DE60212343T2

DE60212343T2 - Verfahren zur schätzung der besten anfangsfokussierung

Info

Publication number: DE60212343T2
Application number: DE60212343T
Authority: DE
Inventors: Pittsburg Ippolito Kim; Oleg Allison Park LAPETS; Michael Pittsburg SIPE; Randall Pittsburg SHOPOFF
Original assignee: Cellomics Inc
Current assignee: Cellomics Inc
Priority date: 2001-02-02
Filing date: 2002-02-01
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2022-02-02
Also published as: US20020172964A1; EP1368689B1; WO2002063367A1; US6970789B2; DK1368689T3; DE60212343D1; EP1368689A1; ATE330244T1

Description

Verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen US-Anmeldung Serien-Nr. 60/266,163, die am 2. Februar 2001 angemeldet worden ist.
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Autofokussierungsverfahren für Mikroskopsysteme.
Hintergrund
Screens mit hohem Durchsatz (high throughput screens; „HTS") und Screens mit großem Inhalt (high content screens; "HCS") sind essentielle Techniken für die Verwendung bei der Entwicklung von Medikamenten und verwandten Bereichen. Bei der herkömmlichen HTS werden Gemische von Verbindungen und biologischen Reagenzien zusammen mit einer Indikatorverbindung verwendet, die in Arrays von Vertiefungen in herkömmlichen Mikrotiterplatten mit 96 oder 384 Vertiefungen geladen werden. Das bei jeder Vertiefung gemessene Signal, entweder Fluoreszenzemission, optische Dichte oder Radioaktivität, integriert das Signal des gesamten Materials in der Vertiefung, wodurch ein Gesamtdurchschnitt der Population von allen Molekülen in der Vertiefung geliefert wird. Im Gegensatz zu der HTS sind zahlreiche HCS entwickelt worden, um den Bedarf nach detaillierterer Information über die temporale und räumliche Dynamik von Zellbestandteilen und Zellprozessen zu befriedigen. Bei HCS wird die Extraktion von Mehrfarbenfluoreszenzinformation automatisiert, die von spezifischen auf Fluoreszenz basierenden Reagenzien abgeleitet wird, die in den Zellen enthalten sind (Guiliano and Taylor (1995), Curr. Op. Cell Biol. 7:4; Guiliano et al. (1995) Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24:405). Zellen werden unter Verwendung eines optischen Systems analysiert, das sowohl eine räumliche als auch eine temporale Dynamik messen kann (Farkas et al. (1993) Ann. Rev. Physiol. 55:785; Giuliano et al. (1990) In Optical Microscopy for Biology. B. Herman and K. Jacobson (Hrsg.), S. 543-557. Wiley-Liss, New York; Hahn et al. (1992) Nature 359:736; Waggoner et al. (1996) Hum. Pathol. 27:494). Das Konzept besteht darin, jede Zelle als ein Objekt aufzufassen, das räumliche und temporale Information über die Aktivitäten der gekennzeichneten bzw. markierten Bestandteile aufweist.
Die Bilderfassung ist eine der Schlüsselprozeduren bei dem Merkmalsextraktionsprozess, der bei HTS und HCS verwendet wird. Um die Analyse von Zellen zu automatisieren, die im Raum verteilt sind, ist es notwendig, den Prozess der Bilderfassung von unterschiedlichen Abschnitten eines Slides oder unterschiedlichen Vertiefungen oder Feldern innerhalb einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte zu automatisieren. Herkömmliche Autofokussierungsverfahren umfassen die Berechnung von einigen Bildstatistiken für alle unterschiedlichen Fokalebenen und sodann die Auswahl der Fokalebene mit der besten Statistik. Dieses Verfahren ist kostspielig sowohl hinsichtlich der Zeit als auch hinsichtlich der Fotobleichung (photobleaching) der Probe und beschränkt die Effizienz von HTS und HCS. Ferner können Probleme aufgrund von Ungleichförmigkeiten in dem Slide oder der Mikrotiterplatte auftreten, so dass die Position der Platte relativ zu dem Objektiv an unterschiedlichen Stellen bzw. Orten auf dem Slide oder der Mikrotiterplatte unterschiedlich ist.
In der US 5,860,032 wird eine Autofokussierungsvorrichtung einer Kamera sowie ein Verfahren beschrieben, dass eine genaue Vorhersageverfolgung von Objekten ermöglicht, die sich mit hoher Geschwindigkeit bewegen. Der Antrieb der Fokussierung der Linse wird auf der Grundlage eines Defokussierungsgrößendetektors ausgeführt, der den Unterschied zwischen einer Bildebene einer Linse und einer vorhergesagten Bildzusammensetzungsebene detektiert.
Ein Linsenantriebskorrekturverfahren, bei dem eine Fokussierungsverstellvorrichtung verwendet wird, die den Fokus des Objekts nach einer vorbestimmten Zeit anpasst, wird in der US 5,060,002 beschrieben.
In der US 5,732,292 wird ein Fokussierungsverfahren beschrieben, bei dem eine Detektionsvorrichtung verwendet wird, in der die Fokusdetektion mit hoher Genauigkeit sogar dann erreicht werden kann, wenn der Zustand eines Objekts nicht optimal ist. Die Fokusdetektion kann unabhängig von der Information des Objekts be wirkt werden, das eine Fernsicht und eine Nahsicht in dem weiten Gesichtsfeld enthält.
Es besteht somit ein Bedarf nach einem schnelleren Autofokussierungsverfahren, um die Effizienz und den Durchsatz von HTS und HCS zu verbessern, sowie nach einem Verfahren, das Ungleichförmigkeiten in der Probenplatte korrigiert. Die vorliegende Erfindung befriedigt diesen Bedarf.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Bestimmen einer besten Anfangsfokuspositionsabschätzung für einen momentanen Probenort auf einem Substrat bereit, das eine Vielzahl von Probenorten aufweist.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein computerlesbares bzw. maschinenlesbares Speichermedium gemäß Anspruch 12 bereit, das ein Programm umfasst, das einen Satz von Anweisungen enthält, die ein Zellenscreeningsystem dazu veranlassen, die Prozeduren des vorstehenden Verfahrens auszuführen.
Beschreibung der Figuren
1 zeigt ein Flussdiagramm, in dem eine bevorzugte Ausführungsform des Autofokussierungsverfahrens gemäß der Erfindung dargestellt ist.
