JP2019006825A - 筋ジストロフィー治療のためのユートロフィン誘導に関するａｃｔｒｉｉｂタンパク質およびその改変体およびその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】筋ジストロフィー治療のためのユートロフィン誘導に関するＡＣＴＲＩＩＢタンパク質およびその改変体およびその使用の提供。【解決手段】特定の態様では、本発明は、筋ジストロフィーのための療法としてＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を用いて、筋肉におけるユートロフィン発現を誘導するための組成物および方法を提供する。本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質および／またはＡｃｔＲＩＩＢリガンドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法も提供する。【選択図】なし

Description

関連出願
この出願は、２００９年１１月１７日に出願された仮出願第６１／２８１，３８６号、
２０１０年３月２６日に出願された同第６１／３１８，１２６号および２０１０年５月５
日に出願された同第６１／３３１，６８６号の利益を主張する。上記で参照された出願の
教示のすべてが、参考として本明細書に援用される。

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、ジストロフィンをコードする遺伝子に
おける種々の異なる突然変異に起因する遺伝病である。ジストロフィンは、収縮する筋線
維に構造的完全性をもたらす大きな細胞骨格タンパク質である。ＤＭＤ患者は、あったと
してもわずかな機能性ジストロフィンを産生し、その結果、各筋線維を取り囲む筋細胞膜
が脆弱になる。この脆弱性の結果として、ＤＭＤ患者は、一般には２歳から６歳で始まる
骨格筋および心筋の進行性変性を示す。この疾患は、全身性の衰弱および筋消耗を引き起
こす。３０代前半を越えて生存することはめったにない。

関連し、そしていくらか軽度の状態であるベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）では
、患者はいくらかの機能性ジストロフィンを産生するが、筋肉組織の正常な耐久性および
維持をもたらすには不十分である。ＢＭＤ患者は、通常、ＤＭＤ患者よりも寿命が長い。

ＤＭＤおよびＢＭＤは現在のところ不治の疾患であるが、調査中の１つの治療的アプロ
ーチは、ユートロフィンと呼ばれるタンパク質のレベルを増加させる因子を用いた処置を
伴う。ユートロフィンは、ジストロフィンと構造的および機能的に類似している。さらに
、ユートロフィンは、通常、胎児発生の間に筋線維に存在し、神経筋接合部の成熟線維に
残る。ユートロフィンは、十分なレベルで、筋細胞膜に適切に局在化すると、ＤＭＤの動
物モデルにおいてジストロフィンが存在しないことを部分的に代償する証拠を示す。

ＤＭＤ患者およびＢＭＤ患者は正常なユートロフィン遺伝子を有し、ユートロフィン生
成を増加させることによって患者の筋線維の強度が増大する可能性があり得る。

したがって、ユートロフィン生成および／またはユートロフィンの筋細胞膜への局在化
を増加させる因子が必要とされている。

特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達経路のアンタゴニストを使用
することによって、ＤＭＤ患者およびＢＭＤ患者におけるユートロフィンの発現および／
または筋線維の細胞膜（筋細胞膜）への局在化を増加させるための方法を提供する。この
ようなアンタゴニストは、例えば、可溶性のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質（例えば、Ａｃｔ
ＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質）、ＡｃｔＲＩＩＢに結合する、またはＡｃｔＲＩＩＢの
発現を阻害するアンタゴニスト、およびＡｃｔＲＩＩＢを通じてシグナルを送り、骨格筋
または心筋におけるユートロフィンの発現の調節に関与するリガンドに結合する、または
その発現を阻害するアンタゴニストであり得る。このようなリガンドとしては、ミオスタ
チン、ＧＤＦ３、アクチビン、ＢＭＰ７、ＢＭＰ２およびＢＭＰ４が挙げられる。特に、
本開示は、筋ジストロフィーのマウスモデルにおいて、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパ
ク質が筋細胞膜でのユートロフィンの発現を増加させることを実証している。ＡｃｔＲＩ
ＩＢシグナル伝達経路のアンタゴニストは、筋細胞膜の損傷に対する抵抗性を増加させる
ことによって、ＤＭＤおよびＢＭＤなどのジストロフィン欠乏状態の特徴である筋肉傷害
、炎症および変性のサイクルを減少させ得る。これらの有益な作用は、全体的な筋肉の量
および強度に対するＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの明白な作用と合わさる。結果として
、本開示は、筋障害の管理におけるＡｃｔＲＩＩＢ経路のアンタゴニストの使用について
、筋線維のサイズおよび強度を増加させることを強調するパラダイムから、筋ジストロフ
ィーに特に関連性のある特徴である筋線維の完全性を増加させることを認めるパラダイム
へと移すパラダイムシフトを提供する。筋ジストロフィー患者における筋肉の脆弱性の結
果は、クレアチンキナーゼ（特にＭＭアイソフォーム、ＣＫ−ＭＭとも呼ばれる）などの
筋肉変性の血清マーカーの増加である。本明細書において提供されるデータは、ＡｃｔＲ
ＩＩＢ経路のアンタゴニストは、筋線維の完全性を増加させ、したがって、ＣＫ−ＭＭな
どの血清マーカーのレベルを減少させ得ることを示している。したがって、血清ＣＫ−Ｍ
Ｍレベルなどの筋肉変性のマーカーが、ＤＭＤ患者およびＢＭＤ患者におけるこのような
療法の有効性をモニターするための機構として使用され得る。例えば、筋肉変性のマーカ
ーの減少が不十分であることは、利益が不十分であるため、用量を増加させる、または投
薬を終了する指標として使用され得、そして、筋肉変性のマーカーの減少が成功したこと
は、成功裏の用量に達したことの指標として使用され得る。同様に、筋肉変性のマーカー
が上昇している患者は、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストで処置するために特に適した候補
であり得る。Ｚａｔｚら（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｓｃｉ． １９９１年１０２巻（２号
）：１９０〜６頁）に記載の通り、ＤＭＤ患者およびＢＭＤ患者では、ＣＫレベルは筋肉
変性が最大になる期間中に最大に到達し（一般には、ＤＭＤでは１〜６歳、７歳または８
歳、ＢＭＤでは１０〜１５歳の年齢範囲）、したがって、筋肉変性のマーカーが高レベル
である（この病態（ｄｉｓｅａｓｅ ｓｔａｔｅ）を有する他者と比較してさえ上昇して
いる、例えば、このような疾患を有する他の患者の５０％、６０％、７０％、８０％、９
０％より高い血清ＣＫ−ＭＭレベル）ＤＭＤ患者およびＢＭＤ患者は、ＡｃｔＲＩＩＢ−
Ｆｃタンパク質などのＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストで処置するために特に適した患者で
ある。

特定の態様では、本開示は、ユートロフィンの筋細胞膜での発現の増加を必要とする患
者に、有効量のＡｃｔＲＩＩＢ関連ポリペプチドを投与することによってユートロフィン
の筋細胞膜での発現を増加させるための方法を提供する。ＡｃｔＲＩＩＢ関連ポリペプチ
ドは、ＧＤＦ３、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、アクチビンま
たはＮｏｄａｌなどのＡｃｔＲＩＩＢリガンドに結合するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（
例えば、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインまたはその部分）であり得る。任意選択で、Ａ
ｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢリガンドに、１０マイクロモル濃度未満ま
たは１マイクロモル濃度未満、１００ナノモル濃度未満、１０ナノモル濃度未満または１
ナノモル濃度未満のＫｄで結合する。種々の適切なＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、その
全てが本明細書中に参考として援用される以下の公開されたＰＣＴ特許出願に記載されて
いる：ＷＯ００／４３７８１、ＷＯ０４／０３９９４８、ＷＯ０６／０１２６２７、ＷＯ
０７／０５３７７５、ＷＯ０８／０９７５４１、およびＷＯ０８／１０９１６７。任意選
択で、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢリガンドによって誘発される細胞
内のシグナル伝達事象などの、ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達を阻害する。このような調製
物に用いられる可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１、２、５、１２および
２３から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号：１、２、５、
１２および２３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５
％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどの本明細書に
開示されるもののいずれかであり得る。可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、天然のＡ
ｃｔＲＩＩＢポリペプチドの機能的フラグメント、例えば、配列番号１、２、５、１２お
よび２３から選択される配列の少なくとも１０、２０もしくは３０アミノ酸を含むもの、
またはＣ末端の１、２、３、４、５もしくは１０〜１５アミノ酸を欠き、Ｎ末端の１、２
、３、４もしくは５アミノ酸を欠く配列番号１の配列を含み得る。任意選択で、ポリペプ
チドは、配列番号１と比較して、Ｎ末端の２〜５アミノ酸、およびＣ末端の３以下のアミ
ノ酸の切断を含む。別のポリペプチドは、配列番号１２として示されているものである。
可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、天然に存在するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに対
して、（例えば、リガンド結合ドメインにおいて）アミノ酸配列に１、２、３、４、５以
上の変更を含み得る。アミノ酸配列の変更は、例えば哺乳動物、昆虫もしくは他の真核細
胞において生成される場合にポリペプチドのグリコシル化を変更し得るか、または、天然
に存在するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに対して、ポリペプチドのタンパク質分解による
切断を変更し得る。可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つのドメインとして、Ａｃ
ｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢのリガンド結合ドメインまたはその改
変体）と、所望の特性、例えば、改良された薬物動態、より容易な精製、特定の組織への
標的化などを提供する１または複数のさらなるドメインとを有する融合タンパク質であり
得る。例えば、融合タンパク質のドメインは、インビボ安定性、インビボ半減期、取込み
／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成、融合タンパク質の多量体化
、および／または精製のうちの１または複数を増強し得る。可溶性のＡｃｔＲＩＩＢ融合
タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメイン、例えばＦｃドメイン（野生型または変異体
）など、または血清アルブミンを含み得る。特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ
融合物は、Ｆｃドメインと細胞外のＡｃｔＲＩＩＢドメインとの間に位置する比較的構造
化されていないリンカーを含む。この構造化されていないリンカーは、ＡｃｔＲＩＩＢの
細胞外ドメインのＣ末端の約１５アミノ酸の構造化されていない領域（「テール」）に対
応することができるか、またはそれは、二次構造が比較的存在しない５〜１５、２０、３
０、５０もしくはそれ以上のアミノ酸の人工配列であってもよい。リンカーは、グリシン
残基およびプロリン残基が豊富であり得、そして例えば、トレオニン／セリンおよび／ま
たはグリシンの繰り返し配列または非繰り返し配列（例えば、ＴＧ_４、ＴＧ_３、ＳＧ_４、
ＳＧ_３、Ｇ_４、Ｇ_３、Ｇ_２、Ｇ）を含み得る。融合タンパク質は、エピトープタグ、ＦＬ
ＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、および、ＧＳＴ融合物のような精製サブ配列（ｐｕｒｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み得る。任意選択で、可溶性ＡｃｔＲ
ＩＩＢポリペプチドは、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミ
ノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合体化されたアミノ酸、
および有機誘導体化因子（ｏｒｇａｎｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）に
結合体化されたアミノ酸から選択される１または複数の修飾されたアミノ酸残基を含む。
一般に、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、患者における望ましくない免疫応答の可能性を低
減するために、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の天然のグリコシル化を適切に媒介する哺乳動
物細胞株において発現されることが好ましい。ヒトおよびＣＨＯの細胞株は、首尾よく使
用されており、そして、他の一般的な哺乳動物発現ベクターが有用であることが予想され
る。

特定の態様では、本明細書に開示されている化合物は薬学的調製物として処方すること
ができる。薬学的調製物は、ＡｃｔＲＩＩＢ関連障害を処置するために使用される化合物
のような１または複数のさらなる化合物も含み得る。薬学的調製物は、実質的に発熱物質
を含まないことが好ましい。

特定の態様では、本開示は、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードし、完全なＡ
ｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードしない核酸を提供する。単離されたポリヌクレオチド
は、上述のような可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコード配列を含み得る。例えば、
単離された核酸は、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン（例えば、リガンド結合ドメイン）
をコードする配列およびＡｃｔＲＩＩＢの、膜貫通ドメインおよび／もしくは細胞質ドメ
インの一部もしくは全部をコードする配列を含み得るが、膜貫通ドメイン内もしくは細胞
質ドメイン内、または、細胞外ドメインと膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメインとの間
に位置する終止コドンは除く。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号４など
の完全長ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチド配列（図４）または部分的切断バージョンを含
むことができ、前記単離されたポリヌクレオチドは、３’末端の少なくとも６００ヌクレ
オチド前に、さもなければ、ポリヌクレオチドの翻訳が、完全長ＡｃｔＲＩＩＢの切断部
分に任意選択で融合される細胞外ドメインを生成するように置かれた転写終結コドンをさ
らに含む。本明細書に開示されている核酸は、発現のためのプロモーターに作動可能に連
結され得、そして、本開示は、このような組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞
を提供する。細胞は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物の細胞であることが好ましい。

特定の態様では、本開示は、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを作製するための方法
を提供する。このような方法は、適切な細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃ
ＨＯ）細胞などにおいて、本明細書中に開示される核酸のいずれか（例えば、配列番号３
）を発現させることを包含し得る。このような方法は、ａ）可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペ
プチドの発現に適した条件下で細胞を培養するステップであって、前記細胞が、可溶性の
ＡｃｔＲＩＩＢ発現構築物で形質転換される、ステップと、ｂ）このようにして発現され
た可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを回収するステップとを包含し得る。可溶性Ａｃｔ
ＲＩＩＢポリペプチドは、細胞培養物からタンパク質を得るための周知技術のいずれかを
用いて、粗製、部分的に精製された、または高度に精製された画分として回収することが
できる。

特定の態様では、本明細書に記載の化合物を使用して筋細胞膜でのユートロフィンの発
現を増加させることは、ジストロフィンタンパク質が存在しない、欠乏している、または
欠損している筋ジストロフィーの処置において有用であり得る。例としては、デュシェン
ヌ型筋ジストロフィーおよびベッカー型筋ジストロフィーの処置が挙げられる。

特定の態様では、本開示は、細胞におけるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲ
ＩＩＢリガンド（例えば、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、アクチビン、ＢＭＰ７、およびＮｏｄ
ａｌ）の活性に拮抗するための方法を提供する。方法は、細胞を可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポ
リペプチドと接触させるステップを含む。任意選択で、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまた
はＡｃｔＲＩＩＢリガンドの活性を、ＡｃｔＲＩＩＢ／ＡｃｔＲＩＩＢリガンド複合体に
よって媒介されるシグナル伝達によって、例えば、細胞増殖、肥大、またはユートロフィ
ンの発現のレベルまたはユートロフィンの局在化をモニターすることによってモニターす
る。この方法の細胞としては、ミオサイトおよび筋肉細胞が挙げられる。

特定の態様では、本開示は、本明細書に記載の障害または状態を処置するための医薬を
作製するための、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの使用を提供する。

特定の態様では、本開示は、ユートロフィンの筋細胞膜での発現の増加を必要とする患
者においてユートロフィンの筋細胞膜での発現を増加させるための方法を提供し、このよ
うな方法は、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも９０％同一であるア
ミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号３の核酸（図３）とストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプ
チドからなる群より選択される化合物を有効量で投与することを包含し得る。ポリペプチ
ドは、異種部分を含む融合タンパク質であり得る。ポリペプチドは、二量体であり得る。
ポリペプチドは、免疫グロブリンの定常ドメインと融合され得る。ポリペプチドは、Ｉｇ
Ｇ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４などの免疫グロブリンのＦｃ部分と融合され得
る。ポリペプチドは、配列番号２（図２）のアミノ酸２９〜１０９、２９〜１２８、２９
〜１３１、２９〜１３４、２５〜１０９、２５〜１２８、２５〜１３１、２５〜１３４ま
たは２０〜１３４の配列と少なくとも８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％
、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。ポリペプチドは、配列番号
５、１２または２３のアミノ酸の配列と少なくとも８０％、９０％、９３％、９５％、９
７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。このような化
合物で処置される患者は、本明細書に記載の障害、例えば、筋ジストロフィーを含めた障
害を有する患者であり得る。

