KR20170000369A - 유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유산균의 배양액에서 분리한 유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물, 및 아토피피부염의 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 유산균 유래 세포밖 소포체는 정상인에 비하여 염증질환 환자의 소변 및 혈액에서 현저히 많이 분포되어 있고, 포도상구균 또는 슈도모나스균 유래 세포밖 소포체 노출에 의한 상피세포 및 염증세포의 염증반응이 유산균 유래 세포밖 소포체에 의해 효율적으로 억제되는 것을 in vitro 및 in vivo 실험을 통해 확인하였는바, 상기 유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물은 아토피피부염, 만성비염, 만성부비동염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 또는 패혈증 등의 염증질환을 예방, 개선, 또는 치료하기 위한 의약품, 화장품, 또는 건강기능식품 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 소변 또는 혈액 샘플에서 유산균 유래 세포밖 소포체의 분포를 측정함으로써 아토피피부염을 진단하는 데에도 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Prevention or Treatment of Inflammatory disease Comprising Extracellular Vesicles Derived from Lactic acid bacteria}
본 발명은 유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물, 및 아토피피부염의 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
최근 생활방식의 변화에 의해 급성 전염성 질환에서 만성 염증질환으로 질병패턴이 바뀌고 있다. 염증은 외부에서 독소 등의 물질이 체내에 들어왔을 때, 우리 몸에서 일어나는 방어기작으로서, 환경 내 세균, 곰팡이 등이 단기간 침입으로 급성 염증이 발생하고, 환경 내에 존재하는 미생물, 알레르겐 등의 원인물질이 지속적으로 우리 몸에 흡수되면, 만성 염증이 발생하게 된다. 최근, 비감염성 원인 인자로 인식되었던 만성 염증질환의 발생에 감염성 원인 인자의 중요성이 부각되고 있다. 대표적으로, 위에 공생한다고 알려져 있던 헬리코박터균이 위염, 위암 등의 발생에 중요한 원인 인자로 밝혀지면서, 주변 환경에 공생한다고 알려진 세균 및 세균 유래 물질이 만성 염증질환 및 만성염증의 합병증으로 발생하는 암의 원인 인자로서 최근 각광을 받고 있다.
아토피피부염은 영유아기와 소아기에서 가장 흔히 볼 수 있는 피부질환으로, 천식이나 알레르기 비염으로 진행되는 알레르기 진행(atopic march)의 첫 신호이기도 하다. 또한, 아토피피부염은 만성적인 가려움증과 반복되는 피부 염증 소견으로 육체적, 정신적으로 환자 자신뿐만 아니라 가족의 삶의 질까지도 저하시키는 만성 염증질환이며, 최근 전 세계적으로 아토피피부염의 유병률이 증가하면서 이에 대한 관심도 증가하고 있다. 국내의 경우, 대한 소아알레르기 호흡기학회에서 실시한 ISAAC(International Study of Allergy and Asthma in Childhood) 설문조사에 따르면, ‘지금까지의 아토피피부염’에서 유병률은 1995년에 비해 2000년에 6~12세(1995년 15.3%, 2000년 17.0%)와 12~15세(1995년 7.2%, 2000년 9.2%) 모두에서 증가하였으며, ‘지난 12개월 동안 아토피피부염’의 발병률에서도 1995년에 비해 2000년에 6~12세(1995년 7.3%, 2000년 10.7%)와 12~15세(1995년 3.9%, 2000년 6.1%) 모두에서 증가하였다. 아토피피부염과 같은 알레르기 질환은 유전적 요인과 환경적 요인의 복합적인 상호작용에 의해 발생하는데, 최근의 증가 추세는 유전적 요인만으로 설명하기에는 부족하다. 알레르기질환의 발생 빈도가 나라에 따라 차이가 나는 점은 종족 간의 차이, 즉 유전적 요소의 중요성을 반영하지만, 이전의 동독이었던 지역에서 통일 후 알레르기 질환의 급증을 보이는 것과 같은 결과는 환경적인 요인 또한 중요함을 나타내는 것이다. 이러한 알레르기질환의 증가는 서구화된 생활과 연관성이 있는데 가능한 원인을 들어본다면 첫째, 일반적으로 더 많은 시간을 실내에서 보내게 되어 집 먼지 진드기에 대한 노출 증가, 둘째, 깨끗한 위생 생활과 항생제 사용 등에 의한 광범위한 미생물에 대한 노출 변화, 셋째, 서구화된 식습관 변화 등이 있을 수 있다.
아토피피부염 환자는 피부 장벽 기능의 장애, 또는 면역기능 이상으로 피부감염이 흔하게 발생한다. 특히, 포도상구균(Staphylococcus)에 의한 세균감염, 단순포진바이러스(herpes simplex virus)에 의한 바이러스감염, 그리고 진균(fungus)감염이 흔하다. 이 중 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 아토피피부염 환자의 90%에서 검출되며 명백한 감염 증상이 없는 피부병변에서도 검출되는데, 황색포도상구균의 독소는 초항원으로 작용하여 알레르기 면역 반응을 증가시켜서 피부에 가려움증과 병변을 더욱 악화시키는 역할을 한다고 알려져 있다.
아토피피부염의 예후는 환자의 피부상태, 자극요인, 알레르기질환의 동반 여부, 세균감염 여부 등에 따라 다양하다. 일반적으로 아토피피부염은 어린 나이에 증상이 심하고 만성화 병변이 지속되었다가 연령이 증가하면서 호전되는 경향이 있다. 그러나 일부 보고서에는 환자의 약 40%가 5세 전후에 호전되는데, 이러한 호전의 이유에 대해선 논란이 있다. 가장 대표적인 아토피피부염의 치료 방법은 보습제의 적절한 사용과 함께 다양한 원인에 의해 악화된 경우 원인제거와 동시에 국소 및 전신 스테로이드 또는 국소 면역억제제의 도포 등이 있다. 하지만 최근 연구 결과들은 이러한 요소들 이외에 유산균 자체 또는 유산균 배양액을 복용하여 아토피피부염의 중등도를 낮출 수 있다고 제시하고 있다.
천식(asthma) 및 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD)은 만성적인 기도 염증에 의한 기도폐색을 특징으로 하는 질환으로서, 천식은 가역적인 기도폐색, COPD는 비가역적인 기도폐색을 특징으로 한다. 천식의 원인인자로서 집먼지진드기 유래 알레르겐에 의한 과민반응이 호산구성 천식의 병인에 중요하다고 알려져 있고, 최근, 중증천식이나 COPD의 특징적인 병리소견인 호중구성 염증의 발생에 세균 유래 물질이 중요하다는 연구결과가 주목받고 있다. 특히, 실내 먼지내에 존재하는 병원성 세균에서 유래하는 세포밖 소포체가 천식과 COPD의 발생에 중요하다는 사실이 보고되고 있다. 또한, 비강 내에 공생하는 세균 및 세균유래 물질이 만성 부비동염(chronic rhinosinusitis)의 병인에 중요한 역할을 담당하는데, 비강 내에 존재하는 세균총의 다양성 감소와 특정 병원균, 특히 포도상구균의 증가가 만성 부비동염의 발생에 중요하다고 보고되고 있다.
