現した。
ｐＹＲＨ２９０は、ｐＹＲＨ２８６に基づいており、そして追加的に、ＲＮＡポリメラ
ーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）プロモーターであるＴＤＨ１（配列番号８）の下で、ＣＡＮ１
標的配列（配列番号７）を標的とする、２８ヌクレオチド（ｎｔ）Ｃｓｙ４エンドヌクレ
アーゼ認識配列（配列番号５）が隣接するｐｒｅ−ｓｇＲＮＡ（配列番号６）を発現する
ＤＮＡ断片（配列番号４）を含有した（図１Ｂ）。
ｐＹＲＨ３１９は、ｐＹＲＨ２９０に基づいており、Ｃｓｙ４をコードする遺伝子が、
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｃ
ｓｙ４（配列番号９）へのＮＬＳ融合体をコードする遺伝子によって置き換えられており
、ＮＬＳは、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）一分節アミノ末端基ＮＬＳ（配列番号１
０）である。
ｐＹＲＨ３２７は、ｐＹＲＨ２９０に基づいており、Ｃｓｙ４をコードする遺伝子が欠
失していた。したがって、ｐＹＲＨ３２７は、Ｃａｓ９、および２８ヌクレオチド（ｎｔ
）Ｃｓｙ４エンドヌクレアーゼ認識配列（配列番号５）が隣接するｐｒｅ−ｓｇＲＮＡ（
配列番号６）を発現した。
全てのベクターは、完全長ＡＲＳ１８（配列番号１２）の３’末端２７ｂｐを欠く不完
全な自己複製配列ＡＲＳ１８（配列番号１１）を含有した。
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属株ＡＴＣＣ２０３６２のＵｒａマイナス誘導体（Ｙ
２２２４）をプラスミドで形質転換して、形質転換体を、ウラシルを欠くＣＭプレート上
で選択した。選択プレート上で増殖させた形質転換体を、ｃａｎ１突然変異体を選択する
ためにカナバニンを含有するＣＭプレートにレプリカプレーティングした。カナバニンを
含有するＣＭプレート上で増殖したコロニーを計数して、標的部位の突然変異を、配列決
定法によって確認した。
表２は、ＮＬＳ−Ｃａｓ９、Ｃｓｙ４部位が隣接したｇＲＮＡ、およびＮＬＳ−Ｃｓｙ
４（ｐＹＲＨ３１９を参照）で形質転換したコロニーが、ＣＡＮ１中に標的突然変異を発
生させるのに、ＮＬＳ−Ｃａｓ９、Ｃｓｙ４部位が隣接したｇＲＮＡ、およびＣｓｙ４（
ｐＹＲＨ２９０）で形質転換したコロニーよりも約２３％有効であったことを示す。興味
深いことに、ＮＬＳ−Ｃａｓ９、およびＣｓｙ４部位が隣接したｇＲＮＡを発現したが、
ＣＳＹ４（ｐＹＲＨ３２７）を発現しなかった形質転換体もまた、標的突然変異体をもた
らした。
Figure 2021058209
次に、機能的ガイドＲＮＡが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターによって直接発現
され得るかを判定する実験を実行した。
実施例２
ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）の下で発現されたｇＲＮＡは、ヤロウイア（Ｙ
ａｒｒｏｗｉａ）属において機能的である
本実施例は、ターミネーター配列の存在下または不在下で、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプ
ロモーターに作動可能に結合した単一ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡに隣接する２８ｎ
ｔ Ｃｓｙ４認識部位を欠く組み換えＤＮＡコンストラクト（図１Ａ）による、ヤロウイ
ア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属におけるＣＡＮ１ターゲティングｓｇＲＮＡの発現を記載する
。これらの組み換えＤＮＡコンストラクトの有効性を、単一ガイドＲＮＡをコードするＤ
ＮＡに隣接する２８ｎｔ Ｃｓｙ４認識部位を有する組み換えＤＮＡコンストラクト（図
１Ｂ）と比較した。Ｃａｓ９が、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属におけるＣＡＮ１遺
伝子不活化用のプラスミド上で共発現された。
ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが機能的ｇＲＮＡをもたらし得るかを試験するた
めに、プラスミドｐＹＲＨ３７６、ｐＹＲＨ３７８、ｐＹＲＨ３７９、およびｐＹＲＨ３
８０を構築した。全てのプラスミドは、ＦＢＡ１プロモーター（配列番号２）の下でＮＬ
Ｓ−Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ（配列番号１）を発現する同じ骨格プラスミド（ｐＲＦ
２９１）を用いた。全てのプラスミドは、完全長ＡＲＳ１８（配列番号１２）を含有した
。
ｐＹＲＨ３７６は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターであるＴＤＨ１プロモーター
（配列番号８）の下で、ＣＡＮ１標的配列（配列番号７）を標的とする、２８ｎｔ Ｃｓ
ｙ４エンドヌクレアーゼ認識配列（配列番号５）が隣接したｐｒｅ−ｓｇＲＮＡ（配列番
号６）を発現する。
ｐＹＲＨ３７８は、ＴＤＨ１プロモーター（配列番号８）の下で、ＣＡＮ１標的配列（
配列番号７）を標的とするｐｒｅ−ｓｇＲＮＡ（配列番号６）を発現する。
ｐＹＲＨ３７９は、ＴＤＨ１プロモーター（配列番号８）の下で、そしてまた、ｐｒｅ
−ｓｇＲＮＡの３’のＴＤＨ１ターミネーター配列（配列番号１３）により、ＣＡＮ１標
的配列（配列番号７）を標的とするｐｒｅ−ｓｇＲＮＡ（配列番号６）を発現する。
ｐＹＲＨ３８０は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターであるＦＢＡ１（配列番号２
）の下で、ＣＡＮ１標的配列（配列番号７）を標的とする、２８ｎｔ Ｃｓｙ４エンドヌ
クレアーゼ認識配列（配列番号５）が隣接したｐｒｅ−ｓｇＲＮＡ（配列番号６）を発現
する。
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属株ＡＴＣＣ２０３６２のＵｒａマイナス誘導体（Ｙ
２２２４）をプラスミドで形質転換して、形質転換体を、ウラシルを欠くＣＭプレート上
で選択した。選択プレート上で増殖させた形質転換体を、ｃａｎ１突然変異体を選択する
ためにカナバニンを含有するＣＭプレートにレプリカプレーティングした。カナバニンを
含有するＣＭプレート上で増殖したコロニーを計数して、形質転換体の総数と比較するこ
とによって、突然変異頻度を算出した。
図２に示すように、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの下で発現されるｇＲＮＡは
、機能的であった。そして、ｇＲＮＡの５’および３’の２８ｎｔ Ｃｓｙ４エンドヌク
レアーゼ認識配列の有無に関係なく、全形質転換体の約７０％でカナバニン耐性突然変異
体が生じた。
実施例３
