CN103534628B - 显微镜成像中的快速自动聚焦 - Google Patents

Abstract

本公开涉及自动聚焦基片上的一个或多个对象的多个图像的方法和系统。该方法包括由处理器根据基片上的已知地点上的一组焦距为基片上的第一地点获取代表性焦距。该方法还包括由图像获取设备获取第一地点的一组至少两个图像。每个图像使用与代表性焦距存在偏移量的不同焦距来获取。该方法进一步包括由处理器根据每个图像的聚焦质量的比较估计与第一地点相对应的理想焦距，并且将估计的理想焦距和第一地点存储在已知地点上的该组焦距中。

Description

显微镜成像中的快速自动聚焦

技术领域

本发明涉及电子成像系统。

背景技术

许多成像和扫描应用都以自动方式获取图像。获得的图像应该被适当聚焦成有助于有意义的分析和解释。为了获取适当聚焦的图像，应该在获取图像之前正确确定焦距，例如，焦高或焦长。这可以通过例如使用不同焦距获取给定地点上的几个图像、然后选择最佳聚焦图像来完成。获取多个图像可能是耗时的，尤其在必须在短时间跨度内捕获大量图像的应用中。

成像对象或平面可能存在对于对象或平面上的不同地点需要不同焦距以获得可接受聚焦图像的局部变化。例如，玻璃显微镜载玻片或沉积在其上面的生物样本的表面可能不是完全平坦的，简单地确定焦平面来代表整个载玻片上的不同地点上的焦距未考虑这样的局部变化。在这样的情况下，为了获取轮廓分明的和清晰的聚焦图像，可能需要为载玻片上的多个地点的每一个确定焦距。通过，例如，进行全面聚焦搜索细调每个地点上的焦距是耗时的，在许多应用中可能是不可行的。

发明内容

使用自动和有效聚焦方法和系统可以大大加快捕获基片上的对象的图像的成像过程。采用本发明的系统和方法通常在沿着基片的多个地点上接二连三地获取聚焦良好图像。本发明至少部分基于如下发现：在要成像的每个新地点上可以可靠地根据以前成像的地点或对象的聚焦数据估计焦距，而不是在每个新地点上进行耗时的全面聚焦搜索。随着更多地点得到成像，通过以均化这样的误差的方式组合以前的估计值逐步减小相关估计误差。

在一个方面中，本公开的特征在于自动聚焦基片上的一个或多个对象的多个图像的方法。该方法包括由处理器根据基片上的已知地点上的一组焦距为基片上的第一地点获取代表性焦距。该方法还包括由图像获取设备获取第一地点的一组至少两个图像。每个图像使用与代表性焦距存在偏移量的不同焦距来获取。该方法进一步包括由处理器根据每个图像的聚焦质量的比较而估计与第一地点相对应的理想焦距，并且将估计的理想焦距和第一地点存储在已知地点上的该组焦距中。

在另一个方面中，本公开的特征在于包括图像获取设备和处理器的成像系统。该图像获取设备被配置成将与代表性焦距存在偏移量的不同焦距用于每个图像来获取基片上的第一地点的一组至少两个图像。该处理器与该图像获取设备连接，被配置成根据基片上的已知地点上的一组焦距为第一地点计算代表性焦距。该处理器还被配置成根据每个图像的聚焦质量的比较而估计与第一地点相对应的理想焦距，并且将估计的理想焦距和第一地点存储在已知地点上的该组焦距中。该处理器被进一步配置成向该图像获取设备提供计算的代表性焦距。

在另一个方面中，本公开的特征在于上面编码了计算机可读指令的计算机可读存储设备。该指令当被处理器执行时，使该处理器根据基片上的已知地点上的一组焦距为基片上的第一地点计算代表性焦距，以及根据每个图像的聚焦质量的比较来估计与第一地点相对应的理想焦距。该指令可以进一步使处理器将估计的理想焦距和第一地点存储在已知地点上的该组焦距中，以及向图像获取设备提供计算的代表性焦距。该图像获取设备被配置成将与代表性焦距存在偏移量的不同焦距用于每个图像来获取第一地点的一组至少两个图像。

这些实现可以包括如下的一种或多种：

该处理器可以检索已知地点上的该组焦距。该图像获取设备可以获取第二地点的另外一组至少两个图像，其中该另外组中的每个图像使用与根据已知地点上的该组已经焦距为第二地点计算的第二代表性焦距存在偏移量的不同焦距来获取。该处理器可以根据该另外组中的每个图像的聚焦质量的比较来估计与第二地点相对应的理想焦距。

该代表性焦距可以作为来自已知地点上的该组焦距的至少两个焦距的加权平均来估计，其中给定焦距的权重根据相应地点与第一地点的距离来计算。比较聚焦质量可以包括通过量化相邻像素之间的差异为每个图像计算聚焦得分。聚焦得分可以是布伦纳（Brenner）聚焦得分。估计理想焦距可以包括计算图像的聚焦得分的对数之间的差值，从计算的差值中估计偏移量，以及根据该偏移量估计理想焦距。

至少两个图像可以在基本相同色光照射下获取，照射颜色的例子包括绿色、黄色、蓝色和红色。该组图像可以在至少两种不同颜色照射下获取，在每种颜色照射下可以获取至少两个图像。估计与第一地点相对应的理想焦距可以包括为每种不同颜色计算焦距偏移量，根据为不同颜色计算的焦距偏移量确定平均焦距偏移量，以及根据平均焦距偏移量估计第一理想焦距。

