JP2019017394A - 人口多能性幹細胞(ipsc)由来の網膜色素上皮(rpe)細胞を生成するための方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】人工多能性幹細胞(iPSC)から網膜色素上皮細胞を作製するための高効率の方法を提供すること。【解決手段】iPSCは、網膜色素上皮(RPE)細胞、例えば、胎児RPE幹細胞を含む体細胞から作製される。いくつかの実施形態において、iPSCは、マーカーに作動可能に連結されたチロシナーゼプロモーターを含む。処置などのためにRPE細胞を使用するための方法が、開示される。RPEの分化に影響する作用物質をスクリーニングするための方法も開示される。【選択図】なし
Description
本出願は、2013年2月1日に出願された米国特許出願第61/759,988号の利益を請求し、その全体が参照により本明細書中に援用される。
本開示の分野
本開示は、網膜色素上皮(RPE)細胞の分野、詳細には、幹細胞からRPE細胞を作製するための方法に関する。
本開示は、網膜色素上皮(RPE)細胞の分野、詳細には、幹細胞からRPE細胞を作製するための方法に関する。
背景
網膜は、脊椎動物の眼の内側表面に位置する特殊化された感光性の神経組織の層である。角膜、水晶体および硝子体液を通過した後に網膜に到達した光は、神経インパルスの引き金を引く化学的事象および電気的事象に変換される。光をこれらの生物学的プロセスに変換するためのプロセスである伝達に関与する細胞は、光受容細胞と呼ばれる特殊化されたニューロンである。
網膜は、脊椎動物の眼の内側表面に位置する特殊化された感光性の神経組織の層である。角膜、水晶体および硝子体液を通過した後に網膜に到達した光は、神経インパルスの引き金を引く化学的事象および電気的事象に変換される。光をこれらの生物学的プロセスに変換するためのプロセスである伝達に関与する細胞は、光受容細胞と呼ばれる特殊化されたニューロンである。
網膜色素上皮(RPE)は、神経網膜と脈絡膜を隔てる、哺乳動物の眼の中の六角形の細胞が高密度に詰まった極性のある単層である。RPEにおける細胞は、色素顆粒を含む細胞であり、血液網膜関門を形成すること、および水晶体によって収束された網膜上の光エネルギーを吸収することによって光受容体と密接に相互作用して視覚機能を維持することによって、網膜の生理機能において重要な役割を果たす。これらの細胞はまた、網膜下腔から血液にイオン、水および代謝最終産物を輸送し、栄養分(例えば、グルコース、レチノールおよび脂肪酸)を血液から取り込み、これらの栄養分を光受容体に送達する。
RPE細胞は、レチナールの視覚サイクルの一部でもある:光受容体は、光子吸収後に形成されるオールトランス−レチナールを11−シス−レチナールに再度異性化して戻すことができないので、レチナールは、RPEに輸送されて、そこで11−シス−レチナールに再度異性化され、光受容体に輸送し返される。
多くの眼疾患(例えば、(加齢)黄斑変性、黄斑ジストロフィー、例えば、シュタルガルト病およびシュタルガルト様疾患、ベスト病(卵黄様黄斑ジストロフィー)ならびに成人卵黄様ジストロフィーまたは網膜色素変性症のサブタイプ)は、網膜自体またはRPEの退化または劣化に関連する。光受容体のレスキューおよび視覚機能の保存は、RPE細胞の網膜下移植によって達成され得ることが、動物モデルにおいて実証された(Coffeyら、Nat.Neurosci.2002:5,53−56;Linら、Curr.Eye Res.1996:15,1069−1077;Littleら、Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.1996:37,204−211;Sauveら、Neuroscience 2002:114,389−401)。網膜変性疾患および網膜傷害の処置のために使用され得るRPE細胞をヒト幹細胞などから作製する方法を見出す必要がある。
Coffeyら、Nat.Neurosci.2002:5,53−56;Linら、Curr.Eye Res.1996:15,1069−1077
Littleら、Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.1996:37,204−211
Sauveら、Neuroscience 2002:114,389−401
開示の要旨
人工多能性幹細胞(iPSC)から網膜色素上皮細胞を作製するための高効率の方法が、本明細書中に開示される。iPSCは、胎児網膜色素上皮幹細胞などの網膜色素上皮細胞を含む体細胞から作製される。
人工多能性幹細胞(iPSC)から網膜色素上皮細胞を作製するための高効率の方法が、本明細書中に開示される。iPSCは、胎児網膜色素上皮幹細胞などの網膜色素上皮細胞を含む体細胞から作製される。
いくつかの実施形態において、ヒト網膜色素上皮細胞を作製するための方法は、ヒト人工多能性幹細胞から胚様体を作製する工程を含む。その胚様体は、2つのWnt経路阻害剤および1つのNodal経路阻害剤を含む第1の培地中で培養される。その胚様体は、第2の培地中の組織培養基材上にプレーティングされる。ある特定の実施形態において、第2の培地は、(a)塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を含まず、(b)塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)阻害剤、2つのWnt経路阻害剤および1つのNodal経路阻害剤を含み;(c)約20〜約90ngのNogginを含み;かつ(d)約1〜約3%のノックアウト血清代替物を含むことにより、分化中の網膜色素上皮細胞が形成される。次いで、分化中の網膜色素上皮細胞は、ACTIVAN AおよびWNT3aを含む第3の培地中で培養される。次いで、それらの細胞は、約5%胎児血清、カノニカルWNT阻害剤、非カノニカルWNT誘導物質ならびにSonic経路およびFGF経路の阻害剤を含む網膜色素上皮細胞(RPE)培地中で培養されることにより、ヒト網膜色素上皮細胞が作製される。
追加の実施形態において、RPE細胞を検出するためまたは細胞がRPE細胞であることを確かめるための方法が、開示される。なおも他の実施形態において、試験物質がiPSCからのRPE細胞の作製に影響するかを判定するための方法が、開示される。さらなる実施形態において、遺伝子発現を増加させ、治療薬として使用され得る試験物質を同定する方法が、提供される。なおも他の実施形態において、タンパク毒性傷害(proteotoxic insult)またはストレスに応答してRPEの生存を増加させる試験物質を同定する方法が、提供される。
本発明の前述および他の特徴および利点は、添付の図面を参照して進められるいくつかの実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるだろう。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
ヒト網膜色素上皮細胞を作製するための方法であって、該方法は、
ヒト人工多能性幹細胞から胚様体を作製する工程;
2つのWnt経路阻害剤および1つのNodal経路阻害剤を含む第1の培地中で該胚様体を培養する工程;
(a)ベータ線維芽細胞成長因子(bFGF)を含まず、(b)塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)阻害剤、該2つのWnt経路阻害剤および該1つのNodal経路阻害剤を含み;(c)約20〜約90ngのNogginを含み;かつ(d)約1〜約3%のノックアウト血清代替物を含む第2の培地中の、マトリゲルがコーティングされた組織培養基材上に該胚様体をプレーティングすることにより、分化中の網膜色素上皮細胞を形成する工程;
ACTIVAN AおよびWNT3aを含む第3の培地中で該分化中の網膜色素上皮細胞を培養する工程;
次いで、約5%の胎児血清、カノニカルWNT阻害剤、非カノニカルWNT誘導物質ならびにSonic経路およびFGF経路の阻害剤を含む網膜色素上皮(RPE)細胞培地中で該細胞を培養する工程
を含み、それにより、ヒト網膜色素上皮細胞を作製する、方法。
(項目2)
前記Wnt経路阻害剤のうちの1つが、N−(2−アミノエチル)−5−クロロイソキノリン−8−スルホンアミド(CK1−7)、3,5,7,8−テトラヒドロ−2−[4−(トリフルオロメチル)フェニル]−4H−チオピラノ[4,3−d]ピリミジン−4−オン(XAV939)、分泌フリズルド関連タンパク質(SFRP)1、SFRP−2、SFRP−3、SFRP−4またはSFRP−5である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記第1の培地が、約3.5〜約9mMのCK1−7を含む、項目1または項目2に記載の方法。
(項目4)
前記Nodal経路阻害剤が、4−(5−ベンゾール[1,3]ジオキソール−5−イル−4−ピリジン−2−イル−1H−イミダゾール−2−イル)−ベンズアミド水和物、4−[4−(1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−5−(2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−2−イル]−ベンズアミド水和物、4−[4−(3,4−メチレンジオキシフェニル)−5−(2−ピリジル)−1H−イミダゾール−2−イル]−ベンズアミド水和物(SB−431542)、左右決定因子(Lefty)または2−(5−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル−2−tert−ブチル−3H−イミダゾール−4−イル)−6−メチルピリジン塩酸塩水和物(SB−505124)である、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記第1の培地が、約3.5〜約9mMのSB43152を含む、項目1または項目4に記載の方法。
(項目6)
前記第1の培地が、血清の非存在下においてダルベッコ改変イーグル培地およびF12を約1:1の比で含む網膜細胞誘導培地である、項目1〜5のいずれか1項に記載の方法。
(項目7)
bFGFの前記阻害剤が、N−[(2R)−2,3−ジヒドロキシプロポキシ]−3,4−ジフルオロ−2−[(2−フルオロ−4−ヨードフェニル)アミノ]−ベンズアミド(PD0325901)、N−[2−[[4−(ジエチルアミノ)ブチル]アミノ−6−(3,5−ジメトキシフェニル)ピリド[2,3−d]ピリミジン−7−イル]−N’−(1,1−ジメチルエチル)尿素(PD173074)、2−(2−アミノ−3−メトキシフェニル)−4H−1−ベンゾピラン−4−オン(PD98059)、1−tert−ブチル−3−[6−(2,6−ジクロロフェニル)−2−[[4−(ジエチルアミノ)ブチル]アミノ]ピリド[2,3−d]ピリミジン−7−イル]尿素(PD161570)または6−(2,6−ジクロロフェニル)−2−[[4−[2−(ジエチルアミノ)エトキシ]フェニル]アミノ]−8−メチル−ピリド[2,3−d]ピリミジン−7(8H)−オン二塩酸塩水和物(PD166285)を含む、項目1〜5のいずれか1項に記載の方法。
(項目8)
前記第2の培地が、約0.5〜約2mMのPD0325901を含む、項目1〜7のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
前記第1の培地が、約50ng/mlのDickkopf関連タンパク質1(DKK1)を含む、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記第2の培地が、約3.5〜約9mMのCK1−7および約3.5〜約9mMのSB431542を含む、項目1〜7のいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
前記第3の培地が、約100〜約200ng/mlのACTIVIN Aを含む、項目1〜10のいずれか1項に記載の方法。
(項目12)
前記第3の培地が、約75〜150ng/mlのWnt3aを含む、項目1〜11のいずれか1項に記載の方法。
(項目13)
前記カノニカルWnt阻害剤が、Dickkopf関連タンパク質1(DKK1)である、項目1〜12のいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
前記第3の培地が、約75〜約150ng/mlのDKK1を含む、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記非カノニカルWnt誘導物質が、WNT5aである、項目1〜14のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
前記第4の培地が、約75〜約150ng/mlのWNT5a、75〜約150ng/mlのDKK1、約5μMシクロパミンおよび/または約10μMのSU5402を含む、項目1〜15のいずれか1項に記載の方法。
(項目17)
工程(a)が、約1.5%ノックアウト血清代替物の存在下において前記細胞を培養する工程を含む、項目1〜15のいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
前記基材が、トランスウェルである、項目1〜17のいずれか1項に記載の方法。
(項目19)
ヒト胎児網膜色素上皮細胞においてOCT4、SOX2、LIN28およびNanogを発現させることにより、前記ヒト人工多能性幹細胞を作製する工程を含む、項目1〜18のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
前記ヒト人工多能性幹細胞が、網膜色素上皮細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されたマーカーをコードする核酸を含む、項目1〜19のいずれか1項に記載の方法。
(項目21)
前記網膜特異的プロモーターが、チロシナーゼプロモーターである、項目20に記載の方法。
(項目22)
目的の作用物質が、網膜色素上皮細胞の分化を増加させるかを判定するための方法であって、該方法は、
網膜色素上皮細胞特異的プロモーターに作動可能に連結された第1のマーカーをコードする核酸を含み、かつ構成的プロモーターに作動可能に連結された第2のマーカーを含む、ヒト人工多能性幹細胞から作製された胚様体を、2つのWnt経路阻害剤および1つのNodal経路阻害剤を含む第1の培地中で培養する工程;
(a)ベータ線維芽細胞成長因子(bFGF)を含まず、(b)塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)阻害剤、該2つのWnt経路阻害剤および該1つのNodal経路阻害剤を含み;かつ(c)約20〜約90ngのNogginを含む第2の培地中の組織培養基材上に該胚様体をプレーティングすることにより、分化中の網膜色素上皮細胞を形成する工程;
ACTIVAN AおよびWNT3aを含む第3の培地中で該分化中の網膜色素上皮細胞を培養する工程;
約5%胎児血清、カノニカルWNT阻害剤、非カノニカルWNT誘導物質ならびにSonic経路およびFGF経路の阻害剤を含む第4の網膜色素上皮細胞(RPE)培地中で、該目的の作用物質の存在下において該細胞を培養し;それにより、ヒト網膜色素上皮細胞を作製する工程;および
該網膜色素上皮細胞における該第1のマーカーの発現を該第2のマーカーの発現と比べて評価する工程
を含み、ここで、該第2のマーカーと比較したときの該第1のマーカーの発現の増加は、該作用物質が、網膜色素上皮細胞の分化を増加させることを示す、方法。
(項目23)
目的の細胞が網膜色素上皮細胞であることを立証するための方法であって、該方法は、該目的の細胞における、MITF(NM_000248)、PAX6(NM_000280)、LHX2(NM_004789)、TFEC(NM_012252)、CDH1(NM_004360)、CDH3(NM_001793)、CLDN10(NM_182848)、CLDN16(NM_006580)、CLDN19(NM_148960)、BEST1(NM_004183)、TIMP3(NM_000362)、TRPM1(NM_002420)、TRPM3(NM_020952)、TTR(NM_000371)、VEGFA(NM_003376)、CSPG5(NM_006574)、DCT(NM_001922)、TYRP1(NM_000550)、TYR(NM_000372)、SILV(NM_006928)、SIL1(NM_022464)、MLANA(NM_005511)、RAB27A(NM_183236)、OCA2(NM_000275)、GPR143(NM_000273)、GPNMB(NM_002510)、MYO6(NM_004999)、MYRIP(NM_015460)、RPE65(NM_000329)、RBP1(NM_002899)、RBP4(NM_006744)、RDH5(NM_002905)、RDH11(NM_016026)、RLBP1(NM_000326)、MERTK(NM_006343)、ALDH1A3(NM_000693)、FBLN1(NM_001996)、SLC16A1(NM_003051)、KCNV2(NM_133497)、KCNJ13(NM_002242)、CFTR(NM_000492)を含むマーカーセットの発現をアッセイする工程;該目的の細胞におけるmiR204およびmiR211の発現をアッセイする工程;
該目的の細胞の分極をアッセイする工程;
パッチクランプ法を用いて該細胞の静止電位をアッセイする工程;および
該細胞の流体輸送速度を評価する工程
を含み、ここで、MITF、PAX6、LHX2、TFEC、CDH1、CDH3、CLDN10、CLDN16、CLDN19、BEST1、TIMP3、TRPM1、TRPM3、TTR、VEGFA、CSPG5、DCT、TYRP1、TYR、SILV、SIL1、MLANA、RAB27A、OCA2、GPR143、GPNMB、MYO6、MYRIP、RPE65、RBP1、RBP4、RDH5、RDH11、RLBP1、MERTK、ALDH1A3、FBLN1、SLC16A1、KCNV2、KCNJ13、CFTRの発現、miR204およびmiR211の発現、約−50〜約−60mVの静止電位、ならびに約5〜約10μlcm−2h−1の流体輸送速度は、該細胞が、網膜色素上皮細胞であることを示す、方法。
(項目24)
前記目的の細胞における、MITF、PAX6、LHX2、TFEC、CDH1、CDH3、CLDN10、CLDN16、CLDN19、BEST1、TIMP3、TRPM1、TRPM3、TTR、VEGFA、CSPG5、DCT、TYRP1、TYR、SILV、SIL1、MLANA、RAB27A、OCA2、GPR143、GPNMB、MYO6、MYRIP、RPE65、RBP1、RBP4、RDH5、RDH11、RLBP1、MERTK、ALDH1A3、FBLN1、SLC16A1、KCNV2、KCNJ13、CFTRの発現をアッセイする工程;
該目的の細胞におけるmiR204およびmiR211の発現をアッセイする工程;
該目的の細胞の分極をアッセイする工程;
パッチクランプ法を用いて該細胞の静止電位をアッセイする工程、および;
該細胞の流体輸送速度を評価する工程
をさらに含み、ここで、MITF、PAX6、LHX2、TFEC、CDH1、CDH3、CLDN10、CLDN16、CLDN19、BEST1、TIMP3、TRPM1、TRPM3、TTR、VEGFA、CSPG5、DCT、TYRP1、TYR、SILV、SIL1、MLANA、RAB27A、OCA2、GPR143、GPNMB、MYO6、MYRIP、RPE65、RBP1、RBP4、RDH5、RDH11、RLBP1、MERTK、ALDH1A3、FBLN1、SLC16A1、KCNV2、KCNJ13、CFTRの発現、miR204およびmiR211の発現、約−50〜約−60mVの静止電位ならびに約5〜約10μlcm−2h−1の流体輸送速度は、該細胞が、網膜色素上皮細胞であることを示す、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記胚様体が、前記第1の培地中で約48時間培養される、項目1〜21のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
前記胚様体が、前記第2の培地中で約18〜約24日間培養される、項目1〜21または25のいずれか1項に記載の方法。
(項目27)
前記胚様体が、前記第2の培地中で約3週間培養される、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記分化中の網膜色素上皮細胞が、前記第3の培地中で約18〜約24日間、項目1〜21または25〜27のいずれか1項に記載の方法。
(項目29)
前記分化中の網膜色素上皮細胞が、前記第3の培地中で約3週間、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記細胞が、前記網膜色素上皮細胞(RPE)培地中で約12〜約16日間培養される、項目1〜21または25〜29のいずれか1項に記載の方法。
(項目31)
前記細胞が、前記網膜色素上皮細胞(RPE)培地中で約2週間培養される、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記網膜色素上皮細胞を、約5%胎児血清を含む網膜色素上皮細胞(RPE)培地中で維持する工程をさらに含む、項目1〜21または25〜33のいずれか1項に記載の方法。
(項目33)
前記細胞が、約5%胎児血清を含む網膜色素上皮細胞(RPE)培地中で前記網膜色素上皮細胞を約6〜約8週間維持する工程を含む、項目32に記載の方法。
(項目34)
発現をアッセイする工程が、マルチプレックスアッセイの使用を含む、項目23または24に記載の方法。
(項目35)
項目1〜21または25〜34のいずれか1項に記載の方法によって作製された網膜色素上皮細胞。
(項目36)
前記細胞が、ヒト細胞である、項目35に記載の網膜色素上皮細胞。
(項目37)
有効量の項目35または項目36に記載の網膜色素上皮細胞を含む薬学的組成物。
(項目38)
医薬を製造するための、項目37に記載の組成物。
(項目39)
網膜変性疾患、網膜機能不全、網膜退化、網膜損傷または網膜色素上皮の喪失を有する被験体を処置する方法であって、該方法は、治療有効量の項目37に記載の薬学的組成物を該被験体に投与し、それにより、該被験体を処置する工程を含む、方法。
(項目40)
前記網膜変性疾患が、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、緑内障、糖尿病性網膜症、レーバー先天性黒内障、後天性黄斑変性、遺伝性(heriditary)黄斑変性、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮、コロイデレミア、パターンジストロフィーである、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記網膜損傷が、レーザー傷害、炎症性傷害、感染性傷害、放射線傷害、新生血管傷害または外傷性傷害によって引き起こされる、項目39に記載の方法。
(項目42)
前記網膜色素上皮細胞が、眼の網膜下腔、硝子体腔、網膜の内側もしくは外側、網膜周辺部または脈絡膜内に導入される、項目39〜41のいずれか1項に記載の方法。
(項目43)
前記網膜色素上皮細胞が、細胞懸濁物の形態で標的部位に導入される、項目39〜42のいずれか1項に記載の方法。
(項目44)
前記網膜色素上皮細胞が、細胞外マトリックス上に接着されている、項目39〜42のいずれか1項に記載の方法。
(項目45)
前記網膜色素上皮細胞が、生分解性ポリマーなどの基材上に提供されている、項目39〜42のいずれか1項に記載の方法。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
ヒト網膜色素上皮細胞を作製するための方法であって、該方法は、
ヒト人工多能性幹細胞から胚様体を作製する工程;
2つのWnt経路阻害剤および1つのNodal経路阻害剤を含む第1の培地中で該胚様体を培養する工程;
(a)ベータ線維芽細胞成長因子(bFGF)を含まず、(b)塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)阻害剤、該2つのWnt経路阻害剤および該1つのNodal経路阻害剤を含み;(c)約20〜約90ngのNogginを含み;かつ(d)約1〜約3%のノックアウト血清代替物を含む第2の培地中の、マトリゲルがコーティングされた組織培養基材上に該胚様体をプレーティングすることにより、分化中の網膜色素上皮細胞を形成する工程;
ACTIVAN AおよびWNT3aを含む第3の培地中で該分化中の網膜色素上皮細胞を培養する工程;
次いで、約5%の胎児血清、カノニカルWNT阻害剤、非カノニカルWNT誘導物質ならびにSonic経路およびFGF経路の阻害剤を含む網膜色素上皮(RPE)細胞培地中で該細胞を培養する工程
を含み、それにより、ヒト網膜色素上皮細胞を作製する、方法。
(項目2)
前記Wnt経路阻害剤のうちの1つが、N−(2−アミノエチル)−5−クロロイソキノリン−8−スルホンアミド(CK1−7)、3,5,7,8−テトラヒドロ−2−[4−(トリフルオロメチル)フェニル]−4H−チオピラノ[4,3−d]ピリミジン−4−オン(XAV939)、分泌フリズルド関連タンパク質(SFRP)1、SFRP−2、SFRP−3、SFRP−4またはSFRP−5である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記第1の培地が、約3.5〜約9mMのCK1−7を含む、項目1または項目2に記載の方法。
(項目4)
前記Nodal経路阻害剤が、4−(5−ベンゾール[1,3]ジオキソール−5−イル−4−ピリジン−2−イル−1H−イミダゾール−2−イル)−ベンズアミド水和物、4−[4−(1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−5−(2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−2−イル]−ベンズアミド水和物、4−[4−(3,4−メチレンジオキシフェニル)−5−(2−ピリジル)−1H−イミダゾール−2−イル]−ベンズアミド水和物(SB−431542)、左右決定因子(Lefty)または2−(5−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル−2−tert−ブチル−3H−イミダゾール−4−イル)−6−メチルピリジン塩酸塩水和物(SB−505124)である、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記第1の培地が、約3.5〜約9mMのSB43152を含む、項目1または項目4に記載の方法。
(項目6)
前記第1の培地が、血清の非存在下においてダルベッコ改変イーグル培地およびF12を約1:1の比で含む網膜細胞誘導培地である、項目1〜5のいずれか1項に記載の方法。
(項目7)
bFGFの前記阻害剤が、N−[(2R)−2,3−ジヒドロキシプロポキシ]−3,4−ジフルオロ−2−[(2−フルオロ−4−ヨードフェニル)アミノ]−ベンズアミド(PD0325901)、N−[2−[[4−(ジエチルアミノ)ブチル]アミノ−6−(3,5−ジメトキシフェニル)ピリド[2,3−d]ピリミジン−7−イル]−N’−(1,1−ジメチルエチル)尿素(PD173074)、2−(2−アミノ−3−メトキシフェニル)−4H−1−ベンゾピラン−4−オン(PD98059)、1−tert−ブチル−3−[6−(2,6−ジクロロフェニル)−2−[[4−(ジエチルアミノ)ブチル]アミノ]ピリド[2,3−d]ピリミジン−7−イル]尿素(PD161570)または6−(2,6−ジクロロフェニル)−2−[[4−[2−(ジエチルアミノ)エトキシ]フェニル]アミノ]−8−メチル−ピリド[2,3−d]ピリミジン−7(8H)−オン二塩酸塩水和物(PD166285)を含む、項目1〜5のいずれか1項に記載の方法。
(項目8)
前記第2の培地が、約0.5〜約2mMのPD0325901を含む、項目1〜7のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
前記第1の培地が、約50ng/mlのDickkopf関連タンパク質1(DKK1)を含む、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記第2の培地が、約3.5〜約9mMのCK1−7および約3.5〜約9mMのSB431542を含む、項目1〜7のいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
前記第3の培地が、約100〜約200ng/mlのACTIVIN Aを含む、項目1〜10のいずれか1項に記載の方法。
(項目12)
前記第3の培地が、約75〜150ng/mlのWnt3aを含む、項目1〜11のいずれか1項に記載の方法。
(項目13)
前記カノニカルWnt阻害剤が、Dickkopf関連タンパク質1(DKK1)である、項目1〜12のいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
前記第3の培地が、約75〜約150ng/mlのDKK1を含む、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記非カノニカルWnt誘導物質が、WNT5aである、項目1〜14のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
前記第4の培地が、約75〜約150ng/mlのWNT5a、75〜約150ng/mlのDKK1、約5μMシクロパミンおよび/または約10μMのSU5402を含む、項目1〜15のいずれか1項に記載の方法。
(項目17)
工程(a)が、約1.5%ノックアウト血清代替物の存在下において前記細胞を培養する工程を含む、項目1〜15のいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
前記基材が、トランスウェルである、項目1〜17のいずれか1項に記載の方法。
(項目19)
ヒト胎児網膜色素上皮細胞においてOCT4、SOX2、LIN28およびNanogを発現させることにより、前記ヒト人工多能性幹細胞を作製する工程を含む、項目1〜18のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
前記ヒト人工多能性幹細胞が、網膜色素上皮細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されたマーカーをコードする核酸を含む、項目1〜19のいずれか1項に記載の方法。
(項目21)
前記網膜特異的プロモーターが、チロシナーゼプロモーターである、項目20に記載の方法。
(項目22)
目的の作用物質が、網膜色素上皮細胞の分化を増加させるかを判定するための方法であって、該方法は、
網膜色素上皮細胞特異的プロモーターに作動可能に連結された第1のマーカーをコードする核酸を含み、かつ構成的プロモーターに作動可能に連結された第2のマーカーを含む、ヒト人工多能性幹細胞から作製された胚様体を、2つのWnt経路阻害剤および1つのNodal経路阻害剤を含む第1の培地中で培養する工程;
(a)ベータ線維芽細胞成長因子(bFGF)を含まず、(b)塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)阻害剤、該2つのWnt経路阻害剤および該1つのNodal経路阻害剤を含み;かつ(c)約20〜約90ngのNogginを含む第2の培地中の組織培養基材上に該胚様体をプレーティングすることにより、分化中の網膜色素上皮細胞を形成する工程;
ACTIVAN AおよびWNT3aを含む第3の培地中で該分化中の網膜色素上皮細胞を培養する工程;
約5%胎児血清、カノニカルWNT阻害剤、非カノニカルWNT誘導物質ならびにSonic経路およびFGF経路の阻害剤を含む第4の網膜色素上皮細胞(RPE)培地中で、該目的の作用物質の存在下において該細胞を培養し;それにより、ヒト網膜色素上皮細胞を作製する工程;および
該網膜色素上皮細胞における該第1のマーカーの発現を該第2のマーカーの発現と比べて評価する工程
を含み、ここで、該第2のマーカーと比較したときの該第1のマーカーの発現の増加は、該作用物質が、網膜色素上皮細胞の分化を増加させることを示す、方法。
(項目23)
目的の細胞が網膜色素上皮細胞であることを立証するための方法であって、該方法は、該目的の細胞における、MITF(NM_000248)、PAX6(NM_000280)、LHX2(NM_004789)、TFEC(NM_012252)、CDH1(NM_004360)、CDH3(NM_001793)、CLDN10(NM_182848)、CLDN16(NM_006580)、CLDN19(NM_148960)、BEST1(NM_004183)、TIMP3(NM_000362)、TRPM1(NM_002420)、TRPM3(NM_020952)、TTR(NM_000371)、VEGFA(NM_003376)、CSPG5(NM_006574)、DCT(NM_001922)、TYRP1(NM_000550)、TYR(NM_000372)、SILV(NM_006928)、SIL1(NM_022464)、MLANA(NM_005511)、RAB27A(NM_183236)、OCA2(NM_000275)、GPR143(NM_000273)、GPNMB(NM_002510)、MYO6(NM_004999)、MYRIP(NM_015460)、RPE65(NM_000329)、RBP1(NM_002899)、RBP4(NM_006744)、RDH5(NM_002905)、RDH11(NM_016026)、RLBP1(NM_000326)、MERTK(NM_006343)、ALDH1A3(NM_000693)、FBLN1(NM_001996)、SLC16A1(NM_003051)、KCNV2(NM_133497)、KCNJ13(NM_002242)、CFTR(NM_000492)を含むマーカーセットの発現をアッセイする工程;該目的の細胞におけるmiR204およびmiR211の発現をアッセイする工程;
該目的の細胞の分極をアッセイする工程;
パッチクランプ法を用いて該細胞の静止電位をアッセイする工程;および
該細胞の流体輸送速度を評価する工程
を含み、ここで、MITF、PAX6、LHX2、TFEC、CDH1、CDH3、CLDN10、CLDN16、CLDN19、BEST1、TIMP3、TRPM1、TRPM3、TTR、VEGFA、CSPG5、DCT、TYRP1、TYR、SILV、SIL1、MLANA、RAB27A、OCA2、GPR143、GPNMB、MYO6、MYRIP、RPE65、RBP1、RBP4、RDH5、RDH11、RLBP1、MERTK、ALDH1A3、FBLN1、SLC16A1、KCNV2、KCNJ13、CFTRの発現、miR204およびmiR211の発現、約−50〜約−60mVの静止電位、ならびに約5〜約10μlcm−2h−1の流体輸送速度は、該細胞が、網膜色素上皮細胞であることを示す、方法。
(項目24)
前記目的の細胞における、MITF、PAX6、LHX2、TFEC、CDH1、CDH3、CLDN10、CLDN16、CLDN19、BEST1、TIMP3、TRPM1、TRPM3、TTR、VEGFA、CSPG5、DCT、TYRP1、TYR、SILV、SIL1、MLANA、RAB27A、OCA2、GPR143、GPNMB、MYO6、MYRIP、RPE65、RBP1、RBP4、RDH5、RDH11、RLBP1、MERTK、ALDH1A3、FBLN1、SLC16A1、KCNV2、KCNJ13、CFTRの発現をアッセイする工程;
該目的の細胞におけるmiR204およびmiR211の発現をアッセイする工程;
該目的の細胞の分極をアッセイする工程;
パッチクランプ法を用いて該細胞の静止電位をアッセイする工程、および;
該細胞の流体輸送速度を評価する工程
をさらに含み、ここで、MITF、PAX6、LHX2、TFEC、CDH1、CDH3、CLDN10、CLDN16、CLDN19、BEST1、TIMP3、TRPM1、TRPM3、TTR、VEGFA、CSPG5、DCT、TYRP1、TYR、SILV、SIL1、MLANA、RAB27A、OCA2、GPR143、GPNMB、MYO6、MYRIP、RPE65、RBP1、RBP4、RDH5、RDH11、RLBP1、MERTK、ALDH1A3、FBLN1、SLC16A1、KCNV2、KCNJ13、CFTRの発現、miR204およびmiR211の発現、約−50〜約−60mVの静止電位ならびに約5〜約10μlcm−2h−1の流体輸送速度は、該細胞が、網膜色素上皮細胞であることを示す、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記胚様体が、前記第1の培地中で約48時間培養される、項目1〜21のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
前記胚様体が、前記第2の培地中で約18〜約24日間培養される、項目1〜21または25のいずれか1項に記載の方法。
(項目27)
前記胚様体が、前記第2の培地中で約3週間培養される、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記分化中の網膜色素上皮細胞が、前記第3の培地中で約18〜約24日間、項目1〜21または25〜27のいずれか1項に記載の方法。
(項目29)
前記分化中の網膜色素上皮細胞が、前記第3の培地中で約3週間、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記細胞が、前記網膜色素上皮細胞(RPE)培地中で約12〜約16日間培養される、項目1〜21または25〜29のいずれか1項に記載の方法。
(項目31)
前記細胞が、前記網膜色素上皮細胞(RPE)培地中で約2週間培養される、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記網膜色素上皮細胞を、約5%胎児血清を含む網膜色素上皮細胞(RPE)培地中で維持する工程をさらに含む、項目1〜21または25〜33のいずれか1項に記載の方法。
(項目33)
前記細胞が、約5%胎児血清を含む網膜色素上皮細胞(RPE)培地中で前記網膜色素上皮細胞を約6〜約8週間維持する工程を含む、項目32に記載の方法。
(項目34)
発現をアッセイする工程が、マルチプレックスアッセイの使用を含む、項目23または24に記載の方法。
(項目35)
項目1〜21または25〜34のいずれか1項に記載の方法によって作製された網膜色素上皮細胞。
(項目36)
前記細胞が、ヒト細胞である、項目35に記載の網膜色素上皮細胞。
(項目37)
有効量の項目35または項目36に記載の網膜色素上皮細胞を含む薬学的組成物。
(項目38)
医薬を製造するための、項目37に記載の組成物。
(項目39)
網膜変性疾患、網膜機能不全、網膜退化、網膜損傷または網膜色素上皮の喪失を有する被験体を処置する方法であって、該方法は、治療有効量の項目37に記載の薬学的組成物を該被験体に投与し、それにより、該被験体を処置する工程を含む、方法。
(項目40)
前記網膜変性疾患が、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、緑内障、糖尿病性網膜症、レーバー先天性黒内障、後天性黄斑変性、遺伝性(heriditary)黄斑変性、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮、コロイデレミア、パターンジストロフィーである、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記網膜損傷が、レーザー傷害、炎症性傷害、感染性傷害、放射線傷害、新生血管傷害または外傷性傷害によって引き起こされる、項目39に記載の方法。
(項目42)
前記網膜色素上皮細胞が、眼の網膜下腔、硝子体腔、網膜の内側もしくは外側、網膜周辺部または脈絡膜内に導入される、項目39〜41のいずれか1項に記載の方法。
(項目43)