2 zeigt ein Flussdiagramm, in dem ein bevorzugtes Verfahren zum Analysieren einer Mikrotiterplatte dargestellt ist.
3A zeigt ein Flussdiagramm, in dem ein bevorzugtes Verfahren zum Verarbeiten einer einzelnen Vertiefung innerhalb einer Mikrotiterplatte dargestellt ist.
3B zeigt ein Flussdiagramm, in dem ein Beispiel eines Verfahrens zum Verarbeiten mehrerer Felder innerhalb einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte dargestellt ist.
4 zeigt ein Flussdiagramm, in dem eine bevorzugte Ausführungsform der Autofokussierungsverfahren gemäß der Erfindung dargestellt ist.
5 zeigt ein Flussdiagramm, in dem ein Autofokussierungsverfahren mit einer Software mit einer zweifachen Schleife dargestellt ist.
6A und 6B zeigten Flussdiagramme, in denen eine intelligente Fokussierungsprozedur (smart-focus procedure) dargestellt ist.
7 zeigt ein Flussdiagramm, in dem ein bevorzugter Algorithmus zur Berechnung einer gewichteten Abschätzung mittels des Verfahrens kleinster Quadrate dargestellt ist.
8 zeigt eine grafische Darstellung einer linearen Regressionsanalyse und einer quadratischen Regressionsanalyse von unbearbeiteten Fokussierungsdaten einer Mikrotiterplatte.
9 zeigt eine grafische Darstellung einer linearen Regressionsanalyse mit vier Datenpunkten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Autofokussierungsverfahren bereit, die schneller als herkömmliche Verfahren sind und Unregelmäßigkeiten in dem Substrat/den Probenorten der analysierten Probe berücksichtigt, und somit in großem Maße Autofokussierungsfehlerraten vermindert und die Menge an Information maximiert, die mittels HTS und HCS erzeugt werden kann. Die Erfindung betrifft jedweden Typ von Mikroskopie, bei dem ein Objekt bzw. Objekte in mehr als einem Feld untersucht werden muss bzw. müssen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Mikroskopie von biologischen Proben (wie beispielsweise Zellen und Gewebeabschnitten), mikroelektronischen Proben, forensischen Proben und Nahrungsmittelwissenschaftsproben.
Gemäß einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen einer besten Anfangsfokuspositionsabschätzung für einen momentanen Probenort auf einem Substrat bereit, das eine Vielzahl von Probenorten umfasst, wobei das Verfahren das Bestimmen der besten Anfangsfokuspositionsabschätzung durch die Verwendung eines Ergebnisses einer oder mehrerer Techniken umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus der linearen Regressionsanalyse von Fokuspositionen, die für wenigstens zwei weitere Probenorte auf dem Substrat bestimmt worden sind, und der quadratischen Regressionsanalyse von Fokuspositionen, die für wenigstens drei weitere Probenorte auf dem Substrat bestimmt worden sind.
Der hier verwendete Begriff „Probenort" bezeichnet einen Unterbereich innerhalb eines größeren Substrats, das eine Probe bzw. Proben enthält, die über ein Gebiet verteilt sind, das optisch abgebildet werden soll. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Probe eine Vielzahl von Zellen, die räumlich auf dem bzw. über das Substrat verteilt sind.
Substrate, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Mikrotiterplatten mit einem Glas- oder Kunststoffboden, Glas- oder Kunststoff-Slides, chemisch gemusterte Substrate, die zellbindende Stellen umfassen, Petrischalen und Laborfläschchen. Die Unterbereiche innerhalb eines größeren Substrats können umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Vertiefungen, wie beispielsweise die einer Mikrotiterplatte, zellbindende Stellen auf einer chemisch gemusterten Oberfläche und benutzerdefinierte Unterbereiche von Substraten. Die Anzahl der Probenorte ist ein benutzerdefinierbarer Parameter. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Substrat um eine Mikrotiterplatte und die Probenorte umfassen Vertiefungen auf der Mikrotiterplatte.
Indem eine beste Anfangsfokusposition für einen gegebenen Probenort gemäß den Verfahren der Erfindung bestimmt wird, wird die Verarbeitungsgeschwindigkeit gesteigert, indem der Suchbereich beschränkt wird, um die endgültige Fokusposition für den Probenort zu finden. Die Verarbeitungszeit wird ungefähr auf ein Fünftel der Zeit reduziert, die für das Fokussieren unter Verwendung eines eingehenden Suchverfahrens erforderlich ist, wie dies beispielsweise bei herkömmlichen Autofokussierungsverfahren der Fall ist.
Der hierin verwendete Begriff „beste Anfangsfokusposition" bezeichnet die beste Näherung der Fokalebene bzw. Brennebene für einen gegebenen Probenort. „Fokalebene" bzw. „Brennebene" ist als die Ebene senkrecht zu der optischen Achse bei der Z-Koordinate der Probe für einen bestimmten Satz von X- und Y-Koordinaten definiert.
Der hierin verwendete Begriff „lineare Regressionsanalyse" bezeichnet das Anpassen bzw. das Fitten eines Modells, wie beispielsweise einer Geraden oder einer Ebene, durch einen gegebenen Satz von Punkten gemäß eines bestimmten Fitgütekrite riums, um die Parameter einer geeigneten linearen Funktion zu liefern. Die Analyse erfordert minimal zwei Datenpunkte und kann mittels eines linearen Verfahrens kleinster Quadrate oder jedwedem anderen geeigneten Verfahren durchgeführt werden, das die Unterschiede zwischen den Daten und dem Modell auf ein Mindestmaß beschränkt, das verwendet wird, um die Daten zu fitten.
Der hierin verwendete Begriff „quadratische Regressionsanalyse" bezeichnet das Fitten eines Modells, wie beispielsweise einer Parabel oder einer quadratischen Oberfläche, durch einen gegebenen Satz von Punkten gemäß einem bestimmten Fitgütekriterium, um die Parameter einer geeigneten quadratischen Funktion zu liefern. Die Analyse erfordert mindestens drei Datenpunkte und kann mittels eines Verfahrens kleinster Quadrate oder jedwedem anderen geeigneten Verfahren durchgeführt werden, das die Unterschiede zwischen den Daten und dem Modell auf ein Mindestmaß beschränkt, das dazu verwendet wird, um die Daten zu fitten.