本发明提供了包括如下的许多好处和优点（其中一些可能只在它的各个方面和各种实现的一些中获得）。一般说来，本发明通过提供快速自动聚焦过程为图像的快速获取创造了条件。通过估计每个成像地点上的理想或真正焦距，公开的系统和方法不会损害成像过程的速度地考虑由对象的表面上的局部不平整引起的变化。对于每个地点，从使用从初始代表性焦距中计算的焦距获取的图像中计算理想焦距。由于代表性焦距基于其他地点上的大量以前已知和/或估计理想焦距，所以估计误差逐步达到最小，从而逐步得出相继成像地点上的焦距的更精确估计值。

关于生物样本成像，某些应用需要接二连三地获取大量图像。一些应用还可能需要快速、可能几乎实时地处理所获图像。在这样的情况下，通过实现有助于成像地点上的快速和精确自动聚焦的方法和系统可以大大加速成像过程。例如，在成像包含血液细胞的样品的情况下，精确聚焦的图像有助于检测、识别和分类各种细胞类型。另外，适当聚焦的图像有助于区分正常和异常细胞。类似地，精确聚焦还在区分成熟和未成熟细胞、胎儿和母体细胞、和健康和病变细胞中起一定作用。此外，接二连三地获取和处理图像保证了可以在给定时段内管理，例如，来自相同或不同患者的多个血液样品，从而提高系统的吞吐量。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管下面描述一些适当方法和器材，但在本发明的实践或测试中也可以使用与本文所述的那些相似或等效的方法和器材。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、和其他参考文献通过引用全文并入本文中。在发生冲突的情况下，将以包括这些定义的本说明书为准。另外，这些器材、方法和例子只是例示性的，而不是限制性的。

本发明的其他特征和优点可以从如下详细描述中，以及从权利要求书中明显看出。

附图说明

图1是实现本文所述的快速自动聚焦方法的成像系统的一个实施例的示意图；

图2是描绘估计理想焦距的一系列操作的一个实施例的流程图；

图3是例示用作聚焦得分的函数的例子的一组曲线；

图4是描绘加权函数的实施例的曲线；

图5是一个平面上的估计焦距的图形表示；以及

图6是计算设备和系统的示意图。

具体实施方式

本公开描述了成像装置中基于在每个成像地点上估计理想焦距而不是为每个新地点进行耗时的全面聚焦搜索的快速自动聚焦。给定地点上的理想焦距是从使用相互之间和与初始代表性焦距存在偏移量的焦距获得的多个图像的聚焦得分中估计的。代表性焦距是把以前估计其他地点上的理想焦距的知识考虑进来或从一组或多组训练数据中计算的。随着更多地点得到成像，这样的累积估计逐渐均化相关估计误差，以及逐步得出理想焦距的更精确估计值。

成像系统

图1示出了采用本文所述的快速自动聚焦方法的成像系统100的一个实施例。成像系统100包括受计算机190控制的成像硬件105。计算机190一般包括中央处理单元192、硬盘驱动器194、和随机存取存储器196。

在显示在图1中的成像系统中，光源110照射包含生物样本135的载玻片130。该载玻片被安装在第一电动载物台120上，第一电动载物台120能够在水平面（与成像的载玻片的表面平行）内移动，以便可以将载玻片130的任何部分放置在物镜140的下面。第二电动载物台150上下移动物镜140，以便有助于聚焦在沉积在载玻片130上的标本135上。载玻片130与物镜140之间的距离被称为“焦距”。缩短焦距在本例中意味着朝着载玻片130垂直移动物镜140。可替代地，也可以通过朝着物镜140垂直移动载玻片130（例如，通过移动第一电动载物台120）调整焦距。在一些实现中，可以移动载玻片120和物镜140两者，以便有助于调整焦距。第一电动载物台120在水平内移动的轴通常被称为X和Y轴。第二电动载物台150移动物镜140的垂直轴通常被称为Z轴。这三个轴定义了系统100用于成像与载玻片130有关的任何（x，y，z）空间点的坐标系。

来自光源110的光线通过载玻片130，由物镜140投射在照相机160的传感器上。该传感器可以是，例如，电荷耦合器件（CCD）阵列。图1描绘了“明视野”显微镜检查的例子，其中载玻片上的对象因为它们吸收光线而可看见，因此在照相机产生的图像中较暗。成像硬件105可以包括一个或多个附加透镜。像荧光、暗视场、或相位对比那样的显微模式也可以生成可以应用本文所述的快速自动聚焦方法的图像。

如果图像是在非最佳焦距上获得的，则该图像是模糊的，通常不适用于许多图像处理应用。如果载玻片130的表面是完全平坦的，则系统100可以通过确定三个（x，y）地点上与焦点对准图像相对应的适当z高度，然后用平面拟合那三个（x，y，z)点简单地获取焦点对准图像。然后，该平面方程将为载玻片上的任何其他（x，y）地点提供焦点对准z高度。但是，实际上，由于载玻片130和/或载物台120的表面上的不平整，可能无法从如上所述拟合的平面中精确确定给定地点的焦距。因此，一般说来，可能需要为在载玻片上的不同（x，y）地点上获得的每个图像稍微调整一下焦距。