세균은 이중막 구조의 단백질지질로서 흔히 나노소포 혹은 나노소포체(nanovesicles)라고도 불리는 세포밖 소포체(extracellular vesicles, EVs)를 세포 밖 환경으로 분비한다. 그람음성균(gram-negative bacteria) 유래 세포밖 소포체, 또는 외막 소포체(outer membrane vesicles, OMVs)는 내독소(lipopolysaccharide) 뿐만 아니라 독성 단백질 및 세균의 DNA와 RNA도 가지고 있고, 그람양성균(gram-positive bacteria) 유래 세포밖 소포체는 독성 단백질과 핵산 외에도 세균의 세포벽 구성성분인 펩티도글리칸(peptidoglycan)과 리포테이코산(lipoteichoic acid)도 가지고 있다. 대표적인 그람양성균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에서 분비되는 세포밖 소포체는 아토피피부염, 만성 부비동염, 호중구성 천식, COPD의 중요한 원인 인자임이 최근 보고되었고, 병원성 그람음성균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter bacumannii) 등에서 유래하는 세포밖 소포체가 실내 먼지에 다량 존재하고, 흡입 시 천식, COPD, 폐암의 중요한 원인 인자임이 보고되었다.
한편, 환경 유전체학이라고도 불리는 메타게놈학은 환경에서 채취한 샘플에서 얻은 메타게놈 자료에 대한 분석학이라고 할 수 있다. 최근 16S 리보솜 RNA(16S rRNA) 염기서열을 기반으로 한 방법으로 인간의 미생물총의 세균 구성을 목록화하는 것이 가능해졌으며, 16S 리보솜 RNA는 454FLX titanium platform을 이용하여 서열을 분석한다. 그동안 환자 샘플에서 분석한 메타게놈에 대한 연구가 수행되어왔으나, 혈청이나 소변 내에는 세균 유래 세포밖 소포체가 존재한다는 사실이 잘 알려져 있지 않았으므로 혈청이나 소변에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포체를 대상으로 한 메타게놈 분석 연구가 수행되지 않았다. 또한, 환자의 혈청이나 소변에서 분리한 세포밖 소포체의 DNA를 이용한 메타게놈 분석 결과를 바탕으로 세균 유래 세포밖 소포체를 통해 아토피피부염, 천식, COPD, 만성 비염, 만성 부비동염, 및 패혈증 등의 염증질환의 예방 또는 치료를 위해 이용한 경우는 없는 실정이다.
본 발명자들은, 아토피피부염 환자와 정상인의 소변에서 분리한 세포밖 소포체의 DNA를 이용하여 메타게놈 분석을 수행한 결과, 아토피피부염 환자에 비하여 정상인의 소변에서 유산균 유래 세포밖 소포체가 현저히 증가되어 있고, 상기 유산균 유래 세포밖 소포체가 염증질환의 주요 원인 인자인 황색포도상구균(S. aureus) 및 녹농균(P. aeruginosa) 유래 세포밖 소포체에 의해 유도되는 염증반응을 효율적으로 억제함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 아토피피부염의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는, 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는, 염증질환의 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는, 염증질환의 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는, 염증질환의 예방 또는 치료용 흡입제 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillales) 목 세균일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 락토바실러스(Lactobacillales) 목 세균은 락토코쿠스(Lactococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 또는 류코노스톡(Leuconostoc) 속 세균일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 락토바실러스(Lactobacillus) 속 세균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포밖 소포체는 평균 직경이 10~300 nm인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포밖 소포체는 유산균 배양액에서 분리되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포밖 소포체는 유산균에서 자연적으로 또는 인공적으로 분비되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 염증질환은 아토피피부염, 만성 비염, 만성 부비동염, 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 및 패혈증으로 이루어진 군에서 선택되는 질환일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 아토피피부염의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
(a) 임상샘플에서 분리한 세포밖 소포체로부터 유전자를 추출하는 단계;
(b) 상기 유전자에 대하여 염기서열을 분석하는 단계; 및
(c) 상기 염기서열 분석을 통하여 유산균 유래 세포밖 소포체의 분포가 정상인에 비하여 낮을 경우 아토피피부염의 유발 위험성이 높을 것으로 판정하는 단계.
본 발명의 일 구현예로, 상기 유전자는 DNA 또는 RNA일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 임상샘플은 소변 또는 혈액일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 염기서열 분석은 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 이루어지는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 유산균 유래 세포밖 소포체의 염증질환의 예방 또는 치료용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 유산균 유래 세포밖 소포체의 염증질환의 진단용도를 제공한다.
본 발명자들은 아토피피부염 환자에 비하여 정상인에서 유산균 유래 세포밖 소포체가 현저히 많이 분포되어 있고, 포도상구균 또는 슈도모나스균 유래 세포밖 소포체 노출에 의한 상피세포 및 염증세포의 염증반응이 유산균 유래 세포밖 소포체에 의해 효율적으로 억제되는 것을 in vitro 및 in vivo 실험을 통해 확인하였는바, 상기 유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물은 아토피피부염, 만성비염, 만성부비동염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 또는 패혈증 등의 염증질환을 예방, 개선, 또는 치료하기 위한 의약품, 화장품, 또는 건강기능식품 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
또한, 소변 또는 혈액 샘플에서 유산균 유래 세포밖 소포체의 분포를 측정함으로써 아토피피부염을 진단하는 데에도 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1은, 장내 세균인 슈도모나스 세드리나(P. cedrina)와 슈도모나스 파나시스(P. panacis)를 체외에서 배양한 후 배양액에서 세포밖 소포체를 분리하여 각각 P. cedrina와 P. panacis 유래 세포밖 소포체(EVs)를 전자현미경으로 관찰한 결과이다.
도 2는, 슈도모나스 세드리나(P. cedrina)와 슈도모나스 파나시스(P. panacis) 유래 세포밖 소포체(EVs)의 크기를 동적광산란법(dynamic light scattering) 방법으로 측정한 결과이다.
도 3은, 슈도모나스 세드리나(P. cedrina)와 슈도모나스 파나시스(P. panacis) 세균 및 이들 세균 유래 세포밖 소포체에 포함된 단백질의 발현양상을 평가하기 위해 SDS-PAGE를 수행한 후 CBB-R-250으로 겔을 염색한 결과이다.
도 4는, 슈도모나스 파나시스(P. panacis) 세균(bacteria)과 P. panacis 유래 세포밖소포체(EV)를 마우스에 경구로 투여한 후, 일정 시간 후 마우스 체내에서 세균과 세포밖 소포체의 분포를 whole body image로 촬영한 결과이다.
도 5는, 슈도모나스 파나시스(P. panacis) 세균(bacteria)과 P. panacis 유래 세포밖 소포체(EV)를 마우스에 경구로 투여한 후, 투여 12시간째에 혈액(blood)과 심장(heart), 폐(lung), 간(liver), 및 신장(kidney)을 적출하여 상기 세균(bacteria)과 세포밖 소포체(EV)의 분포를 촬영한 결과이다.
도 6은, 장내에 직접 슈도모나스 파나시스(P. panacis) 유래 세포밖 소포체(EV)를 투여한 후, 투여 10분 후에 장내 모세혈관에 세포밖 소포체가 존재함을 보여주는 결과이다.
도 7은, 아토피피부염 환자들의 소변과 혈청에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포체의 분포를 비교하기 위해 세균 문(phylum) 수준에서 메타게놈 분석을 수행한 결과이다.
도 8은, 아토피피부염 환자들의 소변과 혈청에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포체의 분포를 비교하기 위해 세균 강(class) 수준에서 메타게놈 분석을 수행한 결과이다.
도 9는, 아토피피부염 환자들의 소변과 혈청에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포체의 분포를 비교하기 위해 세균 목(order) 수준에서 메타게놈 분석을 수행한 결과이다.