Die Abschätzung der besten Anfangsfokusposition für einen momentanen Probenort kann auf den Ergebnissen basieren, die lediglich mittels der linearen Regressionsanalyse gewonnen worden sind. In einer bevorzugten Ausführungsform basiert die Abschätzung der besten Anfangsfokusposition für einen momentanen Probenort auf Ergebnissen der quadratischen Regressionsanalyse. Beispielsweise könnte man adaptiv die eine oder die andere Analyse auswählen, indem die Analyse ausgewählt wird, die das Ergebnis geliefert hat, das für die größte Zahl von vorherigen Probenorten der richtigen Fokusposition am nächsten liegt. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform basiert die Abschätzung der besten Anfangsfokusposition für einen momentanen Probenort auf Ergebnissen von sowohl der quadratischen Regressionsanalyse als auch der linearen Regressionsanalyse, wie beispielsweise indem ein Durchschnitt bzw. Mittelwert der Ergebnisse von den beiden Analysen bestimmt wird. Dies könnte beispielsweise dadurch geschehen, dass die zwei Abschätzungen miteinander addiert werden und durch 2 geteilt werden. Noch weiter bevorzugt wird ein gewichteter Durchschnitt der Ergebnisse von den beiden Analysen verwendet. Beispielsweise könnte man die eine oder die andere Analyse adaptiv höher gewichten, indem die Analyse ausgewählt wird, die die Ergebnisse geliefert hat, das für die größte Anzahl von vorherigen Probenorten der korrekten Fokusposition am nächsten gelegen hat. Alternativ kann der quadratischen Abschätzung ein höheres Gewicht verliehen werden, wenn die Fläche, die durch die Böden der Plattenvertiefungen ausgebildet wird, gekrümmt ist. Wenn die Oberfläche jedoch durch eine geneigte Ebene ausgebildet wird, wäre es bevorzugt, der linearen Abschätzung ein höheres Gewicht zu verleihen. Ohne ein vorheriges Wissen von einer Platte wird ein einfacher Durchschnitt der zwei Abschätzungen bevorzugt.
Die Verfahren gemäß der Erfindung können zusammen mit jedwedem Zellenscreeningsystem verwendet werden, das (a) ein Abbildungssystem umfasst, das eine Lichtquelle und eine Kamera oder einen Detektor umfasst, und zwar vorzugsweise eine Kamera, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf eine Digitalkamera oder eine analoge Videokamera; (b) ein Fokuspositionierungssystem, einschließlich wenigstens eines Mikroskopobjektivs; (c) ein XY-Positionierungssystem, einschließlich wenigstens eines Objekttisches; und (d) ein Steuersystem, das eine zentrale Verarbeitungseinheit für das Empfangen und das Verarbeiten von Daten und für das Steuern automatisierter Funktionen des Zellenscreeningsystems umfasst. Beispiele für derartige Zellenscreeningsysteme umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Fluoreszenzzellenscreeningsysteme, Abtastungselektronenmikroskopsysteme und Mikroskopsysteme mit transmittiertem Licht.
Das Zellenscreening ist ein Prozess, bei dem Zellen an Probenorten auf einem Substrat verteilt sind, das mit einem oder mehreren Reagenzien behandelt worden ist, und optisch hinsichtlich phänotypischer Veränderungen untersucht bzw. überwacht werden. Beispielsweise können die Zellen fluoreszente Reportermoleküle enthalten und das optische Screenen umfasst das Überwachen fluoreszenter Signale von den Zellen. In einem derartigen Beispiel umfasst das Autofokussieren das Fokussieren auf das Fluoreszenzsignal, das von den Zellen emittiert wird. In weiteren Beispielen, wie beispielsweise der Mikroskopie heller Felder, kann das Fokussieren mittels lichtabsorbierender Objekte durchgeführt werden, wie beispielsweise Zellen.
Die Autofokussierungsverfahren gemäß der Erfindung können durch dieselbe zentrale Verarbeitungseinheit (central processing unit; CPU), die das Zellenscreeningsystem steuert, oder mittels einer separaten CPU gesteuert werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Autofokussieren von Probenorten auf einem Substrat bereit, umfassend das Bestimmen einer Fokusposition für einen ersten Probenort auf dem Substrat und einen zweiten Probenort auf dem Substrat, Abschätzen einer besten Anfangsfokusposition für einen dritten Probenort auf dem Substrat, indem ein Ergebnis einer linearen Regressionsanalyse der Fokusposition für den ersten Probenort und den zweiten Probenort verwendet wird, Fokussieren, um eine Fokusposition für den dritten Probenort zu er halten, Abschätzen einer besten Anfangsfokusposition für einen vierten Probenort auf dem Substrat, indem ein Ergebnis von einer oder mehreren Techniken verwendet wird, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus der linearen Regressionsanalyse von Fokuspositionen, die für wenigstens zwei andere Probenorte auf dem Substrat bestimmt worden sind, und der quadratischen Regressionsanalyse von Fokuspositionen, die für wenigstens drei weitere Probenorte auf dem Substrat bestimmt worden sind, Fokussieren, um eine Fokusposition für den vierten Probenort zu erhalten, und Wiederholen der zwei letzten Schritte bei einer gewünschten Anzahl von Probenorten auf dem Substrat.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Aspekts ist in 1 dargestellt, wie diese auf das Screenen einer Mikrotiterplatte mit Probenorten angewendet wird, die Vertiefungen enthält. Beim ersten Schritt wird das Instrument ausgerichtet, um die erste Vertiefung der Platte zu analysieren 15, und eine Suche hinsichtlich der Fokussierung wird über einen großen Bereich von Fokalebenen durchgeführt 20. Nachdem man sich zu der zweiten Vertiefung bewegt hat 25, wird die Fokusposition der ersten Vertiefung als die beste Anfangsfokusposition der zweiten Vertiefung verwendet 30 und die Fokusposition der zweiten Vertiefung wird anschließend bestimmt, indem über einen schmaleren Bereich von Fokalebenen fokussiert wird 35. Das Instrument wird sodann ausgerichtet, um die dritte Vertiefung zu analysieren 40. Die beste Anfangsfokusposition der dritten Vertiefung wird mittels linearer Regressionsanalyse der Fokuspositionen der ersten und der zweiten Vertiefung bestimmt 45, und die Fokusposition der dritten Vertiefung wird anschließend bestimmt, indem durch einen kleineren Bereich von Fokalebenen fokussiert wird 50. Nach der Ausrichtung des Instruments, um die vierte Vertiefung und nachfolgende Vertiefungen zu analysieren 55, wird die beste Anfangsfokusposition der Vertiefung auf der Grundlage der Ergebnisse einer linearen Regressionsanalyse und einer quadratischen Regressionsanalyse von allen oder einer Untermenge der vorherigen Vertiefungen bestimmt 60, wie dies vorstehend beschrieben worden ist.