在图像获取之后，照相机160将图像发送给计算机190以便加以处理。如果图像得到足够迅速处理，则来自一个图像地点的焦距数据可以用于调整下一个地点上的焦距以便捕获图像。这使系统可以调整与不同地点相对应的焦距的变化，接着产生更精确的聚焦图像来显示。例如，如果载玻片130的一个区域稍厚于其他区域，以及在那个区域中成像十个地点，则在获得第一个图像之后可以发现厚度发生了变化，可以使用本文所述的方法在稍作调整的焦距上获取在该区域内的其他地点上拍摄的另外图像以补偿厚度变化。

快速自动聚焦方法

图2是描绘自动聚焦的一般方法的流程图200，该方法包括由估计像显微镜载玻片那样的基片上的不同成像地点上的理想焦距的系统执行的一系列操作。这些操作包括使用与代表性焦距存在预定偏移量的焦距获取成像地点上的一组图像（步骤210），以及为该组当中的所有或一小组图像计算聚焦得分（步骤220）。该操作还包括从计算的聚焦得分中估计和存储成像地点的理想焦距（步骤230），检验系统是否需要成像基片上的另外地点（步骤240），以及根据这样的确定，将物镜和/或载物台硬件移动到新成像地点（步骤260）。新地点的代表性焦距可以作为从以前成像地点存储的估计理想焦距的加权平均来估计（步骤270）。该系统对新成像地点都重复这些步骤，使这个过程一直持续到系统获得处在载玻片130上的所有感兴趣地点和/或对象的图像。下面更详细地描述这些步骤。

图像的获取

在步骤210中获取的该组图像可以称为一“堆”图像。获取该组或该堆图像可以包括获取第一图像和与第一图像不同焦距的成像平面上的一部分目标或（x，_y）地点的至少一个第二图像。一堆内的不同图像的焦距总的来说可以作为相对于该堆的代表性焦距的偏移量来确定。在某些实施例中，针对该堆中的预定点规定与该堆相对应的代表性焦距，并作为相对于这样预定点的相对偏移量计算该堆内的各个图像的焦距。例如，对于相应焦距彼此相等隔开的四图像堆，该堆的代表性焦距可以对应于从该堆的顶部算起第二和第三图像之间的中点。规定该堆的代表性焦距的其他惯例也可以用于实施本发明。例如，一堆的代表性焦距可以对应于与该堆中的特定图像相对应的焦距。

不同堆通常对应于不同成像地点，从一个地点到另一地点可以包括相同数量的图像。进一步，可以预编程系统的部件来获取该堆图像，以便响应来自计算机的单个命令获取整堆图像。这样的预编程无论使用硬件还是软件，与为每个图像提供单独命令的情况相比都可以缩短等待时间。

一堆中的图像可以在不同颜色照射下获取。例如，一堆中的一些图像可以在蓝光照射下获取，而其他图像可以在黄光、绿光、或红光照射下获取。用不同色光照射标本可以导致从所获图像中提取到不同信息。例如，在成像包含血液细胞的标本的情况下，细胞在不同颜色照射下可能表现得不同，从而有助于更容易地识别、分类、或区分。例如，红血球由于存在血红素而吸收相当数量的蓝光，用标准罗曼诺斯基（Romanowsky）染色剂染色的细胞核吸收黄光。

每堆可以含有在给定色光照射下获得的具有相应聚焦偏移量的不止一个图像，以及在不同色光照射下获得的数组图像。例如，一堆可以含有每个在蓝光、绿光、红光和黄光之一或多种照射下获得的两个图像。在相同或不同颜色下获得的图像之间的相对聚焦偏移量可以取决于像分辨率那样的其他参数。例如，对于血液细胞的低分辨率（或低放大倍数）图像，在相同类型或波长照射下获得的两个图像之间的聚焦偏移量可以是大约1到10微米，例如，2、4、5、6或7微米，而对于高分辨率图像，该偏移量可以小到0.1到1.0微米，例如，0.4、0.5、0.6、0.7或0.8微米。

如下面进一步所述，当已知基片上的多个地点上的理想焦距的估计值时，可以将新成像地点的代表性焦距作为以前成像地点的已知或估计理想焦距的加权平均来确定。但是，当获取第一堆（或前几堆）时，可能没有足够的焦距信息可用于基片上的其他地点。在这样的情况下，系统可以首先成像载玻片上的多个地点来确定载玻片平面的倾斜程度。这可以通过，例如，确定载玻片上的三个或更多个地点的实际焦距（例如，细调过程），并拟合通过所确定点的平面来估计焦平面的倾斜来完成。成像该平面中的各个地点可以自始至终考虑或校正倾斜的影响，并且可以根据倾斜测量值计算初始代表性焦距。

聚焦得分的计算

这些操作还包括计算所获组或堆当中的所有或一小组图像的聚焦得分（步骤220）。图像的聚焦得分代表成像平面上的给定点的代表性焦距与理想或真正焦距的偏差。因此，在一些实现中，可以根据来自多个图像的所计算聚焦得分估计理想焦距。聚焦得分可以使用定量评价给定图像的聚焦质量的功能来计算。如果使用一种这样的“自动聚焦功能”计算每个所获图像的聚焦得分，则可以选择与最高得分图像相对应的焦距作为理想焦距。某些自动聚焦功能根据图像差分，即，相邻像素之间的量化差值来工作，一般说来，由于聚焦差而模糊的图像在相邻像素之间具有较小差值，而轮廓分明的聚焦图像在相邻像素之间具有较高差值。