前記網膜色素上皮細胞が、細胞懸濁物の形態で標的部位に導入される、項目39〜42のいずれか1項に記載の方法。
(項目44)
前記網膜色素上皮細胞が、細胞外マトリックス上に接着されている、項目39〜42のいずれか1項に記載の方法。
(項目45)
前記網膜色素上皮細胞が、生分解性ポリマーなどの基材上に提供されている、項目39〜42のいずれか1項に記載の方法。
配列
核酸配列およびアミノ酸配列は、37C.F.R.1.822に定義されているように、ヌクレオチド塩基に対しては標準的な文字省略形、およびアミノ酸に対しては1文字または3文字コードを用いて示される。各核酸配列の一方の鎖だけが示されるが、表示されている鎖に対する任意の言及によって相補鎖も含められると理解される。
核酸配列およびアミノ酸配列は、37C.F.R.1.822に定義されているように、ヌクレオチド塩基に対しては標準的な文字省略形、およびアミノ酸に対しては1文字または3文字コードを用いて示される。各核酸配列の一方の鎖だけが示されるが、表示されている鎖に対する任意の言及によって相補鎖も含められると理解される。
配列番号1は、例示的なヒトチロシナーゼエンハンサーの核酸配列である。
配列番号2は、例示的なプロモーター配列である。
いくつかの実施形態の詳細な説明
いくつかの実施形態の詳細な説明
人工多能性幹細胞(iPSC)から網膜色素上皮細胞を作製するための高効率の方法が、本明細書中に開示される。それらのiPSCは、胎児網膜色素上皮幹細胞などの網膜色素上皮細胞を含む体細胞から作製される。いくつかの実施形態において、それらの細胞は、ヒトの細胞である。
本明細書中に開示される方法は、スクリーニングアッセイにおいて使用するための多数の分化したRPE細胞を作製するため、RPEの基礎生物学を研究するため、および治療薬として研究するために、使用される。それらのRPE細胞は、マーカーをコードする核酸に作動可能に連結されたチロシナーゼエンハンサーを含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される方法を用いて作製されたRPE細胞は、網膜変性疾患を処置するために製剤化および使用され得る。したがって、RPE細胞の実質的に精製された調製物を含むRPE細胞を含む組成物が、開示される。RPE細胞の増殖を調節する作用物質および/またはRPE細胞の分化を変化させる作用物質を同定するためのスクリーニングアッセイもまた、開示される。そのようなスクリーニングアッセイを用いて同定された作用物質は、インビトロまたはインビボで使用され得る。
用語
別段述べられない限り、専門用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学における通常の用語の定義は、Oxford University Pressにより出版された、Benjamin Lewin,Genes V,1994(ISBN0−19−854287−9);Blackwell Science Ltd.により出版された、Kendrewら(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,1994(ISBN0−632−02182−9);およびVCH Publishers,Inc.により出版された、Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,1995(ISBN1−56081−569−8)に見られることがある。
別段述べられない限り、専門用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学における通常の用語の定義は、Oxford University Pressにより出版された、Benjamin Lewin,Genes V,1994(ISBN0−19−854287−9);Blackwell Science Ltd.により出版された、Kendrewら(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,1994(ISBN0−632−02182−9);およびVCH Publishers,Inc.により出版された、Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,1995(ISBN1−56081−569−8)に見られることがある。
本開示の様々な実施形態の概説を容易にするために、特定の用語の以下の説明を提供する:
Activin:細胞の分化および増殖を含むいくつかの生物学的プロセスの制御に関与する、トランスフォーミング成長因子ベータ(TGF−ベータ)スーパーファミリーのメンバー。Activin Aは、膜貫通レセプターセリン/トレオニンキナーゼの複合体を介してその生物学的作用を媒介し、特定のActivin Aレセプターに結合する、このファミリーのメンバーである。それは、2つのサブユニットから構成される二量体である。Activin Aは、POUクラス5ホメオボックス1(Oct−3/4)、nanog、nodalおよびnodalシグナル伝達制御因子、左右決定因子1および2(Lefty−BおよびLefty−A)のような多能性のマーカーのSMAD依存性活性化転写を介して幹細胞維持の制御に関与する。Activin Aは、性腺刺激ホルモン放出ホルモンなどのいくつかのホルモンの転写も刺激する。Activin Aに対する例示的な配列は、GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_002192に提供されている。
作用物質:目的の任意のタンパク質、核酸分子(化学的に改変された核酸を含む)、化合物、小分子、有機化合物、無機化合物または他の分子。作用物質には、治療薬、診断薬または医薬品が含まれ得る。治療薬または医薬品は、単独でまたは追加の化合物とともに、所望の応答を誘導する(例えば、被験体に投与されたときに治療的または予防的な作用を誘導する)ものである。
アゴニストまたは誘導物質:細胞のレセプターまたはそのようなレセプターのリガンドに結合して、天然に存在する物質の作用を模倣することが多い、その細胞による応答の引き金を引く作用物質。1つの実施形態において、フリズルド(Frizzled)(Fzd)アゴニストは、Fzdレセプターに結合して、Wnt/ベータ−カテニンシグナル伝達経路を増強するかまたは亢進する。
変化する:有効量の目的の物質またはパラメータ(例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは細胞の特性)の変化。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたは酵素の活性の変化は、細胞の生理学的特性(例えば、細胞の分化、増殖または老化)に影響し得る。その物質の量は、生成される物質の量の差異、所望の機能を有する物質の量の差異またはその物質の活性化の差異によって、変化し得る。その変化は、増加または減少であり得る。その変化は、インビボまたはインビトロにおけるものであり得る。いくつかの実施形態において、変化は、物質の有効量(レベル)、細胞の増殖および/もしくは生存、または酵素などのタンパク質の活性の少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の増加または減少である。
増幅:核酸分子(例えば、DNAまたはRNA分子)の増幅とは、サンプル中の核酸分子のコピー数を増加させる手法の使用のことを指す。増幅の例は、プライマーとサンプル中の核酸鋳型とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下でオリゴヌクレオチドプライマー対とサンプルを接触させるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である。それらのプライマーは、好適な条件下で伸長され、鋳型から解離され、再度アニールされ、伸長され、解離されることにより、その核酸のコピー数が増幅する。増幅産物は、標準的な手法を使用する、電気泳動、制限エンドヌクレアーゼ切断パターン、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションもしくはライゲーションおよび/または核酸配列決定法によって特徴付けられ得る。
増幅の他の例としては、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)、米国特許第5,744,311号に開示されているような鎖置換増幅;米国特許第6,033,881号に開示されているような無転写等温増幅;PCT公開WO90/01069に開示されているような修復連鎖反応増幅;欧州特許公報EP−A−320,308に開示されているようなリガーゼ連鎖反応増幅;米国特許第5,427,930号に開示されているようなギャップ充填リガーゼ連鎖反応増幅;および米国特許第6,025,134号に開示されているようなNASBA RNA無転写増幅が挙げられる。
動物:例えば、哺乳動物および鳥類を含むカテゴリーである、生存している多細胞脊椎動物生物。哺乳動物という用語は、ヒトと非ヒト哺乳動物の両方を含む。同様に、用語「被験体」は、ヒト被験体と動物被験体の両方、例えば、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、ブタ、マウス、ラットおよびウシを含む。
アンタゴニストまたは阻害剤:レセプターまたはレセプターのリガンドに結合すると、生化学的応答または生物学的応答を阻止するかまたは減衰させる作用物質。アンタゴニストは、レセプター相互作用を介して、アゴニストによって誘導される応答を妨げることによって効果を媒介する。1つの実施形態において、フリズルド(Fzd)アンタゴニストは、FzdレセプターまたはFzdリガンド(例えば、Wnt)に結合して、Wnt/ベータ−カテニンシグナル伝達経路を阻害する。
抗体:抗原のエピトープを特異的に認識して、それに結合する、少なくとも軽鎖免疫グロブリン可変領域または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンド。抗体は、重鎖および軽鎖から構成され、その重鎖および軽鎖の各々は、可変重鎖(VH)領域および可変軽鎖(VL)領域と呼ばれる可変領域を有する。VH領域およびVL領域は、一体となって、抗体によって認識される抗原への結合に関与する。
抗体には、インタクトな免疫グロブリン、ならびに当該分野で周知の抗体のバリアントおよび部分(例えば、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab)’2フラグメント、一本鎖Fvタンパク質(「scFv」)およびジスルフィド安定化Fvタンパク質(「dsFv」))が含まれる。scFvタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域および免疫グロブリンの重鎖可変領域がリンカーによって結合された融合タンパク質であり、一方、dsFvでは、それらの鎖は、それらの鎖の会合を安定化させるジスルフィド結合を導入するように変異されている。この用語には、遺伝的に操作された形態(例えば、キメラ抗体(例えば、ヒト化マウス抗体)、ヘテロ結合体抗体(例えば、二重特異性抗体))も含まれる。Pierce Catalog and Handbook,1994−1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL);Kuby,J.,Immunology,3rd Ed.,W.H.Freeman & Co.,New York,1997も参照のこと。
代表的には、天然に存在する免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された、重(H)鎖および軽(L)鎖を有する。軽鎖には2つのタイプ、ラムダ(λ)およびカッパー(k)がある。抗体分子の機能活性を決定する主要な重鎖クラス(またはアイソタイプ)が5つ存在する:IgM、IgD、IgG、IgAおよびIgE。
分化:比較的特殊化されていない細胞(例えば、胚性幹細胞または他の幹細胞)が、成熟した細胞に特徴的な特殊化された構造的特徴および/または機能的特徴を獲得するプロセスのことを指す。同様に、「分化する」とは、このプロセスのことを指す。代表的には、分化している間、細胞構造は変化し、組織特異的タンパク質が出現する。
胚様体:多能性幹細胞の3次元凝集物。これらの細胞は、分化を起こして、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞になり得る。単層培養物とは対照的に、多能性幹細胞が凝集するときに形成される球状の構造のおかげで、バイオプロセスアプローチにとって有用な、懸濁物中でのEBの非接着性培養が可能になる。EB微小環境内での複雑な細胞接着の確立を含むこの3次元構造およびパラクリンシグナル伝達は、分化および形態形成を可能にする。
胚:それが雌に移植されたかは関係なく、接合体、または人工的に再プログラムされた核を有する活性化された卵母細胞の1回以上の分裂によって得られる細胞の塊。「桑実胚」は、通常、12〜32個の細胞(割球)から構成される、固形の塊になっている受精の3〜4日後の着床前胚である。「胚盤胞」とは、約30〜150個の細胞の、有胎盤哺乳動物における着床前胚のことを指す(マウスでは受精の約3日後、ヒトでは受精の約5日後)。胚盤胞期は、桑実胚期の後に続き、そのユニークな形態によって識別され得る。胚盤胞は、通常、細胞層(栄養外胚葉)、流体で満たされた空洞(胞胚腔または胚盤胞腔)および内側の細胞群(内部細胞塊,ICM)で構成された球である。未分化細胞からなるICMは、胚盤胞が子宮に移植された場合に胎児になる。
胚性幹細胞:必要に応じて細胞株として連続的に継代されている、胚盤胞または桑実胚の内部細胞塊に由来する胚性細胞。この用語には、好ましくは、胚の残りの部分を破壊せずに、その胚の1つ以上の割球から単離された細胞が含まれる。この用語には、体細胞核移植によって作製された細胞も含まれる。「ヒト胚性幹細胞」(hES細胞)は、必要に応じて細胞株として連続的に継代されている、ヒト胚盤胞または桑実胚の内部細胞塊に由来する胚性細胞を含む。hES細胞は、精子もしくはDNAと卵細胞の受精、核移植、単為生殖によって得られてもよいし、HLA領域がホモ接合であるhES細胞を作製する手段によって得られてもよい。ヒトES細胞は、精子と卵細胞との融合、核移植、単為生殖、またはクロマチンの再プログラムおよびその後の再プログラムされたクロマチンが原形質膜に組み込まれることによって作製された、接合体、割球または胚盤胞期の哺乳動物胚から作製されるかまたは得られることにより、胚性細胞が作製され得る。ヒト胚性幹細胞としては、MAO1、MAO9、ACT−4、No.3、H1、H7、H9、H14およびACT30胚性幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ヒト胚性幹細胞は、その起源またはそれらを作製するために使用される特定の方法に関係なく、(i)3つすべての胚葉の細胞に分化する能力、(ii)少なくともOct−4およびアルカリホスファターゼの発現、ならびに(iii)免疫無防備状態の動物に移植されたときに奇形腫をつくる能力に基づいて同定され得る。
拡大する(Expand):細胞培養物中の細胞の数または量が、細胞分裂に起因して増加するプロセス。同様に、用語「拡大」または「拡大される」とは、このプロセスのことを指す。用語「増殖する」、「増殖」または「増殖される」は、語「拡大する」、「拡大」または「拡大される」と交換可能に使用されてもよい。代表的には、拡大期の間は、細胞は、分化して、成熟した細胞を形成することなく、分裂して、より多くの細胞を形成する。
発現:ある遺伝子のコードされた情報が、細胞の、活動の(operational)、非活動の、または構造の一部に変換されるプロセス(例えば、タンパク質の合成)。遺伝子発現は、外部シグナルによって影響され得る。例えば、細胞がホルモンに曝露されると、ホルモン誘導性遺伝子の発現が刺激され得る。異なるタイプの細胞は、同一のシグナルに異なって応答し得る。遺伝子の発現はまた、DNAからRNAを経てタンパク質までの経路におけるいずれかの箇所で制御され得る。制御には、転写、翻訳、RNAの輸送およびプロセシング、mRNAなどの中間分子の分解に対する調節、または産生された後の特定のタンパク質分子の活性化、不活性化、区画化もしくは分解を介した調節が含まれ得る。
フィーダー層:幹細胞の増殖を補助するために使用され得る非増殖細胞(例えば、照射を受けた細胞)。フィーダー層を作製するためのプロトコルは、当該分野で公知であり、インターネット(例えば、American Type Culture Collection(ATCC)が保守しているNational Stem Cell Resourceのウェブサイト)上で入手可能である。
胎児(胎仔):誕生前の胎生期における発生中の哺乳動物。ヒトでは、出生前の発生の胎児期は、受精後9週目の初めから始まる。ヒトでは、眼およびRPEは、受胎から4週間後にはすでに形成されている。RPEは、その次の数週間にわたって成熟し続ける。
線維芽細胞成長因子(FGF):任意の動物に由来する任意の好適な線維芽細胞成長因子およびその機能的フラグメント(例えば、レセプターに結合して、そのレセプターの活性化に関連する生物学的作用を誘導するもの)。種々のFGFが公知であり、それらとしては、FGF−1(酸性線維芽細胞成長因子)、FGF−2(塩基性線維芽細胞成長因子、bFGF)、FGF−3(int−2)、FGF−4(hst/K−FGF)、FGF−5、FGF−6、FGF−7、FGF−8、FGF−9およびFGF−98が挙げられるが、これらに限定されない。「FGF」とは、線維芽細胞成長因子タンパク質(例えば、FGF−1、FGF−2、FGF−4、FGF−6、FGF−8、FGF−9またはFGF−98)またはその生物学的に活性なフラグメントもしくは変異体のことを指す。FGFは、任意の動物種に由来し得る。1つの実施形態において、FGFは、げっ歯類、鳥類、イヌ、ウシ、ブタ、ウマおよびヒトを含むがこれらに限定されない哺乳動物のFGFである。FGFのアミノ酸配列および多くのFGFを作製するための方法は、当該分野で周知である。
ヒトbFGFのアミノ酸配列およびその組換え発現のための方法は、参照により本明細書中に援用される米国特許第5,439,818号に開示されている。ウシbFGFのアミノ酸配列およびその組換え発現のための様々な方法は、参照により本明細書中に援用される米国特許第5,155,214号に開示されている。これらの146個の残基の形態を比較すると、それらのアミノ酸配列は、2つの残基だけが異なり、ほぼ同一である。組換えbFGF−2および他のFGFは、米国特許第4,956,455号に詳細に記載されている手法を用いて、製薬品質(98%以上の純度)に精製され得る。
FGF誘導物質には、FGFの活性なフラグメントが含まれる。その最も単純な形態において、その活性なフラグメントは、メチオニンアミノペプチダーゼによる処理などの、N末端のメチオニンの除去に対する周知の手法を用いて、N末端のメチオニンを除去することによって作製される。2番目に望ましい切断型には、リーダー配列を有しないFGFが含まれる。当業者は、リーダー配列のことを、細胞膜の通過を促進するが、活性にとって必要でなく、成熟タンパク質には見られない、タンパク質のN末端における一続きの疎水性残基として認識している。ヒトおよびマウスのbFGFは、商業的に入手可能である。
フリズルド(Fzd):Gタンパク質共役レセプターの特色を有し、リポ糖タンパク質、分泌フリズルド関連タンパク質(sFRP)、R−スポンジンおよびNorrinといったWntファミリーのタンパク質に結合し、下流のシグナル伝達を活性化する、7回膜貫通型哺乳動物タンパク質のファミリー。フリズルドタンパク質(フリズルドレセプターとも称される)は、その同族のリガンドに結合するシステインリッチドメイン(CRD)、カルボキシ末端のPDZ(Psd−95/ディスクラージ(disc large)/ZO−1相同性)結合ドメイン、ならびにセリン/トレオニンキナーゼおよびチロシンキナーゼに対する様々なコンセンサス部位を含む。アミノ酸ハイドロパシー解析から、フリズルドタンパク質が、1つの細胞外アミノ末端、3つの細胞外タンパク質ループ、3つの細胞内タンパク質ループおよび1つの細胞内カルボキシ末端を含むことが示唆されている。
フリズルドタンパク質は、胚発生中の重要な制御的役割を有し、ヒトおよび動物モデルにおいて、様々な癌、心肥大、家族性滲出性硝子体網膜症および精神分裂病を含むいくつかの疾患にも関連する。
少なくとも10個の哺乳動物フリズルドタンパク質が存在し、その哺乳動物フリズルドタンパク質をコードする遺伝子は、Drosophilaのフリズルド遺伝子に関係する。ヒトフリズルドタンパク質には、Frizzled1(Fzd1;GENBANK(登録商標)アクセッション番号AB017363)、Frizzled2(Fzd2;GENBANK(登録商標)アクセッション番号L37882/NM_001466)、Frizzled3(Fzd3;GENBANK(登録商標)アクセッション番号AJ272427)、Frizzled4(Fzd4;GENBANK(登録商標)アクセッション番号AB032417)、Frizzled5(Fzd5;GENBANK(登録商標)アクセッション番号U43318)、Frizzled6(Fzd6;GENBANK(登録商標)アクセッション番号AB012911)、Frizzled7(Fzd7;GENBANK(登録商標)アクセッション番号AB010881)、Frizzled8(Fzd8;GENBANK(登録商標)アクセッション番号AB043703)、Frizzled9(Fzd9;GENBANK(登録商標)アクセッション番号U82169/NM_003508)およびFrizzled10(Fzd10;GENBANK(登録商標)アクセッション番号AB027464)が含まれる。2013年1月1日に入手可能であるとおりのこれらのGENBANK(登録商標)エントリーのすべてが、参照により本明細書中に援用される。
成長因子:細胞の成長、生存および/または分化を促進する物質。成長因子には、成長刺激物質(マイトジェン)として機能する分子、細胞遊走を刺激する因子、走化性物質として機能するかまたは腫瘍細胞の細胞遊走もしくは侵入を阻害する因子、細胞の分化機能を調節する因子、アポトーシスに関与する因子、あるいは成長および分化に影響せずに細胞の生存を促進する因子が含まれる。成長因子の例は、線維芽細胞成長因子(例えば、FGF−2)、上皮成長因子(EGF)、繊毛神経栄養因子(CNTF)および神経成長因子(NGF)ならびにアクチビン(actvin)−Aである。
成長培地または拡大培地:特定の細胞集団の成長(細胞増殖/拡大)を補助するために必要な栄養分を伴う培養条件の合成セット。1つの実施形態において、それらの細胞は、iPSCなどの幹細胞である。成長培地は、通常、炭素源、窒素源、およびpHを維持する緩衝剤を含む。1つの実施形態において、成長培地は、幹細胞の成長を高める様々な栄養分が補充された、DMEMなどの基礎培地を含む。さらに、基礎培地には、添加物(例えば、ウマ、子ウシまたはウシの胎仔血清)が補充され得る。
宿主細胞:ベクターを増やすことができ、そのDNAを発現できる、細胞。その細胞は、原核生物細胞であっても真核生物細胞であってもよい。この用語は、対象の宿主細胞の任意の子孫も含む。複製中に生じる変異が存在し得るので、すべての子孫が、親細胞と同一でない可能性があることが理解される。しかしながら、用語「宿主細胞」が使用されるとき、そのような子孫も含められる。
単離された:その構成要素が天然に存在する環境(例えば、細胞)内の他の生物学的構成要素、すなわち、染色体および染色体外のDNAおよびRNA、タンパク質およびオルガネラから実質的に分離されているかまたは精製されている、「単離された」生物学的構成要素、例えば、核酸、タンパク質またはオルガネラ。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語は、宿主細胞において組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸およびタンパク質も包含する。同様に、「単離された」細胞は、その細胞が天然に存在する生物の他の細胞から実質的に分離されているか、それらから離れて作製されたか、またはそれらから精製されている。単離された細胞は、例えば、少なくとも99%、少なくとも(at leat)98%、少なくとも97%、少なくとも96%、95%、少なくとも94%、少なくとも93%、少なくとも92%または(aor)少なくとも90%純粋であり得る。
哺乳動物:この用語は、ヒトと非ヒト哺乳動物の両方を含む。哺乳動物の例としては、ヒトならびに家畜(veterinary)動物および実験動物(例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウサギおよびマウス)が挙げられるが、これらに限定されない。
マーカーまたは標識:例えば、ELISA、分光測定法、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光法、顕微鏡法、ノーザン解析またはサザン解析によって、検出が可能な作用物質。例えば、マーカーは、核酸分子またはタンパク質に付着され得、それにより、その核酸分子またはタンパク質の検出が可能になる。マーカーの例としては、放射性同位体、ニトロイミダゾール(nitorimidazole)、酵素基質、補助因子、リガンド、化学発光物質、フルオロフォア、ハプテン、酵素およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。標識するための方法および様々な目的に適切なマーカーの選択の指針は、例えば、Sambrookら(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York,1989)およびAusubelら(In Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,1998)に論じられている。
いくつかの実施形態において、マーカーは、フルオロフォア(「蛍光標識」)である。フルオロフォアは、特定の波長の光に曝露されることによって励起されたとき、例えば異なる波長の、光を発する(すなわち、蛍光を発する)、化学的化合物である。フルオロフォアは、その発光プロファイルすなわち「色」に関して記載され得る。緑色フルオロフォア、例えば、Cy3、FITCおよびオレゴングリーンは、通常、515〜540λの範囲の波長における発光によって特徴付けられる。赤色フルオロフォア、例えば、テキサスレッド、Cy5およびテトラメチルローダミンは、通常、590〜690λの範囲の波長における発光によって特徴付けられる。他の実施形態において、マーカーは、抗体によって認識されるタンパク質タグ、例えば、ヒスチジン(His)タグ、赤血球凝集素(HA)タグまたはc−Mycタグである。
膜電位:外部のバス溶液などの環境に対する細胞の内部の電位。当業者は、従来のホールセル法などを使用することによって、細胞の膜電位を容易に評価し得る。膜電位は、多くのアプローチを使用して(例えば、従来のホールセルアクセスを使用して、または例えば、穿孔パッチホールセル構成およびセルアタッチト構成を使用して)評価され得る。
マイクロRNA(miRNA):遺伝子発現を制御する一本鎖RNA分子。miRNAは、転写されるDNAの遺伝子によってコードされるが、mlRNAはタンパク質に翻訳されず;その代わりに、一次転写産物(プリmiRNA)の各々は、プレmiRNAと呼ばれる短いステムループ構造にプロセシングされ、最終的には、機能的miRNAにプロセシングされる。成熟したmiRNA分子は、1つ以上のメッセンジャーRNA(mRNA)分子と完全にまたは部分的に相補的であり、それらの主要な機能は、遺伝子発現をダウンレギュレートすることである。マイクロRNAは、独立した遺伝子によってコードされ得るが、イントロン、mRNAの3’UTR、長い非コードRNA、snoRNAおよびトランスポゾンを含む種々の異なるRNA種からプロセシングされることもある(酵素Dicerを介して)。本明細書中で使用されるとき、マイクロRNAには、内因性の対応物と同じまたは実質的に同じ機能を有する、外から細胞内に導入されるマイクロRNAのことを意味すると意図された「模倣」マイクロRNAも含まれる。
Nodal:トランスフォーミング成長因子(TGF−ベータ)スーパーファミリーに属するNODAL遺伝子によってコードされる分泌タンパク質。脊椎動物における内臓の器官の左右(LR)非対称は、胚発生の間に、nodalシグナル伝達を介して確立される。Nodalは、初期発生の生物の左側において発現され、新口動物の間で高度に保存されている。例示的なNodal配列は、参照により本明細書中に援用される、2013年1月6日のGENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_018055.4およびNP_060525.3として見られ得る。
核酸:ホスホジエステル結合を介して連結されたヌクレオチド単位(リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの天然に存在する関連する構造的バリアントおよび天然に存在しない合成アナログ)、その天然に存在する関連する構造的バリアントおよび天然に存在しない合成アナログから構成されるポリマー。したがって、この用語には、ヌクレオチドおよびそれらの間の結合が、天然に存在しない合成アナログ(例えば、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、2−O−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)など)を含む、ヌクレオチドポリマーが含まれる。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、自動DNA合成装置を使用して、合成され得る。ヌクレオチド配列が、DNA配列(すなわち、A、T、G、C)によって表されるとき、これは、「U」が「T」に取って代わるRNA配列(すなわち、A、U、G、C)も含むことが理解されるだろう。
「ヌクレオチド」には、糖に連結された塩基(例えば、ピリミジン、プリンまたはそれらの合成アナログ)またはペプチド核酸(PNA)におけるようなアミノ酸に連結された塩基を含むモノマーが含まれるが、これに限定されない。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドにおける1つのモノマーである。ヌクレオチド配列とは、ポリヌクレオチドにおける塩基の配列のことを指す。
ヌクレオチド配列を記載するために、従来の表示法が本明細書中で使用される:一本鎖ヌクレオチド配列の左側の末端が5’末端であり;二本鎖ヌクレオチド配列の左方向が、5’方向と称される。新生のRNA転写物にヌクレオチドが5’から3’に付加する方向は、転写方向と称される。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖は、「コーディング鎖」と称され;DNAから転写され、RNA転写物の5’末端に対して5’に配置された、mRNAと同じ配列を有するDNA鎖上の配列は、「上流配列」と称され;RNAと同じ配列を有し、コードしているRNA転写物の3’末端に対して3’であるDNA鎖上の配列は、「下流配列」と称される。
「cDNA」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態である、mRNAと相補的または同一であるDNAのことを指す。
「コードする」とは、規定のヌクレオチド配列(例えば、rRNA、tRNAおよびmRNA)または規定のアミノ酸配列およびそれらによって生じる生物学的特性を有する、生物学的プロセスにおいて他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として働く、あるポリヌクレオチドにおける具体的なヌクレオチド配列(例えば、遺伝子、cDNAまたはmRNA)の固有の特性のことを指す。したがって、ある遺伝子によって生成されるmRNAの転写および翻訳が、細胞または他の生体系においてタンパク質を生成する場合、その遺伝子は、タンパク質をコードする。コーディング鎖(そのヌクレオチド配列は、mRNA配列と同一であり、通常、配列表に提供されている)と遺伝子またはcDNAの転写用の鋳型として使用される非コーディング鎖との両方が、タンパク質またはその遺伝子もしくはcDNAの他の生成物をコードすると言及され得る。別段特定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンであって、同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびRNAをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。いくつかの例において、核酸は、開示される抗原をコードする。
Noggin:NOG遺伝子によってコードされるタンパク質。Nogginは、TGF−βファミリーリガンドに結合して、それらが対応するレセプターに結合するのを妨げることによって、TGF−βシグナル伝達を阻害する。Nogginは、他のTGF−βシグナル伝達阻害剤(例えば、コーディンおよびフォリスタチン)とともに、BMP4を阻害することによって、神経誘導において重要な役割を果たす。Nogginに対する例示的な配列は、参照により本明細書中に援用される、2013年1月13日のGENBANK(登録商標)アクセッション番号NP_005441.1およびNM_005450.4である。
Oct−4:Oct−4遺伝子の遺伝子産物である、POU5−F1またはMGC22487またはOCT3またはOCT4またはOTF3またはOTF4としても知られるタンパク質。この用語には、任意の種または起源に由来するOct−4が含まれ、iPSCを作製するために使用される能力を保持しているOct−4のアナログおよびフラグメントまたは一部が含まれる。Oct−4タンパク質は、GENBANK(登録商標)などの公的な供給源から入手できる、Oct−4に対する公知の公開された配列のいずれかを有し得る。そのような配列の例としては、GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_002701が挙げられるが、これに限定されない。
作動可能に連結された:第1の核酸配列が、第2の核酸配列と機能的関係性であるように配置されるとき、その第1の核酸配列は、その第2の核酸配列と作動可能に連結される。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合、そのプロモーターは、そのコード配列に作動可能に連結されている。通常、作動可能に連結されたDNA配列は、連続的であり、2つのタンパク質コード領域をつなぎ合わせる必要がある場合、同じ読み枠である。
薬学的に許容され得るキャリア:従来の薬学的に許容され得るキャリアは、本明細書中に開示される方法を実施するためおよび本明細書中に開示される組成物を形成するために有用である。E.W.MartinによるRemington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,PA,15th Edition,1975には、本明細書中に開示される抗菌化合物の薬学的送達に適した組成物および製剤の例が記載されている。
一般に、キャリアの性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、薬学的におよび生理的に許容され得る流体(例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなど)をビヒクルとして含む注射可能な流体を含む。固体の組成物(例えば、散剤、丸剤、錠剤またはカプセルの形態)の場合、従来の無毒性の固体キャリアは、例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを含み得る。投与される薬学的組成物は、生物学的に中性のキャリアに加えて、少量の無毒性の補助剤物質(例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤およびpH緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート)を含み得る。
多能性幹細胞:(a)免疫不全(SCID)マウスに移植されると奇形腫を誘導することができ;(b)3つすべての胚葉の細胞型に分化することができ(例えば、外胚葉、中胚葉および内胚葉の細胞型に分化することができ);(c)胚性幹細胞の1つ以上のマーカーを発現する(例えば、Oct4、アルカリホスファターゼ、SSEA−3表面抗原、SSEA−4表面抗原、nanog、TRA−1−60、TRA−1−81、SOX2、REX1などを発現する)が、胚および胚体外膜を形成できない(全能でない)、幹細胞。
例示的な多能性幹細胞としては、胚盤胞期胚の内部細胞塊(ICM)に由来する胚性幹細胞、ならびに卵割期胚または桑実胚期胚の1つ以上の割球に由来する(必要に応じて、その胚の残りの部分を破壊せずに)胚性幹細胞が挙げられる。これらの胚性幹細胞は、受精、または体細胞核移植(SCNT)、単為生殖および雄性発生を含む無性生殖的手段によってもたらされた胚性物質から作製され得る。PSCは、すべての胚外組織(例えば、インビボにおける胎盤またはインビトロにおけるトロホブラスト)に寄与する能力を欠いているので、PSC単独では、子宮に移植されても胎仔または成体の動物に成長できない。
多能性幹細胞には、因子(本明細書中で再プログラム因子と称される)の組み合わせを発現させることまたはその発現を誘導することによって、体細胞を再プログラムすることにより作製される「人工多能性幹細胞(iPSC)」も含まれる。iPSCは、胎生期、出生後、新生児、若年期または成体の体細胞を使用して作製され得る。ある特定の実施形態において、体細胞を多能性幹細胞に再プログラムするために使用され得る因子としては、例えば、Oct4(時折、Oct3/4と称される)、Sox2、c−MycおよびKlf4、NanogおよびLin28が挙げられる。いくつかの実施形態において、体細胞は、体細胞を多能性幹細胞に再プログラムする、少なくとも2つの再プログラム因子、少なくとも3つの再プログラム因子または4つの再プログラム因子を発現させることによって再プログラムされる。iPSCは、胚性幹細胞に特性が似ている。
ポリペプチド:モノマーが、アミド結合を介して互いにつなぎ合わされたアミノ酸残基である、ポリマー。アミノ酸が、アルファ−アミノ酸であるとき、L−光学異性体またはD−光学異性体が、使用され得るが、L−異性体が、本質的に好ましい。ポリペプチドという用語は、天然に存在するタンパク質ならびに組換え的にまたは合成的に生成されたタンパク質を網羅すると明確に意図されている。
本明細書中で使用される実質的に精製されたポリペプチドとは、それが天然に付随する他のタンパク質、脂質、炭水化物または他の材料を実質的に含まないポリペプチドのことを指す。1つの実施形態において、ポリペプチドは、それが天然に付随する他のタンパク質、脂質、炭水化物または他の材料を少なくとも50%、例えば、少なくとも80%含まない。別の実施形態において、ポリペプチドは、それが天然に付随する他のタンパク質、脂質、炭水化物または他の材料を少なくとも90%含まない。なおも別の実施形態において、ポリペプチドは、それが天然に付随する他のタンパク質、脂質、炭水化物または他の材料を少なくとも95%含まない。
機能的に似ているアミノ酸を提供している保存的アミノ酸置換の表が、当業者に周知である。以下の6つの群は、互いに対して保存的置換であるとみなされるアミノ酸の例である:
1)アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リジン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);および
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
1)アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リジン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);および
