JP2018511583A - 乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む、炎症疾患の予防または治療用の組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は乳酸菌の培養液から分離した乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む炎症疾患の予防、改善、または治療用の組成物、およびアトピー性皮膚炎の診断方法に関するものである。本発明による乳酸菌由来の細胞外ベシクルは健常者比べて炎症疾患患者の尿および血液に顕著に多く分布されており、ブドウ球菌またはシュードモナス菌由来の細胞外ベシクルの露出による上皮細胞および炎症細胞の炎症反応が乳酸菌由来の細胞外ベシクルにより効率的に抑制されることをｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ実験を通じて確認したので、上記の乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む組成物はアトピー性皮膚炎、慢性鼻炎、慢性副鼻腔炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、または敗血症などの炎症疾患を予防、改善、または治療するための医薬品、化粧品、または健康機能食品の開発に有用に用いることができると期待される。また、尿または血液サンプルから乳酸菌由来の細胞外ベシクルの分布を測定することによりアトピー性皮膚炎を診断するのにも有用に用いることができるだろう。【選択図】図３２

Description

本発明は乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む炎症疾患の予防、改善、または治療用の組成物、およびアトピー性皮膚炎の診断方法に関するものである。

最近、ライフスタイルの変化により急性感染性の疾患から慢性炎症疾患に病気のパターンが変わっている。炎症は外部から毒素などの物質が体内に入ってきた際に、私たちの体で起こる防御機作であり、環境内の細菌、カビなどの短期間侵入で、急性炎症が発生し、環境内に存在する微生物、アレルゲンなどの原因物質が継続的に私たちの体に吸収されると、慢性炎症が発生することになる。最近、非感染性の原因因子として認識された慢性炎症疾患の発生に感染性の原因因子の重要性が浮き彫りにされている。代表的に、胃に共生すると知られているヘリコバクター菌が胃炎、胃がんなどの発生に重要な原因因子として明らかになり、周りの環境に共生していると知られている細菌および細菌由来の物質が慢性炎症疾患及び慢性炎症の合併症で発生する癌の原因因子として最近注目を浴びている。

アトピー性皮膚炎は乳幼児期、小児期で最もよく見られる皮膚疾患で、喘息やアレルギー性鼻炎に進行されるアレルギーマーチ（ａｔｏｐｉｃ ｍａｒｃｈ）の最初の信号でもある。また、アトピー性皮膚炎は、慢性的なかゆみと繰り返される皮膚の炎症所見で肉体的、精神的に患者自身だけでなく、家族の生活の質までも低下させる慢性炎症性疾患であり、最近、全世界的にアトピー性皮膚炎の有病率が増加し、これに対する関心も増加している。国内の場合は、大韓小児アレルギー呼吸器学会で行ったＩＳＡＡＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ａｓｔｈｍａ ｉｎ Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ）のアンケート調査によると、「これまでのアトピー性皮膚炎」での有病率は、１９９５年に比べて２０００年に６〜１２歳（１９９５年１５．３％、２０００年１７．０％）と１２〜１５歳（１９９５年７．２％、２０００年９．２％）のすべてで増加しており、「過去１２ヶ月の間にアトピー性皮膚炎」の発病率も、１９９５年に比べて２０００年に６〜１２歳（１９９５年７．３％、２０００年１０．７％）と１２〜１５歳（１９９５年３．９％、２０００年６．１％）のすべてで増加した。アトピー性皮膚炎のようなアレルギー疾患は、遺伝的な要因と環境的な要因の複合的な相互作用により発生するが、最近の増加趨勢は遺伝的な要因のみで説明するのには不十分である。アレルギー疾患の発生頻度が国により異なっている点は、種族間の違い、すなわち遺伝的要素の重要性を反映するが、以前の東ドイツであった地域で統一の後、アレルギー疾患の急増を示すような結果は、環境的な要因もまた重要であることを示すものである。これらのアレルギー疾患の増加は、西洋化された生活と関連性があり、考えられる原因を挙げてみると、まず第一に、一般的により多くの時間を室内で過ごすことになってハウスダストダニへの露出の増加、第二に、きれいな衛生生活と抗生物質の使用等による大規模な微生物への露出の変化、第三に、西洋化された食習慣の変化などがあることができるだろう。

アトピー性皮膚炎患者は皮膚バリア機能の障害、または免疫機能の異常で皮膚感染が頻繁に発生する。特に、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）による細菌感染、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）によるウイルス感染、そして、真菌（ｆｕｎｇｕｓ）感染がよく発生する。この中で、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）はアトピー性皮膚炎患者の９０％で検出されて、明らかな感染症状がない皮膚病変でも検出されるので、黄色ブドウ球菌の毒素は超抗原として作用してアレルギー免疫反応を増加させて皮膚にかゆみ症と病変をさらに悪化させる役割をすると知られている。

アトピー性皮膚炎の予後は、患者の皮膚の状態、刺激の要因、アレルギー疾患の同伴の有無、細菌感染の有無などに応じて様々である。一般的に、アトピー性皮膚炎は若い年齢で症状が激しく、慢性化病変が続けていたが、年齢が増加しながら好転される傾向がある。しかし、一部の報告書では患者の約４０％が５歳前後に好転されるが、これらの好転の理由については議論がある。最も代表的なアトピー性皮膚炎の治療方法は保湿剤の適切な使用とともに様々な原因により悪化された場合、原因の除去と同時に局所および全身ステロイドまたは局所免疫抑制剤の塗布などがある。しかし、最近の研究結果は、これらの要素に加えて乳酸菌自体、または乳酸菌培養液を服用してアトピー性皮膚炎の中等度を下げることができると提示している。

喘息（ａｓｔｈｍａ）および慢性閉塞性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ； ＣＯＰＤ）は慢性的な気道炎症による気道閉塞を特徴とする疾患であり、喘息は可逆的な気道閉塞、ＣＯＰＤは非可逆的な気道閉塞を特徴とする。喘息の原因因子としてハウスダストダニ由来のアレルゲンによる過敏反応が好酸球性喘息の病因に重要であると知られており、最近、重度の喘息やＣＯＰＤの特徴的な病理所見である好中球性炎症の発生に細菌由来の物質が重要である研究結果が注目されている。特に、室内のほこり内に存在する病院性細菌から由来する細胞外ベシクルが喘息とＣＯＰＤの発生に重要である事実が報告されている。また、鼻腔の内に共生する細菌および細菌由来の物質が慢性副鼻腔炎（ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｈｉｎｏｓｉｎｕｓｉｔｉｓ）の病因に重要な役割を担当するので、鼻腔内に存在する細菌叢の多様性の減少と特定の病原菌、特にブドウ球菌の増加が慢性副鼻腔炎の発生に重要であると報告されている。

細菌は二重膜構造のタンパク質脂質として、ナノ小胞またはナノベシクル（ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）とも呼ばれる細胞外ベシクル（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＥＶｓ）を細胞外の環境に分泌する。グラム陰性菌（ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）由来の細胞外ベシクル、または外膜ベシクル（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＯＭＶｓ）は内毒素（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）だけではなく、毒性タンパク質および細菌のＤＮＡとＲＮＡも有しており、グラム陽性菌（ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）由来の細胞外ベシクルは毒性タンパク質と核酸以外にも細菌の細胞壁の構成成分であるペプチドグリカン（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ）とリポタイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ）も有している。代表的なグラム陰性菌である黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）から分泌される細胞外ベシクルはアトピー性皮膚炎、慢性副鼻腔炎、好中球性喘息、ＣＯＰＤの重要な原因因子であることが最近報告されており、病原性グラム陰性菌である緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクターバウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）などから由来する細胞外ベシクルが室内のほこりに多量存在して、吸入の際に喘息、ＣＯＰＤ、肺がんの重要な原因因子であることが報告された。

一方、環境遺伝体学とも呼ばれるメタゲノム学は、環境から採収したサンプルから得たメタゲノム資料に関する解析学とも言えることができる。最近、１６Ｓ リボソーム ＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）塩基配列をベースにした方法で、ヒトの微生物叢の細菌構成をリスト化することができるようになり、１６Ｓ リボソーム ＲＮＡは４５４ＦＬＸ ｔｉｔａｎｉｕｍ ｐｌａｔｆｏｒｍを用いて配列を解析する。これまでの患者のサンプルから解析したメタゲノムに関する研究が行われてきたが、血清や尿の中には細菌由来の細胞外ベシクルが存在するという事実がよく知られていなかったので、血清や尿から分離した細菌由来の細胞外ベシクルを対象にしたメタゲノム解析研究が行われていなかった。また、患者の血清や尿から分離した細胞外ベシクルのＤＮＡを用いたメタゲノム解析の結果をもとに、細菌由来の細胞外ベシクルを介してアトピー性皮膚炎、喘息、ＣＯＰＤ、慢性鼻炎、慢性副鼻腔炎、および敗血症などの炎症疾患の予防または治療のために用いた場合はないのが現状である。