特定の態様では、本開示は、ユートロフィンの筋細胞膜での発現の増加を必要とする患
者において、ユートロフィンの筋細胞膜での発現を増加させるための方法であって、Ａｃ
ｔＲＩＩＢ、またはＡｃｔＲＩＩＢを通じてシグナルを送るリガンドのいずれかを標的化
することによってＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達経路を阻害する化合物を、有効な量で投与
することを包含する方法を提供する。このような化合物の例としては、ＡｃｔＲＩＩＢの
アンタゴニスト；ミオスタチンのアンタゴニスト；ＢＭＰ７のアンタゴニスト；ＢＭＰ２
のアンタゴニスト；ＢＭＰ４のアンタゴニストおよびＧＤＦ３のアンタゴニストが挙げら
れる。前述のそれぞれのアンタゴニストは、このような標的に特異的に結合し、それを阻
害する抗体または他のタンパク質（例えば、モノクローナル抗体などの抗体、または、ミ
オスタチンおよびＧＤＦ３の場合ではプロペプチド）であり得る。また、前述のアンタゴ
ニストは、ＡｃｔＲＩＩＢまたはリガンドの発現を阻害する核酸ベースの化合物（例えば
、アンチセンス核酸またはＲＮＡｉ核酸）などの化合物であり得る。このような化合物で
処置される患者は、本明細書に記載の障害、例えば、筋ジストロフィーを含めた障害を有
する患者であり得る。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
筋細胞膜のユートロフィンの増加を必要とする患者において、筋細胞膜のユートロフィ
ンを増加させるための方法であって、該方法は、以下：
ａ．配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸
配列を含むポリペプチド；および
ｂ．ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号３の核酸とハイブリ
ダイズする核酸によってコードされるポリペプチド
からなる群より選択される化合物を有効量で投与するステップを含む、方法。
（項目２）
上記ポリペプチドが、ＡｃｔＲＩＩＢに対して異種である部分を含む融合タンパク質で
ある、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記ポリペプチドが二量体である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
上記ポリペプチドが、免疫グロブリンの定常ドメインに融合している、項目１から３ま
でのいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
上記ポリペプチドが、免疫グロブリンのＦｃ部分に融合している、項目１から４までの
いずれか一項に記載の方法。
（項目６）
上記免疫グロブリンがヒトＩｇＧ１である、項目５に記載の方法。
（項目７）
上記ポリペプチドが、配列番号５または２３の配列を含む、項目１から６までのいずれ
か一項に記載の方法。
（項目８）
上記患者がデュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する、項目１から７までのいずれか一
項に記載の方法。
（項目９）
上記患者がベッカー型筋ジストロフィーを有する、項目１から７までのいずれか一項に
記載の方法。
（項目１０）
上記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも９５％同
一であるアミノ酸配列を含む、項目１から９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
上記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも９７％同
一であるアミノ酸配列を含む、項目１から９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
上記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも９９％同
一であるアミノ酸配列を含む、項目１から９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
上記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２５〜１３１の配列と少なくとも９０％同
一であるアミノ酸配列を含む、項目１から９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
上記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２５〜１３１の配列と少なくとも９５％同
一であるアミノ酸配列を含む、項目１から９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
上記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２５〜１３１の配列と少なくとも９７％同
一であるアミノ酸配列を含む、項目１から９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
上記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２５〜１３１の配列と少なくとも９９％同
一であるアミノ酸配列を含む、項目１から９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
上記化合物を投与することにより、処置される上記患者において筋線維の筋細胞膜の強
度が増大する、項目１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
上記ユートロフィンの発現が骨格筋または心筋で増加する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
筋細胞膜のユートロフィンの増加を必要とする患者において、筋細胞膜のユートロフィ
ンを増加させるための方法であって、該方法は、以下：
ａ．ＡｃｔＲＩＩＢのアンタゴニスト；
ｂ．ミオスタチンのアンタゴニスト；
ｃ．アクチビンＡのアンタゴニスト；および
ｄ．アクチビンＢのアンタゴニスト
からなる群より選択される化合物を有効量で投与するステップを含む、方法。
（項目２０）
上記化合物がＡｃｔＲＩＩＢのアンタゴニストである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
上記ＡｃｔＲＩＩＢのアンタゴニストが、ＡｃｔＲＩＩＢに結合する抗体、およびＡｃ
ｔＲＩＩＢをコードする核酸とハイブリダイズし、ＡｃｔＲＩＩＢの産生を阻害する核酸
からなる群より選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
上記化合物がミオスタチンのアンタゴニストである、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
上記ミオスタチンのアンタゴニストが、ミオスタチンに結合する抗体、ミオスタチンを
コードする核酸とハイブリダイズし、ミオスタチンの産生を阻害する核酸、およびミオス
タチンのプロペプチドまたはその改変体を含むポリペプチドからなる群より選択される、
項目２２に記載の方法。
（項目２４）
上記化合物がアクチビンＡのアンタゴニストである、項目１９に記載の方法。
（項目２５）
上記アクチビンＡのアンタゴニストが、アクチビンＡに結合する抗体、およびアクチビ
ンＡをコードする核酸とハイブリダイズし、アクチビンＡの産生を阻害する核酸からなる
群より選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
上記化合物がアクチビンＢのアンタゴニストである、項目１９に記載の方法。
（項目２７）
上記アクチビンＢのアンタゴニストが、アクチビンＢに結合する抗体、およびアクチビ
ンＢをコードする核酸とハイブリダイズし、アクチビンＢの産生を阻害する核酸からなる
群より選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
上記患者の筋肉変性についてのマーカーが上昇している、項目１から２７までのいずれ
か一項に記載の方法。
（項目２９）
上記患者の筋肉変性についてのマーカーのレベルが、同じ病態の患者についての標準値
と比較して上昇している、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
上記患者の血清ＣＫ−ＭＭレベルが上昇している、項目２８または２９に記載の方法。
（項目３１）
上記患者の血清ＣＫ−ＭＭレベルが、同じ病態の患者についての標準値と比較して上昇
している、項目２８または２９に記載の方法。
（項目３２）
筋肉変性についてのマーカーを評価するステップと、該筋肉変性についてのマーカーの
レベルに基づいて用量レベルまたは頻度を選択するステップとをさらに含む、項目１から
３１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
上記筋肉変性についてのマーカーが血清ＣＫ−ＭＭである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
筋肉変性についてのマーカーが上昇しているＤＭＤまたはＢＭＤの患者を処置するため
の方法であって、該方法は、該患者に、以下：
ａ．配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸
配列を含むポリペプチド；および
ｂ．ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号３の核酸とハイブリ
ダイズする核酸によってコードされるポリペプチド
からなる群より選択される化合物を有効量で投与するステップを含む、方法。
（項目３５）
上記筋肉変性についてのマーカーが血清ＣＫ−ＭＭである、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
上記ポリペプチドが、ＡｃｔＲＩＩＢに対して異種である部分を含む融合タンパク質で
ある、項目３４または３５に記載の方法。
（項目３７）
上記ポリペプチドが二量体である、項目３４から３６までのいずれか一項に記載の方法
。
（項目３８）
上記ポリペプチドが、免疫グロブリンの定常ドメインに融合している、項目３４から３
７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
上記ポリペプチドが、免疫グロブリンのＦｃ部分に融合している、項目３８に記載の方
法。
（項目４０）
上記免疫グロブリンがヒトＩｇＧ１である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
上記ポリペプチドが、配列番号５または２３の配列を含む、項目３４から４０までのい
ずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
上記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも９５％同
一であるアミノ酸配列を含む、項目３４から４０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
上記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも９７％同
一であるアミノ酸配列を含む、項目３４から４０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
上記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも９９％同
一であるアミノ酸配列を含む、項目３４から４０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
上記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２５〜１３１の配列と少なくとも９０％同
一であるアミノ酸配列を含む、項目３４から４０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
上記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２５〜１３１の配列と少なくとも９５％同
一であるアミノ酸配列を含む、項目３４から４０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
上記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２５〜１３１の配列と少なくとも９７％同
一であるアミノ酸配列を含む、項目３４から４０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
上記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２５〜１３１の配列と少なくとも９９％同
一であるアミノ酸配列を含む、項目３４から４０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
上記化合物を投与することにより、処置される上記患者において筋線維の筋細胞膜の強
度が増大する、項目３４から４８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
上記ユートロフィンの発現が骨格筋または心筋で増加する、項目３４から４９までのい
ずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
筋肉変性についてのマーカーを評価するステップと、該筋肉変性についてのマーカーの
レベルに基づいて用量レベルまたは頻度を選択するステップとをさらに含む、項目３４か
ら５０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
上記筋肉変性についてのマーカーが血清ＣＫ−ＭＭである、項目５１に記載の方法。

本特許または出願のファイルは、カラーで製作された少なくとも１つの図面を含有する
。（１または複数の）カラーの図面を伴う本特許または特許出願公開のコピーは、要請し
、必要な料金を支払えば、特許庁により提供されるであろう。

図１は、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ可溶性（細胞外）ポリペプチド配列（配列番号１）を示す。Ｃ末端の「テール」に下線を付した。 図２は、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質配列（配列番号２）を示す。シグナルペプチドに下線を付し；細胞外ドメイン（配列番号１とも呼ばれる）を太字にし；潜在的なＮ−連結グリコシル化部位を枠で囲った。 図３は、配列番号３で示される、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ可溶性（細胞外）ポリペプチドをコードする核酸配列を示す。 図４は、配列番号４で示される、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質をコードする核酸配列を示す。 図５は、本明細書において推定される残基を有するヒトＡｃｔＲＩＩＡ（配列番号１４）およびヒトＡｃｔＲＩＩＢのアラインメントを示し、これは、枠で示した、リガンドと直接接触させるための多数のＡｃｔＲＩＩＢおよびＡｃｔＲＩＩＡの結晶構造（リガンド結合ポケット）の合成分析に基づく。 図６は、種々の脊椎動物のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質およびヒトＡｃｔＲＩＩＡ（配列番号１５〜２２）の複数の配列アラインメントを示す。 図７は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃの完全なアミノ酸配列を示す。ＴＰＡリーダー（残基１〜２２）および切断されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（天然の残基２５〜１３１）のそれぞれに下線を付す。配列決定によって成熟融合タンパク質のＮ末端アミノ酸であることが明らかになったグルタミン酸を目立たせている。 図２は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す（上にコード鎖を示し、下に３’〜５’で相補物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を示している）。ＴＰＡリーダーをコードする配列（ヌクレオチド１〜６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインをコードする配列（ヌクレオチド７３〜３９６）に下線を付す。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）に対応するアミノ酸配列も示されている。 図２は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す（上にコード鎖を示し、下に３’〜５’で相補物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を示している）。ＴＰＡリーダーをコードする配列（ヌクレオチド１〜６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインをコードする配列（ヌクレオチド７３〜３９６）に下線を付す。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）に対応するアミノ酸配列も示されている。 図９は、筋ジストロフィーのｍｄｘマウスモデルにおける、筋肉におけるユートロフィンタンパク質レベルに対する、２０週間にわたるＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃ処置の作用を示す。Ａ．大胸筋のホモジネートにおけるユートロフィンタンパク質のウェスタンブロット分析。Ｂ．Ａに示されているユートロフィンバンドの、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）タンパク質に対して正規化した濃度測定による定量化であり、相対単位（ＲＵ）で表している。データは、平均±ＳＥＭ；群当たりｎ＝５；＊、ｐ＜０．０５である。中年のｍｄｘマウスをＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃを用いて慢性的な処置をすることにより、胸筋におけるユートロフィンレベルが８０％超増加した。 図１０は、筋ジストロフィーのｍｄｘマウスモデルにおける、筋線維におけるユートロフィンの分布に対する、２０週間にわたるＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃ処置の作用を示す。長指伸筋（ｅｘｔｅｎｓｏｒ ｄｉｇｉｔｏｒｕｍ ｌｏｎｇｕｓ）（ＥＤＬ）を通った横断切片を示している。スケールバーは５０μｍである。ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃ処置により、筋細胞膜のユートロフィンのレベルが広く増加した。Ａ．ｍｄｘマウスを、ビヒクルで処置した。Ｂ．ｍｄｘマウスを、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃで処置した。 図１１は、図１０をより明瞭にするために拡大したものを示す。スケールバーは５０μｍである。Ａ．ｍｄｘマウスを、ビヒクルで処置した。Ｂ．ｍｄｘマウスを、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃで処置した。 図１２は、血清クレアチンキナーゼレベルに対するＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃの作用を示す。Ａ．実施例７に記載の試験の実験設計を示す。Ｂ．グラフは、４つの実験群それぞれについての血清クレアチンキナーゼレベルを示す。第４群は、第１群〜第３群のそれぞれよりも統計学的に低い血清クレアチンキナーゼレベルを有した。

１．概要
特定の態様では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。本明細書中で使用
される、用語「ＡｃｔＲＩＩＢ」は、任意の種に由来するアクチビンＩＩＢ型受容体（Ａ
ｃｔＲＩＩＢ）タンパク質およびＡｃｔＲＩＩＢ関連タンパク質のファミリーを指す。Ａ
ｃｔＲＩＩＢファミリーのメンバーは、一般に、全てが、システインリッチ領域を有する
リガンド結合性細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／スレオニンキナー
ゼ特異性を有する細胞質ドメインで構成される、膜貫通タンパク質である。ヒトＡｃｔＲ
ＩＩＡ前駆体タンパク質（配列番号１４、比較のために提供した）およびＡｃｔＲＩＩＢ
前駆体タンパク質のアミノ酸配列を図５に示す。

用語「ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩＢファミリーのメンバーの任意
の天然に存在するポリペプチド、ならびに、有用な活性を保持するその任意の改変体（変
異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを指
すために使用される。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプ
チドの配列と少なくとも約８０％同一の配列、および、好ましくは少なくとも８５％、９
０％、９５％、９７％、９９％またはそれより高い同一性を有する任意の公知のＡｃｔＲ
ＩＩＢの配列から誘導されたポリペプチドを包含する。

特定の実施形態では、本発明は、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。本明細
書に記載の通り、用語「可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」は、一般に、ＡｃｔＲＩＩ
Ｂタンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチドを指す。本明細書中で使用される場合
、用語「可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」は、任意の天然に存在するＡｃｔＲＩＩＢ
タンパク質の細胞外ドメイン、ならびに、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異
体、フラグメントおよびペプチド模倣形態を含む）を包含する。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ
タンパク質の細胞外ドメインは、リガンドに結合し、また、一般に可溶性である。可溶性
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの例としては、図１に示したＡｃｔＲＩＩＢ可溶性ポリペプ
チドが挙げられる（配列番号１）。可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの他の例は、Ａｃ
ｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインに加えて、シグナル配列を含む（実施例１を参照
されたい）。シグナル配列は、ＡｃｔＲＩＩＢの天然のシグナル配列、または組織プラス
ミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）のシグナル配列もしくはミツバチメリチン（ｍｅｌａｔ
ｉｎ）（ＨＢＭ）シグナル配列などの別のタンパク質由来のシグナル配列であり得る。

ＴＧＦ−βシグナルは、Ｉ型およびＩＩ型のセリン／スレオニンキナーゼ受容体のヘテ
ロマー複合体（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘ）によって媒介され、これらは
、リガンド刺激の際に、下流のＳｍａｄタンパク質をリン酸化および活性化する（Ｍａｓ
ｓａｇｕｅ、２０００年、Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １巻
：１６９〜１７８頁）。これらのＩ型およびＩＩ型の受容体は、全て、システインリッチ
領域を有するリガンド結合性細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および、予測セリン／ス
レオニン特異性を有する細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。Ｉ型受
容体は、シグナル伝達に必須であり、そして、ＩＩ型受容体は、リガンド結合およびＩ型
受容体の発現に必要とされる。Ｉ型およびＩＩ型のアクチビン受容体は、リガンド結合の
後に安定な複合体を形成し、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化をもたらす。

２つの関連するＩＩ型受容体であるＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢが、アクチビ
ンに対するＩＩ型受容体として同定されている（ＭａｔｈｅｗｓおよびＶａｌｅ、１９９
１年、Ｃｅｌｌ ６５巻：９７３〜９８２頁；Ａｔｔｉｓａｎｏら、１９９２年、Ｃｅｌ
ｌ ６８巻：９７〜１０８頁）。ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢは、アクチビンに
加えて、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１を含むいくつかの他のＴＧ
Ｆ−βファミリータンパク質と生化学的に相互作用し得る（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、１９
９５年、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３０巻：２１７〜２２６頁；ＬｅｅおよびＭｃ
Ｐｈｅｒｒｏｎ、２００１年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９８巻
：９３０６〜９３１１頁；ＹｅｏおよびＷｈｉｔｍａｎ、２００１年、Ｍｏｌ． Ｃｅｌ
ｌ ７巻：９４９〜９５７頁；Ｏｈら、２００２年、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １６巻：２
７４９〜５４頁）。出願人は、可溶性のＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質およびＡｃ
ｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質はインビボで実質的に異なる作用を有し、ＡｃｔＲＩＩ
Ａ−Ｆｃは骨に対する一次作用を有し、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃは骨格筋に対する一次作用
を有することを見出だした。

特定の実施形態では、本発明は、本主題のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶
性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）でＡｃｔＲＩＩＢ受容体のリガンド（ＡｃｔＲＩＩＢリ
ガンドとも称される）に拮抗することに関する。したがって、本発明の組成物および方法
は、１または複数のＡｃｔＲＩＩＢ受容体のリガンドの異常な活性に関連する障害を処置
するために有用である。例示的なＡｃｔＲＩＩＢ受容体のリガンドとしては、アクチビン
、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１およびＢＭＰ７などのいくつかのＴＧＦ−βファミ
リーのメンバーが挙げられる。

アクチビンは、二量体ポリペプチド増殖因子であり、そしてＴＧＦ−βスーパーファミ
リーに属する。３種のアクチビン（Ａ、ＢおよびＡＢ）が存在し、これらは、２つの密接
に関連するβサブユニットのホモ二量体／ヘテロ二量体（β_Ａβ_Ａ、β_Ｂβ_Ｂおよびβ_Ａ
β_Ｂ）である。ＴＧＦ−βスーパーファミリーにおいて、アクチビンは、卵巣および胎盤
の細胞におけるホルモン生成を刺激し得、ニューロン細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌ
）の生存を支援し得、細胞周期の進行に対して細胞型に依存して正もしくは負に影響を及
ぼし得、そして、少なくとも両生類の胚において中胚葉分化を誘導し得る、独特かつ多機
能の因子である（ＤｅＰａｏｌｏら、１９９１年、Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｐ Ｂｉｏｌ
Ｍｅｄ．１９８巻：５００〜５１２頁；Ｄｙｓｏｎら、１９９７年、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ
．７巻：８１〜８４頁；Ｗｏｏｄｒｕｆｆ、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａ
ｃｏｌ．５５巻：９５３〜９６３頁）。さらに、刺激されたヒト単球性白血病細胞から単
離された赤血球分化因子（ＥＤＦ）は、アクチビンＡと同一であることが分かった（Ｍｕ
ｒａｔａら、１９８８年、ＰＮＡＳ、８５巻：２４３４頁）。アクチビンＡは、骨髄にお
ける赤血球生成の天然の制御因子として作用することが示唆された。いくつかの組織では
、アクチビンのシグナル伝達は、その関連するヘテロ二量体であるインヒビンによって拮
抗される。例えば、下垂体からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出の間に、アクチビン
は、ＦＳＨの分泌および合成を促進するが、インヒビンは、ＦＳＨの分泌および合成を抑
制する。アクチビンの生活性を調節し得、そして／または、アクチビンに結合し得る他の
タンパク質としては、フォリスタチン（ＦＳ）、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲ
Ｐ）、α_２−マクログロブリン、ケルベロス（ｃｅｒｂｅｒｕｓ）、およびエンドグリン
（ｅｎｄｏｇｌｉｎ）（これらは以下に記載される）が挙げられる。

Ｎｏｄａｌタンパク質は、中胚葉および内胚葉の誘導および形成、ならびに初期胚形成
における心臓および胃などの軸構造物の以降の組織化において機能を果たす。発生中の脊
椎動物の胚の背側組織は脊索および前索板の軸構造物に主に寄与し、同時に、それは周辺
細胞を動員して非軸性の胚性構造物を形成することが実証されている。Ｎｏｄａｌは、Ｉ
型およびＩＩ型の両受容体ならびにＳｍａｄタンパク質として公知の細胞内のエフェクタ
ーを通してシグナル伝達するようである。最近の研究は、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲ
ＩＩＢがＮｏｄａｌのためのＩＩ型受容体の役目を果たすという考えを支持している（Ｓ
ａｋｕｍａら、Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．２００２年、７巻：４０１〜１２頁）。Ｎｏｄ
ａｌリガンドは、それらの補助因子（例えば、ｃｒｉｐｔｏ）と相互作用して、Ｓｍａｄ
２をリン酸化するアクチビンＩ型およびＩＩ型受容体を活性化させることが示唆されてい
る。Ｎｏｄａｌタンパク質は、中胚葉形成、前方パターニングおよび左右軸の特異化を含
む、初期の脊椎動物の胚に重要な多くの事象との関係が示唆されている。実験上の証拠は
、Ｎｏｄａｌシグナル伝達が、アクチビンおよびＴＧＦ−βに特異的に反応することが前
に示されたルシフェラーゼレポーターである、ｐＡＲ３−Ｌｕｘを活性化することを実証
している。しかし、Ｎｏｄａｌは、骨形態発生タンパク質に特異的に反応性であるレポー
ターであるｐＴｌｘ２−Ｌｕｘを誘導することができない。最新結果は、Ｎｏｄａｌシグ
ナル伝達がアクチビン−ＴＧＦ−β経路ＳｍａｄのＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３の両方に
よって媒介されることの直接の生化学的証拠を提供する。さらなる証拠は、細胞外のｃｒ
ｉｐｔｏタンパク質がＮｏｄａｌシグナル伝達のために必要とされることを示し、このこ
とは、Ｎｏｄａｌシグナル伝達をアクチビンまたはＴＧＦ−βのシグナル伝達から差別化
する。