In dieser Ausführungsform umfasst „das Fokussieren über einen schmaleren Bereich von Fokalebenen" das Variieren der besten Anfangsfokusposition in diskreten Inkrementen, wobei ein digitales Bild des Probenorts bei jeder Fokalebene aufgenommen wird, und das Bestimmen einer oder mehrerer Fokusqualitätsmetriken, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Laplace-Energie, Bildvarianz und Gradientenenergie. Der hier verwendete Begriff „Fokusqualitätsmetrik" bezeichnet eine Zahl, die anhand des Bildes bestimmt wird und mit dem Fokussierungsgrad in Beziehung steht. Der Probenort befindet sich im Fokus bei der Fokusposition, wo die Fokusqualitätsmetrik den größten Wert aufweist. Die verwendete Fokusqualitätsmetrik hängt von den Zellen ab, die optisch abgebildet werden.
Die Genauigkeit der besten Anfangsfokuspositionsabschätzung ist sehr wichtig, um verlässliche Ergebnisse zu liefern. Umso näher die Abschätzung an der tatsächlichen Fokusposition liegt, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass das Autofokussierungsverfahren die richtige Fokusposition finden wird, anstatt eine falsche Fokusqualitätsmetrik zu detektieren.
Die Genauigkeit der besten Anfangsfokuspositionsabschätzung ist eine Funktion des Abstands von der momentanen Position zu den anderen Probenorten auf dem Substrat, für die eine Fokusposition bestimmt worden ist. Umso näher diese den anderen Fokuspositionen ist, desto höher ist die Verlässlichkeit der Abschätzung. Umgekehrt ist die Verlässlichkeit umso niedriger, desto größer der Abstand ist. Somit bestimmt in einer bevorzugten Ausführungsform für nachfolgende Probenorte auf dem Substrat der Algorithmus, ob es gespeicherte vorherige Fokuspositionen innerhalb eines gegebenen Abstands von dem momentanen Probenort gibt, wobei der gegebene Abstand mittels eines Eingabeparameters programmiert werden kann und durch einen empirischen Prozess ausgewählt wird.
Wenn es gespeicherte vorherige Fokuspositionen innerhalb des gegebenen Abstands von dem momentanen Probenort gibt, dann wird die beste Anfangsfokusposition des momentanen Probenorts mittels der erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt und die tatsächliche Fokusposition wird mittels einer Fokussuche in einem kleinen Bereich von Fokalebenen um die beste Anfangsfokusposition bestimmt, wonach die X-, Y- und Z-Koordinaten des momentanen Probenorts für die weitere Verwendung gespeichert werden. Wenn es keine gespeicherten vorherigen Fokuspositionen innerhalb eines gegebenen Abstands des momentanen Probenorts gibt, dann wird eine Fokussuche über einen größeren Bereich von Fokalebenen durchgeführt, wie beispielsweise für den ersten Probenort auf einem Substrat.
Da das Zurückgreifen auf ein ausgiebiges Suchverfahren kostspielig ist (hinsichtlich der Zeit und hinsichtlich der Fotobleichung der Probe), ist es ratsam, ein Abtastmuster auszuwählen, das den Abstand zwischen der momentanen Position und den vorherigen Positionen, für die eine Fokusposition bestimmt worden ist, auf ein Mindestmaß beschränkt, um somit die Möglichkeit zu maximieren, eine akkurate beste Anfangsfokuspositionsabschätzung zu erhalten. Für den Fall einer Mikrotiterplatte ist es daher beispielsweise wünschenswert, die Vertiefungen in der Reihenfolge ihrer Position abzutasten (A1, A2, A3, ...), anstatt diese auf eine unzusammenhängende Art und Weise abzutasten (A1, A10, A3, A5).
Gemäß einem weiteren Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ein computerlesbares Speichermedium, das ein Programm umfasst, das einen Satz von Anweisungen enthält, um zu bewirken, dass ein Zellscreeningsystem einen Satz von Prozeduren ausführt, um eine beste Anfangsfokuspositionsabschätzung für einen momentanen Probenort auf einem Substrat zu bestimmen, das eine Vielzahl von Probenorten umfasst, wobei die Prozeduren das Bestimmen der besten Anfangsfokuspositionsabschätzung durch die Verwendung eines Ergebnisses von einer oder mehreren Techniken umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus der linearen Regressionsanalyse von Fokuspositionen, die für wenigstens zwei andere Probenorte auf dem Substrat bestimmt sind, und der quadratischen Regressionsanalyse von Fokuspositionen, die für wenigstens drei weitere Probenorte auf dem Substrat bestimmt sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ein computerlesbares Speichermedium, das ein Programm umfasst, das einen Satz von Anweisungen enthält, um zu bewirken, dass ein Zellenscreeningsystem einen Satz von Prozeduren zum Autofokussieren von Probenorten auf einem Substrat ausführt, umfassend das Bestimmen einer Fokusposition eines ersten Probenorts auf dem Substrat und eines zweiten Probenorts auf dem Substrat, Abschätzen einer besten Anfangsfokusposition für einen dritten Probenort auf dem Substrat, indem ein Ergebnis einer linearen Regressionsanalyse der Fokusposition für den ersten Probenort und den zweiten Probenort verwendet wird, Fokussieren, um eine Fokusposition für den dritten Probenort zu erhalten, Abschätzen einer besten Anfangsfokusposition für einen vierten Probenort auf dem Substrat, indem ein Ergebnis einer oder mehrerer Techniken verwendet wird, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus der linearen Regressionsanalyse von Fokuspositionen, die für wenigstens zwei weitere Probenorte auf dem Substrat bestimmt worden sind, und der quadratischen Regressionsanalyse von Fokuspositionen, die für wenigstens drei weitere Probenorte auf dem Substrat bestimmt worden sind, Fokussieren, um eine Fokusposition für den vierten Probenort zu erhalten, und Wiederholen der letzten beiden Schritte für eine erwünschte Anzahl von Probenorten auf dem Substrat.