Ｃａｓ９発現プラスミド、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）ｇＲＮＡ発現
カセットの構築
この実施例は、Ｃａｓ９、およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａ）染色体配列を標的とするｇＲＮＡの双方を構成的に発現する単一ヤロウイア・リポリ
ティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）プラスミドを生じさせるための、化膿連鎖球菌（Ｓ
．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質の構成的発現用のヤロウイア・リポリティカ（
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）プラスミドの構築、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ ｇＲＮＡ発現
カセットの構築、およびＣａｓ９発現プラスミド中への当該発現カセットの挿入について
考察する。
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属においてｓｇＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシ
ステムを試験するために、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅ
ｓ）Ｍ１ ＧＡＳ由来のＣａｓ９遺伝子（ＳＦ３７０（配列番号１））を、当該技術にお
いて知られている標準的な技術でヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化した（
配列番号１４）。Ｃａｓ９タンパク質を細胞の核に局在化させるために、シミアンウィル
ス４０（ＳＶ４０）一分節（ＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号１５）核局在化シグナルを、Ｃａ
ｓ９タンパク質のカルボキシ末端に組み込んだ。ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コド
ン最適化Ｃａｓ９遺伝子を、標準的な分子生物学の技術によって、ヤロウイア（Ｙａｒｒ
ｏｗｉａ）属構成的プロモーター、ＦＢＡ１（配列番号１６）に融合させた。ヤロウイア
（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９発現カセット（配列番号１７）の例が、Ｆ
ＢＡ１プロモーター、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化Ｃａｓ９−ＮＬＳ融合体
を含有した。そして、Ｃａｓ９発現カセットを、プラスミドｐＺｕｆ、およびｐＺｕｆＣ
ａｓ９と呼ばれる新しいコンストラクト（配列番号１８）中にクローニングした。
ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写ｇＲＮＡ発現カセット（図３Ａ〜図３Ｃ）を生じさせるた
めに、異なるプロモーター（ＦＢＡ１またはＴＥＦ１）を、転写開始部位（ＴＳＳ）に、
または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の末端に組み合わせた。ＤＮＡ断片は、Ｃａｎ１−１部
位を標的とするｇＲＮＡをコードする。ｇＲＮＡの３’側を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩタ
ーミネーター（ＡＣＴ１）と、またはＨＤＶリボザイムおよびその次にＡＣＴ１ターミネ
ーターをコードするＤＮＡと融合させた。これらのコンストラクトは、ｇＲＮＡとのプロ
モーターの最適な融合を、そして、ＨＤＶリボザイム（それ自体、および転写されるあら
ゆるターミネーター配列を、ｇＲＮＡの３’末端から自己触媒的に除去することとなる）
の存在により、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質による遺伝子
ターゲティングが可能となるかを試験する。
ＴＥＦ１ＴＳＳプロモーター断片（配列番号１９）を、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙ
．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムＤＮＡから、標準的なＰＣＲ（ｇｇｇｔｔａａｔｔａａ
ＡＧＡＧＡＣＣＧＧＧＴＴＧＧＣＧＧＣＧＣ（配列番号２０）、フォワード、およびｇａ
ｇｇｇｔｇｇｇｔａａｔｃｇｔｔｔｇａｔｔｇａＣＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡ（配
列番号２１）、リバース）を用いて増幅させた。フォワードプライマーは、ＰａｃＩ制限
エンドヌクレアーゼ部位を付加する。リバースプライマーは、Ｃａｎ１−１ ｇＲＮＡを
コードするＤＮＡの最初の２０ヌクレオチドを付加する。ＴＥＦ１ＵＴＲプロモーター（
配列番号２２）を、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムＤＮ
Ａから、標準的なＰＣＲ（ｇｇｇｔｔａａｔｔａａＡＧＡＧＡＣＣＧＧＧＴＴＧＧＣＧＧ
ＣＧＣ（配列番号２０）、フォワード、およびｇａｇｇｇｔｇｇｇｔａａｔｃｇｔｔｔｇ
ａＴＴＴＧＡＡＴＧＡＴＴＣＴＴＡＴＡＣＴＣ（配列番号２３）、リバース）を用いて増
幅させた。フォワードプライマーは、ＰａｃＩ制限部位を付加し、リバースプライマーは
、Ｃａｎ１−１ ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの最初の２０ヌクレオチドを付加する。Ｆ
ＢＡ１ＴＳＳプロモーター断片（配列番号２４）を、ｐＺｕｆＣａｓ９（配列番号１８）
から、標準的なＰＣＲ（ｇｇｇｔｔａａｔｔａａｇｔｔｔａａａｃｃａｔｃａｔｃｔａａ
ｇｇｇｃｃ（配列番号２５）、フォワード、およびｇａｇｇｇｔｇｇｇｔａａｔｃｇｔｔ
ｔｇａｔｇｇｃａａｃｃｇａｔｔｇｇｇａｇａｇｃ（配列番号２６）、リバース）を用い
て増幅させた。フォワードプライマーは、ＰａｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を付加し
、リバースプライマーは、Ｃａｎ１−１ ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの２０ヌクレオチ
ドを付加する。ＦＢＡ１ＵＴＲプロモーター（配列番号２７）を、ｐＺｕｆＣａｓ９（配
列番号１８）から、標準的なＰＣＲ（ｇｇｇｔｔａａｔｔａａｇｔｔｔａａａｃｃａｔｃ
ａｔｃｔａａｇｇｇｃｃ（配列番号２５）、フォワード、およびｇａｇｇｇｔｇｇｇｔａ
ａｔｃｇｔｔｔｇａｇｇｔｇｔｇａｔｇｔｇｔａｇｔｔｔａｇａ（配列番号２８）、リバ