増殖分化因子８（ＧＤＦ８）は、ミオスタチンとしても公知である。ＧＤＦ８は、骨格
筋量の負の調節因子である。ＧＤＦ８は、発生中および成体の骨格筋で高く発現される。
トランスジェニックマウスでのＧＤＦ８ヌル変異は、骨格筋の著しい肥大および過形成を
特徴とする（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年、３８７巻：８３〜９０
頁）。骨格筋量の類似した増加は、ウシ（Ａｓｈｍｏｒｅら、１９７４年、Ｇｒｏｗｔｈ
、３８巻：５０１〜５０７頁；ＳｗａｔｌａｎｄおよびＫｉｅｆｆｅｒ、Ｊ． Ａｎｉｍ
． Ｓｃｉ．、１９９４年、３８巻：７５２〜７５７頁；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅ
ｅ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１９９７年、９４巻：１
２４５７〜１２４６１頁およびＫａｍｂａｄｕｒら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１９９７
年、７巻：９１０〜９１５頁）、および驚くべきことにヒト（Ｓｃｈｕｅｌｋｅら、Ｎ
Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、２００４年、３５０巻：２６８２〜８頁）のＧＤＦ８の天然に存
在する変異において明白である。研究は、ヒトのＨＩＶ感染に関連する筋肉消耗には、Ｇ
ＤＦ８タンパク質発現の増加が付随することも示している（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａ
ｖｉｄら、ＰＮＡＳ、１９９８年、９５巻：１４９３８〜４３頁）。さらに、ＧＤＦ８は
筋肉特異的酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の生成を調節すること、および筋芽細胞
増殖を調節することができる（国際公開第００／４３７８１号）。ＧＤＦ８プロペプチド
は、成熟したＧＤＦ８ドメイン二量体に非共有結合的に結合し、その生物学的な活性を不
活性化することができる（Ｍｉｙａｚｏｎｏら、（１９８８年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈ
ｅｍ．、２６３巻：６４０７〜６４１５頁；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（１９８８年）Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６３巻：７６４６〜７６５４頁およびＢｒｏｗｎら（１９９
０年）Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、３巻：３５〜４３頁）。ＧＤＦ８または構造的に
関連するタンパク質に結合して、それらの生物学的な活性を阻害する他のタンパク質には
、フォリスタチン、および潜在的に、フォリスタチン関連のタンパク質が含まれる（Ｇａ
ｍｅｒら（１９９９年）Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．、２０８巻：２２２〜２３２頁）。

ＢＭＰ１１としても公知の増殖分化因子１１（ＧＤＦ１１）は、分泌タンパク質である
（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、１９９９年、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．２２巻：２６０〜２６４
頁）。ＧＤＦ１１は、マウスの発生中、尾芽、肢芽、上顎および下顎弓、ならびに後根神
経節で発現される（Ｎａｋａｓｈｉｍａら、１９９９年、Ｍｅｃｈ． Ｄｅｖ．８０巻：
１８５〜１８９頁）。ＧＤＦ１１は、中胚葉および神経の両組織をパターン化することに
おいて、特異な役割を演ずる（Ｇａｍｅｒら、１９９９年、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．、２０８
巻：２２２〜３２頁）。ＧＤＦ１１は、発生中のニワトリの肢における軟骨形成および筋
発生の負の調節因子であることが示された（Ｇａｍｅｒら、２００１年、Ｄｅｖ Ｂｉｏ
ｌ．２２９巻：４０７〜２０頁）。筋肉でのＧＤＦ１１の発現はまた、ＧＤＦ８に類似し
た方法で筋成長を調節することにおけるその役割を示唆する。さらに、脳でのＧＤＦ１１
の発現は、ＧＤＦ１１が神経系の機能に関する活性を有することもできることを示唆する
。興味深いことに、ＧＤＦ１１は嗅上皮で神経発生を阻害することが見出された（Ｗｕら
、２００３年、Ｎｅｕｒｏｎ．３７巻：１９７〜２０７頁）。したがって、ＧＤＦ１１は
、筋肉疾患および神経変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症）などの疾患の処置におい
て、インビトロおよびインビボでの適用を有することができる。

骨形成性タンパク質１（ＯＰ−１）とも呼ばれる骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ７）は
、軟骨および骨の形成を誘導することが周知である。さらに、ＢＭＰ７は多数の生理過程
を調節する。例えば、ＢＭＰ７は、上皮骨形成の現象に関与する、骨誘導因子である可能
性がある。ＢＭＰ７は、カルシウム調節および骨ホメオスタシスで役割を果たすことも見
出されている。アクチビンと同様に、ＢＭＰ７は、ＩＩ型受容体、ＡｃｔＲＩＩＡおよび
ＩＩＢに結合する。しかし、ＢＭＰ７およびアクチビンは、ヘテロマーの受容体複合体に
異なるＩ型受容体を動員する。観察された主要なＢＭＰ７のＩ型受容体はＡＬＫ２であっ
たが、アクチビンはＡＬＫ４（ＡｃｔＲＩＩＢ）に排他的に結合した。ＢＭＰ７およびア
クチビンは異なる生物反応を惹起し、異なるＳｍａｄ経路を活性化した（Ｍａｃｉａｓ−
Ｓｉｌｖａら、１９９８年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７３巻：２５６２８〜３６頁
）。

特定の態様では、本発明は、一般に、ＡｃｔＲＩＩＢ活性に関連する任意のプロセスに
おいて、ＡｃｔＲＩＩＢリガンドのシグナル伝達に拮抗するためのある特定のＡｃｔＲＩ
ＩＢポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）の使用に関する。任意
選択で、本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、
ＧＤＦ１１、およびＢＭＰ７などの１または複数のＡｃｔＲＩＩＢ受容体のリガンドに拮
抗し得、したがって、さらなる障害の処置において有用であり得る。

したがって、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢまたはＡｃｔＲＩＩＢリガンドの異常な活性に
関連する疾患または状態の処置または予防においてＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを使用す
ることを企図する。ＡｃｔＲＩＩＢまたはＡｃｔＲＩＩＢリガンドは、多くの重大な生物
学的プロセスの調節に関与する。これらのプロセスにおけるそれらの重要な機能に起因し
て、それらは治療介入の望ましい標的であり得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド
（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）は、ヒトまたは動物の障害または状態を
処置するために使用され得る。特に、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質な
どのＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達のアンタゴニストが、筋細胞膜内に存在するユートロフ
ィンのレベルを増加させることによって、ジストロフィンが欠乏した患者における根底に
ある欠損に直接対処し得るという驚くべき証拠を提供する。以前の刊行物により、このよ
うな因子が、筋ジストロフィー患者において筋肉の量および強度を増加させるために有用
であり得ることが示されており、そのうえ、これらのデータは、このような因子が、ＤＭ
Ｄ患者およびＢＭＤ患者における筋線維の脆弱性に対する直接的な作用を有する可能性が
あることを示している。これらの障害および状態は、以下に「例示的な治療的用途」の下
で考察されている。

本明細書中で使用される用語は、一般に、本発明の文脈の範囲内で、かつ、各々の用語
が使用される特定の文脈において、当該分野におけるその通常の意味を有する。本発明の
組成物および方法、ならびに、これらの作製方法および使用方法の記載において、専門家
にさらなる案内を提供するために、特定の用語が以下または本明細書中の他の場所で論じ
られている。用語の任意の使用の範囲または意味は、その用語が使用される特定の文脈か
ら明らかである。

「約」および「およそ」は、一般に、測定の性質または正確さが既知の測定された量に
ついての誤差の容認可能な程度を意味するものとする。代表的には、例示的な誤差の程度
は、所与の値または値の範囲の、２０パーセント（％）以内、好ましくは１０パーセント
（％）以内、そしてより好ましくは５％以内である。

あるいは、そして、特に生物学的な系において、用語「約」および「およそ」は、所与
の値の１桁以内、好ましくは、５倍以内、そしてより好ましくは２倍以内の値を意味し得
る。本明細書中に与えられる数量は、特に明記しない限り近似値であり、明白に記述され
ない場合には、用語「約」または「およそ」が、推量され得ることを意味する。

本発明の方法は、配列を互いに比較する工程を包含し得、この比較には、野生型配列の
１または複数の変異体（配列改変体）に対する比較を含む。このような比較は代表的には
、例えば、当該分野で周知の配列アラインメントのプログラムおよび／またはアルゴリズ
ム（例えば、少数の名を挙げれば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＭＥＧＡＬＩＧＮ）を
用いた、ポリマー配列のアラインメントを含む。当業者は、変異が残基の挿入または欠失
を含む場合のこのようなアラインメントにおいて、配列のアラインメントは、挿入もしく
は欠失された残基を含まないポリマー配列中に「ギャップ」（代表的には、ダッシュまた
は「Ａ」で表される）を導入することを容易に理解し得る。

「相同」は、そのあらゆる文法的な形態および語の綴りのバリエーションにおいて「共
通する進化的起源」を有する２つのタンパク質間の関係を指し、同じ生物種のスーパーフ
ァミリーからのタンパク質ならびに異なる生物種からの相同タンパク質を含む。このよう
なタンパク質（およびこれをコードする核酸）は、％同一性の観点であれ、特定の残基も
しくはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであれ、その配列類似性によって
反映されるように、配列の相同性を有する。

用語「配列類似性」は、そのあらゆる文法的な形態において、共通する進化の起源を共
有している場合も共有していない場合もある、核酸もしくはアミノ酸配列間の同一性もし
くは対応性の程度をいう。

しかし、一般的な用法およびこの出願において、用語「相同」は、「高度に」のような
副詞で修飾されるとき、配列の類似性を指す場合があり、そして、共通する進化の起源に
関連していてもしていなくてもよい。

２．ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド
特定の態様では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢ改変体ポリペプチド（例えば、可溶性Ａｃ
ｔＲＩＩＢポリペプチド）に関する。任意選択で、フラグメント、機能的改変体、および
修飾された形態は、それらの対応する野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと同様または同
一の生物学的な活性を有する。例えば、本発明のＡｃｔＲＩＩＢ改変体は、ＡｃｔＲＩＩ
Ｂリガンド（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、Ｎｏｄａｌ、ＧＤ
Ｆ８、ＧＤＦ１１またはＢＭＰ７）に結合し、その機能を阻害し得る。任意選択で、Ａｃ
ｔＲＩＩＢポリペプチドは、筋肉の成長を調節する。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの例と
しては、ヒトのＡｃｔＲＩＩＢ前駆体ポリペプチド（配列番号２）、および可溶性のヒト
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、配列番号１、５および１２）が挙げられる。

本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢの機能的に活性な部分および改変体を同定する。出願人は、
配列番号２のアミノ酸６４に対応する位置にアラニンを有する（Ａ６４）、Ｈｉｌｄｅｎ
ら（Ｂｌｏｏｄ．１９９４年４月１５日；８３巻（８号）：２１６３〜７０頁）によって
開示されている配列を有するＦｃ融合タンパク質が、アクチビンおよびＧＤＦ−１１に対
して比較的低い親和性を有することを確認した。対照的に、６４位にアルギニンを持つ（
Ｒ６４）同じＦｃ融合タンパク質は、アクチビンおよびＧＤＦ−１１に対して、低ナノモ
ル濃度から高ピコモル濃度までの範囲で親和性を有する。したがって、Ｒ６４を持つ配列
は、本開示では、ヒトＡｃｔＲＩＩＢの野生型参照配列として使用される。

Ａｔｔｉｓａｎｏら（Ｃｅｌｌ．１９９２年１月１０日；６８巻（１号）９７〜１０８
頁）は、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのＣ末端におけるプロリンノットの欠失により
、アクチビンに対する受容体の親和性が減少することを示した。本明細書に示すデータは
、配列番号２のアミノ酸２０〜１１９を含有するＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質、
「ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１１９）−Ｆｃ」が、プロリンノット領域および完全な膜近傍
ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−Ｆｃと比較してＧＤＦ−１１およびア
クチビンへの結合が減少していることを示す。しかし、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１２９）
−Ｆｃタンパク質は、プロリンノット領域が破壊されているにもかかわらず、野生型と比
較して同様だがいくらか減少した活性を保持する。したがって、アミノ酸１３４、１３３
、１３２、１３１、１３０および１２９で終止するＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインは全て
活性であると予想されるが、１３４または１３３で終止する構築物が最も活性であり得る
。同様に、残基１２９〜１３４のいずれかにおける変異によってリガンドの結合親和性が
大幅に変更されるとは予想されない。この裏付けとして、Ｐ１２９およびＰ１３０の変異
によってリガンドの結合は実質的に低下しない。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合
タンパク質は、早ければアミノ酸１０９（最後のシステイン）で終了し得るが、１０９〜
１１９で終わる形態は、リガンドの結合が減少していると予想される。アミノ酸１１９は
、不完全に保存されているので、容易に変更または切断される。１２８以後で終わる形態
はリガンドの結合活性を保持している。１１９〜１２７で終わる形態は、中間の結合能を
有する。これらの形態はいずれも、臨床的または実験的な設定に応じて使用することが望
ましい場合がある。

ＡｃｔＲＩＩＢのＮ末端において、アミノ酸２９以前で始まるタンパク質は、リガンド
の結合活性を保持していると予想される。アミノ酸２９は開始システインを表す。２４位
におけるアラニンからアスパラギンへの変異により、リガンドの結合に実質的に影響を及
ぼすことなくＮ−連結グリコシル化配列が導入される。これにより、アミノ酸２０〜２９
に対応する、シグナル切断ペプチドとシステイン架橋領域との間の領域における変異が良
好に許容されることが確認される。具体的には、２０位、２１位、２２位、２３位および
２４位から始まる構築物は活性を保持し、２５位、２６位、２７位、２８位および２９位
から始まる構築物も活性を保持すると予想される。２２、２３、２４または２５から始ま
る構築物は最も活性が高い。

総合すると、ＡｃｔＲＩＩＢの活性部分は配列番号２のアミノ酸２９〜１０９を含み、
構築物は、例えば、アミノ酸２０〜２９に対応する残基から始まり、アミノ酸１０９〜１
３４に対応する位置で終わり得る。他の例としては、２０〜２９または２１〜２９からの
１つの位置から始まり、１１９〜１３４、１１９〜１３３、または１２９〜１３４、１２
９〜１３３からの１つの位置で終わる構築物が挙げられる。他の例としては、２０〜２４
（もしくは２１〜２４、もしくは２２〜２５）からの１つの位置から始まり、１０９〜１
３４（もしくは１０９〜１３３）、１１９〜１３４（もしくは１１９〜１３３）または１
２９〜１３４（もしくは１２９〜１３３）からの１つの位置で終わる構築物が挙げられる
。これらの範囲内の改変体、特に、配列番号２の対応する部分に対して少なくとも８０％
、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する改変体も企図される。

本開示は、図５に示される合成ＡｃｔＲＩＩＢ構造の分析結果を含み、これは、リガン
ド結合ポケットが残基Ｙ３１、Ｎ３３、Ｎ３５、Ｌ３８〜Ｔ４１、Ｅ４７、Ｅ５０、Ｑ５
３〜Ｋ５５、Ｌ５７、Ｈ５８、Ｙ６０、Ｓ６２、Ｋ７４、Ｗ７８〜Ｎ８３、Ｙ８５、Ｒ８
７、Ａ９２、およびＥ９４〜Ｆ１０１によって規定されることを実証している。これらの
位置において、保存的変異は許容されると予想されるが、Ｋ７４Ａ変異は、Ｒ４０Ａ、Ｋ
５５Ａ、Ｆ８２Ａ、およびＬ７９位における変異と同様に良好に許容される。Ｒ４０はツ
メガエルにおいてＫであり、この位置の塩基性アミノ酸が許容されることを示している。
Ｑ５３は、ウシのＡｃｔＲＩＩＢではＲであり、ツメガエルのＡｃｔＲＩＩＢではＫであ
り、したがって、Ｒ、Ｋ、Ｑ、ＮおよびＨを含めたアミノ酸がこの位置で許容される。し
たがって、活性なＡｃｔＲＩＩＢ改変体タンパク質の一般式は、アミノ酸２９〜１０９を
含むものであるが、任意選択で、２０〜２４または２２〜２５の範囲の１つの位置から始
まり、１２９〜１３４の範囲の１つの位置で終わり、リガンド結合ポケットにおいて１、
２、５、１０または１５以下の保存的なアミノ酸の変化を含み、リガンド結合ポケットの
４０位、５３位、５５位、７４位、７９位および／または８２位において０、１またはそ
れ以上の非保存的な変更を含む。このようなタンパク質は、配列番号２のアミノ酸２９〜
１０９の配列に対して８０％、９０％、９５％または９９％を超える配列同一性を保持し
得る。可変性が特に良好に許容され得る結合ポケットの外側の部位は、細胞外ドメインの
アミノ末端およびカルボキシ末端（上述のように）、および４２〜４６位および６５〜７
３位を含む。６５位におけるアスパラギンからアラニンへの変更（Ｎ６５Ａ）は、Ａ６４
バックグラウンドにおけるリガンドの結合を実際に改善し、したがって、Ｒ６４バックグ
ラウンドにおいてリガンドの結合に対する好ましくない影響を有さないと予想される。こ
の変化により、Ａ６４バックグラウンドにおけるＮ６５のグリコシル化が排除される可能
性があり、したがって、この領域における著しい変化が許容される可能性があることが実
証されている。Ｒ６４Ａ変化は許容性が乏しいが、Ｒ６４Ｋは良好に許容され、したがっ
て、Ｈなどの別の塩基性残基が６４位において許容され得る。