도 10은, 아토피피부염 환자들의 소변과 혈청에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포체의 분포를 비교하기 위해 세균 과(family) 수준에서 메타게놈 분석을 수행한 결과이다.
도 11은, 아토피피부염 환자들의 소변과 혈청에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포체의 분포를 비교하기 위해 세균 속(genus) 수준에서 메타게놈 분석을 수행한 결과이다.
도 12는, 아토피피부염 환자와 정상인의 소변에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포체의 분포를 확인하기 위해 세균 문(phylum) 수준에서 메타게놈 분석을 수행한 결과이다.
도 13은, 아토피피부염 환자와 정상인의 소변에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포체의 분포를 확인하기 위해 세균 강(class) 수준에서 메타게놈 분석을 수행한 결과이다.
도 14는, 아토피피부염 환자와 정상인의 소변에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포체의 분포를 확인하기 위해 세균 목(order) 수준에서 메타게놈 분석을 수행한 결과이다.
도 15는, 아토피피부염 환자와 정상인의 소변에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포체의 분포를 확인하기 위해 세균 과(family) 수준에서 메타게놈 분석을 수행한 결과이다.
도 16은, 아토피피부염 환자와 정상인의 소변에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포체의 분포를 확인하기 위해 세균 속(genus) 수준에서 메타게놈 분석을 수행한 결과이다.
도 17은, 아토피피부염 환자와 정상인의 소변에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포체의 메타게놈 분석결과를 heat map으로 표현한 결과이다.
도 18은, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 배양액서 분리한 세포밖 소포체를 전자현미경으로 관찰한 사진이다.
도 19는, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 배양액서 분리한 세포밖 소포체를 동적광산란법으로 크기를 측정한 결과이다.
도 20은, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 배양액서 분리한 세포밖 소포체를 Nanotrafficking assay(NTA) 방법을 통해 소포체 개수를 측정한 결과이다.
도 21은, 피부상피세포에 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체(S. aureus EV), 여드름균 유래 세포밖 소포체(P. acnes EV), 및 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133 EV)를 투여한 후, ELISA 방법으로 IL-6 분비량을 측정한 결과이다.
도 22는, 피부상피세포에 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체(S. aureus EV), 또는 여드름균 유래 세포밖 소포체(P. acnes EV)를 투여하기 12시간 전에 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133 EV)를 투여한 후, ELISA 방법으로 IL-6 분비량을 측정한 결과이다.
도 23은, 복강대식세포에 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체(S. aureus EV), 또는 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133 EV)를 투여한 후, ELISA 방법을 통해 IL-6와 TNF-α 분비량을 측정한 결과이다.
도 24는, 복강대식세포에 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체(S. aureus EV)를 투여하기 12시간 전에 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133 EV)를 투여한 후, ELISA 방법을 통해 IL-6와 TNF-α 분비량을 측정한 결과이다.
도 25는, 피부상피세포에 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체(S. aureus EV)를 투여하기 12시간 전에 유산균 유래 소포체(CJLP133 EV)를 투여한 후, MTT assay를 통해 세포사멸 정도를 평가한 결과이다.
도 26은, 복강대식세포에 녹농균 유래 세포밖 소포체(P. aeruginosa EV)를 투여하기 12시간 전에 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133 EV)를 투여한 후, ELISA 방법을 통해 IL-6와 TNF-α 분비량을 측정한 결과이다.
도 27은, 복강대식세포에 녹농균 유래 세포밖 소포체(P. aeruginosa EV)를 투여하면서, 동시에 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133 EV)를 투여한 후, ELISA 방법을 통해 IL-6와 TNF-α 분비량을 측정한 결과이다.
도 28은, 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체(S. aureus EV)에 의한 아토피피부염 마우스모델에서 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133 EV) 피부투여에 의한 치료효과를 평가하기 위한 프포토콜을 도시한 것이다.
도 29는, 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체(S. aureus EV)에 의한 아토피피부염 마우스모델에서 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133 EV)를 피부로 투여한 후, 치료효과를 평가한 피부사진이다.
도 30은, 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체(S. aureus EV)에 의한 아토피피부염 마우스모델에서 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133 EV)를 피부로 투여한 후, 피부조직에서 IL-17의 농도를 측정한 결과이다.
도 31은, 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체(S. aureus EV)에 의한 아토피피부염 마우스모델에서 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133 EV)의 경구 투여에 의한 치료효과를 평가하기 위한 프포토콜을 도시한 것이다.
도 32는, 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체(S. aureus EV)에 의한 아토피피부염 마우스모델에서 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133 EV)를 경구 투여한 후, 치료효과를 평가한 피부사진이다.
도 33은, 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체(S. aureus EV)에 의한 아토피피부염 마우스모델에서 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133 EV)를 경구 투여한 후, 피부조직에서 면역반응 지표인 IL-4, IL-6, IL-17, 및 IFN-γ의 농도를 측정한 결과이다.
도 34는, 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133 EV)의 고용량 경구투여에 의한 독성을 평가하기 위한 프로토콜을 도시한 것이다.
도 35는, 고용량의 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133 EV)를 경구로 다회 투여한 후, 체중의 변화를 측정한 결과이다.
도 36은, 고용량의 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133 EV)를 경구로 다회 투여한 후, 마우스의 사료 섭취량을 측정한 결과이다.
도 37은, 고용량의 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133 EV)를 경구로 다회 투여한 후, 체온 변화를 측정한 결과이다.
도 38은, 고용량의 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133 EV)를 경구로 다회 투여한 후, 혈액 내 혈구의 변화를 측정한 결과이다(WBC: 백혈구 수, RBC: 적혈구 수, HGB: 헤모글로빈 농도, HCT: 원심분리 혈장, MCV: 적혈구 평균 부피, MCH: 평균 헤모글로빈 수, MCHC: 평균 헤모글로빈 농도, PLT: 혈소판 수).
