JP2020022507A - カンナビノイドの生合成 - Google Patents

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Abstract

【課題】互いに異なるカンナビノイド生成物を回収する方法及びシステムが開示される。【解決手段】反応混合物中で、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）をＣＢＤＡ合成酵素と反応させ、前記反応混合物のｐＨを４．０と８．０のレンジ内に選択して、前記ＣＢＤＡ及び前記ＣＢＣＡを生成し、生成された前記ＣＢＤＡ及び前記ＣＢＣＡを回収することを含む方法が提案される。【選択図】図１

Description

本願は、２０１３年２月２８日付けで出願された米国仮特許出願第６１／７７０，７６６号（その内容が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）の優先権の利益を主張するものである。
本発明はカンナビノイドの生合成に関する。より具体的には本発明は、薬学的及び栄養学的用途に好適なｅｘ ｖｉｖｏでのミリグラム〜グラム又はキログラム量のカンナビノイドの製造に植物中のカンナビノイドの合成に関与するプロテインキナ−ゼ合成酵素を使用する方法に関する。
カンナビノイドはアサ科の一年生植物であるカンナビス・サティバ（Cannabis sativa：アサ）に由来する化合物である。植物は約６０種のカンナビノイドを含有する。最もよく知られている天然のカンナビノイドはテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）であり、緑内障、ＡＩＤＳ消耗症、神経障害性疼痛を含む広範な病状の治療、多発性硬化症と関連する痙縮、線維筋痛及び化学療法による嘔気の治療に用いられている。さらに、ＴＨＣはアレルギ−、炎症、感染、癲癇、鬱病、片頭痛、双極性障害、不安障害、並びに薬物依存及び離脱症候群の治療において治療効果を示すことが報告されている。ＴＨＣは制吐薬として特に効果的であり、オピオイド系鎮痛薬及び麻酔薬の使用、高活性抗レトロウイルス療法及び癌化学療法に付随する一般的な副作用である嘔吐を抑えるために投与される。
カンナビノイドは薬学的及び栄養学的用途でますます使用されるようになっている。かかる用途で使用されるカンナビノイド化合物は、ほぼ例外なく天然源、例えば植物組織から得られる。このため従来技術では、種々の溶媒抽出法を用いてカンナビス・サティバ（C. sativa）植物のトリコームからカンナビノイド化合物を得ることが開示されている。かかる方法と関連する幾つかの欠点としては、低い収率、植物の栽培及び維持と関連する高いコスト、並びに植物抽出物の抽出及び精製と関連するコストが挙げられる。植物の安全性も、医薬品グレードのカンナビノイド化合物の製造コストを増大させる重要な考慮事項である。
しかしながら、特に化学療法と関連する嘔気及び嘔吐、疼痛を治療するための、消耗症候群を患うＡＩＤＳ患者の食欲を刺激する薬剤としての、並びに緑内障の治療のためのカンナビノイド化合物の重要性の増大から、本発明者らはカンナビノイド及びカンナビノイド類似体の大規模製造のためのｅｘ ｖｉｖｏ酵素により触媒される半合成プロトコルを開発することとなった。本発明の方法により、カンナビノイド及びそれらの類似体を減少したコストで合成することも可能である。
上述の概要並びに以下の図面の簡単な説明及び詳細な説明は例示的かつ説明的なものであり、特許請求される本発明の更なる説明を提供することを意図する。他の目的、利点及び新規の特徴は以下の本発明の詳細な説明から当業者に容易に明らかである。
本発明の方法の態様の１つでは、カンナビノイド又はカンナビノイド類似体を、
（ａ）式Ｉによる化合物：
Figure 2020022507
 を選択することと、
（ｂ）前記式Ｉの化合物を前記カンナビノイド又はカンナビノイド類似体へと変換する触媒としてカンナビノイド合成酵素を選択することと、
（ｃ）前記式Ｉの化合物と前記カンナビノイド合成酵素とを接触させることと、
（ｄ）工程（ｂ）の生成物を単離することと、
によって作製する方法が提供される。本合成戦略に従うと、単離された生成物を脱炭酸することができる。
式Ｉにおいて、Ｒは−ＯＨ、ハロゲン、−ＳＨ又は−ＮＲａＲｂ基から選択される。置換基Ｒ１及びＲ２は各々独立して−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＲａ、任意に置換されたＣ１〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルケニレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキニレン、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０アリール、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニレンからなる群から選択される。
幾つかの式Ｉの化合物については、Ｒ１及びＲ２はそれらが結合する炭素原子とともにＣ５〜Ｃ１０環式環を形成する。一態様では、Ｃ５〜Ｃ１０環式環は酸素、硫黄又は窒素から選択される１つ又は複数のヘテロ原子を含む。式Ｉ中のＲ３はＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ及びＣ１〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキルからなる群から選択され、Ｒａ及びＲｂは各々独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１０）直鎖若しくは分岐アルキル、又はＣ３〜Ｃ１０シクロアルキルである。しかしながら、テトラヒドロカンナビノール又はカンナビジオールの合成は本発明の方法では可能でない。
この戦略に従って、カンナビノイド合成酵素がカンナビジオール酸合成酵素、テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素又はカンナビクロメン酸合成酵素からなる群から選択される。
式Ｉ中のＲ２は直鎖アルキレン、
Figure 2020022507
 等のＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、又は、
Figure 2020022507
 から選択されるＣ２〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルキニレンであり得る。幾つかの式Ｉの化合物については、Ｒ２は、
Figure 2020022507
 （式中、Ｘは−ＯＨ、−ＳＨ又は−ＮＲａＲｂから選択される）である。
本発明の方法の態様の１つでは、固体支持体へのカンナビノイド合成酵素の固定化を記載している。上記の方法に従って作製されるカンナビノイド及びカンナビノイド類似体は、単一エナンチオマーとして存在する。これらの化合物のエナンチオマー純度は少なくとも９５％〜少なくとも９９％である。
別の実施の形態によれば、式ＩＩによるカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を、
（ａ）式ＩＩＩによる化合物と式ＩＶによる化合物とを：
Figure 2020022507
 該式ＩＩＩの化合物及び式ＩＶの化合物の反応を触媒する酵素の存在下で反応させ、式ＩＩの化合物：
Figure 2020022507
 を形成することと、
（ｂ）前記式ＩＩの化合物とカンナビノイド合成酵素とを接触させることと、
（ｃ）工程（ｂ）の生成物を単離することと、
（ｄ）任意に（ｃ）の生成物を脱炭酸して、前記カンナビノイド又はカンナビノイド類似体を得ることと、
によって作製する方法が提供される。
置換基Ｒ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は上記で規定される通りであり、Ｒ５は直鎖又は分岐（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、直鎖又は分岐（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン、直鎖又は分岐（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニレン、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニレンからなる群から選択される。さらに式ＩＩ、式ＩＩＩ及び式ＩＶの化合物については、任意のアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、アリールアルキレン又はシクロアルキル基が−ＯＨ、ハロゲン、−ＮＲｂＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、−ＣＮ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）ハロアルキル及び（Ｃ１〜Ｃ４）ヒドロキシアルキルからなる群から選択される１つ又は複数の基で更に置換され、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは各々独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１０）直鎖若しくは分岐アルキル又はＣ３〜Ｃ１０シクロアルキルとすることができる。
テトラヒドロカンナビノール、カンナビクロメン、若しくはテトラヒドロカンナビノール及びカンナビクロメンの両方、又はそれらの類似体を、
（ａ）式Ｖによる化合物：
Figure 2020022507
 を選択することと、
（ｂ）前記式Ｖの化合物とテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素とを接触させることと、
（ｃ）式Ｖの化合物及びテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素を含む反応混合物の少なくとも１つの特性を変更して、テトラヒドロカンナビノール、カンナビクロメン、若しくはテトラヒドロカンナビノール及びカンナビクロメンの両方、又はそれらの類似体を生成物として得ることと、
によって作製する方法も提供される。
式Ｖの化合物については、Ｒは−ＯＨ、ハロゲン、−ＳＨ又は−ＮＲａＲｂ基から選択され、Ｒ１及びＲ２は各々独立して−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＲａ、任意に置換されたＣ１〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルケニレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキニレン、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０アリール、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニレンからなる群から選択され、Ｒ３はＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ又はＣ１〜Ｃ１０直鎖若しくは分岐アルキルから選択される。幾つかの化合物については、Ｒ１及びＲ２はそれらが結合する炭素原子とともにＣ５〜Ｃ１０環式環を形成し、置換基Ｒａ及びＲｂは各々独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１０）直鎖若しくは分岐アルキル又はＣ３〜Ｃ１０シクロアルキルである。
一態様では、反応混合物の少なくとも１つの特性の変更は反応混合物のｐＨを変化させること、例えば上記の方法によって作製されるテトラヒドロカンナビノールとカンナビクロームとの比率を制御するためにｐＨを約４．０〜約８．０単位の範囲に変化させることを含む。
本技術はカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を作製するシステムも提供する。かかるシステムは、培地及び複数の細胞を収容する発酵装置であって、細胞がカンナビノイド合成酵素を産生及び分泌するように構成される、発酵装置と、反応物を含有するバイオリアクターであって、反応物がカンナビノイド合成酵素と相互作用して第１のカンナビノイド及び第２のカンナビノイドを形成するように構成される、バイオリアクターと、バイオリアクターの条件を制御するように構成される制御機構とを備える。後者の制御機構は、第２のカンナビノイドの形成量に対する第１のカンナビノイドの形成量に影響を与えるために使用される。
