JP2018528154A - 生存菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムを含む、皮膚および粘膜の皮膚糸状菌症および酵母感染症の処置用製剤、微生物ピシウム・オリガンドラムの細胞生存率を決定する方法ならびに該製剤の適用方法 - Google Patents
生存菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムを含む、皮膚および粘膜の皮膚糸状菌症および酵母感染症の処置用製剤、微生物ピシウム・オリガンドラムの細胞生存率を決定する方法ならびに該製剤の適用方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
a)乾燥混合物の規定量の微温湯または生理溶液への機械的分散を使用して、適用部位において水性懸濁液1ml当たり、菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムの生存細胞が1〜10×106個、有利には1〜500個、好ましくは10〜50個となる含有量を達成する水性懸濁液を調製するステップ、
b)菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムの生存細胞の推奨される量の使用により処置される診断のタイプに応じて、このように作られた前記水性懸濁液を適用するステップ、
c)処置される診断に応じて適用部位において菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムの生存細胞をコロニー形成させるステップ、
d)処置される診断に応じて適用部位において菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムの生存細胞を増殖させ、皮膚糸状菌または酵母を除去するステップ、および
e)その後適用部位における前記製剤を胞子形成させ、並行して除去し、これにより正常な細菌叢の安定化および発達を促進し、長期治療効果を確保するステップ、
を含むという事実に基づく。
技術的解決を例示的実施形態においてさらに詳細に記載し、添付の概略図においてより詳細に説明する。
モルモットにおける皮膚糸状菌症の処置、爪白癬ならびに非治癒創傷および口腔中の酵母の除去のための、決定された既知の生存率の微生物ピシウム・オリガンドラムを含有する乾燥混合物の製剤。
(表1、表2、表3)
ピシウム・オリガンドラムM1株(DV74株、その連続プロトコルは以下に示す)を寒天において維持し、開始培養物は液体培養により調製した。滅菌粟粒(パニクム・ミリアセウムL(Panicum miliaceum L.))を液体培地に植え付けた。培養を、滅菌条件下でほぼ7日間進行させ、次いで湿潤バイオマスを慎重に乾燥させ、平均サイズ35μm〜50μmの粒子を含有する粉末に粉砕した。卵胞子の量を顕微鏡下で見積もり、製剤を、CZ302297の条件に従って、1g当たり7±1×106個の卵胞子となる含有量に標準化した。
微生物ピシウム・オリガンドラムの生存細胞の数を決定するために、本発明の出願人は、本発明に従った水性懸濁液の形態の製剤の遺伝子検査を使用して実施される独創的な手順を開発し、栄養に富んだ培地において標準大気中30℃で維持された微生物ピシウム・オリガンドラムのβ−チューブリンに関する構成遺伝子の発現レベルを測定した。
1gの乾燥物質を秤量し、100mlの水中にキッチンブレンダーで混合した。0.5mlのこの懸濁液を、30℃においてインキュベートした6ウェルの培養皿中で、4.5mlの培養培地と混合し、この50μlの試料中から、インキュベーション開始後48時間、72時間および96時間において試料を採取した。核酸を抽出し、この抽出液をヌクレアーゼ非含有水で50倍に希釈した。続いて、標準プロトコルに従って、4μlの抽出液、1μlの、ピシウム・オリガンドラムのβ−チューブリン増幅用プライマー混合物(3)、および5μlの酵素混合物を含有する反応混合物中で逆転写およびPCR増幅した。得られた指数曲線を線形化して、初期ゼロ時間に対して推定した。このようにして確認された生存率は、菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムのバッチ(A)の場合41,700/物質1g、菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムのバッチ(B)の場合12,500/物質1gおよび菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムのバッチ(C)の場合8,300/物質1gであった。注:この実施形態および他の実施形態における丸括弧内の文字A、BおよびCは、上記の生存率を有する菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムの個別のバッチを示す。