本発明者は、アトピー性皮膚炎患者と健常者の尿から分離した細胞外ベシクルのＤＮＡを用いてメタゲノム解析を行った結果、アトピー性皮膚炎患者に比べて、健常者の尿から乳酸菌由来の細胞外ベシクルが顕著に増加されており、上記の乳酸菌由来の細胞外ベシクルが炎症疾患の主な原因因子である黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の細胞外ベシクルにより誘導される炎症反応を効率的に抑制することを確認することにより本発明を完成した。

それで、本発明は乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む炎症疾患の予防、改善、または治療用の組成物を提供することを目的にする。

また、本発明はアトピー性皮膚炎の診断方法を提供することを他の目的とする。

しかし、本発明が解決しようとする技術的な課題は以上で言及した課題に制限されずに、言及されていない他の課題は以下の記載から当業者に明確に理解されることができるだろう。

上記のような本発明の目的を達成するために、本発明は乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む、炎症疾患の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。

また、本発明は乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む、炎症疾患の改善用の化粧料の組成物を提供する。

また、本発明は乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む、炎症疾患の改善用の健康機能食品の組成物を提供する。

また、本発明は乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む、炎症疾患の予防または治療用の吸入剤の組成物を提供する。

本発明の一具現例で、上記の乳酸菌はラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目の細菌であることができる。

本発明の他の具現例で、上記のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目の細菌はラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、またはリューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属の細菌であることができる。

本発明の他の具現例で、上記のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）であることができる。

本発明の他の具現例で、上記の細胞外ベシクルは平均直径が１０ないし３００ｎｍであることができる。

本発明の他の具現例で、上記の細胞外ベシクルは乳酸菌培養液から分離されることを特徴とする。

本発明の他の具現例で、上記の細胞外ベシクルは乳酸菌から自然的または人工的に分泌されることを特徴とする。

本発明の他の具現例で、上記の炎症疾患はアトピー性皮膚炎、慢性鼻炎、慢性副鼻腔炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および敗血症からなる群より選択される疾患であることができる。

また、本発明は下記のステップを含む、アトピー性皮膚炎の診断方法を提供する。
（ａ）臨床サンプルから分離した細胞外ベシクルから遺伝子を抽出するステップ；
（ｂ）上記の遺伝子に対して塩基配列を解析するステップ；および
（ｃ）上記の塩基配列解析を通して乳酸菌由来の細胞外ベシクルの分布が健常者に比べて低い場合、アトピー性皮膚炎の誘発危険性が高いと判定するステップ。

本発明の一具現例で、上記の遺伝子はＤＮＡまたはＲＮＡであることができる。

本発明の他の具現例で、上記の臨床サンプルは尿または血液であることができる。

本発明の他の具現例で、上記の塩基配列解析はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して行われることができる。

また、本発明は乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む組成物を個体に投与するステップを含む、炎症疾患の予防または治療方法を提供する。

また、本発明は乳酸菌由来の細胞外ベシクルの炎症疾患の予防または治療用途を提供する。

また、本発明は乳酸菌由来の細胞外ベシクルのアトピー性皮膚炎の診断用途を提供する。

本発明者はアトピー性皮膚炎患者に比べて健常者で乳酸菌由来の細胞外ベシクルが顕著に多く分布されており、ブドウ球菌またはシュードモナス菌由来の細胞外ベシクルの露出による上皮細胞および炎症細胞の炎症反応が乳酸菌由来の細胞外ベシクルにより効率的に抑制されることをｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ実験を通して確認したので、上記の乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む組成物はアトピー性皮膚炎、慢性鼻炎、慢性副鼻腔炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、または敗血症などの炎症疾患を予防、改善、または治療するための医薬品、化粧品、または健康機能食品の開発に有用に用いることができると期待される。

また、尿または血液サンプルから乳酸菌由来の細胞外ベシクルの分布を測定することによりアトピー性皮膚炎を診断するのにも有用に用いることができるだろう。

図１は、腸内細菌であるシュードモナス・セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）とシュードモナス・パナキス（Ｐ．ｐａｎａｃｉｓ）を体外で培養した後、培養液から細胞外ベシクルを分離してそれぞれＰ．ｃｅｄｒｉｎａとＰ．ｐａｎａｃｉｓ由来の細胞外ベシクル（ＥＶｓ）を電子顕微鏡で観察した結果である。 図２は、シュードモナス・セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）とシュードモナス・パナキス（Ｐ．ｐａｎａｃｉｓ）由来の細胞外ベシクル（ＥＶｓ）のサイズを動的光散乱法（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）の方法で測定した結果である。 図３は、シュードモナス・セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）とシュードモナス・パナキス（Ｐ．ｐａｎａｃｉｓ）細菌およびこれらの細菌由来の細胞外ベシクルに含まれたタンパク質の発現様相を評価するためＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ＣＢＢ−Ｒ−２５０でゲルを染色した結果である。 図４は、シュードモナス・パナキス（Ｐ．ｐａｎａｃｉｓ）細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）とＰ．ｐａｎａｃｉｓ由来の細胞外ベシクル（ＥＶ）をマウスに経口で投与した後、一定の時間後マウスの体内に細菌と細胞外ベシクルの分布をｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙ ｉｍａｇｅで撮影した結果である。 図５は、シュードモナス・パナキス（Ｐ．ｐａｎａｃｉｓ）細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）とＰ．ｐａｎａｃｉｓ由来の細胞外ベシクル（ＥＶ）をマウスに経口投与した後、投与１２時間目に血液（ｂｌｏｏｄ）と心臓（ｈｅａｒｔ）、肺（ｌｕｎｇ）、肝（ｌｉｖｅｒ）、および腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）を摘出して上記の細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）と細胞外ベシクル（ＥＶ）の分布を撮影した結果である。 図６は、腸内に直接シュードモナス・パナキス（Ｐ．ｐａｎａｃｉｓ）由来の細胞外ベシクル（ＥＶ）を投与した後、投与の１０分後に腸内毛細血管に細胞外ベシクルが存在することを示す結果である。 図７は、アトピー性皮膚炎患者の尿と血清から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの分布を比較するために細菌門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルでメタゲノム解析を行った結果である。 図８は、アトピー性皮膚炎患者の尿と血清から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの分布を比較するために細菌綱（ｃｌａｓｓ）レベルでメタゲノム解析を行った結果である。 図９は、アトピー性皮膚炎患者の尿と血清から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの分布を比較するために細菌目（ｏｒｄｅｒ）レベルでメタゲノム解析を行った結果である。 図１０は、アトピー性皮膚炎患者の尿と血清から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの分布を比較するために細菌科（ｆａｍｉｌｙ）レベルでメタゲノム解析を行った結果である。 図１１は、アトピー性皮膚炎患者の尿と血清から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの分布を比較するために細菌属（ｇｅｎｕｓ）レベルでメタゲノム解析を行った結果である。 図１２は、アトピー性皮膚炎患者と健常者の尿から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの分布を確認するために細菌門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルでメタゲノム解析を行った結果である。 図１３は、アトピー性皮膚炎患者と健常者の尿から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの分布を確認するために細菌綱（ｃｌａｓｓ）レベルでメタゲノム解析を行った結果である。 図１４は、アトピー性皮膚炎患者と健常者の尿から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの分布を確認するために細菌目（ｏｒｄｅｒ）レベルでメタゲノム解析を行った結果である。 図１５は、アトピー性皮膚炎患者と健常者の尿から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの分布を確認するために細菌科（ｆａｍｉｌｙ）レベルでメタゲノム解析を行った結果である。 図１６は、アトピー性皮膚炎患者と健常者の尿から分離した細胞由来の細胞外ベシクルの分布を確認するために細菌属（ｇｅｎｕｓ）レベルでメタゲノム解析を行った結果である。 図１７は、アトピー性皮膚炎患者と健常者の尿から分離した細菌由来の細菌ベシクルのメタゲノム解析の結果をｈｅａｔ ｍａｐで表した結果である。 図１８は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）培養液から分離した細胞外ベシクルを電子顕微鏡で観察した写真である。 図１９は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）培養液から分離した細胞外ベシクルを動的光散乱法でサイズを測定した結果である。 図２０は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）培養液から分離した細胞外ベシクルをＮａｎｏｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｓｓａｙ（ＮＴＡ）方法を通してベシクルの個数を測定した結果である。 図２１は、皮膚上皮細胞に黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクル（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＥＶ）、ニキビ菌由来の細胞外ベシクル（Ｐ．ａｃｎｅｓ ＥＶ）、および乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）を投与した後、ＥＬＩＳＡ方法でＩＬ−６分泌量を測定した結果である。 図２２は、皮膚上皮細胞に黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクル（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＥＶ）、またはニキビ菌由来の細胞外ベシクル（Ｐ．ａｃｎｅｓ ＥＶ）を投与する１２時間前に乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）を投与した後、ＥＬＩＳＡ方法でＩＬ−６分泌量を測定した結果である。 図２３は、腹腔マクロファージに黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクル（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＥＶ）、または乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）を投与した後、ＥＬＩＳＡ方法を通してＩＬ−６とＴＮＦ−αの分泌量を測定した結果である。 図２４は、腹腔マクロファージに黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクル（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＥＶ）を投与する１２時間前に乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）を投与した後、ＥＬＩＳＡ方法を通してＩＬ−６とＴＮＦ−αの分泌量を測定した結果である。 図２５は、皮膚上皮細胞に黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクル（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＥＶ）を投与する１２時間前に乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）を投与した後、ＭＴＴ ａｓｓａｙを通して細胞の死滅の程度を評価した結果である。 図２６は、腹腔マクロファージに緑膿菌由来の細胞外ベシクル（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＥＶ）を投与する１２時間前に乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）を投与した後、ＥＬＩＳＡ方法を通してＩＬ−６とＴＮＦ−αの分泌量を測定した結果である。 図２７は、腹腔マクロファージに緑膿菌由来の細胞外ベシクル（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＥＶ）を投与しながら、同時に乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）を投与した後、ＥＬＩＳＡ方法を通してＩＬ−６とＴＮＦ−αの分泌量を測定した結果である。 図２８は、黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクル（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＥＶ）によるアトピー性皮膚炎のマウスモデルで乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）の皮膚投与による治療効果を評価するためのプロトコルを図示したものである。 図２９は、黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクル（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＥＶ）によるアトピー性皮膚炎のマウスモデルで乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）を皮膚に投与した後、治療効果を評価した皮膚写真である。 図３０は、黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクル（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＥＶ）によるアトピー性皮膚炎のマウスモデルで乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）を皮膚に投与した後、皮膚組織でＩＬ−１７の濃度を測定した結果である。 図３１は、黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクル（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＥＶ）によるアトピー性皮膚炎のマウスモデルで乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）の経口投与による治療効果を評価するためのプロトコルを図示したものである。 図３２は、黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクル（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＥＶ）によるアトピー性皮膚炎のマウスモデルで乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）を経口投与した後、治療効果を評価した皮膚写真である。 図３３は、黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクル（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＥＶ）によるアトピー性皮膚炎のマウスモデルで乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）を経口投与した後、皮膚組織で免疫反応の指標であるＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、およびＩＦＮ−γの濃度を測定した結果である。 図３４は、乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）の高容量の経口投与による毒性を評価するためのプロトコルを図示したものである。 図３５は、高容量の乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）を経口で多回投与した後、体重の変化を測定した結果である。 図３６は、高容量の乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）を経口で多回投与した後、マウスの飼料摂取量を測定した結果である。 図３７は、高容量の乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）を経口で多回投与した後、体温変化を測定した結果である。 図３８は、高容量の乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）を経口で多回投与した後、血液内の血球の変化を測定した結果である（ＷＢＣ；白血球の数、ＲＢＣ；赤血球の数、ＨＧＢ；ヘモグロビンの濃度、ＨＣＴ；遠心分離血漿、ＭＣＶ；赤血球の平均体積、ＭＣＨ；平均ヘモグロビンの数、ＭＣＨＣ；平均ヘモグロビンの濃度、ＰＬＴ；血小板の数）。