아토피피부염 환자와 정상인의 소변에서 분리한 세포밖 소포체의 DNA를 이용하여 메타게놈 분석을 수행한 결과 아토피피부염 환자에 비하여 정상인의 소변에서 유산균 유래 세포밖 소포체가 현저히 증가되어 있고, 상기 유산균 유래 세포밖 소포체가 염증질환의 주요 원인인자인 황색포도상구균(S. aureus) 및 녹농균(P. aeruginosa) 유래 세포밖 소포체에 의해 유도되는 염증반응을 효율적으로 억제함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, 장내 세균인 슈도모나스 세드리나(Pseudomonas cedrina)와 슈도모나스 파나시스(Pseudomonas panacis)에서 세포밖 소포체를 분리하여 마우스에 상기 세균과 이들 세균 유래 세포밖 소포체를 경구 투여함으로써 체내 분포와 배설양상을 확인한 결과, 장내 세균인 경우 전신에 흡수되지 않는 반면 이들 장내 세균 유래 세포밖 소포체의 경우에는 전신적으로 흡수되어 소변으로 배설됨을 확인하였다(실시예 1 및 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 아토피피부염 환자의 소변 및 혈청에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포체의 DNA를 이용하여 각각 세균 문(phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 속(genus) 수준에서 메타게놈 분석을 수행한 결과 소변과 혈청의 세균 유래 세포밖 소포체의 분포가 정확히 일치함을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 결과를 바탕으로 아토피피부염 환자와 정상인의 소변에서 분리한 세포밖 소포체의 DNA를 이용하여 메타게놈 분석을 수행하였다. 각각 세균 문(phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 속(genus) 수준에서 세포밖 소포체의 분포를 분석한 결과, 정상인에 비하여 아토피피부염 환자의 소변에는 알리사이클로바실러스(Alicyclobacillus) 속, 메틸로박테리움(Methylobacterium) 속, 스트렙토피타(Streptophyta) 목, 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속, 및 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균 유래 세포밖 소포체가 현저히 증가되어있었다. 반면에 락토바실러스(Lactobacillales) 목, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 락토코쿠스(Lactococcus) 속 세균 유래 세포밖 소포체가 현저히 감소되어 있음을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 메타게놈 결과를 바탕으로 발효식품에서 분리한 유산균인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 체외에서 배양한 후, 세포밖 소포체를 분리하여 특성을 분석한 결과, 평균 직경이 약 15 nm인 원형모양의 소포체를 분리할 수 있었고(실시예 5 참조), 상기 소포체를 피부 상피세포와 대식세포에 처리한 후, 염증질환의 주요 원인 인자인 황색포도상구균과 녹농균에서 분비되는 세포밖 소포체 처리에 의해 유도되는 염증반응이 현저하게 억제됨을 확인하였다(실시예 6 내지 9 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 in vitro 실험결과를 바탕으로 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체에 의한 아토피피부염 마우스모델에 유산균 유래 소포체를 경구 혹은 피부로 투여하였을 때, 황색포도상구균 유래 소포체에 의한 피부염증이 유산균 유래 소포체에 의해 효율적으로 억제됨을 확인하였으며(실시예 10 및 11 참조), 고용량의 유산균 유래 세포밖 소포체를 마우스에 다회 경구 투여한 결과 다양한 생체지표에서 대조군과의 차이가 없는 것을 확인하여 상기 세포밖 소포체의 안전성을 확인하였다(실시예 12참조).
이에, 본 발명은 유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “염증질환(Inflammatory disease)"이란, 세균 또는 세균 유래 소포체, 독소, 바이러스, 또는 곰팡이 등의 감염성 인자에 의해 유도되는 감염성 염증질환, 알레르겐 노출에 의해 유도되는 알레르기성 염증질환, 자가 항원에 대한 자가면역성 염증질환 등을 특징으로 하는 질환을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “감염성 염증질환(inflammatory disease)”이란, 감염성 인자에 의해 발생하는 염증질환을 총칭하는 것으로서, 아토피피부염, 만성 비염, 만성 부비동염, 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 패혈증 등을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “알레르기성 염증질환(inflammatory disease)”이란, 알레르겐에 의해 발생하는 염증질환을 총칭하는 것으로서, 아토피피부염, 만성 비염, 만성 부비동염, 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD) 등을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “아토피피부염(atopic dermatitis)”이란, 피부에 만성적으로 발생하는 가려움증을 동반한 피부질환을 총칭한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 염증질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 염증질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillales) 목, 락토코쿠스(Lactococcus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 또는 류코노스톡(Leuconostoc) 속 세균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 락토바실러스 속 세균은 바람직하게는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 세포밖 소포체는 유산균의 배양액 또는 유산균으로 발효시킨 식품에서 분리될 수 있으며, 유산균으로부터 자연적으로 또는 인공적으로 분비된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 유산균의 배양액 또는 발효식품에서 세포밖 소포체를 분리하는 방법은 세포밖 소포체를 포함한다면 특별히 제한되지 않는다. 예컨대 원심분리, 초고속 원심분리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 또는 모세관 전기영동 등의 방법, 및 이들의 조합을 이용하여 세포밖 소포체를 분리할 수 있으며, 또한 불순물의 제거를 위한 세척, 수득된 세포밖 소포체의 농축 등의 과정을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 방법에 의하여 분리된 세포밖 소포체는 평균 직경이 10~300 nm일 수 있으며, 바람직하게는 10~200 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 염증질환의 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 유산균 유래 세포밖 소포체뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 유산균 유래 세포밖 소포체뿐만 아니라, 피부보호 효과를 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 유기 자외선 차단제를 혼합하여 사용할 수도 있다. 상기 유기 자외선 차단제로는 글리세릴파바, 드로메트리졸트리실록산, 드로메트리졸, 디갈로일트리올리에이트, 디소듐페닐디벤즈이미다졸테트라설포네이트, 디에틸헥실부타미도트리아존, 디에틸아미노하이드록시벤조일헥실벤조에이트, 디이에이-메톡시신나메이트, 로우손과 디하이드록시아세톤의 혼합물, 메틸렌비스-벤조트리아졸릴테트라메칠부틸페놀, 4-메틸벤질리덴캠퍼, 멘틸안트라닐레이트, 벤조페논-3(옥시벤존),벤조페논-4, 벤조페논-8(디옥시페벤존), 부틸메톡시디벤조일메탄, 비스에틸헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진, 시녹세이트, 에틸디하이드록시프로필파바, 옥토크릴렌, 에틸헥실디메틸파바, 에틸헥실메톡시신나메이트, 에틸헥실살리실레이트, 에틸헥실트리아존, 이소아밀-p-메톡시신나메이트, 폴리실리콘-15(디메치코디에틸벤잘말로네이트), 테레프탈릴리덴디캠퍼설포닉애씨드 및 그 염류, 티이에이-살리실레이트 및 아미노벤조산(파바)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.
또한, 본 발명은 유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 염증질환의 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “개선”이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물에서 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 치료용 흡입제 조성물을 제공한다.
본 발명의 흡입제 조성물에서 유효성분을 흡입제에 그대로 첨가하거나 다른 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 치료용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 임상샘플에서 분리한 세포밖 소포체로부터 유전자를 추출하는 단계; 상기 유전자에 대하여 염기서열을 분석하는 단계; 및 상기 염기서열 분석을 통하여 유산균 유래 세포밖 소포체의 분포가 정상인에 비하여 낮을 경우 아토피피부염의 유발 위험성이 높을 것으로 판정하는 단계를 포함하는 아토피피부염의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "아토피피부염의 진단을 위한 정보제공방법"은 진단을 위한 예비적 단계로써 아토피피부염의 진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.
상기 유전자는 DNA 또는 RNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 임상샘플은 소변 또는 혈액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 염기서열 분석은 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 장내 세균 유래 세포밖 소포체의 분리 및 특성 평가
장내 세균인 슈도모나스 세드리나(Pseudomonas cedrina)와 슈도모나스 파나시스(Pseudomonas panacis) 균주에서 세포밖 소포체를 분리하고, 그 특성을 분석하기 위해 상기 두 가지 균주를 LB broth(Luria-Bertani broth)에서 각각 30℃, 25℃ 조건하에서 배양하였다. 상기 세균 배양액을 5,000 g에서 30분간 2번에 걸쳐 원심분리한 후 상층액을 0.45 ㎛ bottle-top filter(Corning)를 이용하여 필터링하고, 용출된 시료를 QuixStand™(GE Healthcare Bio-Sciences AB)를 이용하여 농축하였다. 농축된 시료를 0.22 ㎛ bottle-top filter(Corning)를 이용하여 다시 한 번 필터링하여 세포밖 소포체를 분리하였으며, 세포밖 소포체의 단백질 농도는 BCA assay(Thermo Scientific)를 이용하여 정량하였다.
