JP2019180377A - 水棲動物用餌料の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】デトリタス食性水棲動物の飼育に好適な水棲動物用餌料の製造方法を提供する。【解決手段】水棲動物用餌料の製造方法は、海産ツボワムシ類を冷凍する冷凍ステップと、当該海産ツボワムシ類を解凍する解凍ステップと、を含む。【選択図】図７

Description

本発明は、水棲動物用餌料の製造方法に関する。

ニホンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｊａｐｏｎｉｃａ）は、伝統的な食材であり、外食産業で重要な食材の一つである。養殖用の種苗であるシラスウナギのほとんどが天然海域から採捕されている。近年、シラスウナギの採捕量が減少しているため、ニホンウナギの養殖での生産量が制限されている。

ニホンウナギの完全養殖技術は既に確立されているが普及にまでは至っていない。ニホンウナギの完全養殖技術が普及に至らない理由の一つとして、仔魚が稚魚に成長するまでの有効な餌が開発されていないことが挙げられる。ニホンウナギの完全養殖技術の確立時にはアブラツノザメの卵を加工した餌が使用されていた。しかし、アブラツノザメは資源量の少ない魚であるため、アブラツノザメのメスの卵を十分に継続的に確保することは難しい。したがって、アブラツノザメの卵をニホンウナギの仔魚の餌の原料とするのは適切ではない。

天然域のニホンウナギの仔魚の餌はマリンスノーである。マリンスノーとは、デトリタス、すなわち主に動植物プランクトンに由来する高分子有機体である。ニホンウナギに限らず、甲殻類及び貝類もデトリタスを摂取する。養殖対象の甲殻類であるガザミ及びバナメイエビ等、貝類であるアサリ、ハマグリ及びタイラギ等に関しては、幼生期あるいは成体に成長した後でも濾過食性を示す場合に、微細藻類だけでなくデトリタスを餌料とすることができる。

確立されつつある甲殻類及び貝類の養殖技術では、微細藻類が餌料として利用されている。しかし、これら甲殻類又は貝類は、成長段階で生残数が急激に減少することが多い。生残数の減少の原因が餌料である場合に、微細藻類に代わる餌料がないのが現状である。

特許文献１には、クロレラを餌料として海産ツボワムシ類（以下、「ワムシ」ともいう）を養殖している水槽で、ウナギの仔魚を飼育するウナギの増養殖方法が開示されている。特許文献１の増養殖方法では、水槽内のワムシの糞、ワムシの卵、仔ワムシ又はワムシの死骸を含むマリンスノーを餌料として、ウナギが飼育される。

特開２０１５−１０７０８５号公報

上記特許文献１に開示されたウナギの増養殖方法では、マリンスノーの供給量がワムシの状態に依存するため、マリンスノーを安定して供給できない場合がある。また、ワムシの糞は消化された結果の産物であり、栄養価を厳密に制御できない。

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、デトリタス食性水棲動物の飼育に好適な水棲動物用餌料の製造方法を提供することを目的とする。

本発明の観点に係る水棲動物用餌料の製造方法は、
海産ツボワムシ類を冷凍する冷凍ステップと、
前記海産ツボワムシ類を解凍する解凍ステップと、
を含む。

この場合、前記解凍ステップでは、
解凍した前記海産ツボワムシ類を常温下に１５〜３０時間置く、
こととしてもよい。

また、前記解凍ステップの後に、前記海産ツボワムシ類を冷凍する再冷凍ステップをさらに含む、
こととしてもよい。

また、前記海産ツボワムシ類は、
第１の微細藻類を給餌されて培養された第１の海産ツボワムシ類及び前記第１の微細藻類とは異なる第２の微細藻類を給餌されて培養された第２の海産ツボワムシ類である、
こととしてもよい。

また、前記第１の微細藻類及び前記第２の微細藻類は、
クリプト藻類、ハプト藻類及び珪藻類からなる群からそれぞれ選択される、
こととしてもよい。

また、前記第１の微細藻類は、
Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｓｐ．であって、
前記第２の微細藻類は、
Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎｓである、
こととしてもよい。