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
非保存的アミノ酸置換は、(a)置換領域におけるアミノ酸骨格の構造;(b)アミノ酸の電荷もしくは疎水性;または(c)アミノ酸側鎖の嵩の変化に起因し得る。タンパク質の特性に最も大きな変化をもたらすと通常予想される置換は、(a)親水性残基が、疎水性残基の代わりに用いられる(または疎水性残基によって置換される)置換;(b)プロリンが、他の任意の残基の代わりに用いられる(または他の任意の残基によって置換される)置換;(c)嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有しない残基、例えば、グリシンの代わりに用いられる(または側鎖を有しない残基によって置換される)置換;または(d)正に帯電した側鎖を有する残基、例えば、リジル、アルギニルまたはヒスチジル(histadyl)が負に帯電した残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルの代わりに用いられる(または負に帯電した残基によって置換される)置換である。
バリアントアミノ酸配列は、天然のアミノ酸配列と例えば、80、90またはなおも95または98%同一であり得る。パーセンテージ同一性を測定するためのプログラムおよびアルゴリズムは、NCBIウェブサイトに見られ得る。
出生前:誕生前に存在していることまたは生じていること。同様に、「出生後」は、誕生後に存在していることまたは生じていることである。
プライマー:短い核酸分子であって、例えば、10〜100ヌクレオチド長(例えば、約15、20、25、30または50ヌクレオチド長またはそれ以上)のDNAオリゴヌクレオチド。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションによって、相補的な標的DNA鎖(例えば、表1もしくは表Aに列挙される遺伝子または表2に列挙されるmiRNA)にアニールされることにより、そのプライマーと標的DNA鎖との間でハイブリッドが形成され得る。プライマー対は、PCRまたは当該分野で公知の他の核酸増幅方法などによる、核酸配列の増幅のために使用され得る。
核酸プライマーを調製するためおよび使用するための方法は、例えば、Sambrookら(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSHL,New York,1989)、Ausubelら(ed.)(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,1998)およびInnisら(PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.,San Diego,CA,1990)に記載されている。PCRプライマー対は、例えば、Primer(Version 0.5,(著作権)1991,Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge,MA)などのその目的を対象にしたコンピュータプログラムを使用することによって、公知の配列から得ることができる。当業者は、特定のプライマーの特異性が、プライマーが長くなるにつれて高まることを認識するだろう。したがって、例えば、30個連続したヌクレオチドの分子を含むプライマーは、たった15ヌクレオチドの対応するプライマーよりも高い特異性で、標的配列(例えば、指定の分子の別のホモログ)にアニールし得る。したがって、より高い特異性を得るために、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個、少なくとも50個またはそれ以上連続したヌクレオチドの目的の核酸配列を含むプライマーが、選択され得る。
プライマー対:例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または他のインビトロ核酸増幅方法による核酸配列の増幅のために使用され得る2つのプライマー(一方が「順方向」で、もう一方が「逆方向」)。プライマー対の順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、標的核酸配列上の重複する相補的な配列にハイブリダイズしない。
精製された:用語「精製された」は、絶対的な純度を要求しない;むしろ、それは、相対的な用語と意図される。したがって、例えば、精製されたタンパク質調製物は、言及されているタンパク質が、細胞内のその天然の環境におけるタンパク質よりも純粋である、タンパク質調製物である。例えば、タンパク質の調製物は、そのタンパク質が、その調製物の全タンパク質含有量の少なくとも50%に相当するように、精製される。同様に、精製されたオリゴヌクレオチド調製物は、オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの複合混合物を含む環境における場合よりも純粋である調製物である。精製された細胞集団は、約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%超、もしくは100%純粋であるか、または他の細胞型を含まない。
組換え:組換え核酸分子または組換えポリペプチド分子は、天然に存在しない配列を有する分子、または別途切り離された2つの配列セグメントを人工的に組み合わせることによって作製された配列を有する分子である。この人工的な組み合わせは、ポリペプチドもしくは核酸分子の化学合成、または遺伝子操作法などによる、単離された核酸分子セグメントの人工的な操作によって達成され得る。
網膜色素上皮(RPE)細胞:RPE細胞は、色素沈着、上皮の形態、および頂端−基底の極性のある細胞に基づいて認識され得る。RPE細胞は、mRNAレベルとタンパク質レベルの両方において、以下のうちの1つ以上を発現する:Pax6、MITF、RPE65、CRALBP、PEDF、Bestrophinおよび/またはOtx2。ある特定の他の実施形態において、RPE細胞は、mRNAレベルとタンパク質レベルの両方において、Pax−6、MitFおよびチロシナーゼのうちの1つ以上を発現する。RPE細胞は、胚性幹細胞マーカーであるOct−4、nanogまたはRex−1を(いかなる検出可能なレベルでも)発現しない。詳細には、これらの遺伝子の発現は、定量的RT−PCRによって評価されるとき、ES細胞またはiPSC細胞よりもRPE細胞において、およそ100〜1000倍低い。分化したRPE細胞は、その敷石状(cobblestone)の形態および色素の最初の出現によって、視覚的にも認識され得る。さらに、分化したRPE細胞は、単層を横断する経上皮抵抗/TERおよび経上皮電位/TEPを有し(TER>100オーム.cm2;TEP>2mV)、頂端側から基底側に流体およびCO2を輸送し、極性のあるサイトカイン分泌を制御する。
用語「RPE細胞」および「分化したRPE細胞」および「iPSC由来RPE細胞」および「ヒトRPE細胞」は、本明細書中に開示される方法を用いてヒトiPSCから分化したRPE細胞のことを指すために、全体にわたって交換可能に使用される。この用語は、分化したRPE細胞のことを指すために広く使用される。
網膜色素上皮:基底をなす脈絡膜に付着した感覚神経網膜(neurosensory
retinal)のすぐ外側に、哺乳動物においてインビボで存在する六角形の細胞の有色素の層。これらの細胞は、色素顆粒が高密度に詰まっており、入射光から網膜を保護する。網膜色素上皮は、血液によって運ばれる脈絡膜の物質に対して堅固なバリアを残しつつ、小分子(例えば、アミノ酸、アスコルビン酸およびD−グルコース)を供給することによって網膜環境を維持する輸送制限因子としても働く。
retinal)のすぐ外側に、哺乳動物においてインビボで存在する六角形の細胞の有色素の層。これらの細胞は、色素顆粒が高密度に詰まっており、入射光から網膜を保護する。網膜色素上皮は、血液によって運ばれる脈絡膜の物質に対して堅固なバリアを残しつつ、小分子(例えば、アミノ酸、アスコルビン酸およびD−グルコース)を供給することによって網膜環境を維持する輸送制限因子としても働く。
分泌フリズルド関連タンパク質(sFRP):sFRPファミリーのタンパク質は、Wntシグナル伝達のアンタゴニストとして同定されたおよそ32〜40kDaの糖タンパク質である(Rattnerら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:2859−63;Melkonyanら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:13636−41;Finchら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:6770−5;Urenら(2000)J.Biol.Chem.275:4374−82;Kawanoら(2003)J.Cell.Sci.116:2627−34)。哺乳動物には、5つのsFRPが存在する。ヒトsFRPには、2013年1月1日に入手可能であるとおりの、sFRP1(GENBANK(登録商標)アクセッション番号AF001900.1)、sFRP2(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_003013.2)、sFRP3(GENBANK(登録商標)アクセッション番号U91903.1)、sFRP4(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_003014.3)およびsFRP5(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_003015.3)が含まれる。
sFRPは、3つの構造単位:アミノ末端のシグナルペプチド、フリズルド型のシステインリッチドメイン(CRD)およびカルボキシ末端のネトリン(NTR)ドメインを含む。CRDは、およそ120アミノ酸に及び、10個の保存されたシステイン残基を含み、FzdレセプターのCRDに対して30〜50%の配列類似性を有する。ネトリンドメインは、6つのシステイン残基、および疎水性残基のいくつかの保存されたセグメント、および二次構造によって定義される。sFRPの生物学的活性は、Wnt機能の制御因子としての役割に広く起因する。
配列同一性:2つの核酸配列間または2つのアミノ酸配列間の類似性は、それらの配列の間で共有される配列同一性のレベルに関して表現される。配列同一性は、代表的には、パーセンテージ同一性に関して表現され;パーセンテージが高くなるほど、2つの配列は類似している。
比較するために配列をアラインメントするための方法は、当該分野で周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981;Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970;Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988;Higgins and Sharp,Gene 73:237−244,1988;Higgins and Sharp,CABIOS 5:151−153,1989;Corpetら、Nucleic Acids Research 16:10881−10890,1988;Huangら、Computer Applications in the Biosciences 8:155−165,1992;Pearsonら、Methods in Molecular Biology 24:307−331,1994;Tatianaら(1999),FEMS Microbiol.Lett.,174:247−250,1999に記載されている。Altschulらは、配列のアラインメント法および相同性の計算に関する詳細な考慮すべき点を提示している(J.Mol.Biol.215:403−410,1990)。
National Center for Biotechnology Information(NCBI)のベーシックローカルアラインメントサーチツール(BLAST(商標),Altschulら、J.Mol.Biol.215:403−410,1990)は、配列解析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxと関連して使用するために、National Center for Biotechnology Information(NCBI,Bethesda,MD)を含むいくつかの供給源から入手可能であり、インターネット上で利用可能である。このプログラムを使用して配列同一性を測定する方法の説明は、インターネット上でBLAST(商標)に対するヘルプの項のもとに入手可能である。
ソニックヘッジホッグ(SHH):ソニックヘッジホッグ(SHH)は、Drosophilaヘッジホッグシグナル伝達分子の3つの哺乳動物ホモログのうちの1つであり、発生中の胚の脊索および底板において高レベルで発現される。SHHは、神経管のパターン形成(Echerlardら、Cell 75:1417−30,1993)、肢、体節、肺および皮膚の発生において重要な役割を果たすと知られている。さらに、SHHの過剰発現は、基底細胞癌に見られる。SHHの例示的なアミノ酸配列は、米国特許第6,277,820号に示されている。ヒトソニックに対する例示的な配列は、参照により本明細書中に援用されるGENBANKアクセッション番号NG_007504.1(2013年1月1日)として示されている。
被験体:処置、観察または実験に供される動物またはヒト。
全能または全能性:インビボにおいて、分裂して、最終的にすべての胚外組織を含む生物全体をもたらす細胞の能力。1つの態様において、用語「全能」とは、細胞が、インビトロにおいて、一連の分裂を通じて胚盤胞に進む能力のことを指す。胚盤胞は、内部細胞塊(ICM)および栄養外胚葉を含む。ICMに見られる細胞は、無限に増殖する能力を有するか、または適切に誘導された場合、生物に寄与するすべての細胞型に分化する能力を有する、多能性幹細胞(PSC)を生じる。栄養外胚葉細胞は、胎盤および羊膜を含む胚外組織をもたらす。
処置:診断された病的症状または障害を治癒させる、遅らせる、その徴候を和らげる、および/またはその進行を停止する、治療的な措置。ある特定の実施形態において、網膜障害を有する被験体の処置は、網膜の劣化の減少;網膜色素上皮細胞の数の増加、視力の改善、またはいくつか効果の組み合わせがもたらされる。
チロシナーゼ:酸化によるチロシンからのメラニンおよび他の色素の生成を触媒する銅含有オキシダーゼ。この酵素は、メラニンの生成を調節するための律速酵素である。チロシナーゼは、モノフェノールのヒドロキシル化およびo−ジフェノールから対応するo−キノンへの変換において作用する。o−キノンは、いくつかの反応を起こして、最終的にメラニンを形成する。ヒトでは、チロシナーゼ酵素は、TYR遺伝子によってコードされる。例示的なアミノ酸配列および核酸配列は、参照により本明細書中に援用される、2013年1月5日の、GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000372.4(ヒト)およびNM_011661.4(マウス)に示されている。
未分化な:胚起源または成体起源の分化細胞と識別する、未分化細胞の特徴的なマーカーおよび形態学的特色を示す細胞。したがって、いくつかの実施形態において、未分化細胞は、RPEマーカーを含むがこれに限定されない細胞系譜特異的マーカーを発現しない。
ベクター:宿主細胞に導入されたとき、それによって形質転換された宿主細胞をもたらす核酸分子。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞においてその複製を可能にする核酸配列を含み得る。ベクターは、1つ以上の選択マーカー遺伝子および当該分野で公知の他の遺伝的エレメントも含み得る。ベクターは、所望のタンパク質産物の単離を容易にするアミノ酸モチーフをコードする配列(例えば、マルトース結合タンパク質、c−mycまたはGSTをコードする配列)も含み得る。
Wnt:細胞間相互作用を制御し、Drosophilaのセグメント極性遺伝子であるウィングレスに関係する、高度に保存された分泌シグナル伝達分子のファミリー。ヒトでは、Wntファミリーの遺伝子は、38〜43kDaのシステインリッチ糖タンパク質をコードする。Wntタンパク質は、疎水性シグナル配列、保存されたアスパラギン連結型オリゴ糖コンセンサス配列(例えば、Shimizuら、Cell Growth Differ 8:1349−1358(1997)を参照のこと)および22個の保存されたシステイン残基を有する。細胞質のベータ−カテニンの安定化を促進する能力が理由で、Wntタンパク質は、転写活性化因子として作用し得、アポトーシスを阻害し得る。特定のWntタンパク質の過剰発現は、ある特定の癌に関連すると示されている。
Wntファミリーは、少なくとも19個の哺乳動物メンバーを含む。例示的なWntタンパク質としては、Wnt−1、Wnt−2、Wnt2b、Wnt−3、Wnt−3a、Wnt−4、Wnt−5a、Wnt5b、Wnt−6、Wnt−7a、Wnt−7b、Wnt−8a、Wnt−8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt−10b、Wnt−11およびWnt16が挙げられる。これらの分泌リガンドは、少なくとも3つの異なるシグナル伝達経路を活性化する。カノニカル(またはWnt/ベータ−カテニン)Wntシグナル伝達経路において、Wntは、フリズルド(Fzd)レセプターファミリーメンバーおよび低密度リポタンパク質(LDL)レセプター関連タンパク質5または6(LRP5/6)からなるレセプター複合体を活性化する。Fzdリガンドに結合するレセプター複合体を形成するために、Fzdレセプターは、6つのYWTDアミノ酸リピートによって分断された4つの細胞外のEGF様ドメインを有する1回膜貫通タンパク質であるLRP5/6と相互作用する(Johnsonら、2004,J.Bone Mineral Res.19:1749)。レセプター結合の際に活性化されるカノニカルWntシグナル伝達経路は、Fzdレセプターと直接相互作用する細胞質タンパク質Dishevelled(Dvl)によって媒介され、細胞質の安定化およびベータ−カテニンの蓄積をもたらす。Wntシグナルの非存在下において、ベータ−カテニンは、腫瘍抑制因子タンパク質である大腸腺腫性ポリポーシス(APC)およびAxinを含む細胞質破壊複合体に局在化する。これらのタンパク質は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ(GSK)−3ベータがベータ−カテニンに結合してリン酸化することを可能にする極めて重要な骨格として機能し、ユビキチン/プロテアソーム経路を介する分解に対してそれをマークする。Dvlの活性化は、破壊複合体の解離をもたらす。次いで、蓄積された細胞質のベータ−カテニンは、核に輸送され、核でTCF/LEFファミリーのDNA結合タンパク質と相互作用することにより、転写が活性化される。
非カノニカルWNT経路は、これらのWNTリガンドのうちの3つ、WNT4、WNT5aおよびWNT11によって制御される。これらのリガンドは、コレセプター(LRP5/6)の非存在下においてWNTレセプターであるフリズルドに結合する。これにより、細胞質のベータ−カテニンを活性化せずに、RHO GTPアーゼおよびROCKキナーゼが活性化される。ROCKは、細胞骨格を制御して、細胞の頂端−基底極性を制御する。同じレセプターに対する競合のせいで、非カノニカルWNTリガンドは、カノニカルWNTシグナル伝達も阻害する。
別段説明されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。単数形の用語「a」、「an」および「the」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、語「または」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、「および」を含むと意図される。すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および核酸またはポリペプチドに対して与えられるすべての分子量または分子質量の値は、近似値であり、説明のために提供されているとさらに理解されるべきである。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な方法および材料が、本開示の実施または試験において使用され得るが、好適な方法および材料が、下に記載される。用語「含む(comprise)」は、「含む(includes)」を意味する。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により援用される。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および例は、単なる例証であって、限定していると意図されない。
体細胞を再プログラムしてRPE細胞を作製するための方法
体細胞を再プログラムしてRPE細胞を作製するための方法
人工多能性幹細胞が再プログラムされて網膜色素上皮細胞になる方法が、本明細書中に提供される。幹細胞は、インビトロにおいて未分化な状態で無限に維持され得るが、実質的に任意の細胞型に分化することもできる。神経細胞系列である網膜色素上皮(RPE)における特殊化された細胞へのヒトiPSCの分化を誘導する方法が、本明細書中に開示される。
RPEは、血流と網膜との間のバリアの一部として働く、脈絡膜と神経網膜との間の濃い有色素の上皮の単層である。RPEの機能としては、脱落した桿体外節および錐体外節のファゴサイトーシス、迷光の吸収、ビタミンAの代謝、レチノイドの再生ならびに組織修復が挙げられる。RPEは、敷石状の細胞形態の黒色の有色素細胞を有し、マーカー(例えば、細胞レチンアルデヒド結合タンパク質(CRALBP);RPE65、Best卵黄様黄斑ジストロフィー遺伝子(VMD2)および色素上皮由来因子(PEDF))を発現すると知られている。RPEは、光受容体の維持において役割を果たし、インビボにおける様々なRPE機能不全は、光受容体の損傷および失明をもたらし得る、視力を変化させるいくつかの病気(例えば、RPE剥離、異形成、萎縮、網膜症、網膜色素変性症、黄斑ジストロフィーまたは加齢黄斑変性を含む変性)に関連する。RPEは、その創傷治癒能力を理由に、移植治療のために広範に研究された;RPE移植は、視力回復のために使用され得る。さらに、RPEは、ドーパミンを分泌するので、RPEは、パーキンソン病の処置のためにも使用され得る。
出発体細胞は、目的の任意の細胞であってよい。哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラットなど)起源の生殖細胞以外の任意の細胞が、iPSC作製のための出発物質として使用され得る。例としては、とりわけ、角化上皮細胞、粘膜上皮細胞、外分泌腺上皮細胞、内分泌細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、筋細胞、血液および免疫系の細胞、神経細胞およびグリア細胞を含む神経系の細胞、色素細胞、ならびに造血幹細胞を含む前駆細胞が挙げられる。細胞分化の程度、細胞が回収される動物の齢などに制限はなく;未分化な前駆細胞(体性幹細胞を含む)および最終的に分化した成熟した細胞さえも、本発明における体細胞の起源として同様に使用され得る。1つの実施形態において、その体細胞自体が、ヒトRPE細胞などのRPE細胞である。そのRPE細胞は、成体または胎児のRPE細胞であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、体細胞は、妊娠約第9週〜約第38週(例えば、妊娠約第9週〜約第16週、妊娠約第17週〜第25週、約第16〜約第19週または妊娠約第26週〜約第38週)のヒト胎児から得られる胎児ヒトRPE細胞である。この文脈において、「約」は、2日以内を意味する。
体細胞の起源としての哺乳動物個体の選択は、特に限定されない。同種の細胞が、使用され得る。したがって、いくつかの実施形態において、iPSCは、MHC(例えば、HLA)が一致しない。いくつかの実施形態において、得られたiPSCが、ヒトにおける再生医学のために使用されるとき、細胞は、処置される被験体由来またはその患者と同じもしくは実質的に同じHLA型を有する別の被験体由来の体細胞から回収され得る。「実質的に同じHLA型」は、ドナーの体細胞に由来するiPSCの分化を誘導することによって得られた移植細胞が、患者に移植されたときに生着し得る程度に、ドナーのHLA型がその患者のHLA型と一致することを示唆する。その患者は、必要に応じて免疫抑制剤で処置され得る。1つの例において、それは、主要なHLA(例えば、HLA−A、HLA−BおよびHLA−DRという3つの主要な遺伝子座、HLA−Cwをさらに含む4つの主要な遺伝子座)が同一であるHLA型を含む。
哺乳動物から単離された体細胞は、細胞の選択に従ってその培養に適していると知られている培地を使用して前培養され、その後、核の再プログラムの工程に供され得る。そのような培地の具体的で非限定的な例としては、約5〜20%ウシ胎仔血清(FCS)を含む基礎培地(MEM)、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、RPMI1640培地、199培地、F12培地などが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、ヒトなどの哺乳動物から特定の細胞型を増やすために適切な組織培養条件を容易に確認できる。いくつかの実施形態において、完全にゼノフリーなヒトiPSCを得るために、培地は、非ヒト動物に由来する成分、例えば、FCSを排除し得る。様々な体細胞の培養に適したヒト由来成分(特に、組換えヒトタンパク質、例えば、成長因子)、可欠アミノ酸、ビタミンなどが補充された基本培地を含む培地は、商業的に入手可能であり;当業者は、体細胞の起源に従って適切なゼノフリー培地を選択することができる。ゼノフリー培地を使用して前培養された体細胞は、適切なゼノフリー細胞解離液を使用して培養容器から解離され、回収された後、核再プログラム物質と接触される。
下記で別段具体的に示されない限り、一般に、細胞は、約35〜38℃、通常、37℃、約4〜6%CO2、一般に、5%CO2において培養される。
体細胞は、当業者に公知の方法を用いて人工多能性幹細胞(iPSC)を作製するために再プログラムされ得る。当業者は、人工多能性幹細胞を容易に作製し得る。例えば、米国特許出願公開番号20090246875、米国特許出願公開番号2010/0210014;米国特許出願公開番号20120276636;米国特許第8,058,065号;米国特許第8,129,187号;米国特許第8,278,620号;PCT公開番号WO2007/069666A1および米国特許第8,268,620号(これらは参照により本明細書中に援用される)を参照のこと。一般に、核再プログラム因子を使用して、体細胞から多能性幹細胞が作製される。いくつかの実施形態において、Klf4、c−Myc、Oct3/4、Sox2、NanogおよびLin28のうちの少なくとも3つまたは少なくとも4つが、使用される。他の実施形態において、Oct3/4、Sox2、c−MycおよびKlf4が、使用される。
細胞は、体細胞からiPSCを誘導することができる通常1つ以上の因子またはこれらの物質をコードする核酸(ベクターに組み込まれた形態を含む)である核再プログラム物質で処理される。その核再プログラム物質は、通常、少なくともOct3/4、Klf4およびSox2、またはこれらの分子をコードする核酸を含む。p53の機能阻害剤であるL−mycまたはL−mycをコードする核酸、およびLin28もしくはLin28bまたはLin28もしくはLin28bをコードする核酸が、追加の核再プログラム物質として使用され得る。Nanogもまた、核再プログラムのために使用され得る。米国特許出願公開番号20120196360に開示されているように、iPSCを作製するための例示的な再プログラム因子としては、(1)Oct3/4、Klf4、Sox2、L−Myc(Sox2は、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17またはSox18で置き換えられ得;Klf4は、Klf1、Klf2またはKlf5で置き換え可能である);(2)Oct3/4、Klf4、Sox2、L−Myc、TERT、SV40ラージT抗原(SV40LT);(3)Oct3/4、Klf4、Sox2、L−Myc、TERT、ヒトパピローマウイルス(HPV)16 E6;(4)Oct3/4、Klf4、Sox2、L−Myc、TERT、HPV16 E7(5)Oct3/4、Klf4、Sox2、L−Myc、TERT、HPV16 E6、HPV16 E7;(6)Oct3/4、Klf4、Sox2、L−Myc、TERT、Bmi1;(7)Oct3/4、Klf4、Sox2、L−Myc、Lin28;(8)Oct3/4、Klf4、Sox2、L−Myc、Lin28、SV40LT;(9)Oct3/4、Klf4、Sox2、L−Myc、Lin28、TERT、SV40LT;(10)Oct3/4、Klf4、Sox2、L−Myc、SV40LT;(11)Oct3/4、Esrrb、Sox2、L−Myc(Esrrbは、Esrrgで置き換え可能である);(12)Oct3/4、Klf4、Sox2;(13)Oct3/4、Klf4、Sox2、TERT、SV40LT;(14)Oct3/4、Klf4、Sox2、TERT、HPV16 E6;(15)Oct3/4、Klf4、Sox2、TERT、HPV16 E7;(16)Oct3/4、Klf4、Sox2、TERT、HPV16 E6、HPV16 E7;(17)Oct3/4、Klf4、Sox2、TERT、Bmi1;(18)Oct3/4、Klf4、Sox2、Lin28(19)Oct3/4、Klf4、Sox2、Lin28、SV40LT;(20)Oct3/4、Klf4、Sox2、Lin28、TERT、SV40LT;(21)Oct3/4、Klf4、Sox2、SV40LT;または(22)Oct3/4、Esrrb、Sox2(Esrrbは、Esrrgで置き換え可能である)が挙げられる。1つの非限定的な例において、Oct3/4、Klf4、Sox2およびc−Mycが、使用される。他の実施形態において、Oct4、NanogおよびSox2が、使用される。例えば、参照により本明細書中に援用される米国特許第7,682,828号を参照のこと。これらの因子には、Oct3/4、Klf4およびSox2が含まれるが、これらに限定されない。他の例において、因子には、Oct3/4、Klf4およびMycが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの非限定的な例において、Oct3/4、Klf4、c−MycおよびSox2が、使用される。他の非限定的な例において、Oct3/4、Klf4、Sox2およびSal4が、使用される。
これらの核再プログラム物質のマウスおよびヒトcDNA配列は、参照により本明細書中に援用されるWO2007/069666において言及されているNCBIアクセッション番号を参照して入手可能である。1つ以上の再プログラム物質またはこれらの再プログラム(reporgraming)物質をコードする核酸を導入するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許出願公開番号2012/0196360および米国特許第8,071,369号(両方が参照により本明細書中に援用される)に開示されている。
核再プログラム物質とともに培養した後、細胞は、例えば、ES細胞の培養に適した条件下で培養され得る。マウス細胞の場合、その培養は、通常の培地に白血病抑制因子(LIF)を分化抑制因子として添加して行われる。ヒト細胞の場合、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)が、LIFの代わりに添加されることが望ましい。
いくつかの実施形態において、細胞は、フィーダー細胞として、細胞分裂を終了させるために放射線または抗生物質で処理されたマウス胎仔線維芽細胞の共存下において培養される。フィーダーとしての通常の使用におけるマウス胎仔線維芽細胞には、STO細胞株(ATCC CRL−1503)などが含まれ;iPSCの誘導の場合、有用な細胞は、STO細胞などにネオマイシン耐性遺伝子およびLIF遺伝子を安定に組み込むことによって作製され得る(SNL76/7STO細胞;ECACC07032801)(McMahon,A.P.& Bradley,A.Cell 62,1073−1085,1990)が使用され得る。マイトマイシンCで処理されたMEFは、Milliporeから商業的に入手可能である。ガンマ線照射されたMEFは、Global Stemから商業的に入手可能である。一般に、体細胞は、MEFの非存在下において再プログラム因子を形質導入される。いくつかの実施形態において、形質導入の約7〜8日後に、それらの細胞は、MEF上に再度播種される。
いくつかの実施形態において、iPSCは、外来性核酸を発現するように(例えば、プロモーターおよび第1のマーカーをコードする核酸配列に作動可能に(operaby)連結されたチロシナーゼエンハンサーを含むように)改変され得る。チロシナーゼ遺伝子は、例えば、2013年1月1日に入手可能であるとおりのGENBANK(登録商標)アクセッション番号22173に開示されている。この配列は、C57BL/6系統マウスの7番染色体の位置5286971−5291691(反転方向)に整列している。4721塩基対の配列は、RPE細胞における発現にとって十分である。参照により本明細書中に援用されるMurisierら、Dev.Biol.303:838−847,2007を参照のこと。この構築物は、網膜色素上皮細胞において発現される。いくつかの実施形態において、チロシナーゼエンハンサー配列は、以下の核酸配列を含むかまたは以下の核酸配列からなる:
このエンハンサーを含むチロシナーゼ遺伝子の上流領域のより長いフラグメント(例えば、5kb、6Kb、7kb、8kbなど)もまた、使用され得る。
Hsp70 1aプロモーター(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NT_039649.8を含むがこれに限定されない任意のプロモーターが、使用され得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは、
を含むかまたはそれからなる。
配列番号1および/または配列番号2の活性に影響せずに、小さい欠失、付加および置換(例えば、多くとも10、9、8、7、6、5、4、3、2または1塩基)が、行われ得る。
他のエンハンサーも使用され得る。他のRPE特異的エンハンサーとしては、D−MITF、DCT、TYRP1、RPE65、VMD2、MERTK、MYRIP、RAB27Aが挙げられる。好適なプロモーターとしては、チロシナーゼプロモーターを含む、網膜色素上皮細胞において発現される任意のプロモーターが挙げられるが、これに限定されない。上記構築物は、他のエレメント(例えば、翻訳開始のためのリボソーム結合部位(内部リボソーム結合配列)および転写/翻訳ターミネーター)も含み得る。
一般に、上記構築物で細胞をトランスフェクトすることが有益である。安定したトランスフェクションにとって好適なベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびセンダイウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
プラスミドは、いくつかの目標(例えば、制御された高コピー数を達成すること、および細菌におけるプラスミドの不安定性の潜在的原因を回避すること、およびヒト細胞を含む哺乳動物細胞における使用に適合するプラスミドを選択するための手段を提供すること)を念頭において、デザインされてきた。ヒト細胞において使用するためのプラスミドの二要件に対して、特に注意が払われてきた。第1に、大量のDNAが生成され得、精製され得るように、それらのプラスミドは、大腸菌における維持および発酵に適している。第2に、それらのプラスミドは、安全であり、ヒト患者および動物における使用に適している。第1の要件は、細菌の発酵中に比較的容易に選択され得、安定に維持され得る、高コピー数のプラスミドを要求する。第2の要件は、選択マーカーおよび他のコード配列などのエレメントに対する注意を要求する。いくつかの実施形態において、マーカーをコードするプラスミドは、(1)高コピー数の複製起点、(2)選択マーカー(例えば、カナマイシンによる抗生物質選択のためのneo遺伝子であるがこれに限定されない)、(3)チロシナーゼエンハンサーを含む転写終結配列、および(4)様々な核酸カセットを組み込むためのマルチクローニング部位;および(5)チロシナーゼプロモーターに作動可能に連結されたマーカーをコードする核酸配列から構成される。タンパク質をコードする核酸を導入するための当該分野で公知のプラスミドベクターは、数多く存在する。これらとしては、参照により本明細書中に援用される、米国特許第6,103,470号;米国特許第7,598,364号;米国特許第7,989,425号;および米国特許第6,416,998号に開示されているベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
核酸を導入するために、ウイルスベクターが使用され得、そのウイルスベクターとしては、ポリオーマ、SV40(Madzakら、1992,J.Gen.Virol.,73:15331536)、アデノウイルス(Berkner,1992,Cur.Top.Microbiol.Immunol.,158:39−6;Berlinerら、1988,Bio Techniques,6:616−629;Gorzigliaら、1992,J.Virol.,66:4407−4412;Quantinら、1992,Proc.Nad.Acad.Sci.USA,89:2581−2584;Rosenfeldら、1992,Cell,68:143−155;Wilkinsonら、1992,Nucl.Acids Res.,20:2233−2239;Stratford−Perricaudetら、1990,Hum.Gene Ther.,1:241−256)、ワクシニアウイルス(Mackettら、1992,Biotechnology,24:495−499)、アデノ随伴ウイルス(Muzyczka,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:91−123;Onら、1990,Gene,89:279−282)、HSVおよびEBVを含むヘルペスウイルス(Margolskee,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:67−90;Johnsonら、1992,J.Virol.,66:29522965;Finkら、1992,Hum.Gene Ther.3:11−19;Breakfieldら、1987,Mol.Neurobiol.,1:337−371;Fresseら、1990,Biochem.Pharmacol.,40:2189−2199)、シンドビスウイルス(H.Herweijerら、1995,Human Gene Therapy 6:1161−1167;米国特許第5,091,309号および同第5,2217,879号)、アルファウイルス(S.Schlesinger,1993,Trends Biotechnol.11:18−22;I.Frolovら、1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11371−11377)、ヒトヘルペスウイルスベクター(HHV)(例えば、HHV−6およびHHV−7)、ならびに鳥類起源のレトロウイルス(Brandyopadhyayら、1984,Mol.Cell Biol.,4:749−754;Petropouplosら、1992,J.Virol.,66:3391−3397)、マウス(Miller,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:1−24;Millerら、1985,Mol.Cell Biol.,5:431−437;Sorgeら、1984,Mol.Cell Biol.,4:1730−1737;Mannら、1985,J.Virol.,54:401−407)およびヒト起源のレトロウイルス(Pageら、1990,J.Virol.,64:5370−5276;Buchschalcherら、1992,J.Virol.,66:2731−2739)が挙げられる。バキュロウイルス(Autographa californica多核多角体病ウイルス;AcMNPV)ベクターも使用され得る。ベクターは、商業的供給源(例えば、PharMingen,San Diego,Calif.;Protein Sciences Corp.,Meriden,Conn.;Stratagene,La Jolla,Calif.)から入手され得る。好適なベクターは、例えば、参照により本明細書中に援用される米国公開特許出願番号2010/0247486に開示されている。具体的で非限定的な例において、ベクターは、レトロウイルスベクター(例えば、レンチウイルスベクター)、麻疹ウイルスベクター、アルファウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、アデノウイルスおよびポリオウイルスベクターである。