ース）を用いて増幅させた。フォワードプライマーは、ＰａｃＩエンドヌクレアーゼ認識
部位を付加し、リバースプライマーは、Ｃａｎ１−１ ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの２
０ヌクレオチドを付加する。
Ｃａｎ１−１ ｇＲＮＡをコードするＤＮＡへの融合用のＡＣＴ１ターミネーター断片
（配列番号２９）を、ｐＦＢ２３（配列番号３０）から、標準的なＰＣＲ（ａｃｃｇａｇ
ｔｃｇｇｔｇｇｔｇｃｔｔｔｔＧＧＣＣＧＣｇｔｇｔｇｇｔｇａｔｔｇｃｔ（配列番号３
１）、フォワード、およびｇｇｇｇａｔｃｇａｔｔｇｇａａｇａｇａｔｔｔｃｇａａｇｃ
ａｃｇ（配列番号３２）、リバース）を用いて増幅させた。フォワードプライマーは、Ｃ
ａｎ１−１ ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの最も３’の２０ヌクレオチドを付加し、リバ
ースプライマーは、ＣｌａＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を付加する。３’ＨＤＶが
隣接したＣａｎ１−１ ｇＲＮＡをコードするＤＮＡへの融合用のＡＣＴ１ターミネータ
ー（配列番号３３）を、ｐＦＢ２３（配列番号３０）から、標準的なＰＣＲ（ｃｔｔｃｇ
ｇｃａｔｇｇｃｇａａｔｇｇｇａＧＧＣＣＧＣｇｔｇｔｇｇｔｇａｔｔｇｃｔ（配列番号
３４）、フォワード、およびｇｇｇｇａｔｃｇａｔｔｇｇａａｇａｇａｔｔｔｃｇａａｇ
ｃａｃｇ（配列番号３２）、リバース）を用いて増幅させた。フォワードプライマーは、
３’ＨＤＶが隣接したＣａｎ１−１ ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの最も３’の２０ヌク
レオチドを付加し、リバースプライマーは、ＣｌａＩ部位を付加する。
Ｃａｎ１−１ ｇＲＮＡ（配列番号３５）をコードするＤＮＡを、ＦＢＡ１ＴＳＳ断片
（配列番号２４）およびＡＣＴ１ターミネーター断片（配列番号２９）への融合用に、ｐ
ＲＦ８４（配列番号３６）（ｇｃｔｃｔｃｃｃａａｔｃｇｇｔｔｇｃｃａｔｃａａａｃｇ
ａｔｔａｃｃｃａｃｃｃｔｃ（配列番号３７）、フォワード、およびａｇｃａａｔｃａｃ
ｃａｃａｃＧＣＧＧＣＣａａａａｇｃａｃｃａｃｃｇａｃｔｃｇｇｔ（配列番号３８）、
リバース）を用いる標準的なＰＣＲを用いて増幅させた。フォワードプライマーは、ＦＢ
Ａ１ＴＳＳ断片の最も３’の２０ヌクレオチドに対応する２０ヌクレオチドを付加し、リ
バースプライマーは、ＡＣＴ１ターミネーター断片の最も５’の２０ヌクレオチドに対応
する２０ヌクレオチドを付加する。３’ＨＤＶが隣接したＣａｎ１−１ ｇＲＮＡ（配列
番号３９）をコードするＤＮＡを、ＦＢＡ１ＴＳＳプロモーター（配列番号２４）断片お
よびＡＣＴ１ターミネーター断片（配列番号３３）への融合用のｐＲＦ８４（配列番号３
６）から、標準的なＰＣＲ（ｇｃｔｃｔｃｃｃａａｔｃｇｇｔｔｇｃｃａｔｃａａａｃｇ
ａｔｔａｃｃｃａｃｃｃｔｃ（配列番号３７）、フォワード、およびａｇｃａａｔｃａｃ
ｃａｃａｃＧＣＧＧＣＣｔｃｃｃａｔｔｃｇｃｃａｔｇｃｃｇａａｇ（配列番号４０）、
リバース）を用いて増幅させた。フォワードプライマーは、ＦＢＡ１ＴＳＳ断片の最も３
’の２０ヌクレオチドを付加し、リバースプライマーは、ＡＣＴ１ターミネーターの最も
５’の２０ヌクレオチドを付加する。Ｃａｎ１−１ ｇＲＮＡ（配列番号４１）をコード
するＤＮＡを、ＦＢＡ１ＵＴＲプロモーター断片（配列番号２７）およびＡＣＴ１ターミ
ネーター断片（配列番号２９）への融合用のｐＲＦ８４（配列番号３６）から、標準的な
ＰＣＲ（ｔｃｔａａａｃｔａｃａｃａｔｃａｃａｃｃｔｃａａａｃｇａｔｔａｃｃｃａｃ
ｃｃｔｃ（配列番号４２）、フォワード、およびａｇｃａａｔｃａｃｃａｃａｃＧＣＧＧ
ＣＣａａａａｇｃａｃｃａｃｃｇａｃｔｃｇｇｔ（配列番号３８）、リバース）を用いて
増幅させた。フォワードプライマーは、ＦＢＡ１ＵＴＲ断片の最も３’の２０ヌクレオチ
ドを付加し、リバースプライマーは、ＡＣＴ１ターミネーター断片の最も５’の２０ヌク
レオチドを付加する。３’ＨＤＶが隣接したＣａｎ１−１ ｇＲＮＡ（配列番号４３）を
コードするＤＮＡを、ＦＢＡ１ＵＴＲ断片（配列番号２７）およびＡＣＴ１ターミネータ
ー（配列番号３３）断片への融合用のｐＲＦ８４（配列番号３６）から、標準的なＰＣＲ
（ｔｃｔａａａｃｔａｃａｃａｔｃａｃａｃｃｔｃａａａｃｇａｔｔａｃｃｃａｃｃｃｔ
ｃ（配列番号４２）、フォワード、およびａｇｃａａｔｃａｃｃａｃａｃＧＣＧＧＣＣｔ
ｃｃｃａｔｔｃｇｃｃａｔｇｃｃｇａａｇ（配列番号４０）、リバース）を用いて増幅さ
せた。フォワードプライマーは、ＦＢＡ１ＵＴＲ断片の最も３’の２０ヌクレオチドを付
加し、リバースプライマーは、ＡＣＴ１ターミネーター断片の最も５’の２０ヌクレオチ
ドを付加する。Ｃａｎ１−１ ｇＲＮＡ（配列番号４４）をコードするＤＮＡを、ＴＥＦ
１ＴＳＳ断片（配列番号１９）およびＡＣＴ１ターミネーター（配列番号２９）断片への
融合用のｐＲＦ８４（配列番号３６）から、標準的なＰＣＲ（ＴＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣ
ＣＴＴＧｔｃａａｔｃａａａｃｇａｔｔａｃｃｃａｃｃｃｔｃ（配列番号４５）、フォワ
ード、およびａｇｃａａｔｃａｃｃａｃａｃＧＣＧＧＣＣａａａａｇｃａｃｃａｃｃｇａ
ｃｔｃｇｇｔ（配列番号３８）、リバース）を用いて増幅させた。フォワードプライマー
は、ＴＥＦ１ＴＳＳ断片の最も３’の２０ヌクレオチドを付加し、リバースプライマーは
、ＡＣＴ１ターミネーター断片の最も５’の２０ヌクレオチドを付加する。３’ＨＤＶリ
ボザイムが隣接したＣａｎ１−１ ｇＲＮＡ（配列番号４６）を、ＴＥＦ１ＴＳＳ断片（
配列番号１９）およびＡＣＴ１ターミネーター断片（配列番号３３）への融合用のｐＲＦ
８４（配列番号３６）から、標準的なＰＣＲ（ＴＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＴＧｔｃａ
ａｔｃａａａｃｇａｔｔａｃｃｃａｃｃｃｔｃ配列番号４４、フォワード、およびａｇｃ
ａａｔｃａｃｃａｃａｃＧＣＧＧＣＣｔｃｃｃａｔｔｃｇｃｃａｔｇｃｃｇａａｇ（配列
番号４０）、リバース）を用いて増幅させた。フォワードプライマーは、ＴＥＦ１ＴＳＳ
断片の最も３’の２０ヌクレオチドを付加し、リバースプライマーは、ＡＣＴ１ターミネ
ーターの最も５’の２０ヌクレオチドを付加する。Ｃａｎ１−１ ｇＲＮＡ（配列番号４
７）をコードするＤＮＡを、ＴＥＦ１ＵＴＲ断片（配列番号２２）およびＡＣＴ１ターミ
ネーター断片（配列番号２９）への融合用のｐＲＦ８４（配列番号３６）から、標準的な
ＰＣＲ（ｇａｇｇｇｔｇｇｇｔａａｔｃｇｔｔｔｇａＴＴＴＧＡＡＴＧＡＴＴＣＴＴＡＴ
ＡＣＴＣ（配列番号４８）、フォワード、およびａｇｃａａｔｃａｃｃａｃａｃＧＣＧＧ
ＣＣａａａａｇｃａｃｃａｃｃｇａｃｔｃｇｇｔ（配列番号３８）、リバース）を用いて
増幅させた。フォワードプライマーは、ＴＥＦ１ＵＴＲ断片の最も３’の２０ヌクレオチ