本発明によれば、デトリタス食性水棲動物の飼育に好適な餌料が得られる。

Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す図である。 図１に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥで得られたバンドのＯＤ積分値を示す図である。 解凍処理したワムシから調製した試料液の吸光度の相対値を示す図である。 解凍処理したワムシの乾燥重量１ｇあたりの脂肪酸の含量を示す図である。 解凍処理したワムシの乾燥重量１ｇあたりの脂肪酸の種類ごとの含量を示す図である。 解凍処理したワムシの乾燥重量１ｇあたりの飽和脂肪酸、１価不飽和脂肪酸及び多価不飽和脂肪酸の含量を示す図である。 飼育試験１の各試験区の生残率を示す図である。 （Ａ）及び（Ｂ）は、解凍直後に再凍結したワムシを餌料とした試験区の個体の画像を示す図である。（Ｃ）及び（Ｄ）は、解凍から再凍結までの時間を１２時間としたワムシを餌料とした試験区の個体の画像を示す図である。（Ｅ）及び（Ｆ）は、解凍から再凍結までの時間を２４時間としたワムシを餌料とした試験区の個体の画像を示す図である。 飼育試験１及び飼育実験２の各試験区の生残率を示す図である。 （Ａ）は、珪藻類を給餌し、解凍から再凍結までの時間を２４時間としたワムシを餌料とした試験区の個体の画像を示す図である。（Ｂ）はハプト藻類を給餌し、解凍から再凍結までの時間を２４時間としたワムシと、珪藻類を給餌し、解凍から再凍結までの時間を２４時間としたワムシとを混合した餌料を給餌した試験区の個体の画像を示す図である。

本発明に係る実施の形態について図面を参照しながら説明する。なお、本発明は下記の実施の形態によって限定されるものではない。

本実施の形態に係る水棲動物用餌料の製造方法は、冷凍ステップと、解凍ステップとを含む。冷凍ステップでは、水棲動物用餌料の成分となるワムシを冷凍する。ワムシは特に限定されず、例えば、Ｌ型（Ｂｒａｃｈｉｏｎｕｓ ｐｌｉｃａｔｉｌｉｓ Ｏ．Ｆ．Ｍｕｌｌｒｅ）、Ｓ型（Ｂｒａｃｈｉｏｎｕｓ ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｒｍｉｓ Ｔｓｃｈｕｇｕｎｏｆｆ）、ＳＳ型、Ｌ型小浜株及びＳ型八重山株等が用いられる。

ワムシは市販のものでもよいし、公知の方法で培養したものを用いてもよい。ワムシの培養方法としては、植え継ぎ式培養法、屋外培養法、間引き式培養法及び高密度培養法等が挙げられる。ワムシの培養では、微細藻類を給餌されるのが好ましい。微細藻類は、ワムシの餌となるものであれば、特に限定されないが、好ましくはクリプト藻類、ハプト藻類及び珪藻類の少なくとも１種である。

クリプト藻類としては、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）、ロドモナス（Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ）及びクロオモナス（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）等が挙げられる。

ハプト藻類としては、イソクリシス・エスピー（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｓｐ．）、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）及びパブロバ・ルセリ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ）等が挙げられる。具体的には、イソクリシス・エスピーとしては、ＣＣＡＰ９２７／１２、ＣＣＡＰ９２７／１４、ＵＴＥＸ ＬＢ１２９２及びＵＴＥＸ２３０７等が挙げられる。イソクリシス・ガルバナとしては、ＣＣＡＰ９２７／１及びＵＴＥＸ ＬＢ９８７等が挙げられる。好適には、ハプト藻類はイソクリシス・エスピー タヒチ株である。

珪藻類としては、キートセロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、オビケイソウ（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）、フネケイソウ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）及びアンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）等が挙げられる。好適には、珪藻類はキートセロス・カルシトランス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ）である。

微細藻類として、公知の方法で培養できる微細藻類を用いてもよい。微細藻類を培養する場合、微細藻類の確立された培養株を用いればよい。微細藻類は、ギラードＦ培地、ＫＷ２１培地及びＭＮＫ培地等、培養する微細藻類に応じた培養液で培養される。培養液として市販のギラード（Ｆ／２）海水栄養液又は各種ビタミン及びアミノ酸を配合した微細藻類用培養液等を用いてもよい。