リン酸カルシウム共沈殿のようなDNAのトランスフェクション方法、従来の機械的方法(例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームに包まれたプラスミドの挿入またはウイルスベクター)が、使用され得る。真核細胞はまた、抗体、標識された抗体またはそれらの機能的フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列、および選択可能な表現型をコードする第2の外来DNA分子(例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子)で同時に形質転換され得る。
ウイルス遺伝子送達系は、RNAベースまたはDNAベースのウイルスベクターであり得る。エピソーム遺伝子送達系は、プラスミド、エプスタイン・バーウイルス(EBV)ベースのエピソームベクター、酵母ベースのベクター、アデノウイルスベースのベクター、サルウイルス40(SV40)ベースのエピソームベクター、ウシパピローマウイルス(BPV)ベースのベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。
マーカーとしては、蛍光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質)、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼまたはホタル/ウミシイタケルシフェラーゼまたはnanoluc)または他のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。マーカーは、タンパク質(分泌タンパク質、細胞表面タンパク質または内部タンパク質を含み;細胞によって合成されるかまたは取り込まれる);核酸(例えば、mRNAまたは酵素的に活性な核酸分子)または多糖であり得る。目的の細胞型のマーカーに特異的な、抗体、レクチン、プローブまたは核酸増幅反応によって検出可能な任意のそのような細胞構成要素の決定因子が含められる。それらのマーカーは、生化学的アッセイもしくは酵素アッセイ、または遺伝子産物の機能に応じた生物学的応答によっても識別され得る。これらのマーカーをコードする核酸配列は、チロシナーゼエンハンサーに作動可能に連結され得る。さらに、他の遺伝子(例えば、RPEの分化またはRPEの機能もしくは生理機能または病態について幹細胞に影響し得る遺伝子)も含められ得る。したがって、いくつかの実施形態において、MITF、PAX6、TFEC、OTX2、LHX2、VMD2、CFTR、RPE65、MFRP、CTRP5、CFH、C3、C2B、APOE、APOB、mTOR、FOXO、AMPK、SIRT1−6、HTRP1、ABCA4、TIMP3、VEGFA、CFI、TLR3、TLR4、APP、CD46、BACE1、ELOLV4、ADAM10、CD55、CD59およびARMS2のうちの1つ以上をコードする核酸が、含められる。
マーカーに作動可能に連結されたチロシナーゼプロモーターを必要に応じて含むiPSCは、胚様体(EB)が形成されるような条件下で培養される。EBを作製するための方法は、当該分野で公知である。いくつかの実施形態において、EBは、懸濁培養において作製される:未分化なiPSCを、短時間のコラゲナーゼ消化によって回収し、クラスターに解離し、非接着性細胞培養プレートにおいて培養する。EBは、約36〜約72時間(例えば、約48時間)培養され、次いで、プレーティングされる。いくつかの例において、培地は、この期間中、交換されない。
理論に拘束されるものではないが、EBは、未分化な幹細胞上で高度に発現されるCa2+依存性接着分子E−カドヘリンの同種親和性結合によって形成される。iPSCは、特定の条件下で単一細胞として培養されるとき、自発的に凝集して、EBを形成する。そのような自発的な形成は、大量懸濁培養において生じることが多く、それにより、ディッシュを、寒天または親水性ポリマーなどの非接着性材料でコーティングすることが、培養基材への接着ではなく単一細胞間の優先的な接着を促進する。単一細胞への解離を回避するために、接着コロニー(またはコロニーの領域)を手作業で分離し、続いて、懸濁培養することにより、EBが、iPSCから形成され得る。懸濁物中でのEBの形成は、多量のEBの形成に適しているが、得られる凝集物のサイズの調節がそれほどできず、不揃いな形の大きなEBになることが多い。代替法として、iPSCが、大量の懸濁物に接種されるとき、混合培養プラットフォームにおいて付与される流体力が、EBサイズの均一性を高める。
いくつかの実施形態において、約150〜約600個の細胞(例えば、約200〜約500個の細胞、例えば、約200〜約500個の細胞)を含むEBが、選択される。追加の実施形態において、EBは、約500個未満の細胞(例えば、約450個未満の細胞または約400個未満の細胞)を含む。さらなる実施形態において、EBは、500個未満の細胞(例えば、450個未満の細胞または400個未満の細胞)を含む。他の実施形態において、約200〜約400個のEB(例えば、約100〜約200個のEB、例えば、約100〜約150個のEB)が、標準的な6ウェル組織培養プレートの各ウェルにプレーティングされる。この文脈において、「約」は、20個以内の細胞または胚様体を意味する。
次いで、EBは、2つのWnt経路阻害剤および1つのNodal経路阻害剤を含む第1の培地中で培養される。Wnt経路阻害剤およびNodal経路阻害剤を含む第1の培地は、網膜細胞誘導培地であり得る。例示的で非限定的な培地は、血清の非存在下における、約1:1の比のダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)およびF12である。ノックアウトDMEMなどの他の組織培養液もまた使用され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、約36〜約50時間、例えば、約48時間培養される。追加の例示的な培地は、実施例の項に開示される。
Wnt経路阻害剤は、例えば、N−(2−アミノエチル)−5−クロロイソキノリン−8−スルホンアミド(CK1−7)、3,5,7,8−テトラヒドロ−2−[4−(トリフルオロメチル)フェニル]−4H−チオピラノ[4,3−d]ピリミジン−4−オン(XAV939)、分泌フリズルド関連タンパク質(SFRP)1、sFRP1(GENBANK(登録商標)アクセッション番号AF001900.1)、sFRP2(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_003013.2)、sFRP3(GENBANK(登録商標)アクセッション番号U91903.1)、sFRP4(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_003014.3)およびsFRP5(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_003015.3,)、SFRP−3、SFRP−4またはSFRP−5であり得る。2013年1月1日に入手可能であるとおりのこれらのGENBANK(登録商標)配列は、参照により本明細書中に援用される。SFRPは、約5ng/ml〜100ng/ml(例えば、約(a out)10ng/ml〜約90mg/ml、例えば、約20ng/ml〜約80ng/ml)の濃度で含められ得る。いくつかの実施形態において、第1の培地は、約3〜約10mMのCK1−7二塩化物(dicloride)(N−(2−アミノエチル)−5−クロロイソキノリン−8−スルホンアミド二塩酸塩)、例えば、約3.5〜約9mMのCK1−7または約4〜約8mMのCK1−7を含む。
Nodal経路阻害剤は、例えば、4−(5−ベンゾール[1,3]ジオキソール−5−イル−4−ピリジン(pyrldin)−2−イル−1H−イミダゾール−2−イル)−ベンズアミド水和物、4−[4−(1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−5−(2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−2−イル]−ベンズアミド水和物、4−[4−(3,4−メチレンジオキシフェニル)−5−(2−ピリジル)−1H−イミダゾール−2−イル]−ベンズアミド水和物(SB−431542)、左右決定因子(Lefty)または2−(5−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル−2−tert−ブチル−3H−イミダゾール−4−イル)−6−メチルピリジン塩酸塩水和物(SB−505124)であり得る。いくつかの実施形態において、第1の培地は、約3〜約10mMのSB43152、例えば、約3.5〜約9mMのSB43152または約4〜約8mMのSB43152を含む。
細胞は、第1の培地中で、約36〜72時間、例えば、約48時間培養される。例えば、約36〜約72時間、例えば、約48時間にわたる第1の培地中での培養の後、EBは、第2の培地中の組織培養基材上にプレーティングされる。いくつかの実施形態において、組織培養基材は、MATRIGEL(登録商標)でコーティングされる。第2の培地は、外来性のベータ線維芽細胞成長因子(growth fact)(bFGF)を含まない。第2の培地は、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)阻害剤、2つのWnt経路阻害剤および1つのNodal経路阻害剤も含む。例示的な培地は、実施例の項に開示される。
好適なWnt経路阻害剤およびNodal阻害剤は、上に開示されている。好適なbFGF阻害剤としては、N−[(2R)−2,3−ジヒドロキシプロポキシ]−3,4−ジフルオロ−2−[(2−フルオロ−4−ヨードフェニル)アミノ]−ベンズアミド(PD0325901)、N−[2−[[4−(ジエチルアミノ)ブチル]アミノ−6−(3,5−ジメトキシフェニル)ピリド[2,3−d]ピリミジン−7−イル]−N’−(1,1−ジメチルエチル)尿素(PD173074)、2−(2−アミノ−3−メトキシフェニル)−4H−1−ベンゾピラン−4−オン(PD98059)、1−tert−ブチル−3−[6−(2,6−ジクロロフェニル)−2−[[4−(ジエチルアミノ)ブチル]アミノ]ピリド[2,3−d]ピリミジン−7−イル]尿素(PD161570)または6−(2,6−ジクロロフェニル)−2−[[4−[2−(ジエチルアミノ)エトキシ]フェニル]アミノ]−8−メチル−ピリド[2,3−d]ピリミジン−7(8H)−オン二塩酸塩水和物(PD166285)が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、第2の培地は、約0.2〜約2.5mMのPD0325901(例えば、約0.5〜約2mMのPD0325901、例えば、約1〜約2mMのPD0325901)を含む。1つの具体的で非限定的な例において、第2の培地は、約3.5〜約9mMのCK1−7および約3.5〜約9mMのSB431542(例えば、約5mMのSB431542)を含む。
第2の培地は、約20〜約90ngのNoggin(例えば、約30〜約90ngのNoggin、例えば、約40〜約80ngのNoggin、例えば、約50ng/mlのNoggin)を含み得る。
第2の培地は、形成のために、約0.5%〜約3.5%、例えば、約1〜約3%、例えば、約2〜約3%のKNOCKOUT(商標)血清代替物も含み得る。KNOCKOUT(商標)血清代替物は、例えば、米国特許出願公開番号2002/076747およびPCT公開番号98/830679(両方が、参照により本明細書中に援用される)に開示されており、分化中の網膜色素上皮細胞を作製するために、LIFE TECHNOLOGIES(商標)から商業的に入手可能である。
塩基性線維芽細胞成長因子(FGF−2としても知られるbFGF)の阻害剤としては、N−[(2R)−2,3−ジヒドロキシプロポキシ]−3,4−ジフルオロ−2−[(2−フルオロ−4−ヨードフェニル)アミノ]−ベンズアミド(PD0325901)、N−[2−[[4−(ジエチルアミノ)ブチル]アミノ−6−(3,5−ジメトキシフェニル)ピリド[2,3−d]ピリミジン−7−イル]−N’−(1,1−ジメチルエチル)尿素(PD173074)、2−(2−アミノ−3−メトキシフェニル)−4H−1−ベンゾピラン−4−オン(PD98059)、1−tert−ブチル−3−[6−(2,6−ジクロロフェニル)−2−[[4−(ジエチルアミノ)ブチル]アミノ]ピリド[2,3−d]ピリミジン−7−イル]尿素(PD161570)または6−(2,6−ジクロロフェニル)−2−[[4−[2−(ジエチルアミノ)エトキシ]フェニル]アミノ]−8−メチル−ピリド[2,3−d]ピリミジン−7(8H)−オン二塩酸塩水和物(PD166285)が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、第2の培地は、約0.5〜約2mMのPD0325901(例えば、約1〜約2mMのPD0325901、例えば、約1.5〜約2mMのPD0325901、例えば、約1mMのPD0325901)を含む。
いくつかの実施形態において、細胞は、約18〜約24日間(例えば、約20〜約22日間、例えば、約18、19、20、21、22、23または24日間)、第2の培地中で培養される。他の実施形態において、細胞は、約14日間から約4週間の期間にわたって、例えば、約14日間〜約3週間、例えば、約2週間、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20または約21日間、第2の培地中で培養される。具体的で非限定的な例は、14日間から3週間、1週間から2週間、1週間から10日間、1週間から3週間、または1週間、2週間もしくは3週間である。この文脈において、「約」は、列挙された時間の1日以内を示唆する。
PD325901、Nogginおよび/またはDKK1の例示的な濃度の具体的で非限定的な例は、図8〜10に示される。いくつかの実施形態において、上記方法は、第2の培地中で約1〜約2週間培養された細胞におけるPax6の発現を、最初の細胞集団と比べて増加させる。ある特定の実施形態において、細胞は、bFGF阻害剤の非存在下および存在下、ならびにNogginの存在下において培養される。非限定的な例としては、約10mM PD0325901および約50〜約100ng/mlのNogginが挙げられる。追加の例は、図8に示される。必要に応じて、培地は、約50〜100ng/mlのDKK1(例えば、約75m 80、85、90、95または100ng/mlのDKK1)を含み得る。いくつかの実施形態において、Pax6の発現は、1週間培養した後に、出発細胞と比べて、少なくとも150、160、170、180、190、200、210、220、230、240倍増加する。他の実施形態において、Pax6の発現は、1〜2週間培養した後に、出発細胞における発現と比べて、少なくとも400、450、500または600倍増加する。なおも他の実施形態において、Pax6の発現は、1〜3週間培養した後に、出発細胞における培養前の細胞(例えば、培養の0日目の胚様体)における発現と比べて、少なくとも500、600、700、800または900倍増加する。
なおも他の実施形態において、小眼球症関連転写因子(MITF,2013年1月1日に入手可能であるとおりのGENBANKアクセッション番号NG_011631.1,参照により本明細書中に援用される)の発現は、1週間培養した後に、第2の培地中で培養する前の細胞における発現と比べて、少なくとも4、5、6、7、8、9または10倍増加する。他の実施形態において、MITFの発現は、1〜2週間培養した後に、第2の培地中で培養する前の細胞における発現と比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、9または10倍増加する。なおも他の実施形態において、MITFの発現は、1〜3週間培養した後に、出発細胞(例えば、培養の0日目の胚様体)における発現と比べて、少なくとも6、7、8、9、10、20、30、40、45または50倍増加する。
いくつかの実施形態において、チロシナーゼエンハンサープロモーターからの発現は、増加する。したがって、いくつかの実施形態において、チロシナーゼ(tyrosinanse)エンハンサーに作動可能に連結されたマーカーをコードする核酸の発現が、増加する。例えば、マーカーの発現は、少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%増加し得る。
次いで、得られた分化中のRPE細胞は、第3の培地に移される。いくつかの実施形態において、第3の培地は、約50〜約300ng/mlのACTIVIN A(例えば、約100〜約200ng/mlのACTIVIN A、例えば、約150〜約200ng/mlのACTIVIN A、例えば、約150ng/mlのActivin A)を含む。さらなる実施形態において、第3の培地は、約75〜150ng/mlのWnt3a(例えば、約100〜150ng/mlのWnt3a、例えば、約110〜140ng/mlのWnt3a、例えば、約100ng/ml)を含む。この文脈において、約は、2ng/ml以内を意味する。
いくつかの実施形態において、細胞は、約18〜約24日間(例えば、約20〜約22日間、例えば、約18、19、20、21、22、23または24日間)、第3の培地中で培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、約14日間から約4週間の期間にわたって、例えば、約14日間〜約3週間、例えば、約2週間、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20または約21日間、第3の培地中で培養される。具体的で非限定的な例は、14日間から3週間、1週間から2週間、1週間から10日間、1週間から3週間、または1週間、2週間もしくは3週間である。この文脈において、「約」は、列挙された時間の1日以内を示唆する。
第3の培地中での培養の後、細胞は、約3〜約6パーセントの血清、例えば、約5パーセントの血清を含む第4の培地中で培養される。いくつかの実施形態において、その血清は、ウシ胎仔血清である。他の実施形態において、その血清は、ヒト血清である。RPE培地は、分化したRPE細胞を作製するために、カノニカルWNT阻害剤、非カノニカルWNT誘導物質ならびにSonic経路およびFGF経路の阻害剤を含む。
この培地は、カノニカルWNT阻害剤、非カノニカルWNT誘導物質ならびにSonic経路およびFGF経路の阻害剤も含む。さらなる実施形態において、カノニカルWNT阻害剤は、Dickkopf関連タンパク質である。いくつかの例において、この培地は、約50〜約200ng/mlのDickkopf関連タンパク質1(DKK1)、例えば、約50〜約100ng/mlのDKK1、例えば、約40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90または100ng/mlのDKK1を含む。いくつかの実施形態において、非カノニカルWNT誘導物質(induce)は、Want5aである。1つの例において、第4の培地は、約50〜約200ng/mlの非カノニカル(non−cannonical)WNT誘導物質、例えば、WNT5a、例えば、約50〜約100ng/ml、例えば、約40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90または100ng/mlを含む。別の例において、第4の培地は、約5〜約20μMシクロパミン(Cycolopamine)(例えば、約5〜10μMシクロパミン、例えば、約5、6、7、8、9または10μMシクロパミン)を含む。なおも別の(aother)実施形態において、第4の培地(medicum)は、約5〜約20μM SU5402(例えば、約5〜10μM SU5402、例えば、約5、6、7、8、9または10μM SU5402)を含む。
細胞は、約10〜約20日間(例えば、約10、11、12、13、14、15、16、17、18もしくは19日間、例えば、約2週間、または約12〜約16日間)、第4の培地中で培養され得る。
いくつかの実施形態において、細胞は、3〜約6%血清(例えば、約3%〜約6%ヒト血清またはウシ胎仔血清、例えば、約3%、4%、5%もしくは6%ウシ胎仔血清)を含む第4の培地中でも培養される。
本明細書中に開示される方法によって作製される網膜色素上皮細胞は、アフィディコリンを含む第4の培地中で6〜8週間、培養される。いくつかの実施形態において、網膜色素上皮細胞は、例えば、約3μM〜約10μMの濃度のアフィディコリンを含む組織培養液中で培養される。追加の実施形態において、網膜色素上皮細胞は、約3μM、約4μM、約5μM、約6μM、約7μM、約8μM、約9μMまたは約10μMアフィディコリンを含む組織培養液中で培養される。網膜色素上皮細胞は、アフィディコリンを含む組織培養液中で約4〜約6週間(例えば、約4週間、約5週間または約6週間)、培養され得る。いくつかの実施形態において、アフィディコリンの使用は、網膜色素上皮細胞の分極(polarization)を高めるために十分である。
本明細書中に開示される方法は、RPE細胞を効率的に作製する。したがって、本明細書中に開示される方法を用いるとき、得られる細胞の少なくとも約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%が、RPE細胞である。いくつかの実施形態において、蛍光タンパク質などのマーカーに作動可能に連結されたチロシナーゼエンハンサーを含む構築物が、iPSCに含められる。本明細書中に開示される方法を用いるとき、細胞の少なくとも約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%が、このマーカーを発現する。
第4の培地中での培養の後、RPE細胞は、培養液中で維持され得る。いくつかの実施形態において、RPE細胞は、約3〜約6%血清(例えば、約3%、約4%、約5%または約6%血清)を含む含むRPE培地(上記を参照のこと)中で維持される。その血清は、胎児血清であり得る。いくつかの非限定的な例において、血清は、ウシ胎仔血清である。他の実施形態において、血清は、ヒト血清である。RPE細胞は、約3%〜約6%血清(例えば、約5%血清、例えば、約5%胎児血清)を含むRPE培地中で約6〜約8週間、維持され得る。いくつかの実施形態において、RPE細胞は、6ウェル、12ウェル、24ウェルまたは10cmプレートなどにおけるトランスウェルにおいて生育される。網膜色素上皮細胞は、約5%胎児血清を含む網膜色素上皮細胞(RPE)培地中で、約4〜約10週間(例えば、約6〜約8週間、例えば、6、7または8週間)、維持され得る。
上記方法は、得られた細胞がRPE細胞であることを確かめる工程も含み得る。この確かめるための方法は、下記に開示される。
RPE細胞の薬学的組成物および使用
RPE細胞の薬学的組成物および使用
ヒトRPE細胞を含む薬学的組成物などの組成物が、本明細書中に開示される。ある特定の実施形態において、その調製物は、iPSC由来RPE細胞(例えば、胎仔RPE細胞(例えば、ヒト胎児RPE細胞)から作製されたiPSCに由来するRPE細胞であるがこれに限定されない)の調製物である。ある特定の実施形態において、これらの組成物は、本明細書中に開示される方法によって作製された分化したRPE細胞を含む実質的に精製された(非RPE細胞に対して)調製物である。これらの実質的に精製された集団は、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはなおも99%超のRPE細胞を含む組成物である。したがって、その組成物は、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%未満または1%未満の、RPE細胞でない細胞を含む。ある特定の実施形態において、組成物は、少なくとも約1×103個のRPE細胞、約1×104個のRPE細胞、約1×105個のRPE細胞、約1×106個のRPE細胞、約1×107個のRPE細胞、約1×108個のRPE細胞または約1×109個のRPE細胞を含む。
ある特定の実施形態において、上記細胞は、下記の表1に列挙される遺伝子の1つ以上を発現する。
上記細胞は、これらの遺伝子のうちの少なくとも50、100、150、200、250、300、350、360、370個またはすべてを発現し得る。いくつかの実施形態において、上記細胞は、MITF(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000248)、PAX6(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000280)、LHX2(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_004789)、TFEC(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_012252)、CDH1(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_004360)、CDH3(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_001793)、CLDN10(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_182848)、CLDN16(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_006580)、CLDN19(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_148960)、BEST1(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_004183)、TIMP3(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000362)、TRPM1(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_002420)、TRPM3(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_020952)、TTR(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000371)、VEGFA(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_003376)、CSPG5(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_006574)、DCT(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_001922)、TYRP1(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000550)、TYR(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000372)、SILV(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_006928)、SIL1(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_022464)、MLANA(NM_005511)、RAB27A(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_183236)、OCA2(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000275)、GPR143(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000273)、GPNMB(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_002510)、MYO6(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_004999)、MYRIP(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_015460)、RPE65(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000329)、RBP1(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_002899)、RBP4(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_006744)、RDH5(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_002905)、RDH11(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_016026)、RLBP1(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000326)、MERTK(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_006343)、ALDH1A3(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000693)、FBLN1(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_001996)、SLC16A1(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_003051)、KCNV2(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_133497)、KCNJ13(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_002242)およびCFTR(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000492)を発現する。他の実施形態において、RPE細胞は、これらのタンパク質のうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、38、39、40個またはすべてを発現する。2013年1月31日に入手可能であるとおりのGENBANK(登録商標)の開示が、参照により本明細書中に援用される。
いくつかの実施形態において、RPE細胞は、MITF、PAX6、LHX2、TFEC、CDH1、CDH3、CLDN10、CLDN16、CLDN19、BEST1、TIMP3、TRPM1、TRPM3、TTR、VEGFA、CSPG5、DCT、TYRP1、TYR、SILV、SIL1、MLANA、RAB27A、OCA2、GPR143、GPNMB、MYO6、MYRIP、RPE65、RBP1、RBP4、RDH5、RDH11、RLBP1、MERTK、ALDH1A3、FBLN1、SLC16A1、KCNV2、KCNJ13およびCFTRを発現する。
さらなる実施形態において、RPE細胞は、1つ以上のマイクロRNA(mciroRNAs)も発現する。具体的で非限定的な例において、それらの細胞は、表2に列挙されるマイクロRNA(mircorRNAs)のうちの1つ以上を発現する。
したがって、いくつかの実施形態において、上記細胞は、表2に列挙されたmiRNAのうちの少なくとも2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、95個または96個すべてを発現する。1つの具体的で非限定的な例において、上記細胞は、miR204およびmiR211を発現する。
コントロール遺伝子としては、下記の表3に列挙される遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
これらの遺伝子は、RPE細胞およびコントロール細胞において発現される。したがって、いくつかの実施形態において、RPE細胞は、これらのマーカーのうちの1つ以上を発現する。RPE細胞は、これらのマーカーのうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはすべてを発現し得る。
なおも他の実施形態において、RPE細胞は、約−50〜約−60mVの静止電位および約5〜約10μlcm−2h−1の流体輸送速度を有する。追加の実施形態において、RPE細胞は、MITF、PAX6、LHX2、TFEC、CDH1、CDH3、CLDN10、CLDN16、CLDN19、BEST1、TIMP3、TRPM1、TRPM3、TTR、VEGFA、CSPG5、DCT、TYRP1、TYR、SILV、SIL1、MLANA、RAB27A、OCA2、GPR143、GPNMB、MYO6、MYRIP、RPE65、RBP1、RBP4、RDH5、RDH11、RLBP1、MERTK、ALDH1A3、FBLN1、SLC16A1、KCNV2、KCNJ13およびCFTRを発現し、miR204およびmiR211を発現し、約−50〜約−60mVの静止電位を有し、約5〜約10μlcm−2h−1の流体輸送速度を有する。
重合体キャリアおよび/または細胞外マトリックスなどの足場ならびに有効量の本明細書中に開示されるRPE細胞を含む組成物もまた提供される。その細胞外(extraceullar)マトリックスは、ヒト細胞外マトリックスであり得る。その重合体粒子は、微小粒子であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は、単層として提供される。
種々の生物学的なまたは合成の固体マトリックス材(すなわち、固体支持マトリックス、生物学的接着剤または包帯材、および生物学的/医療用足場)が、使用に適している。マトリックス材は、通常、生理的に許容され得るものであり、インビボ用途での使用に適している。そのような生理的に(physiolgocially)許容され得る材料の非限定的な例としては、吸収性および/または非吸収性の固体マトリックス材(例えば、小腸粘膜下組織(SIS)、例えば、ブタ由来(および他のSIS起源));架橋されたまたは架橋されていないアルギネート、親水コロイド、フォーム、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、ポリグリコール酸(PGA)メッシュ、ポリグラクチン(PGL)メッシュ、フリースおよび生体接着剤(例えば、フィブリン糊およびフィブリンゲル)が挙げられるが、これらに限定されない。上記ポリマーは、ポリ(DL)−乳酸−co−グリコール酸)(PLGA)であり得る(Luら、J.Biomater Sci Polym Ed.9(11):1187−205,1998を参照のこと)。他の実施形態において、マトリックス(matric)は、ポリ(L−乳酸)(PLLA)およびポリ(D,L−乳酸−co−グリコール酸)(PLGA)(例えば、約90:10、75:25、50:50、25:75、10:90(PLLA:PLGA)というコポリマー比を有するもの)を含む(Thomsonら、J.Biomed.Mater Res.A 95:1233−42,2010を参照のこと)。
好適な重合体キャリアには、合成または天然のポリマーから形成された多孔性のメッシュまたはスポンジ、ならびにポリマー溶液も含まれる。マトリックスの1つの非限定的な形態は、重合体のメッシュまたはスポンジである。別の非限定的な例は、高分子ヒドロゲルである。使用され得る天然ポリマーには、タンパク質(例えば、コラーゲン、アルブミンおよびフィブリン);および多糖類(例えば、アルギネートおよびヒアルロン酸のポリマー)が含まれる。合成ポリマーには、生分解性ポリマーと非生分解性ポリマーの両方が含まれる。生分解性ポリマーの例としては、ヒドロキシ酸(例えば、ポリ乳酸(PLA)、ポリグリコール酸(PGA)およびポリ乳酸−グリコール酸(PLGA))のポリマー、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼンおよびそれらの組み合わせが挙げられる。非生分解性ポリマーとしては、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、エチレンビニルアセテートおよびポリビニルアルコールが挙げられる。
展性である、イオン性のヒドロゲルまたは共有結合的に架橋されたヒドロゲルを形成し得るポリマーが、使用され得る。ヒドロゲルは、有機ポリマー(天然または合成)が、共有結合、イオン結合または水素結合を介して架橋されることにより、水分子を捕捉してゲルを形成する3次元の開いた格子構造をもたらすときに形成される物質である。ヒドロゲルを形成するために使用され得る材料の例としては、イオンで架橋される多糖類(例えば、アルギネート、ポリホスファジンおよびポリアクリレート)、またはブロックコポリマー(例えば、PLURONICS(商標)またはTETRONICS(商標))、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマー(これらはそれぞれ温度またはpHによって架橋される)が挙げられる。他の材料としては、フィブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどのポリマー、ヒアルロン酸およびコラーゲンが挙げられる。
通常、これらのポリマーは、水溶液(例えば、水、緩衝塩溶液または荷電側基を有するアルコール水溶液)に少なくとも部分的に可溶性であるか、またはその一価イオン塩である。陽イオンと反応し得る酸性側基を有するポリマーの例は、ポリ(ホスファゼン)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、ポリ(酢酸ビニル)およびスルホン化ポリマー(例えば、スルホン化ポリスチレン)である。アクリル酸またはメタクリル酸およびビニルエーテルのモノマーまたはポリマーの反応によって形成される酸性側基を有するコポリマーもまた、使用され得る。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化(好ましくは、フッ素化)アルコール基、フェノールOH基および酸性OH基である。陰イオンと反応し得る塩基性側基を有するポリマーの例は、ポリ(ビニルアミン)、ポリ(ビニルピリジン)、ポリ(ビニルイミダゾール)およびいくつかのイミノ置換ポリホスファゼンである。それらのポリマーのアンモニウム塩または第4級塩は、骨格の窒素またはペンダントイミノ基からも形成され得る。塩基性側基の例は、アミノ基およびイミノ基である。