被験株DV74のピシウム・オリガンドラムのM1_ITS4_rRNA
実験室試験における皮膚糸状菌および酵母の成長抑制および除去
(図1)
公開プロトコル(5)に従って調製された被嚢遊走子形態の微生物ピシウム・オリガンドラムの適用を、実験室有効性試験のために選択した。他の製剤の抗菌活性検証に好ましい懸濁液による試験方法(1)を選択した。遊走子を2分間ボルテックス混合することによって被嚢し、これらの条件下で16℃において実験開始まで維持した。皮膚糸状菌トリコフィトン・インタージギターレ・メンタグロフィテス変種DMF2374、ミクロスポルム・カニスCCM8353およびエピデルモフィトン・フロコースムPL231由来の小分生子の懸濁液ならびにカンジダ・アルビカンスCCM8261酵母の懸濁液を、公開された方法論に従って調製した(7、1)。遊走子の懸濁液および小分生子または酵母細胞の懸濁液を必要な濃度に希釈し、細胞を、6ウェルのプラスチック皿において48時間30℃において懸濁液中で培養した。培養方法により生細胞の数を決定するための試料を、24時間後および48時間後に採取した。
皮膚糸状菌に感染したモルモットにおける皮膚糸状菌の除去および生理学的細菌叢の確立
(図2)
この試験は公開されたプロトコル(4、7)に従って、トリコフィトン・インタージギターレ・メンタグロフィテス変種DMF2374の検証済みの株による感染症を用いて実施した。培養バイオマスを水に置き換えた、本発明の例示的実施形態の混合物と同一の混合物を、適用期間の間プラセボとして使用し、本発明の例示的実施形態1cに従った殺真菌物質を実験物質として使用した。
皮膚糸状菌の除去および爪白癬を有する患者の臨床状態の改善
(表4)
次ページの表4は、他の皮膚糸状菌症と併せて爪白癬に侵された21人の患者に関する研究結果を示す。本発明に従った製剤の適用前に、21人すべての患者は顕微鏡により陽性所見を有し、少なくとも1種の皮膚糸状菌、場合により2種の皮膚糸状菌の発生が培養によりすべての患者に確認された。病原性酵母カンジダ・アルビカンスの発生は、付随する微生物学の中で圧倒的に最も一般的であった。付随する診断で最も一般的なものは、糖尿病、足部白癬および足部白癬インタージギターレであり、一症例では、手の真菌性疾患が観察された。1または複数の足の爪が、爪の面積平均範囲1.5に渡って侵されていた。
患者の非治癒創傷における病原性酵母の抑制および除去
(表5)
本発明に従った製剤の適用の、病原性酵母カンジダ・アルビカンスによる酵母感染症により悪化された非治癒創傷を有する12人の患者の群に対する影響を予備実践研究においてモニターした。6人の患者は糖尿病を患っており、6人は患っていなかった。糖尿病群の患者の平均年齢は77.5歳であり、非糖尿病群の患者の平均年齢は57.2歳であった。女性のほうが多く、女性は静脈瘤性潰瘍および非治癒創傷の発生しやすさが高いことが知られている。患者の既往歴のさらなる結果として、抗生物質を含む一般に使用される医薬製剤を使用した治療の開始後最短で6ヶ月間、数人の患者に関してはさらに長い(最長2年)期間の非治癒創傷の処置においても進展がなかった。
口腔における病原性酵母の抑制および除去
(表6)
口腔中に病原性酵母の存在を有する12人の患者において、口中医の監督下で歯科衛生学救急において研究を実施した。
皮膚および粘膜の皮膚糸状菌症および酵母感染症の処置用製剤を使用して、皮膚糸状菌または酵母による皮膚および粘膜の感染症に付随する症状、例えば、社会的に煩わしい悪臭症状、足の多汗症、刺激および灼熱感を抑制することができ、ならびに非治癒創傷、口腔、皮膚、泌尿生殖器粘膜、毛髪およびこれらの微生物により侵される他の場所における皮膚糸状菌および酵母の発生を抑制および除去することができる。
1.Barros MES、Santos DA、Hamdan JS(2006)Mycol Res 110、1355−1360頁。
2.Calderona RA、Fonzi WA(2001)Trends Microbiol 9、327−335頁。
3.Horner NR、Grenville−Briggs LJ、van West P(2012)Fungal Biol 116、24−41頁。