ドを付加し、リバースプライマーは、ＡＣＴ１ターミネーター断片の最も５’の２０ヌク
レオチドを付加する。３’ＨＤＶが隣接したｇＲＮＡターゲティング（配列番号４９）Ｃ
ａｎ１−１をコードするＤＮＡを、ＴＥＦ１ＵＴＲ断片（配列番号２２）およびＡＣＴ１
ターミネーター（配列番号３３）断片との融合用のｐＲＦ８４（配列番号３６）から、標
準的なＰＣＲ（ｇａｇｇｇｔｇｇｇｔａａｔｃｇｔｔｔｇａＴＴＴＧＡＡＴＧＡＴＴＣＴ
ＴＡＴＡＣＴＣ（配列番号４８）、フォワード、およびａｇｃａａｔｃａｃｃａｃａｃＧ
ＣＧＧＣＣｔｃｃｃａｔｔｃｇｃｃａｔｇｃｃｇａａｇ（配列番号４０）、リバース）を
用いて増幅させた。フォワードプライマーは、ＴＥＦ１ＵＴＲ断片の最も３’の２０ヌク
レオチドを付加し、リバースプライマーは、ＡＣＴ１断片の最も５’の２０ヌクレオチド
を付加する。
ＲＮＡポリメラーゼＩＩ発現カセット中へのプロモーター／ｇＲＮＡ／ターミネーター
断片のアセンブリを、３つ全ての部分を含有する単一ＤＮＡ分子をもたらす重複末端から
の合成を用いて実行した（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ５４（３）：１２９−１３３）。特定のコンストラクトを構築するように組み合
わせた部分のリストを、表３に見出すことができる。最終のコンストラクト（表３）を、
ＰａｃＩ／ＣｌａＩで消化して、ｐＺｕｆＣａｓ９（配列番号１８）の同じ部位中にクロ
ーニングした。
Figure 2021058209
ＲＮＡポリメラーゼＩＩ ｇＲＮＡ発現カセットの存在および配列を、プライマーＨＹ
００９（配列番号５８）、ＨＹ０１０（配列番号５９）、およびＯＮ４７６（配列番号６
０）によるサンガー配列決定法を介して確認した。各ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ発現コンスト
ラクト（表２）を含有するプラスミドを用いて、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａ）におけるＣａｎ１−１標的部位（配列番号６１）を標的とした。
実施例４
Ｃａｓ９によるＣａｎ１−１標的部位のターゲティング、およびＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ発
現ｇＲＮＡ
追加的なプロセシング要素（例えば、ｔＲＮＡプロセシング、リボザイム、またはＣｙ
ｓ４切断部位）を用いずにＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを用いてｇＲＮＡが発現
され得るかを試験するために、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）
を、実施例３に記載したコンストラクトで形質転換して、Ｃａｎ１−１標的部位（配列番
号６９）での標的効率をモニタリングした。
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ２０３６２のウラシ
ル要求株を、１００ｎｇのｐＺｕｆＣａｓ９（配列番号１８）、ｐＲＦ３０３（配列番号
７０）、ｐＲＦ６１７（配列番号６１）、ｐＲＦ６１６（配列番号６２）、ｐＲＦ６１９
（配列番号６３）、ｐＲＦ６１８（配列番号６４）、ｐＲＦ６２３（配列番号６７）、ｐ
ＲＦ６２１（配列番号６８）、またはＤＮＡなしで、標準的な酢酸リチウム形質転換技術
を用いて形質転換した。ポスト形質転換細胞を、１．８ｗ／ｖ％Ｂａｃｔｏアガー（Ｔｅ
ｋｎｏｖａ）で固めたＣＭ−ｕｒａ培地上にプレーティングした。プレートを、２５℃に
て４８時間インキュベートした。各形質転換由来の３２コロニーを、アルギニンを欠き、
かつ６０μｇ／ｍｌ Ｌ−カナバニンを含有する完全最小培地上にパッチ状にした。Ｌ−
カナバニンは、細胞へのアルギニンおよびＬ−カナバニンのインポーターである機能的Ｃ
ＡＮ１遺伝子を有する細胞にとって、有毒である。ＣＡＮ１遺伝子中に機能対立遺伝子の
消失を含有する細胞は、培地中のＬ−カナバニンの存在に対して、表現型的に耐性を示す
こととなり、Ｌ−カナバニンを含有するプレート上でコロニーを形成することとなる。Ｃ
ＡＮ１遺伝子の野生型コピーを含有する細胞は、Ｌ−カナバニンを含有する培地上で増殖
することができない。Ｌ−カナバニンの作用モードは周知である（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ
Ｇ．Ａ．，Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｍｏｄｅ ｏｆ
ａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ−Ｃａｎａｖａｎｉｎｅ，ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌ
ｏｇ ｏｆ Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ｔｈｅ ｑｕａｒｔｅｒｌｙ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ
ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ５２，１９７７，１５５−１７８）。
Ｃａｓ９を発現するが、ｇＲＮＡ発現カセットを含有しないｐＺｕｆＣａｓ９（配列番
号１８）で形質転換した細胞由来のコロニーは、カナバニン耐性コロニーを生じさせない
（図４、表４）。
Figure 2021058209
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターによって駆動されるｇＲＮＡ発現カセット、お
よびプロセシング用の５’ＨＤＶリボザイムを含有するｐＲＦ３０３（配列番号７０）で
形質転換した細胞由来のコロニーは、比較的純粋な突然変異コロニー（図４）を、８８％
の頻度にて生じさせる（表３）。また、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターｇＲＮＡ発現カセット
を含有する全てのコンストラクトは、類似した頻度（おおよそ６９％から１００％、表３
）でカナバニン耐性細胞を含有するコロニーを生じさせた。しかしながら、ｐＲＦ６１８
（配列番号６４）、ｐＲＦ６２１（配列番号６８）、およびｐＲＦ６２３（配列番号６７
）を除いて、コロニーは、殆どの場合、Ｌ−カナバニン含有培地上の弱いパッチによって
実証されるように、非突然変異細胞であった（図４）。ＴＥＦ１コンストラクトおよびＦ
ＢＡ１コンストラクトは双方とも、発現カセットにおけるｇＲＮＡのＨＤＶドメイン３’
の付加によって、向上する。このことは、Ｐｏｌ ＩＩターミネーターが、Ｃａｓ９／ｇ
ＲＮＡターゲティングを阻害する配列を残しているかもしれないことを示唆している。加
えて、プロモーターの５’ＵＴＲを含有するコンストラクトは、ｇＲＮＡが転写開始部位