上記基材に適した材料の非限定的な例としては、パリレンポリプロピレン、ポリイミド、ガラス、ニチノール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、コラーゲン、化学的に処理されたコラーゲン、ポリエーテルスルホン(PES)、ポリ(グリセロール−セバシン酸)PGS、ポリ(スチレン−イソブチル−スチレン)、ポリウレタン、酢酸ビニルエチル(EVA)、ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)、Kynar(ポリフッ化ビニリデン;PVDF)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、Pebax、アクリル(acrylic)、ポリオレフィン、ポリジメチルシロキサン(PDMS)および他のシリコーンエラストマー、ポリプロピレン、ヒドロキシアパタイト(hydroxyapetite)、チタン、金、銀、白金、他の金属および合金、セラミックス、プラスチックならびにそれらの混合物または組み合わせが挙げられる。ある特定の実施形態の基材を構築するために使用される追加の好適な材料としては、ポリ−パラ−キシリレン(例えば、パリレンA、パリレンAM、パリレンC、アンモニア処理パリレン、ポリドーパミンで処理されたパリレンCを含むがこれらに限定されないパリレン)、ポリ(乳酸)(PLA)、ポリエチレン−酢酸ビニル、ポリ(乳酸−co−グリコール酸)(PLGA)、ポリ(D,L−ラクチド)、ポリ(D,L−ラクチド−co−トリメチレンカーボネート)、コラーゲン、ヘパリン処理されたコラーゲン、変性コラーゲン、修飾コラーゲン(例えば、ゼラチンを伴うシリコーン)、他の細胞成長マトリックス(例えば、SYNTHEMAX(商標))、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(グリコール酸)、および/あるいは他のポリマー、コポリマーもしくはブロックコポリマー、環状のアルギニン−グリシン−アスパラギンを含むポリ(カプロラクトン)、環状もしくは直鎖状のアルギニン−グリシン−アスパラギン酸、ポリカプロラクトンとポリエチレングリコールとの混和物(PCL−PEG)、熱可塑性ポリウレタン、シリコーン修飾ポリエーテルウレタン、ポリ(カーボネートウレタン)またはポリイミドが挙げられるが、これらに限定されない。熱可塑性ポリウレタンは、脂肪族ポリウレタン、芳香族ポリウレタン、ポリウレタンヒドロゲル形成材料、親水性ポリウレタンまたはそれらの組み合わせを含み得るポリマーまたはコポリマーである。非限定的な例としては、エラスタン(elasthane)(ポリ(エーテルウレタン))、例えば、ELASTHANE(商標)80A、Lubrizol、TECOPHILIC(商標)、PELLETHANE(商標)、CARBOTHANE(商標)、TECOTHANE(商標)、TECOPLAST(商標)およびESTANE(商標)が挙げられる。シリコーン修飾ポリエーテルウレタンには、CARBOSIL(商標)20またはPURSIL(商標)20 80Aなどが含まれ得る。ポリ(カーボネートウレタン)には、BIONATE(商標)80Aまたは同様のポリマーが含まれ得る。さらに、いくつかの実施形態において、基材(および/または細胞)は、基材および細胞の凍結保存(および解凍)によって影響されない、インサイチュで基材の可視化を可能にする材料(または化学物質)を含む。
本明細書中に開示される方法によって作製される網膜色素上皮細胞は、凍結保存され得る。例えば、参照により本明細書中に援用されるPCT公開番号2012/149484A2を参照のこと。それらの細胞は、基材ありまたはなしで凍結保存され得る。いくつかの実施形態において、貯蔵温度は、約−50℃〜約−60℃、約−600℃〜約−70℃、約−70℃〜約−80℃、約−80℃〜約−90℃、約−90℃〜約−100℃およびその重複する範囲に及ぶ。いくつかの実施形態において、より低い温度が、凍結保存された細胞の貯蔵(例えば、維持)のために使用される。いくつかの実施形態において、液体窒素(または他の類似の冷却液)が、細胞を貯蔵するために使用される。さらなる実施形態において、細胞は、約6時間超、貯蔵される。さらなる実施形態において、細胞は、約72時間貯蔵される。いくつかの実施形態において、細胞は、48時間〜約1週間貯蔵される。なおも他の実施形態において、細胞は、約1、2、3、4、5、6、7または8週間貯蔵される。さらなる実施形態において、細胞は、1、2、3、4、5、67、8、9、10、11または12ヶ月間貯蔵される。細胞は、それより長い時間にわたっても貯蔵され得る。細胞は、別々にまたは本明細書中に開示される任意の基材などの基材上で凍結保存され得る。
任意の細胞型(例えば、iPSCを含む幹細胞および網膜色素上皮細胞などの分化した細胞)の凍結保存のために使用され得る、細胞を凍結保存する一般的な方法が、本明細書中に開示される。その方法は、アルギネートの使用を含む。「アルギネート」(または「アルギン酸」または「アルギン」)とは、褐藻類の細胞壁に広く分布している陰イオン性の多糖のことを指す。アルギネートは、アルカリ金属(例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、マグネシウム)、アンモニウム、および低級アミン(例えば、メチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミンおよびトリエタノールアミン)から得られる置換アンモニウム陽イオンと水溶性の塩を形成する。アルギネートには、アルギン酸カルシウム、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレン−グリコールおよびアルギン酸カリウムが含まれる。
いくつかの実施形態において、開示される網膜色素上皮細胞などの細胞を、有効量のアルギネートと接触させる。それらの細胞を、アルギネートと接触させ、次いで、二価の陽イオン(例えば、カルシウム、バリウム、銅、亜鉛またはストロンチウム)に曝露し、それにより、細胞/液体アルギネート懸濁物中にアルギネートポリマーの架橋がもたらされる(例えば、参照により本明細書中に援用される米国公開特許出願番号2012/0171295を参照のこと)。ある特定の実施形態において、細胞/液体アルギネート溶液中でアルギネートを架橋するために使用される二価の陽イオンは、塩化カルシウム(CaCl2)、塩化バリウム(BaCl2)、塩化ストロンチウム(stromium chloride)(SrCl2)、塩化銅(CuCl2)または塩化亜鉛(ZnCl2)である。具体的な実施形態において、細胞/液体アルギネート溶液中でアルギネートを架橋するために使用される二価の陽イオンは、塩化カルシウム(CaCl2)である。ある特定の実施形態において、二価の陽イオンの溶液は、約0.5%、約0.75%、約1.0%、約1.25%、約1.5%、約1.75%または約2.0%の二価の陽イオンを含む。具体的な実施形態において、二価の陽イオンの溶液は、1.5%の二価の陽イオン、例えば、CaCl2を含む。
いくつかの実施形態において、追加の凍結保護物質が、使用され得る。例えば、細胞は、1つ以上の凍結保護物質(例えば、DMSO、血清アルブミン、例えば、ヒトまたはウシの血清アルブミン)を含む凍結保存溶液中に凍結保存され得る。ある特定の実施形態において、その溶液は、約1%、約1.5%、約2%、約2.5%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%または約10%DMSOを含む。他の実施形態において、その溶液は、約1%〜約3%、約2%〜約4%、約3%〜約5%、約4%〜約6%、約5%〜約7%、約6%〜約8%、約7%〜約9%または約8%〜約10%のDMSOまたはアルブミンを含む。具体的な実施形態において、その溶液は、2.5%DMSOを含む。別の具体的な実施形態において、その溶液は、10%DMSOを含む。
細胞は、小さい容器(例えば、アンプル);凍結保存に適したバッグ;または凍結保存用の他の任意の好適な容器の中で凍結保存され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、商業的に入手可能な凍結保存媒質中で凍結保存される。細胞は、細胞を貯蔵する際に使用するための1つ以上の溶液を含む凍結保存溶液中で凍結保存され得る。凍結保存溶液には、CryoStor CS10(登録商標)およびHYPOTHERMOSOl(登録商標)(BioLife Solutions,Bothell,Wash.))が含まれた。ある特定の実施形態において、その溶液は、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%または約70%HYPOTHERMOSOL(登録商標)を含む。他の実施形態において、その溶液は、約25%〜約50%、約40%〜約60%、約50%〜約60%、約50%〜約70%または約60%〜約70%HYPOTHERMOSOL(登録商標)を含む。具体的な実施形態において、その溶液は、55%HYPOTHERMOSOL(登録商標)を含む。別の具体的な実施形態において、その溶液は、57.5%HYPOTHERMOSOL(登録商標)を含む。さらなる実施形態において、凍結保存溶液は、1つ以上の賦形剤(例えば、デキストラン、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、シリカゲル、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレンおよび/またはグリコール)を含み得る。凍結保存溶液は、本明細書中に開示される培地などの培地を含み得る。追加の実施形態において、その培地は、リン酸緩衝食塩水またはダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)であり得る。
細胞は、凍結保存中に、例えば、約1℃/分で冷却され得る。いくつかの実施形態において、凍結保存温度は、約−80℃〜約−180℃または約−125℃〜約−140℃である。いくつかの実施形態において、細胞は、4℃に冷却された後、約1℃/分で冷却される。凍結保存された細胞は、使用するために解凍する前に、液体窒素の気相に移され得る。いくつかの実施形態において、例えば、細胞が、約−80℃に達したら、それらは、液体窒素貯蔵区域に移される。凍結保存は、速度制御冷凍庫を使用しても行われ得る。凍結保存された細胞は、例えば、約25℃〜約40℃の温度、代表的には、約37℃の温度で解凍され得る。
本明細書中に記載されるヒトRPE細胞またはこれらの細胞を含む薬学的組成物は、ある症状を処置する必要のある患者においてそのような処置を行うための医薬の製造のために使用され得る。それらのRPE細胞は、予め凍結保存され得る。開示されるRPE細胞は、iPSCに由来し、ゆえに、眼疾患を有する患者に「個別化医療」を提供するために使用され得る。いくつかの実施形態において、患者から得られた体細胞は、疾患を引き起こす変異を訂正するように遺伝的に操作され、RPEに分化され、RPE組織を形成するように操作され得る。このRPE組織は、同じ患者の内在性の変性したRPEを置き換えるために使用され得る。あるいは、iPSCは、健常ドナーまたはHLAがホモ接合性の「スーパードナー」から作製され得、使用され得る。RPE細胞は、インビトロにおいて、ある特定の因子(例えば、色素上皮由来因子(PEDF)、トランスフォーミング成長因子(TGF)−ベータおよび/またはレチノイン酸)で処理されることにより、インビボにおける抗炎症性および免疫抑制性の環境がもたらされ得る。
様々な眼の症状が、本明細書中に開示される方法を用いて得られるRPE細胞の導入によって処置され得るかまたは予防され得る。その症状には、網膜の機能不全もしくは退化、網膜傷害および/または網膜色素上皮の喪失に通常関連する網膜の疾患または障害が含まれる。処置され得る症状としては、網膜の変性疾患(例えば、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、網膜色素変性症、黄斑変性(例えば、加齢黄斑変性)、緑内障および糖尿病性網膜症)が挙げられるがこれらに限定されない。追加の症状としては、レーバー先天性黒内障、遺伝性または後天性黄斑変性、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮、コロイデレミア、パターンジストロフィー(pattern dystrophy)、RPEの他のジストロフィー、ならびに光傷害、レーザー傷害、炎症性傷害、感染性傷害、放射線傷害、新生血管傷害または外傷性傷害のいずれか1つによって引き起こされた損傷に起因するRPEおよび網膜の損傷が挙げられる。ある特定の実施形態において、網膜の変性を特徴とする症状を処置するためまたは予防するための方法が提供され、その方法は、それを必要とする被験体に、RPE細胞を含む有効量の組成物を投与する工程を含む。これらの方法は、これらの症状の1つ以上を有する被験体を選択する工程、ならびにその症状を処置するためおよび/またはその症状の徴候を回復させるために十分な治療有効量のRPE細胞を投与する工程を含み得る。RPE細胞は、様々な形式で移植され得る。例えば、RPE細胞は、細胞懸濁物の形態で、またはマトリックス上、細胞外マトリックス上もしくは基材上、例えば、生分解性ポリマー上に、単層として接着された形態で、あるいはその組み合わせで、標的部位に導入され得る。RPE細胞はまた、光受容体などの他の網膜細胞とともに移植され得る(同時移植)。いくつかの実施形態において、RPE細胞は、処置される被験体由来のiPSCから作製され、ゆえに、自家性である。他の実施形態において、RPE細胞は、MHC一致ドナーから作製される。
RPE細胞は、被験体の眼の中の様々な標的部位に導入され得る。いくつかの実施形態において、RPE細胞は、哺乳動物におけるRPEの解剖学的な位置(光受容体外節と脈絡膜との間)である眼の網膜下腔に移植などによって導入される。さらに、それらの細胞の遊走能および/または正のパラクリン作用に応じて、眼のさらなる区画(例えば、硝子体腔、網膜の内側または外側、網膜周辺部および脈絡膜内)への導入が、考えられ得る。
上記細胞は、当該分野で公知の様々な手法によって導入され得る。RPE移植を行うための方法は、例えば、米国特許第5,962,027号、米国特許第6,045,791号および米国特許第5,941,250号;Biochem Biophys Res Commun Feb.24,2000;268(3):842−6;およびOpthalmic Surg February 1991;22(2):102−8)に開示されている。角膜移植を行うための方法は、例えば、米国特許第5,755,785号;Curr Opin Opthalmol August 1992;3(4):473−81;Ophthalmic Surg Lasers April 1998;29(4):305−8;およびOpthalmology April 2000;107(4):719−24に記載されている。いくつかの実施形態において、移植は、経毛様体扁平部(pars pana)硝子体切除術の後、小さな網膜開口部を通じて網膜下腔に、または直接的な注射によって、RPE細胞を送達することによって、行われる。あるいは、RPE細胞は、経強膜的、経脈絡膜的アプローチを介して網膜下腔に送達され得る。さらに、硝子体腔(vitreal space)への直接的な経強膜注射または毛様体に近接した前側の網膜周辺部(anterior retinal periphery)への送達が、行われ得る。
上記細胞はまた、送達デバイスに組み込まれ得る。主にパラクリン作用が用いられるべきである場合、細胞は、宿主免疫系に対するその細胞の曝露を減少させる半透性の容器内に被包された状態で眼に送達され、維持され得る(Neurotech USA CNTF送達系;PNAS.103(10)3896−3901,2006)。
RPE細胞は、細胞懸濁物の形態で、細胞外マトリックスなどのマトリックス上に接着された形態で、または生分解性ポリマーなどの基材上に提供された形態で、標的部位に導入され得る。RPE細胞はまた、光受容体を有する網膜細胞などの他の細胞とともに移植され得る(同時移植)。したがって、本明細書中に開示される方法によって得られたRPE細胞を含む組成物が、提供される。いくつかの実施形態において、これらのRPE細胞は、プロモーターおよびマーカーをコードする核酸に作動可能に連結されたチロシナーゼエンハンサーを含む。他の実施形態において、RPE細胞は、第2のマーカーをコードする核酸に作動可能に連結された第2の構成的プロモーターも含む。
スクリーニング方法およびRPE細胞の識別
RPE細胞を識別するためおよび/またはある細胞がRPE細胞であることを確かめるための方法も提供される。それらの細胞は、本明細書中に開示される方法を用いて作製され得る。
RPE細胞を識別するためおよび/またはある細胞がRPE細胞であることを確かめるための方法も提供される。それらの細胞は、本明細書中に開示される方法を用いて作製され得る。
RPE細胞の分化および/または増殖を変化させる作用物質を同定するための方法が、本明細書中に提供される。いくつかの実施形態において、RPE細胞の増殖を変化させる作用物質を同定するための方法が、提供される。それらの方法は、RPE細胞を有効量の目的の作用物質と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態において、RPEの分化を増加させる作用物質を同定するための方法が、提供される。
追加の実施形態において、RPE細胞の生存に影響する作用物質および/またはRPE細胞における遺伝子の内因性の発現を変化させる作用物質を同定するための方法が、提供される。疾患を処置するための治療薬が、これらの方法を用いて同定され得る。いくつかの実施形態において、RPE細胞の上皮の表現型に影響する作用物質を同定するための方法が、提供される。その方法は、iPSC、RPEまたは胚様体を目的の作用物質と接触させる工程、ならびにRPE細胞の作製および/または生存および/または表現型をアッセイする工程を含む。その作用物質は、本明細書中に開示される方法の任意の工程に導入され得る。
本明細書中に開示される方法を用いて作製されたRPE細胞または他のRPE細胞もまた、ある作用物質と接触させられ、下記に開示される方法を用いて評価され得る。これらの方法は、遺伝子の発現に影響する作用物質を同定するため、またはRPE細胞の生存に影響する作用物質を同定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、RPE細胞は、ストレッサー(例えば、サプシガルジン、A23187、DL−ジチオトレイトールまたは2−デオキシ−D−グルコース)で処理される。
試験化合物は、化学的化合物、小分子、ポリペプチド、成長因子、サイトカインまたは他の生物学的作用物質(例えば、抗体)を含む、関心のある任意の化合物であり得る。いくつかの例では、潜在的な神経栄養物質のパネルが、スクリーニングされる。他の実施形態では、ポリペプチドバリアントのパネルが、スクリーニングされる。
いくつかの実施形態において、目的の作用物質が網膜色素上皮細胞の分化を増加させるかを判定するための方法が、提供される。その方法は、上で開示されたような、網膜色素上皮細胞特異的プロモーターに作動可能に連結された第1のマーカーをコードする核酸を含み、かつ構成的プロモーターに作動可能に連結された第2のマーカーを含む、ヒト人工多能性幹細胞から作製された胚様体を、2つのWnt経路阻害剤および1つのNodal経路阻害剤を含む第1の培地中で培養する工程を含む。それらの胚様体は、(a)ベータ線維芽細胞成長因子(bFGF)を含まず、(b)塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)阻害剤、2つのWnt経路阻害剤および1つのNodal経路阻害剤を含み;(c)約20〜約90ngのNogginを含む第2の培地中の組織培養基材上にプレーティングされることにより、分化中の網膜色素上皮細胞が形成される。それらの分化中の網膜色素上皮細胞は、ACTIVAN AおよびWNT3aを含む第3の培地中で培養される。次いで、それらの細胞は、約5%胎児血清、カノニカルWNT阻害剤、非カノニカルWNT誘導物質ならびにSonic経路およびFGF経路の阻害剤を含む第4の網膜色素上皮細胞(RPE)培地中で培養されることにより、ヒト網膜色素上皮細胞が作製される。好適な方法が、本明細書中に開示される。
これらの工程のうちの1つ、いくつかまたはすべてが、目的の作用物質の存在下において行われる。網膜色素上皮細胞における第1のマーカーの発現が、第2のマーカーの発現と比較され、ここで、第2のマーカーと比べて、第1のマーカーの発現の増加は、その作用物質が、網膜色素上皮細胞の分化を増加させることを示す。
所望の活性について試験することができる分子のコンビナトリアルライブラリーを調製するための方法は、当該分野で周知であり、それらとしては、例えば、拘束されたペプチドであり得るペプチドのファージディスプレイライブラリー(例えば、米国特許第5,622,699号;米国特許第5,206,347号;Scott and Smith,Science 249:386−390,1992;Marklandら、Gene 109:13−19,1991を参照のこと)、ペプチドライブラリー(米国特許第5,264,563号);FDAに承認された薬物ライブラリー(例えば、Huang,E;Southall,N;Wang,Yら、Science Translational Medicine 3:1−12を参照のこと);ペプチド模倣物ライブラリー(Blondelleら、Trends Anal Chem.14:83−92,1995);核酸ライブラリー(O’Connellら、Proc.Natl Acad.Sci.,USA 93:5883−5887,1996;Tuerk and Gold,Science 249:505−510,1990;Goldら、Ann.Rev.Biochem.64:763−797,1995);オリゴ糖ライブラリー(Yorkら、Carb.Res.285:99−128,1996;Liangら、Science 274:1520−1522,1996;Dingら、Adv.Expt.Med.Biol.376:261−269,1995);リポタンパク質ライブラリー(de Kruifら、FEBS Lett.3 99:23 2−23 6,1996);糖タンパク質ライブラリーもしくは糖脂質ライブラリー(Karaogluら、J Cell Biol.130.567−577,1995);または例えば薬物もしくは他の医薬品を含む化学物質ライブラリー(Gordonら、J Med.Chem.37.1385−1401,1994;Ecker and Crooke,BioTechnology 13:351−360,1995)を作製する方法が挙げられる。細胞のポリペプチドを含む細胞の標的に対して結合特異性を有する核酸分子が、天然に存在し、そのような特異性を有する合成分子は、容易に調製および同定され得るので、ポリヌクレオチドは、細胞(例えば、iPSC、胚様体およびRPE細胞であるがこれらに限定されない)の機能を変化させ得る作用物質として特に有用であり得る(例えば、米国特許第5,750,342号を参照のこと)。
1つの実施形態において、ハイスループットの形式の場合、iPSC、胚様体またはRPE前駆体は、マルチウェルプレートまたはスライドガラスまたはマイクロチップのウェルに導入され得、試験物質と接触され得る。一般に、細胞および溶液を操るため、ならびに幹細胞または前駆細胞を、特に、調べている機能に関して、モニターするために、ロボット工学を都合よく使用できるように、それらの細胞は、整列させて、特に、アドレス可能に整列させて、配置される。ハイスループットの形式を使用する利点は、いくつかの試験物質を並行して調べることができる点、および所望であれば、コントロール反応を試験条件と同一の条件下で行うこともできる点である。したがって、本明細書中に開示される方法は、細胞の機能を変化させ得る作用物質、例えば、細胞が所望の細胞型に分化するように誘導する作用物質、または分化、生存および/もしくは細胞増殖に影響する作用物質を同定するために、1つ、数個または多数の試験物質をスクリーニングする手段を提供する。表現型および生存を評価するために、ハイスループットスクリーニングが使用され得る。これらのスクリーニングは、RPEの表現型および生存に影響し得る薬物を同定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、RPEの表現型は、蛍光シグナルの喪失/獲得によってアッセイされ、生存は、(例えば、ATPベースの細胞力価グローアッセイ(cell titer glow assay)によって)アッセイされる。
これらの方法は、表1、表Aまたは図27Cに列挙されている遺伝子のうちの1つ以上の発現を評価する工程を含み得る。いくつかの実施形態において、表1に列挙されている遺伝子のうちの50、100、150、200、250、300、350、360、370個またはすべての発現が、評価され得る。これらのいずれの方法の場合も、MITF(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000248)、PAX6(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000280)、LHX2(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_004789)、TFEC(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_012252)、CDH1(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_004360)、CDH3(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_001793)、CLDN10(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_182848)、CLDN16(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_006580)、CLDN19(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_148960)、BEST1(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_004183)、TIMP3(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000362)、TRPM1(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_002420)、TRPM3(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_020952)、TTR(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000371)、VEGFA(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_003376)、CSPG5(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_006574)、DCT(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_001922)、TYRP1(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000550)、TYR(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000372)、SILV(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_006928)、SIL1(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_022464)、MLANA(NM_005511)、RAB27A(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_183236)、OCA2(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000275)、GPR143(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000273)、GPNMB(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_002510)、MYO6(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_004999)、MYRIP(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_015460)、RPE65(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000329)、RBP1(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_002899)、RBP4(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_006744)、RDH5(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_002905)、RDH11(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_016026)、RLBP1(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000326)、MERTK(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_006343)、ALDH1A3(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000693)、FBLN1(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_001996)、SLC16A1(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_003051)、KCNV2(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_133497)、KCNJ13(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_002242)およびCFTR(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000492)のRNAまたはタンパク質のうちの1つ以上の発現が、評価される。2013年1月31日に入手可能であるとおりのGENBANK(登録商標)の開示が、参照により本明細書中に援用される。上記作用物質と接触していないiPSCまたは胚様体と比べたときの、上記作用物質に曝露した後の1つ以上のmRNAまたはタンパク質の発現の増加は、その作用物質が、RPE細胞の分化、生存および/または増殖に影響すること、詳細には、RPE細胞の分化、生存および/または増殖を増加させることを示唆する。上記作用物質と接触していないiPSCまたは胚様体と比べたときの、上記作用物質に曝露した後の1つ以上のmRNAまたはタンパク質の発現の減少は、その作用物質が、RPE細胞の分化、生存および/または増殖に影響すること、詳細には、RPE細胞の分化、生存および/または増殖を減少させることを示唆する。
他の実施形態において、これらのmRNAまたはタンパク質のうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、38、39、40個またはすべてが、評価される。これらのmRNAまたはタンパク質のうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、38、39、40個またはすべての発現の増加は、その作用物質が、RPE細胞の分化、生存および/または増殖を増加させることを示唆する。これらのmRNAまたはタンパク質のうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、38、39、40個またはすべての発現の減少は、その作用物質が、RPE細胞の分化、生存および/または増殖を減少させることを示唆する。
いくつかの実施形態において、MITF、PAX6、LHX2、TFEC、CDH1、CDH3、CLDN10、CLDN16、CLDN19、BEST1、TIMP3、TRPM1、TRPM3、TTR、VEGFA、CSPG5、DCT、TYRP1、TYR、SILV、SIL1、MLANA、RAB27A、OCA2、GPR143、GPNMB、MYO6、MYRIP、RPE65、RBP1、RBP4、RDH5、RDH11、RLBP1、MERTK、ALDH1A3、FBLN1、SLC16A1、KCNV2、KCNJ13およびCFTRの発現が、評価される。発現の増加は、その作用物質が、RPE細胞の分化、生存または増殖を増加させることを示唆する。発現の減少は、その作用物質が、RPE細胞の分化、生存または増殖を減少させることを示唆する。これらのマーカーの1つまたは組み合わせの発現もまた、ある細胞がRPE細胞であることを確かめるために使用され得る。
追加の実施形態において、表2に列挙されているmiRNAのうちの少なくとも2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、95個または96個すべての発現が、評価される。さらなる実施形態において、miR204(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NR_029621.1,2012年12月9日,参照により本明細書中に援用される)および/またはmiR211(GENBANK(登録商標)アクセッション番号NR_029624.1,2012年9月23日,参照により本明細書中に援用される)の産生が、評価される。これらのマイクロRNAの一方または両方の産生の増加は、その作用物質が、RPE細胞の分化および/もしくは増殖に影響することを示唆するか、またはその細胞がRPEであることを確証させる。発現の増加は、その作用物質が、RPE細胞の分化、生存または増殖を増加させることを示唆する。発現の減少は、その作用物質が、RPE細胞の分化、生存または増殖を減少させることを示唆する。これらのmiRNAは、上に開示された核酸を検出するための例示的な方法を用いて、検出され得る。
他の実施形態において、表3に列挙されている遺伝子のうちの1つ以上の発現もまた、評価される。これらの遺伝子の発現は、対照基準などのコントロールとして使用され得る。したがって、いくつかの実施形態において、これらの遺伝子の発現は、目的の作用物質の存在下でも変化しない。これらの遺伝子は、対照基準としても使用され得る。
なおも他の実施形態において、図27Cに列挙されている分子のうちの1つ以上の発現が、評価される。したがって、いくつかの実施形態において、図27Cに列挙されている分子のうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個が、評価される。追加の実施形態において、表Aに列挙されている分子のうちの1つ以上の発現が、評価される。表Aに列挙されている分子のうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36または37個の発現が、評価され得る。
なおも他の実施形態において、SOX2(例えば、GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_003106)、PAX6(例えば、GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_001604)、RPE65(例えば、GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000329)、RDH5(例えば、GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_000329)、TRPM1(例えば、GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_002420)およびBEST1(例えば、GENBANK(登録商標)アクセッション番号NM_004183)のうちの1つ以上の発現が、評価される(2013年1月31日に入手可能であるとおりのGENBANK(登録商標)アクセッション情報のすべてが、参照により援用される)。いくつかの実施形態において、未分化なiPSCと比べて、iPSC由来RPEは、より低レベルの神経前駆体因子SOX2、ならびにより高レベルのRPE特異的遺伝子PAX6、RPE65、RDH5、TRPM1およびBEST1を発現する。
上記方法は、目的の作用物質が、iPSCからRPE細胞への分化を増加させるかを判定する工程を含み得る。その作用物質が、RPE細胞への分化を増加させる場合、コントロールと比べて、そのサンプルにおいて、SOX2の発現は減少し、かつPAX6、RPE65、RDH5、TRPM1およびBEST1の発現は増加する。別の実施形態において、コントロールと比べて、そのサンプルにおいて、SOX2の発現は減少し、かつPAX6、RPE65、RDH5、TRPM1およびBEST1のうちの2、3、4または5つの発現が、増加する。そのコントロールは、標準的な値であり得るか、またはRPE細胞への分化を増加させないと知られている作用物質と接触されたサンプルであり得る。それらの方法は、目的の作用物質が、iPSCからRPE細胞への分化を減少させるがゆえに、そのiPSCを未分化な状態で維持するかを判定するも含み得る。その作用物質が、RPE細胞への分化を減少させる場合、コントロールと比べて、SOX2の発現は増加し、かつPAX6、RPE65、RDH5、TRPM1およびBEST1の発現は減少する。別の実施形態において、その作用物質が、RPE細胞への分化を減少させた場合、コントロール比べて、そのサンプルにおいて、SOX2の発現は増加し、かつPAX6、RPE65、RDH5、TRPM1およびBEST1のうちの2、3、4または5つの発現は減少する。そのコントロールは、標準的な値であり得るか、またはRPE細胞への分化を増加させると知られている作用物質と接触された(construed)サンプルであり得る。例示的な非限定的なアッセイが、実施例8に開示される。
核酸は、当該分野で公知の任意の方法によって検出され得る。いくつかの例において、核酸は、検出の前に、単離されるか、増幅されるか、またはその両方が行われる。ある例において、細胞またはその画分(例えば、精製された核酸)が、1つ以上のmRNAの増幅を可能にするプライマーとともに、そのような産物の増幅を可能にするのに十分な条件下でインキュベートされ得る。例えば、生物学的サンプルは、開示される核酸配列(例えば、cDNA、ゲノムDNAまたはRNA(例えば、mRNA)の1つ以上に結合し得るプライマーまたはプローブとともに、高ストリンジェンシー条件下でインキュベートされる。次いで、得られたハイブリダイゼーションは、当該分野で公知の方法を用いて検出され得る。
核酸サンプルは、増幅され得る。定量的な結果が望まれる場合、増幅された核酸の相対的な頻度に対して維持するかまたは調節する方法が、用いられる。「定量的」増幅の方法は、当業者に周知である。例えば、定量的PCRは、同じプライマーを使用して、既知量のコントロール配列を同時に共増幅することを含む。これにより、そのPCR反応を較正するために使用され得る内標準が提供される。次いで、アレイは、増幅された核酸の定量のための内標準に特異的なプローブを含み得る。
