JP2018508837A - オートフォーカス方法及びオートフォーカス装置 - Google Patents

Abstract

マルチウェルプレートの少なくとも部分内の複数のウェルの合焦位置を決定するためのオートフォーカス方法であって、第１の倍率を有する第１の対物レンズを使用して、複数のウェルの選択されたサブセットの少なくとも３つのウェルのそれぞれにおいて、それぞれのウェルに対する第１の対物レンズの合焦位置を特定すること、少なくとも３つの合焦位置に基づいて、第１の倍率以下の第２の倍率を有する少なくとも１つの対物レンズが該少なくとも３つのウェルに対して沿って合焦する平面を計算すること、及び該少なくとも１つの対物レンズを使用して、該平面に沿って、プレートの該部分内の複数のウェルの少なくともいくつかを走査することを含む、オートフォーカス方法。

Description

分野及び背景
本発明は、一般的に、光学的測定技法及び／又は検査技法の分野に関し、より具体的には、非平面状の表面を観察する場合に特に有用なオートフォーカス方法及びオートフォーカス装置に関する。

オートフォーカスは、半導体産業、生物医学研究、光学的情報担体におけるデータ読取り／記録などの多くの自動検査の分野での不可欠な特徴である。具体的には、単一のプレートに複数のウェルを含むマルチウェルプレート中の試料を分析する場合、ウェルの内容物を観察している顕微鏡のオートフォーカスは、操作者がプレート中の各ウェルに対物レンズの焦点を別々に合わせる必要がないので、より効率的な作業手順を可能にすることができる。

マルチウェルプレートの検査のための様々なオートフォーカス方法が、過去に、例えば米国特許第７，１０９，４５９号に開示されている。しかし、例えば生きた細胞をスフェロイドに成長させるために、例えばＵ字状の底を有するウェルを有するマルチウェルプレートなどの、非平面状の底を有するウェルを使用する場合、既存のオートフォーカス方法は、時間のかかる画像解析を必要とする場合がある。

したがって、マルチウェルプレートに顕微鏡をオートフォーカスするための方法であって、非平面状の底面を有するウェルを有するマルチウェルプレートに適切である方法が必要とされる。

概要
本発明は、一般的に、光学的測定技法及び／又は検査技法の分野に関し、より具体的には、非平面状の表面を観察する場合に特に有用なオートフォーカス方法及びオートフォーカス装置に関する。

本発明の実施態様により、マルチウェルプレートの少なくとも部分内の複数のウェルの合焦位置を決定するためのオートフォーカス方法であって：
第１の倍率を有する第１の対物レンズを使用して、複数のウェルの選択されたサブセットの少なくとも３つのウェルのそれぞれにおいて、それぞれの該ウェルに対する第１の対物レンズの合焦位置を特定すること；
少なくとも３つの該合焦位置に基づいて、第１の倍率以下の第２の倍率を有する少なくとも１つの対物レンズが該少なくとも３つのウェルに対して沿って合焦する平面を計算すること；及び
該少なくとも１つの対物レンズを使用して、該平面に沿って、プレートの該部分内の複数のウェルのうち少なくともいくつかを走査すること
を含む方法が、提供される。

いくつかの実施態様では、少なくとも１つの対物レンズは第１の対物レンズであり、第１の倍率は第２の倍率と等しい。いくつかの実施態様では、平面を計算することは、第１の対物レンズが少なくとも３つのウェルに対して沿って合焦する平面を計算することを含む。

いくつかの実施態様では、少なくとも１つの対物レンズは第１の対物レンズと異なる第２の対物レンズであり、第２の倍率は第１の倍率よりも小さい。いくつかの実施態様では、平面を計算することは、第２の対物レンズの光学特性に基づいて、第１の対物レンズを使用して特定された合焦位置のうち少なくとも３つを、第２の対物レンズの対応する第２の合焦位置に変換すること；及び少なくとも３つの第２の合焦位置に基づいて平面を計算することを含む。いくつかの実施態様では、平面を計算することは：少なくとも３つの該合焦位置に基づいて、第１の対物レンズが、少なくとも３つのウェルに対して沿って合焦する第１の平面を計算すること；及び第２の対物レンズの光学特性に基づいて、第１の平面を、第２の対物レンズが少なくとも３つのウェルに対して沿って合焦する対応する平面に変換することによって該平面を計算することを含む。

いくつかの実施態様では、少なくとも１つの対物レンズを使用して走査することは、追加的なフォーカス操作を行わずに行われる。

いくつかの実施態様では、複数のウェルのサブセットは、複数のウェルのうち３つ超を含む。

いくつかの実施態様では、合焦位置を特定することは、サブセットにおけるそれぞれのウェルについて合焦位置を特定することを含む。

いくつかの実施態様では、ウェルのそれぞれは、一般的に円筒状の側壁並びに球、放物線、及び楕円のうち少なくとも１つの部分を含む底面を含む。いくつかの実施態様では、ウェルのそれぞれは、Ｕ字状の断面を有する。

いくつかの実施態様では、ウェルのそれぞれは、一般的に円筒状の側壁及び平面状の底面を含む。いくつかの実施態様では、ウェルが矩形断面を有するように、平面状の底面は、マルチウェルプレートの上面に一般的に平行に配置されている。

いくつかの実施態様では、ウェルのそれぞれは、円錐台形状である。

いくつかの実施態様では、ウェルのそれぞれは、傾斜した側壁、平面状の底、及び台形の断面を有する。

いくつかの実施態様では、方法は、第１の対物レンズを使用する前に、第１の対物レンズをウェルのうち１つの中心の上方に軸方向に配置するように位置合わせすることをさらに含む。

いくつかの実施態様では、プレートの部分は、プレートの象限を含む。いくつかの実施態様では、プレートの一部は、プレートの全体を含む。

本発明の実施態様により、プレートにおけるウェルの少なくとも部分の合焦位置を決定するためのオートフォーカス方法であって：第１の倍率を有する第１の対物レンズを使用して、ウェルの少なくとも１つの箇所でウェルの少なくとも部分に対する第１の対物レンズの第１の合焦位置を特定すること；第１の合焦位置について、少なくとも１つの対物レンズの光学特性に基づいて、第２の倍率を有する該少なくとも１つの対物レンズの対応する合焦位置を特定すること；及び該少なくとも１つの対物レンズを使用して、対応する合焦位置に対応する高さで、ウェルの少なくとも該部分を走査することを含むオートフォーカス方法も提供され、その際、第２の倍率は、第１の倍率以下である。