に直接融合して（図４）、頻度全体に影響を及ぼさない（表４）が、単一の形質転換細胞
から生じたコロニー内の突然変異細胞：ＷＴ細胞の比率を増大させるコンストラクトより
も効率的に機能する。
本実施例に提示したデータは、ｇＲＮＡが、転写開始部位または５’非翻訳領域の末端
のいずれかとの融合としての追加的なプロセシング要素なしで、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ
プロモーターから発現され得ることを実証している。ｇＲＮＡとターミネーター配列間へ
のリボザイムの付加により、ターゲティングは向上する。これらのｇＲＮＡの効率は、Ｒ
ＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターおよび／またはプロセシング要素を用いる現存の発
現システムと少なくとも同じくらい良好であるが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータ
ーでは考えられない組織および条件特異的ｇＲＮＡ発現の可能性を含む、ｇＲＮＡ発現用
のプロモーターの非常に大きなプールをオープンする。

Claims (16)

  1. 単一ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合したポリメラーゼＩ
    Ｉ（Ｐｏｌ−ＩＩ）プロモーターを含む組み換えＤＮＡコンストラクトであって、前記ガ
    イドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成することができ、
    前記複合体は、真核生物のゲノム中の標的部位配列に結合することができ、かつこれを切
    断することができる、組み換えＤＮＡコンストラクト。
  2. デュアルガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードするポリヌクレ
    オチドに作動可能に結合したポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）プロモーターを含む組み
    換えＤＮＡコンストラクトであって、前記デュアルガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ／Ｃａ
    ｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成することができ、前記複合体は、真核生物のゲノム中
    の標的部位配列に結合することができ、かつこれを切断することができる、組み換えＤＮ
    Ａコンストラクト。
  3. 請求項１または２に記載の組み換えＤＮＡを含む真核生物。
  4. 前記真核生物は、微生物、酵母、非従来型酵母、真菌、植物、古細菌、ヒト以外の動物
    、昆虫、および線虫を含む群から選択される、請求項１または２に記載の組み換えＤＮＡ
    コンストラクト。
  5. 請求項１に記載の組み換えＤＮＡによってコードされる、単一ガイドＲＮＡまたはデュ
    アルガイドＲＮＡ。
  6. 請求項１に記載の少なくとも１つの組み換えＤＮＡを含む発現ベクター。
  7. Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチドをさらに含む、請求項６に記載の
    発現ベクター。
  8. 前記ベクターはさらに、ポリヌクレオチド改変鋳型ＤＮＡまたはドナーＤＮＡをコード
    する少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項６に記載の発現ベクター。
  9. 非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位を改変する方法であって、非従
    来型酵母に、請求項１に記載の少なくとも第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および
    Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする第２の組み換えＤＮＡコンストラクトを提供する
    ことを含み、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、前記標的部位に一本鎖切断または二本鎖
    切断を導入する、方法。
  10. 請求項１に記載の少なくとも第１の組み換えＤＮＡコンストラクトおよび第２の組み換
    えＤＮＡコンストラクトは、同じポリヌクレオチドまたは別個のポリヌクレオチドの上に
    位置決めされている、請求項９に記載の方法。
  11. 前記標的部位に改変を有する少なくとも１つの非従来型酵母細胞を同定することをさら
    に含み、前記改変は、前記標的部位において、１つ以上のヌクレオチドの少なくとも１つ
    の欠失、付加、または置換を含む、請求項９または１０に記載の方法。
  12. ドナーＤＮＡを前記酵母に提供することをさらに含み、前記ドナーＤＮＡは、注目する
    ポリヌクレオチドを含む、請求項９または１０に記載の方法。
  13. 前記標的部位に統合された注目する前記ポリヌクレオチドを染色体またはエピソーム中
    に含む少なくとも１つの酵母細胞を同定することをさらに含む、請求項１２に記載の方法
    。
  14. 前記非従来型酵母における突然変異効率を同定することをさらに含む、請求項９または
    １０に記載の方法。
  15. 非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上のヌクレオチド配列を編集する方法であっ
    て、非従来型酵母に、ポリヌクレオチド改変鋳型ＤＮＡ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコ
    ードするＤＮＡ配列を含む第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および請求項１に記載
    の第２の組み換えＤＮＡコンストラクトを提供することを含み、前記Ｃａｓエンドヌクレ
    アーゼは、前記酵母の染色体またはエピソーム中の標的部位に、一本鎖切断または二本鎖
    切断を導入し、前記ポリヌクレオチド改変鋳型ＤＮＡは、前記ヌクレオチド配列の少なく
    とも１つのヌクレオチド改変を含む、方法。
  16. 非従来型酵母の染色体またはエピソーム上のヌクレオチド配列をサイレンシングする方
    法であって、非従来型酵母に、不活化ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列
    を含む少なくとも第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および請求項１に記載の少なく
    とも第２の組み換えＤＮＡコンストラクトを提供することを含み、前記ガイドＲＮＡ分子