好ましくは、微細藻類の培養液には、ギラードＦ培地又はＫｗ２１培地が用いられる。Ｋｗ２１培地として、例えば、希釈海水１Ｌに対して１ｍＬのＫｗ２１培地（第一製網社製）を添加したものを用いてもよい。ギラードＦ培地及びＫｗ２１培地には、特に珪藻類の培養に用いる場合にケイ酸ナトリウムがさらに添加されてもよい。ケイ酸ナトリウムの添加量は適宜調整される。例えば、ギラードＦ培地の場合はケイ酸ナトリウム９水和物を、１０〜５０ｍｇ／Ｌ、２０〜４０ｍｇ／Ｌ、好ましくは３０ｍｇ／Ｌの濃度で添加すればよい。一方、Ｋｗ２１培地の場合はケイ酸ナトリウム９水和物を、７０〜１１０ｍｇ／Ｌ、８０〜１００ｍｇ／Ｌ、好ましくは９０ｍｇ／Ｌの濃度で添加すればよい。

培養は、培養液の温度を１８〜２５℃程度、好ましくは２０℃に維持し、通気下で培養すればよい。好ましくは、通気される空気は、濾過フィルター等で無菌処理される。

栄養強化の観点から、上記のワムシは、第１の微細藻類を給餌されて培養された第１のワムシ及び第１の微細藻類とは異なる第２の微細藻類を給餌されて培養された第２のワムシであってもよい。この場合、好適には、第１の微細藻類は、イソクリシス・エスピーであって、第２の微細藻類は、キートセロス・カルシトランスである。第１のワムシと第２のワムシとの混合比は、特に限定されず、各ワムシが有する脂肪酸等の栄養に応じて調整すればよい。

ワムシの冷凍方法は、特に限定されない。ワムシを冷凍するには、ワムシを冷凍庫に保持するのが簡便である。ワムシが凍結する温度であれば、冷凍庫の温度は特に限定されない。ワムシの冷凍温度は、例えば、−２０〜−８０℃である。培養したワムシを冷凍する場合、収穫したワムシの水を切って、ワムシをペースト状にしてから冷凍するのが好ましい。

次に、解凍ステップについて説明する。解凍ステップでは、冷凍された上記ワムシを解凍する。解凍ステップでは、例えば、冷凍されたワムシを常温に静置すればよい。常温とは、２０℃±１５℃（５〜３５℃）である。好ましくは、解凍ステップでは、冷凍されたワムシを１５〜３５℃、１８〜３０℃、２０〜２８℃、又は２２〜２６℃の温度下に置く。

解凍ステップでは、冷凍されたワムシを常温の水に入れてワムシを解凍してもよい。解凍ステップでは、冷凍されたワムシを恒温槽等で緩やかに加熱しながら解凍してもよい。ただし、加熱する場合は、ワムシの温度をワムシの酵素が失活しない温度に維持するのが好ましい。

好適には、解凍ステップでは、解凍したワムシを常温下に１５〜３０時間置く。常温下に置く時間は、例えば１８〜２８時間、２０〜２６時間、好ましくは２４時間である。常温に置くことで、ワムシが有する酵素の活性によってワムシの分解が促進され、ワムシのゲル化が促進される。ワムシの分解をさらに促進するために、所定の分解酵素、特にはワムシが有する分解酵素をワムシに作用させてもよい。

当該製造方法は、解凍ステップの後に、ワムシを冷凍する再冷凍ステップをさらに含んでもよい。再冷凍の方法は、上記冷凍ステップと同様である。再冷凍することで、ワムシが有する酵素活性を低下させることができる。これにより、ワムシの過度の分解を防ぐことができる。

解凍ステップで得られたワムシ、又は再冷凍ステップ後に解凍したワムシは、ゲル状（例えば、飼育水に分散した際の粒子の大きさが約０．１ｍｍ以下）であって、デトリタス食性水棲動物の餌料として使用できる。当該餌料は、上記ワムシの他、必要に応じて種々の添加物等を含んでもよい。

デトリタス食性水棲動物とは、例えば、ニホンウナギ、アナゴ、甲殻類及び貝類等である。甲殻類としてはガザミ及びバナメイエビ等が挙げられる。貝類としてはアサリ、ハマグリ及びタイラギ等が挙げられる。当該餌料は、幼生期のみならず、成体に成長した後でも濾過食性を示す水棲動物の餌料に好適である。ニホンウナギの餌料とする場合、当該餌料は、好ましくは、葉形仔魚及び稚魚の時期に与えられる。

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る水棲動物用餌料の製造方法によれば、解凍ステップにおいてワムシが分解されるため、飼育水中で分散し、水棲動物の口に入りやすく、消化されやすい餌料を製造することができる。当該餌料は、デトリタス食性水棲動物の飼育に好適である。