いくつかの実施態様では、少なくとも１つの対物レンズは第１の対物レンズであり、第１の倍率は、第２の倍率と等しく、対応する合焦位置は、第１の合焦位置である。

いくつかの実施態様では、少なくとも１つの対物レンズは、第１の対物レンズと異なる第２の対物レンズを含み、その際、第２の倍率は、第１の倍率よりも小さい。いくつかのそのような実施態様では、特定することは、第２の対物レンズの光学特性に基づいて、第１の合焦位置を、第２の対物レンズの対応する合焦位置に変換することを含む。

いくつかの実施態様では、追加的なフォーカス操作を行わずに、少なくとも１つの対物レンズを使用して走査が行われる。

いくつかの実施態様では、ウェルは、一般的に円筒状の側壁並びに球、放物線、及び楕円のうち少なくとも１つの部分を含む底面を含む。いくつかの実施態様では、ウェルは、Ｕ字状の断面を有する。

いくつかの実施態様では、ウェルは、一般的に円筒状の側壁及び平面状の底面を含む。いくつかの実施態様では、ウェルが矩形断面を有するように、平面状の底面は、プレートの上面に一般的に平行に配置されている。

いくつかの実施態様では、ウェルは円錐台形状である。いくつかの実施態様では、ウェルは、傾斜した側壁、平面状の底、及び台形の断面を有する。

本発明の実施態様により、ウェルを含むプレートの少なくとも部分に位置する複数のウェルの合焦位置を自動的に決定するためのオートフォーカス装置であって、対物レンズが、プレートの部分内の少なくとも３つのウェルに対して沿って合焦する平面を計算するようにプログラムされた計算コンポーネント；計算コンポーネントと機能的に関連付けられた第１の対物レンズであって、第１の対物レンズが第１の倍率を有し、第１の対物レンズからの画像が、複数のウェルの選択されたサブセットの少なくとも３つのウェルのそれぞれについて合焦位置を特定するための計算コンポーネントにより使用される、第１の対物レンズ；及びプレートの部分内の複数のウェルのうち少なくともいくつかを該平面に沿って走査するための第２の倍率を有する少なくとも１つの対物レンズであって、第２の倍率が第１の倍率以下である、少なくとも１つの対物レンズを含む装置も提供され、その際、少なくとも３つの合焦位置に基づいて、計算コンポーネントは、該少なくとも１つの対物レンズが該少なくとも３つのウェルに対して沿って合焦する平面を計算するように構成されている。

いくつかの実施態様では、少なくとも１つの対物レンズは、追加的なフォーカス操作を行わずに平面に沿って複数のウェルを走査するように構成されている。

いくつかの実施態様では、少なくとも１つの対物レンズは第１の対物レンズであり、第２の倍率は第１の倍率と等しい。

いくつかの実施態様では、少なくとも１つの対物レンズは、第１の対物レンズと異なる第２の対物レンズであり、第２の倍率は、第１の倍率よりも小さい。

いくつかの実施態様では、計算コンポーネントは、第２の対物レンズの光学特性に基づいて、第１の対物レンズを使用して特定された合焦位置のうち少なくとも３つを、第２の対物レンズの対応する第２の合焦位置に変換すること；及び少なくとも３つの第２の合焦位置に基づいて合焦面を計算することによって、合焦面を計算するようにプログラムされている。

いくつかの実施態様では、計算コンポーネントは：少なくとも３つの合焦位置に基づいて、第１の対物レンズが少なくとも３つのウェルに対して沿って合焦する第１の平面を計算すること；及び第２の対物レンズの光学特性に基づいて、第１の平面を、第２の対物レンズが少なくとも３つのウェルに対して合焦する対応する平面に変換することによって平面を計算することによって、合焦面を計算するようにプログラムされている。

いくつかの実施態様では、計算コンポーネントは、サブセットにおけるそれぞれのウェルについて合焦位置を特定するようにプログラムされている。

いくつかの実施態様では、装置は、中のウェルのそれぞれが一般的に円筒状の側壁並びに球の部分、放物線の、及び楕円の部分のうち少なくとも１つを含む底面を含むプレートでの使用に適応されている。いくつかの実施態様では、装置は、ウェルのそれぞれがＵ字状の断面を有するプレートでの使用に適応されている。

いくつかの実施態様では、装置は、中のウェルのそれぞれが一般的に円筒状の側壁及び平面状の底面を含むプレートでの使用に適応されている。いくつかの実施態様では、ウェルのそれぞれが一般的に矩形の断面を有するように、平面状の底面は、プレートの上面に一般的に平行に配置されている。

いくつかの実施態様では、装置は、ウェルのそれぞれが円錐台形状であるプレートでの使用に適応されている。いくつかの実施態様では、装置は、中のウェルのそれぞれが、傾斜した側壁、平面状の底、及び台形の断面を有するプレートでの使用に適応されている。

いくつかの実施態様では、プレートの部分は、プレートの象限を含む。いくつかの実施態様では、プレートの部分は、プレートの全体を含む。

本発明の実施態様により、ウェルの少なくとも部分の合焦位置を自動的に決定するためのオートフォーカス装置であって、ウェルの該部分の合焦位置を計算するようにプログラムされた計算コンポーネント；計算コンポーネントに機能的に関連付けられた第１の対物レンズであって、第１の対物レンズが第１の倍率を有し、第１の対物レンズからの画像が、ウェルの少なくとも１つの位置においてウェルに対する第１の対物レンズの第１の合焦位置を特定するための計算コンポーネントにより使用される、第１の対物レンズ；及び第２の倍率を有する少なくとも１つの対物レンズであって、ウェルに対する第２の倍率が第１の倍率以下である少なくとも１つの対物レンズの合焦位置の高さでウェルの少なくとも部分を走査するための対物レンズを含む、オートフォーカス装置も提供され、その際、計算コンポーネントは、少なくとも１つの対物レンズの光学特性に基づいて対応する合焦位置を特定するようにプログラムされている。