アトピー性皮膚炎患者と健常者の尿から分離した細胞外ベシクルのＤＮＡを用いてメタゲノム解析を行った結果アトピー性皮膚炎患者に比べて健常者の尿で乳酸菌由来の細胞外ベシクルが顕著に増加されており、上記の乳酸菌由来の細胞外ベシクルが炎症疾患の主要原因因子である黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の細胞外ベシクルによって誘導される炎症反応を効率的に抑制することを確認することにより本発明を完成した。

本発明の一実施例では、腸内の細菌であるシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）とシュードモナス・パナキス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｎａｃｉｓ）から細胞外ベシクルを分離してマウスに上記の細菌とこれらの細菌由来の細胞外ベシクルを経口投与することにより、体内分布と排泄様相を確認した結果、腸内細菌である場合、全身に吸収されていないのに対して、これらの腸内細菌由来の細胞外ベシクルの場合には全身的に吸収されて尿から排泄されることを確認した（実施例１および２の参考）。

本発明の他の実施例では、アトピー性皮膚炎患者の尿および血清から分離した細菌由来の細胞外ベシクルのＤＮＡを用いて、それぞれの細菌の門（ｐｈｙｌｕｍ）、綱（ｃｌａｓｓ）、目（ｏｒｄｅｒ）、科（ｆａｍｉｌｙ）、属（ｇｅｎｕｓ）のレベルでメタゲノム解析を行った結果、尿と血清の細菌由来の細胞外ベシクルの分布が正確に一致することを確認した（実施例３の参考）。

本発明の他の実施例では、上記の結果をもとにアトピー性皮膚炎患者と健常者の尿から分離した細胞外ベシクルのＤＮＡを用いてメタゲノム解析を行った。それぞれ、細菌の門（ｐｈｙｌｕｍ）、綱（ｃｌａｓｓ）、目（ｏｒｄｅｒ）、科（ｆａｍｉｌｙ）、属（ｇｅｎｕｓ）のレベルで細胞外ベシクルの分布を解析した結果、健常者に比べてアトピー性皮膚炎患者の尿にはアリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプト植物（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）目、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の細菌由来の細胞外ベシクルが顕著に増加されていた。一方、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌由来の細胞外ベシクルが顕著に減少されていることを確認した。

本発明のまたの他の実施例では、上記のメタゲノムの結果をもとに発酵食品から分離した乳酸菌であるラクトバチルス・プランタルム(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ)を体外で培養した後、細胞外ベシクルを分離して特性を解析した結果、平均直径が約１５ｎｍである円形模様のベシクルを分離することができたし（実施例５の参考）、上記のベシクルを皮膚上皮細胞とマクロファージに処理した後、炎症疾患の主な原因因子である黄色ブドウ球菌と緑膿菌から分泌される細胞外ベシクルの処理により誘導される炎症反応が顕著に抑制されることを確認した（実施例６ないし９の参考）。

本発明の他の実施例では、上記のｉｎ ｖｉｔｒｏの実験結果をもとに黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクルによるアトピー性皮膚炎のマウスモデルに乳酸菌由来のベシクルを経口または皮膚に投与した際に、黄色ブドウ球菌由来のベシクルによる皮膚炎症が乳酸菌由来のベシクルにより効率的に抑制されることを確認したし（実施例１０および１１の参考）、高容量の乳酸菌由来の細胞外ベシクルをマウスに多回経口投与した結果、多様な生体指標で対照群との差がないことを確認して、上記の細胞外ベシクルの安定性を確認した（実施例１２の参考）。

それで、本発明は乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分で含む炎症疾患の予防または治療用の薬学的な組成物を提供する。

本発明で用いられる用語、「炎症疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）」とは、細菌または細菌由来のベシクル、毒素、ウイルス、またはカビなどの感染性因子により誘導される感染性炎症疾患、アレルゲンの露出により誘導されるアレルギー性炎症疾患、自己抗原に対する自己免疫性炎症疾患などを特徴とする疾患を含む。

本発明で用いられる用語、「感染性の炎症疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）」とは、感染性の因子により発生する炎症疾患を 総称するものであり、アトピー性皮膚炎、慢性鼻炎、慢性副鼻腔炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などを含む。

本発明で用いられる用語、「アレルギー性炎症疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）」とは、アレルゲンにより発生する炎症疾患を総称するものであり、アトピー性皮膚炎、慢性鼻炎、慢性副鼻腔炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などを含む。

本発明で用いられる用語、「アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）」とは、皮膚に慢性的に発生するかゆみ症を伴う皮膚疾患を総称する。

本発明で用いられる用語、「予防」とは本発明による薬学的な組成物の投与により炎症疾患を抑制したり発病を遅延させるすべての行為を意味する。

本発明で用いられる用語、「治療」とは本発明による薬学的な組成物の投与により炎症疾患による症状が好転されたり有利に変更されるすべての行為を意味する。

本発明の上記の乳酸菌はラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属 、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、またはリューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属の細菌であることができるが、これに制限されるものではない。

上記のラクトバチルス属の細菌は望ましくはラクトバチルス・プランタルム(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ)であることができるが、これに制限されるものではない。

本発明の上記の細胞外ベシクルは乳酸菌の培養液または乳酸菌で発酵させた食品から分離されることができ、乳酸菌から自然的または人工的に分泌されたものであることができるが、これに制限されるものではない。