不同类型的图像差分函数被用于度量图像的相对聚焦质量。例如，布伦纳得分可以用于度量图像的聚焦质量。布伦纳得分的计算描述在，例如，如下出版物中：Brenneretal.,“AnAutomatedMicroscopeforCytologicalResearch,”J.Histochem.Cytochem.,24:100-111(1971)；在此通过引用全文并入本文中。

布伦纳得分是图像中的纹理的度量。焦点对准图像具有高布伦纳得分，以及具有尺度比焦点未对准图像小的纹理。相反，焦点未对准图像具有低布伦纳得分，以及具有尺度不比焦点对准图像小的纹理。布伦纳得分随焦距的变化可以使用通过获取不同焦距上的几个图像和作为焦距的函数画出它们的布伦纳得分用实验方法画出的布伦纳函数来表示。布伦纳函数在理想焦距上具有峰值，随着焦距相对于理想焦距沿着任一个方向变化而减小。因此，通常，布伦纳函数从在低于理想焦距的焦距上获取图像时的低值出发，当在理想焦距上获取图像时到达峰值，然后随着焦距在理想焦距之上增加而减小。

图3中的曲线310描绘了示出函数的钟形性质的布伦纳函数。焦点被取作参考点（0μm），通过钟形曲线的峰值来识别。在这个例子中，布伦纳函数相对于焦点是对称的，在沿着任一个方向离焦点大约10μm的点上几乎减小到零。

布伦纳得分可以通过测量被给定个数的像素分开的点对之间的平均灰度级变化来计算。例如，给定图像的布伦纳得分（B）可以使用如下方程来计算：

$B=\underset{i=1}{\overset{R}{\mathrm{\Σ}}}\underset{j=1}{\overset{C-n}{\mathrm{\Σ}}}{[P_{i,j}-P_{i,j+n}]}^2---\left(1\right)$

其中R和C是图像中的像素的行数和列数，以及P_i,j是第i行第j列的像素的数值。然后可以用实验方法选择n的数值，例如，取决于光学系统的分辨率和放大倍数，以及照相机的像素大小。例如，n可以是光学系统可以分辨的最小距离。

传感器获得的任何图像在像素值中都包含一些噪声，例如，由于撞击像素地点的光子的数量的变化，或与传感器有关的电子设备的噪声。这样的噪声可以使给定图像中的两个像素值不同，即使两个像素代表图像的相同强度水平。这样的噪声的影响可以通过对在计算布伦纳得分的求和中所考虑的数项设阈来减小。例如，只有当差值高于预定阈值时，才把两个相邻像素之间的平方值加入布伦纳得分的和值中。这样加阈过程的一个例子用如下伪代码描述：

其中B代表布伦纳得分，P_i,j代表第i行第j列的像素的像素值，R和C分别代表行数和列数，以及T代表阈值。如上面伪代码所述，只有当被n个像素分开的两个像素之间的强度值之差超过阈值T时，才将该差值平方并加入布伦纳得分的最当前值中。因此，给定图像的布伦纳得分通过在整个图像上合计这样的差值来计算。

理想焦距的估计

再次参照图2，这些操作进一步包括根据计算的聚焦得分估计和存储给定地点的理想焦距（步骤230）。在一些实施例中，将从布伦纳得分中导出的函数用于从计算的聚焦得分中估计理想焦距。另外，可以将布伦纳得分的对数之差用于估计理想焦距。

布伦纳得分的对数可以表示成抛物线。描绘在图3中的曲线320示出了这样抛物线的例子。从给定的一组聚焦得分中估计理想焦距可以包括作为焦距的函数地用一条抛物线拟合聚焦得分的对数。由于抛物线的一般形状是已知的，所以举例来说，以及使用图3中的曲线320，可以用如下方程在数学上表示抛物线：

y=Ax²+Bx+C（4）

其中y=f(x)=log(b(x))代表布伦纳得分的对数，以及A、B和C代表支配X-Y平面上的抛物线的形状和位置的常数。因此，需要三个方程才能求解A、B和C。可以将抛物线的峰值y_max（或顶点处的值）预编程到曲线拟合算法中。峰值可以根据实验数据来确定，并提供求解参数A、B和C的第一方程。两个其他方程使用为两个不同图像计算的布伦纳得分的对数来实现。可以从三个方程中确定参数A、B和C，从而得出抛物线的完整描述。然后将与抛物线的峰位相对应的焦距用作理想焦距的估计值。

对所计算聚焦得分拟合抛物线的其他方式也在本描述的范围之内。例如，可以根据历史或实验数据固定参数A、B和C的某一个。因此可以将方程（4）简化成具有可以使用两个不同图像的所计算布伦纳得分求解的两个未知参数。在对于给定照射颜色需要三个图像而不是两个图像的情况下，可以从相应所计算聚焦得分中实现三个方程，并且可以从这些方程中求解参数A、B和C。在一些应用中，这可能比只基于两个点的估计更加精确，但需要获取和处理附加图像。可以适合用于方程的其他聚焦得分函数也可以不偏离本公开的范围地用于估计理想焦距。