また、本実施の形態に係る解凍ステップでは、解凍したワムシを常温下に置いてよいこととした。こうすることで、ワムシが有する酵素の活性によってワムシの分解がさらに促進され、ウナギ等の葉形仔魚の狭小な咽頭部にも取り込まれやすく、さらに消化されやすいゲル状の餌料が得られる。

また、本実施の形態に係る解凍ステップでは、解凍ステップの後に、ワムシを冷凍する再冷凍ステップをさらに含んでもよいこととした。これにより、水棲動物に必要な栄養素の分解を防ぐことができる。

また、本実施の形態に係るワムシは、異なる微細藻類を給餌されて培養された第１のワムシ及び第２のワムシであってもよいこととした。豊富に有する栄養が異なる微細藻類をそれぞれ与えられたワムシを組み合わせることで、餌料の栄養を柔軟に制御することができる。例えば、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を豊富に含むイソクリシス・エスピーを給餌したワムシと、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を豊富に含むキートセロス・カルシトランスを給餌したワムシとを用いることで、当該水棲動物用餌料に含まれる、ニホンウナギ等の水棲動物に重要な脂肪酸を強化することができる。

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

（解凍処理したワムシの調製）
ワムシとして、海産ツボワムシ類Ｂｒａｎｃｈｉｏｎｕｓ Ｌ型小浜株を用いた。ワムシは植え継ぎ式培養法で培養した。培養水は、７５％に希釈した海水（２２ｐｓｕ）とした。ワムシの培養は５Ｌの水槽から始め、ワムシの増殖に応じて３０Ｌの円形透明ポリカーボネート水槽を用いた。エアストーンを介して培養水を十分に通気しながらワムシを培養した。培養水の温度を、ヒーターを用いて２６℃に維持した。３日おきに、６３μｍの目合いのプランクトンネット（２５ＸＸ、田中三次郎商店製）を用いて培養水の交換を行った。

キートセロス・カルシトランス（以下「キートセロス」という）又はイソクリシス・エスピー タヒチ株（以下「イソクリシス」という）を餌としてワムシに与えた。ワムシへの給餌は１日１回とした。１回あたりの給餌量はワムシ１個体につきキートセロス又はイソクリシスを２００００細胞とした。

ここで、微細藻類の培養方法について説明する。キートセロスの培養液の調製では、１００μｍ、２５μｍ及び１０μｍの目合いのカートリッジフィルターを目合いの大きい順に用いて、海水（約３３ｐｓｕ）をろ過した。強制循環式殺菌灯で海水を紫外線殺菌した。続いて、３０Ｌの円形透明ポリカーボネート水槽で１０Ｌの上記海水と５Ｌの蒸留水とを混合し、希釈海水（約２２ｐｓｕ）を調製した。

希釈海水にケイ酸ナトリウム９水和物（Ｎａ_２ＳｉＯ_３・９Ｈ_２Ｏ）を添加した（３０ｍｇ／Ｌ）。得られた希釈海水を用いて、Ｇｕｉｌｌａｒｄ及びＲｙｔｈｅｒの方法（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、８、２２９−２３９、１９６２年）に従って、培養液としてのギラードＦ培地を調製した。ギラードＦ培地の調製で希釈海水に添加した成分は、チアミン、ビオチン、ビタミンＢ_１２、硫酸銅、硫酸亜鉛、塩化コバルト、モリブデン酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム及び鉄（ＩＩＩ価）−ＥＤＴＡである。室温２０℃及び２４時間電照の条件で、強通気下の当該培養液においてキートセロスを培養した。

イソクリシスの培地には、ケイ酸ナトリウム９水和物を添加する点を除いて上記キートセロスの培養に用いたギラードＦ培地と同様に調製した培地を用いた。水温２０℃、１５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ^２／ｓの光を２４時間連続照射し通気下で、１Ｌフラスコ内のバッチ培養によってイソクリシスを培養した。

培養したワムシを６３μｍの目合いのプランクトンネットで濾し、蒸留水で洗った。プランクトンネットの下から水分を拭き、１．５ｍＬ容マイクロチューブにワムシを入れた。その後、ワムシを−８０℃で凍結し、ウォーターバス（ＳＢ−１２００、東京理化器械社製）を用いて２５℃で解凍した。解凍直後のワムシ、解凍から１２時間又は２４時間、２５℃に静置しておいたワムシを−８０℃で再度凍結させた。