本発明の上記の乳酸菌の培養液または発酵食品から細胞外ベシクルを分離する方法は細胞外ベシクルを含めば、特に制限されない。例えば、遠心分離、超高速遠心分離、フィルターによる濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、フリーフロー電気泳動、またはキャピラリー電気泳動などの方法、およびこれらの組合せを用いて細胞外ベシクルを分離することができ、また不純物の除去のための洗浄、収得された細胞外ベシクルの濃縮などのステップを追加に含むことができる。

本発明で上記の方法により分離された細胞外ベシクルは平均直径が１０〜３００ｎｍであることができ、望ましくは１０〜２００ｎｍであることができるが、これに制限されるものではない。

本発明による薬学的な組成物は乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含めて、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。上記の薬学的に許容可能な担体は製剤の際に通常的に用いられるものであって、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソームなどを含むが、これらに限定されず、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液などの他の通常の添加剤をさらに含むことができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤などを付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用の剤形、丸薬、カプセル、顆粒、または錠剤に製剤化することができる。適切な薬学的に許容される担体および製剤化に関しては、レミントンの文献に開示されている方法を用いて各成分により望ましく製剤化することができる。本発明の薬学的な組成物は財形に特別な制限はないが、注射剤、吸入剤、皮膚外用剤、または経口摂取剤などで製剤化することができる。

本発明の薬学的な組成物は目的にする方法により経口投与したり、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、鼻腔、気道に適用）することができ、投与量は患者の状態および体重、疾病の程度、薬物の形態、投与の経路および時間により異なるが、当業者により適切に選択することができる。

本発明による組成物は薬学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬学的に有効な量」は医学的な治療に適用可能な合理的な恩恵／リスクの比率で疾患を治療するのに十分な量を意味して、有効容量のレベルは患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路、および排出の比率、治療期間、同時に用いられる薬物を含む要素およびその他の医学分野でよく知られている要素に応じて決定することができる。本発明に係る組成物は、個々の治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは、順次的または同時に投与することができ、単一または多重投与されることができる。上記の要素をすべて考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定することができる。

具体的に、本発明による組成物の有効量は患者の年齢、性別、体重により異なることができ、一般的には体重１ｋｇ当たり、０．００１ないし１５０ｍｇ、望ましくは０．０１ないし１００ｍｇを毎日または隔日投与したり、１日１ないし３回に分けて投与することができる。しかし、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などによって増減することができるので、上記の投与量がどのような方法でも、本発明の範囲を限定するものではない。

また、本発明は乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む炎症疾患の改善用の化粧料の組成物を提供する。

本発明の上記の化粧料の組成物は乳酸菌由来の細胞外ベシクルだけでなく、化粧料の組成物に通常的に用いられる成分を含むことができ、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料および香料のような通常的な補助剤、そして担体を含むことができる。

また、本発明の組成物は、乳酸菌由来の細胞外ベシクルだけでなく、皮膚の保護効果を損なわない限度で、従来から用いられてきた有機日焼け止め剤を混合して用いることもできる。上記の有機日焼け止め剤には、グリセリルＰＡＢＡ、ドロメトリゾールトリシロキサン、ドロメトリゾール、ジガロイルトリオレエート、フェニルジベンズイミダゾールテトラスルホン酸２Ｎａ、ジエチルヘキシルブタミドトリアゾン、ジエチルアミノヒドロキシベンゾイル安息香酸ヘキシル, メトキシケイ皮酸ＤＥＡ, ローソンとジヒドロキシアセトンの混合物、メチレンビスベンゾトリアゾリルテトラメチルブチルフェノール、４−メチルベンジリデンカンファー、アントラニル酸メチル、ベンゾフェノン−３（オキシベンゾン）、ベンゾフェノン−４、ベンゾフェノン−８（オキシベンゾン）、ブチルメトキシジベンゾイルメタン、ビスエチルヘキシルオキシフェノールメトキシフェニルトリアジン、シノキセート、エチルジヒドロキシプロピルＰＡＢＡ、オクトクリレン、ジメチルＰＡＢＡエチルヘキシル、メトキシケイ皮酸エチルヘキシル、サリチル酸エチルヘキシル、エチルヘキシルトリアゾン、パラメトキシケイヒ酸イソアミル、 ポリシリコーン−１５（ジメチコジエチルベンザルマロネート）、テレフタリリデンジカンフルスルホン酸およびその塩類、サリチル酸ＴＥＡおよびアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）からなる群より選ばれる１種以上を用いることができる。

本発明の化粧料の組成物を添加することができる製品では、例えば、収れん化粧水、柔軟化粧水、栄養化粧水、各種クリーム、エッセンス、パック、ファンデーションなどのような化粧品類とクレンジング、洗顔料、石鹸、トリートメント、美容液などがある。本発明の化粧料の組成物の具体的な剤形としては、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、エッセンス、栄養エッセンス、パック、石鹸、シャンプー、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディローション、ボディクレンザー、乳液、 リップスティック 、メイクアップベース、ファンデーション、プレストパウダー、ルースパウダー、アイシャドウなどの剤形を含む。

また、本発明は乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む炎症疾患の改善用の健康機能食品の組成物を提供する。

本発明で用いられる用語、「改善」とは、治療になる状態と関連されるパラメーター、例えば、症状の程度を少なくとも減少させるすべての行為を意味する。

本発明の健康機能食品の組成物で有効成分を食品にそのまま添加したり、他の食品または食品成分と一緒に用いることができ、通常的な方法により適切に用いることができる。有効成分の混合量はその使用目的（予防または改善用）に応じて適合に決定されることができる。一般的に、食品または飲料の製造の際に、本発明の組成物は原料に対して１５重量％以下、望ましくは１０重量％以下の量で添加される。しかし、健康および衛生を目的にしたりまたは健康の調節を目的にする長期間の摂取の場合には、上記の量は上記の範囲以下であることができる。

本発明の健康機能食品の組成物は指示された比率を必須成分として上記の有効成分を含有すること以外に他の成分には特別な制限がなく、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。上述した天然炭水化物の例は、単糖類、例えば、ブドウ糖、加糖など；二糖類、例えば、マルトース、スクロースなど;および多糖類、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどの通常の糖、およびキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。上述したもの以外の香味剤として天然香味剤（ソーマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウディオシドＡ、グリチルリチンなど）および合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に用いることができる。上記の天然炭水化物の割合は、当業者の選択によって適切に決定することができる。

上記の以外に本発明の健康機能食品の組成物は様々な栄養剤、ビタミン、ミネラル（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸 とその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性のコロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含有することができる。このような成分は、独立的に、または組み合わせして用いることができる。このような添加剤の割合も当業者によって適切に選択することができる。

また、本発明は乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む炎症疾患の予防または治療用の吸入剤の組成物を提供する。

本発明の吸入剤の組成物に有効成分を吸入剤にそのまま添加したり、他の成分と一緒に用いることができ、通常的な方法により適切に用いることができる。有効成分の混合量はその使用目的（予防または治療用）により適合に決定されることができる。

本発明の他の様態として、本発明は臨床サンプルで分離した細胞外ベシクルから遺伝子を抽出するステップ；上記の遺伝子に対して塩基配列を解析するステップ；および上記の塩基配列の解析を通して乳酸菌由来の細胞外ベシクルの分布が健常者に比べて低い場合、アトピー性皮膚炎の誘発危険性が高いと判定するステップを含むアトピー性皮膚炎の診断方法を提供する。

上記の遺伝子はＤＮＡまたはＲＮＡであることができるが、これに制限されるものではない。

上記の臨床サンプルは尿または血液であることができるが、これに制限されるものではない。

上記の塩基配列の解析はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を通して行われることができるが、これに制限されない。

本発明のまたの他の様態として、本発明は乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む組成物を個体に投与するステップを含む炎症疾患の予防または治療方法を提供する。

本発明で「個体」とは、疾病の治療を必要にする対象を意味して、より具体的にはヒトまたは非−ヒトである霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、ラット（ｒａｔ）、犬、猫、馬、および牛などの哺乳類を意味する。

以下、本発明の理解を助けるために望ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより理解しやすくするために提供されるものであり、下記の実施例により、本発明の内容が限定されるものではない。

実験例１．腸内細菌由来の細胞外ベシクルの分離および特性評価
腸内の細菌であるシュードモナス・セドリナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｉｎａ）とシュードモナス・パナキス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｎａｃｉｓ）菌株から細胞外ベシクルを分離して、その特性を解析するために、上記の二つの菌株をＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ ｂｒｏｔｈ）でそれぞれ３０℃、２５℃の条件下で培養した。上記の細菌培養液を５，０００ｇで３０分間２回にかけて遠心分離した後、上澄み液を０．４５μｍ ｂｏｔｔｌｅ−ｔｏｐ ｆｉｌｔｅｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いてフィルタリングして、溶出された試料をＱｕｉｘＳｔａｎｄ^ＴＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）を用いて濃縮した。濃縮された試料を０．２２μｍ ｂｏｔｔｌｅ−ｔｏｐ ｆｉｌｔｅｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて、再び一回フィルタリングして細胞外ベシクルを分離しており、細胞外ベシクルのタンパク質の濃度はＢＣＡ ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量した。