いくつかの実施態様では、前記少なくとも１つの対物レンズは、追加的なフォーカス操作を行わずにウェルの部分を走査するように構成される。

いくつかの実施態様では、前記少なくとも１つの対物レンズは、第１の対物レンズであり、第２の倍率は第１の倍率に等しく、対応する合焦位置は第１の合焦位置と同じである。

いくつかの実施態様では、前記少なくとも１つの対物レンズは、第１の対物レンズと異なる第２の対物レンズであり、その際、第２の倍率は第１の倍率よりも小さい。

いくつかの実施態様では、計算コンポーネントは、第２の対物レンズの光学特性に基づいて、第１の合焦位置を、第２の対物レンズの対応する合焦位置に変換することによって対応する合焦位置を特定するようにプログラムされている。

いくつかの実施態様では、装置は、一般的に円筒状の側壁並びに球の部分、放物線及び楕円の部分のうち少なくとも１つを含む底面を含むウェルでの使用に適応されている。いくつかの実施態様では、装置は、Ｕ字状の断面を有するウェルでの使用に適応されている。

いくつかの実施態様では、装置は、一般的に円筒状の側壁及び平面状の底面を含むウェルでの使用に適応されている。いくつかの実施態様では、平面状の底面は、ウェルが一般的に矩形の断面を有するように、プレートの上面と一般的に平行に配置される。

いくつかの実施態様では、装置は、円錐台形状のウェルでの使用に適応されている。いくつかの実施態様では、装置は、傾斜した側壁、平面状の底、及び台形の断面を有するウェルでの使用に適応されている。

特に規定しない限り、本明細書に使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の技術者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が優先されるものとする。

本明細書に使用される用語「含んでいる（comprising）」、「含んでいる（including）」、「有している」及びそれらの文法的変形は、述べられた特徴、完全体、段階又はコンポーネントを明示すると考えるべきであるが、１つ以上の追加的な特徴、完全体、段階若しくはコンポーネント、又はそれらの群の追加を排除しない。これらの用語は、用語「からなる」及び「から本質的になる」を包含する。

本明細書に使用される不定冠詞「a」及び「an」は、文脈が明らかに他のものを示さない限り、「少なくとも１つの」又は「１つ以上」を意味する。

本発明の方法及び／又は装置の実施態様は、選択されたタスクを手動、自動で、又はそれらの組合せを行う又は完了することを含み得る。本発明のいくつかの実施態様は、ハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア又はそれらの組合せを含むコンポーネントを使用して実現される。いくつかの実施態様では、いくつかのコンポーネントは、汎用コンピュータ又はモニターなどの汎用コンポーネントである。いくつかの実施態様では、いくつかのコンポーネントは、回路、集積回路又はソフトウェアなどの専用コンポーネント又はカスタムコンポーネントである。

例えば、いくつかの実施態様では、実施態様のいくつかは、データ処理装置、例えば、汎用又はカスタムコンピューターの一部であるデータ処理装置により遂行される複数のソフトウェア命令として実現される。いくつかの実施態様では、データ処理装置又はコンピュータは、命令及び／若しくはデータを記憶するための揮発性メモリー並びに／又は命令及び／若しくはデータを記憶するための不揮発性記憶装置、例えば磁気ハードディスク及び／若しくは取外し可能な媒体を含む。いくつかの実施態様では、実装は、ネットワーク接続を含む。いくつかの実施態様では、実装は、一般的に、入力装置（例えば、コマンド及び／又はパラメータの入力を可能にする）及び出力装置（例えば、演算のパラメータ及び結果を報告することを可能にする）の１つ以上を含むユーザーインターフェースを含む。

添付の図面を参照して、本発明のいくつかの実施態様を本明細書に説明する。説明は、図面と一緒に本発明のいくつかの実施態様がどのように実施され得るかを当業者に明白にするものである。これらの図面は、説明的な論考のためであり、本発明の基本的理解に必要なものよりも詳細に実施態様の構造的詳細を示そうとはしていない。明確にするために、図面に示されたいくつかのオブジェクトは縮尺通りではない。

それぞれマルチウェルプレートの平面図及び本明細書における教示の実施態様が有用であり得る非平面状の底面を有するマルチウェルプレート中の単一のウェルの断面図である。 それぞれマルチウェルプレートの平面図及び本明細書における教示の実施態様が有用であり得る非平面状の底面を有するマルチウェルプレート中の単一のウェルの断面図である。 本明細書における教示の実施態様にしたがってマルチウェルプレート中の試料にオートフォーカスするための撮像装置の実施態様のブロック図である。 本明細書における教示の実施態様によりマルチウェルプレート中の試料に撮像装置をオートフォーカスするための方法の実施態様の流れ図である。

発明のいくつかの実施態様の説明
本明細書における教示の原理、使用及び実施は、付随する説明及び図面を参照してより良く理解され得る。本明細書に存在する説明及び図面を精査して、当業者は、過度の努力又は実験なしに本発明の実現することができる。

本発明の少なくとも１つの実施態様を詳細に説明する前に、本発明が、以下の説明に示され、かつ／又は図面及び／若しくは実施例に例証されるコンポーネントの構築及び配列の詳細並びに／又は方法へのその適用に限定されないことを理解すべきである。本発明は、他の実施態様で実現することができ、様々な方法で実行又は実施することができる。本明細書に採用される用語及び術語は、説明目的であり、限定するものと見なすべきでないことも理解されている。

次に、それぞれマルチウェルプレートの平面図及び本明細書における教示の実施態様が有用であり得る非平面状の底を有する、マルチウェルプレート中の単一のウェルの断面図である図１Ａ及び１Ｂを参照する。

図１Ａから分かるように、マルチウェルプレート１０は、上面１１、側面（図示せず）及びいくつかの実施態様では底面（図示せず）を有する。プレート１０は、列１４及び行１６から形成される格子状に配置され、上面１１の開口１７から到達可能な複数のウェル１２を含む。典型的には、ユーザが特定のウェル１２を容易に参照できるように、行及び列は、番号付け又は他の方法で標記される。例証された実施態様におけるマルチウェルプレート１０は、９６個のウェルを含むが、例えば、１２、２４、又は３８４個のウェルなどの異なる数のウェルを含む他の種類のプレートが、本明細書下記にさらに詳記される本明細書における教示で使用される場合がある。典型的には、ウェル１２は、相互に固定距離を有し、したがって、プレート１０の上に規則的な間隔で分布している。ウェルの間の距離に関する仕様は、当技術分野において標準的であり、典型的にはプレートの製造業者によっても提供される。多くの場合に、プレート中のウェルの数は、３：２（横：縦）の縦横比を有する。このように、ウェルは、例えば、３×２格子、６×４格子、１２×８格子、又は２４×１６格子として配列される場合がある。