好適な増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Innisら、PCR Protocols,A guide to Methods and Application,Academic Press,Inc.San Diego,1990を参照のこと)、リガーゼ連鎖反応(LCR)(Wu and Wallace,Genomics 4:560,1989;Landegrenら、Science 241:1077,1988;およびBarringerら、Gene 89:117,1990を参照のこと)、転写増幅(Kwohら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:1173,1989)および自家持続配列複製法(Guatelliら、Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.87:1874,1990)が挙げられるが、これらに限定されない。1つの実施形態において、サンプルmRNAは、逆転写酵素ならびにオリゴdTおよびファージT7プロモーターをコードする配列からなるプライマーを用いて逆転写されることにより、一本鎖DNA鋳型(「第1鎖(first strand)」と呼ばれる)が提供される。第2のDNA鎖は、DNAポリメラーゼを使用して重合される。二本鎖cDNAの合成の後、T7RNAポリメラーゼが加えられ、そのcDNA鋳型からRNAが転写される。単一の各cDNA鋳型からの連続した数回の転写によって、増幅されたRNAがもたらされる。
インビトロで重合する方法は、当業者に周知である(例えば、Sambrook,前出;Van Gelderら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1663−1667,1990を参照のこと)。直接的な転写方法は、アンチセンス(aRNA)プールを提供する。アンチセンスRNAが、標的核酸として使用される場合、アレイとして提供されるオリゴヌクレオチドプローブは、そのアンチセンス核酸の部分配列に対して相補的であるように選択される。逆に、標的核酸プールが、センス核酸のプールである場合、そのオリゴヌクレオチドプローブは、そのセンス核酸の部分配列に対して相補的であるように選択される。最後に、核酸プールが、二本鎖である場合、プローブは、標的核酸がセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含むので、いずれかのセンスであってよい。
1つの実施形態において、ハイブリダイズされた核酸は、サンプル核酸に付着された1つ以上の標識を検出することによって検出される。それらの標識は、いくつかの任意の方法によって組み込まれ得る。1つの例において、標識は、サンプル核酸の調製における増幅工程中に同時に組み込まれる。したがって、例えば、標識されたプライマーまたは標識されたヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、標識された増幅産物を提供し得る。1つの実施形態において、標識されたヌクレオチド(例えば、フルオレセイン標識されたUTPおよび/またはCTP)を使用する、上に記載されたような転写増幅は、転写された核酸に標識を組み込む。いくつかの実施形態において、マルチプレックスPCRアッセイが、使用される。そのアッセイは、マルチプレックスアッセイであり得る。
遺伝子発現の発現を評価するための例示的なアッセイが、図27に示されている。このアッセイでは、第1の目的の遺伝子に特異的な第1のプローブが、第1の検出可能なビーズに付着されている。このアッセイが、マルチプレックスアッセイになるように、追加の(Addition)プローブが、このアッセイに含められ得る。したがって、このアッセイは、第2の検出可能な標識に付着された第2の目的の遺伝子に特異的な第2のプローブ、第3の検出可能な標識に付着された第3の目的の遺伝子に特異的な第3のプローブなどを含み得る(an include)。いくつかの実施形態において、単一ウェルは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30個のプローブを含み得、そのプローブの各々が、異なる目的の遺伝子に特異的であり、各々が、ユニークな検出可能な標識に付着される。この様式では、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30個の遺伝子の発現を、各アッセイにおいて評価することができる。例示的なプローブは、図27Bに示されている。
あるいは、標識は、元の核酸サンプル(例えば、mRNA、ポリA mRNA、cDNAなど)または増幅が完了した後の増幅産物に、直接付加され得る。核酸に標識を付着させる手段は、当業者に周知であり、それらとしては、例えば、ニックトランスレーションまたは核酸のリン酸化(kinasing)による末端標識(例えば、標識されたRNAを用いる)、およびそれに続く、サンプル核酸を標識(例えば、フルオロフォア)につなぎ合わせる核酸リンカーの付着(ライゲーション)が挙げられる。
用途に適した検出可能な標識としては、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物が挙げられる。有用な標識としては、標識されたストレプトアビジン結合体で染色するためのビオチン、磁気ビーズ(例えば、DYNABEADS(商標))、蛍光色素(例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など)、放射標識(例えば、3H、125I、35S、14Cまたは32P)、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびELISAにおいて通常使用されるその他の酵素)および比色標識(colorimetric labels)(例えば、コロイド金または色ガラス)またはプラスチック(例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど)のビーズが挙げられる。そのような標識の使用を教示している特許としては、米国特許第3,817,837号;米国特許第3,850,752号;米国特許第3,939,350号;米国特許第3,996,345号;米国特許第4,277,437号;米国特許第4,275,149号;および米国特許第4,366,241号が挙げられる。
そのような標識を検出するための手段もまた、周知である。したがって、例えば、放射標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出され得、蛍光マーカーは、放射光を検出する光検出器を用いて検出され得る。酵素標識は、代表的には、その酵素に基質を提供して、その基質に対する酵素の作用によって生成される反応産物を検出することによって検出され、比色標識は、単純に有色の標識を可視化することによって検出される。
標識は、ハイブリダイゼーションの前または後に標的(サンプル)核酸に付加され得る。いわゆる「直接的な標識」は、ハイブリダイゼーションの前に標的(サンプル)核酸に直接付着されるまたは組み込まれる検出可能な標識である。対照的に、いわゆる「間接的な標識」は、ハイブリダイゼーション後にハイブリッド二重鎖につなぎ合わされる。しばしば、間接的な標識は、ハイブリダイゼーションの前に標的核酸に付着されている結合部分に付着される。したがって、例えば、標的核酸は、ハイブリダイゼーションの前にビオチン化され得る。ハイブリダイゼーション後に、アビジンに結合体化されたフルオロフォアが、ビオチンを有するハイブリッド二重鎖に結合して、容易に検出される標識がもたらされ得る(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Vol.24:Hybridization With Nucleic Acid Probes,P.Tijssen,ed.Elsevier,N.Y.,1993を参照のこと)。
核酸ハイブリダイゼーションは、単純に、プローブおよびその相補的な標的が、相補的な塩基対形成によって、安定したハイブリッド二重鎖を形成し得る条件下に、変性されたプローブおよび標的核酸を提供する工程を含む。次いで、ハイブリッド二重鎖を形成しない核酸が、洗浄除去されて、代表的には付着された検出可能な標識の検出によって検出されるハイブリダイズした核酸が残る。核酸は、温度を上げることによってまたはその核酸を含む緩衝液の塩濃度を下げることによって、変性されることが広く認識されている。低ストリンジェンシー条件下(例えば、低温および/または高塩)では、アニールした配列が完璧に相補的でない場合でさえ、ハイブリッド二重鎖(例えば、DNA:DNA、RNA:RNAまたはRNA:DNA)が形成され得る。したがって、より低いストリンジェンシーでは、ハイブリダイゼーションの特異性は低下する。逆に、より高いストリンジェンシー(例えば、より高い温度またはより少ない塩)では、ハイブリダイゼーションの成功には、より少ないミスマッチが要求される。
当業者は、ハイブリダイゼーション条件が、種々の程度のストリンジェンシーを提供するようにデザインされ得ることを認識するだろう。1つの実施形態において、ハイブリダイゼーションは、確実にハイブリダイゼーションが行われるために、低ストリンジェンシー、この場合、37℃の6×SSPE−T(0.005%Triton X−100)において行われ、次いで、ミスマッチのハイブリッド二重鎖を排除するために、その後の洗浄が、より高いストリンジェンシー(例えば、37℃の1×SSPE−T)において行われる。所望のレベルのハイブリダイゼーションの特異性が得られるまで、徐々にストリンジェンシーを高めながら(例えば、37℃から50℃において、0.25×SSPE−Tもの低さにまで低下させて)、連続した洗浄が行われ得る。ストリンジェンシーは、ホルムアミドなどの作用物質を加えることによっても、高められ得る。ハイブリダイゼーションの特異性は、試験プローブへのハイブリダイゼーションと、存在し得る様々なコントロール(例えば、発現レベルコントロール、正規化コントロール、ミスマッチコントロールなど)へのハイブリダイゼーションとの比較によって評価され得る。
一般に、ハイブリダイゼーションの特異性(ストリンジェンシー)とシグナル強度との間には、相反関係が存在する。したがって、1つの実施形態において、洗浄は、一貫した結果をもたらし、バックグラウンド強度のおよそ10%より高いシグナル強度を提供する最も高いストリンジェンシーで行われる。したがって、ハイブリダイズされたアレイは、引き続いてより高いストリンジェンシー溶液で洗浄され得、各洗浄の間に読み出され得る。このようにして生成されたデータセットの解析は、ハイブリダイゼーションパターンが感知できるほど変化しない、目的の特定のオリゴヌクレオチドプローブに対して適切なシグナルを提供する、上記の洗浄のストリンジェンシーを明らかにするだろう。これらの工程は、商業的に入手可能なアレイシステムに対して標準化されている。
ハイブリダイゼーションの結果を評価するための方法は、使用された特異的なプローブ核酸ならびに提供されたコントロールの性質によって変化する。1つの実施形態では、各プローブに対する蛍光強度の単純な定量が行われる。これは、アレイ上の(異なるプローブに相当する)各位置におけるプローブのシグナル強度を計測することによって単純に達成される(例えば、その標識が、蛍光標識である場合、アレイ上の各位置における規定の励起照度によってもたらされる蛍光(florescence)の量(強度)の検出)。「試験」サンプル由来(例えば、治療プロトコルで処置された患者由来)の核酸にハイブリダイズされたアレイの絶対強度と、「コントロール」サンプル(例えば、その治療プロトコルで処置される前の同じ患者由来)によって生成された強度との比較によって、各プローブにハイブリダイズする核酸の相対的な発現の尺度が提供される。
例えば、これらの方法によって検出される発現の変化は、例えば、異なる治療に対して異なり得、その変化には、そのような核酸のレベル(量)もしくは機能活性、それらのタンパク質への発現もしくは翻訳、またはそれらの局在化もしくは安定性の増加または減少が含まれ得る。増加または減少は、例えば、特定の核酸の発現の約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍の変化(増加または減少)であり得る。
いくつかの例において、ある作用物質の有効性、またはRPE細胞の作製、またはRPE細胞の識別は、単離された核酸分子をアレイに適用することによって行われ、ここで、その単離された核酸分子は、目的の作用物質で処理した後などに、RPE細胞を含む生物学的サンプルから得られる。そのような例において、アレイは、上に開示された核酸に相補的なオリゴヌクレオチドを含む。
ある例において、単離された核酸分子は、単離された核酸分子とオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な時間にわたって、上に開示された核酸分子に相補的なオリゴヌクレオチドを含むアレイとともにインキュベートされ、それにより、単離された核酸分子:オリゴヌクレオチド複合体が形成される。次いで、単離された核酸分子:オリゴヌクレオチド複合体を解析することにより、その単離された核酸分子の発現が変化しているかが判定される。そのような例では、ある作用物質を評価することにより、それが、コントロール(その作用物質と接触していないそのような細胞)または参照値と比べて、分子の発現に影響するかが調べられる。
RPE細胞を作製するためまたはRPE細胞を識別するための作用物質の有効性を識別するために使用され得る遺伝子発現プロファイルが、本明細書中に開示される。ある例では、その遺伝子発現プロファイルは、上に列挙された分子のうちの少なくとも2つ(例えば、列挙された分子のうちの少なくとも5つ、少なくとも7つ、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個またはすべて)を含む。いくつかの例において、遺伝子発現プロファイルは、少なくとも2つ、少なくとも5つ、少なくとも7つ、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも35個または少なくとも40個の分子(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40個または41個すべての分子)を含む。1つの具体的で非限定的な例において、遺伝子発現プロファイルは、MITF、PAX6、LHX2、TFEC、CDH1、CDH3、CLDN10、CLDN16、CLDN19、BEST1、TIMP3、TRPM1、TRPM3、TTR、VEGFA、CSPG5、DCT、TYRP1、TYR、SILV、SIL1、MLANA、RAB27A、OCA2、GPR143、GPNMB、MYO6、MYRIP、RPE65、RBP1、RBP4、RDH5、RDH11、RLBP1、MERTK、ALDH1A3、FBLN1、SLC16A1、KCNV2、KCNJ13およびCFTRを含む。
さらなる実施形態において、遺伝子発現プロファイルは、表2に列挙されているmiRNAのうちの少なくとも2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、95個または96個すべてを含む。1つの具体的で非限定的な例において、遺伝子発現プロファイルは、miR204およびmiR211を含む。さらなる実施形態において、遺伝子発現プロファイルは、表1および表2に列挙されているマーカーのうちの少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135個またはすべてを含む。この発現プロファイルは、RPE細胞を検出するため、および/またはある細胞がRPE細胞であることを確かめるために使用され得る。
核酸の存在についてサンプルを解析するための代替案として、タンパク質の存在が、測定され得る。タンパク質は、当該分野で公知の任意の方法によって検出され得る。いくつかの例において、タンパク質は、検出前に精製される。例えば、発現を検出するために、ある作用物質の作用は、iPSC、胚様体またはRPE細胞などの細胞を、上に列挙された分子のうちの1つに特異的に結合する1つ以上の抗体とともに、免疫複合体を形成するのに十分な長さの時間にわたってインキュベートすることによって、測定され得る。1次抗体は、検出可能な標識を含み得る。例えば、1次抗体が、直接標識され得るか、またはその後に、サンプルが、標識された(例えば、蛍光標識で)二次抗体とともにインキュベートされ得る。次いで、その標識が、例えば、顕微鏡法、ELISA、フローサイトメトリー(flow cytometery)または分光測定法によって、検出され得る。別の例において、生物学的サンプルは、ウエスタンブロッティングによって、特定の分子の存在または非存在について解析される。他の例では、生物学的サンプルは、質量分析によって、特定の分子の存在または非存在について解析される。他の例では、上に列挙された分子に特異的に結合する第1の抗体は、標識されず、第1の抗体に特異的に結合し得る第2の抗体または他の分子が、標識される。当業者に周知であるように、第1の抗体の特定の種およびクラスに特異的に結合することができる第2の抗体が、選択される。例えば、第1の抗体が、ヒトIgGである場合、二次抗体は、抗ヒトIgGであり得る。抗体に結合し得る他の分子としては、プロテインAおよびプロテインG(これらの両方ともが商業的に入手可能である)が挙げられるがこれらに限定されない。二次抗体は、免疫複合体を形成するのに十分な時間にわたって、細胞とともにインキュベートされる。
抗体または二次抗体にとって好適な標識としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、磁性物質および放射性材料が挙げられる。好適な酵素の非限定的な例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。好適な補欠分子族複合体の非限定的な例としては、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが挙げられる。好適な蛍光材料の非限定的な例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる。非限定的な例示的な発光材料は、ルミノールであり;非限定的な例示的な磁性物質は、ガドリニウムであり、非限定的な例示的な放射性標識としては、125I、131I、35Sまたは3Hが挙げられる。
代替の例において、生物学的サンプル中のタンパク質は、検出可能な物質、および所望の分子に特異的に結合する未標識の抗体で標識されたタンパク質標準物質(分子)を使用する競合イムノアッセイによってアッセイされ得る。このアッセイでは、細胞、標識された分子標準物質およびその分子に特異的に結合する抗体が、混和され、未標識の抗体に結合した標識された分子標準物質の量が、測定される。生物学的サンプル中の分子の量は、その分子に特異的に結合する抗体に結合した標識された分子標準物質の量に反比例する。
なおも他の実施形態では、細胞の静止電位が評価される。いくつかの実施形態において、約−50〜約−60mVの静止電位および約5〜約10μlcm−2h−1の流体輸送速度は、その細胞がRPE細胞であることを示す。追加の実施形態において、MITF、PAX6、LHX2、TFEC、CDH1、CDH3、CLDN10、CLDN16、CLDN19、BEST1、TIMP3、TRPM1、TRPM3、TTR、VEGFA、CSPG5、DCT、TYRP1、TYR、SILV、SIL1、MLANA、RAB27A、OCA2、GPR143、GPNMB、MYO6、MYRIP、RPE65、RBP1、RBP4、RDH5、RDH11、RLBP1、MERTK、ALDH1A3、FBLN1、SLC16A1、KCNV2、KCNJ13およびCFTRを発現し、miR204およびmiR211を発現し、かつ約−50〜約−60mVの静止電位を有する細胞の作製。ある特定の実施形態において、目的の作用物質との接触後の、これらの特徴を有する細胞の数の増加は、その作用物質が、RPE細胞の増殖および/または分化を増加させることを示す。
追加の実施形態において、細胞の流体輸送が、測定される。細胞の流体輸送は、静電容量計を使用して計測され得る。いくつかの実施形態において、単層組織として生育された細胞は、改変されたUssingsチャンバーにマウントされ、電気容量を計測する探針が、使用される。細胞層のいずれかの側の流体の体積が変化する場合、それらの探針の電気容量は、変化する。これは、体積の変化および流体の流れを計算するために使用され得る。いくつかの例において、約5〜約10μlcm−2h−1の流体輸送速度などの約5〜約15μlcm−2h−1の流体輸送速度は、その細胞がRPE細胞であることを示す。
細胞が頂端側のATP処理または基底側のIFNガンマ処理によって流体の流れを可逆的に増加させる能力が、計測され得る。これらの応答の両方ともが、基底側上の塩素チャネルを阻害することによって阻害され得る。これらの特性は、その細胞がRPE細胞である(as)ことを判定するために使用され得る。
さらなる例において、細胞の分極が、評価される。したがって、いくつかの実施形態において、RPE細胞の頂端表面の選択的なCO2透過性が、計測される。光受容体は、高濃度のCO2を頂端表面に向かって分泌する(Adijantoら、J Gen Physiol.2009 Jun;133(6):603−22)。ゆえに、この表面は、CO2を捕捉するために進化的に選択されてきた。この機能は、RPE細胞(例えば、トランスウェルにおいて成長しているRPE細胞)の頂端バスまたは基底バス内のCO2濃度を変化させることによって、インビトロで計測され得る。RPE細胞が、CO2を捕捉する場合、それらの細胞は、pHの低下によって応答し、それは、レシオメトリック色素によって計測され得る。
1つの具体的で非限定的な例では、多孔性のポリエステル膜上で生育されたRPE単層を、8μM BCECF−AMを含むリンガー液中でインキュベートする。BCECF−AMとのインキュベーションの後、その組織を、コントロール(5%CO2)リンガー中でさらに30分間インキュベートした後、改変Ussingチャンバーにマウントした。そのUssingチャンバーは、20×対物レンズを備えたaxiovert−200顕微鏡(Carl Zeiss,Inc.)のステージ上に載せられている。そのRPEは、リンガー液(36.5℃において5%CO2で平衡化されている)で連続的に灌流される。励起光子(440/480nm)を、キセノン光源によって生成し、モノクロメーター(Polychrome IV;Photonics)を用いて特定の波長を選択する。放射蛍光シグナルは、光電子増倍管(Thorn EMI)で捕捉される。pHiの較正は、20μMナイジェリシンを含む高K較正溶液(pH6.8、7.2および7.6において)を両方の溶液バスに灌流することによって行われる。
いくつかの実施形態において、RPE細胞の電気的特性の変化が、計測され得る。いくつかの具体的で非限定的な例において、RPE細胞は、多孔性のポリエステル膜上で単層として生育される。経上皮電位は、Ussingチャンバーの頂端バスおよび基底バスの中に配置されたリンガー液寒天(4%wt/vol)橋と直列のカロメル電極対を用いて計測される。そのTEPの記録は、3秒の移動平均である。経上皮抵抗をオームの法則から計算した。
光が、RPE細胞における光受容体にあたると、その光受容体は、カリウム(K)チャネルを閉じることによって脱分極する(Millerら(ed).Encyclopedia of the eye,ELSEVIERを参照のこと)。これにより、光受容体とRPEとの間(網膜下腔)のKイオンの濃度が5mMから1mMに低下する。RPE細胞は、過分極してKチャネルを開けることにより、網膜下のK濃度を5Mmに再上昇させることによって、この濃度の変化に応答する。1〜5mMの範囲は、その細胞がRPE細胞であることを示す。
さらなる実施形態において、MITF、PAX6、LHX2、TFEC、CDH1、CDH3、CLDN10、CLDN16、CLDN19、BEST1、TIMP3、TRPM1、TRPM3、TTR、VEGFA、CSPG5、DCT、TYRP1、TYR、SILV、SIL1、MLANA、RAB27A、OCA2、GPR143、GPNMB、MYO6、MYRIP、RPE65、RBP1、RBP4、RDH5、RDH11、RLBP1、MERTK、ALDH1A3、FBLN1、SLC16A1、KCNV2、KCNJ13およびCFTRを発現し、miR204およびmiR211を発現し、約−50〜約−60mVの静止電位を有し、約5〜約10μlcm−2h−1iの流体輸送速度を有する細胞の作製。ある特定の実施形態において、目的の作用物質との接触後の、これらの特徴を有する細胞の数の増加は、その作用物質が、RPE細胞の増殖および/または分化を増加させることを示す。
本開示は、以下の非限定的な実施例によって例証される。
実施例1
ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)を網膜色素上皮細胞(RPE)に分化させるための例示的な材料および方法
hiPSCの維持および継代
ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)を網膜色素上皮細胞(RPE)に分化させるための例示的な材料および方法
hiPSCの維持および継代
・hiPSCを、ヒト胚性幹細胞(hES)培地+塩基性線維芽細胞成長因子(添加したばかりのbFGF)中のg線照射されたマウス胚線維芽細胞(MEF)上で生育する。
・hiPSCに毎日、hES培地+bFGF(添加したばかり)を、P6の1ウェルあたり1.5mlという10ng/mlという最終濃度まで供給する。
・hiPSCコロニーが、80%コンフルエントになったら、継続した継代のために新しいMEF上に、それらを分割する(1:6)(例えば、6ウェルの1枚のP6プレートが、6枚のP6プレートに拡大される)。
hES培地を吸引する。
PBSで1回洗浄する。
1mlのCTKを加え、+37C恒温器内に10分間置く(時間は、iPSC株によって変動する)。
CTKを吸引する(コロニーがなおもプレートに接着しているか確かめる)。
Ca/Mgを含まない2mlのPBSを加え、+37C恒温器内に5分間置く。
PBSを吸引し、さらに2mlのPBSを加え、+37C恒温器内に5分間置く。
PBSを吸引する(MEFが、PBS中に優先的に引き上げられる)。
1mlのhES培地+(10ng/ml)bFGF(添加したばかり)+(10μM)Rock阻害剤(RI)(添加したばかり)をP6の各ウェルに加える。
1mlピペットマンを使用して、静かに上下にピペット操作することにより、プレートからコロニーを取り出し(シングルセルとならないように努める);細胞を清浄なチューブに移し;さらなる1mlのhES培地+bFGF+RIを各ウェルに加え、プレートを回転させ、上下にピペット操作することにより、残っているコロニーをほぐし;細胞を同じチューブに移し;適切な体積のhES+bFGF+RI培地を細胞に加える(6枚のP6プレートでは、54mlが必要である)。
MEFプレートからフィーダー培地を吸引する。
P6の1ウェルあたり1.5mlの細胞を分配する。
(Rehら、2010,Methods Mol.Biol.;Takahashiら、2001 PLoS One)。
hES培地を吸引する。
PBSで1回洗浄する。
1mlのCTKを加え、+37C恒温器内に10分間置く(時間は、iPSC株によって変動する)。
CTKを吸引する(コロニーがなおもプレートに接着しているか確かめる)。
Ca/Mgを含まない2mlのPBSを加え、+37C恒温器内に5分間置く。
PBSを吸引し、さらに2mlのPBSを加え、+37C恒温器内に5分間置く。
PBSを吸引する(MEFが、PBS中に優先的に引き上げられる)。
1mlのhES培地+(10ng/ml)bFGF(添加したばかり)+(10μM)Rock阻害剤(RI)(添加したばかり)をP6の各ウェルに加える。
1mlピペットマンを使用して、静かに上下にピペット操作することにより、プレートからコロニーを取り出し(シングルセルとならないように努める);細胞を清浄なチューブに移し;さらなる1mlのhES培地+bFGF+RIを各ウェルに加え、プレートを回転させ、上下にピペット操作することにより、残っているコロニーをほぐし;細胞を同じチューブに移し;適切な体積のhES+bFGF+RI培地を細胞に加える(6枚のP6プレートでは、54mlが必要である)。
MEFプレートからフィーダー培地を吸引する。
P6の1ウェルあたり1.5mlの細胞を分配する。
(Rehら、2010,Methods Mol.Biol.;Takahashiら、2001 PLoS One)。
・hiPSCコロニーが、70%コンフルエントになったら、胚様体(EB)を調製する。
hES培地を吸引する。
PBSで1回洗浄する。
P6の1ウェルあたり1mlの1mg/mlコラゲナーゼを加え、+37C恒温器内に15分間置く。
コラゲナーゼを吸引し、1mlのDMEMを加える。
コロニーが壊れてシングルセルにならないように注意しながら、セルリフター(Corning#3008)を用いて静かにコロニーを掻き取る。
1mlピペットマンを用いて、6つすべてのウェルの内容物を1本の15mlコニカルチューブに移す。
さらに1mlのDMEMを各ウェルに加え、そのプレートを回転させ、セルリフターを用いて、残っているコロニーを静かに掻き取り;6つすべてのウェルの内容物を同じチューブに移す(約12mlのDMEM/チューブ)。
細胞凝集物をチューブの底に沈ませる(約2〜5分間または培地が透明になるまで)。
上清(シングルセルおよびMEFを含む)を吸引し、細胞凝集物を10mlのDMEMで洗浄し;凝集物が大きすぎる場合(開始時のiPSCコロニーのサイズに依存する)、10mlピペットで3〜5回上下にピペット操作することにより、凝集物を破壊し;それらをより小さい凝集塊に破壊する。200〜500個の細胞を含むより小さい細胞凝集塊は、より大きな凝集塊と比べて、より高効率でRPEを作製する。より大きな凝集塊は、プレーティングされると、高効率でRPEを形成しない3次元構造をとる。
その細胞凝集物を15mlコニカルチューブの底に沈ませる。
上清を吸引し、細胞凝集物を所望の体積の網膜誘導培地(RIM)+Rock阻害剤(10μM)(通常、8mlのRIM/15mlコニカルチューブ)に再懸濁する。
ノックアウト血清代替物(KSR)の量を10%から1.5%に減少させると、RPEの分化効率が上昇した。
RIM+RI中の凝集物を低接着ディッシュ(Corning#326210cm低接着プレート)に移し、そこでそれらの凝集物は、24時間以内にEBを形成する。
hES培地を吸引する。
PBSで1回洗浄する。
P6の1ウェルあたり1mlの1mg/mlコラゲナーゼを加え、+37C恒温器内に15分間置く。
コラゲナーゼを吸引し、1mlのDMEMを加える。
コロニーが壊れてシングルセルにならないように注意しながら、セルリフター(Corning#3008)を用いて静かにコロニーを掻き取る。
1mlピペットマンを用いて、6つすべてのウェルの内容物を1本の15mlコニカルチューブに移す。
さらに1mlのDMEMを各ウェルに加え、そのプレートを回転させ、セルリフターを用いて、残っているコロニーを静かに掻き取り;6つすべてのウェルの内容物を同じチューブに移す(約12mlのDMEM/チューブ)。
細胞凝集物をチューブの底に沈ませる(約2〜5分間または培地が透明になるまで)。
上清(シングルセルおよびMEFを含む)を吸引し、細胞凝集物を10mlのDMEMで洗浄し;凝集物が大きすぎる場合(開始時のiPSCコロニーのサイズに依存する)、10mlピペットで3〜5回上下にピペット操作することにより、凝集物を破壊し;それらをより小さい凝集塊に破壊する。200〜500個の細胞を含むより小さい細胞凝集塊は、より大きな凝集塊と比べて、より高効率でRPEを作製する。より大きな凝集塊は、プレーティングされると、高効率でRPEを形成しない3次元構造をとる。
その細胞凝集物を15mlコニカルチューブの底に沈ませる。
上清を吸引し、細胞凝集物を所望の体積の網膜誘導培地(RIM)+Rock阻害剤(10μM)(通常、8mlのRIM/15mlコニカルチューブ)に再懸濁する。
ノックアウト血清代替物(KSR)の量を10%から1.5%に減少させると、RPEの分化効率が上昇した。
RIM+RI中の凝集物を低接着ディッシュ(Corning#326210cm低接着プレート)に移し、そこでそれらの凝集物は、24時間以内にEBを形成する。
・48時間後、MATRIGEL(登録商標)でコーティングされたプレート上にEBを均等に分配する。6ウェルプレートの1ウェルあたり150〜250個のEBが、1ウェルあたり250個超のEBと比べて、より高効率でRPEに分化する。より多数のEBは、培養物をコンフルエントにしすぎて、細胞が高効率でRPEに分化しない。
EBを15mlコニカルチューブに移し、静置させる(約2〜5分間)。
上清を吸引する。
適切な体積の網膜分化培地(RDM)をEBに加える。
各ウェルからマトリゲルを吸引し、PBSで1回洗浄する。
等量のEBを各マトリゲルコートウェルに分配し、プレートを回旋させて、ウェルの表面上にEBを均一に分布させる(通常、P6プレートの1ウェルからのEBが、P6プレートの2ウェルにプレーティングされ得る)。
3週間にわたって、培地を1日おきに交換する(例えば、月曜日、水曜日、金曜日に)。
EBを15mlコニカルチューブに移し、静置させる(約2〜5分間)。
上清を吸引する。
適切な体積の網膜分化培地(RDM)をEBに加える。
各ウェルからマトリゲルを吸引し、PBSで1回洗浄する。
等量のEBを各マトリゲルコートウェルに分配し、プレートを回旋させて、ウェルの表面上にEBを均一に分布させる(通常、P6プレートの1ウェルからのEBが、P6プレートの2ウェルにプレーティングされ得る)。
3週間にわたって、培地を1日おきに交換する(例えば、月曜日、水曜日、金曜日に)。
このプロトコルは、RPE運命の誘導に関与する遺伝子の発現を有意に増加させ、RPEの分化効率を高めた。この(tis)プロトコルの要素は、KSRの濃度が低いこと(1.5%)、FGFを含まないこと、DKK1(100ng/ml)およびPD0325901(0.1uM)を加えること、NOGGINを50ng/mlで使用することである。WNT経路の阻害(DKK1による)とBMP経路の阻害(NOGGINによる)の両方が、吻側神経外胚葉形成を促進し、それにより、眼細胞もつくられ得る。FGFシグナル伝達の阻害(PD0325901による)は、網膜の運命を抑制し、吻側化(rostralized)神経外胚葉からのRPEの運命を誘導する。
・細胞を網膜培地(RM)+ニコチンアミド、ActivinおよびWnt3a(NAW)に移す。3週間にわたって培地を1日おき(例えば、月曜日、水曜日および金曜日)に交換する。
WNT3aの添加もまた、RPEの分化効率を有意に高めた。カノニカルWNTシグナル伝達の活性化は、2つのRPE誘導転写因子であるMITFおよびPAX6の発現を増加させ、ゆえに、RPEの分化効率を高める。
・WNT5a(100ng/ml)、DKK1(100ng/ml)、SU5402(10uM)、シクロパミン(5uM)を含む5%網膜色素上皮(RPE)培地に細胞を移す。WNT5aおよびDKK1は、カノニカルWNTシグナル伝達を阻害し、それにより、PAX6およびMITFの発現が低下し、RPE細胞が成熟する。SU5402は、FGFシグナル伝達を阻害し、シクロパミンは、Sonicシグナル伝達を阻害する。FGFシグナル伝達とSonicシグナル伝達の両方が、網膜の誘導に関連する。ゆえに、これらの経路の阻害は、RPEの分化を促進する。1日おき(例えば:月曜日、水曜日および金曜日)に培地を交換する。1週間または2週間以内に、いくつかの有色素コロニーが出現する。この時点において、細胞は、機能解析のために、5%RPE培地中のトランスウェル上に播種され得る。
・細胞を、これらのトランスウェル上で8週間にわたって維持し、そこでそれらは成熟し続ける。8週間後に、トランスウェル上の完全に機能的な極性のある単層の細胞を、RPEシグネチャ遺伝子およびmiRNAの発現のために回収する。qRT−PCRアッセイを用いて、遺伝子発現を計測する。
MEFプレートを調製するために:
4枚のP6プレートを0.1%ゼラチンでコーティングし、室温において少なくとも15分間、静置させる。
1本のバイアルのMEF(Mt.Sinai Stem Cell#GSC−6001G;500万個の細胞/バイアル)を解凍し、9mlのフィーダー細胞培地に再懸濁する。細胞を1.2Kで5分間遠心し;上清を吸引し、ペレットを36mlのフィーダー細胞培地に再懸濁する。
ウェルからゼラチンを吸引し、P6の1ウェルあたり1.5mlのMEFを分配する。
〜MEFは、2週間にわたって良好であり、培地を交換する必要はない。
4枚のP6プレートを0.1%ゼラチンでコーティングし、室温において少なくとも15分間、静置させる。
1本のバイアルのMEF(Mt.Sinai Stem Cell#GSC−6001G;500万個の細胞/バイアル)を解凍し、9mlのフィーダー細胞培地に再懸濁する。細胞を1.2Kで5分間遠心し;上清を吸引し、ペレットを36mlのフィーダー細胞培地に再懸濁する。
ウェルからゼラチンを吸引し、P6の1ウェルあたり1.5mlのMEFを分配する。
〜MEFは、2週間にわたって良好であり、培地を交換する必要はない。
MATRIGEL(登録商標)プレートを調製するために:
マトリゲル(BD#356230)を+4Cの氷上で一晩解凍させる。
翌日、氷上の解凍されたマトリゲルに等体積のDMEMを加え、十分に混合する。
+4Cにおいて新しい氷上で一晩インキュベートする。
翌日に混合し、エッペンドルフチューブ1本あたり0.4mlで等分し(=1:2)、−80Cで凍結する。
希釈された(1:2)マトリゲルのチューブを氷上で解凍し(またはそれを+4Cで一晩解凍させ);アリコートを、それらを扱っている間は、氷上で維持する。
マトリゲルを冷DMEM培地中に1:25希釈する(10ml培地+0.4mlのMATRIGEL(登録商標)(1:2))。
組織培養プレートをコーティングするために、マトリゲルをディッシュ上に置き、振盪することにより、均等に分配する(例えば、P6の1ウェルあたり1ml)。
そのプレートを、非常に静かに振盪しながら室温において1時間から一晩静置させ;そのプレートを使用するまで+4Cで冷却する。
それらのプレートをすぐに使用しない場合、それらを箔に包んで、+4Cで1〜2日間維持する。
マトリゲル(BD#356230)を+4Cの氷上で一晩解凍させる。
翌日、氷上の解凍されたマトリゲルに等体積のDMEMを加え、十分に混合する。
+4Cにおいて新しい氷上で一晩インキュベートする。
翌日に混合し、エッペンドルフチューブ1本あたり0.4mlで等分し(=1:2)、−80Cで凍結する。
希釈された(1:2)マトリゲルのチューブを氷上で解凍し(またはそれを+4Cで一晩解凍させ);アリコートを、それらを扱っている間は、氷上で維持する。
マトリゲルを冷DMEM培地中に1:25希釈する(10ml培地+0.4mlのMATRIGEL(登録商標)(1:2))。
組織培養プレートをコーティングするために、マトリゲルをディッシュ上に置き、振盪することにより、均等に分配する(例えば、P6の1ウェルあたり1ml)。
そのプレートを、非常に静かに振盪しながら室温において1時間から一晩静置させ;そのプレートを使用するまで+4Cで冷却する。
それらのプレートをすぐに使用しない場合、それらを箔に包んで、+4Cで1〜2日間維持する。
試薬
フィーダー細胞培地(500ml)
DMEM(高グルコース)(Invitrogen#11960−077) 435ml熱失活ウシ胎仔血清(FBS)(Invitrogen#10082147) 50mlPen/Strep(Gibco#15140) 5mlグルタミン(200mM)(Gibco#25030) 5mlピルビン酸Na(100mM)(Gibco#11360) 5ml
培地を濾過する。
hES培地(500ml)
DMEM/F12(1:1)(Invitrogen#11320−033)385mlノックアウト血清代替物(Invitrogen#10828−028) 100ml可欠アミノ酸(Gibco#11140) 5mlPen/Strep(Gibco#15140) 5mlグルタミン(200mM)(Gibco#25030) 5mlb−メルカプトエタノール(PBS中55mM)(Gibco#21985)0.5ml