上記の細菌培養液から分離した細胞外ベシクルを電子顕微鏡で観察するために、生理食塩水（ＰＢＳ、５０μｇ／ｍｌ）にある細胞外ベシクルを３００−グリッド銅メッシュ（ｍｅｓｈ ｃｏｐｐｅｒ ｇｒｉｄｓ）（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に位置させた後、２％ウラニル酢酸（ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で１２時間染色した。その後、ＪＥＭ１０１１ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＪＥＯＬ）を用いて１００ｋＶの加速電圧下で映像を得て細胞外ベシクルを観察した。

その結果、図１に示すように、シュードモナス・セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）とシュードモナス・パナキス（Ｐ．ｐａｎａｃｉｓ）由来の細胞外ベシクル（ＥＶｓ）が球形の模様であることを観察した。また、上記の細菌培養液から分離した細胞外ベシクルのサイズを動的光散乱法（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，ＤＬＳ）で測定するためにＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，６３３−ｎｍ ｌａｓｅｒ ｌｉｎｅ，ｓｃａｔｔｅｒｅｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ １０×３０ｓ）を用いて細胞外ベシクルの直径を測定した。その結果、図２に示すように、上記のシュードモナス・セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）とシュードモナス・パナキス（Ｐ．ｐａｎａｃｉｓ）由来の細胞外ベシクルの直径はそれぞれ３０−４０ｎｍ、２０−３０ｎｍで測定された。

次に、上記の二つの細菌とこれらの細菌由来の細胞外ベシクルに含まれたタンパク質の発現の様相を評価するために、タンパク質の試料でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。１５％ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｇｅｌを用いて上記の細菌細胞そのものから得たｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ（ＷＣＬ）とこれらの細菌由来の細胞外ベシクル（ＥＶ）をゲルにローディングした後、電気泳動を行っており、タンパク質がサイズ別に分離されたゲルをＣＢＢＲ−２５０（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０）で染色した。その結果、図３に示すように、上記の二つの細菌とこれら細菌から由来した細胞外ベシクルはタンパク質の構成でお互いに異なる様相を見せることを確認した。

実験例２．シュードモナス・パナキス細菌およびシュードモナス・パナキス由来の細胞外ベシクルの体内吸収、分布、および排泄様相の評価
シュードモナス・パナキス（Ｐ．ｐａｎａｃｉｓ）細菌とシュードモナス・パナキス（Ｐ．ｐａｎａｃｉｓ）由来の細胞外ベシクルを経口投与した際に、体内での吸収、分布、および排泄の様相を評価するために、ジャクソン研究所から受けたＣ５７ＢＬ／６Ｊ（６〜８−ｗｋ−ｏｌｄ）雄のマウスを用いて実験を行った。

シュードモナス・パナキス（Ｐ．ｐａｎａｃｉｓ）細菌と上記の細菌由来の細胞外ベシクルを常温で１時間Ｃｙ７（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でラベリングした後、２０μｇ／ｍｏｕｓｅの容量のマウスを夜間空腹させた後、胃で給食させた。０時間（ｈ）、５分（ｍｉｎ）、３時間（ｈ）、および１２時間（ｈ）の後にＩＶＩＳ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＣＴ（ＳｅｌｅｃｔＳｃｉｅｎｃｅ）を用いて７８０−８００ｎｍ波長（ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）でマウスの全身イメージを撮影した。

その結果、図４に示すように、シュードモナス・パナキス細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）の場合、経口投与の５分後、胃に存在したし、その後、体内に吸収されなく排泄された。一方、シュードモナス・パナキス由来の細胞外ベシクル（ＥＶ）の場合には経口投与５分後には全身的に吸収されており、投与３時間目には、心血関係、肺、肝に分布しており、膀胱に排泄されることを確認した。その後、上記の細菌および細菌由来の細胞外ベシクルの組織分布を評価するために、経口投与１２時間目、心臓（ｈｅａｒｔ）、肺（ｌｕｎｇ）、肝（ｌｉｖｅｒ）、および腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）を摘出して、血液（ｂｌｏｏｄ）を採取してＩＶＩＳ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＣＴで蛍光物質を検出した。その結果、図５に示すように、シュードモナス・パナキス由来の細胞外ベシクルの場合、血液、心臓、肺、肝、腎臓に存在しており、シュードモナス・パナキス細菌の場合には存在しないことを確認した。

さらに、実際に細菌由来の細胞外ベシクルが腸で腸内の血管に吸収されるかを確認するために、夜間空腹させたマウスで大腸を摘出して大腸の両側を密封して緑の蛍光を示すＧＦＰ１０μｇでラベリングされたシュードモナス・パナキス由来の細胞外ベシクルを腸内に注射した。その後、大腸の固有層の血液はＴＣＳ ＳＰ５ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｌｅｉｃａ）を用いて映像を得た。

投与の１０分後に二光子顕微鏡（ｔｗｏ−ｐｈｏｔｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を通してイメージを得た結果、図６に示すように、細胞外ベシクルが毛細血管に存在することを確認した。

実験例３．アトピー性皮膚炎患者の尿と血清を用いた細菌由来の細胞外ベシクルのメタゲノム解析
３−１．アトピー性皮膚炎患者の尿および血清から細胞外ベシクルの分離
上記の実施例２で細菌由来の細胞外ベシクルが体内に吸収された後、尿で排泄されて、血液にも分布して存在するという結果をもとに、アトピー性皮膚炎患者の尿と血清に存在する細菌由来の細胞外ベシクルを分離して、これに含むＤＮＡを抽出した。

アトピー性皮膚炎患者は スンチョンヒャン大学ソウル病院の小児アレルギー呼吸器センターを訪問した患者の中でＨａｎｉｆｉｎとＲａｊｋａのアトピー性皮膚炎の診断基準を満たしている、満１７歳以下のアトピー性皮膚炎患者を対象にした。他の皮膚疾患を伴っていたり、最近１４日以内の抗生剤の成分の外用剤、経口用の製剤、または注射製剤を投与された場合は対象から除外した。正常対照群はアトピー性皮膚炎を含む他の皮膚疾患がなく、アレルギー疾患及び意味のある他の病歴および薬物の服用歴がない小児を対象にした。アトピー性皮膚炎患者と正常対照群の中、本研究に同意した患者を対象に尿および血清を得た。その後、実施例１の方法で尿および血清から細胞外ベシクルを分離して高温で沸かしてＤＮＡを抽出した後、ＤＮＡの量と質は次のステップを行う前にｎａｎｏ−ｄｒｏｐで測定した。

３−２．尿および血清に存在する細胞外ベシクルから分離したＤＮＡメタゲノム解析
実施例３−１の方法でアトピー性皮膚炎患者の尿および血清に存在する細胞外ベシクルから分離したＤＮＡを用いてメタゲノム解析を実施した。

まず、それぞれのクローンをＶ１−Ｖ２ ｒｅｇｉｏｎ増幅のために１６ｓ ｒＤＮＡ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒとＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてＤＮＡ解析のため、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を行った。上記の１６ｓ ｒＤＮＡ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒの配列を下記の表１に示した。

ＰＣＲを通した増幅反応はエマルジョン状態である油とａｍｐｌｉｃｏｎが混合された状態で行って、ＧＳ−ＦＬＸ ｐｌｕｓ ｅｍＰＣＲ Ｋｉｔ（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたＴｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）で増幅混合物と単独粒子を含むマイクロリアクター(「ｍｉｃｒｏ−ｒｅａｃｔｏｒｓ」)を作るために行った。エマルジョンは９６−ｗｅｌｌプレートに分けて盛って、それぞれＤＮＡサンプル２０ｎｇを５０μｌ ＰＣＲ反応に用いて、製造社のプロトコルによりＰＣＲを行った（１ステップ：９４℃で３分間、２ステップ：９４℃で１５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で１分間３５サイクルの遂行、ラストステップ：７２℃で８分間の遂行）。エマルジョンＰＣＲ（ｅｍｕｌｓｉｏｎ ＰＣＲ；ｅｍＰＣＲ）を行って、各ＤＮＡを増幅した後、ａｍｐｌｉｃｏｎはＡＭｐｕｒｅ Ｂｅａｄ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて精製して、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ ｍｅｔｈｏｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて定量化した。その後、ａｍｐｌｉｃｏｎは希釈してＧＳ−ＦＬＸ Ｔｉｔａｎｉｕｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて解析した。ＰＣＲ増幅の後、エマルションは化学的に分解されて、ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙを有する粒は濾過を通して洗浄した。陽性であるビーズ（ｂｅａｄｓ）はｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ Ａ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｔｏ ａｄａｐｔｏｒ Ａ）を用いて精製しており、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏａｔｅｄ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓに付くようにした。その後、ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓに付けたＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｂｅａｄｓを二重螺旋構造を溶かしてｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓで分離して一本鎖ＤＮＡは流すようにした。塩基配列ｐｒｉｍｅｒは再び増幅された一本鎖ＤＮＡで作った。最後に、増幅された一本鎖ＤＮＡを有している粒をＰａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて個数を数えた。塩基配列の解析はＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＦＬＸ ｔｉｔａｎｉｕｍ（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行っており、それぞれのサンプルは７０ｍｍ−７５ｍｍ ＰｉｃｏＴｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のぞれぞれにローディングした。