図１Ｂに転じると、ウェルが非直線状の底面を有するように、プレート１０の中のそれぞれのウェル１２の断面は非矩形であり得ることが見てとれる。図示された実施態様において、ウェル１２は、空洞１８を含み、Ｕ字状の断面を有する結果、ウェルの側壁２０は一般的に円筒を形成し、ウェルの底部２２は、球の部分、放物線の部分、又は楕円の部分を形成し、それにより、ウェルに曲がった底面を定めている。このように、ウェルは、典型的にはＵ字状の断面又は放物線に幾分似通った断面を有する。典型的には、側壁２０及び底部２２の厚さは均一である。典型的にはプレート１０の上面１１の部分を形成し、かつ上面１１と同一平面にある又はそれに対して立ち上がっているリム２６が、多くの場合にウェル１２を取り囲んでいる。

非平面状の底面を有するウェルを含むマルチウェルプレートは、当技術分野において周知であり、Corning Incorporated Life Sciences（Tewksbury, Massachusetts）などの多くの製造業者から市販されている。そのようなマルチウェルプレートは、スフェロイドを成長させるため、リンパ球及び他の血球などの非接着細胞を成長させるため、三次元試料を分析するため、及び化合物の取扱いのためを含む、多くの種類の試料のために使用される。多くの場合、そのような試料の分析は、ウェル内の試料の撮像を必要とする。

ウェル１２の底面の弯曲のせいで、ウェルを観察している顕微鏡が合焦する面積は、典型的には非常に小さく、場合により単一の点を含むことが認識されている。このように、米国特許第７，１０９，４５９号に開示されるような既存のオートフォーカス機構は、多くの場合にウェル内に配された試料に合焦することに成功していない。本明細書下記に説明するように、本明細書における教示の方法は、オペレータが、各個別のウェルに撮像装置を手動でフォーカスする必要なしに、図１ＢのＵ字状のウェル１２などの非平面状の底を有するウェルに撮像装置をオートフォーカスできるようにする。

例示的な説明は、Ｕ字状の断面を有するウェルを示しているが、本明細書下記の本明細書における教示の方法が、平面状の底面及び矩形断面を有するウェル又は円錐台形状、すなわち傾斜した側壁及び平面状の底を有し、かつ一般的に台形の断面を有する円錐台を含む形状のウェルなどの、他の種類のウェルのために使用され得ることが評価されている。

次に、本明細書における教示の実施態様により、マルチウェルプレート中のウェルにオートフォーカスするための撮像装置２００の実施態様のブロック図である図２を参照する。

本明細書における開示が、単なる一例として試料を含むウェルへのオートフォーカスを論じていること、並びに同じ方法及び装置が試料を含まないウェル、又は試料を含むウェルもあれば含まないウェルもあるマルチウェルプレートへのオートフォーカスにも使用され得ることが評価されている。

図２に見られるように、撮像装置１００は、Ｘ、Ｙ、及びＺ軸に沿って可動の試料台に機能的に関連付けられた走査顕微鏡２０２を含む。試料台は、例えば図１Ａ及び１Ｂのプレート１０のようなプレートであり得る試料プレート２０５を上に配するように構成されている。

顕微鏡２０２は、さらに、対物レンズ交換装置２０８に機能的に関連付けられた複数の対物レンズ２０６を含む。任意の所与の時間に、レンズ２０６のうち１つだけが試料台（図示せず）と位置合わせされ、かつ動作可能であることにより、試料台上に配された試料プレートは、対物レンズを通して観察され得る。対物レンズ交換装置２０８は、対物レンズの変更が必要な場合、試料を観察するために使用される動作可能なレンズを変更するように構成されている。そのような交換装置の例は、例えば、国際公開公報第２０１２／０９７１９１号に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み入れられる。

顕微鏡２０２は、制御ユニット（図示せず）により制御される少なくとも１つの照明光源に機能的に関連付けられている。いくつかの実施態様では、顕微鏡は、上に配された試料プレート２０５の撮像時に試料台を照明するように構成された、ＬＥＤランプなどの透過光源２１０ａを含む第１の照明光源を含む。いくつかの実施態様では、顕微鏡は、さらに、試料の蛍光又は発光成分を励起するために照明を提供するなどの、試料プレート２０５上又は試料プレート２０５中に担持された試料に応答をもたらすための照明を提供するように構成された励起光源２１０ｂを備える第２の照明光源を含む。いくつかの実施態様では、光源２１０ａ及び／又は２１０ｂからの照明は、試料プレート２０５上に配された試料に入射する前に、鏡、ダイクロイックキューブ、ビームスプリッター、フィルターなどの１つ以上の光学素子２１２に入射する。いくつかの実施態様では、照明光源２１０からの照明は、試料に入射する前に光ファイバー２１３を通過する。

いくつかの実施態様では、顕微鏡２０２により視認可能な画像は、画像取得部（図示せず）により取得され、さらなる処理及び解析のために処理部２１４に転送される。

次に、本明細書における教示の実施態様によりマルチウェルプレート中の試料に撮像装置をオートフォーカスするための方法の実施態様の流れ図である、図３を参照する。

本明細書下記の方法は、図１Ａのプレート１０などの、複数のウェルを含む試料プレート中に配された複数の試料の合焦位置を自動的に決定するための、図２の撮像装置２００などの撮像装置に使用され得る。該方法は、図１Ｂのウェル１２などの非平面状の底面を有するウェルを含むプレートに対して、又は平面状の底面を有するウェル若しくは傾斜した側壁及び平面状の底を有する円錐台形状のウェルなどの、他の種類のウェルに対して実施される場合がある。