システムは、培地から複数の細胞を少なくとも部分的に分離し、分離後にカンナビノイド合成酵素を含有する培地をバイオリアクターに導入するように構成されるフィルターを更に備えていてもよい。一実施の形態では、複数の細胞によって発現される酵素には、酵素をバイオリアクター内のニッケル支持体に結合させるタグが含まれる。任意の式Ｉの化合物又はカンナビゲロール酸を、酵素であるテトラヒドロカンナビノール酸（tetrahydrocannabinolic acid）合成酵素の基質とすることができる。バイオリアクター内の条件に応じて、テトラヒドロカンナビノール酸又はカンナビクロメン酸が第１のカンナビノイドとして作製され、第２のカンナビノイドがテトラヒドロカンナビノール酸及びカンナビクロメン酸のもう一方である。
例示的な実施形態によるカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を作製するシステムの概略図である。
定義
本明細書で使用される場合、他に指定のない限り、数量を特定していない単数形（the singular forms "a," "an," and "the"）は複数の指示対象を含む。このため例えば、「細胞（a cell）」への言及は複数の細胞を含み、「分子（a molecule）」への言及は１つ又は複数の分子への言及である。
本明細書で使用される場合、「約」は当業者に理解され、それが使用される文脈に応じて或る程度異なる。当業者に明らかでない用語が使用される場合、それが使用される文脈から判断すると、「約」は特定の用語の最大で±１０％を意味する。
「アルキル」という用語は、指定数の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖の飽和炭化水素を指す。例えば、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、及びネオヘキシル等を含むことを意味するが、これらに限定されない。アルキル基は非置換であっても、又は本明細書で下記の１つ若しくは複数の置換基で任意に置換されていてもよい。
「アルケニル」という用語は、指定数の炭素原子及び少なくとも１つの二重結合を有する直鎖又は分岐鎖の不飽和炭化水素を指す。（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニル基の例としては、エチレン、プロピレン、１−ブチレン、２−ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、１−ペンテン、２−ペンテン、イソペンテン、１−ヘキセン、２−ヘキセン、３−ヘキセン、イソヘキセン、１−ヘプテン、２−ヘプテン、３−ヘプテン、イソヘプテン、１−オクテン、２−オクテン、３−オクテン、４−オクテン、及びイソオクテンが挙げられるが、これらに限定されない。アルケニル基は非置換であっても、又は本明細書で下記の１つ若しくは複数の置換基で任意に置換されていてもよい。
「アルキニル」という用語は、指定数の炭素原子及び少なくとも１つの三重結合を有する直鎖又は分岐鎖の不飽和炭化水素を指す。（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニル基の例としては、アセチレン、プロピン、１−ブチン、２−ブチン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ヘキシン、２−ヘキシン、３−ヘキシン、１−ヘプチン、２−ヘプチン、３−ヘプチン、１−オクチン、２−オクチン、３−オクチン及び４−オクチンが挙げられるが、これらに限定されない。アルキニル基は非置換であっても、又は本明細書で下記の１つ若しくは複数の置換基で任意に置換されていてもよい。
「アルコキシ」という用語は指定数の炭素原子を有する−Ｏ−アルキル基を指す。例えば、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基としては、−Ｏ−メチル、−Ｏ−エチル、−Ｏ−プロピル、−Ｏ−イソプロピル、−Ｏ−ブチル、−Ｏ−ｓｅｃ−ブチル、−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル、−Ｏ−ペンチル、−Ｏ−イソペンチル、−Ｏ−ネオペンチル、−Ｏ−ヘキシル、−Ｏ−イソヘキシル、及び−Ｏ−ネオヘキシルが挙げられる。
「アリール」という用語は３員〜１４員の単環式、二環式、三環式又は多環式の芳香族炭化水素環系を指す。アリール基の例としては、ナフチル、ピレニル及びアントラシルが挙げられる。アリール基は非置換であっても、又は本明細書で下記の１つ若しくは複数の置換基で任意に置換されていてもよい。
「アルキレン」、「アルケニレン」及び「アリーレン」という用語は、単独で又は別の置換基の一部として、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−により例示されるように、それぞれアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、又はヘテロアリール基から誘導される二価ラジカルを意味する。アルキレン、アルケニル又はアリール連結基については、連結基の配向を意味するものではない。
「ハロゲン」及び「ハロ」という用語は−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ又は−Ｉを指す。
「ヘテロ原子」という用語は酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、及び硫黄（Ｓ）を含むことを意味する。
「ヒドロキシル」又は「ヒドロキシ」は−ＯＨ基を指す。
「ヒドロキシアルキル」という用語は、指定数の炭素原子を有し、アルキル基の水素原子の１つ又は複数が−ＯＨ基で置き換えられたアルキル基を指す。ヒドロキシアルキル基の例としては、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、及びそれらの分岐型が挙げられるが、これらに限定されない。
「シクロアルキル」という用語は、単環式、二環式、三環式又は多環式の３員〜１４員の飽和した、不飽和の又は芳香族の環系を指す。複素環は任意のヘテロ原子又は炭素原子を介して付着していてもよい。シクロアルキルとしては、上記で規定されるアリール及びヘテロアリール（heteroaryls）が挙げられる。シクロアルキル（cycloalkyl）の代表例としては、シクロエチル、シクロプロピル、シクロイソプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロプロペン、シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセン、フェニル、ナフチル、アントラシル、ベンゾフラニル、及びベンゾチオフェニルが挙げられるが、これらに限定されない。シクロアルキル基は非置換であっても、又は本明細書で下記の１つ若しくは複数の置換基で任意に置換されていてもよい。
「ニトリル」又は「シアノ」という用語はほぼ同じ意味で使用することができ、ヘテロアリール環、アリール環及びヘテロシクロアルキル環の炭素原子に結合した−ＣＮ基を指す。
「アミン」又は「アミノ」という用語は−ＮＲｃＲｄ基（ここで、Ｒｃ及びＲｄは各々独立して水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ８）ハロアルキル、及び（Ｃ１〜Ｃ６）ヒドロキシアルキル基を表す）を指す。
「アルキルアリール」という用語は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル鎖の少なくとも１つの水素原子が、本明細書で下記の１つ又は複数の置換基で任意に置換され得るアリール原子で置き換えられたＣ１〜Ｃ８アルキル基を指す。アルキルアリール基の例としては、メチルフェニル基、エチルナフチル基、プロピルフェニル基、及びブチルフェニル基が挙げられるが、これらに限定されない。
「アリールアルキレン」は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン基の１つ又は複数の水素原子が（Ｃ３〜Ｃ１４）アリール基で置き換えられた二価アルキレンを指す。（Ｃ３〜Ｃ１４）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン基の例としては、１−フェニルブチレン、フェニル−２−ブチレン、１−フェニル−２−メチルプロピレン、フェニルメチレン、フェニルプロピレン、及びナフチルエチレンが挙げられるが、これらに限定されない。
「アリールアルケニレン」は、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニレン基の１つ又は複数の水素原子が（Ｃ３〜Ｃ１４）アリール基で置き換えられた二価アルケニレンを指す。
「アリールアルキニレン」という用語は、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニレン基の１つ又は複数の水素原子が（Ｃ３〜Ｃ１４）アリール基で置き換えられた二価アルキニレンを指す。
「カルボキシル」及び「カルボキシレート」という用語は、下記一般式によって表すことができる部分を含む：
Figure 2020022507
式中のＥは結合又はＯであり、Ｒｆは個別にＨ、アルキル、アルケニル、アリール又は薬学的に許容可能な塩である。ＥがＯであり、Ｒｆが上記で規定される通りである場合、この部分は本明細書でカルボキシル基と称され、特にＲｆが水素である場合、式は「カルボン酸」を表す。概して、明示的に示される酸素が硫黄で置き換えられる場合、式は「チオカルボニル」基を表す。
他に指定のない限り、「立体異性体」は、化合物の他の立体異性体を実質的に含まないその化合物の１つの立体異性体を意味する。このため、１つの不斉中心を有する立体異性体的に純粋な化合物は、化合物の反対のエナンチオマーを実質的に含まない。２つの不斉中心を有する立体異性体的に純粋な化合物は、化合物の他のジアステレオマーを実質的に含まない。典型的な立体異性体的に純粋な化合物は、約８０重量％超の化合物の１つの立体異性体及び約２０重量％未満の化合物の他の立体異性体、例えば約９０重量％超の化合物の１つの立体異性体及び約１０重量％未満の化合物の他の立体異性体、又は約９５重量％超の化合物の１つの立体異性体及び約５重量％未満の化合物の他の立体異性体、又は約９７重量％超の化合物の１つの立体異性体及び約３重量％未満の化合物の他の立体異性体を含む。
示される構造とその構造に与えられる名称とに食い違いがある場合、示される構造を優先する。さらに、構造又は構造の一部の立体化学が例えば太字又は破線で示されない場合、構造又は構造の一部はその全立体異性体を包含すると解釈される。
本発明は、無細胞環境でのカンナビノイド又はカンナビノイド類似体の酵素触媒合成の方法に焦点を合わせている。カンナビノイド及びカンナビノイド類似体のｅｘ ｖｉｖｏ製造のための装置も記載される。「類似体」という用語は、天然のカンナビノイドに構造的に関連するが、化学的及び生物学的特性が天然のカンナビノイドとは異なり得る化合物を指す。本文脈において、類似体（単数又は複数）は天然のカンナビノイドの１つ又は複数の不要な副作用を示さない可能性がある化合物を指す。類似体は、天然のカンナビノイドの化学的、生物学的又は半合成変換により天然のカンナビノイドから誘導された化合物も指す。
本発明に含まれるカンナビノイド化合物の例は、限定されるものではないが、カンナビノール、カンナビジオール、Δ９−テトラヒドロカンナビノール、Δ８−テトラヒドロカンナビノール、１１−ヒドロキシ−テトラヒドロカンナビノール、１１−ヒドロキシ−Δ９−テトラヒドロカンナビノール、レボナントラド−ル、Δ１１−テトラヒドロカンナビノール、テトラヒドロカンナビバリン、ドロナビノール、アマンダミド（amandamide）及びナビロン、並びに基本的なカンナビノイド構造を有し、合成的に修飾されてカンナビノイド類似体をもたらす天然又は合成分子である。