4.Klimes R、Suchanek M、Mastalkova Lら(2016) Vet Dermatol、発売中
5.Madsen AM、Robinson HL、Deacon JW(1995)Mycol Res99、1417−1424頁。
6.Martinez DA、Oliver BG、Graser Yら(2012)mBio 3、e00259−12。
7.Saunte DM、Simmel F、Frimodt−Moller N(2007)Antimicrob Agents Chemother 51、3317−3321頁。
8.CZ302297(2011年公開)Suchanek M,Klimes R
9.CZ28816U(2015年11月16日公開)Suchanek M、Klimes R
10.CZ9883U(2000年4月14日公開)Vesely D、Vesely L
11.Yacoub A、Berger H、Gerbore Jら(2016)Genome Announcements 4、e00215−16。
1.Barros MES、Santos DA、Hamdan JS(2006)Mycol Res 110、1355−1360頁。
2.Calderona RA、Fonzi WA(2001)Trends Microbiol 9、327−335頁。
3.Horner NR、Grenville−Briggs LJ、van West P(2012)Fungal Biol 116、24−41頁。
4.Klimes R、Suchanek M、Mastalkova Lら(2016) Vet Dermatol、発売中
5.Madsen AM、Robinson HL、Deacon JW(1995)Mycol Res99、1417−1424頁。
6.Martinez DA、Oliver BG、Graser Yら(2012)mBio 3、e00259−12。
7.Saunte DM、Simmel F、Frimodt−Moller N(2007)Antimicrob Agents Chemother 51、3317−3321頁。
8.CZ302297(2011年公開)Suchanek M,Klimes R
9.CZ28816U(2015年11月16日公開)Suchanek M、Klimes R
10.CZ9883U(2000年4月14日公開)Vesely D、Vesely L
11.Yacoub A、Berger H、Gerbore Jら(2016)Genome Announcements 4、e00215−16。
<付記>
<項1>
0.1〜99.9重量%の菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムと、0.1〜99.9%の、吸着剤、バッファー、保湿剤、デオドラント剤および芳香剤を含む群からの少なくとも1つの成分を含有する補助物質とを含有する乾燥混合物から得られる、菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムを含有する、皮膚および粘膜の皮膚糸状菌症および酵母感染症の処置用製剤であって、適用部位において水性懸濁液1ml当たり、1〜10×10 6 個の微生物ピシウム・オリガンドラムの生存細胞を含有することを特徴とし、ここで前記微生物ピシウム・オリガンドラムの生存細胞は休眠卵胞子、被嚢遊走子および生存多核菌糸体を含む、製剤。
<項2>
水性懸濁液状の適用される製剤1ml当たり、1〜500個の前記微生物ピシウム・オリガンドラムの生存細胞を含有することを特徴とする、<項1>に記載の製剤。
<項3>
適用製剤の水性懸濁液1ml当たり、10〜50生存細胞の前記微生物ピシウム・オリガンドラムを含有することを特徴とする、<項1>に記載の製剤。
<項4>
0.1〜99.9重量%の菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムと、0.1〜99.9%の、吸着剤、バッファー、保湿剤、デオドラント剤および芳香剤を含む群からの少なくとも1つの成分を含有する補助物質とを含有する乾燥混合物から得られる、皮膚および粘膜の皮膚糸状菌症および酵母感染症の処置のための微生物ピシウム・オリガンドラムの細胞の生存率を決定する方法であって、水性懸濁液形態の前記製剤の遺伝子検査により実施され、栄養に富んだ培地において標準大気中30℃で維持された微生物ピシウム・オリガンドラムのβ−チューブリンに関する構成遺伝子の発現レベルが測定されることを特徴とする方法。
<項5>