ステップ３００に見られるように、プレート中のウェルのサブセットが選択される。いくつかの実施態様では、サブセットは、それぞれ液体又は試料を含む少なくとも３つのウェルを含むが、これは、本明細書開示の方法に必要なわけではない。サブセットにおけるウェルのうち少なくとも３つについて、及びいくつかの実施態様ではサブセットの全てのウェルについて、ウェル中に含まれる試料の合焦位置が、ステップ３０２で図２の対物レンズ２０６などの、第１の倍率を有する第１の対物レンズに対して特定される。

典型的には、第１の対物レンズは、例えば２０×、１０×などのかなり大きな倍率を有する。

いくつかの実施態様では、サブセットは、３つを超えるウェルを含むが、合焦位置は、サブセットにおけるウェルのうち３つについてのみ特定される。いくつかの実施態様では、サブセットは、３つを超えるウェルを含み、合焦位置は、サブセットにおける全てのウェルについてではなく、サブセットにおける３つを超えるウェルについて特定される。例えば、サブセットは、少なくとも５つのウェルを含む場合があり、合焦位置は、サブセットにおける全てのウェルについてではなく、少なくとも４つのウェルについて特定される。いくつかの実施態様では、合焦位置は、サブセットにおける全てのウェルについて特定される。

サブセットのウェルの中の試料の合焦位置は、手動方法及び自動方法の両方を含む、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して特定され得る。いくつかの実施態様では、合焦位置は、本明細書において完全に述べられているかのように参照により組み入れられる米国特許第７，１０９，４５９号に実質的に記載されているように特定される。

米国特許第７，１０９，４５９号の教示により、合焦位置を特定するために、第１の対物レンズの焦点面は、プレートの底面などのプレートの表面から、ある特定の距離、例えば約１ミリメートル間隔を空けられる。次に、例えば対物レンズ又はプレートを相互に対して変位することにより、対物レンズの焦点面がプレートに向けて変位する。例えば、対物レンズの焦点面が、プレート表面の下方に配され、焦点面が、プレート表面に向けて鉛直上方に変位するように、対物レンズは、プレートの下方に配され得る。

対物レンズの焦点面の変位の間に、検出された光の強度がいくつかの実施態様において予め設定された閾値よりも高い最大値に達するまで、顕微鏡の制御ハードウェアが、プレートから反射された光の強度を記録する。検出された光強度のこの最大値は、プレート表面の合焦位置に対応する。

理論に縛られることを望むわけではないが、対物レンズがプレートの下方に配され、かつ焦点面が最初にプレートの下方に配されてプレート方向に変位する上記の例において、最大光強度が観察される箇所は、対物レンズの焦点面がウェルの底の曲面に対して接線方向である点に対応すると考えられる。

続いて、いくつかの実施態様では、反射光の強度における別のピークであって、環境及び被験試料に応じてそれぞれの閾値により定義されるピークが検出されるまで、対物レンズの焦点面は、プレート方向に変位し続ける。理論に縛られることを望むわけではないが、対物レンズがプレートの下方に配され、かつ焦点面が最初はプレートの下方に配されてプレート方向に変位する上記例において、反射光の強度におけるこの第２のピークは、対物レンズの焦点面がウェル内のプレート底に対して接線方向である場合に発生し、典型的には、試料の合焦位置からのオフセットを表すことが推測される。オフセットの大きさは、ユーザにより手動的に決定される場合があり、又は当技術分野において公知の方法を使用して自動的に決定される場合もある。

いくつかの実施態様では、オフセットは、検出された光の強度における第２のピークの探索を継続せずに、検出された光の強度における第１のピークから計算される。そのような実施態様では、オフセットの大きさは、ユーザにより手動的に決定される場合があり、又は当技術分野において公知の方法を使用して自動的に決定される場合がある。

焦点面がプレートに向けて変位する方向、及び検出された光の強度におけるピークが特定される順序は、撮像装置の設定に依存することが認識されている。例えば、いくつかの実施態様では、対物レンズは、試料プレートの下方に配されるが、対物レンズの焦点面は、焦点面がウェルの底に向けて下向きに変位するようにウェルの底の上方に配される。理論に縛られることを望むわけではないが、そのような実施態様では、反射光の強度における第１のピークは、対物レンズの焦点面がウェル内のプレート底に対して接線方向である場合に発生し、典型的には、試料の合焦位置からのオフセットを表すが、一方で反射光の強度における第２のピークが検出される箇所は、対物レンズの焦点面がウェルの底の曲面に対して接線方向である点に対応することが推測される。対応する状況は、焦点面がウェルの底に向けて下向きに変位するように、対物レンズが試料プレートの上方に配されており、かつ対物レンズの焦点面がウェルの底の上方に配されている、他の実施態様において発生する。

別の例として、いくつかの実施態様では、対物レンズは、試料プレートの上方に配されているが、対物レンズの焦点面がウェルの底に向けて上方に変位するように、焦点面は、ウェルの底の下方に配される。理論に縛られることを望むわけではないが、そのような実施態様では、反射光の強度における第１のピークが検出される箇所は、対物レンズの焦点面がウェルの底の曲面に対して接線方向である点に対応し、一方で反射光の強度における第２のピークは、対物レンズの焦点面がウェル内のプレートの底に対して接線方向である場合に発生し、典型的には、試料の合焦位置からのオフセットを表すことが推測される。

いくつかの実施態様では、合焦位置が配置されているウェルの中心は、製造業者により提供されるプレートの仕様に基づいて特定される。いくつかの実施態様では、ウェルの中心は、当技術分野において公知の適切な光検出パラメータ及び特性を使用してウェルの中心又はウェルの縁部が特定されるまで、プレートのＸ−Ｙ変位又は対物レンズのＸ−Ｙ変位を使用して決定される。

ステップ３０４で、ステップ３０２で特定された合焦位置のうち少なくとも３つを使用して、図２の対物レンズ２０６などの第２の対物レンズが、プレート中の複数のウェルのうち少なくともいくつか、典型的にはプレート中の全てのウェルに対して沿って合焦する又はほとんど合焦する平面が計算される。第２の対物レンズは、第１の対物レンズの第１の倍率以下の第２の倍率を有する。本明細書下記のように、ウェルは、走査された任意の所与のウェルについて、計算された平面及び第２の対物レンズの焦点面が一致する又はほぼ一致するように、第２の対物レンズの位置を走査の間に維持することによって、その箇所で計算された平面に基づいて、第２の対物レンズを使用して走査される。