Das computerlesbare Medium umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf magnetische Disks, optische Disks, organischen Speicher und andere flüchtige (z.B. RAM; random access memory) oder nicht-flüchtige (z.B. ROM; read-only memory) Massenspeichersysteme, die mittels der CPU gelesen werden können. Das computerlesbare Medium umfasst zusammenwirkende oder miteinander verbundene computerlesbare Medien, die exklusiv auf dem Verarbeitungssystem existieren oder über mehrere miteinander verbundene Verarbeitungssysteme verteilt sind, die hinsichtlich des Verarbeitungssystems lokal oder rechnerfern sein können.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung umfasst das Zellenscreeningsystem ein Abbildungssystem, ein Fokuspositionierungssystem, ein XY-Positionierungssystem und ein Steuersystem, wie dies vorstehend definiert worden ist.
Die vorliegende Erfindung kann besser unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele verstanden werden, die lediglich dem Zwecke der Illustration dienen und nicht so ausgelegt werden sollten, dass diese den Schutzumfang der Erfindung beschränken, wie dieser durch die angehängten Ansprüche definiert wird.
Beispiele
Beispiel 1. Regressionsanalyse
Problem: Wenn eine Anzahl von Stützpunkten (x_i, y_i, z_i) gegeben ist, dann fitte eine mathematische Funktion an diese Punkte und verwende diese Funktion, um eine Abschätzung für den besten Fokus Z_best für andere x, y zu bestimmen. „Stützpunkt" bezeichnet einen bestimmten Satz von X-, Y- und Z-Koordinaten, die eine Fokusposition für einen bereits fokussierten Probenort darstellen. Z_best ist hier definiert als der Z-Wert, der der Fokusposition für einen gegebenen Satz von X- und Y-Koordinaten entspricht.
Auf der Grundlage der Anzahl von Stützpunkten innerhalb eines vordefinierten Radius des momentanen Probenorts, für den eine Abschätzung der anfänglichen Fokalebene notwendig ist, kann die nachstehende bevorzugte Analyse durchgeführt werden:
Ein Stützpunkt: Das „z" von diesem Stützpunkt wird als die anfänglich abgeschätzte Fokalebene für den momentanen Probenort verwendet.
Zwei Stützpunkte: Eine exakte Linie bzw. Gerade durch diese zwei Stützpunkte (lineares Modell) wird definiert und verwendet, um die abgeschätzte Fokalebene für den momentanen Probenort zu bestimmen.
Drei Stützpunkte, die alle in derselben Reihe oder Zeile auf dem Substrat liegen: Eine exakte Parabel durch diese drei Stützpunkte (quadratisches Modell) zusätzlich zu der besten Fittlinie durch die Stützpunkte (lineares Modell) wird definiert und verwendet, um die abgeschätzte Fokalebene für den momentanen Probenort zu bestimmen.
Drei Stützpunkte, die nicht alle in derselben Reihe oder Zeile auf dem Substrat liegen: Eine exakte Ebene durch diese drei Stützpunkte wird definiert und verwendet, um die abgeschätzte Fokalebene für den momentanen Probenort zu bestimmen.
Vier oder mehr Stützpunkte, die alle in derselben Reihe oder Zeile auf dem Substrat liegen: Eine gewichtete beste Fittparabel durch alle Stützpunkte (quadratisches Modell) wird zusätzlich zu der besten Fittlinie durch die drei am nächsten liegenden Stützpunkte (lineares Modell) definiert und verwendet, um die abgeschätzte Fokalebene für den momentanen Probenort zu bestimmen.
Vier oder mehr Stützpunkte, die nicht alle in derselben Reihe oder Zeile liegen: Eine gewichtete quadratische Oberfläche (best fit) durch alle Stützpunkte (quadratisches Modell) wird zusätzlich zu der exakten Ebene durch die drei am nächsten liegenden Stützpunkte (lineares Modell) definiert und verwendet, um die abgeschätzte Fokalebene für den momentanen Probenort zu bestimmen. Ein Typ einer quadratischen Oberfläche ist der Paraboloid, der in dem Mikrotiterplattenbeispiel dargestellt ist.
Beispiel 2. Hintergrund hinsichtlich der Regression in zwei Dimensionen
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Problem der linearen Regression vereinfacht so dargestellt werden:
GEGEBEN

1. eine Tabelle von Daten
2. ein hypothetisches lineares Modell

y = ax + b,

Um zu messen, wie gut der Fitt zwischen dem linearen Modell und den Datenpunkten ist, wird ein UNTERSCHIEDSMASS bei den Datenpunkten bestimmt. Es gibt mehrere Möglichkeiten, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die folgenden drei Beispiele:
Ein lineares Verfahren kleinster Quadrate verwendet das dritte Maß in der vorstehenden Liste:
Diese Funktion ist eine Funktion der Parameter a und b. Da es das Ziel ist, gemäß diesem Maß einen besten Fitt zu erhalten, ist es wünschenswert, diese Funktion als eine Funktion dieser zwei Parameter zu minimieren.
Um dies zu tun, werden die üblichen notwendigen Bedingungen für ein Minimum verwendet, nämlich:
wobei mittels dieser Gleichungen, die hinsichtlich der Parameter gelöst werden müssen, können a und b berechnet werden. Ein Beispiel einer linearen Regressionsanalyse für eine Gerade lautet folgendermaßen: y = ax + bwobei a und b Konstanten sind, die für einen gegebenen Satz von X und Y bestimmt werden müssen
Σxi 2 = 4 + 9 + 25 + 36 = 14 Σxl = 2 + 3 + 5 + 6 = 16 Σyl = 1 + 3 + 4 + 6 = 14 Σxiyl = 2 + 9 + 20 + 36 = 67n = 4
Dies liefert das System von Gleichungen: 74a + 16b = 67 16a + 4b = 14
Die Lösung lautet
a = 1,1; b = –0,9
Schließlich lautet die lineare Regressionsgerade:
y = 1,1 x – 0,9
In 9 ist ein Plot der Daten und der besten Fittgeraden dargestellt.
Für irgendeinen Wert von x kann man eine Abschätzung für das entsprechende y finden. Beispielsweise für x = 4 beträgt die Abschätzung für y = 1,1·4 – 0,9 = 3,5.