本技術は、カンナビノイドの生合成に関与する酵素の大規模クローニング及び発現、並びにカンナビノイド及びカンナビノイド類似体の製造への真核生物の発現系の使用にも関する。カンナビノイド合成酵素のクローニング及び発現に適した真核細胞の例としては、限定されるものではないが、大腸菌（E coli）、酵母及びバキュロウイルス宿主が挙げられる。本技術の実施形態では、ｐｉｎｋピキア酵母発現系を用いたテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡ合成酵素）、カンナビクロメン酸合成酵素（ＣＢＣＡ合成酵素）及びカンナビジオール酸合成酵素（ＣＢＤＡ合成酵素）を含む幾つかのカンナビノイド合成酵素の大規模製造の方法が開示される。したがって、これらの酵素の大規模製造は、ＴＨＣＡ合成酵素、ＣＢＣＡ合成酵素又はＣＢＤＡ合成酵素の遺伝子を含むＤＮＡ構築物で酵母を形質転換し、形質転換酵母細胞を機能的に活性な酵素の発現を促進するのに好適な条件下で培養することによって行うことができる。
ＴＨＣＡ合成酵素及びＣＢＤＡ合成酵素の遺伝子の配列を公的に利用可能なデータベースから得て、それらのタンパク質コード領域を変更してピキア・パストリス（Pichia Pastoris）酵母細胞におけるタンパク質発現を最適化した。InvitrogenのＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）プログラムを用いてコドン最適化を行った。
さらに両方の遺伝子を、酵母α分泌配列及び発現タンパク質にＨｉｓタグを組み入れるためのコドンを含むように修飾した。酵母α分泌配列は遺伝子の５’末端に挿入され、発現タンパク質の細胞外分泌に必要とされる。Ｈｉｓタグ用のコドンは遺伝子の３’末端に存在し、親和性クロマトグラフィーによる発現タンパク質の精製を容易にするために導入される。
これらのキメラ配列、α−ＣＢＤＡ合成酵素及びα−ＴＨＣＡ合成酵素をｐＰｉｎｋ−ＨＣベクター（Invitrogen（登録商標））に挿入し、Ｔｏｐ １０ Ｆ−形質転換大腸菌細胞を得るために使用し、この細胞を今後の使用のために寒天スタブとして保管した。酵母細胞の形質転換の前に対象のカンナビノイド合成酵素遺伝子（ＧＯＩ）を含有するベクターを、形質転換大腸菌細胞を含有する寒天スタブから単離し、ＰｍｅＩ又はＳｐｅＩ制限酵素を用いて線状化した。線状化プラスミドを、ＰｉｃｈｉａＰｉｎｋ（商標）酵母発現系（Invitrogen（登録商標））を用いてピキア・パストリスｐｅｐＢ欠失突然変異細胞に電気穿孔した。制限酵素ＰｍｅＩを用いた線状化では挿入断片がピキアゲノムのＡＯＸ１プロモーター領域に指向され、制限酵素ＳｐｅＩでは挿入断片がＴＲＰ遺伝子に指向される。
形質転換酵母細胞をアデニン欠乏選択的プレートで増殖させ、色によるスクリーンを使用して陽性形質転換体を特定した。このスクリーニング法に従うと、赤色／ピンク色のコロニーは対象の遺伝子を保有しない形質転換体、及びピキア・パストリスのゲノムに組み込まれた限定数の対象の遺伝子のコピーを保有する形質転換体を示す。一方で白色コロニーは、複数の対象の遺伝子のコピーを有する形質転換体を示す。通例、多量の組み換えタンパク質、例えば培養物１Ｌ当たり約１．０ｇ〜約２．０ｇのタンパク質を得るためには、６コピー〜１０コピーの対象の遺伝子を有する細胞が所望される。メタノールを形質転換酵母細胞に添加することによるＴＨＣＡ合成酵素又はＣＢＤＡ合成酵素の誘導時の基質カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）からＴＨＣＡ又はＣＢＤＡ生成物への変換を定量化する酵素アッセイを用いて、２０％超の基質から生成物への変換をもたらす酵母細胞の白色コロニーを特定した。
したがって、ＴＨＣＡ合成酵素遺伝子又はＣＢＤＡ合成酵素遺伝子を保有する酵母細胞の個々の白色コロニーを、ＢＭＧＹ培地を用いてフラスコ内で別個に培養した後、ＢＭＭＹ培地中での増殖により誘導し、下記に更に記載されるようにＴＨＣＡ合成酵素又はＣＢＤＡ合成酵素の発現を誘導した。簡潔に述べると、各々の培養物中の酵素を含有する培地を細胞から分離し、既知の量の基質ＣＢＧＡを各々の培養フラスコの培地に添加した。インキュベーションの後、各々の培養フラスコを分析して、ＣＢＧＡから生成物への変換率を定量化した。２０％超の変換を示す形質転換体の培養物を、本発明の方法に従うカンナビノイド又はカンナビノイド類似体の商業的合成に用いる。
claim 16-27対応
上記のＰｉｃｈｉａＰｉｎｋ（商標）酵母発現系を用いて得られるカンナビノイド合成酵素、ＴＨＣＡ合成酵素及びＣＢＤＡ合成酵素を、カンナビノイド又はカンナビノイド類似体の製造に使用することができる。一実施形態では、式Ｉの化合物及びカンナビノイド合成酵素を、式Ｉの化合物をカンナビノイド又はカンナビノイド類似体へと変換する触媒として選択することによってカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を作製する方法が提供される。
Figure 2020022507
式Ｉにおいて、Ｒはヒドロキシル（−ＯＨ）、ハロゲン、チオール（−ＳＨ）又は−ＮＲａＲｂ基から選択することができる。置換基Ｒ１及びＲ２は各々独立して−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＲａ、任意に置換されたＣ１〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルケニレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキニレン、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０アリール、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニレンからなる群から選択される。代替的には、Ｒ１及びＲ２はそれらが結合する炭素原子とともにＣ５〜Ｃ１０環式環を形成する。式Ｉによる化合物については、Ｒ３はＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ及びＣ１〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキルからなる群から選択され、Ｒａ及びＲｂは各々独立して−Ｈ、−ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ１０）直鎖若しくは分岐アルキル、−ＳＨ、−ＮＨ２又はＣ３〜Ｃ１０シクロアルキルである。
式Ｉの化合物とカンナビノイド合成酵素とを接触させることによって得られるカンナビノイド若しくはカンナビノイド類似体は、治療薬として単離、精製及び使用することができ、又はカンナビノイド若しくはカンナビノイド（cannabinoid）類似体を任意の脱炭酸工程に供して、例えばカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）をカンナビクロメン（ＣＢＣ）に変換した後、カンナビクロメン（ＣＢＣ）を医薬品又は栄養剤として使用することができる。
幾つかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素はカンナビジオール酸合成酵素である。本技術の他の態様については、カンナビノイド合成酵素はテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素又はカンナビクロメン酸合成酵素である。幾つかの式Ｉの化合物については、Ｒ１及びＲ２はそれらが結合する環炭素原子とともにＣ５〜Ｃ１０環式環を形成する。このような式Ｉの化合物については、環の１つ又は複数の炭素原子が酸素、硫黄又は窒素から選択されるヘテロ原子で置換されていてもよい。
式Ｉによる化合物については、Ｒ２は直鎖アルキレン又は分岐アルキレンであり得る。直鎖アルキレンの例としては、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、Ｃ５Ｈ１１、Ｃ６Ｈ１３、Ｃ７Ｈ１５及びＣ８Ｈ１７が挙げられるが、これらに限定されない。分岐アルキレンの例は、イソプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ネオペンチル基、２−メチルヘキシル基、又は２，３−ジメチルヘキシル基から選択される基である。幾つかの実施形態では、Ｒ２は任意に置換された直鎖又は分岐アルキレンとすることができ、ここで１つ又は複数の水素原子が、限定されるものではないが塩素、フッ素、臭素、ニトロ、アミノ、ヒドロキシル、フェニル、又はベンジル基から選択される基で置き換えられている。
幾つかの式Ｉの化合物については、Ｒ２はＣ２〜Ｃ１０アルケニレンであり、
Figure 2020022507
 からなる群から選択され、Ｒ４は上記の直鎖又は分岐アルキレンである。Ｒ２がＣ２〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキニレンである場合、Ｒ２は、
Figure 2020022507
 であり得る。代替的には、式Ｉ中のＲ２は、
Figure 2020022507
 であり、置換基Ｘは−ＯＨ、−ＳＨ又は−ＮＲａＲｂから選択される基であり、基Ｒａ及びＲｂは上記で規定される通りである。
天然のカンナビノイドの多くが植物においてそれらのカルボン酸誘導体として産生される。しかしながら、それらの精神刺激活性はカンナビノイド酸を含有する植物組織に熱を加えること、又は植物材料を使用前に乾燥させることで起こる脱炭酸により増強される。本発明の方法を用いて合成されるカンナビノイド及びカンナビノイド類似体は、Ｒ１置換基としてカルボン酸（−ＣＯＯＨ）基を有していてもよく、かかる化合物を医薬品又は栄養剤として使用する前に任意の脱炭酸工程に供してもよい。かかるカンナビノイド又はカンナビノイド類似体の例は、Ｒが−ＯＨであり、Ｒ１が−ＣＯＯＨであり、Ｒ２がＣ５Ｈ１１であり、Ｒ３が−Ｈである式Ｉの種とカンナビノイド合成酵素とを接触させることによって得られる化合物である。
カンナビノイド又はカンナビノイド類似体の合成、単離及び精製は、カンナビノイド合成酵素を固体支持体に固定化すること、又は合成酵素をリポソームに封入することで改善することができる。合成の一態様では、酵素を固体支持体に固定化する。かかる固定化は固定化酵素の再循環及び再利用を可能にし、医薬品グレードのカンナビノイド又はカンナビノイド類似体の製造と関連するコストを顕著に低減するため有利である。酵素の固定化は酵素触媒の容易な使用及び回収、所望の生成物の容易な精製、最終生成物のエナンチオマー過剰率（ｅｅ）の維持、並びに生成物の収率の全体的な改善も可能にする。通例、特許請求される方法によるカンナビノイド又はカンナビノイド類似体のエナンチオマー純度は約９０％ｅｅ〜約１００％ｅｅであり、例えば本発明の方法を用いて作製されるカンナビノイド又はカンナビノイド類似体は、約９１％ｅｅ、約９２％ｅｅ、約９３％ｅｅ、約９４％ｅｅ、約９５％ｅｅ、約９６％ｅｅ、約９７％ｅｅ、約９８％ｅｅ及び約９９％ｅｅのエナンチオマー純度を有し得る。
通例、固定化される酵素は固体支持体に吸収させる、支持体に吸着させる、支持体に共有結合する、又はイオン相互作用により固体支持体に固定化することができる。一実施形態では、カンナビノイド合成酵素を固体支持体に共有結合させる。酵素を固体支持体に連結するのに好適な戦略は生化学分野で既知であり、適切に官能化された支持体とアミノ酸基の側鎖との共有結合、又は支持体を酵素から分離するための適切に官能化されたリンカー若しくはスペーサーを用いた共有結合によるものが含まれる。「リンカー」という用語は、支持体を酵素から分離する任意の基を指す。したがって、リンカーは共有結合により支持体の表面上の基の一端に繋がれ、もう一端の酵素に付着する基である。例示的なリンカーとしては、エチレングリコールの（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレンリンカーポリマー、例えば−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−Ｏ−基（ここで、ｎは０〜１０の整数である）、−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン−ＮＨ−、−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレンシロキシ、又は−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン−Ｃ（Ｏ）−が挙げられる。