상기 세균 배양액에서 분리한 세포밖 소포체를 전자현미경으로 관찰하기 위해 생리식염수(PBS, 50 ㎍/㎖)에 있는 세포밖 소포체를 300-메시 구리 그리드(mesh copper grids)(Electron Microscopy Sciences)에 위치시킨 후, 2% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 12시간 동안 염색하였다. 이후 JEM1011 microscope(JEOL)를 이용하여 100 kV의 가속 전압 하에서 영상을 얻어 세포밖 소포체를 관찰하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 슈도모나스 세드리나(P. cedrina)와 슈도모나스 파나시스(P. panacis) 유래 세포밖 소포체(EVs)가 구형의 모양임을 관찰하였다. 또한, 상기 세균 배양액에서 분리한 세포밖 소포체의 크기를 동적광산란법(dynamic light scattering, DLS)으로 측정하기 위해 Zetasizer Nano S(Malvern Instruments Ltd., 633-nm laser line, scattered intensity 10 × 30 s)를 이용하여 세포밖 소포체의 직경을 측정하였다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 슈도모나스 세드리나(P. cedrina)와 슈도모나스 파나시스(P. panacis) 유래 세포밖 소포체의 직경은 각각 30-40 nm, 20-30 nm로 측정되었다.
다음으로, 상기 두 가지 세균과 이들 세균 유래 세포밖 소포체에 포함된 단백질의 발현양상을 평가하기 위해, 단백질 시료로 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis; SDS-PAGE)을 수행하였다. 15% resolving gel을 이용하여 상기 세균 세포 자체에서 얻은 whole-cell lysate(WCL)와 이들 세균 유래 세포밖 소포체(EV)를 겔에 로딩한 후 전기영동을 수행하였으며, 단백질이 크기별로 분리된 겔을 CBB R-250(Coomassie Brilliant Blue R-250)으로 염색하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 두 가지 세균과 이들 세균에서 유래한 세포밖 소포체는 단백질 구성에서 서로 다른 양상을 보임을 확인하였다.
실시예 2. 슈도모나스 파나시스 세균 및 슈도모나스 파나시스 유래 세포밖 소포체의 체내 흡수, 분포, 및 배설 양상 평가
슈도모나스 파나시스(P. panacis) 세균과 슈도모나스 파나시스(P. panacis) 유래 세포밖 소포체를 경구 투여하였을 때 체내 흡수, 분포, 및 배설 양상을 평가하기 위해 잭슨 연구소에서 받은 C57BL/6J(6~8-wk-old) 수컷 마우스를 사용하여 실험을 수행하였다.
슈도모나스 파나시스(P. panacis) 세균과 상기 세균 유래 세포밖 소포체를 상온에서 1시간 동안 Cy7(GE Healthcare)으로 라벨링한 후 20 ㎍/mouse의 용량으로 마우스를 야간 공복 시킨 뒤 위로 급식하였다. 0시간(h), 5분(min), 3시간(h), 및 12시간(h) 후에 IVIS spectrum CT(SelectScience)를 이용하여 780-800 nm 파장(wavelength)에서 마우스의 전신 이미지를 촬영하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 슈도모나스 파나시스 세균(Bacteria)의 경우, 경구 투여 5분 후 위에 존재하였고, 이후 체내에 흡수되지 않고 배설되었다. 반면, 슈도모나스 파나시스 유래 세포밖 소포체(EV)의 경우에는 경구 투여 5분 후에는 전신적으로 흡수되었고, 투여 3시간째에는 심혈관계, 폐, 간에 분포하였으며, 방광으로 배설됨을 확인하였다. 이후, 상기 세균 및 세균 유래 세포밖 소포체의 조직 분포를 평가하기 위해 경구 투여 12시간째 심장(heart), 폐(lung), 간(liver), 및 신장(kidney)을 적출하고 혈액(blood)을 채취하여 IVIS spectrum CT로 형광 물질을 검출하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 슈도모나스 파나시스 유래 세포밖 소포체의 경우 혈액, 심장, 폐, 간, 신장에 존재하였으며, 슈도모나스 파나시스 세균의 경우에는 존재하지 않는 것을 확인하였다.
더욱이, 실제로 세균 유래 세포밖 소포체가 장에서 장내 혈관으로 흡수되는지를 확인하여 위하여, 야간 공복 시킨 마우스에서 대장을 적출하여 대장의 양측을 밀봉하고 초록 형광을 나타내는 GFP 10 ㎍으로 라벨링된 슈도모나스 파나시스 유래 세포밖 소포체를 장내로 주사하였다. 이후 대장 고유판의 혈액은 TCS SP5 microscope(Leica)를 이용하여 영상을 얻었다.
투여 10분 후에 이광자현미경(two-photon microscopy)을 통해 이미지를 얻은 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 세포밖 소포체가 모세혈관에 존재하는 것을 확인하였다.
실시예 3. 아토피피부염 환자의 소변과 혈청을 이용한 세균 유래 세포밖 소포체의 메타게놈 분석
3-1. 아토피피부염 환자의 소변 및 혈청으로부터 세포밖 소포체 분리
상기 실시예 2에서 세균 유래 세포밖 소포체가 체내로 흡수된 후 소변으로 배설되고 혈액에도 분포하여 존재한다는 결과를 바탕으로, 아토피피부염 환자의 소변과 혈청에 존재하는 세균 유래 세포밖 소포체를 분리하고 이에 포함된 DNA를 추출하였다.
아토피피부염 환자는 순천향대학교 서울병원 소아 알레르기 호흡기 센터를 방문한 환자 중 Hanifin과 Rajka의 아토피피부염 진단 기준을 만족하는 만 17세 이하 아토피피부염 환자를 대상으로 하였다. 다른 피부 질환을 동반하고 있거나, 최근 14일 이내 항생제 성분의 외용제, 경구용 제제, 또는 주사 제제를 투여 받은 경우는 대상에서 제외하였다. 정상대조군은 아토피피부염을 포함한 다른 피부 질환이 없으며, 알레르기질환 및 의미 있는 다른 병력 및 약물 복용력이 없는 소아를 대상으로 하였다. 아토피피부염 환자와 정상대조군 중 본 연구에 동의한 환자들을 대상으로 소변 및 혈청을 얻었다. 이후 실시예 1의 방법으로 소변 및 혈청으로부터 세포밖 소포체를 분리하고 고온에 끓여 DNA를 추출한 후 DNA의 양과 질은 다음 단계를 진행하기 전 nano-drop으로 측정하였다.
3-2. 소변 및 혈청에 존재하는 세포밖 소포체에서 분리한 DNA 메타게놈 분석
실시예 3-1의 방법으로 아토피피부염 환자의 소변 및 혈청에 존재하는 세포밖 소포체에서 분리한 DNA를 이용하여 메타게놈 분석을 실시하였다.