Quadratisches Problem
Dieselben Techniken, wie diese für das lineare Verfahren kleinster Quadrate beschrieben worden sind, können verwendet werden, um die Gleichungen für das Problem des Fittens eines quadratischen Polynoms zu finden. y = ax2 + bx + c
Beispiel 3. Zellenscreening einer Mikrotiterplatte
Ein detailliertes Beispiel der Verwendung der Autofokussierungsverfahren gemäß der Erfindung in einem Verfahren zum Screenen einer Mikrotiterplatte, wo die Probenorte Vertiefungen sind, die Zellen umfassen, ist in den 2 bis 5 dargestellt. Die Analyse einer Mikrotiterplatte (2) wird gestartet 100 mit einer ersten Vertiefung 110. Die Vertiefung wird verarbeitet 120, das Instrument wird erneut ausgerichtet, um die nächste Vertiefung zu analysieren 130 und die Schritte 110 bis 130 werden wiederholt, bis alle Vertiefungen analysiert worden sind 140.
Jede Vertiefung wird mittels eines Verfahrens verarbeitet, das das Autofokussieren der Vertiefung auf der Basis des Autofokussierungsverfahrens nach 3A und das Verarbeiten der Felder innerhalb der Vertiefung umfasst (3B). Wie sich 3A entnehmen lässt, beginnt das Verfahren 200, indem die X- und Y-Koordinaten des ersten Feldes innerhalb der Vertiefung bestimmt werden 210, wonach die beste Anfangsfokusposition (die nachstehend als Z_est bezeichnet wird) für dieses Feld bestimmt wird 220.
Das Bestimmen von Z_est (4) erfordert eine Eingabe der Anzahl von Stützpunkten, die vorher bestimmt worden sind. N stellt die Anzahl von gespeicherten Stützpunkten dar 305. „Stützpunkt" ist definiert als ein bestimmter Satz von X-, Y- und Z-Koordinaten, die eine Fokusposition für einen vorher fokussierten Probenort darstellen. Anfänglich 300 wird eine Bestimmung durchgeführt, ob mehr als ein Stützpunkt für das Substrat bereits bestimmt worden ist und auf der Systemdatenbank gespeichert worden ist 305. Wenn keine Stützpunkte gespeichert worden sind, wie beispielsweise für die erste Vertiefung auf einem Substrat, so dass N gleich Null ist 310, dann wird keine Bestimmung von Z_est durchgeführt 315. In diesem Fall ist die Gültigkeit von Z_est 225 negativ und das Instrument wird verstellt, um sich zu Z_bottom zu bewegen 240. Z_bottom ist hier als ein benutzerdefinierbarer Parameter definiert, der einen Z-Wert darstellt, so dass sichergestellt wird, dass die Fokalebene eines gegebenen Probenorts darüber liegt. Die Fokusposition für den Probenort wird sodann bestimmt, indem Fokusqualitätsmetriken über einen großen Bereich von Fokalebenen analysiert werden, wie dies vorstehend beschrieben worden ist, um Z_best zu liefern 245. Z_best ist hier als der Z-Wert definiert, der der Fokusposition für einen gegebenen Satz von X- und Y-Koordinaten entspricht. Eine derartige Z_best-Bestimmung kann beispielsweise durch die Autofokussierungsprozedurdoppelschleifensoftware (5) durchgeführt werden, die einen Prozess der Grob- und der Feinfokussierung umfasst. Während der Grobfokussierung wird ein ungefährer Fokusbereich für den Probenort unter Verwendung großer Schritte der Objekttischbewegung identifiziert, wobei ein „Fokusbereich" einen Satz von Fokalebenen darstellt, die analysiert werden sollen. Beim Feinfokussieren wird die endgültige Fokusposition bestimmt, indem der ungefähre Fokusbereich in sehr viel kleineren Schritten abgetastet wird. Sobald Z_best bestimmt worden ist, werden die Werte für X, Y und Z für den momentanen Probenort in einer Stützpunktliste gespeichert 250 und das erste Feld in dem Probenort wird verarbeitet 255, indem das Feld wie erwünscht analysiert wird.
Zusätzliche Felder innerhalb des Probenortes können verarbeitet werden, wie dies in 3B dargestellt ist. Der hier verwendete Begriff „Feld" wird als das Ausmaß der Probe in der XY-Ebene definiert, der in einem einzelnen Bild erfasst wird. Beispielsweise kann eine Vertiefung auf einer Mikrotiterplatte ein einzelnes Feld bei einer geringen Vergrößerung, wie beispielsweise 1,25x, oder mehrere Felder bei einer höheren Vergrößerung umfassen (10x und höher, je nach Größe der Vertiefung). Sobald ein Feld verarbeitet worden ist 255, wird der Bedarf, zusätzliche Felder innerhalb des Probenorts zu analysieren, bestimmt 265. Wenn die Analyse zu sätzlicher Felder erforderlich ist, dann werden die X- und Y-Koordinaten des nächsten Feldes bestimmt 275 und der Wert von Z_est für das nächste Feld wird mit dem Wert von Z_best gleichgesetzt, der für das am nächsten liegende Feld innerhalb des Probenorts bestimmt worden ist 280. Zusätzlich wird ein MinInterval gesetzt 280. Der hierin verwendete Begriff „MinInterval" bezeichnet den Abstand zwischen dem nächsten Feld und dem am nächsten liegenden Feld innerhalb des Probenorts. Der Objekttisch und der Fokusmotor werden zu den X-, Y- und Z_est-Koordinaten des nächsten Feldes 285 bewegt und MinInterval wird mit einem benutzerprogrammierten vordefinierten Maximum verglichen 290, wobei das vordefinierte Maximum dazu dient, um zu bestimmen, ob es notwendig ist, zusätzlich über Z_est hinaus zu fokussieren, und zwar auf der Grundlage der Nähe des nächsten Feldes zu einem vorher autofokussierten Feld. Wenn MinInterval kleiner als das vordefinierte Maximum ist 290, dann wird das Feld verarbeit 255, indem das Feld wie erwünscht analysiert wird. Wenn MinInterval größer als das vordefinierte Maximum ist 290, dann wird die tatsächliche Fokusposition des Felds mittels einer Fokussuche in einem kleinen Bereich von Fokusebenen um Z_est bestimmt, um Z_best zu erzeugen 295, und das Feld wird sodann verarbeitet 255. Wenn alle Felder in dem Probenort verarbeitet worden sind, dann ist die Verarbeitung des ersten Probenorts abgeschlossen 270, das Instrument wird verstellt, um den zweiten Probenort zu analysieren 130 und sodann wird dieser Probenort 110 verarbeitet 120.