培地を濾過する。
フィーダー細胞培地(500ml)
DMEM(高グルコース)(Invitrogen#11960−077) 435ml熱失活ウシ胎仔血清(FBS)(Invitrogen#10082147) 50mlPen/Strep(Gibco#15140) 5mlグルタミン(200mM)(Gibco#25030) 5mlピルビン酸Na(100mM)(Gibco#11360) 5ml
培地を濾過する。
hES培地(500ml)
DMEM/F12(1:1)(Invitrogen#11320−033)385mlノックアウト血清代替物(Invitrogen#10828−028) 100ml可欠アミノ酸(Gibco#11140) 5mlPen/Strep(Gibco#15140) 5mlグルタミン(200mM)(Gibco#25030) 5mlb−メルカプトエタノール(PBS中55mM)(Gibco#21985)0.5ml
培地を濾過する。
bFGF(RD Systems#233−FB;10ng/mlという最終濃度;10ug/ml原液を調製し、hESにおいて1:1000希釈する)をhES培地に、使用の直前に加える。hiPSCを継代するとき、使用の直前にhES培地にRIも加える。
CTK:
5mlの0.25%トリプシン+5mlの1mg/mlコラゲナーゼIV+0.5mlの0.1M CaCl2+10mlのKSR(ノックアウト血清)+30mlのDMEM−F12を−20Cで貯蔵する。
5mlの0.25%トリプシン+5mlの1mg/mlコラゲナーゼIV+0.5mlの0.1M CaCl2+10mlのKSR(ノックアウト血清)+30mlのDMEM−F12を−20Cで貯蔵する。
EMD製の溶液の形態のRock阻害剤 Y27632 cat#688001−10mM原液
網膜誘導培地(RIM)(500ml)
DMEM/F12(1:1)(Invitrogen#11320−033)500mlノックアウト血清代替物(Invitrogen#10828−028) 7.5ml可欠アミノ酸(Gibco#11140) 5mlPen/Strep(Gibco#15140) 5mlピルビン酸ナトリウム(100mM)(Gibco#11360) 5mlN2サプリメント1×(Gibco#17502−048) 5mlB27サプリメント1×(Gibco#17504−044) 10mlCK1−7二塩酸塩(5mM)(Sigma#C0742) 50ulSB431542水和物(5mM)(Sigma#S4317) 50ulNoggin(250ug/ml)(RD Systems#6057−NG) 2ulIGF−1(100ug/ml)(RD Systems#291−G1) 5ulアスコルビン酸(5mg/ml)(Sigma#A4544−25G) 5ml
網膜分化培地(RDM)(500ml)
DMEM/F12(1:1)(Invitrogen#11320−033)500mlノックアウト血清代替物(Invitrogen#10828−028) 7.5ml可欠アミノ酸(Gibco#11140) 5mlPen/Strep(Gibco#15140) 5mlピルビン酸ナトリウム(100mM)(Gibco#11360) 5mlN2サプリメント1×(Gibco#17502−048) 5mlB27サプリメント1×(Gibco#17504−044) 10mlCK1−7(5mM)(Sigma#C0742) 0.5mlDKK1(100ug/ml)(R&D Systems) 0.5mlSB−431542(5mM)(Sigma#S4317) 0.5mlNoggin(250ug/ml)(RD Systems#6057−NG)0.1ml
IGF−1(100ug/ml)(RD Systems#291−G1) 50ulアスコルビン酸(5mg/ml)(Sigma#A4544−25G) 5mlPD0325901(1mM)(Tocris#4192) 0.5mlFGFなし
網膜培地(RM)+ニコチンアミド、ActivinおよびWnt3a(NAW)(500ml)
DMEM/F12(1:1)(Invitrogen#11320−033)500mlノックアウト血清代替物(Invitrogen#10828−028) 50ml可欠アミノ酸(Gibco#11140) 5mlPen/Strep(Gibco#15140) 5mlピルビン酸ナトリウム(100mM)(Gibco#11360) 5mlN2サプリメント1×(Gibco#17502−048) 5mlB27サプリメント1×(Gibco#17504−044) 10mlニコチンアミド(Sigma#N0636)(1M) 5mlActivin(RD Systems#338−AC)(50ug/ml)1.5mlWnt3a(RD Systems#5036−WN)(200ug/ml)250ulEMD製の溶液の形態のRock阻害剤 Y27632 cat#688001
5%網膜色素上皮(RPE)培地
改変MEM(M−4526) 500mL
N1サプリメント(N−6530) 5mL
グルタマックス、ペニシリン−ストレプトマイシン(G−1146)5mL
可欠アミノ酸(M−7145) 5mL
タウリン(T−0625) 125mg
ヒドロコルチゾン(H−0396) 10ug
トリヨードチロニン(T−5516) 0.0065ug
熱失活ウシ胎仔血清 1%または5%または15%
DMEM/F12(1:1)(Invitrogen#11320−033)500mlノックアウト血清代替物(Invitrogen#10828−028) 7.5ml可欠アミノ酸(Gibco#11140) 5mlPen/Strep(Gibco#15140) 5mlピルビン酸ナトリウム(100mM)(Gibco#11360) 5mlN2サプリメント1×(Gibco#17502−048) 5mlB27サプリメント1×(Gibco#17504−044) 10mlCK1−7二塩酸塩(5mM)(Sigma#C0742) 50ulSB431542水和物(5mM)(Sigma#S4317) 50ulNoggin(250ug/ml)(RD Systems#6057−NG) 2ulIGF−1(100ug/ml)(RD Systems#291−G1) 5ulアスコルビン酸(5mg/ml)(Sigma#A4544−25G) 5ml
網膜分化培地(RDM)(500ml)
DMEM/F12(1:1)(Invitrogen#11320−033)500mlノックアウト血清代替物(Invitrogen#10828−028) 7.5ml可欠アミノ酸(Gibco#11140) 5mlPen/Strep(Gibco#15140) 5mlピルビン酸ナトリウム(100mM)(Gibco#11360) 5mlN2サプリメント1×(Gibco#17502−048) 5mlB27サプリメント1×(Gibco#17504−044) 10mlCK1−7(5mM)(Sigma#C0742) 0.5mlDKK1(100ug/ml)(R&D Systems) 0.5mlSB−431542(5mM)(Sigma#S4317) 0.5mlNoggin(250ug/ml)(RD Systems#6057−NG)0.1ml
IGF−1(100ug/ml)(RD Systems#291−G1) 50ulアスコルビン酸(5mg/ml)(Sigma#A4544−25G) 5mlPD0325901(1mM)(Tocris#4192) 0.5mlFGFなし
網膜培地(RM)+ニコチンアミド、ActivinおよびWnt3a(NAW)(500ml)
DMEM/F12(1:1)(Invitrogen#11320−033)500mlノックアウト血清代替物(Invitrogen#10828−028) 50ml可欠アミノ酸(Gibco#11140) 5mlPen/Strep(Gibco#15140) 5mlピルビン酸ナトリウム(100mM)(Gibco#11360) 5mlN2サプリメント1×(Gibco#17502−048) 5mlB27サプリメント1×(Gibco#17504−044) 10mlニコチンアミド(Sigma#N0636)(1M) 5mlActivin(RD Systems#338−AC)(50ug/ml)1.5mlWnt3a(RD Systems#5036−WN)(200ug/ml)250ulEMD製の溶液の形態のRock阻害剤 Y27632 cat#688001
5%網膜色素上皮(RPE)培地
改変MEM(M−4526) 500mL
N1サプリメント(N−6530) 5mL
グルタマックス、ペニシリン−ストレプトマイシン(G−1146)5mL
可欠アミノ酸(M−7145) 5mL
タウリン(T−0625) 125mg
ヒドロコルチゾン(H−0396) 10ug
トリヨードチロニン(T−5516) 0.0065ug
熱失活ウシ胎仔血清 1%または5%または15%
分化プロトコルの最初の3週間にわたって使用された培地中における種々の量のノックアウト血清代替物(KOSR)の使用を評価した。網膜分化培地(RDM)は、細胞の色素沈着に対して差次的な作用を示した。高KOSR(10%)中でインキュベートされたiPSCは、より少ない量のKOSR(1.5%)を使用したときと比べて、より少数の有色素細胞を生じた。10、5.25または1.5%のKOSR中での培養の後、細胞を、3週間にわたって1.5%KOSRを含むNAWに移し、16週間後に写真撮影した(図34Aおよび図34Bを参照のこと)。
実施例2
レポーターiPSC細胞株
上記プロトコルを、iPSCからRPEへの分化用に最適化するために、レポーターiPSC株を作出した。このレポーター系統は、赤色蛍光タンパク質を恒常的に発現し、その発現は、ユビキチン遺伝子プロモーターによって調節される。このレポーターiPSC株は、とりわけ、RPE系列に分化したときに、緑色蛍光タンパク質(GFP)も発現する(図1〜3)。チロシナーゼ遺伝子のRPE特異的エンハンサーが、このiPSC株においてGFPの発現を調節する(図1)。第1の目標は、GFPの発現が、本当にRPE系列を表しているかを確かめることだった。これを達成するために、公開されている分化プロトコルを用いてiPSC株を分化させ、分子アッセイおよび生理学的アッセイを用いて、それらの分化細胞を特徴づけた。これらのアッセイは、図22〜24に開示されている。図2は、iPSC−RPE分化の単純な模式図を描写している。レポーターiPSCが、RPEに分化すると(分化へおよそ28日)、GFP陽性細胞が存在する(図3A)。これらの細胞は、進んでいくと、特徴的な多角形のRPEの形態を有する上皮の単層を形成し、GFPを発現し続ける(図3B)。GFP陽性細胞およびGFP陰性細胞をフローサイトメトリーによって選別し、いくつかのRPE特異的遺伝子の発現を解析し、図4に示した。これらの結果は、GFP陽性細胞が、同じディッシュ由来のGFP陰性細胞と比べて一層高いレベルでRPE特異的マーカーを発現することを示している。
レポーターiPSC細胞株
上記プロトコルを、iPSCからRPEへの分化用に最適化するために、レポーターiPSC株を作出した。このレポーター系統は、赤色蛍光タンパク質を恒常的に発現し、その発現は、ユビキチン遺伝子プロモーターによって調節される。このレポーターiPSC株は、とりわけ、RPE系列に分化したときに、緑色蛍光タンパク質(GFP)も発現する(図1〜3)。チロシナーゼ遺伝子のRPE特異的エンハンサーが、このiPSC株においてGFPの発現を調節する(図1)。第1の目標は、GFPの発現が、本当にRPE系列を表しているかを確かめることだった。これを達成するために、公開されている分化プロトコルを用いてiPSC株を分化させ、分子アッセイおよび生理学的アッセイを用いて、それらの分化細胞を特徴づけた。これらのアッセイは、図22〜24に開示されている。図2は、iPSC−RPE分化の単純な模式図を描写している。レポーターiPSCが、RPEに分化すると(分化へおよそ28日)、GFP陽性細胞が存在する(図3A)。これらの細胞は、進んでいくと、特徴的な多角形のRPEの形態を有する上皮の単層を形成し、GFPを発現し続ける(図3B)。GFP陽性細胞およびGFP陰性細胞をフローサイトメトリーによって選別し、いくつかのRPE特異的遺伝子の発現を解析し、図4に示した。これらの結果は、GFP陽性細胞が、同じディッシュ由来のGFP陰性細胞と比べて一層高いレベルでRPE特異的マーカーを発現することを示している。
次に、選別されたGFP陽性細胞およびGFP陰性細胞を、新しいディッシュに再度プレーティングした。GFP陰性細胞は、生育されても、非常に少ない有色素コロニーしか形成しない(図5A)。相対的に、GFP陽性細胞は、完全にコンフルエントな純粋なRPE単層になる(図5B)。これにより、GFPの発現が、これらの細胞におけるRPE運命を本当に表すことが確かめられ、GFPのシグナルが、RPE分化の信頼できる指標として使用され得ることが実証された。iPSCからのRPEの分化を最適化するために、参照プロトコルを確立した(Idelsonら(2009),Cell Stem Cell5,396−408;Meyerら(2009),Proc.Natl.Acad.Sci.USA106,16698−16703;Osakadaら(2009),J.CellSci.122,3169−3179を参照のこと。このプロトコルは、4つの段階、すなわち、分化の誘導、眼の領域/眼胞細胞への分化、RPE分化の誘導、およびRPE細胞の成熟に分けられた。
実施例3
分化の誘導
iPSCの分化を誘導するために、コロニーを、穏やかなコラゲナーゼ処理(1mg/ml、15分間)によってはずし、小さい細胞凝集物に解離した。これらの凝集物を、RIM培地中で48時間、非接着性の培養条件で培養した。24時間以内に、その細胞凝集物は、胚様体(EB)に変化する。EBのサイズ(細胞数/EB)が、RPEの分化に影響するかが判定され、200〜400個の細胞/EBを有する比較的小さいEBSが、より大きなEBと比べて、効率的にRPEに分化することが見出された(図6)。
分化の誘導
iPSCの分化を誘導するために、コロニーを、穏やかなコラゲナーゼ処理(1mg/ml、15分間)によってはずし、小さい細胞凝集物に解離した。これらの凝集物を、RIM培地中で48時間、非接着性の培養条件で培養した。24時間以内に、その細胞凝集物は、胚様体(EB)に変化する。EBのサイズ(細胞数/EB)が、RPEの分化に影響するかが判定され、200〜400個の細胞/EBを有する比較的小さいEBSが、より大きなEBと比べて、効率的にRPEに分化することが見出された(図6)。
網膜誘導培地(RIM)(500ml)
DMEM/F12(1:1)(Invitrogen#11320−033)500mlノックアウト血清代替物(Invitrogen#10828−028) 7.5ml可欠アミノ酸(Gibco#11140) 5mlPen/Strep(Gibco#15140) 5mlピルビン酸ナトリウム(100mM)(Gibco#11360) 5mlN2サプリメント1×(Gibco#17502−048) 5mlB27サプリメント1×(Gibco#17504−044) 10mlCK1−7二塩酸塩(5mM)(Sigma#C0742) 50ulSB431542水和物(5mM)(Sigma#S4317) 50ulNoggin(250ug/ml)(RD Systems#6057−NG) 2ulIGF−1(100ug/ml)(RD Systems#291−G1) 5ulアスコルビン酸(5mg/ml)(Sigma#A4544−25G) 5ml
DMEM/F12(1:1)(Invitrogen#11320−033)500mlノックアウト血清代替物(Invitrogen#10828−028) 7.5ml可欠アミノ酸(Gibco#11140) 5mlPen/Strep(Gibco#15140) 5mlピルビン酸ナトリウム(100mM)(Gibco#11360) 5mlN2サプリメント1×(Gibco#17502−048) 5mlB27サプリメント1×(Gibco#17504−044) 10mlCK1−7二塩酸塩(5mM)(Sigma#C0742) 50ulSB431542水和物(5mM)(Sigma#S4317) 50ulNoggin(250ug/ml)(RD Systems#6057−NG) 2ulIGF−1(100ug/ml)(RD Systems#291−G1) 5ulアスコルビン酸(5mg/ml)(Sigma#A4544−25G) 5ml
実施例4
眼の領域/眼胞細胞への分化
浮遊EB培養の48時間後に、それらを、MATRIGEL(登録商標)でコーディングされたプレート上のRDM培地中にプレーティングする。1ウェルあたりのプレーティングされたEBの数が、RPEへのiPSCの分化に影響するかを調べた。その結果は、理想的な分化効率が、標準的な6ウェル組織培養プレートの1ウェルあたり150〜250個のEBをプレーティングすることによって達成されることを示した(図7)。毎週月曜日、水曜日および金曜日に、細胞上の培地を交換しながら、RDM培地を3週間にわたって使用した。Nodal経路、BMP経路およびWNT経路の阻害は、幹細胞を眼の領域の細胞に分化させるために重要であり得る。nodal経路を阻害するために、阻害剤SB431542を使用した。BMP経路の活性を阻害するために、様々な濃度の、BMP阻害剤であるNogginを試験した。WNT経路の阻害のために、生物学的Wnt阻害剤であるDKK1とWNT経路の小分子阻害剤であるCK1−7との組み合わせを使用した。
眼の領域/眼胞細胞への分化
浮遊EB培養の48時間後に、それらを、MATRIGEL(登録商標)でコーディングされたプレート上のRDM培地中にプレーティングする。1ウェルあたりのプレーティングされたEBの数が、RPEへのiPSCの分化に影響するかを調べた。その結果は、理想的な分化効率が、標準的な6ウェル組織培養プレートの1ウェルあたり150〜250個のEBをプレーティングすることによって達成されることを示した(図7)。毎週月曜日、水曜日および金曜日に、細胞上の培地を交換しながら、RDM培地を3週間にわたって使用した。Nodal経路、BMP経路およびWNT経路の阻害は、幹細胞を眼の領域の細胞に分化させるために重要であり得る。nodal経路を阻害するために、阻害剤SB431542を使用した。BMP経路の活性を阻害するために、様々な濃度の、BMP阻害剤であるNogginを試験した。WNT経路の阻害のために、生物学的Wnt阻害剤であるDKK1とWNT経路の小分子阻害剤であるCK1−7との組み合わせを使用した。
結果は、FGFシグナル伝達の阻害がRPE発生にとって重要であることを示した。ゆえに、FGFシグナル伝達経路の活性は、その濃度を変更することまたは/およびFGF阻害剤(PD0325901)を培地に加えることによって調節された。それらの結果を、RPE分化のマスター制御因子である2つの転写因子Pax6およびMitfの定量的な遺伝子発現の計測によって毎週スコア付けした(図8〜13)。さらに、GFPの発現も、RPE細胞の誘導の直接的な尺度として、6週間後にスコア付けした(図14)。
それらの結果は、WNT経路の二重阻害、FGF経路の阻害および50ng/mlのNogginの使用が、3週間にわたってPax6およびMitfの発現を有意かつ徐々に改善することを示したことから、それらの細胞が、第3週の終わりまでに眼胞の独自性を獲得したと示唆される。正常なRPE分化の終わりに計測されるGFPシグナルは、これらの処理が、iPSCからのRPEの分化を有意に改善することを確証させる。
次に、RPEの分化に対するノックアウト血清代替物(KSR)の濃度の影響を試験した。KSRを1.5%に低下させることにより、RPEから分化するとき、有色素のRPE細胞の数が増加した(図15)。
網膜分化培地(RDM)(500ml)
DMEM/F12(1:1)(Invitrogen#11320−033)500mlノックアウト血清代替物(Invitrogen#10828−028) 7.5ml可欠アミノ酸(Gibco#11140) 5mlPen/Strep(Gibco#15140) 5mlピルビン酸ナトリウム(100mM)(Gibco#11360) 5mlN2サプリメント1×(Gibco#17502−048) 5mlB27サプリメント1×(Gibco#17504−044) 10mlCK1−7(5mM)(Sigma#C0742) 0.5mlDKK1(100ug/ml)(R&D Systems) 0.5mlSB−431542(5mM)(Sigma#S4317) 0.5mlNoggin(250ug/ml)(RD Systems#6057−NG)0.1ml
IGF−1(100ug/ml)(RD Systems#291−G1) 50ulアスコルビン酸(5mg/ml)(Sigma#A4544−25G) 5mlPD0325901(1mM)(Tocris#4192) 0.5mlFGFなし。
DMEM/F12(1:1)(Invitrogen#11320−033)500mlノックアウト血清代替物(Invitrogen#10828−028) 7.5ml可欠アミノ酸(Gibco#11140) 5mlPen/Strep(Gibco#15140) 5mlピルビン酸ナトリウム(100mM)(Gibco#11360) 5mlN2サプリメント1×(Gibco#17502−048) 5mlB27サプリメント1×(Gibco#17504−044) 10mlCK1−7(5mM)(Sigma#C0742) 0.5mlDKK1(100ug/ml)(R&D Systems) 0.5mlSB−431542(5mM)(Sigma#S4317) 0.5mlNoggin(250ug/ml)(RD Systems#6057−NG)0.1ml
IGF−1(100ug/ml)(RD Systems#291−G1) 50ulアスコルビン酸(5mg/ml)(Sigma#A4544−25G) 5mlPD0325901(1mM)(Tocris#4192) 0.5mlFGFなし。
実施例5
RPE分化の誘導
Activin Aは、ES細胞からのRPE分化を誘導する。動物モデルでは、カノニカルWNT(WNT3a)が、RPE分化にとって重要である。アクチビンAとWNT3aと組み合わせが、iPSCからのRPE分化の誘導にとって有効であり得ると仮定した。これらの2つの因子の組み合わせを眼胞期に試験した。細胞を、RDM培地から、アクチビンA(NA)のみまたはアクチビンA+WNT3a(NAW)を含む培地に移動させた。WNT3aの添加により、ディッシュ1枚あたりの有色素細胞の数が有意に増加した(図16)。この分化プロセスは、レポーターiPSC株から開始されたので、2つの処理間のGFPシグナルを比較することによって、RPE細胞の数の増加が確かめられた。NAと比べて、NAWは、培養物中のGFP陽性細胞の数を増加させた(図17,上パネル)。FACS解析によって定量すると、NA処理は、22%のGFP陽性細胞しかもたらさなかったのに対し、NAW処理は、52%のGFP陽性細胞をもたらした(図17,下パネル)。この結果は、WNTシグナル伝達が、TGF−ベータ(アクチビン)シグナル伝達のRPE分化能力を相乗的に高めることを示した。
RPE分化の誘導
Activin Aは、ES細胞からのRPE分化を誘導する。動物モデルでは、カノニカルWNT(WNT3a)が、RPE分化にとって重要である。アクチビンAとWNT3aと組み合わせが、iPSCからのRPE分化の誘導にとって有効であり得ると仮定した。これらの2つの因子の組み合わせを眼胞期に試験した。細胞を、RDM培地から、アクチビンA(NA)のみまたはアクチビンA+WNT3a(NAW)を含む培地に移動させた。WNT3aの添加により、ディッシュ1枚あたりの有色素細胞の数が有意に増加した(図16)。この分化プロセスは、レポーターiPSC株から開始されたので、2つの処理間のGFPシグナルを比較することによって、RPE細胞の数の増加が確かめられた。NAと比べて、NAWは、培養物中のGFP陽性細胞の数を増加させた(図17,上パネル)。FACS解析によって定量すると、NA処理は、22%のGFP陽性細胞しかもたらさなかったのに対し、NAW処理は、52%のGFP陽性細胞をもたらした(図17,下パネル)。この結果は、WNTシグナル伝達が、TGF−ベータ(アクチビン)シグナル伝達のRPE分化能力を相乗的に高めることを示した。
網膜培地(RM)+ニコチンアミド、ActivinおよびWnt3a(NAW)(500ml)
DMEM/F12(1:1)(Invitrogen#11320−033)500mlノックアウト血清代替物(Invitrogen#10828−028) 7.5ml可欠アミノ酸(Gibco#11140) 5mlPen/Strep(Gibco#15140) 5mlピルビン酸ナトリウム(100mM)(Gibco#11360) 5mlN2サプリメント1×(Gibco#17502−048) 5mlB27サプリメント1×(Gibco#17504−044) 10mlニコチンアミド(Sigma#N0636)(1M) 5mlActivin(RD Systems#338−AC)(50ug/ml)1.5ml
Wnt3a(RD Systems#5036−WN)(200ug/ml)250ul
DMEM/F12(1:1)(Invitrogen#11320−033)500mlノックアウト血清代替物(Invitrogen#10828−028) 7.5ml可欠アミノ酸(Gibco#11140) 5mlPen/Strep(Gibco#15140) 5mlピルビン酸ナトリウム(100mM)(Gibco#11360) 5mlN2サプリメント1×(Gibco#17502−048) 5mlB27サプリメント1×(Gibco#17504−044) 10mlニコチンアミド(Sigma#N0636)(1M) 5mlActivin(RD Systems#338−AC)(50ug/ml)1.5ml
Wnt3a(RD Systems#5036−WN)(200ug/ml)250ul
実施例6
RPE細胞の成熟
RPE細胞をさらに精製し、成熟させるために、これらの細胞をトリプシン処理し、半透性トランスウェル上の5%RPE培地中で4週間培養した。これにより、RPE色素に関してかなり均一に見える細胞が作製された(図18,上パネル)。FACS解析によるGFPシグナルの定量は、4週間生育した培養物中に最大92%のGFP陽性細胞をもたらした。これは、その5%RPE培地が、RPE細胞に富んでいることを示唆する。これらの細胞を、より長い期間にわたって培養したとき、NAWで処理された細胞は、NAで処理された細胞と比べて、RPE色素、RPEの形態およびGFP発現に関してより均一に見えた(図19,図20、NAW細胞の場合のみ)。しかしながら、これらの細胞は、Pax6、Sox2、Tfecなどのような胎児特異的RPE遺伝子を発現し続ける。
RPE細胞の成熟
RPE細胞をさらに精製し、成熟させるために、これらの細胞をトリプシン処理し、半透性トランスウェル上の5%RPE培地中で4週間培養した。これにより、RPE色素に関してかなり均一に見える細胞が作製された(図18,上パネル)。FACS解析によるGFPシグナルの定量は、4週間生育した培養物中に最大92%のGFP陽性細胞をもたらした。これは、その5%RPE培地が、RPE細胞に富んでいることを示唆する。これらの細胞を、より長い期間にわたって培養したとき、NAWで処理された細胞は、NAで処理された細胞と比べて、RPE色素、RPEの形態およびGFP発現に関してより均一に見えた(図19,図20、NAW細胞の場合のみ)。しかしながら、これらの細胞は、Pax6、Sox2、Tfecなどのような胎児特異的RPE遺伝子を発現し続ける。
分化中のRPE細胞は、RPE細胞の成熟に影響し得るカノニカルWNTの産生を開始する。ゆえに、完全に成熟したRPE細胞を作製するため、および胎児遺伝子の発現を停止するために、これらの培養物を、カノニカルWNT経路の阻害剤で処理した。共にカノニカルWNT経路を阻害し、非カノニカルWNT経路を誘導するWNT5aおよびDKK1を、これらの研究において使用した。後者(later)は、細胞の分極および成熟を誘導すると示されている。さらに、FGF経路の阻害剤(SU54052)およびソニックヘッジホッグ経路の阻害剤(シクロパミン)を使用して、RPEの成熟に影響し得る任意の内在性のFGFシグナル伝達およびSonicシグナル伝達を抑制した。これらの阻害剤を、2週間にわたって使用し、それらの細胞を処理の直後にアッセイした。いくつかの胎児RPEおよび成熟RPEに特異的な遺伝子の発現を計測した(図21)。興味深いことに、これらの処理は、胎児RPE特異的遺伝子(Pax6、Sox2、Tfec、Klf4、Snail1/2)の発現をダウンレギュレートし、RPE成熟関連遺伝子(TYR、TYRP1、MYRIP、カドヘリン1/3、TRPM1/3)の発現をアップレギュレートした。
結論として、iPSCからRPEへの分化を有意に改善し、完全に分化した細胞も作製するプロトコルが開発された。このプロトコルは、適切な疾患モデルおよび有効な細胞ベース治療に役立つRPE細胞をiPSCから作製する上で非常に貴重である。
5%網膜色素上皮(RPE)培地
改変MEM(M−4526) 500mL
N1サプリメント(N−6530) 5mL
グルタマックス,ペニシリン−ストレプトマイシン(G−1146) 5mL
可欠アミノ酸(M−7145) 5mL
タウリン(T−0625) 125mg
ヒドロコルチゾン(H−0396) 10ug
トリヨードチロニン(T−5516) 0.0065ug熱失活ウシ胎仔血清 5%
DKK1(100ug/ml)(R&D Systems) 0.5ml
Wnt5a(RD Systems)(100ug/ml) 250ul
SU5402(sigma)(10uM) 0.5ml
シクロパミン(Sigma)(10uM) 0.5ml
改変MEM(M−4526) 500mL
N1サプリメント(N−6530) 5mL
グルタマックス,ペニシリン−ストレプトマイシン(G−1146) 5mL
可欠アミノ酸(M−7145) 5mL
タウリン(T−0625) 125mg
ヒドロコルチゾン(H−0396) 10ug
トリヨードチロニン(T−5516) 0.0065ug熱失活ウシ胎仔血清 5%
DKK1(100ug/ml)(R&D Systems) 0.5ml
Wnt5a(RD Systems)(100ug/ml) 250ul
SU5402(sigma)(10uM) 0.5ml
シクロパミン(Sigma)(10uM) 0.5ml
実施例7
iPSC由来RPE細胞の立証
このプロトコルを通じて得られた細胞を立証するために、それらの細胞を、分子アッセイと生理学的アッセイの両方によって試験した。シグネチャ遺伝子のセットを、以前に公開されたRPE遺伝子シグネチャ(Strunnikovaら(2010),Hum.Mol.Genet.19:2468−2486)から選択し、それらの遺伝子の発現を、初代ヒトRPEと、本発明者らのプロトコルを使用してiPSCから得られたRPEとを比較した。得られた細胞は、RPE特異的遺伝子の発現に関して初代ヒトRPEによく似ている(図22)。
iPSC由来RPE細胞の立証
このプロトコルを通じて得られた細胞を立証するために、それらの細胞を、分子アッセイと生理学的アッセイの両方によって試験した。シグネチャ遺伝子のセットを、以前に公開されたRPE遺伝子シグネチャ(Strunnikovaら(2010),Hum.Mol.Genet.19:2468−2486)から選択し、それらの遺伝子の発現を、初代ヒトRPEと、本発明者らのプロトコルを使用してiPSCから得られたRPEとを比較した。得られた細胞は、RPE特異的遺伝子の発現に関して初代ヒトRPEによく似ている(図22)。
同様に、iPSC由来RPEが頂端バスおよび基底バスにおけるCO2濃度の変化に応答する能力、ならびに頂端バスにおけるカリウム濃度の変化に応答して過分極する(hyerpolarize)能力を評価した(図23、24)。これらのすべてのアッセイにおいて、iPSC由来RPE細胞は、初代ヒトRPEと同様に挙動する。したがって、開示されたプロトコルによって、完全に機能的なRPE細胞が作製される。これらの分子アッセイおよび生理学的アッセイは、完了したRPE分化に対する重要なバイオマーカーである。
実施例8
マルチプレックスハイスループットスクリーニング
iPSC由来の網膜色素上皮(RPE)において複数の発生マーカー、機能マーカーおよび疾患マーカーの内因性の発現を同時に検出するマルチプレックスハイスループットスクリーニングアプローチを開発した。プロトコルを、96ウェルおよび384ウェルの形式でのハイスループットスクリーニングのためのiPSC由来RPEの分化および成長に対して最適化した。原理証明として、iPSC、2つの分化段階におけるiPSC由来RPEおよび初代ヒトRPE細胞における10個の遺伝子の内因性の発現を、そのマルチプレックスアッセイを使用して比較した。このアッセイから得られたデータは、標準的なqRT−PCRに基づく計測値と有意に相関する。このアッセイは、RPEの機能、成熟を改善する化合物、および疾患経路を標的化する化合物をスクリーニングする根拠を提供し、ゆえに、いくつかの網膜変性疾患の効果的な処置に対する根拠が提供される。
マルチプレックスハイスループットスクリーニング
iPSC由来の網膜色素上皮(RPE)において複数の発生マーカー、機能マーカーおよび疾患マーカーの内因性の発現を同時に検出するマルチプレックスハイスループットスクリーニングアプローチを開発した。プロトコルを、96ウェルおよび384ウェルの形式でのハイスループットスクリーニングのためのiPSC由来RPEの分化および成長に対して最適化した。原理証明として、iPSC、2つの分化段階におけるiPSC由来RPEおよび初代ヒトRPE細胞における10個の遺伝子の内因性の発現を、そのマルチプレックスアッセイを使用して比較した。このアッセイから得られたデータは、標準的なqRT−PCRに基づく計測値と有意に相関する。このアッセイは、RPEの機能、成熟を改善する化合物、および疾患経路を標的化する化合物をスクリーニングする根拠を提供し、ゆえに、いくつかの網膜変性疾患の効果的な処置に対する根拠が提供される。
十分に立証されたiPSC由来RPEをマルチプレックスハイスループットアッセイのために使用するプロトコルを開発した。このマルチプレックス遺伝子発現アッセイは、6つのRPE系列遺伝子、2つの幹細胞/前駆体細胞遺伝子および2つのハウスキーピング遺伝子について報告する。1)このアッセイが、96ウェルおよび384ウェルのハイスループット様式で行われ得、2)このアッセイが、遺伝子発現のわずかな変化さえも計測でき、3)このマルチプレックスアッセイを用いて得られたデータが、RT−qPCRデータと高度に相関するという、原理証明データが得られた。このアッセイによって、完全に成熟したRPE細胞に向かう分化プロトコルの効率をさらに高め得る小分子の同定が可能になる。さらに、このアッセイは、ハイスループット様式で追跡され得る発生バイオマーカーおよび機能バイオマーカーを提供する。これらの機能バイオマーカーおよび疾患バイオマーカーの発現を調節する小分子は、RPE関連網膜変性疾患に対する潜在的な治療用薬物を提供し得る。
A.材料および方法
iPSCの起源、培養および分化:Coriell(Camden,NJ)から購入したヒト成人皮膚線維芽細胞(AG9309,女性,21歳,足指のバイオプシー)を再プログラムした(15)。iPSCを、3つの胚葉またはRPEに分化させた(12,15〜17)。
iPSCの起源、培養および分化:Coriell(Camden,NJ)から購入したヒト成人皮膚線維芽細胞(AG9309,女性,21歳,足指のバイオプシー)を再プログラムした(15)。iPSCを、3つの胚葉またはRPEに分化させた(12,15〜17)。
免疫染色、電子顕微鏡法およびqRT−PCR解析:免疫染色およびqRT−PCR解析を行った(Greenら、Nature biotechnology 29(3):267−272,2011;Bhartiら、PLoS Genet 8(7):e1002757,2012)。以下の抗体を使用した:ALEXAFLUOR(登録商標)488−抗Tra−1−60(1:50,BD Biosciences);ALEXAFLUOR(登録商標)488−抗SSEA4(1:50,BD Biosciences);OCT4(1:400,Cell Signaling,Danvers,MA);NANOG(1:100,R&D Systems);SOX2(1:100,Santa Cruz,Dallas,TX);KLF4(1:50,Santa Cruz);c−MYC(1:50,Santa Cruz);AFP(1:75,Thermo Scientific,Waltham,MA);TUJ1(1:400,Sigma,St.Louis,MO,http://www.sigmaaldrich.com);aSMA(1:500,Thermo Scientific);DCT(1:100,Bioworld antibodies,Mt.Airy);PAX6(1:200,Covance Chantilly,VA);およびZO1(1:100 Life Technologies)。
細胞内カルシウムの計測および電気生理学:RPE細胞におけるカルシウムシグナル伝達を評価するために、ATP(200μM;Sigma)およびシクロピアゾン酸(CPA;10μM;EMD Millipore);(Maminishkisら、Invest.Ophthal.Vis.Sci.47(8):3612−3624,2006);Quinnら、Invest.Ophthal.Vis.Sci.33(13):3513−3527,1992を参照のこと)。
リンガー液および寒天橋と直列のカロメル電極を使用して、経上皮電位(TEP)を計測した。細胞内微小電極からのシグナルを、基底バスに対して参照して、頂端および基底の膜電位VAおよびVBを計測した(ここで、TEP=VB−VAである)。組織を横断して2〜4μAの電流パルス(ピーク・トゥ・ピーク)を通し、生じたTEP、VAおよびVBの変化を計測することによって、経上皮抵抗全体(Rt)および頂端と側底膜との抵抗の比(RA/RB)を得た。詳細については、Maminishkisら、前出およびQuinnら、前出を参照のこと。
QUANTIGENE PLEX(登録商標)技術の原理:96ウェルまたは384ウェルプレートにおいて生育された細胞を溶解し、溶解産物を、QUANTIGENE PLEX(登録商標)プローブおよびLUMINEX(登録商標)ビーズセットを含むハイブリダイゼーションプレートに移す。各ビーズタイプを、異なる一本鎖DNA捕捉プローブ(CP)でコーティングする。ssDNAオリゴも含むQUANTIGENE(登録商標)プローブセットの他の構成要素としては、捕捉エクステンダー(Capture Extenders)(CE)、標識エクステンダー(Label Extenders)(LE)およびブロッキングプローブ(BP)が挙げられる。CEオリゴの一部は、標的mRNA(200〜600塩基をカバーする)に相補的であり、一部は、LUMINEX(登録商標)ビーズ上に結合されたCPに相補的である。この相互作用は、特定のLUMINEX(登録商標)ビーズへの特定の標的mRNAの捕捉を容易にする。LEは、標的mRNA特異的配列、およびシグナル増幅のために使用される第1の構成要素であるプレアンプリファイアに対する結合部位を含む。BPは、CEおよびLEによって結合されない標的mRNA上の任意の配列に結合する。単一の標的mRNAに対する代表的なプローブセットは、標的mRNA内の約500塩基を通常カバーする4つ以上の異なるCEおよびLEのファミリーからなる。過剰なプローブおよび残っている細胞溶解産物を洗浄除去した後、プレアンプリファイア(PreAmp)、アンプリファイア(Amp)および標識プローブ(LP)からなるシグナル増幅試薬を、順次、mRNAにハイブリダイズさせる。LPは、ビオチン分子も含み、それは、最終的なシグナル増幅試薬であるSAPE(ストレプトアビジン結合体化R−フィコエリトリン)に対する結合部位となる。各アンプリファイアは、最大400個のSAPEに結合する。個々の捕捉ビーズに関連する得られた蛍光シグナルを、LUMINEX(登録商標)機器において読み出す。シグナルは、蛍光強度中央値(MFI)として報告され、サンプル中に存在する標的RNA分子の数に比例する。MFIは、1遺伝子あたり50〜100個のビーズ上のシグナルを計測することによって計算される。標的RNAを含まないバックグラウンドブランクウェルから得られたMFI値を、各標的の読み出しのMFIから減算した。