酵素の固定化に好適な支持体としては、限定されるものではないが、アンバーライト（Amberlite）樹脂、デュオライト樹脂、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標） Ｃ、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ等のアクリル樹脂が挙げられ、ポリビニルアルコールを用いて作製されるゲルを本技術のカンナビノイド合成酵素を固定化する支持体として使用することができる。
カンナビノイドは種々の生理学的特性を示し、痛みを軽減し、食欲を刺激することが知られており、アレルギ−、炎症、感染、癲癇、鬱病、片頭痛、双極性障害、不安障害及び緑内障等の様々な疾患状態を治療する候補治療薬として試験されている。カンナビノイドが示す生理的効果は、主にカンナビノイド受容体、例えばＣＢ１、ＣＢ２及びＣＢ３受容体を刺激又は不活性化するその能力によるものである。受容体活性の調節は結合相互作用及びカンナビノイド受容体活性部位内のリガンドの配向に応じて異なり、カンナビノイド又はカンナビノイド類似体に付着した置換基の性質及び配向が、かかる化合物が示す薬学的特性に影響を与えることとなる。
一実施形態では、中央コアに付着した構造的に異なる多様な置換基を有するカンナビノイドを製造する方法が提供される。かかる化合物は、種々の薬学的に有益な特性を示すことが期待される。構造多様性は適切に置換された式ＩＩＩの化合物と式ＩＶの化合物とを、ＧＰＰオリベトレートゲラニルトランスフェラーゼ（ポリケチド合成酵素）等の酵素の存在下で接触させ、式ＩＩの化合物を得ることによって導入される。スキーム１に、本実施形態に従う式ＩＩの化合物を合成するプロトコルを構造的に示す。
Figure 2020022507
式ＩＩＩ及び式ＩＶ中のＲ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ５の置換基の性質及びタイプに応じて、本発明の方法は、カンナビノイド又はカンナビノイド類似体の製造のための前駆体又はシントンとしての中央フェニルコアの周囲に異なる置換基を有する式ＩＩの化合物の合成を可能にする。したがって本方法によると、カンナビノイド又はカンナビノイド類似体は、式ＩＩの化合物とカンナビノイド合成酵素、例えばＴＨＣＡ合成酵素、ＣＢＣＡ合成酵素又はＣＢＤＡ合成酵素とを接触させた後、カンナビノイド又はカンナビノイド類似体を得るために得られる生成物を単離及び脱炭酸することによって得ることができる。
式ＩＩＩにおいて、Ｒはヒドロキシル（−ＯＨ）、ハロゲン、チオール（−ＳＨ）又は−ＮＲａＲｂ基から選択することができる。置換基Ｒ１及びＲ２は各々独立して−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＲａ、任意に置換された直鎖又は分岐（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、任意に置換された直鎖又は分岐（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン、任意に置換された直鎖又は分岐（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニレン、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０アリール、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニレンからなる群から選択される。
幾つかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２はそれらが結合する炭素原子とともにＣ５〜Ｃ１０環式環を形成し、Ｒ３はＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ及びＣ１〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキルからなる群から選択される。
式ＩＶ中のＲ５は直鎖又は分岐（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、直鎖又は分岐（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン、直鎖又は分岐（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニレン、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニレンとすることができる。式ＩＩ、式ＩＩＩ及び式ＩＶの化合物については、任意のアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリール、アリールアルキレン又はシクロアルキル基が−ＯＨ、ハロゲン、−ＮＲｂＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、−ＣＮ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）ハロアルキル及び（Ｃ１〜Ｃ４）ヒドロキシアルキルからなる群から選択される１つ又は複数の基で更に置換されていてもよく、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは各々独立して−Ｈ、−ＯＨ、又は（Ｃ１〜Ｃ１０）直鎖若しくは分岐アルキル、−ＳＨ、−ＮＨ２、又はＣ３〜Ｃ１０シクロアルキルから選択される。
一実施形態によると、式ＩＶ中のＲ５は、
Figure 2020022507
 から選択される（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレンであってもよく、Ｒ４はＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、Ｃ３Ｈ７、Ｃ４Ｈ９、Ｃ５Ｈ１１、Ｃ６Ｈ１３、Ｃ７Ｈ１５及びＣ８Ｈ１７からなる群から選択される直鎖アルキレンである。幾つかの式ＩＶの化合物については、Ｒ５は、
Figure 2020022507
 であり、Ｒ６基は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン、−ＯＨ、−ＳＨ、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＮＨ２又は−ＮＨＲａから選択され、Ｒａは上記で規定される通りである。
酵素はそれらが触媒する化学反応のタイプ、並びにこれらの反応に関与する基質の性質及びタイプに対して非常に特異的である。酵素は高レベルの立体特異性、位置特異性及び化学選択性も示す。したがって本発明者らにより認められた時点で、酵素であるＴＨＣＡ合成酵素が環化反応を触媒する条件に応じて同じ基質カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を用いて２つの異なる生成物、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）を生成することができることは予期されていなかった。
したがって、ＴＨＣＡとＣＢＣＡ生成物との分配比率に対する温度、ｐＨ、溶媒、イオン強度及びインキュベーション時間の影響を研究した。一実施形態では、生成物の分配比率に対する溶媒の影響を評価した。カンナビノイドは親油性（lipophilic）であり、水性溶媒に殆ど可溶化しない。水性溶媒におけるカンナビノイドの低い溶解性のため、ｅｘ ｖｉｖｏ酵素により触媒されるカンナビノイド及びカンナビノイド類似体の合成法の開発が妨げられていた。本発明者らは驚くべきことに、ＴＨＣＡ合成酵素が緩衝液及び非水性溶媒、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、イソプロピルアルコール及びシクロデキストリンを含有する溶媒混合物において、混合物中の非水性溶媒の濃度が４０％（ｖ／ｖ）未満に維持される場合にその触媒活性を保持することを見出した。
例えば、非水性溶媒の濃度が約２０％である場合に酵素触媒反応は最も効果的であった。触媒反応速度は非水性溶媒の濃度が増大するにつれ僅かに減少する。このため２０％ＤＭＳＯは、緩衝液単独での触媒反応よりおよそ２．５倍速いという最も高い触媒反応速度をもたらした。表１に触媒活性の速度に対する非水性溶媒の濃度の影響を示す。
表１に更に示されるように、非水性溶媒の濃度は生成物として生成するＴＨＣＡとＣＢＣＡとの比率を変化させ得る。このため、１０％ＤＭＳＯを溶媒として使用する場合、１０：１というＴＨＣＡ：ＣＢＣＡ分配比率が観察されるため、緩衝液におけるＤＭＳＯの濃度が２０％未満である場合により高レベルのＴＨＣＡが得られる。
Figure 2020022507
１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液へのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の洗浄剤の添加は、基質ＣＢＧＡから生成物への変換率に影響を与えなかったことが観察された。対照的に、シクロデキストリンを含有する１００ｍＭクエン酸緩衝液へのＳＤＳの添加は、反応を触媒するＴＨＣＡ合成酵素の能力を消失させた。これらの反応条件下では僅か８％の基質しか生成物へと変換されず、ＴＨＣＡの形成がこれらの反応条件下での生成物として有利であった。
カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）は、天然のカンナビノイドの生合成における種々のカンナビノイド合成酵素の共通の基質として働く。例えば以前の研究では、酵素であるＴＨＣＡ合成酵素、ＣＢＤＡ合成酵素及びＣＢＣＡ合成酵素が、テトラヒドロカンナビノール酸、カンナビジオール酸及びカンナビクロメン酸のそれぞれの生合成において各々のＣＢＧＡを基質として使用することが示唆されている。
このため、ＴＨＣＡ合成酵素活性の最適ｐＨの評価を目的とする研究において、本発明者らは驚くべきことに、触媒反応が行われるｐＨに応じて、酵素であるＴＨＣＡ合成酵素が基質ＣＢＧＡからＴＨＣＡ又はＣＢＣＡへの変換を触媒することに気付いた。この観察結果は、単一の酵素であるＴＨＣＡ合成酵素が植物において２つの異なるカンナビノイド生成物の形成に関与し得るために予期せぬものであった。
表３に生成物の比率、すなわちＴＨＣＡ合成酵素を基質であるＣＢＧＡと接触させた場合に生成するＴＨＣＡとＣＢＣＡ化合物との比率に対するｐＨの影響を特定することを目的とするものであったｐＨ研究の結果を示す。本研究における反応混合物のｐＨは４．０〜８．０のｐＨ範囲であった。ＴＨＣＡ合成酵素が８．０を超えるｐＨで触媒的に不活性であるため、より高いｐＨ値は試験しなかった。
表３に示されるように、ＴＨＣＡは６．０未満のｐＨ値で優先的に合成される。実際に、触媒反応がｐＨ４．０で行われる場合にＴＨＣＡが主要生成物である。反応混合物のｐＨを増大させることで生成物の分配比率が変化し、およそ３０％のＣＢＣＡがｐＨ５．０で生成物として生成し、およそ１５％のＣＢＣＡがｐＨ値６．０で生成物として生成した。反応混合物のｐＨの更なる増大、例えばｐＨ７．０までの反応混合物のｐＨの増大により、ＴＨＣＡ合成酵素により触媒されるＣＢＧＡの変換の生成物として専らＣＢＣＡが生じた。さらに、ｐＨの任意の更なる増大はＴＨＣＡ合成酵素の触媒活性を低減又は消去し、ｐＨ８．０の反応混合物については生成物は観察されなかった。
Figure 2020022507
したがって一実施形態では、本発明はテトラヒドロカンナビノール、カンナビクローム、又はテトラヒドロカンナビノール及びカンナビクロームの両方、又はそれらの類似体を、式Ｖの化合物を反応物として選択し、式Ｖの化合物をテトラヒドロカンナビノール酸合成酵素（ＴＨＣＡ合成酵素）と接触させ、テトラヒドロカンナビノール、カンナビクローム、又はテトラヒドロカンナビノール及びカンナビクロームの両方、又はそれらの類似体が生成物として得られるように反応混合物の少なくとも１つの特性を変更することによって作製する方法を提供する。