关于利用布伦纳得分的实施例，相互具有固定聚焦偏移量地拍摄的一对图像的布伦纳得分的对数之差是线性函数（在显示在图3中的例子中，曲线330），其数值基本上与相对于由布伦纳函数的峰位所代表的理想焦距的偏差或偏移量成正比。于是，假设布伦纳得分的对数的每单位差值焦距的差值（Δf）已知地计算在给定照射下获得的图像的估计理想焦距偏移量。这样的假设可以从，例如，像显示在图3中的曲线330那样的线性曲线的的斜率中导出。然后可以按如下计算偏移量：

$\mathrm{offset}=\mathrm{difference}\·\left(\frac{\mathrm{\Δf}}{\mathrm{\δ}}\right)---\left(5\right)$

其中Δf是布伦纳得分的对数的每单位差值焦距的差值，以及δ是图像对之间的Z间隔。该堆图像的估计偏移量总的来说可以作为所有四种颜色的偏移量的平均值来计算。在将平均偏移量加入用于获取该堆的代表性焦距中之后存储该地点的理想焦距。应该注意到，将计算的偏移量加入代表性焦距中还是从中减去取决于在特定应用中所遵循的符号约定。

一旦为给定地点估计了理想焦距，就将估计的理想焦距存储在与基片上的相对地点相联系的存储地点（例如，数据库中）中。然后，可以将存储的数值用在如下所述，为随后成像地点上的图像堆计算代表性焦距中。

可以将相同地点或对象的两个或更多个图像用于评估用曲线拟合来估计理想焦距的聚焦得分。例如，可以在不同焦距上获取多个图像，并用钟形曲线方程拟合来自多个图像的聚焦得分。钟形曲线的峰位可以从聚焦得分中内插出来。图像和相应聚焦得分可以以相对较大聚焦偏移量（例如，4μm）来收集，但理想焦距可以以细得多的分辨率来估计。

新地点上的代表性焦距的估计

这些操作可以包括检验成像系统是否需要获取给定基片上的其他地点上的另外图像（步骤240），于是转到成像过程。如果没有剩下进一步的地点，则可以对给定对象终止成像过程（步骤250），并为新的对象，例如，包含不同生物样本的不同载玻片重启成像过程。相反，如果还有地点要成像，则成像硬件可以移动到新成像地点（步骤260）。可以将要成像的地点预编程到控制成像硬件的控制模块中。

这些操作进一步包括估计新地点上的初始代表性焦距（步骤270）。该代表性焦距可以作为其他地点的已知的估计理想焦距的加权平均来估计或计算。可以根据，例如，根据以前成像地点相对于新成像地点的距离确定的加权函数对已知的估计理想焦距指定权重。在图4中例示了代表性焦距估计的一个例子。在该图中，成像平面405上的几个地点被表示成（x，y）坐标对，这些地点上的相应估计理想焦距使用z值来表示。例如，在本例中地点（5，3)上的理想焦距被估计为z=3。类似地，地点（1，8）、（5，8）、（8，4）和（8，3）上的理想焦距被分别估计为z=-1、z=-3、z=-2、和z=1。然后将估计理想焦距用于估计点（6，6）所代表的新成像地点上的代表性焦距。

一般说来，加权平均将较高权重指定给与最当前成像地点最接近的地点的估计理想焦距，将较低权重指定给远离当前成像地点的成像地点的焦距。加权函数可以是线性的或一个或多个参数的函数。在一些实施例中，指定给给定地点上的估计（或已知）理想焦距的权重按如下计算：

weight=(d²+n²)^-(s/2)（6）

其中参数d是给定地点与最当前地点的距离，代表邻域的参数n控制加权函数的水平尺度，以及代表锐度的参数s控制与加权函数相对应的曲线的形状。在当前的例子中，以毫米为尺度计算（x，y）距离。因此，当假设邻域为1000μm（即，n=1000μm）和锐度为4（即，s=4)时，在本例中权重按如下方程计算：

weight=(d²+1)^(-2)（7）

在表1中例示了上面新成像地点（6，6）的例子中代表性焦距的计算：

表1：示出计算代表性焦距的例子

总和：0.055-0.079

z的加权平均：-1.451μm

如上所例示，地点（6，6）上的代表性焦距被估计为-1.451微米。一般说来，代表性焦距不同于以前成像地点的真正焦距或估计理想焦距。例如，可以证明地点（6，6）上的理想焦距的估计值是1微米。为给定地点存储估计理想焦距，而不是代表性焦距，并用在估计一个或多个新成像地点上的代表性焦距中。通过累积平均来自多个地点的理想焦距的前估计值，可以使估计值中的误差平滑化，从而得出新成像地点上的焦距的逐步变好估计值。

估计给定地点上的焦距的估计理想焦距的加权平均也可以导致给定地点上的拟合抛物线的斜率的逐步更精确估计值。抛物线的斜率通常取决于成像场的一个或多个参数。例如，在成像包含染色血液细胞的样品的载玻片的情况下，该斜率可以取决于细胞的暗度和密度。

参照图5，曲线图500示出了曲线f(x,n,s)的例子，f(x,n,s)例示了加权函数f(x)的形状如何根据方程（6）随参数n和s而变化。例如，曲线510代表n=1000μm和s=2的加权函数。曲线520代表n=1554μm和s=4的加权函数。曲线530代表n=1961μm和s=6的加权函数，以及曲线540代表n=2299μm和s=8的加权函数。在一些实现中，通过操纵参数n和s用实验方法确定适当加权函数。带有或没有另外或更少参数的其他加权函数也在本公开的范围之内。