먼저, 각각의 클론을 V1-V3 region 증폭을 위한 16s rDNA fusion primer와 FastStart High Fidelity PCR System(Roche, Basel, Switzerland)을 이용하여 DNA 분석을 위해 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 수행하였다. 상기 16s rDNA fusion primer의 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
프라이머(primer) 서열
27F Forward 5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’
518R Reverse 5’-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’
PCR을 통한 증폭 반응은 에멀션 상태인 기름과 amplicon이 혼합된 상태로 진행되었고, GS-FLX plus emPCR Kit(454 Life Sciences)를 이용한 Tissue Lyser II(Qiagen)로 증폭 혼합물과 단독 입자를 포함한 미세 반응자(“micro-reactors”)를 만들기 위해 시행하였다. 에멀션은 96-well 플레이트에 나누어 담고, 각각 DNA 샘플 20 ng을 50 ㎕ PCR 반응에 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 PCR을 수행하였다(1단계: 94℃에서 3분간, 2단계: 94℃에서 15초간, 55℃에서 45초간, 72℃에서 1분간 35 사이클 수행, 마지막 단계: 72℃에서 8분간 시행). 에멀젼 PCR(emulsion PCR; emPCR)을 수행하여 각 DNA를 증폭한 후, amplicon은 AMpure Bead kit(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 이용하여 정제하고, Picogreen method(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 정량화하였다. 그 다음, amplicon은 희석하여 GS-FLX Titanium sequencer(Roche, Basel, Switzerland)를 이용하여 분석하였다. PCR 증폭 후, 에멀션은 화학적으로 분해되고 amplified DNA library를 가진 알갱이들은 여과를 통해 세척하였다. 양성인 비드(beads)는 biotinylated primer A(complementary to adaptor A)를 이용하여 정제하였고, streptavidin-coated magnetic beads에 붙게 하였다. 이후 magnetic beads에 붙은 DNA library beads를 이중나선 구조를 녹여서 magnetic beads에서 분리하고 단일가닥 DNA들은 흘러가게 하였다. 염기서열 primer는 다시 증폭된 단일가닥 DNA로 만들었다. 마지막으로, 증폭된 단일가닥 DNA를 가지고 있는 알갱이들을 Particle Counter(Beckman Coulter)를 이용하여 개수를 세었다. 염기서열 분석은 Genome Sequencer FLX titanium(454 Life Sciences)에서 하였고, 각각의 샘플들은 70 mm-75 mm PicoTiter plate(454 Life Sciences)의 각각에 로딩하였다.
생물정보학을 통한 메타게놈 분석을 위해 품질점수(평균 Phred 점수 > 20)와 read length(> 300 bp)를 체크하여 고품질의 서열들을 모았다. UCLUST와 USEARCH(Edgar, 2010)를 이용하여 Operational Taxonomy Unit(OUT)를 분석하였고, 계통학적 분류는 QIIME(Lozupone, et al., 2006)을 이용하여 분석하였다. 유사성에 기초하여, 모든 16s RNA 서열들은 다음의 계통학적 단계에 따라 분류하였다: 종(species) > 97% 유사성; 속(genus) > 94% 유사성 ; 과(family) > 90% 유사성; 목(order) > 85% 유사성; 강(class) > 80% 유사성; 문(phylum) > 75% 유사성. 속(genus) 단계의 세균 구성은 아토피피부염 환자와 정상대조군 사이에 2배 이상의 유의한 구성 차이가 보일 경우 heat map으로 그렸다. 계층적 클러스터링은 속(genus) 단계에서 아토피피부염 환자와 정상대조군 사이에 2배 이상의 유의한 구성 차이가 보이거나 1% 이상의 평균 구성을 보이는 경우 시행하였다.
3-3. 소변과 혈청에 존재하는 세균 유래 세포밖 소포체 분포의 연관성 분석
실시예 3-1의 방법으로 아토피피부염 환자의 소변과 혈청에 존재하는 세균 유래 세포밖 소포체에서 DNA를 분리한 후 실시예 3-2의 방법으로 메타게놈 분석을 통해 16S rDNA의 염기서열을 분석하여 상기 소변과 혈청에 존재하는 세균 유래 세포밖 소포체의 분포를 비교하였다.
도 7 내지 도 11에 각각 문(phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 속(genus) 수준의 메타게놈 분석 결과를 나타내었으며, 각 환자의 소변 샘플(boiled urine)의 세포밖 소포체 분포결과는 빨간 밑줄, 각 혈청 샘플(serum)의 세포밖 소포체 분포결과는 파란 밑줄로 표시하였다. 그 결과, 아토피피부염 환자의 소변에 존재하는 세균 유래 세포밖 소포체의 분포와 혈청에 존재하는 세균 유래 세포밖 소포체의 분포가 정확히 일치함을 알 수 있었다.
실시예 4. 아토피피부염 환자와 정상인 소변의 세균 유래 세포밖 소포체 분포 차이 분석
실시예 3-1 및 3-2의 방법으로 아토피피부염 환자와 정상인의 소변에 존재하는 세균 유래 세포밖 소포체의 분포 차이를 평가하였다.
도 12 내지 도 16에 각각 문(phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 속(genus) 수준의 메타게놈 분석 결과를 나타내었으며, 정상인(control) 소변 샘플의 세포밖 소포체 분포결과는 파란 밑줄, 아토피피부염 환자(case) 소변 샘플의 세포밖 소포체 분포결과는 빨간 밑줄로 표시하였다.
그 결과, 문(phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 속(genus) 수준에서 모두 아토피피부염 환자와 정상인의 소변에 존재하는 세균 유래 세포밖 소포체의 분포에 현저한 차이가 있음을 확인하였다. 보다 구체적으로, 도 17 및 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 소변에 1% 이상 존재하는 세균 유래 세포밖 소포체 중에서 정상인(control)에 비하여 아토피피부염 환자(case)의 소변에는 알리사이클로바실러스(Alicyclobacillus) 속 세균 유래 세포밖 소포체(정상인 vs. 아토피피부염 환자: 0.31% vs. 8.49%), 메틸로박테리움 (Methylobacterium) 속 세균 유래 세포밖 소포체(정상인 vs. 아토피피부염 환자: 0.22% vs. 2.02%), 스트렙토피타(Streptophyta) 목 세균 유래 세포밖 소포체(정상인 vs. 아토피피부염 환자: 2.87% vs. 7.89%), 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속 세균 유래 세포밖 소포체(정상인 vs. 아토피피부염 환자: 2.78% vs. 7.6%), 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균 유래 세포밖 소포체(정상인 vs. 아토피피부염 환자: 9.56% vs. 21.91%) 등이 현저히 증가되어 있었다. 반면, 소변에 1% 이상 존재하는 세균 유래 세포밖 소포체 중에서 정상인에 비하여 아토피피부염 환자의 소변에는 락토바실러스(Lactobacillus) 속 세균 유래 세포밖 소포체(정상인 vs. 아토피피부염 환자: 20.92% vs. 4.61%), 류코노스톡(Leuconostoc) 속 세균 유래 세포밖 소포체(정상인 vs. 아토피피부염 환자: 14.60% vs. 0.12%), 락토바실러스(Lactobacillales) 목 세균 유래 세포밖 소포체(정상인 vs. 아토피피부염 환자: 18.19% vs. 0.05%), 락토코쿠스(Lactococcus) 속 세균 유래 세포밖 소포체(정상인 vs. 아토피피부염 환자: 11.57% vs. 0.03%) 등이 현저히 감소되어 있음을 확인하였다.
Figure pat00001
실시예 5. 유산균 배양액에서 세포밖 소포체 분리 및 특성 분석
상기 실시예 4의 결과를 통해 락토바실러스 목 세균 및 락토바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체가 정상인에 비해 아토피피부염 환자 소변에서 현저히 감소되어 있는 것을 확인하였으므로, 락토바실러스 유래 세포밖 소포체가 면역반응 및 염증반응에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
이를 위해, 김치에서 분리한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 유산균을 배양하고, 유산균 배양액을 10,000 x g 에서 20분 동안 원심분리한 후, 상등액만을 수거해 0.22 mm filter에서 여과하였다. 분리된 여과액을 100 kDa 보다 큰 것만 일정량으로 농축한 후, 150,000 x g, 4℃에서 3시간 동안 초고속 원심분리를 수행하였고, 상등액을 버리고 남은 세포밖 소포체 덩어리를 여과된 생리식염수(PBS)로 희석한 후 BCA protein assay (Pierce, 미국)로 농도를 정량하였다. 이후 상기 유산균으로부터 분리한 세포밖 소포체의 물리적 특성이 동일한지를 확인하기 위해 동적광산란법(Dynamic light scattering) 및 전자현미경관찰을 실시하였다.