上述のキートセロスを給餌して培養したワムシであって、解凍直後に再凍結したワムシを「Ｃ０」とする。キートセロスを給餌して培養したワムシであって、解凍から再凍結までの時間を１２時間としたワムシを「Ｃ１２」とする。キートセロスを給餌して培養したワムシであって、解凍から再凍結までの時間を２４時間としたワムシを「Ｃ２４」とする。Ｃ０、Ｃ１２及びＣ２４を試料として、以下の分析及び飼育実験を行った。

（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解凍処理したワムシの成分分析）
Ｃ０、Ｃ１２及びＣ２４におけるタンパク質の分解の程度を、以下のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した。１．５ｍＬ容マイクロチューブに試料を少量加え、１×ＰＢＳバッファー（塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素二ナトリウム・１２水和物、リン酸二水素カリウム）５００μＬを加えた。次に、撹拌機（Ｖｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ ２、サイエンティフィックインダストリーズ社製）で撹拌し、マイクロ冷却遠心機（３７４０、久保田商事社製）で遠心分離した（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）。遠心分離後、上澄み液を捨てた。

新しい遠沈管の中で、１×ＰＢＳバッファー４５００μＬ、１０％ＴｒｉｔｉｏｎＸ−１００溶液５００μＬ、２ｍｇ／ｍＬロイペプチン溶液２５μＬ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液１０μＬ、０．２Ｍ ＰＭＳＦ溶液５μＬを混合した（以下、試薬Ａとする）。試料の量の９倍量の試薬Ａを、試料が入った１．５ｍＬ容マイクロチューブに加えた。当該マイクロチューブを氷上で１５分間静置した。撹拌機で試料を撹拌し、遠心分離した（１２，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）。遠心分離後、上澄み液を回収し、１０倍希釈して試料液を得た。

タンパク質量の基準となるウシ血清アルブミン（Ｆ−Ｖ、ｐＨ５．２）（以下、「ＢＳＡ」とする）を１ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ及び０．２５ｍｇ／Ｌの濃度で含むＢＳＡ溶液をそれぞれ２０μＬ調製した。５倍希釈したＣＢＢ溶液（コマジーブリリアントブルー、Ｇ−２５０、エタノール及びリン酸）５００μＬを、試料液及びＢＳＡ溶液それぞれに加えた。撹拌機で試料液を撹拌し、分光光度計（Ｕ−５１００、日立ハイテクサイエンス社製）を用いて試料液の吸光度を測定した。ＢＳＡ溶液のＢＳＡの濃度とその吸光度とからたんぱく質量の指標となる標準曲線を作成した。標準曲線の回帰式から試料液のタンパク質濃度を推定した。

タンパク質濃度が一定（ｍｇ／ｍＬ）で容量が２４ｍＬに溶液になるように、１．５ｍＬ容マイクロチューブに試料液、純水及び３×Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒを入れた。試料液を撹拌機で撹拌し、５秒間遠心分離した。続いて、インキュベーター（Ｍｉｎｉ Ｔ−１００、チヨダサイエンス社製）で３分間、１００℃でインキュベートした。

ランニングゲルを調製するために、アクリルアミド水溶液３．４ｍＬ、純水４．５ｍＬ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ２．０ｍＬ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）１００μＬ、５％ペルオキソ二硫酸アンモニウム水溶液（ＡＰＳ）１００μＬ、及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ（ＴＥＭＥＤ）を含む１，４−ブタンジアミン水溶液１０μＬを混合した。ガラス板（ＭＡＢ−１０及びＭＢ−００、アトー社製）の間にガスケット（ＲＭＳ−０１、アトー社製）を挟み、クリップ（ラピダスマグネクリップミニ、アトー社製）で固定した。ガラス板の間にランニングゲルを流し込んだ後、純水をランニングゲル上に重層し、３０分間静置した。

スタッキングゲルを調製するために、アクリルアミド水溶液５００μＬ、純水３．９ｍＬ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５００μＬ、ＳＤＳ ５０μＬ、５％ＡＰＳ ５０μＬ、ＴＥＭＥＤを含む１，４−ブタンジアミン水溶液５μＬを混合した。ランニングゲルの上にある純水を取り除き、スタッキングゲルを流し入れ、コーム（ＲＭ１０−１２、アトー社製）を取り付け、３０分間静置した。

泳動槽（ＡＥ−６５３０、アトー社製）の中に泳動用Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、グリシン及びＳＤＳ）を約４００ｍｌ入れた。ゲル板からガスケットとコームをとりはずし、泳動槽内に設置した。泳動用Ｂｕｆｆｅｒを泳動槽が満たされるまで加えた。５ｍＬのシリンジを用いてウェルに残った未重合のアクリルアミドを取り除いた。シリンジで試料液をウェルに入れた。