计算系统的概述

图6是按照一种实现，可以用于控制与本文所述的任何计算机实现方法相联系所述的操作的计算机系统600的示意图。系统600包括处理器610、存储器620、存储设备630、和输入/输出设备640。每个部件610、620、630和640使用系统总线650互连。处理器610能够处理在系统600内执行的指令。在一种实现中，处理器610是单线程处理器。在另一种实现中，处理器610是多线程处理器。处理器610能够处理存储在存储器620中或存储设备630上的指令，以便为输入/输出设备640上的用户界面显示图形信息。

存储器620存储系统600内的信息。在一些实现中，存储器620是计算机可读介质。存储器620可以包括易失性存储器和/或非易失性存储器。

存储设备630能够为系统600提供大容量存储。一般说来，存储设备630可以包括配置成存储计算机可读指令的非短暂有形介质。在一种实现中，存储设备630是计算机可读介质。在各种不同实现中，存储设备630可以是软盘驱动器、硬盘驱动器、光盘驱动器、或磁带驱动器。

输入/输出设备640为系统600提供输入/输出操作。在一些实现中，输入/输出设备640包括键盘和/或定位设备。在一些实现中，输入/输出设备640包括显示图形用户界面的显示单元。

所述的特征可以在数字电路中，或在计算机硬件、固件、或它们的组合体中实现。该特征可以在有形地体现在信息载体中，例如，在机器可读存储设备中，供可编程处理器执行的计算机程序产品中实现，该特征可以由执行程序指令的可编程处理器通过操作输入数据和生成输出来执行，以执行所述实现的功能。所述特征可以用可在可编程系统上执行的一个或多个计算机程序来实现，该可编程系统包括至少一个可编程处理器，该至少一个可编程处理器被配置成从/向数据存储系统、至少一个输入设备、和至少一个输出设备接收/发送数据和指令。计算机程序包括可以直接或间接用在计算机中执行某种活动或带来某种结果的一组指令。计算机程序可以用包括汇编或解释语言在内的任何形式编程语言缩写，并且可以以任何形式部署，包括作为独立程序或作为模块、部件、子例程、或适合用在计算环境中的其他单元。

各种软件架构可以用于实现描述在本申请中的方法和系统。例如，发布/订阅消息传送模式可以用在实现本文所述的方法和系统中。在发布/订阅消息传送的情况下，该系统包括只经由消息传送模块通信的几个硬件和软件模块。每个模块可以被配置成执行特定功能。例如，该系统可以包括硬件模块、照相机模块、和聚焦模块的一个或多个。硬件模块可以将命令发送给实现快速自动聚焦的成像硬件，该成像硬件又触发照相机获取图像。

照相机模块可以接收来自照相机的图像，并确定像快门时间或焦点那样的参数。图像也可以在被照相机模块处理之前缓存在计算机的存储器中。当对载玻片的倾斜进行初始搜索时，照相机模块也可以发送当看到足以确定适当快门时间或焦点的图像时中断硬件模块的消息。

该系统还可以包括聚焦模块，该聚焦模块可以实现成软件、硬件或软件和硬件的组合体。在一些实现中，该聚焦模块检查一堆中的所有帧，并估计该堆离理想或理想焦距有多远。该聚焦模块也可以负责对一堆图像中的每个帧指定聚焦得分。

适合执行程序指令的处理器包括，举例来说，通用和专用微处理器两者、和任何类型计算机的单个处理器或多个处理器之一。一般说来，处理器从只读存储器或随机存取存储器或两者接收指令和数据。计算机包括执行指令的处理器和存储指令和数据的一个或多个存储器。一般说来，计算机还包括存储数据文件的一个或多个大容量存储设备，或可操作地耦合成与其通信；这样的设备包括像内部硬盘和移动盘那样的磁盘；磁光盘；和光盘。适合有形体现计算机程序指令和数据的存储设备包括所有形式的非易失性存储器，举例来说，包括像EPROM、EEPROM、和闪速存储设备那样的半导体存储设备；像内部硬盘和移动盘那样的磁盘；磁光盘；以及CD-ROM和DVD-ROM盘。处理器和存储器可以由ASIC（专用集成电路）补充或并入ASIC中。

为了提供与用户的交互，该特征可以在含有向用户显示信息的像CRT（阴极射线管）或LCD（液晶显示器）监视器那样的显示设备、和用户可以向计算机提供输入的像鼠标或跟踪球那样的键盘和定位设备的计算机上实现。可替代地，该计算机可以没有附在上面的键盘、鼠标、或监视器，可以通过另一台计算机远程控制。

该特征可以在包括像数据服务器那样的后端部件，包括像应用服务器或互联网服务器那样的中间部件，包括像含有图形用户界面或互联网浏览器的客户计算机那样的前端部件，或包括它们的任何组合体的计算系统中实现。系统的部件可以通过像通信网络那样的数字数据通信的任何形式或媒体互连。通信网络的例子包括，例如，LAN（局域网）、WAN（广域网）、和形成互联网的计算机和网络。

计算系统可以包括客户机和服务器。客户机和服务器一般相互远离，通常通过像所述的一种那样的网络交互。客户机和服务器的关系通过运行在各自计算机上和相互具有客户机-服务器关系的计算机程序建立起来。