ＡｃｔＲＩＩＢは、完全に保存された細胞外ドメインの大きなストレッチ（ｓｔｒｅｔ
ｃｈ）を持ち、ほぼ全ての脊椎動物にわたって良好に保存されている。ＡｃｔＲＩＩＢに
結合するリガンドの多くも高度に保存されている。したがって、種々の脊椎動物の生物体
からのＡｃｔＲＩＩＢ配列を比較することにより、変更され得る残基への洞察がもたらさ
れる（図６）。したがって、活性なヒトＡｃｔＲＩＩＢ改変体は、別の脊椎動物のＡｃｔ
ＲＩＩＢの配列からの対応する位置の１つまたは複数のアミノ酸を含み得、または、ヒト
または他の脊椎動物の配列中の残基と同様の残基を含み得る。以下の例は、活性なＡｃｔ
ＲＩＩＢ改変体を定義するためのこのアプローチを例示している。Ｌ４６は、ツメガエル
のＡｃｔＲＩＩＢではバリンであるので、この位置は変更され得、任意選択で、Ｖ、Ｉま
たはＦなどの別の疎水性残基、またはＡなどの非極性残基に変更され得る。Ｅ５２は、ツ
メガエルではＫであり、これは、この部位で、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、Ｙ
およびおそらくＡなどの極性残基を含めた多種多様の変化が許容され得ることを示してい
る。Ｔ９３は、ツメガエルではＫであり、これは、この位置において幅広い構造的差異が
許容されることを示しており、Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、ＧおよびＹなどの極性
残基が好ましい。Ｆ１０８は、ツメガエルではＹであり、したがって、Ｙまたは他の疎水
性群、例えばＩ、ＶまたはＬが許容されるはずである。Ｅ１１１は、ツメガエルではＫで
あり、これは、この位置において、Ｄ、Ｒ、ＫおよびＨ、ならびにＱおよびＮを含めた、
荷電残基が許容されることを示している。Ｒ１１２は、ツメガエルではＫであり、これは
、この位置において、ＲおよびＨを含めた塩基性残基が許容されることを示している。１
１９位のＡは比較的不完全に保存されており、げっ歯類ではＰとして、ツメガエルではＶ
として現れ、したがって、この位置では本質的にいかなるアミノ酸も許容されるはずであ
る。

本開示は、さらなるＮ−連結グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）を加えることにより
、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期がＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４）−Ｆｃ
形態と比較して増加することを実証する。２４位にアスパラギンを導入することにより（
Ａ２４Ｎ構築物）、より長い半減期を与えるＮＸＴ配列が作製される。他のＮＸ（Ｔ／Ｓ
）配列は、４２〜４４（ＮＱＳ）および６５〜６７（ＮＳＳ）において見出されるが、後
者は６４位のＲで効率的にグリコシル化されないことがあり得る。Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列は
、一般に、図５で定義されるリガンド結合ポケットの外側の位置に導入され得る。非内因
性Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列の導入に特に適した部位としては、アミノ酸２０〜２９、２０〜２
４、２２〜２５、１０９〜１３４、１２０〜１３４または１２９〜１３４が挙げられる。
Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列は、ＡｃｔＲＩＩＢ配列とＦｃまたは他の融合成分との間のリンカー
にも導入され得る。このような部位は、以前から存在しているＳまたはＴに対して正しい
位置にＮを導入することによって、または、以前から存在しているＮに対応する位置にＳ
またはＴを導入することによって、最小の労力で導入され得る。したがって、Ｎ−連結グ
リコシル化部位を生じる望ましい変更は、Ａ２４Ｎ、Ｒ６４Ｎ、Ｓ６７Ｎ（できるかぎり
Ｎ６５Ａの変更と組み合わせる）、Ｅ１０６Ｎ、Ｒ１１２Ｎ、Ｇ１２０Ｎ、Ｅ１２３Ｎ、
Ｐ１２９Ｎ、Ａ１３２Ｎ、Ｒ１１２ＳおよびＲ１１２Ｔである。グリコシル化されること
が予測されるＳはどれも、グリコシル化によってもたらされる保護のために、免疫原性部
位を生じることなくＴに変更され得る。同様に、グリコシル化されることが予測されるＴ
はどれも、Ｓに変更され得る。したがって、Ｓ６７ＴおよびＳ４４Ｔの変更が企図される
。同様に、Ａ２４Ｎ改変体では、Ｓ２６Ｔの変更が使用され得る。したがって、ＡｃｔＲ
ＩＩＢ改変体は、１つまたは複数の、追加の非内因性Ｎ−連結グリコシル化コンセンサス
配列を有し得る。

Ｌ７９位は、変更されたアクチビン−ミオスタチン（ＧＤＦ−１１）結合特性を与える
ために変更され得る。Ｌ７９ＡまたはＬ７９Ｐにより、ＧＤＦ−１１の結合が、アクチビ
ンの結合よりも大きな程度で減少する。Ｌ７９ＥまたはＬ７９ＤはＧＤＦ−１１の結合を
保持する。著しいことに、Ｌ７９ＥおよびＬ７９Ｄ改変体は、アクチビンの結合が大幅に
減少した。インビボでの実験は、これらの非アクチビン受容体が筋肉量を増加させる著し
い能力を保持し、他の組織に対する作用の減少を示すことを示す。これらのデータは、ア
クチビンに対する作用が減少したポリペプチドを得ることについての望ましさおよび実行
可能性を実証する。

記載される差異は、種々の方法に組み合わせられ得る。さらに、本明細書中に記載され
る変異誘発プログラムの結果は、保存が多くの場合有益であるアミノ酸位がＡｃｔＲＩＩ
Ｂにあることを示す。これらとしては、６４位（塩基性アミノ酸）、８０位（酸性または
疎水性アミノ酸）、７８位（疎水性、そして特にトリプトファン）、３７位（酸性、そし
て特にアスパラギン酸またはグルタミン酸）、５６位（塩基性アミノ酸）、６０位（疎水
性アミノ酸、特にフェニルアラニンまたはチロシン）が挙げられる。したがって、本明細
書中に開示される改変体それぞれにおいて、本開示は保存され得るアミノ酸のフレームワ
ークを提供する。保存が望ましいと考えられる他の位置は以下の通りである：５２位（酸
性アミノ酸）、５５位（塩基性アミノ酸）、８１位（酸性）、９８位（極性または荷電、
特にＥ、Ｄ、ＲまたはＫ）。

特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの単離されたフラグメントは、Ａｃ
ｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸（例えば、配列番号３および４）の対応するフ
ラグメントから組換えにより生成されるポリペプチドをスクリーニングすることによって
得られ得る。さらに、フラグメントは、従来のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃもしくはｔ
−Ｂｏｃ化学のような当該分野で公知の技術を用いて化学的に合成され得る。フラグメン
トは、（組換えにより、または、化学合成により）生成され得、そして、例えば、Ａｃｔ
ＲＩＩＢタンパク質またはＡｃｔＲＩＩＢリガンドのアンタゴニスト（インヒビター）ま
たはアゴニスト（活性化因子）として機能し得るペプチジルフラグメントを同定するため
に試験され得る。

特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの機能的改変体は、配列番号１、２
、５、１２および２３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％同一であるアミノ
酸配列を有する。ある場合では、機能的改変体は、配列番号１、２、５、１２および２３
から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９
８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。

特定の実施形態では、本発明は、治療上の効力または安定性（例えば、エクスビボ貯蔵
寿命およびインビボでのタンパク質分解に対する抵抗性）の増強のような目的のために、
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの構造を修飾することによって機能的改変体を作製すること
を企図する。修飾されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドはまた、例えば、アミノ酸の置換、
欠失または付加によって生成され得る。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリン
での単発的な置換、アスパラギン酸のグルタミン酸での単発的な置換、スレオニンのセリ
ンでの単発的な置換、または、あるアミノ酸の、構造的に関連したアミノ酸での同様の置
換（例えば、保存的変異）は、結果として生じる分子の生物学的活性に対して大きな影響
を及ぼさないと予想するのは理にかなっている。保存的置換は、その側鎖が関連している
アミノ酸のファミリー内で行われる置換である。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸
配列の変化によって機能的ホモログがもたらされているかどうかは、改変体ＡｃｔＲＩＩ
Ｂポリペプチドの、野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと同様に細胞における反応を生じ
る能力、または、１または複数のリガンド、例えば、アクチビン、ＧＤＦ−１１またはミ
オスタチンなどに野生型と同様に結合する能力を評価することにより容易に決定され得る
。

特定の実施形態では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの細胞外ドメイン（リガ
ンド結合ドメインとも呼ばれる）において、改変体（または変異体）ＡｃｔＲＩＩＢポリ
ペプチドのリガンド結合活性（例えば、結合親和性または結合特異性）が変更されるよう
に変異を生じさせることを企図する。ある場合では、このような改変体ＡｃｔＲＩＩＢポ
リペプチドは、特異的なリガンドに対する結合親和性が変更されている（上昇または低下
）。他の場合では、改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、そのリガンドに対する結合特
異性が変更されている。

例えば、本開示は、アクチビンと比較してＧＤＦ８／ＧＤＦ１１に優先的に結合する改
変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを提供する。このような選択的な改変体は、治療効果の
ために筋肉量の非常に大きな増加が必要となり得、そしてある程度の的外れの（ｏｆｆ−
ｔａｒｇｅｔ）作用が許容され得る、重篤な疾患の処置のためにはあまり望ましくない可
能性があるが、本開示は、さらに、的外れの作用を減少させることについてのこのような
ポリペプチドの望ましさを証明する。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質のアミノ酸残基
、例えばＥ３９、Ｋ５５、Ｙ６０、Ｋ７４、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ１０１はリガンド結
合ポケット内にあり、そのリガンド、例えばアクチビンおよびＧＤＦ８などへの結合を媒
介する。したがって、本発明は、これらのアミノ酸残基に１または複数の変異を含む、Ａ
ｃｔＲＩＩＢ受容体の変更されたリガンド結合ドメイン（例えば、ＧＤＦ８結合ドメイン
）を提供する。任意選択で、変更されたリガンド結合ドメインは、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体
の野生型のリガンド結合ドメインと比較して、ＧＤＦ８などのリガンドに対する選択性が
増加されていることがあり得る。例示のように、これらの変異は、アクチビンを超える、
ＧＤＦ８への変更されたリガンド結合ドメインの選択性を増加させる。任意選択で、変更
されたリガンド結合ドメインは、ＧＤＦ８の結合についてのＫ_ｄに対するアクチビンの結
合についてのＫ_ｄの比を有し、それは、野生型のリガンド結合ドメインに対する比の少な
くとも２倍、５倍、１０倍、またはさらには１００倍である。任意選択で、変更されたリ
ガンド結合ドメインは、ＧＤＦ８の阻害についてのＩＣ_５０に対するアクチビンの阻害に
ついてのＩＣ_５０の比を有し、野生型のリガンド結合ドメインと比較して少なくとも２倍
、５倍、１０倍、またはさらには１００倍である。任意選択で、変更されたリガンド結合
ドメインは、アクチビンの阻害についてのＩＣ_５０の、少なくとも２分の１、５分の１、
１０分の１、またはさらには１００分の１のＩＣ_５０でＧＤＦ８を阻害する。

特定の例として、ＡｃｔＲＩＩＢのリガンド結合ドメインの正荷電アミノ酸残基Ａｓｐ
（Ｄ８０）は、改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドがアクチビンではなくＧＤＦ８に優先
的に結合するように、異なるアミノ酸残基に変異され得る。Ｄ８０残基は、非荷電アミノ
酸残基、負荷電アミノ酸残基、および疎水性アミノ酸残基からなる群より選択されるアミ
ノ酸残基に変えられることが好ましい。さらなる特定の例として、疎水性残基Ｌ７９は、
ＧＤＦ１１の結合を保持する一方でアクチビンの結合を大きく低下させるために、酸性ア
ミノ酸のアスパラギン酸またはグルタミン酸に変更され得る。当業者に認識されるように
、記載された変異、改変体または修飾の大半は、核酸レベルで、または、いくつかの場合
、翻訳後修飾または化学合成によって作製され得る。このような技法は当該分野で周知で
ある。

特定の実施形態では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのグリコシル化を変更す
るように、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの特異的な変異を企図する。ＡｃｔＲＩＩＢポリ
ペプチドのグリコシル化部位の例は、図２に例示される。このような変異は、１または複
数のグリコシル化部位（例えば、Ｏ−連結もしくはＮ−連結のグリコシル化部位）を導入
もしくは排除するように選択され得る。アスパラギン連結グリコシル化認識部位は、一般
に、トリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここで、「Ｘ」は任意のアミノ
酸である）を含み、この配列は、適切な細胞のグリコシル化酵素によって特異的に認識さ
れる。変化はまた、（Ｏ−連結グリコシル化部位については）野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリ
ペプチドの配列への、１または複数のセリンもしくはスレオニン残基の付加、または、１
または複数のセリンもしくはスレオニン残基による置換によってなされ得る。グリコシル
化認識部位の第１位もしくは第３位のアミノ酸の一方もしくは両方における種々のアミノ
酸置換もしくは欠失（および／または、第２位におけるアミノ酸の欠失）は、修飾された
トリペプチド配列において非グリコシル化をもたらす。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドにお
ける糖質部分の数を増加させる別の手段は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドへのグリコシド
の化学的もしくは酵素的なカップリングによるものである。使用されるカップリング様式
に依存して、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（
ｃ）遊離スルフヒドリル基（例えば、システインのもの）；（ｄ）遊離ヒドロキシル基（
例えば、セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのもの）；（ｅ）芳香族残基（例
えば、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのもの）；または（ｆ）グルタ
ミンのアミド基に付加され得る。これらの方法は、本明細書中に参考として援用される１
９８７年９月１１日に公開されたＷＯ ８７／０５３３０ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒ
ｉｓｔｏｎ（１９８１年）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９〜
３０６頁に記載されている。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド上に存在する１または複数の糖
質部分の除去は、化学的および／または酵素的に達成され得る。化学的な脱グリコシル化
は、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物へのＡｃｔＲＩＩ
Ｂポリペプチドの曝露を含み得る。この処理は、アミノ酸配列をインタクトなままにしつ
つ、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほと
んどもしくは全ての糖の切断を生じる。化学的な脱グリコシル化は、さらに、Ｈａｋｉｍ
ｕｄｄｉｎら（１９８７年）Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９巻
：５２頁、およびＥｄｇｅら（１９８１年）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８巻：１
３１頁によって記載されている。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド上の糖質部分の酵素的切断
は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８巻：３５０
頁に記載されるように、種々のエンドグリコシダーゼもしくはエキソグリコシダーゼの使
用により達成され得る。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの配列は、適切なように、使用され
る発現系のタイプに応じて調節され得る。というのも、哺乳動物、酵母、昆虫および植物
の細胞は全て、ペプチドのアミノ酸配列によって影響され得る異なるグリコシル化パター
ンを導入し得る。一般に、ヒトにおいて使用するためのＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、適
切なグリコシル化を提供する哺乳動物細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞株またはＣＨＯ
細胞株）において発現されるが、他の哺乳動物発現細胞株も同様に有用であることと期待
される。

本開示はさらに、改変体、特に、任意選択で切断型改変体を含むＡｃｔＲＩＩＢポリペ
プチドの組み合わせ改変体のセットを作製する方法を企図する；組み合わせ変異体のプー
ルは、機能的改変体の配列を同定するために特に有用である。このような組み合わせライ
ブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、変更された特性（例えば、変更された薬
物動態または変更されたリガンド結合）を有するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド改変体を作
製するため、であり得る。種々のスクリーニングアッセイが以下に提供され、そして、こ
のようなアッセイは、改変体を評価するために使用され得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポ
リペプチド改変体は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに結合する能力、ＡｃｔＲＩＩＢリガ
ンドのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドへの結合を妨害する能力についてスクリーニングされ
得る。

ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはその改変体の活性はまた、細胞ベースのアッセイま
たはインビボアッセイにおいて試験され得る。例えば、骨芽細胞または前駆体における骨
の生成に関与する遺伝子の発現に対するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド改変体の作用が評価
され得る。これは、必要な場合、１または複数の組換えＡｃｔＲＩＩＢリガンドタンパク
質（例えば、ＢＭＰ７）の存在下で行われ得、そして、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよ
び／またはその改変体、そして任意選択でＡｃｔＲＩＩＢリガンドを生成するように細胞
がトランスフェクトされ得る。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、マウスまたは他
の動物に投与され得、そして、骨の１または複数の特性（例えば、密度または体積）が評
価され得る。骨折に対する治癒速度も評価され得る。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチ
ドまたはその改変体の活性は、筋肉細胞、脂肪細胞およびニューロン細胞において、これ
らの細胞の成長に対する任意の作用について、例えば、下記のアッセイによって試験され
得る。このようなアッセイは、当技術分野で周知であり、常套的である。ＳＭＡＤ応答性
のレポーター遺伝子が、このような細胞株において、下流のシグナル伝達に対する影響を
モニターするために使用され得る。

天然に存在するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに対して、選択的効力を有する、組み合わ
せで得られる（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｌｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ）改変体が作製され得
る。このような改変体タンパク質は、組換えＤＮＡ構築物から発現されたとき、遺伝子治
療のプロトコルにおいて使用され得る。同様に、変異誘発は、対応する野生型ＡｃｔＲＩ
ＩＢポリペプチドとは劇的に異なる細胞内半減期を有する改変体を生じ得る。例えば、変
更されたタンパク質は、タンパク質分解、または、天然のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの
崩壊もしくは他の方法で不活性化をもたらす他のプロセスに対してより安定性であるかも
しくは安定性が低いかのいずれかにされ得る。このような改変体およびこれをコードする
遺伝子は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの半減期を調節することによってＡｃｔＲＩＩＢ
ポリペプチドレベルを変更するために利用され得る。例えば、短い半減期は、より一過性
の生物学的作用を生じ得、そして、誘導性の発現系の一部である場合、細胞内での組換え
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドレベルのより厳しい制御を可能にし得る。

特定の実施形態では、本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、さらに、ＡｃｔＲＩＩ
Ｂポリペプチド中に天然に存在する任意のものに加えて、翻訳後修飾を含み得る。このよ
うな修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およ
びアシル化が挙げられるがこれらに限定されない。結果として、修飾されたＡｃｔＲＩＩ
Ｂポリペプチドは、ポリエチレングリコール、脂質、多糖類もしくは単糖類およびホスフ
ェイトのような非アミノ酸成分を含み得る。このような非アミノ酸成分の、ＡｃｔＲＩＩ
Ｂポリペプチドの機能に対する影響は、他のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド改変体について
本明細書中に記載されるようにして試験され得る。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの新生形
態を切断することによってＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが細胞内で生成される場合、翻訳
後プロセシングもまた、このタンパク質の正確な折り畳みおよび／または機能にとって重
要となり得る。様々な細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、
ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３）が、このような翻訳後の活性のための特定の細胞機
構および特徴的なメカニズムを有し、そして、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの正確な修飾
およびプロセシングを保証するように選択され得る。