いくつかの実施態様では、平面は、第２の対物レンズの光学特性に基づいて、第１の対物レンズを使用してステップ３０２において特定された合焦位置のうち少なくとも３つ、典型的にはそれぞれを、第２の対物レンズの対応する第２の合焦位置に変換すること、及び第２の合焦位置のうち少なくとも３つを含む平面を計算することによって計算される。

いくつかの実施態様では、平面は、合焦位置のうち少なくとも３つに基づいて、第１の平面に沿ってプレート中の複数のウェルの少なくともいくつか、典型的には第１の対物レンズがプレート中の全てのウェルに対して沿って合焦する又はほとんど合焦する平面を計算することによって計算される。次に、第１の平面は、第２の対物レンズが、第２の対物レンズの光学特性に基づいて、ウェルのうち少なくともいくつか、典型的には全てのウェルに対して沿って合焦する又はほとんど合焦する、対応する平面に変換される。

上述のように、第２の対物レンズは、第１の対物レンズの第１の倍率以下の倍率を有する。そのように、いくつかの実施態様では、第２の倍率は第１の倍率よりも小さく、例えば４×又は２×であり得る。いくつかの実施態様では、第２の倍率は、第１の倍率と等しいが、第２の対物レンズの開口数の値は、第１の対物レンズの開口数の値よりも高い。

いくつかの実施態様では、平面は、ステップ３０２で特定された全ての合焦位置を使用して計算される。他の実施態様では、平面は、ステップ３０２で特定された全ての合焦位置よりも少ない合焦位置を使用して計算される。

いくつかの実施態様では、平面は、プレートの区画内で第１の対物レンズを使用して特定された少なくとも３つの合焦位置を使用して、プレートの該区画について、例えば象限について計算される。そのような実施態様では、本明細書記載の方法は、各区画について合焦位置の異なるセットを使用して、プレートのそのような各区画又は象限について繰り返される。

上記ステップ３０４の前後に起こり得るステップ３０６で、第１の対物レンズは、例えば図２の対物レンズ交換装置などの適切なハードウェアメカニズムにより、第２の対物レンズに変更される。いくつかの実施態様では、第１及び第２の対物レンズは同一であり、図３のステップ３０６は省略される。

最後にステップ３０８で、マルチウェルプレートのウェルは、いかなる追加的なフォーカス操作も行わずに、第２の対物レンズを使用してステップ３０４で計算された平面に沿って走査又は撮像される。

ステップ３０８での走査は、スフェロイドなどの三次元構築物を撮像する場合に特に有用な画像スタックを取得することを含む、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して行われ得る。いくつかの実施態様では、本明細書における教示は、単一のウェルを有するプレートに対して、又はマルチウェルプレート内の単一のウェルに対して行われ得る。そのような実施態様では、第１の対物レンズは、プレート中の試料の合焦位置を見出すために使用される。第１の対物レンズを使用して見出される合焦位置は、第２の対物レンズの光学特性に基づいて、第２の対物レンズについての合焦位置に変換される。次に、第２の対物レンズは、変換された合焦点又はその高さに置かれたとき、プレートを走査するために使用される。

本明細書における教示は、プレート内の「予想される高さの差」及び「予想外の高さの差」にかかわらず、プレートを撮像装置に対して合焦させることが認識されている。「予想される高さの差」は、構造が原因で弯曲した底を有するなどの、製造業者によりプレートにあることが意図される、プレートの仕様に挙げられるプレートの弯曲として定義される。「予想外の高さの差」は、プレートの仕様に意図されない平面性の欠如として定義される。そのような「予想外の高さの差」は、例えば、ウェルの底の相対高さにおける差が原因であり得；又は例えば、対物レンズが移動されるときに走査コンポーネントによりトレースされる仮想表面における平面性からの逸脱；若しくは対物レンズが移動するときに、プレートが載る表面が走査コンポーネントによりトレースされる仮想表面と非平行であることが原因であり得る。

明確にするために、別々の実施態様に関連して記載された本発明のある特定の特徴が、組み合わされて単一の実施態様においても提供され得ることが認識されている。逆に、簡潔にするために単一の実施態様に関連して記載された本発明の様々な特徴も、別々に、又は任意の適切な副組合せで、又は本発明の記載された任意の他の実施態様に適切であるとして提供され得る。様々な実施態様に関連して記載されたある特定の特徴は、該実施態様がそれらの要素なしに機能する限り、実施態様の不可欠な特徴と見なすべきではない。

本発明をその特定の実施態様と共に説明したものの、多数の代替、修飾及び変形が当業者に明白であることが明らかである。したがって、添付の特許請求の範囲内に入る全てのそのような代替、修飾及び変形を包含することが意図される。

本出願の任意の参照の引用又は特定は、そのような参照が本発明の先行技術として利用可能であるという承認として解釈されるものではない。

本明細書において、明細書の容易な理解のためにセクションの見出しが使用されるが、それを必然的に限定するものと見なすべきではない。

Claims (51)