전자현미경 관찰 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, 상기 유산균 유래 세포밖 소포체가 구형의 형태를 가지는 것을 관찰하였으며, 동적광산란법을 통해 도 19와 같이 평균적으로 약 15 nm 정도의 직경을 가지는 것을 확인하였다.
다음으로, 분리된 세포밖 소포체의 양을 확인하기 위해 나노사이트(Nanoparticle tracking analysis: LM-10HS)를 수행하였다. 500 ng/㎖ 농도로 맞춘 세포밖 소포체 샘플을 2 ㎖ 준비하고, 샘플 0.3 내지 0.4 ㎖를 LM-10HS 기기의 챔버에 올려놓은 후 카메라를 이용하여 초점을 맞추어서 입자(particle)가 선명하게 보이도록 하였다. 초점이 맞추어진 상태에서 카메라의 레벨을 최대로 올린 후 레벨을 한 단계씩 내려가면서 샘플의 캡쳐(capture)하여 샘플의 드리프트(drift)가 없는지 확인하였다. 샘플의 농도, 초점과 드리프트가 없는지 확인한 후 캡쳐 간격(duration)을 30초로 맞추어 놓고 데이터를 얻어 확인하였다. 그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이, 세포밖 소포체는 단백질 1㎍ 기준 2.47 x 108 개가 존재함을 확인하였다.
실시예 6. 피부상피세포의 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체 자극에 의한 면역반응 발생에서 유산균 유래 세포밖 소포체의 면역조절 효과 확인
염증반응의 발생에서 유산균 유래 세포밖 소포체의 효능을 알아보기 위해, 피부 상피세포주(HaCaT) 2 x 105 cells에 염증질환의 주요 원인 인자로 알려져 있는 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체(S. aureus EV) 및 여드름 균(P. acnes EV) 유래 세포밖 소포체와 상기 실시예 5의 방법으로 분리한 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133 EV)를 각각 10 ng ~ 25 ㎍/㎖ 농도로 처리하고 12시간 동안 배양한 후 상등액에서 Th17 면역반응을 유발하는 사이토카인(cytokine)인 IL-6 분비량을 ELISA를 통해 측정하였다. 그 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이, 황색포도상구균 및 여드름균 유래 소포체에 비하여 상기 유산균 유래 세포밖 소포체를 처리한 경우 IL-6의 분비량이 훨씬 낮게 나타났다.
또한, 상기 유산균 유래 세포밖 소포체를 피부상피세포에 다양한 농도(0.1, 1, 10 ㎍/㎖)로 12시간 전에 처리하고, 25 ㎍/㎖ 농도의 황색포도상구균 또는 여드름균 유래 소포체를 상기 피부상피세포에 처리하여 12시간 동안 배양한 후 상등액에서 염증성 사이토카인인 IL-6 분비량을 ELISA법으로 확인하였다. 그 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이, 유산균 유래 세포밖 소포체(S. aureus EV)를 전 처리한 경우, 황색포도상구균 유래 소포체에 의한 IL-6 분비가 농도 의존적으로 감소한 반면, 여드름균 유래 소포체(P. acnes EV)에 의한 IL-6 분비에는 유산균 유래 세포밖 소포체의 효과가 나타나지 않았다.
이러한 결과는 유산균 유래 세포밖 소포체가 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체에 의한 Th1 매개 면역반응 및 염증반응을 억제하고, 이는 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체에 의한 면역기능 이상에 특이적으로 작용함을 의미한다.
실시예 7. 염증세포의 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체 자극에 의한 염증반응의 발생에서 유산균 유래 세포밖 소포체의 항염증 효과 확인
염증세포에서 황색포도상구균에 유래 세포밖 소포체에 의한 염증반응 발생에 유산균 유래 세포밖 소포체가 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. 먼저, 염증세포인 마우스 복강대식세포주(Raw 264.7)에 1 ㎍의 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체(S. aureus) 또는 10 ng, 100 ng, 또는 1 ㎍의 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133)를 12시간 동안 처리한 후 복강대식세포에서 분비되는 염증성 사이토카인인 IL-6와 TNF-α의 양을 측정하여 비교하였다. 그 결과, 도 23에 나타낸 바와 같이, 유산균 유래 세포밖 소포체를 처리한 경우 농도에 관계없이 황색포도상구균 유래 소포체를 처리한 경우에 비해 IL-6 및 TNF-α의 분비가 현저히 감소하였다. 이는 황색포도상구균 유래 소포체에 비하여 유산균 유래 세포밖 소포체가 체내에 흡수되었을 때, 훨씬 안전함을 의미한다.
상기 결과를 바탕으로, 마우스 복강대식세포주에 유산균 유래 세포밖 소포체를 다양한 농도(0.01, 0.1, 1 ㎍/㎖ 농도)로 처리하고, 12시간 후에 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체를 1㎍/㎖의 농도로 처리한 다음 12시간 후 ELISA를 통해 염증성 사이토카인인 IL-6와 TNF-α의 양을 측정하였다. 그 결과, 도 24에 나타낸 바와 같이, 유산균 유래 세포밖 소포체를 전 처리 한 경우, 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체에 의한 IL-6 및 TNF-α 분비가 억제되는 것을 확인하였다. 이는, 유산균 유래 세포밖 소포체가 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체에 의해 유도되는 염증세포에 의한 염증반응을 효율적으로 억제할 수 있음을 의미한다.
실시예 8. 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체 자극에 의한 피부상피세포 사멸에서 유산균 유래 세포밖 소포체의 사멸 억제효과 확인
황색포도상구균 유래 세포밖 소포체에 의한 피부상피세포의 사멸에서 유산균 유래 세포밖 소포체의 사멸 억제효과를 평가하기 위하여, 피부상피세포에 실시예 6과 동일한 농도 및 조건으로 유산균 유래 세포밖 소포체를 전 처리한 후 황색포도상구균 유래 소포체(S. aureus EV)를 25㎍ 농도로 24시간 동안 처리하고 MTT assay(Sigman, 미국)를 실시하였다. 그 결과, 도 25에 나타낸 바와 같이, 황색포도상구균 유래 소포체에 의한 피부상피세포 사멸이 유산균 유래 세포밖 소포체를 0.1 ㎍/㎖ 또는 1 ㎍/㎖ 농도로 처리한 경우 효율적으로 억제됨을 확인하였다.
실시예 9. 녹농균 유래 세포밖 소포체에 의한 염증 발생에서 유산균 유래 세포밖 소포체의 항염증 효과 확인
녹농균(P. aeruginosa)은 슈도모나스(Pseudomonas) 속에 속하는 주요 병원성 세균으로서, 항생제 내성을 잘 일으키고, 패혈증의 주요 원인 세균으로 알려져 있다. 최근 녹농균 유래 세포밖 소포체가 기도를 통한 반복 노출에 의하여, 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 폐암 등과 같은 만성폐질환의 주요 원인 인자로 알려지게 되었다. 이러한 배경하에, 녹농균 유래 소포체에 의한 염증반응의 발생에 있어서 유산균 유래 세포밖 소포체의 항염증 효과를 평가하고자 하였다.