特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの機能的改変体または修飾形態は、少な
くともＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの一部分と１または複数の融合ドメインとを有する融
合タンパク質を含む。このような融合ドメインの周知の例としては、ポリヒスチジン、Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテ
インＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（例えば、Ｆｃ）、マルトース結合
タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンが挙げられるがこれらに限定されない
。融合ドメインは、所望される特性を与えるように選択され得る。例えば、いくつかの融
合ドメインが、アフィニティクロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用
である。アフィニティ精製の目的では、グルタチオン−、アミラーゼ−、およびニッケル
−もしくはコバルト−結合化樹脂のような、アフィニティクロマトグラフィーのための適
切なマトリクスが使用される。このようなマトリクスの多くは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｇ
ＳＴ精製システムおよび（ＨＩＳ_６）融合パートナーと共に有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ
^ＴＭシステム（Ｑｉａｇｅｎ）のような「キット」の形態で利用可能である。別の例とし
ては、融合ドメインは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの検出を容易にするように選択され
得る。このような検出ドメインの例としては、種々の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）
、ならびに、「エピトープタグ」（これは、特定の抗体に利用可能な、通常は短いペプチ
ド配列である）が挙げられる。特定のモノクローナル抗体に容易に利用可能な周知のエピ
トープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）および
ｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。いくつかの場合、融合ドメインは、関連のプロテアーゼが
融合タンパク質を部分的に消化し、それによって、そこから組換えタンパク質を解放する
ことを可能にする、第Ｘａ因子またはトロンビンのようなプロテアーゼ切断部位を有する
。解放されたタンパク質は、次いで、その後のクロマトグラフィーによる分離によって、
融合ドメインから単離され得る。特定の好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプ
チドは、インビボでＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを安定化させるドメイン（「安定化」ド
メイン）と融合される。「安定化」とは、それが、崩壊の減少によるものであるか、腎臓
によるクリアランスの減少によるものであるか、他の薬物動態作用によるものであるかと
は無関係に、血清半減期を増加させる任意のものを意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分
との融合は、広範囲のタンパク質に対して所望の薬物動態特性を与えることが公知である
。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合は、所望の特性を与え得る。選択され得る融合ド
メインの他のタイプとしては、多量体化（例えば、二量体化、四量体化）ドメインおよび
機能的ドメイン（例えば、筋肉の成長のさらなる刺激のような付加的な生物学的機能を与
えるもの）が挙げられる。

具体例として、本発明は、Ｆｃドメインに融合された細胞外（例えば、ＧＤＦ８結合）
ドメインを含む、ＧＤＦ８アンタゴニストとしての融合タンパク質を提供する。（例えば
、配列番号１３）

好ましくは、Ｆｃドメインは、Ａｓｐ−２６５、リジン３２２およびＡｓｎ−４３４の
ような残基における１または複数の変異を有する。特定の場合、これらの変異のうち１ま
たは複数（例えば、Ａｓｐ−２６５変異）を持つ変異型Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメ
インに対する、Ｆｃγ受容体への結合能の低下を有する。他の場合では、これらの変異の
うち１または複数（例えば、Ａｓｎ−４３４変異）を持つ変異型Ｆｃドメインは、野生型
Ｆｃドメインに対する、ＭＨＣクラスＩ関連のＦｃ受容体（ＦｃＲＮ）への結合能の増加
を有する。

融合タンパク質の様々な成分は、所望の機能と両立するあらゆる様式で配列され得るこ
とが理解される。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、異種ドメインに対してＣ末端
側に配置されても、あるいは、異種ドメインが、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに対してＣ
末端側に配置されてもよい。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインと異種ドメインとは、
融合タンパク質において隣接している必要はなく、そして、さらなるドメインもしくはア
ミノ酸配列が、いずれかのドメインに対してＣ末端もしくはＮ末端側に、または、これら
のドメイン間に含められてもよい。

特定の実施形態では、本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペ
プチドを安定化させ得る１または複数の修飾を含む。例えば、このような修飾は、Ａｃｔ
ＲＩＩＢポリペプチドのインビトロ半減期を増強させるか、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド
の循環半減期を増強させるか、または、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのタンパク質分解を
減少させる。このような安定化修飾としては、融合タンパク質（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ
ポリペプチドと安定化ドメインとを含む融合タンパク質が挙げられる）、グリコシル化部
位の修飾（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドへのグリコシル化部位の付加が挙げられ
る）、および糖質部分の修飾（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドからの糖質部分の除
去が挙げられる）が挙げられるがこれらに限定されない。融合タンパク質の場合、Ａｃｔ
ＲＩＩＢポリペプチドは、ＩｇＧ分子（例えば、Ｆｃドメイン）などの安定化ドメインに
融合される。本明細書中で使用される場合、用語「安定化ドメイン」は、融合タンパク質
の場合のように融合ドメイン（例えば、Ｆｃ）を指すだけでなく、糖質部分のような非タ
ンパク質性修飾、または、ポリエチレングリコールのような非タンパク質性ポリマーも含
む。

特定の実施形態では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの単離および／または精
製された形態（他のタンパク質から単離されたか、そうでなければ他のタンパク質を実質
的に含まないもの）を利用可能にする。

特定の実施形態では、本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（修飾されていないか、ま
たは修飾された）は、種々の当該分野で公知の技法によって生成され得る。例えば、この
ようなＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、Ｂｏｄａｎｓｋｙ、Ｍ． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅ
ｒｌｉｎ（１９９３年）およびＧｒａｎｔ Ｇ． Ａ．（編）、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ、Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎ
ｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２年）に記載されているものなどの、標
準のタンパク質化学の技法を使用して合成され得る。さらに、自動ペプチド合成装置が市
販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ Ｍｏｄｅｌ ３９６；Ｍ
ｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ９６００）。あるいは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプ
チド、そのフラグメントまたは改変体は、当該分野で周知のように、種々の発現系（例え
ば、Ｅ．ｃｏｌｉ、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス）
（下記もまた参照のこと）を使用して組換えにより生成され得る。さらなる実施形態では
、修飾されたか、または修飾されていないＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、例えば、プロ
テアーゼ、例えばトリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシン、または対の塩
基性アミノ酸変換酵素（ＰＡＣＥ）を使用して、天然に存在するかまたは組換えにより生
成された完全長ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを消化することによって生成され得る。コン
ピュータ解析（市販のソフトウェア、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧ
ｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．を使用する）は、タンパ
ク質分解の切断部位を同定するために使用され得る。あるいは、このようなＡｃｔＲＩＩ
Ｂポリペプチドは、化学的切断によって（例えば、臭化シアン、ヒドロキシアミン）など
の当該分野で公知の標準技法などで天然に存在するかまたは組換えにより生成された完全
長ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドから生成され得る。

３．ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸
特定の態様では、本発明は、本明細書に開示されている任意の改変体を含めた、任意の
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）をコードす
る、単離された核酸および／または組換え型の核酸を提供する。例えば、配列番号４は、
天然に存在するＡｃｔＲＩＩＢ前駆体ポリペプチドをコードする（図４）一方、配列番号
３は、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする（図３）。主題の核酸は、一本鎖
であっても二本鎖であってもよい。このような核酸は、ＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子で
あり得る。これらの核酸は、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを作製するための方法
において、または（例えば、遺伝子治療アプローチにおいて）直接的な治療剤として使用
され得る。

特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする本主題の核酸はさらに、配
列番号３の改変体である核酸を含むものと理解される。改変体ヌクレオチド配列は、対立
遺伝子改変体のような、１または複数のヌクレオチドの置換、付加もしくは欠失によって
異なる配列を含み、したがって、配列番号４に指定されるコード配列のヌクレオチド配列
とは異なるコード配列を含む。

特定の実施形態では、本発明は、配列番号３に対して少なくとも８０％、８５％、９０
％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な単離されたかまたは組換えの
核酸配列を提供する。当業者は、配列番号３に対して相補的な核酸配列、および配列番号
３の改変体もまた、本発明の範囲内であることを理解する。さらなる実施形態では、本発
明の核酸配列は、異種ヌクレオチド配列と共に、または、ＤＮＡライブラリーにおいて、
単離、組換えおよび／または融合され得る。

他の実施形態では、本発明の核酸はまた、配列番号３に指定されるヌクレオチド配列に
対して高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、配列番
号３の相補配列、あるいは、これらのフラグメントを含む。上述のように、当業者は、Ｄ
ＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変更され得る
ことを容易に理解する。当業者は、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なス
トリンジェンシー条件が変更され得ることを容易に理解する。例えば、約４５℃における
６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーションの
後に、５０℃における２．０×ＳＳＣの洗浄を行い得る。例えば、洗浄工程における塩濃
度は、５０℃における約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから、５０℃における約
０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択され得る。さらに、洗浄工程における温
度は、室温（約２２℃）の低ストリンジェンシー条件から、約６５℃の高ストリンジェン
シー条件まで上昇され得る。温度と塩の両方が変更されても、温度または塩濃度が一定に
保たれ、他の変数が変更されてもよい。一実施形態では、本発明は、室温における６×Ｓ
ＳＣとその後の室温で２×ＳＳＣでの洗浄の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイ
ズする核酸を提供する。

遺伝子コードにおける縮重に起因して配列番号３に示される核酸と異なる単離された核
酸もまた、本発明の範囲内である。例えば、多数のアミノ酸が１を超えるトリプレットに
よって示される。同じアミノ酸を特定するコドンまたは同義語（例えば、ＣＡＵおよびＣ
ＡＣはヒスチジンに対する同義語である）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさ
ない「サイレント」変異を生じ得る。しかしながら、哺乳動物細胞の中には、本主題のタ
ンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列の多型が存在することが予想される
。当業者は、天然の対立遺伝子改変に起因して、所与の種の個体間に、特定のタンパク質
をコードする核酸の１または複数のヌクレオチド（約３〜５％までのヌクレオチド）にお
けるこれらの改変が存在し得ることを理解する。任意およびあらゆるこのようなヌクレオ
チドの改変と、結果として生じるアミノ酸の多型とは、本発明の範囲内である。

特定の実施形態では、本発明の組換え核酸は、発現構築物において１または複数の調節
性ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節性のヌクレオチド配列は、一般に、
発現のために使用される宿主細胞に対して適切なものである。種々の宿主細胞について、
多数のタイプの適切な発現ベクターおよび適切な調節性配列が当該分野で公知である。代
表的には、上記１または複数の調節性ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リ
ーダー配列もしくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配
列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびに、エンハンサー配列もしくは活性化因子
配列が挙げられ得るがこれらに限定されない。当該分野で公知の構成的もしくは誘導性の
プロモーターが、本発明によって企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモー
ター、または、１を超えるプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーター
のいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドのようにエピソーム上で細胞中に存在
し得るか、または、発現構築物は、染色体中に挿入され得る。好ましい実施形態では、発
現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー
遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は、当該分野で周知であり、そして、使用され
る宿主細胞により変化する。

本発明の特定の態様では、本主題の核酸は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードし、
そして、少なくとも１つの調節性配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発
現ベクターにおいて提供される。調節性配列は当該分野で認識され、そして、ＡｃｔＲＩ
ＩＢポリペプチドの発現を誘導するように選択される。したがって、用語、調節性配列は
、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。例示的な調節性配
列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄ
ｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０年）に記載される。例えば、作動可能に連結されたときにＤＮ
Ａ配列の発現を制御する広範な種々の発現制御配列のいずれかが、ＡｃｔＲＩＩＢポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクターにおいて使用され得
る。このような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモ
ーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスもしくはサイトメガロウイルスの前初期プ
ロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣもしくはＴ
ＲＣシステム、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによってその発現が誘導されるＴ７プロモータ
ー、ファージλの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の
制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼもしくは他の糖分解酵素のプロモーター、酸
性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α−接合因子（ｍａｔｉｎ
ｇ ｆａｃｔｏｒ）のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、ならび
に、原核生物もしくは真核生物の細胞、または、そのウイルスの遺伝子の発現を制御する
ことが公知である他の配列、ならびにこれらの種々の組合せが挙げられる。発現ベクター
の設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現されることが所望されるタ
ンパク質のタイプのような要因に依存し得ることが理解されるべきである。さらに、ベク
ターのコピー数、コピー数を制御する能力およびベクターによってコードされる任意の他
のタンパク質（例えば、抗生物質マーカー）の発現もまた考慮されるべきである。

本発明の組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部を、原核生物細胞、
真核生物細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物）のいずれか、または両方において発現
させるために適切なベクター中に連結することによって生成され得る。組換えＡｃｔＲＩ
ＩＢポリペプチドの生成のための発現ビヒクルとしては、プラスミドおよび他のベクター
が挙げられる。例えば、適切なベクターとしては、以下のタイプのプラスミドが挙げられ
る：原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のための、ｐＢＲ３２２由来の
プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来のプラスミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ由来の
プラスミドおよびｐＵＣ由来のプラスミド。

いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を促進するための原核
生物の配列と、真核生物細胞において発現される１または複数の真核生物の転写単位との
両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２
ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、
ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核生物細胞のトランス
フェクションに適切な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは
、原核生物細胞および真核生物細胞の両方における複製および薬物耐性選択を容易にする
ために、細菌プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２）からの配列を用いて修飾される。ある
いは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン−バーウイルス（ｐＨ
ＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）のようなウイルスの誘導体が、真核生物細胞にお
けるタンパク質の一過的な発現のために使用され得る。他のウイルス（レトロウイルスを
含む）発現系の例は、遺伝子治療送達系の説明において以下に見出され得る。プラスミド
の調製および宿主生物の形質転換において用いられる種々の方法は、当該分野で周知であ
る。原核生物細胞および真核生物細胞の両方についての他の適切な発現系、ならびに、一
般的な組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭ
ａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ、１９８９年）第１６および１７章を参照のこと。いくつかの場合において、バ
キュロウイルス発現系を用いて組換えポリペプチドを発現させることが望ましくあり得る
。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来のベクター（例えば、ｐ
ＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来のベクター（例え
ば、ｐＡｃＵＷｌ）およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（例えば、β−ｇａｌを含む
ｐＢｌｕｅＢａｃ ＩＩＩ）が挙げられる。

好ましい実施形態では、ベクターは、ＣＨＯ細胞における本主題のＡｃｔＲＩＩＢポリ
ペプチドの生成のために設計される（例えば、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ））。明らかであるように、本主題の遺伝子構築
物は、例えば、タンパク質（融合タンパク質または改変体タンパク質を含む）を生成する
ため、精製のために、培養物において増殖させた細胞において本主題のＡｃｔＲＩＩＢポ
リペプチドの発現を引き起こすために使用され得る。

本発明はまた、１または複数の本主題のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコード配列（例
えば、配列番号４）を含む組換え遺伝子をトランスフェクトされた宿主細胞に関する。宿
主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、本発明のＡｃｔ
ＲＩＩＢポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロ
ウイルス発現系を用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。他の適
切な宿主細胞は、当業者に公知である。

したがって、本発明はさらに、本主題のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを生成する方法に
関する。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェ
クトされた宿主細胞は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現を起こすことが可能な適切な
条件下で培養され得る。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを
含む細胞および培地の混合物から分泌および単離され得る。あるいは、ＡｃｔＲＩＩＢポ
リペプチドは、細胞質または膜画分に保持され得、そして、細胞が回収、溶解され、そし
て、タンパク質が単離される。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。
細胞培養に適切な培地は、当該分野で周知である。本主題のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド
は、タンパク質の精製についての当該分野で公知の技術（イオン交換クロマトグラフィー
、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチ
ドの特定のエピトープに特異的な抗体を用いた免疫親和性精製を含む）を用いて、細胞培
養培地、宿主細胞またはこの両方から単離され得る。好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩ
ＩＢポリペプチドは、その精製を促進するドメインを含む融合タンパク質である。

別の実施形態では、精製用リーダー配列（例えば、組換えＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド
の所望の部分のＮ末端に位置するポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位の配列）
をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ^２＋金属樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーによる
、発現された融合タンパク質の精製を可能にし得る。その後、精製用リーダー配列は、引
き続いて、エンテロキナーゼでの処理によって除去され、精製ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチ
ドを提供し得る（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら、（１９８７年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ
ａｐｈｙ ４１１巻：１７７頁；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８
巻：８９７２頁を参照のこと）。

融合遺伝子を作製するための技術は周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列
をコードする種々のＤＮＡフラグメントの接合は、ライゲーションのための平滑末端もし
くはスタガード（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化
、必要に応じた粘着末端のフィルイン（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、所望されない接合を回
避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および酵素によるライゲーション、を用い
る従来の技術に従って行われる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置
を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は
、２つの連続した遺伝子フラグメント間の相補的なオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）
を生じるアンカープライマーを用いて行われ得、これらのフラグメントは、その後、キメ
ラ遺伝子配列を生じるようにアニーリングされ得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２年を参照のこと）。

４．抗体
本発明の別の態様は、抗体に関する。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性Ａ
ｃｔＲＩＩＢポリペプチド）に特異的に反応する抗体およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド
と競合的に結合する抗体が、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの活性のアンタゴニストとして
使用され得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに由来する免疫原を使用することに
より、標準のプロトコルによって抗タンパク質／抗ペプチドの抗血清またはモノクローナ
ル抗体が作製され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｐｒｅｓｓ：１９８８年）を参照されたい）。マウス、ハムスターまたはウサギなどの哺
乳動物を、免疫原性の形態のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、抗体応答を惹起することがで
きる抗原性フラグメント、または融合タンパク質を用いて免疫化することができる。タン
パク質またはペプチドに免疫原性を付与するための技法としては、担体への結合体化また
は当技術分野で周知の他の技法が挙げられる。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの免疫原性部
分は、アジュバントの存在下で投与され得る。免疫化の進行は、血漿中または血清中の抗
体価を検出することによってモニターされ得る。抗体のレベルを評価するために、標準の
ＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイが、免疫原としての抗原と一緒に使用され得る。

ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの抗原性調製物を用いて動物を免疫化した後、抗血清を得
ることができ、所望であれば、ポリクローナル抗体が血清から単離され得る。モノクロー
ナル抗体を生成するために、免疫化した動物から抗体産生細胞（リンパ球）を回収し、標
準の体細胞融合手順によって骨髄腫細胞などの不死化細胞と融合してハイブリドーマ細胞
を生じさせることができる。このような技法は当技術分野で周知であり、それらとしては
、例えば、ハイブリドーマ技法（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５年、Ｎ
ａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５〜４９７頁によって最初に開発された）、ヒトＢ細胞ハイ
ブリドーマ技法（Ｋｏｚｂａｒら、１９８３年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４
巻：７２頁）、およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ
技法（Ｃｏｌｅら、１９８５年、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓおよびＣ
ａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．７７〜９６頁）が挙
げられる。ハイブリドーマ細胞は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに特異的に反応する抗体
の産生について、免疫化学的にスクリーニングされ得、そしてこのようなハイブリドーマ
細胞を含む培養物からモノクローナル抗体が単離され得る。