1. マルチウェルプレートの少なくとも部分内の複数のウェルの合焦位置を決定するためのオートフォーカス方法であって：
   第１の倍率を有する第１の対物レンズを使用して、前記複数のウェルの選択されたサブセットの少なくとも３つのウェルのそれぞれにおいて、それぞれの前記ウェルに対する前記第１の対物レンズの合焦位置を特定すること；
   少なくとも３つの前記合焦位置に基づいて、前記第１の倍率以下の第２の倍率を有する少なくとも１つの対物レンズが前記少なくとも３つのウェルに対して沿って合焦する平面を計算すること；及び
   前記少なくとも１つの対物レンズを使用して、前記平面に沿って、前記プレートの前記部分内の前記複数のウェルのうち少なくともいくつかを走査すること
   を含む方法。
2. 前記少なくとも１つの対物レンズが前記第１の対物レンズであり、前記第１の倍率が前記第２の倍率と等しい、請求項１記載のオートフォーカス方法。
3. 前記平面を計算することが、前記第１の対物レンズが前記少なくとも３つのウェルに対して沿って合焦する平面を計算することを含む、請求項２記載のオートフォーカス方法。
4. 前記少なくとも１つの対物レンズが、前記第１の対物レンズと異なる第２の対物レンズであり、前記第２の倍率が、前記第１の倍率よりも小さい、請求項１記載のオートフォーカス方法。
5. 前記平面を計算することが：
   前記第２の対物レンズの光学特性に基づいて、前記第１の対物レンズを使用して特定された前記合焦位置のうち少なくとも３つを、前記第２の対物レンズの対応する第２の合焦位置に変換すること；及び
   少なくとも３つの前記第２の合焦位置に基づいて、前記平面を計算すること
   を含む、請求項４記載のオートフォーカス方法。
6. 前記平面を計算することが：
   少なくとも３つの前記合焦位置に基づいて、前記第１の対物レンズが前記少なくとも３つのウェルに対して沿って合焦する第１の平面を計算すること；及び
   前記第２の対物レンズの光学特性に基づいて、前記第１の平面を、前記第２の対物レンズが前記少なくとも３つのウェルに対して沿って合焦する対応する平面に変換することによって前記平面を計算すること
   を含む、請求項４記載のオートフォーカス方法。
7. 前記少なくとも１つの対物レンズを使用して前記走査することが、追加的なフォーカス操作を行わずに実施される、前記請求項のいずれか一項記載のオートフォーカス方法。
8. 前記複数のウェルの前記サブセットが、前記複数のウェルのうち３つ超を含む、前記請求項のいずれか一項記載のオートフォーカス方法。
9. 前記合焦位置を特定することが、前記サブセットにおけるそれぞれのウェルについて前記合焦位置を特定することを含む、前記請求項のいずれか一項記載のオートフォーカス方法。
10. 前記ウェルのそれぞれが、一般的に円筒状の側壁並びに球、放物線、及び楕円のうち少なくとも１つの部分を含む底面を含む、前記請求項のいずれか一項記載のオートフォーカス方法。
11. 前記ウェルのそれぞれが、Ｕ字状の断面を有する、前記請求項のいずれか一項記載のオートフォーカス方法。
12. 前記ウェルのそれぞれが、一般的に円筒状の側壁及び平面状の底面を含む、請求項１〜９のいずれか一項記載のオートフォーカス方法。
13. 前記ウェルが矩形断面を有するように、前記平面状の底面が、前記マルチウェルプレートの上面に一般的に平行に配置されている、請求項１２記載のオートフォーカス方法。
14. 前記ウェルのそれぞれが、円錐台形状である、請求項１〜９のいずれか一項記載のオートフォーカス方法。
15. 前記ウェルのそれぞれが、傾斜した側壁、平面状の底、及び台形の断面を有する、請求項１〜９のいずれか一項記載のオートフォーカス方法。
16. 前記第１の対物レンズを使用することの前に、前記第１の対物レンズを前記ウェルのうち１つの中心の上方に軸方向に配置するように位置合わせすることをさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載のオートフォーカス方法。
17. 前記プレートの前記部分が、前記プレートの象限を含む、前記請求項のいずれか一項記載のオートフォーカス方法。
18. 前記プレートの前記部分が、前記プレートの全体を含む、請求項１〜１６のいずれか一項記載のオートフォーカス方法。
19. プレートにおけるウェルの少なくとも部分の合焦位置を決定するためのオートフォーカス方法であって、
    前記方法が：
    第１の倍率を有する第１の対物レンズを使用して、前記ウェルの少なくとも１つの箇所で前記ウェルの少なくとも部分に対する前記第１の対物レンズの第１の合焦位置を特定すること；
    前記第１の合焦位置について、前記少なくとも１つの対物レンズの光学特性に基づいて、前記第１の対物レンズと異なり、かつ第２の倍率を有する第２の対物レンズの対応する合焦位置を特定すること；及び
    前記少なくとも１つの対物レンズを使用して、前記対応する合焦位置に対応する高さで、前記ウェルの少なくとも前記部分を走査すること
    を含み、
    前記第２の倍率が、前記第１の倍率よりも小さい、オートフォーカス方法。
20. 前記特定することが、前記第２の対物レンズの光学特性に基づいて、前記第１の合焦位置を、前記第２の対物レンズの前記対応する合焦位置に変換することを含む、請求項１９記載のオートフォーカス方法。
21. 前記少なくとも１つの対物レンズを使用して前記走査することが、追加的なフォーカス操作を行わずに実施される、請求項１９又は２０のいずれか一項記載のオートフォーカス方法。
22. 前記ウェルが、一般的に円筒状の側壁並びに球、放物線、及び楕円のうち少なくとも１つの部分を含む底面を含む、請求項１９〜２１のいずれか一項記載のオートフォーカス方法。
23. 前記ウェルがＵ字状の断面を有する、請求項１９〜２２のいずれか一項記載のオートフォーカス方法。
24. 前記ウェルが、一般的に円筒状の側壁及び平面状の底面を含む、請求項１９〜２１のいずれか一項記載のオートフォーカス方法。
25. 前記ウェルが矩形断面を有するように、前記平面状の底面が、前記プレートの上面に一般的に平行に配置されている、請求項２４記載のオートフォーカス方法。
26. 前記ウェルが円錐台形状である、請求項１９〜２１のいずれか一項記載のオートフォーカス方法。
27. 前記ウェルが、傾斜した側壁、平面状の底、及び台形の断面を有する、請求項１９〜２１のいずれか一項記載のオートフォーカス方法。
28. ウェルを含むプレートの少なくとも部分に位置する複数のウェルの合焦位置を自動的に決定するためのオートフォーカス装置であって、前記装置が：
    対物レンズが、前記プレートの前記部分内の少なくとも３つのウェルに対して沿って合焦する平面を計算するようにプログラムされた計算コンポーネント；
