CN111983794B - 自动聚焦光学显微镜 - Google Patents

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Abstract

在用于自动聚焦显微镜的方法中，记录示出样品(62)和环境的概览图像(60)。图像处理算法在概览图像(60)中确定不是样品(62)本身的对象(61、63、64、66)的至少一个边界(61A，63A，64A，66A)。然后在所确定的边界(63A，66A)中的至少一个的位置(65)处确定聚焦设置。

Description

自动聚焦光学显微镜
技术领域
本发明涉及一种自动聚焦的光学显微镜，一种用于光学显微镜的自动聚焦方法以及一种用于执行该方法的计算机程序产品。
背景技术
用于光学显微镜的自动聚焦方法变得越来越重要，既用于提高用户的便利性，又用于自动检查样品。尤其是，如果需要检查大量样品(例如数千个样品)，则在可能的情况下，无需用户干预。
不同的常规方法利用基于图像清晰度的基于样品的自动聚焦。在此，必须知道样品位置的横向坐标，以便可以进行有意义的聚焦。另外，所使用的对比方法中的样品必须足够可见，这取决于样品，而可能是有问题的。例如，荧光细胞或细菌可能在概览图像中提供很少的对比度。变脏，例如盖玻片上的灰尘颗粒，也会干扰自动对焦。最后，根据样品，捕获区域也可以很小，也就是说，高度区域或z区域，瞬时聚焦设置必须位于其中，以便进行正确的聚焦。
为了执行较少依赖于具体样品的自动聚焦，还额外使用了基于投影的方法。在这些方法中，特定的图案(例如网格)倾斜地投影到样品容器的底部或显微镜载玻片上。使用照相机从照明方向检测图案。可以根据已记录图像中图案的位置来计算显微镜载玻片的z位置。此处的缺点是需要特殊的硬件，这会带来额外的成本。在专利DE 102011003807A1中描述了一种类似的聚焦方法，其中使用了单独的自动聚焦光束路径。
发明内容
本发明的目的可认为为提供一种方法，一种计算机程序产品以及一种光学显微镜，它们尽可能地独立于样品，并且就所涉及的设备而言，以简单的方式实现可靠的光学显微镜自动聚焦。
该目的通过方法、计算机程序产品以及光学显微镜来实现。本发明的有利变型是从属权利要求的主题，并且将在以下说明书的以下内容中进行讨论。
在用于光学显微镜的自动聚焦的方法中，本发明提供一种图像处理算法的规定，以在显示样品和环境的概览图像中，确定不是样品本身的对象的至少一个边界，以及在确定边界的位置确定/测定聚焦设置。
根据本发明的计算机程序产品包括指令，该指令在由光学显微镜的计算单元执行时，使光学显微镜执行本文描述的方法。本发明还涉及一种计算机可读数据载体，其上存储有计算机程序产品。
根据本发明，具有自动聚焦的光学显微镜包括电子控制和评估设备，该电子控制和评估设备包括图像处理算法，该图像处理算法设计为，在显示样品和环境的概览图像中，确定不是样品本身对象的至少一个边界。电子控制和评估设备配置为在至少一个确定的边界的位置处确定聚焦设置。
尽管样品本身经常会产生较小的图像对比度，并以此方式为自动图像处理算法带来困难，但其他对象的边界(例如盖玻片边缘)可以通过图像处理算法更轻松地检测出来，然后用于聚焦。该聚焦也可以称为粗聚焦(coarse focusing)，因为所确定的聚焦位置可以根据选择用于聚焦的对象类型而稍微偏离样品的z位置。例如，在聚焦于盖玻片边缘的情况下，误差可能在盖玻片厚度的数量级上。因此，(粗)聚焦可选地紧接着在样品上聚焦。相对于盖玻片或另一样品容器部件的变脏，根据本发明的聚焦特别坚固。相比之下，直接使用样品结构来确定聚焦设置的常规聚焦方法，更倾向于将盖玻片上的灰尘颗粒误认为样品结构，从而导致聚焦错误。
可以使用的合适的边界，特别是样品架或样品容器的部件的边缘或角，例如盖玻片边缘，显微镜载玻片边缘或文本或显微镜载玻片上的标签的边界。在确定了这样的边界之后，确定聚焦设置，其中将边界清晰地成像到所使用的图像传感器上。