<項1>〜<項3>のいずれかに記載の、菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムを含有する皮膚および粘膜の皮膚糸状菌症および酵母感染症の処置用製剤の適用方法であって、
a)乾燥混合物の規定量の微温湯または生理溶液への機械的分散を使用して、適用部位において水性懸濁液1ml当たり、菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムの生存細胞が1〜10×10 6 個、有利には1〜500個、好ましくは10〜50個となる含有量を達成する水性懸濁液を調製するステップ、
b)菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムの生存細胞の推奨される量の使用により処置される診断のタイプに応じて、このように作られた前記水性懸濁液を適用するステップ、
c)処置される診断に応じて適用部位において菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムの生存細胞をコロニー形成させるステップ、
d)処置される診断に応じて適用部位において菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムの生存細胞を増殖させ、皮膚糸状菌または酵母を除去するステップ、および
e)その後適用部位における前記製剤を胞子形成させ、並行して除去し、これにより正常な細菌叢の安定化および発達を促進し、長期治療効果を確保するステップ、
を含むことを特徴とする方法。
<項6>
爪白癬の形態の皮膚糸状菌症の処置のために、乾燥混合物を水に分散させた湿潤懸濁液の形態で水性懸濁液状の製剤1ml当たり50個の生存細胞を含有する前記製剤を患部に適用することを特徴とする、<項5>に記載の製剤適用方法。
<項7>
爪白癬の形態の皮膚糸状菌症の処置のために、非水性懸濁液状の製剤1ml当たり50個の生存細胞を含有する前記製剤を、クリーム、ゲル剤、軟膏、ウェットワイプ、抗菌スプレー、湿らせたパッチおよび湿らせた粉末の形態で患部に適用することを特徴とする、<項5>に記載の製剤適用方法。
<項8>
非治癒創傷における酵母感染症を処置するために、前記製剤が、生理溶液中水性懸濁液1ml当たり30個の生存細胞を含有する湿布の形態で適用されること、および生理溶液中水性懸濁液1ml当たり30個の生存細胞を含有する湿布に8時間後に交換することを4日間行うことを特徴とする、非治癒創傷における酵母感染症を処置するための<項5>に記載の製剤適用方法。
<項9>
前記製剤が、水性懸濁液1ml当たり30個の生存細胞を含有するクリーム、軟膏、ウェットワイプ、抗菌スプレー、湿らせたパッチおよび粉末の形態の湿式治癒製品を使用して適用され、その後、これらの非水性圧縮物を8時間ごとに4日間にわたり交換することを特徴とする、<項5>に記載の製剤適用方法。
<項10>
前記適用が、適用水性懸濁液1ml当たり10個の生存細胞を含有する水性懸濁液状の前記製剤ですすぐことによって実施され、前記すすぎを少なくとも1日2回、連続5日間行うことを特徴とする、口腔における酵母感染症を処置するための<項5>に記載の製剤適用方法。
<項11>
前記適用が、練り歯磨き、ゲル剤または口腔スプレーの一部として水性懸濁液1ml当たり10個の生存細胞を含有する製剤を使用して実施されるか、または前記適用が注射器および針を使用して水性懸濁液を口腔に導入することによって実施され、これらの適用は少なくとも1日2回、連続5日間行うことを特徴とする、<項5>に記載の製剤の適用方法。
Claims (11)
- 0.1〜99.9重量%の菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムと、0.1〜99.9%の、吸着剤、バッファー、保湿剤、デオドラント剤および芳香剤を含む群からの少なくとも1つの成分を含有する補助物質とを含有する乾燥混合物から得られる、菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムを含有する、皮膚および粘膜の皮膚糸状菌症および酵母感染症の処置用製剤であって、適用部位において水性懸濁液1ml当たり、1〜10×106個の微生物ピシウム・オリガンドラムの生存細胞を含有することを特徴とし、ここで前記微生物ピシウム・オリガンドラムの生存細胞は休眠卵胞子、被嚢遊走子および生存多核菌糸体を含む、製剤。
- 水性懸濁液状の適用される製剤1ml当たり、1〜500個の前記微生物ピシウム・オリガンドラムの生存細胞を含有することを特徴とする、請求項1に記載の製剤。