    前記計算コンポーネントと機能的に関連付けられた第１の対物レンズであって、前記第１の対物レンズが第１の倍率を有し、前記第１の対物レンズからの画像が、前記複数のウェルの選択されたサブセットの少なくとも３つのウェルのそれぞれについて合焦位置を特定するための前記計算コンポーネントにより使用される、第１の対物レンズ；及び
    前記プレートの前記部分内の前記複数のウェルのうち少なくともいくつかを前記平面に沿って走査するための、第２の倍率を有する少なくとも１つの対物レンズであって、前記第２の倍率が第１の倍率以下である、少なくとも１つの対物レンズ
    を含み、
    前記計算コンポーネントが、少なくとも３つの前記合焦位置に基づいて、前記少なくとも１つの対物レンズが前記少なくとも３つのウェルに対して沿って合焦する前記平面を計算するように構成されている、オートフォーカス装置。
29. 前記少なくとも１つの対物レンズが、追加的なフォーカス操作を行わずに前記平面に沿って前記複数のウェルを走査するように構成されている、請求項２８記載のオートフォーカス装置。
30. 前記少なくとも１つの対物レンズが前記第１の対物レンズであり、前記第２の倍率が前記第１の倍率と等しい、請求項２８又は２９記載のオートフォーカス装置。
31. 前記少なくとも１つの対物レンズが、前記第１の対物レンズと異なる第２の対物レンズであり、前記第２の倍率が、前記第１の倍率よりも小さい、請求項２８又は２９記載のオートフォーカス装置。
32. 前記計算コンポーネントが：
    前記第２の対物レンズの光学特性に基づいて、前記第１の対物レンズを使用して特定された前記合焦位置のうち少なくとも３つを、前記第２の対物レンズの対応する第２の合焦位置に変換すること；及び
    少なくとも３つの前記第２の合焦位置に基づいて前記合焦面を計算すること
    によって、前記合焦面を計算するようにプログラムされている、請求項３１記載のオートフォーカス装置。
33. 前記計算コンポーネントが：
    少なくとも３つの前記合焦位置に基づいて、前記第１の対物レンズが前記少なくとも３つのウェルに対して沿って合焦する前記第１の平面を計算すること；及び
    前記第２の対物レンズの光学特性に基づいて、前記第１の平面を、前記第２の対物レンズが前記少なくとも３つのウェルに対して沿って合焦する対応する平面に変換することによって前記平面を計算すること
    によって、前記合焦面を計算するようにプログラムされている、請求項３１記載のオートフォーカス装置。
34. 前記計算コンポーネントが、前記サブセットにおけるそれぞれのウェルについて前記合焦位置を特定するようにプログラムされている、請求項２８〜３３のいずれか一項記載のオートフォーカス装置。
35. 該装置は、前記ウェルのそれぞれが一般的に円筒状の側壁並びに球の部分、放物線、及び楕円の部分のうち少なくとも１つを含む底面を含むプレートでの使用に適応されている、請求項２８〜３４のいずれか一項記載のオートフォーカス装置。
36. 該装置は、前記ウェルのそれぞれがＵ字状の断面を有するプレートでの使用に適応されている、請求項２５〜３５のいずれか一項記載のオートフォーカス装置。
37. 該装置は、前記ウェルのそれぞれが一般的に円筒状の側壁及び平面状の底面を含むプレートでの使用に適応されている、請求項２８〜３４のいずれか一項記載のオートフォーカス装置。
38. 前記ウェルのそれぞれが一般的に矩形の断面を有するように、前記平面状の底面が前記プレートの上面に一般的に平行に配置されている、請求項３７に記載のオートフォーカス装置。
39. 該装置は、前記ウェルのそれぞれが円錐台形状であるプレートでの使用に適応されている、請求項２８〜３４のいずれか一項記載のオートフォーカス装置。
40. 該装置は、前記ウェルのそれぞれが、傾斜した側壁、平面状の底、及び台形の断面を有するプレートでの使用に適応されている、請求項２８〜３４のいずれか一項記載のオートフォーカス装置。
41. 前記プレートの前記部分が、前記プレートの象限を含む、請求項２８〜４０のいずれか一項記載のオートフォーカス装置。
42. 前記プレートの前記部分が、前記プレートの全体を含む、請求項２８〜４０のいずれか一項記載のオートフォーカス装置。
43. ウェルの少なくとも部分の合焦位置を自動的に決定するためのオートフォーカス装置であって、
    前記装置が：
    前記ウェルの前記部分の合焦位置を計算するようにプログラムされた計算コンポーネント；
    前記計算コンポーネントと機能的に関連付けられた第１の対物レンズであって、前記第１の対物レンズが第１の倍率を有し、前記第１の対物レンズからの画像が、前記ウェルの少なくとも１つの位置において前記ウェルに対する前記第１の対物レンズの第１の合焦位置を特定するための前記計算コンポーネントにより使用される、第１の対物レンズ；及び
    第２の倍率を有する第２の対物レンズであって、前記第２の対物レンズが前記第１の対物レンズと異なり、前記第２の倍率が前記第１の倍率よりも小さい、前記ウェルに対する前記少なくとも１つの対物レンズの対応する合焦位置の高さで前記ウェルの少なくとも部分を走査するための、第２の対物レンズ
    を含み、
    前記計算コンポーネントが、前記少なくとも１つの対物レンズの光学特性に基づいて、前記対応する合焦位置を特定するようにプログラムされている、オートフォーカス装置。
44. 前記の少なくとも１つの対物レンズが、追加的なフォーカス操作を行わずに前記ウェルの前記部分を走査するように構成されている、請求項４３記載のオートフォーカス装置。
45. 前記計算コンポーネントが、前記第２の対物レンズの光学特性に基づいて、前記第１の合焦位置を、前記第２の対物レンズの前記の対応する合焦位置に変換することにより、前記の対応する合焦位置を特定するようにプログラムされている、請求項４３又は４４記載のオートフォーカス装置。
46. 該装置は、一般的に円筒状の側壁並びに球の部分、放物線、及び楕円の部分のうち少なくとも１つを含む底面を含むウェルでの使用に適応されている、請求項４３〜４５のいずれか一項記載のオートフォーカス装置。
47. 該装置は、Ｕ字状の断面を有するウェルでの使用に適応されている、請求項４３〜４５のいずれか一項記載のオートフォーカス装置。
48. 該装置は、一般的に円筒状の側壁及び平面状の底面を含むウェルでの使用に適応されている、請求項４３〜４５のいずれか一項記載のオートフォーカス装置。
49. 前記ウェルが一般的に矩形の断面を有するように、前記平面状の底面が、前記プレートの上面に一般的に平行に配置されている、請求項４８記載のオートフォーカス装置。
50. 該装置は、円錐台形状のウェルでの使用に適応されている、請求項４３〜４５のいずれか一項記載のオートフォーカス装置。
51. 該装置は、傾斜した側壁、平面状の底、及び台形の断面を有するウェルでの使用に適応されている、請求項４３〜４５のいずれか一項記載のオートフォーカス装置。