概览图像可以在第一个方法步骤中记录，或者由于较早的测量而已经存在。它可能与以后要记录的样品或显微镜图像有所不同，所述图像是使用视场的大小或基于确定的聚焦设置来记录的。特别地，可以通过样本、或显微镜图像、或扫描整个概览图像的方式，以放大的方式记录或扫描概览图像的细节。概览图像可以可选地用概览单元记录，该概览单元不包含稍后用于记录样品或显微镜图像的物镜。
一旦在概览图像中识别出边界的位置，则致动设备可以在样品和检测光束路径之间执行相对运动，使得检测光束路径指向边界的确定位置。相对运动可以是垂直于聚焦方向的横向运动。接下来，可以确定聚焦设置。此处提供了致动设备和概览图像坐标之间的校准。例如，致动设备可以包括可移动的样品台，从而将在概览图像中确定的边界的坐标转换为样品台的坐标。可选地，期望的相对运动也可以通过例如在检测光束路径中的扫描仪(即，特别是具有可移动镜或其他光学元件的光偏转设备)来执行。可以使用不同的物镜，来执行对概览图像的记录，和在概览图像内的已确定的边界处，确定聚焦设置。
为了确定概览图像中的对象之间的边界，图像处理算法可以包括分割或检测算法，其可以特别地基于机器学习算法。分割算法可以执行概览图像的分割，其中将每个图像点分配给多个类别之一。这些类别可以对应于对象，甚至直接对应于对象之间的边界。可能的类别为：“样品”、“背景”、“显微镜载玻片边界”或“盖玻片边界”。类似地，检测算法指示边界框的坐标。可选地，检测算法也可设计为，如上面作为示例所提到的，针对相应的边界框指示对象类别。
也可制定规定，图像处理算法确定概览图像中的多个边界。使用预定的标准，特别是使用机器学习算法已教导的预定的标准，可以选择一个或多个边界用于确定聚焦设置。如果选择了多个边界，则可以连续放大这些边界，并且在每种情况下，都要为每个选定边界确定聚焦设置。边界可能会超出记录显微镜图像以确定聚焦设置时使用的视场。在这些情况下，有必要在概览图像中自动选择已确定边界的一个或多个特定位置，即边界部分，然后将其放大以确定那里的聚焦设置。
如果选择一个或多个确定的边界的一个或多个位置然后确定那里的聚焦设置，则可以基于这些位置处的边界的相应对齐来进行选择。特别地，在随后确定聚焦设置时，可以考虑边界在这些位置上相对于照明方向的对准。在此，利用这样的事实，即为了确定聚焦设置而记录的图像中的对比度，可以明显取决于相对于边界框的照明方向。在暗场测量中，可能会出现这样的情况，例如两个盖玻片边缘近似平行于照明方向，而另外两个盖玻片边缘近似垂直于照明方向，因此更容易在垂直于所有盖玻片边缘记录的显微镜图像中评估。
为了可靠地检测通常出现的边界，可以通过学习模式来教导这些边界。例如，边界可以是矩形、正方形或圆形盖玻片或样品容器的边缘，其中特别是可以教导通常出现的边界的形状和大小。学习模式可以包括表示参考样品的参考概览图像。术语“参考样品”用于更清晰地描述学习模式；参考样品原则上可以是用户选择的任何样品。然后为用户提供了标记工具，用户可以使用该标记工具标记每个参考概览图像中的一个或多个边界。由此训练图像处理算法的机器学习算法，也就是说，它基于参考概览图像和由用户标记的边界，确定一标准，该标准用于确定边界，以确定聚焦设置。原则上，如果用户仅在一个参考概览图像中标记一个或多个边界，特别是如果还考虑了先前发生的学习过程(例如在显微镜制造商处)，则在学习模式下也可以满足要求。
已确定边界的对象，特别是任何样品容器部件/显微镜载玻片部件，例如盖玻片、显微镜载玻片、室载玻片、多孔板、细胞培养管或细胞培养皿。可选地，该对象也可以是在显微镜载玻片上或在另一个样品容器上的标签(例如文本框)、印刷区域或标记。在概览图像中已确定的边界现在可以是或包括该对象的边缘，特别是因此可以是或包括盖玻片边缘、显微镜载玻片边缘或标签、印刷区域或标记的外围。