生物情報学を通したメタゲノム解析のために品質点数（平均Ｐｈｒｅｄ点数＞２０）とｒｅａｄ ｌｅｎｇｔｈ（＞３００ｂｐ）をチェックして、高品質の配列を集めた。ＵＣＬＵＳＴとＵＳＥＡＲＣＨ（Ｅｄｇａｒ，２０１０）を用いて、Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ Ｕｎｉｔ（ＯＵＴ）を解析しており、系統学的な分類はＱＩＩＭＥ（Ｌｏｚｕｐｏｎｅ， ｅｔ ａｌ．， ２００６）を用いて解析した。類似性に基づいて、すべての１６ｓ ＲＮＡ配列は次の系統学的なステップにより分類した：種（ｓｐｅｃｉｅｓ）＞９７％類似性；属（ｇｅｎｕｓ）＞９４％類似性；科（ｆａｍｉｌｙ）＞９０％類似性；目（ｏｒｄｅｒ）＞８５％類似性； 綱（ｃｌａｓｓ）＞８０％；門（ｐｈｙｌｕｍ）＞７５％類似性。属（ｇｅｎｕｓ）のレベルの細菌構成はアトピー性皮膚炎患者と正常対照群の間に２倍以上の有意な構成の差が見える場合、ｈｅａｔ ｍａｐで画いた。階層的なクラスタリングは属（ｇｅｎｕｓ）のレベルでアトピー性皮膚炎患者と正常対照群の間に２倍以上の有意味な構成の差が見えたり、１％以上の平均構成を見せる場合に行った。

３−３．尿と血清に存在する細菌由来の細胞外ベシクルの分布の関連性の解析
実施例３−１の方法でアトピー性皮膚炎患者の尿と血清に存在する細菌由来の細胞外ベシクルからＤＮＡを分離した後、実施例３−２の方法でメタゲノム解析を通して１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を解析して、上記の尿と血清に存在する細菌由来の細胞外ベシクルの分布を比べた。

図７ないし図１１にそれぞれ門（ｐｈｙｌｕｍ）、綱（ｃｌａｓｓ）、目（ｏｒｄｅｒ）、科（ｆａｍｉｌｙ）、属（ｇｅｎｕｓ）のレベルのメタゲノム解析を示したし、各患者の尿サンプル（ｂｏｉｌｅｄ ｕｒｉｎｅ）の細胞外ベシクルの分布結果は赤い下線、各血清サンプル（ｓｅｒｕｍ）の細胞外ベシクルの分布結果は青い下線で示した。その結果、アトピー性皮膚炎患者の尿に存在する細菌由来の細胞外ベシクルの分布と血清に存在する細菌由来の細胞外ベシクルの分布が正確に一致することが分かった。

実験例４．アトピー性皮膚炎患者と健常者の尿の細菌由来の細胞外ベシクルの分布の差の解析
実施例３−１および３−２の方法でアトピー性皮膚炎患者と健常者の尿に存在する細菌由来の細胞外ベシクルの分布の差を評価した。

図１２ないし図１６にそれぞれの門（ｐｈｙｌｕｍ）、綱（ｃｌａｓｓ）、目（ｏｒｄｅｒ）、科（ｆａｍｉｌｙ）、属（ｇｅｎｕｓ）のレベルのメタゲノム解析の結果を示したし、健常者（ｃｏｎｔｒｏｌ）の尿サンプルの細胞外ベシクルの分布結果は青い下線、アトピー性皮膚炎患者（ｃａｓｅ）の尿サンプルの細胞外ベシクルの分布結果は赤い下線で表した。

その結果、門（ｐｈｙｌｕｍ）、綱（ｃｌａｓｓ）、目（ｏｒｄｅｒ）、科（ｆａｍｉｌｙ）、属（ｇｅｎｕｓ）のレベルですべてのアトピー性皮膚炎患者と健常者の尿に存在する細菌由来の細胞外ベシクルの分布に顕著な差があることを確認した。より具体的に、図１７および下記の表２に示すように、尿に１％以上存在する細菌由来の細胞外ベシクルの中で健常者（ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて、アトピー性皮膚炎患者（ｃａｓｅ）の尿にはアリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌由来の細胞外ベシクル（健常者ｖｓ．アトピー性皮膚炎患者：０．３１％ｖｓ．８．４９％）、 メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌由来の細胞外ベシクル（健常者ｖｓ．アトピー性皮膚炎患者：０．２２％ｖｓ．２．０２％）、ストレプト植物（Ｓｔｒｅｐｔｏｐｈｙｔａ）目細菌由来の細胞外ベシクル（健常者ｖｓ．アトピー性皮膚炎患者：２．８７％ｖｓ．７．８９％）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌由来の細胞外ベシクル（健常者ｖｓ．アトピー性皮膚炎患者：２．７８％ｖｓ．７．６％）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌由来の細胞外ベシクル（健常者ｖｓ．アトピー性皮膚炎患者：９．５６％ｖｓ．２１．９１％）などが顕著に増加されていた。一方、尿に１％以上存在する細菌由来の細胞外ベシクルの中で健常者に比べて、アトピー性皮膚炎患者の尿にはラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌由来の細胞外ベシクル（健常者ｖｓ．アトピー性皮膚炎患者：２０．９２％ｖｓ．４．６１％）、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属細菌由来の細胞外ベシクル（健常者ｖｓ．アトピー性皮膚炎患者：１４．６０％ｖｓ．０．１２％）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目細菌由来の細胞外ベシクル（健常者ｖｓ．アトピー性皮膚炎患者：１８．１９％ｖｓ．０．０５％）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来の細胞外ベシクル（健常者ｖｓ．アトピー性皮膚炎患者：１１．５７％ｖｓ．０．０３％）などが顕著に減少されていることを確認した。

実験例５．乳酸菌培養液で細胞外ベシクルの分離および特性解析
上記の実施例４の結果を通してラクトバチルス目細菌およびラクトバチルス属細菌由来の細胞外ベシクルが健常者に比べてアトピー性皮膚炎患者の尿で顕著に減少されていることを確認したので、ラクトバチルス由来の細胞外ベシクルが免疫反応および炎症反応に及ぶ影響を調べるようにした。

これのため、キムチから分離したラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）乳酸菌を培養して、乳酸菌培養液を１０，０００×ｇで２０分の間、遠心分離した後、上澄み液のみを収去し、０．２２ｎｍ ｆｉｌｔｅｒで濾過した。分離された濾過液を１００ｋＤａより大きいもののみを一定量で濃縮した後、１５０，０００×ｇ、４℃で３時間超高速遠心分離を行っており、上澄み液を捨てて残った細胞外ベシクルの塊を濾過された生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した後、ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ、アメリカ）で濃度を定量した。その後、上記の乳酸菌から分離した細胞外ベシクルの物理的な特性が同一であるかを確認するために動的光散乱法（Ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）および電子顕微鏡の観察を実施した。

電子顕微鏡の観察の結果、図１８に示すように、上記の乳酸菌由来の細胞外ベシクルが球形の形態を有することを観察しており、動的光散乱法を通して図１９のように平均的に約１５ｎｍ程度の直径を有することを確認した。

次に、分離された細胞外ベシクルの量を確認するために、ナノサイト（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ：ＬＭ−１０ＨＳ）を行った。５００ｎｇ／ｍｌ濃度で合わせた細胞外ベシクルのサンプルを２ｍｌ準備して、サンプル０．３なし０．４ｍｌをＬＭ−１０ＨＳ機器のチェンバーに乗せた後、カメラを用いてフォーカスを合わせて粒子（ｐａｒｔｉｃｌｅ）が明白に見えるようにした。フォーカスが会わせられた状態でカメラのレベルを最大に上げた後、レベルを一段階ずつ降りながらサンプルのキャプチャー（ｃａｐｔｕｒｅ）してサンプルのドリフト（ｄｒｉｆｔ）がないか確認した。サンプルの濃度、フォーカスとドリフトがないか確認した後、キャプチャー間隔（ｄｕｒａｔｉｏｎ）を３０秒に合わせておいて、データを得て確認した。その結果、図２０に示すように、細胞外ベシクルはタンパク質１μｇ基準２．４７×１０^８個が存在することを確認した。