    および前記不活化Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、前記酵母の前記染色体または前記エピソ
    ーム中の前記ヌクレオチド配列に結合することによって、前記ヌクレオチド配列の転写を
    阻止する複合体を形成することができる、方法。
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Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3613852A3 (en) 2011-07-22 2020-04-22 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9340800B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College Extended DNA-sensing GRNAS
US20150166984A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting alpha-antitrypsin point mutations
WO2016022363A2 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
CA2969619A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Agilent Technologies, Inc. Guide rna with chemical modifications
EP3280803B1 (en) 2015-04-06 2021-05-26 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Chemically modified guide rnas for crispr/cas-mediated gene regulation
IL258821B (en) 2015-10-23 2022-07-01 Harvard College Nucleobase editors and their uses
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
US11293021B1 (en) 2016-06-23 2022-04-05 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
SG11201900907YA (en) 2016-08-03 2019-02-27 Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11352647B2 (en) 2016-08-17 2022-06-07 The Broad Institute, Inc. Crispr enzymes and systems
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
GB2573062A (en) 2016-10-14 2019-10-23 Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
WO2018165629A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
CA3057192A1 (en) 2017-03-23 2018-09-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
US11591601B2 (en) 2017-05-05 2023-02-28 The Broad Institute, Inc. Methods for identification and modification of lncRNA associated with target genotypes and phenotypes
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
HRP20220615T1 (hr) 2017-06-30 2022-06-24 Inscripta, Inc. Postupci, moduli, instrumenti i sustavi za automatiziranu obradu stanica
JP2020534795A (ja) 2017-07-28 2020-12-03 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ファージによって支援される連続的進化（ｐａｃｅ）を用いて塩基編集因子を進化させるための方法および組成物
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
US20210180053A1 (en) * 2017-11-01 2021-06-17 Novartis Ag Synthetic rnas and methods of use
WO2019209926A1 (en) 2018-04-24 2019-10-31 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of peptide libraries
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
US10557216B2 (en) 2018-04-24 2020-02-11 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of T-cell receptor peptide libraries
WO2020005383A1 (en) 2018-06-30 2020-01-02 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US11142740B2 (en) 2018-08-14 2021-10-12 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
GB201817010D0 (en) * 2018-10-18 2018-12-05 Imperial Innovations Ltd Methods
US11214781B2 (en) 2018-10-22 2022-01-04 Inscripta, Inc. Engineered enzyme
CN113227368B (zh) 2018-10-22 2023-07-07 因思科瑞普特公司 工程化酶
US10982200B2 (en) * 2019-02-14 2021-04-20 Metagenomi Ip Technologies, Llc Enzymes with RuvC domains