Die Analyse des zweiten Probenorts beginnt mit einer Bestimmung der X- und Y-Koordinaten des ersten Feldes innerhalb der Vertiefung 210, wonach Z_est und MinDist bestimmt werden 220. Der hierin verwendete Begirff MinDist definiert den Abstand zwischen der am nächsten gelegenen Fokusposition (Stützpunkt) in der Liste von Fokuspositionen (Stützpunkte), die für das Substrat gespeichert sind. Das vordefinierte Maximum von MinDist ist ein benutzerprogrammierter Parameter, der empirisch bestimmt wird. Für den zweiten Probenort auf der Mikrotiterplatte ist ein Stützpunkt bestimmt worden, der die Fokusposition des ersten Probenorts darstellt. N ist nicht größer als Eins 305 und nicht gleich Null 310 und daher wird Z_est mit der Fokusposition des vorhergehenden Probenorts gleichgesetzt und MinDist wird gleich Null gesetzt 320. Eine Bestimmung der Gültigkeit von Z_est und des Wertes von MinDist relativ zu dem vordefinierten Maximum wird sodann durchgeführt 225. Mit der Überprüfung, dass Z_est gültig ist und dass MinDist kleiner als das vordefinierte Maximum ist, werden der Objekttisch und die Fokusmotoren des Instruments zu den X-, Y- und Z_est-Koordinaten des momentanen Probenorts 230 bewegt und die Fokusposition wird bestimmt, indem über einen kleinen Bereich von Fokal ebenen gesucht wird 235, um Z_best für den momentanen Probenort zu liefern. Eine derartige Z_best-Bestimmung kann beispielsweise mittels der Smart-Fokus-Prozedur durchgeführt werden (6), die bei Z_est startet, die mechanische Z-Achse entlang einer Anzahl von unterschiedlichen Positionen bewegt, ein Bild bei jeder Position aufnimmt und eine Fokusqualitätsmetrik für jedes Bild berechnet. Der Z-Wert, der dem Bild mit der maximalen Fokusqualitätsmetrik entspricht, bestimmt Z_best für ein bestimmtes Feld. Dieses Verfahren geht davon aus, dass die Startposition genau ist, so dass das lokale Maximum das globale Maximum ist (d.h. es gibt keine falschen Fokusqualitätsmetriken). Mit der Bestimmung von Z_best werden die Werte von X, Y und Z_best für den momentanen Probenort in der Stützpunktliste gespeichert 250 und das erste Feld in der Vertiefung wird verarbeitet 255, indem das Feld wie erwünscht analysiert wird. Anschließende Felder in der Vertiefung werden verarbeitet, wie dies vorstehend für die erste Vertiefung beschrieben worden ist.
Das Instrument wird sodann verstellt, um die nächste Vertiefung zu analysieren 130, und diese Vertiefung 110 wird sodann verarbeitet 120. Für den dritten und nachfolgende Probenorte auf der Mikrotiterplatte ist N > 1 305. MinDist wird mit dem Abstand von dem momentanen Probenort zu dem nächstgelegenen Stützpunkt gleichgesetzt 325, und sodann wird überprüft, ob dieser Wert gleich Null ist 330. Wenn MinDist gleich Null ist, dann entspricht der momentane Probenort einem vorher bestimmten Stützpunkt und Z_est wird mit dem Z-Wert gleichgesetzt, der der Fokusposition dieses Stützpunktes entspricht 335, um das erneute Fokussieren auf einen vorher fokussierten Probenort zu vermeiden.
Wenn MinDist nicht gleich Null ist, dann werden sowohl eine lineare Regressionsanalyse als auch eine quadratische Regressionsanalyse mittels der gespeicherten Stützpunkte durchgeführt. Vorzugsweise werden die Stützpunkte invers proportional zu ihrem Abstand von dem momentanen Punkt mittels eines Gewichtungsprozesses vor der Regressionsanalyse gewichtet 340, so dass ein lokaler anstatt ein globaler Fitt an das besondere Modell befördert wird.
Für die lineare Regressionsanalyse werden die zwei oder mehr Stützpunkte gefunden, die dem momentanen Probenort am nächsten liegen 345, und ein Modell, entweder eine Gerade oder eine Ebene, das auf der Grundlage der Anzahl und der Art der Stützpunkte ausgewählt wird, wird an die Punkte gefittet, um Z_est1 zu bestimmen 350. Z_est1 bezeichnet hier die beste Anfangsfokusposition, wie diese durch die lineare Regressionsanalyse bestimmt ist. Wenn lediglich zwei Stützpunkte ge speichert worden sind, wird die lineare Regressionsanalyse durchgeführt, indem eine Gerade an die Daten gefittet wird, und zwar in diesem Fall die genaue Gerade, die durch die zwei Stützpunkte definiert wird. Wenn drei oder mehr Stützpunkte ausgewählt werden, dann wird die lineare Regressionsanalyse durchgeführt, indem entweder eine Gerade oder eine Ebene durch die Daten gefittet wird. Wenn alle Projektionen der Stützpunkte auf die Z = 0-Ebene entlang der Geraden verlaufen, d.h. entlang derselben Reihe oder Zeile der Mikrotiterplatte, dann wird eine Gerade an die Stützpunkte gefittet. Wenn die Projektionen der Stützpunkte auf die Z = 0-Ebene nicht alle auf derselben Geraden liegen, dann wird eine Ebene an die Stützpunkte gefittet.
Für die quadratische Regressionsanalyse 355 werden wenigstens 3 oder vorzugsweise alle vorhergehenden Stützpunkte analysiert und ein Modell, entweder eine Parabel oder eine quadratische Oberfläche, die auf der Grundlage der Anzahl und der Art der Stützpunkte ausgewählt worden ist, wird an die Punkte gefittet, um Z_est2 mittels einer gewichteten Approximation kleinster Quadrate zu bestimmen (7). Z_est2 bezeichnet hier die beste Anfangsfokusposition, wie diese durch die quadratische Regressionsanalyse bestimmt wird. Wenn die Projektionen der Stützpunkte auf die Z = 0-Ebene alle entlang einer Gerade verlaufen, d.h. entlang derselben Reihe oder Zeile, dann wird eine Parabel an die Stützpunkte gefittet. Wenn die Projektionen der Stützpunkte auf die Z = 0-Ebene nicht alle entlang derselben Gerade liegen, dann wird eine quadratische Oberfläche an die Stützpunkte gefittet. 8 zeigt ein Beispiel sowohl einer linearen Regressionsanalyse als auch einer quadratischen Regressionsanalyse mittels der unbearbeiteten Fokusdaten einer Mikrotiterplatte.