式Ｖにおいて、Ｒは−ＯＨ、ハロゲン、−ＳＨ又は−ＮＲａＲｂ基から選択される。置換基Ｒ１及びＲ２は各々独立して−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−ＯＲａ、任意に置換されたＣ１〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルケニレン、任意に置換されたＣ２〜Ｃ１０直鎖又は分岐アルキニレン、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０アリール、任意に置換されたＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキレン、（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニレン及び（Ｃ３〜Ｃ１０）アリール−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニレンからなる群から選択される。
Figure 2020022507
幾つかの実施形態については、Ｒ１及びＲ２はそれらが結合する環炭素原子とともにＣ５〜Ｃ１０環式環を形成し、ここで１つ又は複数の炭素原子が任意に酸素、硫黄、窒素又は−ＮＲａ基から選択される１つ又は複数のヘテロ原子で置き換えられていてもよい。式Ｖ中のＲ３はＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ又は（Ｃ１〜Ｃ１０）直鎖若しくは分岐アルキルから選択される基であってもよく、置換基Ｒａ及びＲｂは各々独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ１０）直鎖若しくは分岐アルキル、又はＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル部分から選択される。
酵素活性及び触媒反応に影響を与えることが知られる任意の物理的特性は、生成物ＴＨＣＡとＣＢＣＡとの比率を変化させるように調節することができる。したがって一実施形態では、反応混合物のｐＨを変化させ、生成物として酵素的に生成するＴＨＣＡとＣＢＣＡとの比率を調節した。本合成方法に従うと、約４．０〜約６．０の範囲のより低いｐＨでの触媒反応は生成物としてのＴＨＣＡの形成に有利であり、約６．５〜約７．５の範囲の中性ｐＨでの触媒反応は生成物としてのＣＢＣＡの形成に有利であった。
このため、本発明者らは、反応混合物のｐＨを制御することによって触媒反応の生成物としてのＴＨＣＡ又はＣＢＣＡの形成を制御することが可能であることを示した。
反応溶媒の組成、イオン強度、温度、圧力、反応媒体の粘度及び試薬の濃度等の他の物理的特性も生成物の比率を変化させ得る。実際に、これらの物理的パラメーターの多くはバイオリアクターを用いたカンナビノイド又はカンナビノイド類似体の大規模製造における触媒反応の調節に重要な役割を果たす。
このため、一実施形態では、第２のカンナビノイド又はその類似体の形成量に対する第１のカンナビノイド又はその類似体の形成量に影響を与える条件を制御することによって、カンナビノイド又はカンナビノイド類似体を作製するシステム１００が提供される。図１に概略的に示されるシステム１００は発酵装置２、フィルター１８、バイオリアクター１０及び制御機構２０を備えることができる。図１に表示されるシステムの説明を下記に提示する。
発酵装置２は細胞培養培地４及び複数の細胞６を収容する。細胞６はカンナビノイド合成酵素８を産生及び分泌するように構成される。カンナビノイド合成酵素８の製造用の発酵装置２に使用される細胞６は、カンナビノイド合成酵素タンパク質をコードする核酸配列又は遺伝子を含むように遺伝子操作した任意の真核細胞であり得る。幾つかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素タンパク質をコードする核酸配列は、酵母α分泌配列をその５’末端に含み、６残基ヒスチジンタグをその３’末端に組み込むように修飾される。酵母α分泌配列の付加は、カンナビノイド合成酵素タンパク質の真核細胞増殖に用いる培地への分泌を可能にする。カンナビノイド合成酵素８の細胞外分泌は、フィルター１８を用いた発酵装置２とバイオリアクター１０との間での酵素の分離及び輸送を容易にするため有利である。発酵装置２におけるカンナビノイド合成酵素８の作製に続いて、上清（例えば培地４、細胞６及びカンナビノイド合成酵素８）をパス２４に沿ってフィルター１８へと輸送する。パス２４は上清の輸送に好適な管又は任意の他の経路であり得る。
フィルター１８は上清を濾過し、発現された酵素を含有する培地４から細胞６を少なくとも部分的に分離することができる。通例、フィルター１８は全細胞６の少なくとも８０％を培地４から分離する。幾つかの実施形態については、フィルター１８は全細胞６の少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％を、培地４をバイオリアクター１０に導入する前にこの培地４から分離する。濾過の後、細胞６はパス２６に沿って発酵装置２へと再び輸送される。一実施形態では、フィルター１８は、カンナビノイド合成酵素８を精製するための複数のフィルター及びリザーバを備える濾過及び精製システムであり得る。
フィルター１８を通過した後、カンナビノイド合成酵素８はパス２８に沿ってバイオリアクター１０に流入し、入口３０を介してバイオリアクター１０に入る。バイオリアクター１０は、基質ＣＢＧＡ又は上記の式Ｉの化合物に従う他の基質等の反応物の入口３２も備える。このため図１に示されるように、バイオリアクター１０はカンナビノイド合成酵素８と相互作用して第１のカンナビノイド１４を形成するように構成される反応物１２を含有する。バイオリアクター１０は第２のカンナビノイド１６の合成環境も提供し得る。第２のカンナビノイド１６は、第１のカンナビノイド１４と同じタイプのカンナビノイド合成酵素８及び基質を用いて作製することができる。例えば、第１のカンナビノイド１４及び第２のカンナビノイド１６の両方を反応物１２としてＣＢＧＡ、カンナビノイド合成酵素８としてＴＨＣＡ合成酵素を用いて作製することができる。本実施形態では、第１のカンナビノイド１４はＴＨＣＡであり、第２のカンナビノイド１６はＣＢＣＡであり得る。代替的な実施形態では、第２のカンナビノイド１６は、第１のカンナビノイド１４の合成に使用されるものとは異なる基質又はカンナビノイド合成酵素を用いて合成することができる。
バイオリアクター１０は、二価金属イオンを含浸させた固体支持体又は表面を二価金属イオンで官能化した支持体を有するカラムバイオリアクターであり得る。通例、セファロース、アガロース又は他の生体高分子をニッケル、コバルト、マグネシウム及びマンガン等の二価金属イオンを結合する支持体として使用する。かかる支持体は、発現されたカンナビノイド合成酵素８上に存在するヒスチジンタグに対して強い親和性を有し、合成酵素を隔離し、カンナビノイド合成を阻害又は妨害し得る他の不必要なタンパク質及び残屑から分離するために使用することができる。
カンナビノイドの合成に使用されるバイオリアクター１０は、薬学的に有用なカンナビノイドの商業的製造を可能にするバッチ及び連続合成プロセス用に構成される。一実施形態では、バイオリアクター１０は培地４の組成、酵素及び基質の濃度がプロセスの開始時に固定され、触媒反応中に変化しないバッチ合成用に構成される。合成は、バイオリアクター１０の培地中の所望の生成物の濃度が所定の値に達した又は基質の濃度が、例えば基質から生成物への検出可能な触媒変換が存在しないレベルまで所定のレベルを下回った時点で終了する。
したがって一実施形態では、Ｈｉｓタグ付きカンナビノイド合成酵素８は既知の量の基質、例えばカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）又は式Ｉ、式ＩＩ若しくは式Ｖの化合物をバイオリアクター１０に導入する前にバイオリアクターカラム内のニッケル含有樹脂支持体に隔離される。代替的な実施形態では、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）又は式Ｉ、式ＩＩ若しくは式Ｖの化合物は、カンナビノイド合成酵素８を含有する培地４をバイオリアクター１０に導入する前にニッケル樹脂支持体を有するバイオリアクター１０内に存在し得る。いずれの場合も、既知の量の酵素と基質である既知の量の式Ｉ、式ＩＩ若しくは式Ｖの化合物又はＣＢＧＡとを接触させ、生成物としてカンナビノイド又はカンナビノイド類似体、例えば第１のカンナビノイド１４又は第２のカンナビノイド１６を合成する。
バイオリアクター１０内の反応の進行は定期的又は連続的にモニタリングすることができる。例えば、光学モニタリングシステムを利用して、時間に応じたバイオリアクター１０内の培地４中の生成物の濃度を検出してもよい。代替的には、基質の濃度の低下をモニタリングして合成の終了を知らせることができる。このようにして作製されたカンナビノイド生成物は、標準的な溶媒抽出又はクロマトグラフィー精製法を用いて培地から容易に回収することができる。モニタリングシステムは、下記に更に説明されるように制御機構２０の一部であっても又はそれと対話するものであってもよい。
バッチプロセスモードの代替手段は、規定量の基質及び培地４を連続的にバイオリアクター１０に添加し、カンナビノイド生成物を含有する等量の培地４を同時にバイオリアクター１０から取り出すことで、一定の生成物形成速度を維持する連続プロセスモードである。培地４は入口３２を介してバイオリアクター１０に入り、出口３４を介してバイオリアクター１０から出ることができる。基質、酵素及び生成物形成速度の最大化に関わる他の因子の濃度を調節する方法は当該技術分野で既知である。
バイオリアクター１０の条件は制御機構２０を用いて制御することができる。制御機構２０はバイオリアクター１０に連結させてもよく、又は代替的にはバイオリアクター１０とワイヤレス又は遠隔で対話するものであってもよい。制御機構２０はバイオリアクター１０の少なくとも１つの条件を制御し、それにより第２のカンナビノイド１６の形成量に対する第１のカンナビノイド１４の形成量に影響を与えることができる。例えば一実施形態では、カンナビノイド合成酵素８はＴＨＣＡ合成酵素であり、遺伝子組み換えピキア・パストリス酵母細胞により産生される。上記のように、この酵素とカンナビゲロール酸とを接触させることでＴＨＣＡ又はＣＢＣＡの両方の作製が可能となる。ＣＢＣＡに対するＴＨＣＡの産生量（例えばＴＨＣＡとＣＢＣＡとの比率）に影響を与える一条件は、バイオリアクター１０内の培地４のｐＨである。温度、圧力及び流量等のバイオリアクター１０内の他の条件も、バイオリアクター１０内で産生される第１のカンナビノイド１４（例えばＴＨＣＡ）及び第２のカンナビノイド１６（例えばＣＢＣＡ）の相対量に影響を与え得る。一実施形態では、条件（例えばｐＨ、温度、圧力及び／又は流量）の変化は、第２のカンナビノイド１６と比べてより多量の第１のカンナビノイド１４の形成から、第１のカンナビノイド１４と比べてより多量の第２のカンナビノイド１６の形成へのシフトを引き起し得る。
別の実施形態では、制御機構２０を酸素レベル、撹拌、ｐＨ及び供給速度等の発酵装置２の条件を制御するために使用することもできる。制御機構２０は、発酵装置２、フィルター１８及びバイオリアクター１０への材料の（例えば制御ポンプによる）出入りを制御することもできる。
制御機構２０はプロセッサ及び記憶装置を有する処理回路を備えていてもよい。プロセッサは汎用プロセッサ、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、１つ又は複数のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、処理要素群、又は他の好適な電子処理要素として実装され得る。記憶装置（例えばメモリ、メモリユニット、ストレージ装置等）は、本願に記載の様々なプロセス及び機能を完成させる又は容易にする、例えばバイオリアクター１０のｐＨ、温度及び圧力を制御する、又はバイオリアクター１０に出入りする培地４の流量を変更するためのデータ及び／又はコンピュータコードを保存する１つ又は複数の装置（例えばＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリ、ハードディスクストレージ等）である。記憶装置は揮発性メモリ又は不揮発性メモリであっても又はそれを含んでいてもよい。記憶装置はデータベース要素、オブジェクトコード要素、スクリプト要素、又は本願に記載の様々な動作及び情報構造を支持する任意の他のタイプの情報構造を含み得る。一実施形態によると、記憶装置はプロセッサに処理回路を介した通信によって接続し、本明細書に記載の１つ又は複数のプロセスを（例えば処理回路及び／又はプロセッサによって）実行するコンピュータコードを含む。