泳動槽を電源装置（パワーパック（商標）ＨＣ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）に接続し、０．０２Ａで泳動した。泳動後、ランニングゲルを切り出し、固定液（メタノール、酢酸及び水）に１０分間漬けた。回転撹拌機（ＤＳＲ−２１００Ｐ、Ｐｒｉｍａｃｏ Ｇｒｏｕｐ社製）の上で、ＣＢＢ染色液（コマジーブリリアントブルー、エタノール及び酢酸）で一日染色した。

ゲル専用撮影システム（ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈ ＭＰ イメージングシステム、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）でゲルを撮影した。画像解析ソフトｉｍａｇｅｊ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）を用いて画像解析により特定のバンドを定量化した。

（ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果）
図１にＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルの画像を示す。各試料について３７ｋＤａ付近（実線で包囲した部分）のバンドのＯＤ積分値を図２に示す。ＯＤ積分値は、解凍から再凍結までの静置時間が長いほど減少した。

（ＯＰＡ法による解凍処理したワムシの成分分析）
Ｃ０、Ｃ１２及びＣ２４について、分解により分離した遊離アミノ酸の量をＯＰＡ（ｏ−Ｐｈｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅ）法で測定した。１００Ｍホウ酸Ｂｕｆｆｅｒ（四ホウ酸二ナトリウム１０水和物及び蒸留水、ｐＨ９．５）５０ｍＬ、メタノール２ｍＬにオルトフタルアルデヒド８０ｍｇを溶かした溶液、及びβ−メルカプトエタノール２００μＬを混合し、純水で１００ｍＬにメスアップした（以下、「溶液Ｂ」とする）。

各試料と溶液Ｂとを混合し、撹拌機で５秒間撹拌して試料液を得た。２分間静置し、分光光度計（Ｕ−５１００、日立ハイテクサイエンス社製）を用いて、３４０ｎｍにおける試料液の吸光度を測定した。結果の統計解析には、統計解析ソフト（Ｓｔａｔｖｉｅｗ５．０、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）を使用した。

（ＯＰＡ法の結果）
図３は、Ｃ０の吸光度に対するＣ１２及びＣ２４の吸光度の相対値を示す。Ｃ１２及びＣ２４は、解凍直後に再凍結したワムシの試料の４倍以上の値であった。Ｃ０とＣ１２との間、Ｃ０とＣ２４との間で多重比較検定を行ったところ有意な差が認められた（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ、ｎ＝３、ＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤ法）。

以上、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＯＰＡ法の結果から、解凍処理したワムシではタンパク質が分解されているため、解凍処理したワムシはウナギ等の仔魚の咽頭部及び消化管を通過すると考えられる。

（ガスクロマトグラフィーによる解凍処理したワムシの脂肪酸分析）
解凍から再凍結までの静置時間の長さによって解凍処理したワムシ中の脂肪酸組成及び脂質量に変化があるか調べた。各試料１ｇを凍結乾燥器（ＦＤＵ−１２００型、東京理科器械社製）で２４時間凍結乾燥し、乾燥重量で約０．１ｇの乾燥試料を得た。脂質の抽出は、次のようにＦｏｌｃｈらの方法で行った。クロロホルム−メタノール混合液（２：１）を乾燥試料に２０ｍＬ加え、１０分以上静置し、１分間ホモジナイザー（ＶＨ１０、アズワン社製）で破砕した。ホモジナイザーに付着した脂質を１０ｍＬのクロロホルム−メタノール混合液（２：１）で回収した後にガラス繊維濾紙（ＷｈａｔｍａｎＮｏ．１、ＧＥヘルスケア社製）でろ過し、１００ｍＬ容ナスフラスコに溶液を移した。３５℃に設定した恒温水槽（ＳＢ−１２００、東京理科器械社製）にナスフラスコを浸し、ロータリーエバポレーター（Ｎ−１１１０、東京理科器械社製）で蒸留した。

続いて、試料をデジケーター（ＭＤＡ−００６、アルバック機工社製）で真空乾燥した後に、クロロホルムを３０ｍＬ入れ、ガラス繊維濾紙で再びろ過し、１００ｍＬ容ナスフラスコに移した。これを蒸留し、デジケーターで真空乾燥した後に、総脂質（ＴＬ）含量を電子天秤（ＡＸ２２４、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）で測定した。測定後、３ｍＬのクロロホルム−メタノール混合液（１：１）を用いて、総脂質をバイアル瓶に回収した後に、−８０℃に設定した冷凍庫内に保存した。