Anschließend wird der Erfolg der quadratischen Regressionsanalyse abgeschätzt 360. Wenn die quadratische Regressionsanalyse versagt, dann wird Z_est für den momentanen Probenort auf den Wert gesetzt, der für Z_est1 bestimmt worden ist 365. In dem Fall des dritten Probenorts gibt es lediglich zwei vorherige Datenpunkte und weder die Gewichtungsprozedur 340 noch die quadratische Regressionsanalyse 355 werden aufgrund einer unzureichenden Anzahl von Datenpunkten durchgeführt. Die gewichtete Approximation kleinster Quadrate zeigt daher einen Fehler an 360 und das Z_est für den dritten Probenort wird alleine auf der Grundlage der Ergebnisse der linearen Regressionsanalyse bestimmt 365.
Wenn die quadratische Regressionsanalyse erfolgreich ist, dann wird Z_est für den momentanen Probenort gleich dem Durchschnitt der Werte gesetzt, die für Z_est1 und für Z_est2 bestimmt worden sind 370, wie dies ebenso der Fall für die vierten und nachfolgenden Probenorte sein wird.
Eine Bestimmung der Gültigkeit des erhaltenen Z_est 380 und des Werts von MinDist relativ zu dem vordefinierten Maximum wird sodann durchgeführt 225. Wenn MinDist größer als das vordefinierte Maximum ist, so dass der momentane Probenort zu weit weg von den vorherigen Stützpunkten ist, um Vertrauen in die Bestimmung der besten Anfangsfokusposition zu haben, dann wird das Instrument verstellt, sich zu Z_bottom zu bewegen 240, und die Fokusposition wird bestimmt, indem über einen großen Bereich von Fokalebenen gesucht wird 245, um Z_best zu liefern. Wenn MinDist innerhalb des vordefinierten Limits ist, dann werden der Objekttisch und die Fokusmotoren des Instruments zu den X-, Y- und Z_est-Koordinaten der momentanen Probenposition bewegt 230 und die Fokusposition wird bestimmt, indem über einen kleinen Bereich von Fokalebenen gesucht wird 235, um Z_best zu liefern.

Claims

Verfahren zum Bestimmen einer besten Fokuspositionsabschätzung für einen momentanen Probenort auf einem Substrat, das eine Vielzahl von Probenorten aufweist, unter Verwendung eines Mikroskopfokuspositionierungssystems, wobei das Verfahren umfasst: (A) Bestimmen einer Fokusposition von wenigstens zwei weiteren Probenorten auf dem Substrat, umfassend die Durchführung einer Fokuspositionssuche über einen großen Bereich von Fokalebenen; (B) Ausrichten des Mikroskopfokussierungspositionssystems mit einem momentanen Probenort auf dem Substrat; (C) Abschätzen einer besten Fokuspositionsabschätzung für den momentanen Probenort mittels eines Verfahrens, das die Durchführung einer oder mehrerer Techniken umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: i) Durchführen einer linearen Regressionsanalyse von Fokuspositionen, die in Schritt (A) für wenigstens zwei weitere Probenorte auf dem Substrat bestimmt worden sind, um eine beste Fokusposition für den momentanen Probenort abzuschätzen; und ii) Durchführen einer quadratischen Regressionsanalyse von Fokuspositionen, die in Schritt (A) für wenigstens drei weitere Probenorte auf dem Substrat bestimmt worden sind, um eine beste Fokusposition für den momentanen Probenort abzuschätzen; (D) Fokussieren über einen schmalen Bereich von Fokalebenen, um die Fokusposition für den momentanen Probenort zu erhalten, wobei die Probenorte aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, zellbindenden Stellen auf einer chemisch gemusterten Oberfläche und benutzerdefinierten Unterbereichen von Substraten besteht, die ein Probenexemplar oder mehrere Probenexemplare enthalten, die über den Raum verteilt sind, der unter Verwendung von Mikroskopie optisch abgebildet werden soll.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Technik um lineare Regressionsanalyse handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Technik um quadratische Regressionsanalyse handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die eine oder die mehreren Techniken sowohl lineare Regressionsanalysen als auch quadratische Regressionsanalysen sind, und wobei das Ergebnis ein Durchschnitt eines Ergebnisses einer linearen Regressionsanalyse und eines Ergebnisses einer quadratischen Regressionsanalyse ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die lineare Regressionsanalyse das Fitten einer Geraden oder einer Ebene an die Fokuspositionen umfasst, die für wenigstens zwei weitere Probenorte auf dem Substrat bestimmt worden sind, für die eine Fokusposition bestimmt worden ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die lineare Regressionsanalyse das Verwenden der Fokuspositionen von wenigstens drei Probenorten auf dem Substrat umfasst, für die eine Fokusposition bestimmt worden ist, die dem momentanen Probenort am nächsten liegen.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die quadratische Regressionsanalyse das Fitten einer Parabel oder einer quadratischen Oberfläche an die Fokuspositionen der wenigstens drei weiteren Probenorte auf dem Substrat umfasst, für die eine Fokusposition bestimmt worden ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die quadratische Regressionsanalyse das Verwenden der Fokuspositionen von allen Probenorten auf dem Substrat umfasst, für die eine Fokusposition bestimmt worden ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die quadratische Regressionsanalyse durch eine Abschätzung gewichteter kleinster Quadrate durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Fokuspositionen, die für weitere Probenorte auf dem Substrat bestimmt worden sind, in einem umgekehrten Verhältnis zu ihrem Abstand von dem momentanen Probenort vor der Durchführung der quadratischen Regressionsanalyse gewichtet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probenorte Zellen umfassen.
Maschinenlesbares Speichermedium, das ein Programm umfasst, das einen Satz von Anweisungen enthält, die ein Zellenscreeningsystem dazu veranlassen, das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 auszuführen.