WO2020191153A2 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
CN113631713A (zh) * 2019-03-25 2021-11-09 因思科瑞普特公司 酵母中的同时多重基因组编辑
US11001831B2 (en) 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
WO2020236967A1 (en) 2019-05-20 2020-11-26 The Broad Institute, Inc. Random crispr-cas deletion mutant
CA3139122C (en) 2019-06-06 2023-04-25 Inscripta, Inc. Curing for recursive nucleic acid-guided cell editing
US10920189B2 (en) 2019-06-21 2021-02-16 Inscripta, Inc. Genome-wide rationally-designed mutations leading to enhanced lysine production in E. coli
US10927385B2 (en) 2019-06-25 2021-02-23 Inscripta, Inc. Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
US20220298501A1 (en) 2019-08-30 2022-09-22 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated mu transposase systems
US11203762B2 (en) 2019-11-19 2021-12-21 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
US10883095B1 (en) 2019-12-10 2021-01-05 Inscripta, Inc. Mad nucleases
JP2023507566A (ja) 2019-12-18 2023-02-24 インスクリプタ， インコーポレイテッド 核酸誘導ヌクレアーゼ編集済み細胞のｉｎ ｖｉｖｏ検出のためのカスケード／ｄＣａｓ３相補性アッセイ
WO2021154706A1 (en) 2020-01-27 2021-08-05 Inscripta, Inc. Electroporation modules and instrumentation
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
KR20230019843A (ko) 2020-05-08 2023-02-09 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 표적 이중 가닥 뉴클레오티드 서열의 두 가닥의 동시 편집을 위한 방법 및 조성물
US11787841B2 (en) 2020-05-19 2023-10-17 Inscripta, Inc. Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli
US11299731B1 (en) 2020-09-15 2022-04-12 Inscripta, Inc. CRISPR editing to embed nucleic acid landing pads into genomes of live cells
US11512297B2 (en) 2020-11-09 2022-11-29 Inscripta, Inc. Affinity tag for recombination protein recruitment
CN114480470A (zh) * 2020-11-13 2022-05-13 深圳华大生命科学研究院 高通量制备模式生物基因编辑突变体的方法及相关质粒
AU2021415461A1 (en) 2021-01-04 2023-08-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
US11332742B1 (en) 2021-01-07 2022-05-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
WO2022197727A1 (en) * 2021-03-15 2022-09-22 Duke University Generation of novel crispr genome editing agents using combinatorial chemistry
CA3173953A1 (en) * 2021-06-11 2023-12-10 Tyson D. BOWEN Rna polymerase iii promoters and methods of use
US11884915B2 (en) 2021-09-10 2024-01-30 Agilent Technologies, Inc. Guide RNAs with chemical modification for prime editing
US11643672B2 (en) * 2021-10-01 2023-05-09 The Florida International University Board Of Trusters Inducible CRISPR system expression and applications thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015004241A2 (en) * 2013-07-10 2015-01-15 Novartis Ag Multiple proteases deficient filamentous fungal cells and methods of use thereof
WO2015006747A2 (en) * 2013-07-11 2015-01-15 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions comprising synthetic polynucleotides encoding crispr related proteins and synthetic sgrnas and methods of use.
WO2015138855A1 (en) * 2014-03-14 2015-09-17 The Regents Of The University Of California Vectors and methods for fungal genome engineering by crispr-cas9

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