QUANTIGENE PLEX(登録商標)2.0試薬システム:96ウェルアッセイプロトコル:QUANTIGENE PLEX(登録商標)96ウェルアッセイを、製造者のマニュアル(QUANTIGENE PLEX(登録商標)2.0 Assay,Affymetrix,Santa Clara,CA)に記載されているように行った。1ウェルあたり25,000個および50,000個の細胞を播種し、37℃、5%CO2において14日間培養する。細胞を、200μLのワーキング溶解混合物中で、50℃において30分間溶解した。80μLの細胞溶解産物を、すでに各ウェルに20μLのワーキングビーズ混合物(6.6μLの溶解混合物、5.2μLのヌクレアーゼフリー水、0.2μLのプロテイナーゼK溶液、2μLのブロッキング試薬、5μLのプローブセット、1μLのLUMINEX(登録商標)磁気ビーズ;QUANTIGENE PLEX(登録商標)セット−パネル#11828)が入ったこのアッセイのハイブリダイゼーションプレート(96ウェル透明ポリプロピレンプレートAbgene#AB0796,Pittsburg,PA)に移した。ハイブリダイゼーションを、600rpmで振盪しながら54℃±1℃において18〜22時間行った。次いで、そのハイブリダイゼーション混合物を96ウェル磁気分離プレート(96ウェル平底マイクロプレートNunc#269620)に移した。Affymetrix手持ち式磁気ビーズ洗浄機(Affymetrix P/N QP0702)を使用してビーズを洗浄し、ゆえに、未結合の材料のすべてが除去された。100μLの2.0プレアンプリファイアワーキング試薬(製造者によって提供されるPreAmp溶液+Amp希釈剤を使用して3:1000希釈)を各アッセイウェルに加えた。その磁気分離プレートを、裏に接着剤が付いた箔で密封し、50℃±1℃および600rpmで1時間インキュベートした。手持ち式磁気洗浄機を使用して、未結合の2.0プレアンプリファイアを除去し、ビーズを100μLの洗浄緩衝液(製造者によって提供される)で3回洗浄した。これに続いて、2.0アンプリファイアワーキング試薬、続いて、標識プローブワーキング試薬、続いて最後に、SAPEワーキング試薬(3つすべての溶液が、3:1000希釈の100μLで、製造者によって提供される)とのインキュベーションを行った。インキュベーションおよび洗浄は、上に記載されたとおり行った。ビーズを130ulのSAPE洗浄緩衝液に再懸濁した後、ビーズからのシグナルを、LUMINEX(登録商標)FLEXMAP(登録商標)3D機器(LUMINEX(登録商標)Corp.Austin,TX)で、5,000〜25,000というddゲートの設定を使用して、計測した。標的1つあたり50〜100個のビーズを、100ulのサンプル体積において計測した。
QUANTIGENE PLEX(登録商標)384ウェルアッセイプロトコル:QUANTIGENE PLEX(登録商標)384ウェルアッセイを、Affymetrixからの技術支援を用いて、および製造者によって提供される96ウェルアッセイプロトコルを使用して、最適化した。384ウェルプレートの1ウェルあたり6,000個および12,000個の細胞を播種した。比例した体積の試薬/ウェルを、384ウェルプレートに対して使用した。上に記載されたようにシグナルを計測した。
B.結果
1.iPSC由来RPEの作製
幹細胞由来のRPEの発生的および機能的な特徴を同時にモニターするハイコンテントスクリーニングアッセイを開発した。図25Aは、iPSC由来RPEの純粋な培養物を得るための実験ストラテジーの概要を提供しており、それらの工程は、機能的立証のための細胞を調製するため、およびハイスループットスクリーニングにおいて使用するために必要である。iPSCを、OCT3/4、c−MYC、SOX2およびKLF4を発現するレトロウイルスベクターを使用して、ヒト成人女性皮膚線維芽細胞から作製した。選択されたiPSCコロニーの多能性を、以下の3つの多能性検証アッセイを使用して測定した:(I)多能性マーカーNANOG、SSEA4、TRA1−60、OCT3/4、c−MYC、SOX2およびKLF4に対するポジティブ免疫染色(図25B);(II)胚性幹細胞株と皮膚線維芽細胞とのNANOG、OCT3/4、c−MYC、SOX2およびKLF4のmRNA発現の比較。形質導入されたウイルスベクターは、OCT3/4、c−MYC、SOX2およびKLF4も発現したので、特異的なプライマーセットを使用して、内在性遺伝子座からの発現と全発現(ウイルスベクター+内在性)とを区別した(図25C)。iPSCにおける内在性遺伝子座からの多能性マーカーの発現は、皮膚線維芽細胞と比べて有意に高く、未分化なES細胞よりも比較的高いかまたは等しかった(図25C);(III)iPSCが3つすべての胚葉に分化する能力。図25Dに示されているように、このiPSC株は、3つすべての胚葉に分化する。
1.iPSC由来RPEの作製
幹細胞由来のRPEの発生的および機能的な特徴を同時にモニターするハイコンテントスクリーニングアッセイを開発した。図25Aは、iPSC由来RPEの純粋な培養物を得るための実験ストラテジーの概要を提供しており、それらの工程は、機能的立証のための細胞を調製するため、およびハイスループットスクリーニングにおいて使用するために必要である。iPSCを、OCT3/4、c−MYC、SOX2およびKLF4を発現するレトロウイルスベクターを使用して、ヒト成人女性皮膚線維芽細胞から作製した。選択されたiPSCコロニーの多能性を、以下の3つの多能性検証アッセイを使用して測定した:(I)多能性マーカーNANOG、SSEA4、TRA1−60、OCT3/4、c−MYC、SOX2およびKLF4に対するポジティブ免疫染色(図25B);(II)胚性幹細胞株と皮膚線維芽細胞とのNANOG、OCT3/4、c−MYC、SOX2およびKLF4のmRNA発現の比較。形質導入されたウイルスベクターは、OCT3/4、c−MYC、SOX2およびKLF4も発現したので、特異的なプライマーセットを使用して、内在性遺伝子座からの発現と全発現(ウイルスベクター+内在性)とを区別した(図25C)。iPSCにおける内在性遺伝子座からの多能性マーカーの発現は、皮膚線維芽細胞と比べて有意に高く、未分化なES細胞よりも比較的高いかまたは等しかった(図25C);(III)iPSCが3つすべての胚葉に分化する能力。図25Dに示されているように、このiPSC株は、3つすべての胚葉に分化する。
iPSCを、本明細書中に開示される方法を用いてRPEに分化させた。RPE様の敷石状の形態を有する有色素細胞クラスターを、手作業で拾い、T25フラスコ内で拡大して、RPE細胞の純粋な培養物を得た。精製されたRPE細胞を、トランスウェルフィルター上に再度播種することにより、およそ6〜8週間で、電気的にインタクトでコンフルエントな極性のあるRPE単層を得た。この段階において行われた上皮マーカーZO1に対する免疫染色から、それらの細胞の典型的な上皮の形態が確認された(図26A)。iPSC由来RPEは、頂端突起局在化(apical process localized)タンパク質であるEZRIN;RPEの色素沈着にとって重要な酵素であるDCT;RPEの体積制御にとって極めて重要な塩素チャネルであるCLCN2;およびRPE単層を横断したラクテート輸送に必要であり、細胞内pHの制御に関与する頂端膜モノカルボン酸トランスポーターであるSLC16A1も発現した。透過型電子顕微鏡像の解析から、これらの細胞におけるいくつかの典型的なRPEの特徴(例えば、主に頂端に局在する葉巻形および卵形のメラノソーム(me,矢頭)、隣接した細胞間のタイトジャンクション(tj)および頂端突起(矢印))が明らかになった(図26B)。
ヒトの天然のRPE細胞および培養RPE細胞の多くの特徴的な生理反応は、インビトロで計測され得る。iPSC由来RPE単層培養物は、これらの特徴のうちのいくつかを示す。これらの細胞は、電気的にインタクトであり、170〜200Ω・cm2という単層を横断する経上皮抵抗を示し(図26Cおよび26D)、それらの定常状態の細胞内カルシウム濃度は、約120nMである。天然のRPEと同様に、iPSC由来RPEにおいても、ATPによって頂端膜P2Y2レセプターを刺激すると、典型的な二相反応が生じ、最初の反応シグナルは、小胞体から細胞質への細胞内カルシウムの放出であり、第2の相は、細胞外のCa2+の存在に依存する(Maminishkisら、Investigative ophthalmology & visual science 47(8):3612−3624,2006)。シクロピアゾン酸を適用すると、ER膜上に位置するATP依存性カルシウム再取り込みチャネルである筋/小胞体Ca2+ATPアーゼが遮断され、定常状態のカルシウム増加に至り、ATP応答が鈍る(図26C)。電気生理学的には、頂端膜および基底膜の静止膜電位は、およそ−55mVであり(頂端側と比べて基底側がわずかにより脱分極している)、頂端側が正である約2.5mVという単層を横断する経上皮電位(TEP)となる(図26D)。暗所から明所に移動した後のインビボでの網膜下腔K+の変化を模倣する、頂端バスにおけるK+濃度の5mMから1mMへの変化は、頂端膜を有意に10〜20mV過分極させるので、TEPが急に低下する(17,20)。頂端膜へのATPの適用は、細胞内ストアからのカルシウムの放出および側底膜Ca2+活性化型Cl−チャネルの活性化の後に、側底膜を有意に脱分極させる(Maminishkisら、前出;Quinnら、前出;Steinbergら、Documenta ophthalmologica.Advances in ophthalmology 60(4):327−346,1985)。
未分化なiPSC、iPSC由来RPEおよび初代ヒト胎児RPEにおける多能性遺伝子およびRPEシグネチャ遺伝子の発現を、qRT−PCRを使用して比較した(Liaoら、Human molecular genetics 19(21):4229−4238,2010;Strunnikovaら、Human molecular genetics 19(12):2468−248,2010)。2つの主要な多能性遺伝子OCT3/4(POU5F1とも呼ばれる)およびSOX2は、未分化なiPSCと比べて、iPSC由来RPEにおいてダウンレギュレートされることから、多能性の状態の喪失が示唆される。しかしながら、他のいくつかのRPE特異的転写因子、色素沈着経路遺伝子、視覚サイクル遺伝子、構造タンパク質およびチャネルは、iPSC由来RPEにおいて、未分化なiPSCと比べて有意に高いレベルで発現され、初代RPEと比べて、より低いレベルまたは同様のレベルで発現された(表A)。
これらの結果は、iPSC由来RPEが、RPE様の表現型を獲得したが、完全に成熟した状態ではないことを示唆している。iPSC由来RPEが、より高いレベルの胎児遺伝子または前駆体遺伝子(SOX2およびKLF4,表Aを参照のこと)を発現するという事実にもかかわらず、これらの細胞の生理反応が有意に損なわれないことは、注目に値する。
立証されたiPSC由来RPEを使用する、拡張可能なハイスループットマルチプレックス遺伝子発現アッセイの原理証明
立証されたiPSC由来RPEを使用する、拡張可能なハイスループットマルチプレックス遺伝子発現アッセイの原理証明
目標は、RPEに対する発生マーカー、機能マーカーおよび疾患マーカーを同時にモニターできるハイスループットスクリーニングアッセイを開発すること、ならびにそのアッセイの原理証明の解析を行うことだった。そのスクリーニングアッセイのプラットフォームを設計する際、2つの主な理由のために、マルチプレックス遺伝子発現アッセイを選択した:(1)それが、RPEの発生、分化、機能および病態に関わる遺伝子の同時検出を可能にするハイコンテントアッセイであること;(2)それが、標準的なスクリーニング装置を使用したハイスループットスクリーニングに対して容易に適用できること。異なる細胞プロセス−RPEの発生および分化(SOX2およびPAX6)、RPEの機能(チロシナーゼ、RPE65、RDH5、TRPM1、CSPG5およびBEST1)ならびにRPEの病態(チロシナーゼ、RPE65、RDH5、BEST1)を計測する遺伝子を選択した。図27Aは、マルチプレックスアッセイの概要を要約しており、図27Bは、アッセイの原理の概略図を示しており、図27Cは、このマルチプレックスアッセイにおいて使用される遺伝子、それらのアクセッション番号、それらのmRNAのそれぞれの長さ、ならびに捕捉エクステンダーおよび標識エクステンダーがハイブリダイズする領域のリストを提供している。手短に言えば、マイクロタイタープレートにおいて調製された細胞溶解産物中の単離されたmRNAが、アンチセンスオリゴヌクレオチド技術を用いて、LUMINEX(登録商標)ビーズに結合される。検出プローブ(ビオチン−ストレプトアビジン−フィコエリトリン)が、アンチセンスオリゴヌクレオチド技術を用いて特異的なmRNAにハイブリダイズされる。mRNAの定量は、各ビーズ上の特異的な蛍光標識を認識してビーズ1つあたりのシグナル強度を計測するフローサイトメトリーベースの機器を使用して行われる。
原理証明として、96ウェルまたは384ウェルプレートのウェルにおいて、未分化なiPSCとiPSC由来RPEと初代ヒト胎児RPEとの間で複数の遺伝子の差次的なレベルを同時に検出するマルチプレックス遺伝子発現アッセイの実行可能性を実証した。最適化のために合計9つの遺伝子を選択した。以前の研究によって、2つのハウスキーピング遺伝子であるHPRT1およびB2Mの発現が、このアッセイにおいて使用される3つの細胞型の間で有意に異ならないことが示唆されたので(22)、これらの2つの遺伝子をデータの正規化のために使用した。RPEの分化、機能および病態を解析するために、SOX2、PAX6、RPE65、RDH5、CSPG5、TRPM1およびBEST1の発現をモニターした。インビトロ培養の場合、より高密度で播種された細胞は、より低い密度で播種された細胞と比べてより速く成熟する。ゆえに、iPSC由来RPEと初代胎児RPEの両方を、2つの細胞密度、25,000細胞/ウェルまたは50,000細胞/ウェルで播種した(図28B〜D)。未分化なiPSCを、追加のコントロールとして使用した(図28A)。iPSC由来RPEおよび初代RPEを、2週間培養することにより、コンフルエントな有色素の単層を得た。すべての細胞型に対して同時にアッセイを行うために、iPSCを後で培養し、たった5日間でコンフルエンスに到達させた。精製されたRNA、ならびに未分化なiPSC、iPSC由来RPE(低および高細胞密度)および初代RPE(低および高細胞密度)からの溶解産物を使用して、各プローブセットに対して、検出の線形範囲を計算した(図36)。すべてのプローブが、16倍の連続希釈にわたって、バックグラウンドより高いシグナルを検出した。この段階希釈から作成された線形回帰プロットは、すべての場合において0.97を超える測定値の係数をもたらしたことから、それらのプローブが、広い範囲のmRNA濃度にわたってシグナルを検出できることが示唆された。
このアッセイの結果は、未分化なiPSCと比べて(図28Eおよび28F)および高細胞密度の初代胎児RPEと比べて(図28Gおよび28H)、2つの異なる細胞密度でのiPSC由来RPEにおける遺伝子発現の変化倍率として表される。予想どおりに、未分化なiPSCと比べて、iPSC由来RPEは、より低いレベルの神経前駆体因子SOX2、ならびにより一層高いレベルのRPE特異的遺伝子PAX6、RPE65、RDH5、TRPM1およびBEST1を発現する。細胞外タンパク質であるCSPG5は、それら2つの細胞型において同様のレベルで発現される。この最適化の重要な目標は、マルチプレックスアッセイから得られた結果を、標準的なqRT−PCRアッセイから得られた結果と比較することだった(表A)。ゆえに、マルチプレックスアッセイから得られた遺伝子発現の変化倍率とqRT−PCRアッセイから得られた遺伝子発現の変化倍率との間のピアソン相関係数(r)を決定した。これらの結果は、それら2つのアッセイが、有意に相関することを示している(r値=0.69および0.75)。これは、マルチプレックスアッセイが、関連性のある遺伝子発現の変化を計測し、ハイスループットスクリーニングのために使用され得るという信頼性を提供する。結論として、このハイコンテント遺伝子発現アッセイは、未分化なiPSC、iPSC由来RPEおよび初代ヒトRPEに対してハイスループット形式において1日半で行われ得る。初代胎児RPEと比べたとき、iPSC由来RPEは、より低いレベルの分化RPEマーカー(RPE65、RDH5、CSPG5、BEST1)およびより高いレベルの前駆体転写因子PAX6およびSOX2を発現することから、これらの細胞の比較的未熟な状態が示唆される。しかしながら、マルチプレックスアッセイにおいて初代RPEとiPSC由来RPEとを比較することによって得られた結果が、表Aに表される標準的なqRT−PCRアッセイと強く相関することに注意することが重要である。
検出限界の評価およびアッセイの処理量の向上
マルチプレックスアッセイのもう1つの重要な局面である、所与のアッセイウェルにおける各転写物に対する検出限界を試験した。96ウェルプレートの1ウェルあたり1つの標的を解析するとき、マルチプレックス遺伝子発現アッセイに対して推奨される最小検出限界は、200個以下の転写物である。以下の式を使用して、本発明者らのプローブセットの検出限界(LOD)を計算した:LOD=4つのウェルの平均バックグラウンド値+その平均バックグラウンド値の3×標準偏差(Affymetrix,製造者マニュアル)。このアッセイは、記載された限界よりも有意に高感度であり、以下の検出値が得られた:SOX2=41、PAX6=32、RPE65=24、RDH5=10、CSPG5=19、TRPM1=25、BEST1=11、HPRT1=55およびB2M=30。これらの転写物の数を考慮して、スクリーニング処理量の増大のためならびに試薬コストおよびスクリーニングコストの低下のために、そのアッセイを384ウェル形式で試験した。
マルチプレックスアッセイのもう1つの重要な局面である、所与のアッセイウェルにおける各転写物に対する検出限界を試験した。96ウェルプレートの1ウェルあたり1つの標的を解析するとき、マルチプレックス遺伝子発現アッセイに対して推奨される最小検出限界は、200個以下の転写物である。以下の式を使用して、本発明者らのプローブセットの検出限界(LOD)を計算した:LOD=4つのウェルの平均バックグラウンド値+その平均バックグラウンド値の3×標準偏差(Affymetrix,製造者マニュアル)。このアッセイは、記載された限界よりも有意に高感度であり、以下の検出値が得られた:SOX2=41、PAX6=32、RPE65=24、RDH5=10、CSPG5=19、TRPM1=25、BEST1=11、HPRT1=55およびB2M=30。これらの転写物の数を考慮して、スクリーニング処理量の増大のためならびに試薬コストおよびスクリーニングコストの低下のために、そのアッセイを384ウェル形式で試験した。
シグナルの検出範囲の線形性を調べるために、384ウェルプレートにおいて2つの細胞密度、6,000および12,000細胞/ウェルを用いてアッセイを行った。予想どおりに、384ウェルプレートで2週間培養した後、より低い細胞密度は、初代胎児RPE細胞とiPSC由来RPEの両方に対して、よりコンフルエントでなく、より少ない有色素の細胞層をもたらした(図35A〜35D)。2つの異なるビーズ濃度−96ウェルプレートの場合に推奨されるプローブ1つあたり700ビーズ/ウェル、およびプローブ1つあたり375ビーズ/ウェルを試験した。RPEの成熟を表すチロシナーゼである追加のプローブを、このアッセイに含めた。図35は、このアッセイが、両方のビーズ濃度を用いたとき、384ウェルプレートでも首尾よく最適化されたことを示している。このデータは、以下の3つの結論を支持する:(1)384ウェルプレートにおいて得られた結果は、96ウェルプレートにおいて得られた結果と似ている。例えば、初代RPEと比べたとき、iPSC由来RPEは、より高レベルのSOX2およびPAX6、ならびにより低いレベルのRPE分化/機能遺伝子を発現する;(2)2つのビーズ濃度は、384ウェルプレート形式においてほぼ同一の結果をもたらす;(3)384ウェルプレートにおけるマルチプレックスアッセイは、96ウェルプレートアッセイと比べて、qRT−PCRデータとよりよく相関する(多いビーズおよび少ないビーズに対してそれぞれ0.91および0.89というピアソン相関係数)。結論として、本結果は、最大10個の異なる遺伝子の発現の変化が、iPSC由来RPEの384ウェルプレートを用いて、同時に計測され得ることを実証した。
ここに提示されたアプローチは、前駆体遺伝子の発現をダウンレギュレートし、分化遺伝子の発現をアップレギュレートするがゆえに、培養中の多能性幹細胞由来RPEの系統的な成熟を可能にする小分子を同定するための詳細に明らかにされた方法を提供する。このiPSC由来RPEは、黄斑変性疾患の治療的介入においてより有効であり得、また、有効な疾患モデルとして働き得る。このスクリーニング方法は、疾患を引き起こす推定経路の活性を変化させる小分子を同定するため、および治療薬を発見するためにも使用され得る。
実施例9
QUANTIGENEPLEX(登録商標)2.0試薬システム−96ウェルアッセイプロトコル
QUANTIGENE PLEX(登録商標)96ウェルアッセイを、以下のプロトコルを用いて行った。細胞を、96ウェルプレートの1ウェルごとに播種し、1日おきに培地の交換を手作業で行って、それらのウェルを10日間にわたって37℃、5%CO2に調整した。次いで、個々のウェルからの細胞を、200μLのワーキング溶解混合物(Affymetrix)中で50℃において30分間、溶解した。80μLの細胞溶解産物を、すでに各ウェルに20μLの使用ビーズ混合物が入ったこのアッセイのハイブリダイゼーションプレート(96ウェル透明ポリプロピレンプレートAbgene#AB0796)に移した。各20μLのワーキングビーズ混合物は、6.6μLの溶解混合物、5.2μLのヌクレアーゼフリー水、0.2μLのプロテイナーゼK溶液、2μLのブロッキング試薬、5μLのプローブセット、1μLのLuminex磁気ビーズ(1000個のビーズ/遺伝子/ウェル)を含んだ。そのプローブセットおよびLuminexビーズは、QuantiGene Plexセット−パネル#11828に対応する。そのハイブリダイゼーションプレートを、圧力によって活性化される供給された透明のシールで密封し、加熱/振盪恒温器(LabNet VorTemp 56 P/N S−0256−Q)内に置き、600rpmで振盪しながら54℃±1℃において18〜22時間インキュベートした。このマルチプレックスアッセイにおいて使用される各磁気ビーズは、プローブセットとともに働いて、異なるmRNA標的を異なるビーズ上に捕捉する異なるssDNA捕捉プローブを有する。次いで、一晩ハイブリダイゼーション混合物を96ウェル磁気分離プレート(96ウェル平底マイクロプレートNunc#269620)に移した。Affymetrix手持ち式磁気ビーズ洗浄機(Affymetrix P/N QP0702)を使用してビーズを洗浄し、ゆえに、すべての未結合材料が除去された。100μLの2.0プレアンプリファイアワーキング試薬(製造者によって提供されるPreAmp溶液+Amp希釈剤を使用して3:1000希釈)を各アッセイウェルに加えた。その磁気分離プレートを、裏に接着剤が付いた箔で密封し、50℃±1℃および600rpmで1時間インキュベートした。未結合の2.0プレアンプリファイアを除去し、手持ち式磁気プレートを使用して、ビーズを100μLの洗浄緩衝液(製造者によって提供される)で3回洗浄した。100μLの2.0アンプリファイアワーキング試薬(製造者によって提供されるAmp溶液+Amp希釈剤を使用して3:1000希釈)を各アッセイウェルに加えた。その磁気分離プレートを密封し、50℃±1℃および600rpmで1時間インキュベートした。未結合の2.0アンプリファイアを除去し、手持ち式磁気ビーズ洗浄機を使用して、ビーズを100μLの洗浄緩衝液で3回洗浄した。100μLの標識プローブワーキング試薬(製造者によって提供される標識プローブ溶液+標識プローブ希釈剤を使用して3:1000希釈)を、各アッセイウェルに加えた。その磁気分離プレートを密封し、50℃±1℃および600rpmで1時間インキュベートした。未結合の標識プローブを除去し、手持ち式磁気ビーズ洗浄機を使用して、ビーズを100μLの洗浄緩衝液で3回洗浄した。100μLのSAPEワーキング試薬(製造者によって提供されるSAPE溶液+SAPE希釈剤を使用して3:1000希釈)を各アッセイウェルに加えた。その磁気分離プレートを密封し、アルミニウム箔で包み、RTおよび600rpmで30分間インキュベートした。未結合のSAPEワーキング試薬を除去し、手持ち式磁気ビーズ洗浄機を使用して、ビーズを100μLのSAPE希釈剤で3回洗浄した。まず、ビーズを130μLのSAPE希釈剤に再懸濁した後、ビーズからのシグナルを、50〜100ビーズ/メッセージ、50μLというサンプル体積および45秒間のサンプルタイムアウトというDDゲートの設定を使用し、Luminex Flex Map 3D機器を用いて計測した。
QUANTIGENEPLEX(登録商標)2.0試薬システム−96ウェルアッセイプロトコル
QUANTIGENE PLEX(登録商標)96ウェルアッセイを、以下のプロトコルを用いて行った。細胞を、96ウェルプレートの1ウェルごとに播種し、1日おきに培地の交換を手作業で行って、それらのウェルを10日間にわたって37℃、5%CO2に調整した。次いで、個々のウェルからの細胞を、200μLのワーキング溶解混合物(Affymetrix)中で50℃において30分間、溶解した。80μLの細胞溶解産物を、すでに各ウェルに20μLの使用ビーズ混合物が入ったこのアッセイのハイブリダイゼーションプレート(96ウェル透明ポリプロピレンプレートAbgene#AB0796)に移した。各20μLのワーキングビーズ混合物は、6.6μLの溶解混合物、5.2μLのヌクレアーゼフリー水、0.2μLのプロテイナーゼK溶液、2μLのブロッキング試薬、5μLのプローブセット、1μLのLuminex磁気ビーズ(1000個のビーズ/遺伝子/ウェル)を含んだ。そのプローブセットおよびLuminexビーズは、QuantiGene Plexセット−パネル#11828に対応する。そのハイブリダイゼーションプレートを、圧力によって活性化される供給された透明のシールで密封し、加熱/振盪恒温器(LabNet VorTemp 56 P/N S−0256−Q)内に置き、600rpmで振盪しながら54℃±1℃において18〜22時間インキュベートした。このマルチプレックスアッセイにおいて使用される各磁気ビーズは、プローブセットとともに働いて、異なるmRNA標的を異なるビーズ上に捕捉する異なるssDNA捕捉プローブを有する。次いで、一晩ハイブリダイゼーション混合物を96ウェル磁気分離プレート(96ウェル平底マイクロプレートNunc#269620)に移した。Affymetrix手持ち式磁気ビーズ洗浄機(Affymetrix P/N QP0702)を使用してビーズを洗浄し、ゆえに、すべての未結合材料が除去された。100μLの2.0プレアンプリファイアワーキング試薬(製造者によって提供されるPreAmp溶液+Amp希釈剤を使用して3:1000希釈)を各アッセイウェルに加えた。その磁気分離プレートを、裏に接着剤が付いた箔で密封し、50℃±1℃および600rpmで1時間インキュベートした。未結合の2.0プレアンプリファイアを除去し、手持ち式磁気プレートを使用して、ビーズを100μLの洗浄緩衝液(製造者によって提供される)で3回洗浄した。100μLの2.0アンプリファイアワーキング試薬(製造者によって提供されるAmp溶液+Amp希釈剤を使用して3:1000希釈)を各アッセイウェルに加えた。その磁気分離プレートを密封し、50℃±1℃および600rpmで1時間インキュベートした。未結合の2.0アンプリファイアを除去し、手持ち式磁気ビーズ洗浄機を使用して、ビーズを100μLの洗浄緩衝液で3回洗浄した。100μLの標識プローブワーキング試薬(製造者によって提供される標識プローブ溶液+標識プローブ希釈剤を使用して3:1000希釈)を、各アッセイウェルに加えた。その磁気分離プレートを密封し、50℃±1℃および600rpmで1時間インキュベートした。未結合の標識プローブを除去し、手持ち式磁気ビーズ洗浄機を使用して、ビーズを100μLの洗浄緩衝液で3回洗浄した。100μLのSAPEワーキング試薬(製造者によって提供されるSAPE溶液+SAPE希釈剤を使用して3:1000希釈)を各アッセイウェルに加えた。その磁気分離プレートを密封し、アルミニウム箔で包み、RTおよび600rpmで30分間インキュベートした。未結合のSAPEワーキング試薬を除去し、手持ち式磁気ビーズ洗浄機を使用して、ビーズを100μLのSAPE希釈剤で3回洗浄した。まず、ビーズを130μLのSAPE希釈剤に再懸濁した後、ビーズからのシグナルを、50〜100ビーズ/メッセージ、50μLというサンプル体積および45秒間のサンプルタイムアウトというDDゲートの設定を使用し、Luminex Flex Map 3D機器を用いて計測した。
実施例10
アフィディコリン
アフィディコリンは、細胞周期をS期初期において阻止する真核生物の核DNA複製の可逆的な阻害剤である。その構造は、四環式の小分子の構造である。人工的な膜/足場上で生育されているiPS細胞由来RPEに添加されるアフィディコリンは、RPEの表現型を改善する。それは、運命拘束されたRPE細胞を、さらに成熟させ、完全に分化して高度に分極した組織単層を形成させる(図30〜31を参照のこと)。アフィディコリンを第4の培地に溶解し、RPE細胞をその中で6〜8週間培養した後、解析が行われる。
アフィディコリン
アフィディコリンは、細胞周期をS期初期において阻止する真核生物の核DNA複製の可逆的な阻害剤である。その構造は、四環式の小分子の構造である。人工的な膜/足場上で生育されているiPS細胞由来RPEに添加されるアフィディコリンは、RPEの表現型を改善する。それは、運命拘束されたRPE細胞を、さらに成熟させ、完全に分化して高度に分極した組織単層を形成させる(図30〜31を参照のこと)。アフィディコリンを第4の培地に溶解し、RPE細胞をその中で6〜8週間培養した後、解析が行われる。
完全に分化して分極した、足場上のRPE組織は、網膜変性疾患に対するより有効な治療をもたらし得、インビトロ疾患モデリングおよびハイスループットスクリーニングに対するより「天然の」モデルも提供し得る。アフィディコリン処理は、完全に成熟したタイトジャンクションおよびより成熟した生理反応を有する組織をもたらす。生分解性足場と組み合わされるとき、この化合物は、RPE単層を刺激して、それ自体の細胞外マトリックスを分泌させ、真の組織に似た特徴を獲得する。
実施例11
アルギネートコーティングは、細胞生存率を高め、細胞剥離を減少させる
アルギネートによって増強される凍結保存プロトコルを、下記に提供する。結果は、図32A〜32Dに示されている。
アルギネートコーティングは、細胞生存率を高め、細胞剥離を減少させる
アルギネートによって増強される凍結保存プロトコルを、下記に提供する。結果は、図32A〜32Dに示されている。
1.10mmバイオプシーパンチ(ACCU−PUNCH(登録商標),USA)を使用して、hfRPEのコンフルエントな単層を含むトランスウェル膜を切除する。
2.サンプルを、オートクレーブ滅菌された0.7%アルギン酸ナトリウム(Sigma Aldrich,United Kingdom)を溶解したddH2Oに0.5秒間浸ける。
3.サンプルを、ddH2O中のオートクレーブ滅菌された2%CaCl2(Sigma Aldrich,USA)に0.5秒間漬けることにより、アルギネートを重合させる。
4.直ちに、サンプルを、1mLのCryoStor CS10(STEMCELL(登録商標),Canada)または10%DMSO凍結保存培地(500μLの5%RPE、400μLのFBS、100μLのDMSO)を含む2mLクライオバイアル(Corning,USA)に入れる。
5.クライオバイアルを氷上に30分間置く。
6.クライオバイアルを、4℃に予冷しておいたMr.Frosty凍結容器(Thermo Scientific,USA)に移し、1℃/分の速度で−80℃に冷却する。
7.サンプルを37℃のウォーターバス内で部分的に融解することによって、凍結保存された組織を回収する。
8.1mLの予め温めておいた5%RPE培地をクライオバイアルに完全に融解するまで加える。
9.サンプルを1mLの5%RPEに移して、凍結保存培地の構成要素をすすぐ。
10.サンプルを1mLの5%RPE培地に移動させる。
11.培地を毎日交換して、3日間にわたって回収する。
12.エチジウムホモダイマー−1(2.5μM)を使用して、細胞生存率を試験する。
SNAPWELL(商標)(Costar,US)システムの準備(図33A〜33E)。
1.ウェル底部からウェル上部を手作業で分離する(図2A)。
1.ウェル底部からウェル上部を手作業で分離する(図2A)。
2.足場(Stellenbosch Nanofiber Company(Pty)Ltd.,South Africa)をそれが平らに横たわるようにSNAPWELL(商標)底部の中心に置く(図2B)。
3.Oリング(ポリテトラフルオロエチレン(PTFE),12mm×10.25mm×1.2mm,Superior Washer and Gasket Corp,US)が足場を適所に保つように、そのOリングを足場の上に置く。そのOリングは、70%エタノール中での20分間の処理によって予め滅菌されていなければならない(図2C)。
4.Oリングの上にSNAPWELL(商標)の上部を置き、適所に軽く圧入する(図2D)。
細胞播種用の足場の調製
1.200mLの1×PBS(Life technologies,US)を、足場を有するSnapWell(商標)に分注する。室温で2時間放置する。
1.200mLの1×PBS(Life technologies,US)を、足場を有するSnapWell(商標)に分注する。室温で2時間放置する。
2.PBSを吸引除去し、200mLのヒト細胞外マトリックス(ECM)/フェノールレッド(PR)含有1×HBSS溶液を各SnapWell(商標)に加える(1バイアルECM:20mL HBSS)。ヒトECM(BD BioSciences,US
フェノールレッド含有1×HBSS(Life technologies,US)。
フェノールレッド含有1×HBSS(Life technologies,US)。
3.そのプレートを、蓋を開けてUV光の下に2時間置く。
4.2時間後、UVを切る。細胞調製中に溶液が乾燥しきらないようにするために、200mLのヒトECM/PR含有1×HBSS溶液に100mLのPR非含有1×HBSS(Life technologies,US)を加える。
細胞の播種
1.300mLのヒトECM/1×HBSS溶液を吸引除去する。
1.300mLのヒトECM/1×HBSS溶液を吸引除去する。
2.500mLの細胞懸濁物(250,000細胞/mLという密度での5%RPE培地中)を各ウェルに分注する。
RPEを分化させるために人工多能性幹(iPS)細胞技術を使用することにより、眼球の変性を有する患者に対する自己細胞ベースまたは同種細胞ベースの治療が提供される。幹細胞に由来するRPE細胞は、網膜の変性を有する患者の眼に、細胞懸濁物として注入されてきている。生分解性足場の上で極性のあるコンフルエントな単層として生育されたiPSC由来RPEからRPE組織が作製された。単一の単層組織を移植することによって、懸濁物に関連する問題を回避することができる。
RPE細胞は、パリレン−Cおよびポリイミドなどの生体適合性膜上で培養された(Dinizら、IOVS 2013)。これらの膜は、時間が経過しても分解せず、眼の中に永久的な外来性の実体を残すことから、時間が経過すると、タンパク質性材料を詰まらせ得る。本明細書中に開示されるのは、RPE層が成熟し、それ自体の外部環境を作り出したら、加水分解によって足場が除去される手法である。ゆえに、機能的かつ極性のあるRPE単層を足場上に作り出すための本発明者らの方法は、網膜変性疾患に対する治療を提供する実行可能な組織工学ストラテジーである。
RPE細胞を培養して、インビボモデルに移植されることにより網膜の(rental)疾患に対抗することができる機能的な組織にするために、生分解性足場を利用するプロトコルを作成した。この方法の主な構成要素は、CORNING(登録商標)COSTAR(登録商標)SNAPWELL(商標)プレート、生体不活性Oリングおよび生分解性足場である。SNAPWELL(商標)プレートは、生分解性足場に対して構造およびプラットフォームを提供する。頂端側および基底側を作り出す微多孔膜が、足場に支持を提供するため、ならびに極性のある細胞層の異なる側を隔離するために理想的である。SNAPWELL(商標)インサートが膜を剥離する能力のおかげで、そのインサートの支持リングが足場用のアンカーとして使用されることが可能になる。しかしながら、支持リングと膜とを組み合わせた後も、支持リングの底の縁(bottom lip)と多孔性膜自体との間に狭い空隙が存在する。ゆえに、本発明者らは、生体不活性Oリングを利用して、完全に適合させ、その空隙を満たした。これにより、支持リング(support rig)は、膜の外縁の周りに均一に圧力をかけることにより、膜に対して足場を保持することができる。
まず、SNAPWELL(商標)装置を解体し、支持リングを底部の膜から除去した。次に、生分解性足場を、SNAPWELL(商標)膜の内側の寸法にマッチするように予め切断し、その膜の底面に沿って平らに置いた。次いで、Oリングを、足場と膜の両方の上部のSNAPWELL(商標)インサートの膜の部分に直接置いた。次いで、SnapWell(商標)インサートを再度組み立てることにより、支持リングと多孔性膜との間に間隙が存在しないように、支持リングがOリングの上を確実に押すようにした。
培養デバイスにいずれの溶液を加える前も、足場を濡らし、エタノール処理および紫外線曝露などの手法を用いて滅菌した。次いで、この足場および膜構造は、足場の上に細胞を播種することによる、極性のある細胞の培養に適している。細胞が足場の上に置かれた後、組織が完全に発生し、機能的になるまで、追加の因子の適用を含む培養条件を維持した。次いで、その組織は、インビボモデルへの移植または他のインビトロ研究において使える状態になった。
上記培養用組立品は、膜から支持リングをはずし、Oリングを膜リングから取り除いて解体することができる。組織もまた、直接穴が開けられ得るか、またはデバイスから切除され得る。多孔性膜に組織を化学的に保持するものは無いので、その組織は、切除された後は膜から持ち上げられ、取りはずされる。得られたRPE組織は、光受容体の死を予防することおよび光受容体の再生を促進することによって、分解中の領域を蘇らせるために、網膜の変性を有する患者の網膜下腔に単一の実体として移植され得る。
本発明者の発明の原理が適用され得る多くの可能性のある実施形態を考慮すると、例証された実施形態は、本発明の単なる例であって、本発明の範囲に対する限定であると見なされるべきでないことが認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の請求項によって定義される。ゆえに、本発明者らは、これらの請求項の範囲および精神の中に入るすべてを本発明者らの発明として主張する。
Claims (5)
- 単層を横断する経上皮抵抗を計測することによって、人工多能性幹細胞(iPSC)が網膜色素上皮(RPE)細胞に分化したことを立証するための方法であって、170Ω・cm 2 以上の経上皮抵抗は、人工多能性幹細胞が網膜色素上皮細胞に分化したことを示す、方法。
- 前記iPSC由来のRPE細胞が、Ussingチャンバーの頂端バスおよび基底バスの中に配置される、請求項1に記載の方法。
- 前記経上皮抵抗が、リンガー液寒天橋と直列のカロメル電極対を用いて計測される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記iPSC由来のRPE単層を横断する前記経上皮抵抗が170〜200Ω・cm 2 である、請求項1、2または3に記載の方法。
- 定常状態の前記iPSC由来のRPE細胞の細胞内カルシウム濃度が120nMである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
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