用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、対象のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに
も特異的に反応するそのフラグメントを包含することが意図される。抗体は、従来の技法
を使用してフラグメント化され得、そして、そのフラグメントは、有用性について、上記
の全抗体についてと同様にスクリーニングされ得る。例えば、抗体をペプシンで処理する
ことによって、Ｆ（ａｂ）_２フラグメントが作製され得る。生じたＦ（ａｂ）_２フラグメ
ントは、Ｆａｂフラグメントを作製するために、ジスルフィド架橋を還元させるように処
理され得る。本発明の抗体は、抗体の少なくとも１のＣＤＲ領域によって付与されるＡｃ
ｔＲＩＩＢポリペプチドに対する親和性を有する二重特異性分子、単鎖分子、キメラ分子
およびヒト化分子を包含することがさらに意図される。好ましい実施形態において、抗体
は、抗体に付着し、検出され得る標識をさらに含む（例えば、標識は、放射性同位元素、
蛍光化合物、酵素または酵素の補因子であり得る）。

特定の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体であり、特定の実
施形態では、本発明は、新規の抗体を作製するための方法を利用可能にする。例えば、Ａ
ｃｔＲＩＩＢポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を作製するための方法
は、マウスに、ある量の、検出可能な免疫応答を刺激するために有効なＡｃｔＲＩＩＢポ
リペプチドを含む免疫原性組成物を投与するステップと、マウスから抗体産生細胞（例え
ば、脾臓からの細胞）を得るステップと、抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合して抗体産生
ハイブリドーマを得るステップと、抗体産生ハイブリドーマを試験して、ＡｃｔＲＩＩＢ
ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定す
るステップとを含み得る。ハイブリドーマが得られたら、それを細胞培養物中で、任意選
択で、ハイブリドーマ由来の細胞が、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに特異的に結合するモ
ノクローナル抗体を産生する培養条件において、増殖させることができる。モノクローナ
ル抗体は細胞培養物から精製され得る。

形容詞「に特異的に反応する」は、抗体に関して使用される場合、当技術分野で一般に
理解されているように、抗体が、対象の抗原（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）と
対象でない他の抗原との間で十分に選択的であること、抗体が、最低でも、特定の種類の
生物試料中の対象の抗原の存在を検出するために有用であることを意味することが意図さ
れる。治療適用などの、抗体を使用する特定の方法では、高い程度の結合の特異性が望ま
れ得る。モノクローナル抗体は、一般に、（ポリクローナル抗体と比較して）所望の抗原
と交差反応性のポリペプチドとを有効に識別する傾向が強い。抗体：抗原相互作用の特異
性に影響を及ぼす１つの特徴は、抗体の抗原に対する親和性である。所望の特異性には、
種々の異なる親和性で達し得るが、一般に好ましい抗体は、約１０^−６、１０^−７、１０
^−８、１０^−９またはそれ未満の親和性（解離定数）を有する。

さらに、望ましい抗体を同定するために抗体をスクリーニングするのに使用される技法
は、得られる抗体の特性に影響を及ぼし得る。例えば、抗体を、溶液中の抗原と結合させ
るために使用する場合、溶液の結合を試験することが望ましいことがある。特に望ましい
抗体を同定するために、抗体と抗原との間の相互作用を試験するための種々の異なる技法
が利用可能である。このような技法としては、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッ
セイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイ、Ｂｉａ−ｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ
，Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄの常磁性ビーズシステム
）、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイおよび免疫組織化学が挙げられる。

特定の態様では、本開示は、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに結合する抗体を提供
する。このような抗体は、上記の通り、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそのフ
ラグメントを抗原として使用して多量に生成され得る。この種類の抗体は、例えば、生物
試料中のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを検出するため、および／または個体における可溶
性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのレベルをモニターするために使用され得る。ある場合で
は、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに特異的に結合する抗体は、ＡｃｔＲＩＩＢポリ
ペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢリガンドの活性を調節し、それによって組織（骨
、軟骨、筋肉、脂肪およびニューロンなど）の成長を制御する（促進または阻害する）か
、または筋細胞膜のユートロフィンを増大させるために使用され得る。

５．スクリーニングアッセイ
特定の態様では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴ
ニストである化合物（因子）を同定するための、対象のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例
えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）の使用に関する。このスクリーニングによっ
て同定された化合物は、インビトロで組織の成長を調節するその能力を評価するために、
骨、軟骨、筋肉、脂肪および／またはニューロンなどの組織において試験され得る。任意
選択で、これらの化合物は、インビボで組織の成長を調節するそれらの能力を評価するた
めに、動物モデルにおいてさらに試験され得る。

ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを標的化することによって、組織の成長を調節するための
治療剤についてスクリーニングするための多数のアプローチが存在する。特定の実施形態
では、骨、軟骨、筋肉、脂肪および／またはニューロンの成長に対するＡｃｔＲＩＩＢ媒
介性の作用を混乱させる因子を同定するために、化合物のハイスループットなスクリーニ
ングが行われ得る。特定の実施形態では、アッセイは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの、
その結合パートナー、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、アクチビン、Ｎｏｄａ
ｌ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１またはＢＭＰ７）などへの結合を特異的に阻害する、または減
少させる化合物をスクリーニングし、同定するために行われる。あるいは、アッセイは、
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの、その結合タンパク質、例えばＡｃｔＲＩＩＢリガンドな
どへの結合を増強する化合物を同定するために使用され得る。さらなる実施形態では、化
合物は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと相互作用するその能力によって同定され得る。

種々のアッセイ形式が十分であり、そして、本開示を考慮すれば、本明細書中に明示的
に記載されない形式は、本明細書中に記載されていないにもかかわらず、当業者によって
理解される。本明細書中に記載されるように、本発明の試験化合物（因子）は、任意の組
み合わせ化学の方法によって作製され得る。あるいは、本主題の化合物は、インビボまた
はインビトロで合成された天然に存在する生体分子であり得る。組織増殖の調節因子とし
て作用するその能力について試験される化合物（因子）は、例えば、細菌、酵母、植物ま
たは他の生物によって生成されても（例えば、天然の生成物）、化学的に生成されても（
例えば、ペプチド模倣物を含む低分子）、組換えにより生成されてもよい。本発明によっ
て企図される試験化合物としては、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペ
プチド模倣物、糖、ホルモンおよび核酸分子が挙げられる。特定の実施形態では、試験因
子は、約２０００ダルトン未満の分子量を持つ小さな有機分子である。

本発明の試験化合物は、単一の別個の実体として提供され得るか、または、組み合わせ
化学によって作製されたような、より複雑度の高いライブラリーにおいて提供され得る。
これらのライブラリーは、例えば、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミン、アミド、
エステル、アルデヒド、エーテルおよび有機化合物の他の分類を含み得る。試験システム
に対する試験化合物の提示は、特に、最初のスクリーニング段階において、単離された形
態または化合物の混合物としてのいずれかであり得る。任意選択で、化合物は、任意選択
で他の化合物で誘導体化され得、そして、化合物の単離を容易にする誘導体化基を有し得
る。誘導体化基の非限定的な例としては、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、
緑色蛍光タンパク質、同位体、ポリヒスチジン、磁気ビーズ、グルタチオンＳトランスフ
ェラーゼ（ＧＳＴ）、光活性化クロスリンカー、またはこれらの任意の組合せが挙げられ
る。

化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラ
ムにおいて、所与の期間に調査される化合物の数を最大にするためには、ハイスループッ
トアッセイが望ましい。精製もしくは半精製（ｓｅｍｉ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）されたタン
パク質で誘導され得るような、無細胞のシステムにおいて行われるアッセイは、試験化合
物によって媒介される分子標的における変更の迅速な発生と比較的容易な検出とを可能に
するように作られ得るという点で、しばしば、「一次」スクリーニングとして好ましい。
さらに、試験化合物の細胞毒性またはバイオアベイラビリティの作用は、一般に、インビ
トロのシステムでは無視され得るが、その代わりに、このアッセイは主として、ＡｃｔＲ
ＩＩＢポリペプチドとその結合タンパク質（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド）との間の
結合親和性の変更において明らかになり得るような、分子標的に対する薬物の作用に焦点
を当てている。

単なる例示として、本発明の例示的なスクリーニングアッセイでは、関心のある化合物
は、アッセイの意図に応じて適宜、通常ＡｃｔＲＩＩＢリガンドに結合し得る単離および
精製されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと接触させられる。その後、化合物とＡｃｔＲＩ
ＩＢポリペプチドとの混合物は、ＡｃｔＲＩＩＢリガンドを含む組成物に加えられる。Ａ
ｃｔＲＩＩＢ／ＡｃｔＲＩＩＢリガンド複合体の検出および定量は、ＡｃｔＲＩＩＢポリ
ペプチドとその結合タンパク質との間の複合体の形成の阻害（または助長）における化合
物の効力を決定するための手段を提供する。化合物の効力は、種々の濃度の試験化合物を
用いて得られたデータから用量応答曲線を生成することによって評価され得る。さらに、
比較のためのベースラインを提供するためのコントロールアッセイもまた行われ得る。例
えば、コントロールアッセイでは、単離および精製されたＡｃｔＲＩＩＢリガンドは、Ａ
ｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む組成物に加えられ、そして、ＡｃｔＲＩＩＢ／ＡｃｔＲ
ＩＩＢリガンド複合体の形成は、試験化合物の非存在下で定量される。一般に、反応物が
混合され得る順序は変化し得、そして、同時に混合され得ることが理解される。さらに、
適切な無細胞アッセイ系を与えるように、精製したタンパク質の代わりに、細胞の抽出物
および溶解物が使用され得る。

ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合タンパク質との間の複合体の形成は、種々の技
術によって検出され得る。例えば、複合体の形成の調節は、例えば、検出可能に標識され
たタンパク質、例えば、放射標識（例えば、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１４Ｃまたは^３Ｈ）、蛍光
標識（例えば、ＦＩＴＣ）、または、酵素標識されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは
その結合タンパク質を用いて、イムノアッセイによって、あるいは、クロマトグラフィー
による検出によって定量され得る。

特定の実施形態では、本発明は、直接的または間接的のいずれかで、ＡｃｔＲＩＩＢポ
リペプチドとその結合タンパク質との間の相互作用の程度を測定する、蛍光偏光アッセイ
および蛍光共鳴エネルギー遷移（ＦＲＥＴ）アッセイの使用を企図する。さらに、光導波
管（ｗａｖｅｇｕｉｄｅ）（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２６４３２および米国特許第５，６７
７，１９６号）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面電荷センサ、および表面力センサ
に基づくもののような、他の検出様式が、本発明の多くの実施形態と適合性がある。

さらに、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合タンパク質との間の相互作
用を妨害または助長する因子を同定するための、「ツーハイブリッドアッセイ」としても
公知である相互作用トラップアッセイの使用を企図する。例えば、米国特許第５，２８３
，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３年）Ｃｅｌｌ ７２巻：２２３〜２３２頁；Ｍａ
ｄｕｒａら（１９９３年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８巻：１２０４６〜１２０５４
頁；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４巻：９２０〜９２
４頁；およびＩｗａｂｕｃｈｉら（１９９３年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８巻：１６９３〜１
６９６頁を参照のこと。特定の実施形態では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと
その結合タンパク質との間の相互作用を解離させる化合物（例えば、低分子またはペプチ
ド）を同定するための、逆ツーハイブリッドシステムの使用を企図する。例えば、Ｖｉｄ
ａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ（１９９９年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７巻
：９１９〜２９頁；ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ（１９９９年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ １７巻：３７４〜８１頁；ならびに米国特許第５，５２５，４９０号
；同第５，９５５，２８０号；および同第５，９６５，３６８号を参照のこと。

特定の実施形態では、本主題の化合物は、本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと相互
作用するその能力によって同定される。化合物と、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとの間の
相互作用は、共有結合性であっても非共有結合性であってもよい。例えば、このような相
互作用は、光架橋、放射性標識リガンド結合、およびアフィニティクロマトグラフィーを
含むインビトロの生化学的な方法を用いて、タンパク質レベルで同定され得る（Ｊａｋｏ
ｂｙ ＷＢら、１９７４年、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４６巻：１
頁）。特定の場合には、化合物は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに結合する化合物を検出
するためのアッセイのような、機構ベースのアッセイにおいてスクリーニングされ得る。
これは、固相もしくは流体相の結合事象を含み得る。あるいは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプ
チドをコードする遺伝子は、レポーターシステム（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシ
フェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質）と共に細胞中にトランスフェクトされ、そして、
好ましくは、ハイスループットスクリーニングによって、ライブラリーに対して、または
、ライブラリーの個々のメンバーを用いてスクリーニングされ得る。他の機構ベースの結
合アッセイ（例えば、自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイ）が使用され得る。
結合アッセイは、ウェル、ビーズもしくはチップに固定されているか、または、固定され
た抗体によって捕捉されている標的を用いて行われ得るか、あるいは、キャピラリー電気
泳動によって分離され得る。結合した化合物は通常、比色または蛍光または表面プラズモ
ン共鳴を用いて検出され得る。

特定の態様では、本発明は、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／またはＡｃ
ｔＲＩＩＢリガンドの機能に拮抗することによって、筋肉の成長を刺激し、筋肉量を増加
させるための方法および因子を提供する。したがって、同定された任意の化合物は、イン
ビトロまたはインビボで、細胞全体または組織全体において、筋肉の成長を調節する、ま
たは筋細胞膜におけるユートロフィンレベルを変更するそれらの能力を確認するために試
験され得る。この目的のために当該分野で公知のさまざまな方法を利用することができる
。例えば、本発明の方法は、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、ＧＤＦ８）への結合によ
って活性化される、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を介するシグナル伝達が減少する、または
阻害されるように実施される。生物における筋肉組織の成長により、生物における筋肉量
が、結果として、対応する、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を介するシグナル伝達が行われて
いない生物（または生物の集団）の筋肉量と比較して増加することが認識される。

例えば、筋肉細胞の成長／増殖に対するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは試験化合物
の作用は、筋原細胞の増殖に関連するＰａｘ−３およびＭｙｆ−５の遺伝子発現、ならび
に筋肉の分化に関連するＭｙｏＤの遺伝子発現を測定することによって決定することがで
きる（例えば、Ａｍｔｈｏｒら、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ． ２００２年、２５１巻：２４１〜
５７頁）。ＧＤＦ８は、Ｐａｘ−３およびＭｙｆ−５の遺伝子発現を下方制御すること、
およびＭｙｏＤの遺伝子発現を妨げることが公知である。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドま
たは試験化合物は、ＧＤＦ８のこの活性と拮抗することが予測される。細胞に基づくアッ
セイの別の例としては、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは試験化合物の存在下でＣ（２
）Ｃ（１２）筋芽細胞などの筋芽細胞の増殖を測定することが挙げられる（例えば、Ｔｈ
ｏｍａｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０００年、２７５巻：４０２３５〜４３頁）
。

本発明はまた、筋肉の量および強度を測定するためのインビボまたはエクスビボのアッ
セイを企図する。例えば、Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ
Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． ２００３年、３００巻：９６５〜７１頁）は、マウスにおいて
、骨格筋量の増加および握力の増加を測定する方法を開示している。任意選択で、この方
法を使用して、筋肉疾患または状態、例えば、筋肉量が限定されている疾患に対する試験
化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）の治療効果を決定することができる。さ
らに、治療介入後のその筋肉の生理的完全性を評価するために、収縮の繰り返しに対する
筋肉の機械的反応が使用され得る。例えば、筋ジストロフィーのマウスモデルは、一般に
は、力を発揮する（収縮する）と筋線維が伸びる間の一連の伸張性収縮後に最大強縮力の
過剰な急降下を示す。治療剤（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）を投与した後に力
の急降下が少なくなることは、筋細胞膜の完全性に対する有益な作用を示し得る。したが
って、Ｋｒａｇら（２００４年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０
１巻：１３８５６〜１３８６０頁）は、エクスビボで単離された筋肉を用いてこのような
アッセイを行うための方法を開示している。あるいは、Ｂｌａａｕｗら（２００８年、Ｈ
ｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １７巻：３６８６〜３６９６頁）は、インビボでそのように
試験するための方法を開示している。

本発明のスクリーニングアッセイは、本主題のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃ
ｔＲＩＩＢポリペプチドの改変体だけでなく、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアゴニスト
およびアンタゴニストを含めた任意の試験化合物にも適用されることが理解される。さら
に、これらのスクリーニングアッセイは、薬物の標的の確認および品質管理の目的のため
に有用である。

６．例示的な治療的用途
特定の実施形態では、本発明の組成物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）は、Ａ
ｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、ＧＤＦ８）
の異常な活性に関連する疾患また状態を処置または予防するために使用され得る。これら
の疾患、障害または状態は、本明細書中では一般に「ＡｃｔＲＩＩＢ関連状態」と呼ばれ
る。特定の実施形態では、本発明は、治療有効量の上記のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを
個体に投与することによって、疾患、障害または状態の処置または予防を必要とする個体
における疾患、障害または状態を処置または予防する方法を提供する。これらの方法は、
特に動物、特に、ヒトの治療的および予防的な処置を目的としている。

本明細書中で使用される場合、障害または状態を「予防する」治療薬は、統計的試料に
おいて、無処置の対照試料に対して、処置試料における障害もしくは状態の出現を低下さ
せるか、あるいは、無処置の対照試料に対して、障害もしくは状態の１または複数の症状
の発症を遅延させるか、または、重篤度を低下させるような化合物を指す。用語「処置す
る」は、本明細書中で使用される場合、指定された状態の予防、または、一度確立された
状態の改善もしくは除去を含む。

特定の実施形態では、本発明の組成物（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）
は、筋ジストロフィーに対する処置の一部として使用される。用語「筋ジストロフィー」
は、骨格筋および場合によっては心臓および呼吸器の筋肉のゆるやかな衰弱および劣化を
特徴とする退行性の筋疾患のグループを指す。筋ジストロフィーは、筋肉における微視的
な変化で始まる進行性の筋肉の消耗および衰弱を特徴とする遺伝的障害である。時間とも
に筋肉が変性するにつれて、その人の筋肉の強度が減退する。特に、本主題のＡｃｔＲＩ
ＩＢポリペプチドを含むレジメンを用いて処置され得る、ジストロフィン機能の喪失によ
って引き起こされる筋ジストロフィーとしては、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび
ベッカー型筋ジストロフィーが挙げられる。

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、フランスの神経科医であるＧｕｉｌｌ
ａｕｍｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ａｍａｎｄ Ｄｕｃｈｅｎｎｅによって１８６０年代に最
初に記載され、男性における最も頻度の高い遺伝性疾患の１つであり、３，５００人に１
人の少年に影響を及ぼしている。ＤＭＤは、全長ジストロフィンタンパク質の形成を妨げ
る、ジストロフィン遺伝子の変異または欠失によって引き起こされる。特に男性は、ジス
トロフィン遺伝子を、Ｘ染色体上に位置する単一コピーのみしか保有しないので、ジスト
ロフィン欠損の危険性がある。ジストロフィンは、通常、筋肉細胞（線維）の原形質膜（
筋細胞膜）とアクチンの細胞骨格および細胞外マトリックスとを連結し、それによって線
維収縮の間、筋細胞膜を安定化する多タンパク質複合体の重大な成分として機能する。機
能性ジストロフィンの非存在下では、収縮と弛緩のサイクルの間に、筋細胞膜、および最
終的には筋線維全体が容易に損傷を受ける。ＤＭＤの経過の初期では、筋肉は再生によっ
て補償されるが、最終的に、筋肉前駆細胞は進行中の傷害についていけず、そして、健康
な筋肉が、非機能的な線維脂肪性組織に置き換えられる。

ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、１９５０年代にＤＭＤのこの変形について
最初に記載したドイツの医師であるＰｅｔｅｒ Ｅｍｉｌ Ｂｅｃｋｅｒにちなんで名付
けられた。ＢＭＤは、ジストロフィン遺伝子における異なる突然変異に起因する。ＢＭＤ
患者はいくらかのジストロフィンを有するが、量が不十分であるか、または質が悪いかの
いずれかである。ある程度のジストロフィンの機能性を有することにより、ＢＭＤの人の
筋肉は、ＤＭＤの人の筋肉と同じくらいひどく、または同じくらい急速に変性することか
ら保護される。

ユートロフィンは、ジストロフィンと構造的に類似した常染色体性のタンパク質であり
、胚発生の間に筋細胞膜においてジストロフィンと共に広く発現される。筋肉におけるユ
ートロフィンの発現は、通常、出生時までに減退し、成熟線維では神経筋接合部および筋
肉腱接合部に限られるようになる。説得力のある証拠は、筋ジストロフィー患者において
ユートロフィンがジストロフィンの代わりをし得、初期発生において見られるように、筋
細胞膜に沿ってユートロフィンレベルを増加させる方法を考案することができれば、治療
的な利益をもたらし得ることを示唆している（Ｍｉｕｒａら、２００６年、Ｔｒｅｎｄｓ
Ｍｏｌ Ｍｅｄ １２巻：１２２〜１２９頁）。原理の実験的な証明では、ｍｄｘマウ
スモデルにおいて、筋肉におけるユートロフィンのトランスジェニック発現によって正常
な機械的機能が完全に回復し、筋ジストロフィーが予防された（Ｔｉｎｓｌｅｙら、１９
９８年、Ｎａｔ Ｍｅｄ ４巻：１４４１〜１４４４頁）。

最近の研究では、インビボでＧＤＦ８（ＡｃｔＲＩＩＢリガンド）の機能を遮断または
排除することにより、ＤＭＤ患者およびＢＭＤ患者における少なくともある特定の症状が
有効に処置され得ることが実証されている。したがって、本主題のＡｃｔＲＩＩＢポリペ
プチドは、ＧＤＦ８インヒビター（アンタゴニスト）として作用され得、ＤＭＤ患者およ
びＢＭＤ患者においてインビボでＧＤＦ８および／またはＡｃｔＲＩＩＢの機能を遮断す
る代替の手段を構成する。このアプローチは、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質が、筋ジ
ストロフィーのマウスモデルにおいて筋肉の量および強度を増大させたので、筋細胞膜で
の広範なユートロフィンの発現を誘導することが示されたという本明細書で示されるデー
タによって確証され、支持される。

７．薬学的組成物
特定の実施形態では、本発明の化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）は、薬
学的に受容可能なキャリアと共に処方される。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、
単独で、または、薬学的処方物（治療用組成物）の成分として投与され得る。本主題の化
合物は、ヒトまたは獣医学における医薬での使用のために任意の簡便な方法で投与するた
めに処方され得る。

特定の実施形態では、本発明の治療方法は、局所に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、全身に、
または、移植物もしくはデバイスとして局所的に（ｌｏｃａｌｌｙ）組成物を投与するこ
とを包含する。投与される場合、本発明において使用するための治療用組成物は、当然の
ことながら、発熱物質を含まない生理学的に容認可能な形態である。さらに、組成物は、
標的組織部位（例えば、骨、軟骨、筋肉、脂肪またはニューロン）、例えば、組織の損傷
を有する部位へと送達するためにカプセル化されるか、または粘性の形態で注射されるこ
とが望ましい場合がある。局所投与は、創傷治癒および組織修復のために適している可能
性がある。また、その代わりにまたはそれに加えて、上記の組成物中に任意選択で含めら
れ得るＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド以外の治療上有用な因子は、本発明の方法において、
本主題の化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）と同時に、または逐次的に投与
され得る。

特定の実施形態では、本発明の組成物は、標的組織部位に１または複数の治療用化合物
（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）を送達し得、成長中の組織のための構造を提供
し得、そして、最適には身体内へと再吸収され得るマトリクスを含み得る。例えば、マト
リクスは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのゆっくりとした放出を提供し得る。このような
マトリクスは、他の移植医療用途に現在使用される材料から形成され得る。

マトリクス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、見かけ上の様相および
界面の特性に基づく。本主題の組成物の特定の用途が、適切な処方物を画定する。組成物
のための可能性のあるマトリクスは、生分解性でかつ化学的に画定された硫酸カルシウム
、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であり得る。
他の可能性のある材料は、生分解性でかつ生物学的に十分に画定されたもの（例えば、骨
または皮膚のコラーゲン）である。さらなるマトリクスは、純粋なタンパク質または細胞
外マトリクスの成分を含む。他の可能性のあるマトリクスは、非生分解性でかつ化学的に
画定されたもの（例えば、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオグラス、アルミン酸塩、ま
たは他のセラミクス）である。マトリクスは、上述のタイプの材料のいずれかの組合せ（
例えば、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、または、コラーゲンおよびリン酸三カル
シウム）を含み得る。バイオセラミクスは、組成物中（例えば、カルシウム−アルミン酸
−リン酸中）で変化され得、孔径、粒径、粒子の形状および生分解性を変更するように加
工され得る。

特定の実施形態では、本発明の方法は、例えば、カプセル、カシェ、丸剤、錠剤、ロゼ
ンジ（矯味矯臭薬を含む基材、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガントを用い
て）、散剤、顆粒剤、または、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁物として、
または、水中油もしくは油中水の液体エマルジョンとして、または、エリキシルもしくは
シロップとして、または、トローチ（ゼラチンおよびグリセリン、または、スクロースお
よびアカシアのような不活性基材を用いて）および／またはマウスウォッシュなどの形態
（この各々が、活性成分として所定量の因子を含む）で、経口投与され得る。因子はまた
、ボーラス、舐剤またはペーストとしても投与され得る。

経口投与のための固体投薬形態（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤など）
において、本発明の１または複数の治療用化合物は、１または複数の薬学的に受容可能な
キャリア（例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム）および／または、以
下のうちのいずれかと共に混合され得る：（１）充填剤または増量剤（例えば、デンプン
、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸）；（２）
結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピ
ロリドン、スクロースおよび／またはアカシアなど）；（３）湿潤剤（例えば、グリセロ
ール）；（４）崩壊剤（例えば、寒天（ａｇａｒ−ａｇａｒ）、炭酸カルシウム、ポテト
もしくはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）；（
５）溶液抑制因子（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅｔａｒｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（例えば、パ
ラフィン）；（６）吸収加速剤（例えば、四級アンモニウム化合物）；（７）加湿剤（例
えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなど）；（８）吸着剤（例
えば、カオリンおよびベントナイトクレイ）；（９）潤滑剤（例えば、滑石、ステアリン
酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸
ナトリウムおよびこれらの混合物）；および（１０）着色剤。カプセル、錠剤および丸剤
の場合には、薬学的組成物はまた、緩衝剤を含み得る。同様のタイプの固形組成物もまた
、ラクトースすなわち乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤
を用いて、軟充填ゼラチンカプセルおよび硬充填ゼラチンカプセル中の充填物として用い
られ得る。

経口投与のための液体投薬形態としては、薬学的に受容可能なエマルジョン、マイクロ
エマルジョン、溶液、懸濁物、シロップおよびエリキシルが挙げられる。活性成分に加え
、液体投薬形態は、当該分野で一般に用いられる不活性希釈剤、例えば、水または他の溶
媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸
エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、
１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽
油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコー
ル、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合
物を含み得る。不活性な希釈剤に加え、経口用組成物はまた、加湿剤、乳化剤および懸濁
剤、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤、芳香剤および保存剤のようなアジュバントを含み得る
。

懸濁物は、活性な化合物に加えて、懸濁剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアル
コール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロー
ス、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガント、ならびにこ
れらの混合物を含み得る。

本明細書に開示されている特定の組成物は、皮膚または粘膜のいずれかに局所的に投与
され得る。局所用処方物は、皮膚または角質層への浸透賦活剤（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ
ｅｎｈａｎｃｅｒ）として有効であることが公知の多種多様の因子の１または複数をさ
らに含み得る。これらの例は、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチル
アセトアミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチルアルコールまたは
イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、およびアゾンである。さらなる因子が
、化粧品として容認される処方物を作製するためにさらに含められ得る。これらの例は、
脂肪、ワックス、油、色素、芳香剤、保存料、安定剤、および表面活性剤（ｓｕｒｆａｃ
ｅ ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）である。当技術分野で公知のものなどの角質溶解薬（ｋ
ｅｒａｔｏｌｙｔｉｃ ａｇｅｎｔ）も含められ得る。例は、サリチル酸および硫黄であ
る。

局所投与または経皮投与するための剤形としては、散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペース
ト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、パッチ剤、および吸入剤が挙げられる
。活性化合物は、滅菌条件下で、薬学的に受容可能なキャリアと共に、および必要であり
得る任意の保存料、緩衝剤、または噴霧剤（ｐｒｏｐｅｌｌａｎｔ）と共に混合され得る
。軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤およびゲル剤は、本発明の本主題の化合物（例えば、
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）に加えて、賦形剤、例えば、動物および植物の脂肪、油、
ワックス、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコ
ール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはそれらの混合
物などを含み得る。

散剤およびスプレー剤は、本主題の化合物に加えて、賦形剤、例えば、ラクトース、タ
ルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末、または
これらの物質の混合物などを含み得る。スプレー剤は、ブタンおよびプロパンなどの、ク
ロロフルオロヒドロカーボンおよび揮発性の非置換型炭化水素などの通例の噴霧剤をさら
に含み得る。

特定の実施形態では、非経口投与に適した薬学的組成物は、１または複数のＡｃｔＲＩ
ＩＢポリペプチドを、１または複数の薬学的に受容可能な無菌かつ等張の水性もしくは非
水性の溶液、分散物、懸濁液もしくはエマルジョン、または、使用直前に無菌の注射可能
な溶液もしくは分散物へと再構成され得る無菌粉末と組み合わせて含み得、この組成物は
、抗酸化物質、緩衝剤、静菌剤、処方物を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶
質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含み得る。本発明の薬学的組成物中で採用され得る適
切な水性および非水性のキャリアの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、
グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびこれらの適
切な混合物、植物油（例えば、オリーブ油）、ならびに、注射可能な有機エステル（例え
ば、オレイン酸エチル）が挙げられる。適切な流動性は、例えば、コーティング材料（例
えば、レシチン）の使用によって、分散物の場合には必要とされる粒径の維持によって、
そして、界面活性剤の使用によって維持され得る。

本発明の組成物はまた、保存剤、加湿剤、乳化剤および分散剤のようなアジュバントを
含み得る。微生物の作用の阻止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、
クロロブタノール、ソルビン酸フェノールなど）を含めることによって保証され得る。糖
、塩化ナトリウムなどのような等張化剤を組成物中に含めることも望ましくあり得る。さ
らに、注射可能な薬学的形態の吸収の延長は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラ
チンのような吸収を遅らせる因子を含めることによってもたらされ得る。

投薬レジメンは、本発明の主題の化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）の作
用を修飾する種々の要因を考慮して主治医によって決定されることが理解される。種々の
要因は、処置されるべき疾患に依存する。筋障害の場合では、要因としては、形成される
ことが望ましい筋肉量、疾患によって最も影響を受ける筋肉、劣化した筋肉の状態、患者
の年齢、性別および食事、投与時間、および他の臨床的な要因が挙げられ得るが、これら
に限定されない。最終的な組成物に他の公知の増殖因子を加えることも、投与量に影響を
及ぼし得る。筋肉の成長および／または修復を、例えば、強度試験、筋肉のサイズのＭＲ
Ｉ評価および筋肉の生検材料の分析によって定期的に評価することにより、進行をモニタ
ーすることができる。

本発明のある特定の実施形態では、１または複数のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、一
緒に（同時に）または違う時間に（逐次的にまたは重複して）投与され得る。さらに、Ａ
ｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、別の種類の治療剤、例えば、軟骨誘導因子、骨誘導因子、
筋肉誘導因子、脂肪減少因子（ｆａｔ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ）または神経誘導因子（ｎｅｕ
ｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）と共に投与され得る。２種類の化合物は、同時
に、または違う時間に投与され得る。本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、別の治療
剤と協調して、またはことによると相乗的に作用し得ることが予想される。

特定の例では、種々の骨形成因子、軟骨誘導因子および骨誘導因子、特に、ビスホスホ
ネートが記載されている。例えば、欧州特許出願第１４８，１５５号および同第１６９，
０１６号を参照されたい。例えば、本主題のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと組み合わせる
ことができる他の因子としては、種々の増殖因子、例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血
小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧ
Ｆ−β）、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）などが挙げられる。

特定の実施形態では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのインビボ産生のための
遺伝子治療も提供する。このような治療は、上に列挙したような障害を有する細胞または
組織中にＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチド配列を導入することによってその治療作用を達
成する。ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチド配列の送達は、キメラウイルスのような組換え
発現ベクターまたはコロイド分散系を用いて達成され得る。ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオ
チド配列の治療的送達には、標的化されたリポソームの使用が好ましい。

本明細書中で教示されるような遺伝子治療に利用され得る種々のウイルスベクターとし
ては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または、好ましくはレトロウイ
ルスのようなＲＮＡウイルスが挙げられる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マ
ウスもしくはトリのレトロウイルスの誘導体である。単一の外来遺伝子が挿入され得るレ
トロウイルスベクターの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：モロニ
ーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベーマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ
）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。多数の
さらなるレトロウイルスベクターが多数の遺伝子を組み込み得る。これらのベクターは全
て、形質導入された細胞が同定および生成され得るように、選択マーカーについての遺伝
子を移送または組み込み得る。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタ
ンパク質を付着させることによって、標的特異的とされ得る。好ましい標的化は、抗体を
用いて達成される。当業者は、ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベ
クターの標的特異的な送達を可能にするために、特定のポリヌクレオチド配列がレトロウ
イルスゲノム中に挿入され得るか、または、ウイルスエンベロープに付着され得ることを
認識する。 一つの好ましい実施形態において、このベクターは、骨、軟骨、筋肉または
ニューロンの細胞／組織に標的化される。

あるいは、組織培養細胞は、従来のリン酸カルシウムトランスフェクション法によって
、レトロウイルスの構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをコードするプラスミドを用
いて直接トランスフェクトされ得る。これらの細胞は、次いで、関心のある遺伝子を含む
ベクタープラスミドでトランスフェクトされる。得られた細胞は、培養培地中にレトロウ
イルスベクターを放出する。

ＡｃｔＲＩＩポリヌクレオチドのための別の標的化送達システムは、コロイド分散系で
ある。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ
および脂質ベースの系（水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミセルおよびリポソームを
含む）が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは
、インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして有用な人工の膜小胞である。ＲＮＡ、
ＤＮＡおよびインタクトなビリオンが、水性の内部に封入され得、そして、生物学的に活
性な形態で細胞へと送達され得る（例えば、Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ． Ｓｃｉ．、６巻：７７頁、１９８１年を参照のこと）。リポソームビヒクルを用
いた効率的な遺伝子移入のための方法は当該分野で公知であり、例えば、Ｍａｎｎｉｎｏ
ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６８２頁、１９８８年を参照のこと。リポソー
ムの組成は、通常リン脂質の組合せであり、通常ステロイド（特に、コレステロール）と
組合わされる。他のリン脂質または他の脂質もまた使用され得る。リポソームの物理的特
性は、ｐＨ、イオン強度および二価のカチオンの存在に依存する。

リポソームの生成において有用な脂質の例としては、ホスファチジル化合物（例えば、
ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファ
チジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシド）が挙げ
られる。例示的なリン脂質としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファ
チジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。例えば、器官特
異性、細胞特異性および細胞小器官特異性に基づいたリポソームの標的化もまた可能であ
り、当該分野で公知である。

本発明は、ここで、一般的に記載されてきたが、単に特定の実施形態および本発明の実
施形態を例示する目的のために含められ、本発明を限定することは意図されない以下の実
施例を参照するとより容易に理解される。

（実施例１）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質の作製
出願人は、間に最小限のリンカー（３つのグリシンアミノ酸）を用いて、ヒトもしくは
マウスのＦｃドメインに融合させたヒトＡｃｔＲＩＩｂの細胞外ドメインを有する可溶性
のＡｃｔＲＩＩｂ融合タンパク質を構築した。この構築物を、それぞれＡｃｔＲＩＩｂ（
２０〜１３４）−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩｂ（２０〜１３４）−ｍＦｃと呼ぶ。

ＡｃｔＲＩＩｂ（２０〜１３４）−ｈＦｃを、ＣＨＯ細胞から精製されたものとして以
下に示す（配列番号５）

ＡｃｔＲＩＩｂ（２０〜１３４）−ｈＦｃタンパク質およびＡｃｔＲＩＩｂ（２０〜１
３４）−ｍＦｃタンパク質をＣＨＯ細胞株中で発現させた。３つの異なるリーダー配列を
検討した：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（
配列番号７）
（ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬ
ＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号８）
（ｉｉｉ）天然：ＭＧＡＡＡＫＬＡＦＡＶＦＬＩＳＣＳＳＧＡ（配列番号９）。

選択された形態は、ＴＰＡリーダーを採用し、そして、以下のプロセシングを受けてい
ないアミノ酸配列を有する：

このポリペプチドは、以下の核酸配列によってコードされる（配列番号１０）：

ＣＨＯ細胞が産生した物質のＮ末端の配列決定により、主要な配列である−ＧＲＧＥＡ
Ｅ（配列番号１１）が明らかになった。特に、文献において報告された他の構築物は、−
ＳＧＲ…配列で始まる。

精製を、例えば、以下のうちの３またはそれ以上を任意の順序で含む一連のカラムクロ
マトグラフィーステップによって達成し得る：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセフ
ァロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除ク
ロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィー。精製は、ウイルス濾過およ
びバッファーの交換で完了し得る。