本開示は様々な操作を達成する、例えばバイオリアクター１０の条件を制御するための任意の機械可読媒体上の方法、システム及びプログラム製品を企図する。本開示の実施形態は、この又は別の目的で組み込まれる既存のコンピュータプロセッサ又は適切なシステムの専用コンピュータプロセッサを用いて、又はハードワイヤードシステムによって実行することができる。本開示の範囲内の実施形態としては、機械可読媒体に保存されている機械により実行可能な指示又はデータ構造を実行する又は有する機械可読媒体を含むプログラム製品が挙げられる。かかる機械可読媒体は、汎用若しくは専用コンピュータ又はプロセッサを有する他の機械がアクセスすることができる任意の利用可能な媒体であり得る。例としては、かかる機械可読媒体はＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ又は他の光ディスクストレージ、磁気ディスクストレージ、他の磁気ストレージ装置、半導体ストレージ装置、又は所望のプログラムコードを機械により実行可能な指示若しくはデータ構造の形態で実行若しくは保存するのに使用することができ、汎用若しくは専用コンピュータ若しくはプロセッサを有する他の機械がアクセスすることができる任意の他の媒体を含み得る。情報がネットワーク又は別の通信接続（ハードワイヤード、ワイヤレス、又はハードワイヤード若しくはワイヤレスの組合せ）を通じて機械に転送又は提供された場合、機械は機械可読媒体の接続を適切に表示する。このため、任意のかかる接続は機械可読媒体と適切に称される。上記の組合せも機械可読媒体の範囲に含まれる。機械により実行可能な指示としては、例えば汎用コンピュータ、専用コンピュータ又は専用処理機械に或る特定の機能又は機能群を実行させる指示及びデータが挙げられる。
制御機構２０は、バイオリアクター１０の条件を制御するためにユーザーと制御機構２０との対話を可能にするキーボード２２及びディスプレー３６等の付加的な装置を更に備えていてもよい。例えば、ディスプレーはユーザーがバイオリアクター１０のｐＨ、温度、圧力及び流量の変化をモニタリングする、又はカンナビノイド若しくはカンナビノイド類似体を作製するシステムの任意の他の条件をモニタリングするのを可能にするスクリーンを備えていてもよい。
様々な例示的な実施形態に示されるカンナビノイド又はカンナビノイド類似体を作製するシステムの構築及び配置は例示的なものにすぎない。ごく少数の実施形態を本開示で詳細に記載したが、多くの修正（例えば様々な要素のサイズ、寸法、構造、形状及び割合、パラメーターの値、材料の使用、色、配向等の変更）が可能である。例えば、要素の位置を入れ替えても又は別の形で変更してもよく、個別の要素の性質若しくは数又は位置を交換又は変更してもよい。したがって、かかる修正は全て本開示の範囲に含まれることが意図される。さらに、任意のプロセス又は方法工程の順序又は配列を代替的な実施形態に従って変更又は並び替えることができる。本開示の範囲から逸脱することなく他の置換、修正、変更及び省略を例示的な実施形態の設計、操作条件及び配置に対して行うことができる。
本技術を以下の実施例によって更に説明するが、これらの実施例は特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
Ａ． 高収率酵母形質転換体からのタンパク質の分子クローニング、スクリーニング及び発現
１． 制限消化
ＴＨＣＡ αプラスミドＤＮＡ又はＣＢＤＡ αプラスミドＤＮＡを、プラスミドをＰｍｅ Ｉ又はＳｐｅ Ｉ制限酵素によって３７℃で適切な時間消化することによって線状化した。次いで、３Ｍ酢酸ナトリウムの１０倍希釈溶液及び２．５容量の９０％エタノールを用いてＤＮＡをエタノール沈殿した。沈殿後にＤＮＡを１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによってペレット化した。ペレットを８０μＬの８０％エタノールで洗浄し、加熱遠心分離を用いて遠心分離して乾固した。この洗浄及び遠心分離工程を繰り返し、それにより得られたＤＮＡを１０μＬの滅菌水に再懸濁し、−２０℃で使用時まで凍結した。
２． エレクトロコンピテント酵母細胞の調製
エレクトロコンピテントＰｉｃｈｉａＰｉｎｋ（ｐＰｉｎｋ）細胞を、１０ｍＬのＹＰＤ培地に遺伝子組み換えＡｄｅ２、ｐｅｐ４ノックアウトｐＰｉｎｋ酵母株２のグリセロールストックを接種することによって作製した。これらの細胞を、２７０ｒｐｍで回転する振盪機を用いて培養物のＯＤ６００が対数期増殖を示す１．３単位の値に達するまで１２５ｍＬ容のバッフル底フラスコにおいて２７℃で一晩増殖させた。次いで、この培養物を１００ｍＬのＹＰＤ培地に添加し、同じ条件下で一晩インキュベートした。ＯＤ６００を１時間毎に確認し、１２時間のインキュベーション期間後に１．３単位の値に達した。
この時点で、培養物を５００ｍＬ容の遠心分離管に移し、４℃及び５２００ｒｐｍで５分間回転させた。上清をデカントし、２５０ｍＬの滅菌氷冷水を添加して、細胞を再懸濁した。この洗浄及び遠心分離プロトコルを２回繰り返して、ＹＰＤ培地の完全な除去を確実にした。５０ｍＬの滅菌氷冷水を用いて最終洗浄を行い、細胞を懸濁し、続いて細胞を５２００ｒｐｍで再ペレット化し、上清をデカントにより除去した。
細胞ペレットに１０ｍＬの滅菌氷冷１Ｍソルビトールを添加した。次いで、ソルビトール−細胞混合物を１５ｍＬ容の滅菌円錐管に移し、５２００ｒｐｍで遠心分離した。３００μＬの滅菌氷冷１Ｍソルビトールを用いた細胞ペレットの２回目の洗浄を行った後、これらの細胞をエレクトロポレーションに使用した。
３． エレクトロポレーション
予め凍結しておいた線状化ＴＨＣＡ αプラスミドＤＮＡ又はＣＢＤＡ αプラスミドＤＮＡを氷上で解凍し、８０μＬのエレクトロコンピテントｐＰｉｎｋ細胞を管に添加した。次いで、この混合物を０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移し、氷上で５分間インキュベートした。キュベットに１６４０Ｖ、２００Ω及び２５μＦ、総パルス時間およそ４ｍｓでパルスした。パルスの直後に、１ｍＬのＹＰＤＳ培地をキュベットに添加し、全混合物をピペッティングにより十分に混合した。次いで、キュベットを振盪することなく２７℃のインキュベーターに２時間入れ、続いて３００μＬを新鮮ＰＡＤプレートに画線培養した（streaked）。これらのプレートを２７℃でおよそ７日〜１０日間インキュベートし、細胞増殖を促進した。
４． スクリーニング及びタンパク質発現
色によるスクリーンを使用して、陽性酵母細胞形質転換体を特定した。白色コロニーは対象の遺伝子の陽性発現の指標であり、赤色コロニーは発現を示さない。したがって、白色コロニーをＰＡＤプレートから選択し、新鮮ＰＡＤプレートに再び画線培養して、これを３日〜５日間インキュベートして、個々のコロニーの増殖を促進した。次いで、単一コロニーを使用して１２５ｍＬ容のバッフル底フラスコに入った１０ｍＬのＢＭＧＹ培地に播種し、これを振盪（２７０ｒｐｍ）しながら２７℃で一晩インキュベートした。６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）（ＯＤ６００）を培養物の１０倍希釈サンプルについて定期的に測定した。
接種材料培養物が１．２単位〜１．５単位のＯＤ６００を達成した時点でインキュベーションを停止した。次いで、接種材料を５０ｍＬ容の円錐管に移し、５２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞をペレット化した。上清をデカントした後、１ｍＬの新鮮ＢＭＭＹ培地をペレットに添加し、続いて管を、滅菌空気交換を可能にする空気孔テープで覆い、２７℃の振盪インキュベーターに入れた。
２４時間後に１００μＬの細胞サンプルを取り出し、これに１００μＬの４０％メタノールを添加して、酵素産生を誘導した。次いで、このメタノールサンプルを１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清及びペレットをＴ１サンプルとして保存した。第２の培養物サンプルを４８時間のインキュベーション期間後に得て、上記のようにメタノールで処理した。遠心分離後に上清及びペレットをＴ２サンプルとして保存した。７２時間の時点で全インキュベーション混合物を適切な容量の４０％メタノールで処理した。７２時間のインキュベーション期間後に培養物のメタノール処理により得られた上清及びペレットをＴ３と標識する。Ｔ３上清をＡｍｉｃｏｎ ３０ｋＤタンパク質フィルターを通して回転させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いてタンパク質について分析した。
商業的量のＴＨＣＡ合成酵素又はＣＢＤＡ合成酵素を、発酵装置を用いて培養物の容量をスケールアップすることによって得た。このため、酵母接種材料を初めに１２５ｍＬ容のバッフル底フラスコ内の１０ｍＬのＢＭＧＹ培地を酵母の単一白色コロニーと接触させることによって調製した。このスターター培養物を２７０ｒｐｍで振盪しながら２７℃で一晩インキュベートし、ＯＤ６００が１．２単位〜１．５単位の培養物を得た。このスターター培養物を用いて１Ｌ容のバッフル底フラスコ内の９０ｍＬのＢＭＧＹ培地に播種した。この培養物のＯＤ６００が１．２単位〜１．５単位に達した時点で、接種材料を５００ｍＬ容の遠心分離ボトルに移し、酵母細胞を５２００ｒｐｍで５分間ペレット化した。
５． 酵素変換
ＴＨＣＡ合成酵素の触媒活性を、２５μｌのＴ３サンプルに由来する無細胞上清を、１０％ＤＭＳＯを含むｐＨ４．８の２００μｌの１００ｍＭクエン酸緩衝液中の２５μｌの１ｍｇ／ｍｌ ＣＢＧＡストックとともに３０℃で２時間インキュベートすることによって測定した。反応混合物中のＣＢＧＡの最終濃度は０．１ｍｇ／ｍｌであった。最終ｐＨは５．０である。表４に、形質転換ｐＰｉｎｋ酵母細胞、すなわち線状化ＴＨＣＡ合成酵素プラスミドを用いて形質転換されたｐＰｉｎｋ酵母細胞の独立コロニーから得られたＴＨＣＡ合成酵素の触媒活性に関するデータを示す。２０％超の基質ＣＢＧＡが生成物ＴＨＣＡへと変換された培養物サンプルをスケールアップに選択した。
Figure 2020022507
６． 多コピーＧＯＩ挿入断片をｉｎ ｖｉｔｒｏで生成するクローニング戦略
上記のように、６コピー〜１０コピーの対象の遺伝子を有する形質転換細胞を、異種タンパク質の作製を潜在的に高めるために使用することができる。代替酵母発現系を使用して、対象の遺伝子の複数のコピーを有する形質転換細胞を得た。Invitrogenの多コピーピキア発現キットを用いて、酵母細胞をプラスミドの複数のコピーで形質転換させる新たなプラスミドを構築した。
簡潔に述べると、ｐＡＯ８１５ベクターを使用して対象の遺伝子をクローニングした。このため、α−ＣＢＤＡ合成酵素及びα−ＴＨＣＡ合成酵素の遺伝子をＥｃｏＲ Ｉ及びＢａｍ ＨＩ制限酵素を用いてｐＰｉｎｋ−ＨＣプラスミドから切り取った。α−ＣＢＤＡ合成酵素遺伝子又はα−ＴＨＣＡ合成酵素遺伝子を含有する１００ｎｇのｐＰｉｎｋ−ＨＣベクターを１μｌのＥｃｏＲ Ｉ緩衝液、１ｕｌの各制限酵素（１０単位／ｕｌ）及び１ｕｌのＢＳＡとともに２０ｕｌの総反応容量、３７℃で２時間インキュベートした。別個に、１００ｎｇのｐＡＯ８１５ベクターを上記のプロトコルを用いてＥｃｏＲ Ｉ及びＢａｍ ＨＩ酵素で消化した。
次いで、消化混合物を０．８％アガロースゲルにロードし、ＤＮＡフラグメントを９５Ｖで１時間の電気泳動により互いに分離した。ＴＨＣＡ合成酵素又はＣＢＤＡ合成酵素の遺伝子に対応するバンドを、Invitrogenのゲル抽出キットを用いてゲルから抽出した。これらの遺伝子フラグメントをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用い、NEB（登録商標）のライゲーションプロトコルに従って線状化ｐＡＯ８１５ベクターにライゲートした。
ライゲーションに続いて、対象の遺伝子を含有する環状ベクターを１５００Ｖ、２００Ω及び２５μＦで４ｍｓのエレクトロポレーションにより大腸菌Ｔｏｐ １０ Ｆ−細胞に形質転換した。次いで、形質転換細胞を２５０ｕｌのＳＯＣ培地（InvitrogenのＯｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標） Ｔｏｐ １０ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐ（商標）大腸菌を添加した）と混合し、ＬＢ−Ａｍｐ１００プレートに３７℃で一晩プレーティングした。