- 適用製剤の水性懸濁液1ml当たり、10〜50生存細胞の前記微生物ピシウム・オリガンドラムを含有することを特徴とする、請求項1に記載の製剤。
- 0.1〜99.9重量%の菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムと、0.1〜99.9%の、吸着剤、バッファー、保湿剤、デオドラント剤および芳香剤を含む群からの少なくとも1つの成分を含有する補助物質とを含有する乾燥混合物から得られる、皮膚および粘膜の皮膚糸状菌症および酵母感染症の処置のための微生物ピシウム・オリガンドラムの細胞の生存率を決定する方法であって、水性懸濁液形態の前記製剤の遺伝子検査により実施され、栄養に富んだ培地において標準大気中30℃で維持された微生物ピシウム・オリガンドラムのβ−チューブリンに関する構成遺伝子の発現レベルが測定されることを特徴とする方法。
- 請求項1〜請求項3のいずれかに記載の、菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムを含有する皮膚および粘膜の皮膚糸状菌症および酵母感染症の処置用製剤の適用方法であって、
a)乾燥混合物の規定量の微温湯または生理溶液への機械的分散を使用して、適用部位において水性懸濁液1ml当たり、菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムの生存細胞が1〜10×106個、有利には1〜500個、好ましくは10〜50個となる含有量を達成する水性懸濁液を調製するステップ、
b)菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムの生存細胞の推奨される量の使用により処置される診断のタイプに応じて、このように作られた前記水性懸濁液を適用するステップ、
c)処置される診断に応じて適用部位において菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムの生存細胞をコロニー形成させるステップ、
d)処置される診断に応じて適用部位において菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムの生存細胞を増殖させ、皮膚糸状菌または酵母を除去するステップ、および
e)その後適用部位における前記製剤を胞子形成させ、並行して除去し、これにより正常な細菌叢の安定化および発達を促進し、長期治療効果を確保するステップ、
を含むことを特徴とする方法。 - 爪白癬の形態の皮膚糸状菌症の処置のために、乾燥混合物を水に分散させた湿潤懸濁液の形態で水性懸濁液状の製剤1ml当たり50個の生存細胞を含有する前記製剤を患部に適用することを特徴とする、請求項5に記載の製剤適用方法。
- 爪白癬の形態の皮膚糸状菌症の処置のために、非水性懸濁液状の製剤1ml当たり50個の生存細胞を含有する前記製剤を、クリーム、ゲル剤、軟膏、ウェットワイプ、抗菌スプレー、湿らせたパッチおよび湿らせた粉末の形態で患部に適用することを特徴とする、請求項5に記載の製剤適用方法。
- 非治癒創傷における酵母感染症を処置するために、前記製剤が、生理溶液中水性懸濁液1ml当たり30個の生存細胞を含有する湿布の形態で適用されること、および生理溶液中水性懸濁液1ml当たり30個の生存細胞を含有する湿布に8時間後に交換することを4日間行うことを特徴とする、非治癒創傷における酵母感染症を処置するための請求項5に記載の製剤適用方法。
- 前記製剤が、水性懸濁液1ml当たり30個の生存細胞を含有するクリーム、軟膏、ウェットワイプ、抗菌スプレー、湿らせたパッチおよび粉末の形態の湿式治癒製品を使用して適用され、その後、これらの非水性圧縮物を8時間ごとに4日間にわたり交換することを特徴とする、請求項5に記載の製剤適用方法。
- 前記適用が、適用水性懸濁液1ml当たり10個の生存細胞を含有する水性懸濁液状の前記製剤ですすぐことによって実施され、前記すすぎを少なくとも1日2回、連続5日間行うことを特徴とする、口腔における酵母感染症を処置するための請求項5に記載の製剤適用方法。
- 前記適用が、練り歯磨き、ゲル剤または口腔スプレーの一部として水性懸濁液1ml当たり10個の生存細胞を含有する製剤を使用して実施されるか、または前記適用が注射器および針を使用して水性懸濁液を口腔に導入することによって実施され、これらの適用は少なくとも1日2回、連続5日間行うことを特徴とする、請求項5に記載の製剤の適用方法。
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