ＡｃｔＲＩＩｂ−Ｆｃ融合タンパク質を、ＨＥＫ２９３細胞およびＣＯＳ細胞において
も発現させた。すべての細胞株由来の材料および妥当な培養条件により、インビボで筋肉
増強活性（ｍｕｓｃｌｅ−ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を持つタンパク質がも
たらされたが、観察された効力の変動性は、おそらく、細胞株の選択および／または培養
条件に関連する。

（実施例２）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ変異体の作製
出願人は、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインに一連の変異を生じさせ、これらの変異体
タンパク質を細胞外ＡｃｔＲＩＩＢとＦｃドメインとの可溶性の融合タンパク質として作
製した。バックラウンドのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合物はこの配列を有した（Ｆｃ部分に
下線を付した）（配列番号１２）：

Ｎ末端およびＣ末端の切断を含めた、さまざまな変異をバックラウンドのＡｃｔＲＩＩ
Ｂ−Ｆｃタンパク質に導入した。実施例１において提示されたデータに基づいて、これら
の構築物は、ＴＰＡリーダーを用いて発現させる場合、Ｎ末端のセリンを欠くことが予想
される。ＰＣＲ変異誘発によって、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインにおいて変異を発生さ
せた。ＰＣＲの後、フラグメントをＱｉａｇｅｎカラムによって精製し、ＳｆｏＩおよび
ＡｇｅＩを用いて消化し、ゲル精製した。これらのフラグメントを、発現ベクターのｐＡ
ＩＤ４（ＷＯ２００６／０１２６２７参照）に、ライゲーションすると、ヒトＩｇＧ１と
の融合キメラが創出されるようにライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５アルファ中
へ形質転換し、コロニーを採集し、ＤＮＡを単離した。マウスの構築物（ｍＦｃ）につい
ては、ヒトＩｇＧ１をマウスＩｇＧ２ａに置き換えた。すべての変異体について配列を確
認した。

変異体は全て、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において一過性のトランスフェクションによって作
製した。要約すると、５００ｍｌのスピナー中、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２５０ｍｌ体積
のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地中、１ｍｌ当たり細胞６×１０^５個
で準備し、一晩成長させた。次の日に、これらの細胞を、ＤＮＡ：ＰＥＩ（１：１）複合
体を最終的なＤＮＡ濃度０．５μｇ／ｍｌで用いて処理した。４時間後、２５０ｍｌの培
地を加え、細胞を７日間成長させた。細胞を遠心して沈降させることにより馴化培地を回
収し、濃縮した。

変異体を、例えば、プロテインＡカラムを含めたさまざまな技法を使用して精製し、低
ｐＨ（３．０）のグリシンバッファーを用いて溶出した。中和した後、これらをＰＢＳに
対して透析した。

変異体は、ＣＨＯ細胞においても同様の方法論によって作製した。

（実施例３）
切断された改変体ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃの作製
出願人は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃを用いて観察されたものと同様の
、筋肉に対する作用を示す、切断された融合タンパク質、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１
）−ｈＦｃ（図７〜８）を作製した。ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃに関して
上記したものと同じリーダーおよび方法論を使用して、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）
−ｈＦｃを作製した。ＣＨＯ細胞において発現させた後に精製した成熟ＡｃｔＲＩＩＢ（
２５〜１３１）−ｈＦｃタンパク質は、以下に示す配列を有する（配列番号２３）：

（実施例４）
ｍｄｘマウスにおける、筋肉の量および強度に対するＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの作用
疾患状態において筋肉量を増加させるＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−Ｆｃタンパク
質の能力を決定するために、出願人は、筋ジストロフィーのｍｄｘマウスモデルにおいて
、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質の、筋肉量を増加させる能力を決定した。

成体のｍｄｘマウスを週２回、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃタンパク質（
１、３、または１０ｍｇ／ｋｇ；腹腔内）またはＰＢＳビヒクル対照で処置した。力変換
器（ｆｏｒｃｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）を引っ張る際にマウスが発揮した力を測定して
前肢の握力を決定する。５回の引っ張り試行の平均の力を使用してコホート間の握力を比
較した。試験終了時に、大腿筋、腓腹筋、胸筋および横隔膜筋を解剖し、秤量した。握力
測定でも有意な増加が示された。筋肉量の結果が以下の表に要約されている。

この表において例示されているように、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃ処置
群は、ｍｄｘマウスにおいて、ＰＢＳ処置したマウスと比較して除脂肪組織質量（ｌｅａ
ｎ ｔｉｓｓｕｅ ｍａｓｓ）の増加を示した。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ処置により、ビヒ
クル対照群と比較して、腓腹筋のサイズが２５．９％、大腿部のサイズが３１．８％、お
よび胸筋が８５．４％増加した。可能性のある臨床的な重要性として、我々は、ＡｃｔＲ
ＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃ処置マウスの横隔膜の重量が、対照コホートと比較して
３４．２％増加したことも見出した。これらのデータは、筋ジストロフィー疾患状態にお
けるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質の有効性を実証している。

さらに、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質で処置したｍｄｘマウスは、ビヒクルで処置
した対照と比較して、握力の増加を示す。１６週の時点で、１、３および１０ｍｇ／ｋｇ
のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ群は、それぞれ、ビヒクル対照群と比較して、３１．４％、３２
．３％および６４．４％の握力の増加を実証した。ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍ
Ｆｃ処置群の握力性能の改善は、処置群において見出される筋肉の増加が、生理的に意味
があるという観念を支持する。ｍｄｘマウスは、収縮誘導性傷害を受けやすく、それらの
野生型対応物よりも有意に多い変性と再生のサイクルを受ける。これらの筋肉表現型にも
かかわらず、ｍｄｘマウスにおいて、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃ処置によ
り握力が増加する。

デュシェンヌ型筋ジストロフィーでは、疾患の発症は小児期の初期、しばしば、早けれ
ば５歳で起こる。したがって、成体マウスに関して上に提示されているデータは、必ずし
も、ＡｃｔＲＩＩＢ分子がＤＭＤの小児において有し得る作用を反映しない。これに対処
するために、若齢のｍｄｘマウスを用いて試験を行った。

ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃ処置により、若齢（４週齢）のＣ５７ＢＬ／
１０マウスおよびｍｄｘマウスにおいて体重が有意に増加する。インビボＮＭＲ分光法を
使用した体組成分析により、より重い体重に伴う除脂肪組織質量の増加が明らかになった
。ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃで処置したＣ５７ＢＬ／１０マウスでは、そ
れらのそれぞれの対照コホートよりも、除脂肪組織質量が３５．２％増加し、処置したｍ
ｄｘ群では除脂肪組織質量が４８．３％増加した。さらに、強度に対するＡｃｔＲＩＩＢ
（２０〜１３４）−ｍＦｃ処置の作用を評価した。ビヒクルで処置したｍｄｘマウスの握
力スコアは、ビヒクルＣ５７ＢＬ／１０コホートよりも１５．７％低く、それにより、ジ
ストロフィン欠乏に関連する筋肉の衰弱が例示されている。対照的に、ＡｃｔＲＩＩＢ（
２０〜１３４）−ｍＦｃで処置したｍｄｘマウスでは、それらの握力がｍｄｘビヒクル群
と比較して改善され、Ｃ５７ＢＬ／１０ビヒクルマウスを凌ぐ握力測定値が達成され、処
置したＣ５７ＢＬ／１０の握力スコアのレベルに到達した（ビヒクルｍｄｘ：０．１４０
±０．０１ＫｇＦ；処置したｍｄｘ：０．１９９±０．０２ＫｇＦ；ビヒクルＣ５７ＢＬ
／１０：０．１６６±０．０３；０．２０５±０．０２ＫｇＦ）。驚くべきことに、この
処置により、若齢のｍｄｘマウスが野生型の握力のレベルまで回復した。したがって、Ａ
ｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃ分子は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、特に
、この疾患の発症に近い年齢の若齢の患者において重要な臨床的適用を有する可能性があ
る。

（実施例５）
ｍｄｘマウスにおける、筋細胞膜でのユートロフィンの発現に対するＡｃｔＲＩＩＢ−
Ｆｃの作用
最も一般的な種類の筋ジストロフィーは、機能性ジストロフィンタンパク質の部分的ま
たは完全な喪失によって引き起こされ、筋細胞膜（筋肉細胞膜）の脆弱性、筋肉の衰弱、
および最終的な筋肉の壊死に至る。ユートロフィンは、正常状態下では成熟筋線維におけ
る分布が非常に限られてはいるが、構造的に類似したタンパク質である。説得力のある証
拠は、ユートロフィンが、ジストロフィンの代わりをし得、初期発生の間の場合と同様に
筋線維の筋細胞膜全体を通してユートロフィンレベルを増加させる方法を考案することが
できれば、多くの筋ジストロフィー患者において、治療的な利益をもたらし得ることを示
唆している（Ｍｉｕｒａら、２００６年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １２巻：１２
２〜１２９頁）。

したがって、出願人は、ジストロフィン遺伝子のエクソン１０における点変異が中途で
の終止コドンおよび機能不全のジストロフィンタンパク質を生み出すｍｄｘ^５ｃｖマウス
モデルにおいて、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃの、筋線維の筋細胞膜全体を
通してユートロフィンレベルを増加させる能力を調査した。４〜６カ月齢で始めて、ｍｄ
ｘ^５ｃｖマウスを、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃ、１０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ
．で、またはビヒクル（トリス緩衝生理食塩水）で、週２回、２０週間にわたって処置し
た。投薬を終了したら、大胸筋および長指伸筋（ＥＤＬ）を取り出し、後で分析するため
に凍結させた。

筋肉におけるユートロフィンの発現に対するＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの作用を、ウェスタ
ンブロット分析および免疫組織化学によって調査した。ウェスタンブロット分析のための
調製において、大胸筋を、手持ち式の組織ホモジナイザーを用いて、プロテアーゼおよび
ホスファターゼのインヒビターの存在下で機械的にホモジナイズした。タンパク質試料を
４〜１２％アクリルアミドＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）トリスミニ
ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にかけ、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）−ＦＬフッ化ポ
リビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。免疫検出する前に、タンパク質がレ
ーン間で均等に投入されていること、およびタンパク質が膜に均一に転写されていること
を、Ｐｏｎｃｅａｕ染色を用いて確認した。膜に結合したユートロフィンを、組換えヒト
ユートロフィンを対象とするマウスモノクローナル抗体（ＭＡＮＣＨＯ３ クローン８Ａ
４、１：２００に希釈；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏ
ｍａ Ｂａｎｋ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ）を用いて検出した。この抗体
は、マウスユートロフィン、ならびにヒト、イヌおよびツメガエルのホモログを認識する
ことが示されている。二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたウ
サギ抗マウス抗体（１：２０００希釈）であった。濃度測定を、Ｃｈｅｍｉ Ｇｅｎｉｕ
ｓ Ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｙｎｇｅｎｅ）を用いて実施し、ユートロ
フィンレベルを、不均一な処理について調整するために各試料中のＧＡＰＤＨ（グリセル
アルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）レベルに対して正規化した。免疫組織化学的
な分析のために、ヒトユートロフィンのＣ末端を対象とするマウス一次抗体（Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号ｓｃ−８１５５６）およびＡｌ
ｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８で標識したヤギ抗マウス二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カ
タログ番号Ａ２１１２１）を用いて、アセトンで固定したＥＤＬ筋線維の横断切片（厚さ
１４μｍ）上でユートロフィンを可視化した。

これらの相補的なアプローチにより、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃがｍｄｘマウスにおいて筋
細胞膜でのユートロフィンの発現を誘導する強力な証拠がもたらされた。ウェスタンブロ
ットによって評価された通り、中年のｍｄｘマウスにおけるＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３
４）−ｍＦｃを用いた慢性的な処置により、ユートロフィンタンパク質レベルが、胸筋全
体にわたって平均すると、対照と比較して８０％超増加した（図９）。さらに、ＥＤＬ筋
線維の免疫組織化学的な分析により、ユートロフィンの発現の増加が筋細胞膜に局在した
ことが確認された。図１０〜１１に示されているように、ｍｄｘの成体の成熟筋線維につ
いて予測されるように、ユートロフィンは、ビヒクルで処置したｍｄｘマウスの大部分の
筋細胞膜のセグメントにおいてほとんど検出できなかった。対照と比較して、年齢を釣り
合わせたＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃで処置したｍｄｘマウスにおいて、筋
細胞膜のユートロフィン（ｕｔｏｐｈｉｎ）レベルが顕著に増加し、ユートロフィンは個
々の線維の筋細胞膜に沿って広範に分布していた（図１０〜１１）。これらの結果は、Ａ
ｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃ処置により、筋ジストロフィーのマウスモデルに
おいて、筋線維へのユートロフィンの広範な筋細胞膜分布が予想外に誘導され得ることを
実証している。ユートロフィンを誘導し、そして、ジストロフィン欠乏を潜在的に補償す
るこの能力により、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃ処置によって、筋肉のサイ
ズおよび強度が増大するので、筋細胞膜の不安定性および収縮に関連する細胞損傷が改善
され得ることが示されている。したがって、患者に筋肉の量および強度の増大がもたらさ
れることに加えて、ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達のアンタゴニストを用いた処置により、
ＤＭＤおよびＢＭＤの典型である損傷および変性に対してより抵抗性である筋線維が作ら
れ得る。

（実施例６）
ｍｄｘマウスにおける、伸長性収縮に伴う筋細胞膜の完全性および力の急降下に対する
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの作用
出願人は、筋ジストロフィーのマウスモデルにおいて、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃのユート
ロフィンを誘導する特性により、筋細胞膜の不安定性および収縮に関連する筋肉損傷が保
護されるかどうかを決定するために、ｍｄｘ^５ｃｖマウスをＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３
４）−ｍＦｃまたはビヒクルを用いて上記の通り処置する。さらに、対照としての機能を
果たす野生型マウスを、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃまたはビヒクルで処置
する。エバンスブルー色素を用いたトレーサーアッセイを使用して、筋線維への血漿血清
アルブミンの浸潤を検出することによって使用依存性の筋細胞膜浸透性（膜の完全性の指
標として）を評価する。各群のマウスを、トレッドミルで定期的に運動させ、次いで、投
薬終了時に滅菌エバンスブルー色素（体重１０ｇ当たり１０ｍｇ／ｍｌの緩衝溶液５０μ
ｌ）をＩＰ注射する。筋肉を２４時間後に切除し、そして冷却したイソペンタン中で直ち
に凍結させる。横断切片を、クライオスタットを用いて調製し、そして個々の線維内への
エバンスブルー色素の浸潤を顕微鏡で可視化するために処理する。筋細胞膜の境界を確認
または示すために、筋細胞膜のタンパク質（ラミニンなど）の免疫組織化学的染色が使用
され得、血清アルブミン（エバンスブルー色素）が浸潤した全線維の百分率が定量化され
得る。出願人は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃを用いた処置により、筋細胞
膜の完全性が改善されたことの指標として、運動したｍｄｘ^５ｃｖマウスの筋線維へのエ
バンスブルー色素の浸潤が改善される、または妨げられることを予測する。

ｍｄｘマウスでは、骨格筋（特に速筋）は、力を発揮する（収縮する）と筋線維が伸び
る一連の伸長性収縮の後に最大強縮力の過剰な急降下を示す。この力の過剰な急降下は、
ジストロフィン欠乏筋細胞膜の破壊に由来する収縮依存性の線維傷害に起因している（Ｂ
ｌａａｕｗら、２００８年、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １７巻：３６８６〜３６９６
頁）。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃが、そのユートロフィンを誘導する能力によっ
て、伸長性収縮によって媒介される線維損傷に対する抵抗性をもたらし得るかどうかを決
定するために、追加的なｍｄｘマウスおよび野生型対照を試験する。本実験では、ｍｄｘ
^５ｃｖマウス（または野生型対照）をトレッドミルで、規則的な間隔で運動させ、そして
、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃまたはビヒクルで上記の通り処置した。投薬
休止時に、主として速筋線維（ＥＤＬなど）を含有する筋肉を切除し、Ｋｒａｇら、（２
００４年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１巻：１３８５６〜１
３８６０頁）のものと同様のエクスビボプロトコールに従って試験する。。簡単に述べる
と、筋肉を秤量し、酸素添加したリンゲル液を含有する器官浴槽（ｏｒｇａｎ ｂａｔｈ
）内でマイクロメーター（ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ）および力変換器の両方に付ける。刺激
器ユニットに接続したフィールド電極（ｆｉｅｌｄ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）を用いて刺激
を行う。伸長性収縮に伴う力の急降下を、標準のプロトコールの最初の強縮間に生成され
る等尺性の力と２０番目の強縮の間に生成される等尺性の力との差異を用いて算出する。
生理学的試験の終わりに、組織学的分析のために筋肉を冷却したイソペンタン中で急速冷
凍する。出願人は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃを用いた処置により、筋細
胞膜の脆弱性の低下の指標として、伸長性収縮に伴う力の急降下が低下することを予測す
る。

（実施例７）
ｍｄｘマウスにおける、運動に誘導される筋肉損傷に対するＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの作
用
出願人は、ｍｄｘ^５ｃｖマウスモデルにおいて、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍ
Ｆｃの、運動に誘導される筋肉損傷を鈍らせるまたは逆転させる能力を調査した。５週齢
のｍｄｘマウスを４つの群（各群についてＮ＝１０）に分けた。第１群には、介入を与え
ず、４週間後に屠殺し、そして血清クレアチンキナーゼレベルについて評価した。第２群
には、トレッドミル運動を与え、そして、４週間後に屠殺した。第３群には、８週間にわ
たってトレッドミル運動を与え、４週から８週にかけてビヒクル処置（ＴＢＳ）を与えた
。第４群には、８週間にわたってトレッドミル運動を与え、４週から８週にかけてＡｃｔ
ＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃ処置（１０ｍｇ／ｋｇ、週２回）を与えた。

図１２に各群についての血清クレアチンキナーゼレベルが示されている。ＡｃｔＲＩＩ
Ｂ−Ｆｃ処置により、第４週の後に生じる運動に誘導される損傷が完全に妨げられ（血清
クレアチンキナーゼレベルによって測定したところ）、さらに、第４週の前に損傷の逆転
が起こっている（第２群と第４群を比較する）。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃは、
デュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウスモデルにおいて、筋線維への損傷を妨げ、逆転
させ、これは本明細書中のユートロフィンレベルの増加に関する他の所見と一致している
。

参考としての援用
本明細書中で言及される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が、具
体的かつ個別に参考として援用されると示されるかのように、その全体が本明細書に参考
として援用される。

本主題の特定の実施形態が考察されてきたが、上記明細書は、例示的であり、限定的な
ものではない。本明細書および以下の特許請求の範囲を精査すれば、多くの変更が当業者
に明らかとなる。本発明の完全な範囲は、その等価物の完全な範囲と共に特許請求の範囲
を、そして、このような変更と共に明細書を参照することによって決定されるべきである
。

Claims (1)

1. 方法またはポリペプチドまたは組成物。