处理器61执行与计算机程序有关的指令。处理器610可以包括像逻辑门、加法器、乘法器和计数器那样的硬件。处理器610可以进一步包括进行算术和逻辑运算的单独算术逻辑单元（ALU）。

例子

如下例子描述了使用结合图1所述的系统100成像包含血液细胞的生物样本的本发明应用。作为上面结合图4所述的例子的继续的如下例子只是为了例示的目的，而不是限制在权利要求书中所述的发明的范围。

自动样品制备系统，例如，公开在同时待审美国申请第12/430,885号中的系统的实施例通过在载玻片130上沉积薄单层血液细胞制备用于成像的生物样本。此后，公开在同时待审美国申请第12/943,687号中的系统的实施例固定、染色、漂洗、和/或干燥载玻片130上的标本。这个过程包括用亚甲基蓝和天青B将细胞染色。但是，公开在这个文献中和公开在如下例子中的方法也可以用在使用罗曼诺斯基染色剂或其他染色剂和/或染料制备成像标本的时候。然后，系统100的自动输送机构（未示出）将载玻片130装载到第一电动载物台120上。

在成像沉积在载玻片130上的细胞之前，如下面进一步所述，系统100确定载玻片130被装载到载物台120上的倾斜程度。计算机190通过发出沿着x和y方向移动载物台120和使用第二电动载物台150沿着z方向移动物镜140的命令，测量载玻片130上的三个不同（x，y）地点上的聚焦得分。在三个地点的每一个上，计算机190使成像硬件在不同焦距上捕获载玻片130的多个图像，并使用布伦纳聚焦函数搜索聚焦得分的峰值。载玻片130上的这三个不同（x，y）地点在图4中被标记为A（0，0），B（0，10），和C（10，0）。与三个地点的每一个上的峰值聚焦得分相对应的焦距用于提供载玻片130的焦平面的初步估计值。计算机190确定地点A，B和C的每一个的峰值聚焦得分对应于列在表2中的如下载物台坐标：

表2：示出计算代表性焦距的例子

地点	X	Y	Z
				A	0	0	0.5
B	0	10	-0.5
				C	10	0	2.5

当使用载玻片130上的每个峰值聚焦得分地点的载物台坐标时，计算机190如下列方程所表示计算载玻片130的焦平面：

z=0.2x-0.1y+0.5（8）

在为载玻片130计算了焦平面之后，系统100在包含感兴趣细胞的几个（x，y）地点上为载玻片130启动一系列图像捕获步骤。在第一新（x，y）地点（5，3）上以及对于上面列在表1中的载玻片130上的另外四个（x，y）地点，照相机160获取感兴趣细胞的8-图像堆。具体地说，照相机在与为载玻片130计算的焦平面相对应的第一焦距上在四种照射颜色（即，635，598，525和415nm）的每一种上获取一个图像。接着，电动载物台150将焦距改变0.7微米，让照相机160在相同（x，y）地点（5，3）上获取另外四个图像，四种照射颜色的每一种各一个图像。如结合方程5所述，计算机190使用理想焦距偏移量计算来估计如表1所示的地点（5，3）、（8，3）、（8，4）、（5，8）和（1，8）每一个的理想焦距。

在要成像的下一个地点（6，6）上，计算机190根据与如表1所示的载玻片130上的五个以前成像地点相对应的估计理想焦距，利用将方程（7）用于地点（6，6）计算的权重计算出-1.451微米的代表性焦距。与此大不相同，使用方程8计算的地点（6，6）上的z高度是z=1.1。

于是，计算机190根据1.1的焦平面z值和-1.451的相对于焦平面的代表性焦距，确定（x，y）载物台坐标（6，6）上的8-图像堆的中心的z载物台坐标是-0.351，即，z=1.1+(-1.451)=-0.351微米。计算机190命令成像硬件105在地点（6，6）上获取两组四个图像。成像硬件在相对于成像堆的中心的第一和第二z地点±0.35微米上在不同颜色照射下获取两组四个图像。相对于焦平面，在地点（6，6）上，对于第一组四个图像，z=-1.101，对于第二组四个图像，z=-1.801。

当使用来自在地点（6，6）上获取的八图像堆的聚焦得分时，计算机190如下表所述为地点计算估计理想焦距。

表3：8图像堆的理想焦距估计的例子

平均：0.429微米

布伦纳得分的对数的每单位差值焦距的差值被取作2微米。每种颜色的图像对的焦距相隔0.7微米，计算机190使用方程5计算估计理想焦距偏移量。因此，计算机190确定地点（1，1）上的所获堆的焦距如表3所示是低于理想焦距的0.429微米。于是，计算机190将偏移值应用于代表性焦距，按如下导出地点（6，6）的估计理想焦距：0.429+（-1.451）=1.022微米。然后，将这个估计理想焦距加入表1中，用在计算机190为载玻片130上要成像的下一个（x，y）地点计算代表性焦距的时候。

接着，计算机190继续为地点（6，6）之后成像的每个新（x，y）地点计算代表性焦距和估计理想焦距。系统100直到系统100为载玻片130上的所有感兴趣细胞获得图像堆之后才完成这个过程。一旦接收到来自新（x，y）地点的一堆图像，计算机190就分析图像，并通过成像硬件105向照相机160展示下一个感兴趣细胞的时刻更新焦平面的模型。随着系统成像沿着载玻片130的另外地点，该模型在考虑载玻片130的表面上的局部变化的时候使焦距估计越来越精确。这使得可以与使用简单平面拟合一样迅速地获取图像，但改善了聚焦测量。