インキュベーション後に、ＰＣＲ実行用の５’ＡＯＸ１及び３’ＡＯＸ１プライマーによるコロニーＰＣＲプロトコルを用いて陽性コロニーを特定した。対象の遺伝子を含有する陽性コロニーを液体ＬＢ−Ａｍｐ１００培地中、３７℃で一晩増殖させた。翌日、Invitrogenのｆａｓｔ ｐｒｅｐキットを用いてプラスミドミニプレップを行い、更なる増幅の前にプラスミドの濃度を０．８％アガロースゲルで分析した。
α−ＴＨＣＡ合成酵素及びα−ＣＢＤＡ合成酵素の遺伝子がｐＡＯ８１５に挿入された後、組み換えプラスミドを２つのバッチに分ける。第１のバッチを対象の遺伝子の第２のコピーが挿入されるベクターとして使用した。ｐＡＯ８１５組み換えプラスミドの第２のバッチは、α−ＴＨＣＡ合成酵素又はα−ＣＢＤＡ合成酵素の遺伝子の抽出に使用した。したがって、ベクターとして使用されるｐＡＯ８１５組み換えプラスミドを、初めにＢａｍ ＨＩ制限酵素でNEBの単一消化プロトコルに従って消化した。同時に、ｐＡＯ８１５組み換えプラスミドの第２のバッチをＢｇｌ ＩＩ及びＢａｍ ＨＩ制限酵素で消化した。
第１及び第２の消化混合物を、０．８％アガロースゲルを用いて精製し、続いて精製した線状化ベクター及びα−ＴＨＣＡ合成酵素又はα−ＣＢＤＡ合成酵素の遺伝子配列をゲルから抽出した。次いで、各々の遺伝子配列をNEBのＴ４ ＤＮＡリガーゼプロトコルに従って線状化ベクターにライゲートし、遺伝子を含有するベクターを使用して大腸菌Ｔｏｐ１０ Ｆ−細胞をエレクトロポレーションにより形質転換した。形質転換細胞を３７℃で一晩インキュベートした後、正確な遺伝子挿入断片についてスクリーニングした。上記のプロトコルを数回繰り返し、多コピー挿入断片プラスミドを得る。遺伝子挿入断片の配列同一性を確認した後、多コピープラスミドをＨｉｓ４配列領域で制限酵素消化により線状化し、コンピテントピキア・パストリス株Ｇ１１５（ｈｉｓ４、Ｍｕｔ＋）細胞の形質転換に使用した。形質転換細胞をスクリーニングのためにＨｉｓ−プレート上で増殖させた。スクリーニングをＨｉｓ−プレートで行い、ピキア・パストリスゲノムのＨｉｓ部位でのプラスミドの組込みを確認した。陽性コロニーをタンパク質のメタノール誘導で選び、分泌タンパク質の活性を上記のプロトコルを用いてアッセイした。
化学合成
Ａ． ゲラニオール（３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエン−１−オール）の合成
Figure 2020022507
 ゲラニオールをパルマローザ油の蒸留によって得た。パルマローザ油（New Directions Aromatics）を減圧下で蒸留し、１３９℃〜１４５℃、２５ｍｍ Ｈｇの減圧下で蒸留される画分をプールして純粋なゲラニオールを得た。
Ｂ． オリベトールの合成
Figure 2020022507
 オリベトールを公表されている手法（Focella, A, et al., J. Org. Chem., Vol. 42, No. 21, (1977), p. 3456-3457）を用いて合成した。
１． メチル６−Ｎ−ペンチル−２−ヒドロキシ−４−オキソ−シクロヘキサ−２−エン−１−カルボキシレート
Figure 2020022507
 ２３０ｍＬの無水メタノール中のナトリウムメトキシド（３２．４ｇ、０．６０ｍｏｌ）及びマロン酸ジメチル（９０ｇ、０．６８ｍｏｌ）の撹拌溶液に、７５ｇ（０．４８ｍｏｌ）の９０％３−ノネン−２−オンを少量ずつ添加した。次いで、反応混合物をＮ２下で３時間還流させ、室温まで冷却した。溶媒を減圧下で蒸留し、残渣を３５０ｍＬの水に溶解した。白色結晶とほぼ透明な溶液とのスラリーを８０ｍＬのクロロホルムで３回抽出した。水層を濃ＨＣｌでｐＨ４まで酸性化し、形成される白色沈殿物を一晩静置した後、濾過した。結晶を高真空下、５０℃で５時間乾燥させ、１０６．５ｇ（０．４４１６ｍｏｌ）（９２％）のメチル６−ｎ−ペンチル−２−ヒドロキシ−４−オキソ−シクロヘキサ−２−エン−１−カルボキシレート（融点９６℃〜９８℃）を得た。生成物を、石油エーテル：酢酸エチル（９：１）の混合物を用いて再結晶化し、９４ｇの純粋なメチル６−ｎ−ペンチル−２−ヒドロキシ−４−オキソ−シクロヘキサ−２−エン−１−カルボキシレート（融点９８℃〜１００℃）を得た。
２． １−Ｎ−ペンチル−３，５−ジヒドロキシベンゼン（オリベトール）
Figure 2020022507
 １１５ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解したメチル６−Ｎ−ペンチル−２−ヒドロキシ−４−オキソ−シクロヘキサ−２−エン−１−カルボキシレート（５８．４ｇ、０．２４ｍｏｌ）の撹拌氷冷溶液に、６０ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解した３７．９ｇ（０．２３ｍｏｌ）の臭素を滴加した。添加（およそ９０分）の終了後に反応混合物を８０℃までゆっくりと加熱すると、二酸化炭素の発生が非常に激しくなった。
反応をガス発生が止まるまでこの温度に維持し、続いて反応物を１６０℃まで更に加熱し、この温度におよそ１０時間保持した。加熱後に反応物を冷却し、溶媒ＤＭＦを減圧下で除去した。これにより得られた残渣を水（８０ｍＬ）で処理し、２５０ｍＬのエーテルで２回抽出した。合わせたエーテル層を水で洗浄した後、２×８０ｍＬの亜硫酸水素ナトリウムの１０％溶液、２×８０ｍＬの酢酸の１０％溶液、続いて水で再び洗浄した。
無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧下で除去し、４６．８ｇの粘性の油を得た。油を減圧下で蒸留し、３０．３ｇ（０．１６８ｍｏｌ）（６９．３％）のオリベトールを生成物として得た。ＨＰＬＣ分析により９７．５％の純度が示された。
Ｃ． ＣＢＧの合成
ＣＢＧをTaura et al., (1996), The Journal of Biological Chemistry, Vol. 271, No. 21, p. 17411-17416に開示のプロトコルに従って合成した。
１． ２−［（２Ｅ）−３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニル］−５−ペンチル−ベンゼン−１，３−ジオール（カンナビゲロール（ＣＢＧ））の合成
Figure 2020022507
 ゲラニオール（３ｇ、０．０１９４ｍｏｌ）及びオリベトール（２ｇ、０．０１１１ｍｏｌ）を、８０ｍｇのｐ−トルエンスルホン酸を触媒として含有する４００ｍＬのクロロホルムに溶解し、反応混合物を暗所、室温で１２時間撹拌した。１２時間後に反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム（４００ｍＬ）、続いてＨ２Ｏ（４００ｍＬ）で洗浄した。クロロホルム層を減圧下、４０℃で濃縮し、得られた残渣を、ベンゼン（１０００ｍＬ）を溶離液として用いた２．０ｃｍ×２５ｃｍシリカゲルカラムでのクロマトグラフにかけ、１．４ｇ（０．００４４２ｍｏｌ）（３９．９％）のＣＢＧを生成物として得た。
代替的には、粗ＣＢＧを以下のようにして精製した。２５０ｍＬ容のビーカーに７．２５ｇの粗ＣＢＧ及び５０ｍＬのベンゼンを添加した。フラスコをかき混ぜてＣＢＧを溶解し、５０ｇのシリカゲルを撹拌子とともに添加した。溶液を一晩撹拌した後、４４ｃｍ×２．７５ｃｍカラムに注ぎ入れた。カラムを３００ｍＬのベンゼンで溶出した。溶離液のおよそ７０ｍＬの画分をＣＢＧについてアッセイした。ＣＢＧを含有する画分１、２及び３（約２３０ｍＬ）を合わせ、溶媒を加圧下で除去し、次の合成工程での使用に好適な純度を有する８０％超のＣＢＧを含む残渣を６．４６４ｇ得た。
一実施形態では、７．２５ｇの粗ＣＢＧ残渣とシリカゲル（５０ｍＬ）のスラリーとを２５０ｍｌ容のビーカー内で混合することによって粗ＣＢＧを精製した。この混合物を１時間ゆっくりとかき混ぜた後、細目濾紙を用いて真空濾過した。濾過ケ−キを２５０ｍｌのベンゼンで透明な濾液が得られるまで洗浄した。濾液から溶媒を減圧下で除去し、８０％超のＣＢＧを含む残渣を６．５６７ｇ得た。
２． ＣＢＧ酸（ＣＢＧＡ）の合成
Ａ． 炭酸メチルマグネシウム（ＭＭＣ）の合成
炭酸メチルマグネシウム（ＭＭＣ）をBalasubrahmanyam et al., (1973), Organic Synthesis, Collective Volume V, John Wiley & Sons, Inc., p. 439-444に開示のプロトコルに従って合成した。
乾燥した２Ｌ容の三つ口フラスコに機械的撹拌器、凝縮器及び１Ｌ容の均圧添加漏斗を取り付け、その最上部にガス導入管を取り付けた。清浄な乾燥マグネシウムリボン（４０．０ｇ、１．６５ｍｏｌ）をフラスコに入れ、システムを窒素でフラッシングした後、無水メタノール（６００ｍＬ）を添加した。反応混合物を外部から冷却することによって水素ガスの発生を制御した。水素の発生が止まった後、緩徐な窒素流をシステムに通過させ、凝縮器を全縮−分取蒸留ヘッドに交換した。窒素フローを停止し、メタノールの大部分を減圧下で溶液から蒸留した。マグネシウムメトキシドのペースト状の懸濁液の撹拌が実際的でなくなった時点で蒸留を停止した。システムを、窒素を用いて再度フラッシングし、蒸留ヘッドの出口を、鉱油を含有する小トラップに取り付け、それにより反応システムから流出するガスの容量を推定することができた。
無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（７００ｍＬ）を反応フラスコに添加し、得られる懸濁液を激しく撹拌しながら、無水二酸化炭素流を添加漏斗に接続したガス導入管により反応容器に通した。二酸化炭素の溶解は懸濁マグネシウムメトキシドの発熱反応を伴っていた。ＣＯ２が吸収されなくなった時点で、無色の溶液を蒸留される液体の温度が１４０℃に達するまで緩徐なＣＯ２ガス流下で加熱し、残留メタノールが反応混合物から除去されたことが示された。反応混合物を、不活性雰囲気下で混合物を室温まで冷却するのを助ける緩徐な窒素流を用いてフラッシングした。これにより５３６ｍｇ ＭＭＣ／ｍＬのＤＭＦを含む溶液が得られた。
Ｂ． ＣＢＧ−Ａの形成
６−カルボン酸−２−［（２Ｅ）−３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニル］−５−ペンチル−ベンゼン−１，３−ジオール、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を以下のようにして調製した。１０ｍＬ容の三角フラスコに１ｍＬのＭＭＣのＤＭＦ溶液を添加した。この溶液に２−［（２Ｅ）−３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニル］−５−ペンチル−ベンゼン−１，３−ジオール（１２０ｍｇ、０．３７９ｍｍｏｌ）を添加した。フラスコを１２０℃で１時間加熱した後、反応混合物を１００ｍＬのクロロホルム：メタノール（２：１）溶液に溶解した。この溶液のｐＨを希ＨＣｌでｐＨ２．０に調整した後、５０ｍＬのＨ２Ｏを用いて分配した。
有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を蒸発により除去した。粗反応物のＨＰＬＣ分析によりＣＢＧからＣＢＧ−Ａへの約４０％の変換が示された。
代替的には、３．１６ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＣＢＧ（又は任意の他の中性カンナビノイド）、８．６３ｇ（１００ｍｍｏｌ）のマグネシウムメチレート及び４４ｇ（１ｍｏｌ）のドライアイスを圧力適合容器に密封した。容器を５０℃に加熱し、温度をその値に３時間保持した。加熱の後、容器を室温まで冷却し、ゆっくりと通気した。反応混合物を１００ｍＬのクロロホルム：メタノール（２：１）溶媒に溶解した。この溶液のｐＨを希ＨＣｌによりｐＨ２．０に調整した後、この溶液を５０ｍＬのＨ２Ｏを用いて分配した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を蒸発により除去した。粗反応混合物のＨＰＬＣ分析により、このプロトコルを用いたＣＢＧからＣＢＧ−Ａへの約８５％の変換が示された。