実験例６．皮膚上皮細胞の黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクルの刺激による免疫反応の発生で乳酸菌由来の細胞外ベシクルの免疫調節効果の確認
炎症反応の発生で乳酸菌由来の細胞外ベシクルの効能を調べるために、皮膚上皮細胞株（ＨａＣａＴ）２×１０^５ｃｅｌｌｓに炎症疾患の主な原因因子として知られている黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクル（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＥＶ）およびニキビ菌（Ｐ．ａｃｎｅｓ ＥＶ）由来の細胞外ベシクルと上記の実施例５の方法で分離した乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）をそれぞれ１０ｎｇ〜２５μｇ／ｍｌの濃度で処理して１２時間の間培養した後、上澄み液でＴｈ１７免疫反応を誘発するサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）であるＩＬ−６の分泌量をＥＬＩＳＡを通して測定した。その結果、図２１に示すように、黄色ブドウ球菌およびニキビ菌由来のベシクルに比べて、上記の乳酸菌由来の細胞外ベシクルを処理した場合、ＩＬ−６の分泌量がはるかに低く示された。

また、上記の乳酸菌由来の細胞外ベシクルを皮膚上皮細胞に様々な濃度（０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）で１２時間前に処理して、２５μｇ／ｍｌの濃度の黄色ブドウ球菌またはニキビ菌由来のベシクルを上記の皮膚上皮細胞に処理して１２時間の間培養した後、上澄み液に炎症性サイトカインであるＩＬ−６の分泌量をＥＬＩＳＡ法で確認した。その結果、図２２に示すように、乳酸菌由来の細胞外ベシクル（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＥＶ）を前処理した場合、黄色ブドウ球菌由来のベシクルによるＩＬ−６の分泌が濃度依存的に減少したのに比べて、ニキビ菌由来のベシクル（Ｐ．ａｃｎｅｓ ＥＶ）によるＩＬ−６の分泌には乳酸菌由来の細胞外ベシクルの効果が示していない。

このような結果は乳酸菌由来の細胞外ベシクルが黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクルによるＴｈ１媒介免疫反応および炎症反応を抑制して、これは黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクルによる免疫機能の異常に特異的に作用することを意味する。

実験例７．炎症細胞の黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクルの刺激による炎症反応の発生で乳酸菌由来の細胞外ベシクルの抗炎症効果の確認
炎症細胞で黄色ブドウ球菌に由来の細胞外ベシクルによる炎症反応の発生に乳酸菌由来の細胞外ベシクルがどのような影響を及ぼすのかを調べてみようとした。まず、炎症細胞であるマウスの腹腔マクロファージ（Ｒａｗ ２６４．７）に１μｇの黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクル（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または１０ｎｇ、１００ｎｇ、または１μｇの乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３）を１２時間の間処理した後、腹腔マクロファージから分泌される炎症性サイトカインであるＩＬ−６とＴＮＦ−αの量を測定して比較した。その結果、図２３に示すように、乳酸菌由来の細胞外ベシクルを処理した場合、濃度に関係なく黄色ブドウ球菌由来のベシクルを処理した場合に比べてＩＬ−６およびＴＮＦ−αの分泌が顕著に減少した。これは黄色ブドウ球菌由来のベシクルに比べて乳酸菌由来の細胞外ベシクルが体内に吸収された際に、はるかに安全であることを意味する。

上記の結果をもとに、マウスの腹腔マクロファージに乳酸菌由来の細胞外ベシクルを様々な濃度（０．０１、０．１、１μｇ／ｍｌの濃度）で処理して、１２時間後に黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクルを１μｇ／ｍｌの濃度で処理した後、１２時間後、ＥＬＩＳＡを通して炎症性サイトカインであるＩＬ−６とＴＮＦ−αの量を測定した。その結果、図２４に示すように、乳酸菌由来の細胞外ベシクルを前処理した場合、黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクルによるＩＬ−６およびＴＮＦ−αの分泌が抑制されることを確認した。これは、乳酸菌由来の細胞外ベシクルが黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクルにより誘導される炎症細胞による炎症反応を効率的に抑制することができることを意味する。

実験例８．黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクルの刺激による皮膚上皮細胞の死滅で乳酸菌由来の細胞外ベシクルの死滅抑制効果の確認
黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクルによる皮膚上皮細胞の死滅で乳酸菌由来の細胞外ベシクルの死滅抑制効果を評価するために、皮膚上皮細胞に実施例６と同一な濃度および条件で乳酸菌由来の細胞外ベシクルを前処理した後、黄色ブドウ球菌由来のベシクル（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＥＶ）を２５μｇ濃度で２４時間の間処理して、ＭＴＴ ａｓｓａｙ（Ｓｉｇｍａｎ、アメリカ）を実施した。その結果、図２５に示すように、黄色ブドウ球菌由来のベシクルによる皮膚上皮細胞の死滅が乳酸菌由来の細胞外ベシクルを０．１μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌ濃度で処理した場合、効率的に抑制されることを確認した。

実験例９．緑膿菌由来の細胞外ベシクルによる炎症発生で乳酸菌由来の細胞外ベシクルの抗炎症効果の確認
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する主な病院性細菌として、抗生剤の耐性を起こりやすく、敗血症の主な原因細菌として知られていった。最近、緑膿菌由来の細胞外ベシクルが気道を通す繰り返す露出により、喘息、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺がんなどのような慢性肺疾患の主な原因因子として知られるようになった。このような背景の下で、緑膿菌由来のベシクルによる炎症反応の発生において乳酸菌由来の細胞外ベシクルの抗炎症の効果を評価しようとした。

このために、炎症細胞である腹腔マクロファージ（Ｒａｗ ２６４．７）に乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）を様々な濃度（０．０１、０．１、１μｇ／ｍｌ）で処理して、12時間後に緑膿菌由来の細胞外ベシクル（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＥＶ）を１μｇ／ｍｌ濃度で処理して炎症性サイトカインであるＩＬ−６およびＴＮＦ−αの濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。その結果、図２６に示すように、緑膿菌由来のベシクルの刺激によるＩＬ−６およびＴＮＦ−αの分泌が乳酸菌由来の細胞外ベシクルの処理濃度に比例してほぼ完璧に抑制されることを確認した。

また、緑膿菌由来の細胞外ベシクルと乳酸菌由来の細胞外ベシクルを腹腔マクロファージに同時に処理して、炎症性サイトカインの分泌様相を評価した結果、図２７に示すように、緑膿菌由来の細胞外ベシクルの刺激によるＩＬ−６およびＴＮＦ−αの分泌が乳酸菌由来のベシクルでの処理により顕著に抑制されることを確認した。以上の結果は慢性肺疾患、敗血症の原因因子として知られた緑膿菌由来のベシクルによる炎症発生が乳酸菌由来のベシクルにより効率的に抑制されることができることを意味する。

実験例１０．乳酸菌由来の細胞外ベシクルの皮膚投与による黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクルによるアトピー性皮膚炎の発生の抑制効果の確認
上記の実施例６ないし８を通して、乳酸菌由来の細胞外ベシクルの黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクルによる免疫調節、抗炎症、および皮膚細胞の死滅の抑制効果を確認したので、実際に乳酸菌由来の細胞外ベシクルの皮膚投与によるアトピー性皮膚炎の治療効果を評価するようにした。

このために、図２８に示したプロトコルにより、ＳＫＨ−１ ｈａｉｒｌｅｓｓマウスに１０μｇ濃度の黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクル（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＥＶ）を週３回ずつ４週間、繰り返し塗布してアトピー性皮膚炎のモデルを制作しており、黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクルを塗布する１２時間前に乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）を皮膚に塗布してアトピー性皮膚炎の発生に対する治療効果を観察した。この際、陽性対照群にはアトピー性皮膚炎の治療剤として用いられている免疫抑制剤であるデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）を３００μｇ濃度で腹腔投与（ｉ．ｐ．ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）して同一な条件で実験を行った。

その結果、図２９に示すように、黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクルにより誘発されたアトピー性皮膚炎のマウスモデルに乳酸菌由来の細胞外ベシクルを塗布する場合、塗布しない場合に比べて皮膚病変のサイズが減少しており、乳酸菌由来のベシクルを１００μｇ投与した場合には免疫抑制剤であるデキサメタゾンを腹腔投与した場合と類似な程度で皮膚病変の発生が抑制されたことを確認した。

また、皮膚組織でＴｈ１７炎症を起こす代表的な免疫指標であるＩＬ−１７を測定した結果、図３０に示すように、乳酸菌由来の細胞外ベシクルを皮膚に塗布した場合、塗布していない場合に比べてＩＬ−１７の濃度が低く測定されて、これは陽性対照群（ｄｅｘａ）と同じようなレベルであることを確認した。以上の結果は乳酸菌由来の細胞外ベシクルを皮膚に投与した際に、効率的にアトピー性皮膚炎のような皮膚炎症疾患を抑制することができることを意味する。