其他实施例

本文所述的发明可以以许多方式实现。上面描述了一些有用的实现。对这些实现的描述不是对不局限于本文所述的详细实现，而是用更宽泛的术语描述在权利要求书中的发明的描述。要明白的是，虽然结合其详细描述对本发明作了描述，但前面的描述旨在例示而不是限制由所附权利要求书的范围限定的本发明的范围。本文所述的方法和系统可以用于在其他成像系统中，例如，在各种医学成像应用和快速聚焦摄影术中实现快速自动聚焦。需要快速在线估计焦距的任何成像系统都在本申请的范围之内。其他方面、优点、和修改都在所附权利要求的范围之内。

Claims (17)

1.一种自动聚焦基片上的一个或多个对象的多个图像的方法，该方法包含：

a)由处理器根据基片上的已知地点上的一组焦距获取基片上的第一地点的代表性焦距，其中该代表性焦距作为来自已知地点上的该组焦距的至少两个焦距的加权平均来估计，其中给定焦距的权重根据相应地点与第一地点的距离来计算；

b)由图像获取设备获取第一地点的一组至少两个图像，其中每个图像使用与代表性焦距存在偏移量的不同焦距来获取；

c)由处理器根据每个图像的聚焦质量的比较估计与第一地点相对应的理想焦距；以及

d)将估计的理想焦距和第一地点存储在已知地点上的该组焦距中。

2.如权利要求1所述的方法，进一步包含：

由处理器检索已知地点上的该组焦距；

由图像获取设备获取第二地点的另外一组至少两个图像，其中该另外组中的每个图像使用与根据已知地点上的该组已知焦距计算的第二地点的第二代表性焦距存在偏移量的不同焦距来获取；以及

由处理器根据该另外组中的每个图像的聚焦质量的比较估计与第二地点相对应的理想焦距。

3.如权利要求1所述的方法，其中比较聚焦质量进一步包含通过量化相邻像素之间的差异为每个图像计算聚焦得分。

4.如权利要求3所述的方法，其中该聚焦得分是布伦纳聚焦得分。

5.如权利要求3所述的方法，其中估计理想焦距进一步包含：

计算图像的聚焦得分的对数之间的差值；

从计算的差值中估计偏移量；以及

根据该偏移量估计理想焦距。

6.如权利要求1所述的方法，其中至少两个图像在基本相同色光照射下获取，其中光的颜色是绿色、黄色、蓝色和红色的至少一种。

7.如权利要求1所述的方法，其中该组图像在至少两种不同颜色照射下获取，以及在每种颜色照射下获取至少两个图像。

8.如权利要求7所述的方法，其中估计与第一地点相对应的理想焦距进一步包含：

为每种不同颜色计算焦距偏移量；

根据为不同颜色计算的焦距偏移量确定平均焦距偏移量；以及

根据平均焦距偏移量估计与第一地点相对应的理想焦距。

9.一种成像系统，其包含：

图像获取设备，其被配置成将与代表性焦距存在偏移量的不同焦距用于每个图像来获取基片上的第一地点的一组至少两个图像；以及

与该图像获取设备连接的处理器，该处理器被配置成：

根据基片上的已知地点上的一组焦距计算第一地点的代表性焦距，其中该代表性焦距作为来自已知地点上的该组焦距的至少两个焦距的加权平均来估计，其中给定焦距的权重根据相应地点与第一地点的距离来计算；

根据每个图像的聚焦质量的比较估计与第一地点相对应的理想焦距；

将估计的理想焦距和第一地点存储在已知地点上的该组焦距中；以及

向该图像获取设备提供计算的代表性焦距。

10.如权利要求9所述的系统，其中：

该处理器被进一步配置成检索已知地点上的该组焦距；以及

该图像获取设备被进一步配置成获取第二地点的另外一组至少两个图像，其中该另外组中的每个图像使用与根据已知地点上的该组已知焦距计算的第二地点的第二代表性焦距存在偏移量的不同焦距来获取。

11.如权利要求10所述的系统，其中该处理器被进一步配置成根据该另外组中的每个图像的聚焦质量的比较估计与第二地点相对应的理想焦距。

12.如权利要求9所述的系统，其中比较聚焦质量进一步包含通过量化相邻像素之间的差异为每个图像计算聚焦得分。

13.如权利要求12所述的系统，其中该聚焦得分是布伦纳聚焦得分。

14.如权利要求12所述的系统，其中该处理器被进一步配置成：

计算图像的聚焦得分的对数之间的差值；

从计算的差值中估计偏移量；以及

根据该偏移量估计理想焦距。

15.如权利要求9所述的系统，其中至少两个图像在基本相同色光照射下获取，其中光的颜色是绿色、黄色、蓝色和红色的至少一种。

16.如权利要求9所述的系统，其中该组图像在至少两种不同颜色照射下获取，以及在每种颜色照射下获取至少两个图像。

17.如权利要求16所述的系统，其中该处理器被进一步配置成：

为每种不同颜色计算焦距偏移量；

根据为不同颜色计算的焦距偏移量确定平均焦距偏移量；以及

根据平均焦距偏移量估计与第一地点相对应的理想焦距。