이를 위해, 염증세포인 복강대식세포주(Raw 264.7)에 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133 EV)를 다양한 농도(0.01, 0.1, 1 ㎍/㎖)로 처리하고 12시간 후 녹농균 유래 세포밖 소포체(P. aeruginosa EV)를 1㎍/㎖ 농도로 처리하고 염증성 사이토카인인 IL-6 및 TNF-α의 농도를 ELISA법으로 측정하였다. 그 결과, 도 26에 나타낸 바와 같이, 녹농균 유래 소포체 자극에 의한 IL-6 및 TNF-α의 분비가 유산균 유래 세포밖 소포체의 처리농도에 비례하게 거의 완벽하게 억제되는 것을 확인하였다.
또한, 녹농균 유래 세포밖 소포체와 유산균 유래 세포밖 소포체를 복강대식세포주에 동시에 처리하고 염증성 사이토카인의 분비양상을 평가한 결과, 도 27에 나타낸 바와 같이, 녹농균 유래 세포밖 소포체 자극에 의한 IL-6 및 TNF-α 분비가 유산균 유래 소포체에 처리에 의하여 현저히 억제되는 것을 확인하였다. 이상의 결과는 만성폐질환, 패혈증의 원인인자로 알려진 녹농균 유래 소포체에 의한 염증 발생이 유산균 유래 소포체에 의해 효율적으로 억제될 수 있음을 의미한다.
실시예 10. 유산균 유래 세포밖 소포체 피부투여에 의한 황색포도상구균 유래 소포체에 의한 아토피피부염 발생 억제효과 확인
상기 실시예 6 내지 8을 통해 유산균 유래 세포밖 소포체의 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체에 의한 면역조절, 항염증, 및 피부세포 사멸 억제효과를 확인하였으므로, 실제로 유산균 유래 세포밖 소포체 피부 투여에 의한 아토피피부염 치료효과를 평가하고자 하였다.
이를 위해, 도 28에 도시한 프로토콜에 따라, SKH-1 hairless 마우스에 10 ㎍ 농도의 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체(S. aureus EV)를 주 3회씩 4주간 반복적으로 도포하여 아토피 피부염 모델을 제작하였고, 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체를 도포하기 12시간 전에 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133 EV)를 피부에 도포하여 아토피피부염 발생에 대한 치료효과를 관찰하였다. 이때, 양성대조군으로는 아토피피부염 치료제로 사용되고 있는 면역억제제인 덱사메타손(dexamethasone)을 300 ㎍ 농도로 복강투여(i.p. injection)하고 동일한 조건에서 실험을 진행하였다.
그 결과, 도 29에 나타낸 바와 같이, 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체에 의해 유발된 아토피피부염 마우스모델에 유산균 유래 세포밖 소포체를 도포한 경우, 도포하지 않은 경우에 비해 피부병변의 크기가 감소하였으며, 유산균 유래 소포체를 100 ㎍ 투여한 경우에는 면역억제제인 덱사메타손을 복강 투여한 경우와 유사한 정도로 피부병변의 발생이 억제된 것을 확인하였다.
또한, 피부조직에서 Th17 염증을 일으키는 대표적인 면역지표인 IL-17을 측정한 결과, 도 30에 나타낸 바와 같이, 유산균 유래 세포밖 소포체를 피부에 도포한 경우, 도포하지 않은 경우에 비하여 IL-17의 농도가 낮게 측정되었고, 이는 양성대조군(dexa)과 비슷한 수준임을 확인하였다. 이상의 결과는 유산균 유래 세포밖 소포체를 피부로 투여하였을 때, 효율적으로 아토피피부염과 같은 피부염증질환을 억제할 수 있음을 의미한다.
실시예 11. 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체에 의한 피부염 발생에서 유산균 유래 세포밖 소포체 경구투여의 치료효과 확인
유산균 유래 세포밖 소포체의 경구 투여에 의한 아토피피부염 치료효과를 평가하기 위하여, 도 31에 도시한 프로토콜에 따라, SKH-1 hairless 마우스에 10 ㎍의 농도의 황색포도상구균 유래 소포체(S. aureus EV)를 주 3회씩 4주간 반복적으로 도포하여 아토피 피부염 모델을 제작하였고, 황색포도상구균 유래 소포체를 도포하기 12시간 전에 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133 EV)를 경구로 투여하여 아토피피부염 발생에 대한 치료효과를 관찰하였다.
그 결과, 도 32에 나타낸 바와 같이, 유산균 유래 세포밖 소포체를 경구 투여한 경우, 투여하지 않은 경우에 비하여 피부 병변의 크기가 감소하였고, 유산균 유래 소포체를 10 ㎍ 또는 100 ㎍ 투여한 일부에서는 피부병변이 전혀 관찰되지 않았다.
또한, 피부조직에서 면역 및 염증 지표를 평가하기 위해, 피부조직 내 IL-4, IL-5, IL-17, 및 IFN-γ 농도를 측정한 결과, 도 33에 나타낸 바와 같이, 유산균 유래 세포밖 소포체를 경구 투여하였을 때 상기 사이토카인들의 분비가 현저히 억제되는 것을 확인하였다. 이상의 결과는 유산균 유래 세포밖 소포체를 경구로 투여하였을 때, 효율적으로 아토피피부염과 같은 피부염증질환을 억제할 수 있음을 의미한다.
실시예 12. 고용량의 유산균 유래 세포밖 소포체 다회 경구 투여에 의한 안전성 평가
유산균 유래 세포밖 소포체의 고용량 반복투여에 의한 독성을 평가하기 위해, 도 34에 도시한 방법으로 주 3회, 4주간(총 12회) 유산균 유래 세포밖 소포체(CJLP133) 500 ㎍을 경구로 투여하였다. 이후 소포체를 투여하지 않은 대조군과 유산균 유래 소포체를 경구 투여한 군에서 각각 마우스의 체중, 사료 섭취량, 체온을 측정하였다.
그 결과, 도 35 내지 도 37에 나타낸 바와 같이, 세 가지 지표 모두에서 대조군과 유산균 유래 소포체 투여군에서 별다른 차이가 나타나지 않는 것을 확인하였다.
또한, 4주간의 경구 투여 후 혈액을 채취하여 혈구 성분을 분석한 결과, 도 38에 나타낸 8가지 지표(WBC; 백혈구 수, RBC; 적혈구 수, HGB; 헤모글로빈 농도, HCT; 원심분리 혈장, MCV; 적혈구 평균 부피, MCH; 평균 헤모글로빈 수, MCHC; 평균 헤모글로빈 농도, PLT; 혈소판 수)에서 대조군과 유산균 유래 세포밖 소포체 투여군 간에 유의한 차이가 나타나지 않았다. 이상의 결과는 고용량으로 유산균 유래 세포밖 소포체를 경구로 투여하였을 때, 안전하게 치료효과를 유도함을 의미한다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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Claims (4)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 아토피피부염의 진단을 위한 정보제공방법:
    (a) 임상샘플에서 분리한 세포밖 소포체로부터 유전자를 추출하는 단계;
    (b) 상기 유전자에 대하여 염기서열을 분석하는 단계; 및
    (c) 상기 염기서열 분석을 통하여 유산균 유래 세포밖 소포체의 분포가 정상인에 비하여 낮을 경우 아토피피부염의 유발 위험성이 높을 것으로 판정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유전자는 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 임상샘플은 소변 또는 혈액인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 염기서열 분석은 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
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