US5316931A (en) 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
US5879918A (en) 1989-05-12 1999-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Pretreatment of microprojectiles prior to using in a particle gun
US5240855A (en) 1989-05-12 1993-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Particle gun
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
US5324646A (en) 1992-01-06 1994-06-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of regeneration of Medicago sativa and expressing foreign DNA in same
WO1994002620A2 (en) 1992-07-27 1994-02-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of agrobacterium-mediated transformation of cultured soybean cells
IL108241A (en) 1992-12-30 2000-08-13 Biosource Genetics Corp Plant expression system comprising a defective tobamovirus replicon integrated into the plant chromosome and a helper virus
US5736369A (en) 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
AU3495297A (en) 1996-07-08 1998-02-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transformation of zygote, egg or sperm cells and recovery of transformed plants from isolated embryo sacs
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
RU2441366C2 (ru) 2006-01-12 2012-02-10 Сайбас Юроп Б.В. Мутанты epsps
PE20150336A1 (es) 2012-05-25 2015-03-25 Univ California Metodos y composiciones para la modificacion de adn objetivo dirigida por arn y para la modulacion de la transcripcion dirigida por arn
WO2015048707A2 (en) * 2013-09-30 2015-04-02 Regents Of The University Of Minnesota Conferring resistance to geminiviruses in plants using crispr/cas systems
CN106103706B (zh) * 2013-12-26 2021-08-24 通用医疗公司 多重引导rna
WO2015153940A1 (en) * 2014-04-03 2015-10-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for the production of guide rna
EP3242948B1 (en) * 2015-01-06 2021-12-22 DSM IP Assets B.V. A crispr-cas system for a yarrowia host cell

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015004241A2 (en) * 2013-07-10 2015-01-15 Novartis Ag Multiple proteases deficient filamentous fungal cells and methods of use thereof
WO2015006747A2 (en) * 2013-07-11 2015-01-15 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions comprising synthetic polynucleotides encoding crispr related proteins and synthetic sgrnas and methods of use.
WO2015138855A1 (en) * 2014-03-14 2015-09-17 The Regents Of The University Of California Vectors and methods for fungal genome engineering by crispr-cas9

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MOLECULAR CELL, 2014, VOL.54, PP.689-710, JPN6020036730, ISSN: 0004881833 *
PROTEIN CELL, 2015, VOL.6, NO.9, PP.689-692, JPN6020036729, ISSN: 0004881832 *
SCIENTIFIC REPORTS, 16 DEC. 2015, VOL.5, ARTICLE NO.18341, PP.1-8, JPN6020036731, ISSN: 0004881834 *
YANGBIN GAO; ET AL: "SELF-PROCESSING OF RIBOZYME-FLANKED RNAS INTO GUIDE RNAS IN VITRO AND IN VIVO FOR CRISPR-MEDIATED GE", JOURNAL OF INTEGRATIVE PLANT BIOLOGY, vol. VOL:56, NR:4, JPN5019000021, 6 April 2014 (2014-04-06), pages 343 - 349, ISSN: 0004716656 *

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