試料から抽出した脂質をクロロホルム−メタノール混合液（１：１）に溶かし、ガラス試験管に移した。窒素ガスで溶媒を除去した後に、各脂質の基準となるＣ１９：０を１ｍｇ／ｍＬを含むクロロホルム０．５ｍＬに試料を再懸濁させた。懸濁液を試験管に移し５％塩化水素メタノール溶液１ｍＬに溶解させ、８０℃で３時間加熱してメチルエステル化した。加熱後、溶液を放冷し、イオン交換水５．５ｍＬとヘキサン１ｍＬを加え、遠心分離した（２０００ｒｐｍ、５分間）。ヘキサン層をパスツールピペットで回収後、ガスクロマトグラフ分析計（ＧＣ−２０１０、島津製作所製）で脂肪酸を分析した。ＧＣ用ワークステーションソフトウェア（ＧＣ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ、島津製作所製）で解析した。結果の統計解析には、統計解析ソフト（Ｓｔａｔｖｉｅｗ５．０、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）を使用した。

（脂肪酸分析の結果）
図４にワムシの乾燥重量１ｇあたりの脂肪酸の含量を示す。多重比較検定によれば、解凍から再凍結までの静置時間の違いで有意差はなかった。

ワムシの乾燥重量１ｇあたりの脂肪酸の種類ごとの含量を図５に示す。解凍から再凍結までの静置時間の違いで、含量が異なる脂肪酸も含量がほとんど変化しない脂肪酸もあった。

脂肪酸を、飽和脂肪酸、１価不飽和脂肪酸及び多価不飽和脂肪酸の３つのグループに分けた場合のワムシの乾燥重量１ｇあたりの含量を図６に示す。多重比較検定によれば、解凍から再凍結までの静置時間の違いで、有意差はなかった。よって、解凍から再凍結までの静置時間を長くしても栄養価の劣化は起こっていないことが示された。

（飼育実験１）
試験区として、Ｃ０を餌料として給餌するＣ０試験区、Ｃ１２を餌料として給餌するＣ１２試験区及びＣ２４を餌料として給餌するＣ２４試験区を設定した。各試験区に４Ｌ水槽（５９７９７５、神畑養魚社製）を用いた。飼育水としては、１００μｍ、２５μｍ及び１０μｍ目合いのカートリッジフィルターで目合いの大きい順にろ過した海水（約３３ｐｓｕ）を用いた。飼育水を強制循環式殺菌灯（ＵＶＦ−１０００、イワキ社製）で紫外線殺菌した後に、ガラス繊維濾紙（ＧＦ／Ｆ、ＧＥヘルスケア社製）を用いて吸引ろ過した。

チンアナゴ（Ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｇｅｒ ｈａｓｓｉ）の受精卵を、Ｃ０試験区に４２個、Ｃ１２試験区に３２個、Ｃ２４試験区に３０個収容した。水槽を、水温をヒーターで２６℃に調節したウォーターバス内に設置した。飼育水はセラミック製エアストーンで通気した（１３ｍｌ／分）。飼育は蛍光灯で照明した室内に設けた暗幕（遮光率９５％、ワイドスクリーンＢＫ２０１２、日本ワイドクロス社製）内で行った。飼育期間中は給餌を９時から１７時の間で２時間おきに０．０２ｇのＣ０、Ｃ１２又はＣ２４を給餌した。水質の悪化を防ぐために毎日水替えを行った。

各試験区で生残している個体数を毎日計数し、生存率を算出した。飼育試験の統計解析には、統計解析ソフトＪＭＰ（ＳＡＳ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）を使用した。

（飼育試験１の結果）
各試験区の生残率を図７に示す。Ｃ０試験区及びＣ１２試験区では、４日齢で生残率が０％であった。一方、Ｃ２４試験区では他の試験区に比べ開口した日以降の生残率が安定しており、５日齢までの生存を確認できた。生存時間分析の結果、Ｃ０試験区とＣ１２試験区との間、Ｃ０試験区とＣ２４試験区との間に有意差があったが、Ｃ１２試験区とＣ２４試験区との間では有意差がなかった（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法、ｐ＜０．０５）。