粗ＣＢＧ−Ａを、２．０ｃｍ×２５ｃｍシリカゲルカラムを用いたクロマトグラフィーにより精製した。生成物をｎ−ヘキサン：酢酸エチル（２：１）（１０００ｍＬ）の混合物を用いて溶出し、４５ｍｇ（０．１２５ｍｍｏｌ）（３７．５％）の所望の生成物を得た。
代替的には、超高純度ＣＢＧＡを、粗生成物を媒体としてＬＨ−２０親油性樹脂を用いたクロマトグラフにかけることによって得た。４００ｇのＬＨ−２０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂を、初めに２ＬのＤＣＭ：クロロホルム（４：１）溶媒を用いて膨潤させた。膨潤させた樹脂を４４×２．７５ｃｍカラムに重力充填した。最小量のＤＣＭ：クロロホルム（４：１）溶媒に溶解した２．１ｇの粗ＣＢＧＡをカラムにロードし、１．７Ｌの同じ溶媒で溶出した。１００ｍＬの画分を回収した。未反応のＣＢＧを、この溶媒系を用いて黄色／橙色溶液として溶出した。約１．７Ｌのこの溶媒を通過させると黄色／橙色画分は観察されなくなり、溶出溶媒を結合したＣＢＧＡを溶出する１００％アセトンに変更した。
ＣＢＧＡを含有する画分をプールし、溶媒を除去して０．５２ｇのＣＢＧＡを得た（約９０％の回収率）。アセトンで溶出する前にカラムに通すＤＣＭ：クロロホルム（４：１）溶媒の容量を増大させることで、９９．５％超の純度を有するＣＢＧＡを得た。
ＣＢＧＶの合成
ＣＢＧＶを以下のようにして合成した。
Ａ． メチル６−Ｎ−プロピル−２−ヒドロキシ−４−オキソ−シクロヘキサ−２−エン−１−カルボキシレート：
Figure 2020022507
 簡潔に述べると、３−ヘプテン−２−オン（３０．１ｇ、０．２５ｍｏｌ）を、マロン酸ジエチル（５２．０１６ｇ、０．３２３ｍｏｌ）及びナトリウムメトキシド（１６．２０６ｇ、０．３ｍｏｌ）の乾燥メタノール（１２５ｍＬの乾燥ＭｅＯＨ）溶液に滴加した。真空オーブン内、４５℃で一晩乾燥させると、粗生成物は４６．３１５ｇと秤量された。粗生成物を石油エーテル（３００ｍＬ）に溶解した。撹拌後に任意の非溶解材料を溶液から濾過し、その後酢酸エチル（３０ｍＬ）を添加し、ＣＢＧＶを沈殿させた。沈殿物を濾過し、真空オーブン内、４４℃で一晩乾燥させた。合計３３．５６９ｇ（０．１５７ｍｏｌ）（５２．３％）の所望の生成物が回収された。
Ｂ． １−Ｎ−プロピル−３，５−ジヒドロキシベンゼン
Figure 2020022507
 メチル６−Ｎ−プロピル−２−ヒドロキシ−４−オキソ−シクロヘキサ−２−エン−１−カルボキシレートを出発物質として使用した以外は、オリベトールの合成のための上記と同様の手法を用いて表題の化合物を製造した。簡潔に述べると、メチル６−Ｎ−プロピル−２−ヒドロキシ−４−オキソ−シクロヘキサ−２−エン−１−カルボキシレートの撹拌氷冷ＤＭＦ溶液に臭素のＤＭＦ溶液を添加した。臭素の添加の後、反応混合物を８０℃に加熱した。加熱に伴って二酸化炭素ガスの生成及び放出が起こった。ガス発生が止まった後、反応物の温度を１６０℃まで増大させ、加熱を１０時間継続した。次いで、反応物を冷却し、ＤＭＦを減圧下で除去した。粗混合物を水で希釈し、ジエチルエーテルを用いた溶媒抽出に供した。エーテルを除去し、残留する油を蒸留することによって表題の化合物を得た。
Ｃ． ２−［（２Ｅ）−３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニル］−５−プロピル−ベンゼン−１，３−ジオール（ＣＢＧＶ）
ＣＢＧＶの合成は、ｐ−トルエンスルホン酸をゲラニオール及び１−Ｎ−プロピル−３，５−ジヒドロキシベンゼンのクロロホルム溶液に添加することによって進行した。反応物を暗所、室温で１２時間撹拌した後、水を添加して粗生成物をクロロホルム層に分配した。次いで、クロロホルム層を飽和重炭酸ナトリウムで洗浄し、乾燥させ、有機溶媒を除去した後、ＣＢＧの合成について上記したように精製した。
Ｄ． ６−カルボン酸−２−［（２Ｅ）−３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニル］−５−プロピル−ベンゼン−１，３−ジオール（ＣＢＧＶＡ）
６−カルボン酸−２−［（２Ｅ）−３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニル］−５−プロピル−ベンゼン−１，３−ジオール、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＶＡ）を以下のようにして調製した。炭酸メチルマグネシウム（ＭＭＣ）を上記のようにして調製した。フラスコ内のＭＭＣのＤＭＦ溶液に、２−［（２Ｅ）−３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニル］−５−プロピル（propyl）−ベンゼン−１，３−ジオールを添加した。フラスコを１２０℃で１時間加熱した後、反応混合物をクロロホルム：メタノールの２：１混合物に溶解した。この溶液のｐＨを希ＨＣｌでｐＨ２．０に調整し、反応混合物を、Ｈ２Ｏを用いて抽出した。
有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を蒸発により除去して、表題の化合物ＣＢＧＶＡを粗生成物として得た。
カンナビノイドの大規模酵素生成
１００ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を、酸素ガススパージャー及び撹拌器を備えるガラス反応容器に入れた。この溶液に３５ｇ／ｌの２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰβＣＤ；Ｋｌｅｐｔｏｓｅ（登録商標） ＨＰＢ）、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンナトリウム塩（ＳＢＥβＣＤ；Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標））、又は無作為にメチル化したβ−シクロデキストリン（ＲＭβＣＤ）を添加した。ＣＤを５ｇと少量で添加し、完全に溶解させた。
２．５ｇのカンナビノイド合成酵素基質、例えばＣＢＧＡ若しくはＣＢＧＶ−Ａ、又は式Ｉ、式ＩＩ若しくは式Ｖの化合物を緩衝シクロデキストリン溶液に添加した。ＣＤと基質とのモル比は約４：１であった。６０ｍｇの精製合成酵素を溶液に添加し、反応混合物を３０℃で８時間インキュベートした。反応の進行をＨＰＬＣによって定期的にモニタリングし、酵素アッセイを用いて過酸化水素の発生を検出及び定量化した。
８時間後に、９０％超のＣＢＧＡ基質がＴＨＣＡ及びＣＢＣＡに変換された。ＴＨＣＡとＣＢＣＡとの比率は５．０の酸性ｐＨでおよそ１０：１であった。ＣＢＣ異性体の比率は５：１であった。
水溶液を９５％ＥｔＯＨで１０倍に希釈した。これによりシクロデキストリンが沈殿し、カンナビノイドが溶液中に残る。シクロデキストリンを真空濾過し、１Ｌの９０％ＥｔＯＨで洗浄し、乾燥させて今後の反応における再利用を可能にする。カンナビノイドを含有するエタノール溶液の濃縮、その後のＤＣＭ：クロロホルム（chloroform）（４：１）溶媒への残渣の懸濁により、約２５ｇの橙黄色の粗残渣が得られた。
カンナビノイドの大規模精製
本技術の方法を用いて合成したカンナビノイドの精製は、ＬＨ−２０親油性樹脂を用いたクロマトグラフィーにより達成された。簡潔に述べると、４０００ｇの樹脂を、２０ＬのＤＣＭ：クロロホルム（４：１）を用いて膨潤させた。膨潤させた樹脂を４４×２７．５ｃｍカラムに重力充填した。膨潤させた樹脂の容量は約１３５０ｍＬであった。カラムに最小量の溶媒に溶解した２５ｇの粗残渣をロードした後、４ＬのＤＣＭ：クロロホルム（４：１）溶媒で洗浄してＣＢＧを溶出させた。カンナビノイド酸はこの溶出中にカラムから溶出しなかった。
１：１→０：１のＤＣＭ：アセトン溶媒による勾配溶出を用いてカンナビノイド酸を溶出した。各勾配工程に１カラム容量（４Ｌ）の溶媒を用いた。ＣＢＣＡが初めに溶出し、続いてＣＢＧＡ、その後ＴＨＣＡが溶出した。各々のカンナビノイドの純度は９９．５％超であった。
純粋なカンナビノイドを、酸形態を真空下、９０℃で加熱することによってそれらの中性又は「活性」形態へと更に加工することができる。脱炭酸により中性カンナビノイドが定量的に得られた。必要に応じて再結晶化を行い、医薬品グレードのカンナビノイドを得ることができる。

Claims (14)

  1. カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）及びカンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）を異なる比率で生成する方法であって、
    （ａ）反応混合物中で、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）をＣＢＤＡ合成酵素と反応させ、
    （ｂ）前記反応混合物のｐＨを４．０と８．０のレンジ内に選択して、前記ＣＢＤＡ及び前記ＣＢＣＡを生成し、
    （ｃ）生成された前記ＣＢＤＡ及び前記ＣＢＣＡを回収することを含む方法。
  2. 前記ＣＢＤＡ合成酵素は固体支持体に固定されていることを含む請求項１の方法。
  3. 前記ＣＢＤＡ合成酵素は遺伝子組み換えＣＢＤＡ合成酵素であり、前記方法は更に前記遺伝子組み換えＣＢＤＡ合成酵素を生成することを含む請求項１の方法。
  4. 前記遺伝子組み換えＣＢＤＡ合成酵素を生成するステップはＣＢＤＡ合成酵素を過剰に発現することを含む請求項３の方法。
  5. 前記ＣＢＤＡ合成酵素は酵母又は大腸菌内で発現することを含む請求項４の方法。
  6. 前記反応混合物は、ジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、イソプロピルアルコール、及びシクロデキストリンの一つ又は複数である溶媒であり、前記反応混合物中の前記溶媒の量は５％（ｖ／ｖ）と３０％（ｖ／ｖ）の間である、請求項１の方法。
  7. カンナビノイド生成物を作製するシステムであって、
    （ａ） 遺伝子操作された酵母またはバクテリア細胞を含む細胞培養培地を収容し、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）合成酵素を前記細胞培養培地に産生及び分泌する発酵装置と、
    （ｂ）反応混合物を含むバイオリアクターであって、前記ＣＢＤＡ合成酵素をカンナビゲロリック酸（ＣＢＧＡ）と接触させ、前記ＣＢＤＡ合成酵素によって合成された少なくとも一つのカンナビノイド生成物を形成するバイオリアクターと、
    （ｃ）前記ＣＢＤＡ合成酵素を含む前記細胞培養培地の特性を調整するか、又は、前記反応混合物の特性を制御するように構成され、生成された一つ又はより多くのカンナビノイド生成物の量を修正する制御機構を含み、
    前記反応生成物の前記特性は前記反応のイオン強度、前記反応のｐＨ、前記反応の温度、前記反応の圧力の少なくとも一つであり、
    前記反応混合物のｐＨは４〜８未満である、システム。
  8. 更に、前記細胞によって生成された前記カンナビノイド合成酵素を含む前記細胞培養培地から前記細胞を分離するフィルターを含んでいる請求項７のシステム。
  9. 前記制御機構は前記反応混合物の一つ又はより多くの特性を制御する処理回路及び表示装置を含んでいる請求項７のシステム。
  10. 遺伝子操作された酵母またはバクテリア細胞を含む前記細胞培養培地の特性は前記細胞培養培地の酸素レベル、前記細胞培養培地の攪拌レート、又は前記細胞培養培地のｐＨの一つ又はそれ以上である、請求項７のシステム。
  11. 前記制御機構は前記細胞培養培地の流量を前記バイオリアクターに対して調整するように構成されている請求項７のシステム。
  12. 前記バイオリアクターはニッケルを含むカラムバイオリアクターであり、前記カンナビノイド合成酵素はニッケル接合用タグを含んでいる、請求項７のシステム。
  13. 前記バイクテリア細胞は大腸菌の細胞である、請求項７のシステム。
  14. 前記反応混合物は溶媒（ｓｏｌｖｅｎｔ）を含んでおり、前記溶媒はジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、イソプロピルアルコール、及びシクロデキストリンの一つ又は複数であり、前記反応混合物中における前記溶媒の量は５％〜３０％（ｗ／ｖ）である請求項７のシステム。
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