実験例１１．黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクルによる皮膚炎の発生で乳酸菌由来の細胞外ベシクルの経口投与の治療効果の確認
乳酸菌由来の細胞外ベシクルの経口投与によるアトピー性皮膚炎の治療効果を評価するために、図３１に示すプロトコルにより、ＳＫＨ−１ ｈａｉｒｌｅｓｓマウスに１０μｇの濃度の黄色ブドウ球菌由来のベシクル（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＥＶ）を週３回ずつ４週間、繰り返し塗布してアトピー性皮膚炎モデルを製作して、黄色ブドウ球菌由来のベシクルを塗布する１２時間前に乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３ ＥＶ）を経口で投与してアトピー性皮膚炎の発生に対する治療の効果を観察した。

その結果、図３２に示すように、乳酸菌由来の細胞外ベシクルを経口投与した場合、投与していない場合に比べて、皮膚病変のサイズが減少しており、乳酸菌由来のベシクルを１０μｇまたは１００μｇ投与した一部では皮膚病変が全く観察されていなかった。

また、皮膚組織で免疫および炎症指標を評価するために、皮膚組織内のＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１７、およびＩＦＮ−γの濃度を測定した結果、図３３に示すように、乳酸菌由来の細胞外ベシクルを経口投与した場合、上記のサイトカインの分泌が顕著に抑制されることを確認した。以上の結果は乳酸菌由来の細胞外ベシクルを経口で投与する際に、効率的にアトピー性皮膚炎のような皮膚炎症疾患を抑制することができることを意味する。

実験例１２．高容量の乳酸菌由来の細胞外ベシクルの多回経口投与による安定性の評価
乳酸菌由来の細胞外ベシクルの高容量反復投与による毒性を評価するために、図３４に図示した方法で、週３回、４週間（総１２回）、乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＣＪＬＰ１３３）の５００μｇを経口で投与した。その後、ベシクルを投与していない対照群と乳酸菌由来のベシクルを経口投与した群でそれぞれのマウスの体重、飼料の摂取量、体温を測定した。

その結果、図３５ないし図３７で示すように、三つの指標、すべてで対照群と乳酸菌由来の細胞外ベシクル投与群で別に差が示されていないことを確認した。

また、４週間の経口投与の後、血液を採取して血球成分を解析した結果、図３８に示した八つの指標（ＷＢＣ；白血球の数、ＲＢＣ；赤血球の数、ＨＧＢ；ヘモグロビンの濃度、ＨＣＴ；遠心分離血漿、ＭＣＶ；赤血球の平均体積、ＭＣＨ；平均ヘモグロビンの数、ＭＣＨＣ；平均ヘモグロビンの濃度、ＰＬＴ；血小板の数）で対照群と乳酸菌由来の細胞外ベシクルの投与群の間に有意味な差が表していない。以上の結果は高容量で乳酸菌由来の細胞外ベシクルを経口に投与した際に、安全に治療効果を誘導することを意味する。

上記に述べた本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者は本発明の技術的な思想や必須的な特徴を変更しなくて、他の具体的な形態に容易に変形することが可能であることを理解することができるだろう。したがって、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的ではないと理解するべきである。

配列リスト Ｆｒｅｅ Ｔｅｘｔ
＜２１０＞１
＜２１１＞１９
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ

＜２２０＞
＜２２３＞１６ｓ ｒＤＮＡ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ＿２７Ｆ

＜４００＞１
ｇａｇｔｔｔｇａｔｃ ｍｔｇｇｃｔｃａｇ １９

＜２１０＞２
＜２１１＞１７
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ

＜２２０＞
＜２２３＞１６ｓ ｒＤＮＡ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ＿５１８Ｒ

＜４００＞２
ｗｔｔａｃｃｇｃｇｇ ｃｔｇｃｔｇｇ １７

Claims (39)

1. 乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む、炎症疾患の予防または治療用の薬学的な組成物。
2. 上記の乳酸菌はラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目の細菌であることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的な組成物。
3. 上記のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目の細菌はラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、またはリューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属の細菌であることを特徴とする、請求項２に記載の薬学的な組成物。
4. 上記のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）であることを特徴とする、請求項３に記載の薬学的な組成物。
5. 上記の細胞外ベシクルは平均直径が１０〜３００ｎｍであることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的な組成物。
6. 上記の細胞外ベシクルは乳酸菌培養液から分離されることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的な組成物。
7. 上記の細胞外ベシクルは乳酸菌で自然的または人工的に分泌されることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
8. 上記の炎症疾患はアトピー性皮膚炎、慢性鼻炎、慢性副鼻腔炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および敗血症からなる群より選ばれる疾患であることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的な組成物。
9. 乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む、炎症疾患の改善用の化粧料の組成物。
10. 上記の乳酸菌はラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目の細菌であることを特徴とする、請求項９に記載の化粧料の組成物。
11. 上記のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目の細菌はラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、またはリューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属の細菌であることを特徴とする、請求項１０に記載の化粧料の組成物。
12. 上記のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）であることを特徴とする、請求項１１に記載の化粧料の組成物。
13. 上記の細胞外ベシクルは平均直径が１０〜３００ｎｍであることを特徴とする、請求項９に記載の化粧料の組成物。
14. 上記の細胞外ベシクルは乳酸菌培養液から分離されることを特徴とする、請求項９に記載の化粧料の組成物
15. 上記の細胞外ベシクルは乳酸菌から自然的または人工的に分泌されることを特徴とする、請求項９に記載の化粧料の組成物。
16. 上記の炎症疾患はアトピー性皮膚炎、慢性鼻炎、慢性副鼻腔炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および敗血症からなる群より選ばれる疾患であることを特徴とする、請求項９に記載の化粧料の組成物。
17. 乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む、炎症疾患の改善用の健康機能食品の組成物。
18. 上記の乳酸菌はラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目の細菌であることを特徴とする、請求項１７に記載の健康機能食品の組成物。
19. 上記のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目の細菌はラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、またはリューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属の細菌であることを特徴とする、請求項１８に記載の健康機能食品の組成物。
20. 上記のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）であることを特徴とする、請求項１９に記載の健康機能食品の組成物。
21. 上記の細胞外ベシクルは平均直径が１０〜３００ｎｍであることを特徴とする、請求項１７に記載の健康機能食品の組成物。
22. 上記の細胞外ベシクルは乳酸菌培養液から分離されることを特徴とする、請求項１７に記載の健康機能食品の組成物。
23. 上記の細胞外ベシクルは乳酸菌から自然的または人工的に分泌されることを特徴とする、請求項１７に記載の健康機能食品の組成物。
24. 上記の炎症疾患はアトピー性皮膚炎、慢性鼻炎、慢性副鼻腔炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および敗血症からなる群より選ばれる疾患であることを特徴とする、請求項１７に記載の健康機能食品の組成物。
25. 乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む、炎症疾患の予防または治療用の吸入剤の組成物。
26. 上記の乳酸菌はラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目の細菌であることを特徴とする、請求項２５に記載の吸入剤の組成物。
27. 上記のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目の細菌はラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、またはリューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属の細菌であることを特徴とする、請求項２６に記載の吸入剤の組成物。
28. 上記のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）であることを特徴とする、請求項２５に記載の吸入剤の組成物。
29. 上記の細胞外ベシクルは平均直径が１０〜３００ｎｍであることを特徴である、請求項２７に記載の吸入剤の組成物。
30. 上記の細胞外ベシクルは乳酸菌培養液から分離されることを特徴とする、請求項２５に記載の吸入剤の組成物。
31. 上記の細胞外ベシクルは乳酸菌から自然的または人工的に分泌されることを特徴とする、請求項２５に記載の吸入剤の組成物。
32. 上記の炎症疾患はアトピー性皮膚炎、慢性鼻炎、慢性副鼻腔炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および敗血症からなる群より選ばれる疾患であることを特徴とする、請求項２５に記載の吸入剤の組成物。
33. 下記のステップを含む、アトピー性皮膚炎の診断方法：
    （ａ）臨床サンプルで分離した細胞外ベシクルから遺伝子を抽出するステップ；
    （ｂ）上記の遺伝子に対して塩基配列を解析するステップ；および
    （ｃ）上記の塩基配列の解析を通して乳酸菌由来の細胞外ベシクルの分布が健常者に比べて低い場合、アトピー性皮膚炎の誘発危険性が高いと判定するステップ。
34. 上記の遺伝子はＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする、請求項３３に記載の診断方法。
35. 上記の臨床サンプルは尿または血液であることを特徴とする、請求項３３に記載の診断方法。
36. 上記の塩基配列の解析はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を通して行われることを特徴とする、請求項３３に記載の診断方法。
37. 乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む組成物を個体に投与するステップを含む、炎症疾患の予防または治療方法。
38. 乳酸菌由来の細胞外ベシクルの炎症疾患の予防または治療用途。
39. 乳酸菌由来の細胞外ベシクルのアトピー性皮膚炎の診断用途。