各試験区で最も長く生存した個体を実体顕微鏡（Ｃ−ＢＤ１１５、Ｎｉｋｏｎ社製）で撮像した画像を図８に示す。図８（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、Ｃ０試験区の３日齢の個体では、消化管内に内容物を確認できなかった。一方、図８（Ｃ）及び（Ｄ）に示すＣ１２試験区の３日齢の個体及び図８（Ｅ）及び（Ｆ）に示すＣ２４試験区の５日齢の個体では、消化管内に内容物を確認できた。

（飼育実験２）
イソクリシスを給餌し、解凍から再凍結までの時間を２４時間としたワムシと、Ｃ２４と、を重量比１：１で混合した餌料（ＣＩ２４）を給餌するＣＩ２４試験区を設定した。チンアナゴの受精卵を、ＣＩ２４試験区に４４個収容した。餌料を除いて、ＣＩ２４試験区のその他の条件はＣ０試験区と同じである。ＣＩ２４試験区で生残している個体数を毎日計数し、飼育実験１と同様に生存率を算出した。

ＣＩ２４試験区で飼育したチンアナゴ仔魚を１００％ホルマリンで固定後、マイクロルーラー（ＭＲ−２、ケニス社製）を載せて、実体顕微鏡と一眼レフカメラ（Ｄ５２００、Ｎｉｋｏｎ社製）で撮影した。画像解析ソフトＩｍａｇｅ Ｊを用いた画像解析によりチンアナゴの頭長を測定した。

（飼育試験２の結果）
飼育実験１の結果と合わせてＣＩ２４試験区の生残率を図９に示す。Ｃ２４試験区よりも、ＣＩ２４試験区の生残率は高く、１１日齢までの生存を確認できた。Ｃ０試験区とＣＩ２４試験区との間、Ｃ１２試験区とＣＩ２４試験区との間、及びＣ２４試験区とＣＩ２４試験区との間に有意差があった。（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法、ｐ＜０．０５）。ＥＰＡが豊富なキートセロスを与えたワムシとＤＨＡが豊富なイソクリシスを与えたワムシとを解凍処理して混合した餌料によって、チンアナゴ仔魚にとって必要な栄養素が補填され生残率が向上し、生残日数が伸びたと考えられる。

Ｃ２４試験区及びＣＩ２４試験区で最も長く生存した個体を実体顕微鏡で撮像した画像をそれぞれ図１０（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図１０（Ｂ）に示すＣＩ２４試験区の１１日齢の個体は、図１０（Ａ）に示すＣ２４試験区の５日齢の個体と比べて体長が長く、頭部の発達が確認できた。

ＣＩ２４試験区の３日齢の個体の頭長の平均値は８．７±１．１ｍｍであった。一方、ＣＩ２４試験区の１１日齢の１２．３±０．９ｍｍであった。３日齢と１１日齢との間で有意差があった（ｎ＝３、ｔ検定、ｐ＜０．０５）。３日齢よりも１１日齢の頭長の方が長かったことから、キートセロスを与えたワムシとイソクリシスを与えたワムシとを解凍処理して混合した餌料を摂取して成長していることが確認された。

上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

本発明は、デトリタス食性水棲動物の養殖に好適である。

Claims (6)

1. 海産ツボワムシ類を冷凍する冷凍ステップと、
   前記海産ツボワムシ類を解凍する解凍ステップと、
   を含む、水棲動物用餌料の製造方法。
2. 前記解凍ステップでは、
   解凍した前記海産ツボワムシ類を常温下に１５〜３０時間置く、
   請求項１に記載の水棲動物用餌料の製造方法。
3. 前記解凍ステップの後に、前記海産ツボワムシ類を冷凍する再冷凍ステップをさらに含む、
   請求項１又は２に記載の水棲動物用餌料の製造方法。
4. 前記海産ツボワムシ類は、
   第１の微細藻類を給餌されて培養された第１の海産ツボワムシ類及び前記第１の微細藻類とは異なる第２の微細藻類を給餌されて培養された第２の海産ツボワムシ類である、
   請求項１から３のいずれか一項に記載の水棲動物用餌料の製造方法。
5. 前記第１の微細藻類及び前記第２の微細藻類は、
   クリプト藻類、ハプト藻類及び珪藻類からなる群からそれぞれ選択される、
   請求項４に記載の水棲動物用餌料の製造方法。
6. 前記第１の微細藻類は、
   Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｓｐ．であって、
   前記第２の微細藻類は、
   Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎｓである、
   請求項４に記載の水棲動物用餌料の製造方法。