如果在概览图像中确定对象的多个边缘和至少两个边缘相交的至少一个角，则在某些发明变体中，将角(例如盖玻片角)用作物体边界的位置，在这些位置确定聚焦设置。可选地，还可以通过随机机构来选择沿着边界框的位置，例如在圆形盖玻片的情况下这是有利的。
前述边界或边缘总是可以指向另一对象或材料的边界。举例来说，所述对象可以是约束空气、浸没介质、样品容器的另一部件或样品介质。
确定聚焦设置可以包括以下步骤：
-在已确定的边界位置记录多个不同高度的显微镜图像，
-确定显微镜图像的各自的质量因子，特别是各自图像清晰度的质量因子，
-确定显微镜图像或具有最大质量因子的显微镜图像，和
-根据具有最大质量因子的一个或多个显微镜图像建立聚焦设置。
如在引言部分所述，以上述方式建立的聚焦设置，既可以直接用于记录样本图像，也可以在记录样本图像之前通过精细聚焦(例如在样本结构上)进行更改。在盖玻片厚度上，也可以清晰地辨别盖玻片边缘。这样，多个图像可以具有基本相同的(图像清晰度)质量因子。在此，可以基于具有基本相同的质量因子的显微镜图像来建立聚焦设置，例如，在这些清晰的显微镜图像的最后一个图像的区域中，该区域位于从盖玻片到样品的过渡处。
所使用的图像清晰度质量因子特别可以是图像清晰度或相关联的变量，例如对比度或边缘数量。也可以通过机器学习算法来确定质量因子。机器学习算法会根据学习标准，分别计算不同显微镜图像的质量因子。该质量因子可以与图像清晰度相关联，然而其中，在显微镜图像具有最大图像清晰度的情况下，不一定必须获得最高质量因子。已确定的聚焦设置可以精确地对应于具有最大质量因子的显微镜图像的高度聚焦。可选地，可以仅根据其上的：可以添加有具有最大图像清晰度质量因子的显微镜图像的高度聚焦上的偏移量，以建立聚焦设置，来确定聚焦设置。该偏移量可教导或规定，并且例如考虑边界和样本之间的预期高度偏移量。
最大(图像清晰度)质量因子或质量因子的局部最大值可表示以下事实：与其相邻，且在聚焦到较深或较浅层的情况下的显微镜图像具有较小的质量因子。
不必要在为记录有显微镜图像的高度平面的之一上完全建立聚焦设置。而是，可以执行对中间值的内插，即对记录有显微镜图像的高度平面之间的高度平面进行内插。推断也是可能的，其中聚焦设置对应于位于由多个显微镜图像覆盖的高度区域之外的高度平面。由于这些步骤，两个聚焦不同的显微镜图像也已经足够了。
在改进的变型中，在确定的边界位置仅记录一个显微镜图像。可以特别地包含机器学习算法的图像处理算法，可以从所述显微镜图像导出聚焦设置，该聚焦设置用于以后的测量。例如，已训练的图像处理算法可以从图像清晰度，或另一质量因子，估计当前高度设置，与可以将显微镜图像中可见结构清晰地成像到用于图像记录的相机上的高度设置之间的偏离程度。
在前面的描述中，确定聚焦设置应该理解为意味着确定至少一个聚焦设置。特别地，还可以确定对应于多个显微镜图像的两个局部锐度最大值的两个聚焦设置。这两个最大值可以基于对象的上侧和下侧，例如盖玻片的上侧和下侧。
因此，作为确定聚焦设置的一部分，也可以进行盖玻片厚度的确定。为此，确定盖玻片边界作为对象在概览图像中的边界。当确定具有最大(图像清晰度)质量因子的显微镜图像时，确定两个具有局部最大质量因子的显微镜图像。例如根据这两个显微镜图像的高度值之间的差值来确定盖玻片的厚度。高度值在此旨在指示分别聚焦的检测平面的z坐标，在该聚焦平面上记录有显微镜图像。除了差值之外，还可以更普遍地由(图像清晰度)质量因子的分布来确定厚度。特别地，首先可以从质量因子数的分布，估计盖玻片的上侧和下侧的高度位置。这些高度位置不需要精确地对应于所记录的显微镜图像的高度位置，而是可以特别地通过内插或外推来估计。接下来，可以将盖玻片厚度计算为上侧和下侧的高度位置之间的差值。也可以类似地确定其他对象的厚度。在一种变型方案中，盖玻片的厚度也可以由确定的盖玻片的高度值和确定的显微镜载玻片边界的高度值，特别是作为这些高度值之间的差值，导出。如果在同一显微镜图像中可见盖玻片外围和显微镜载玻片外围两者，则只要记录下一个或多个显微镜图像即可，从这些这些显微镜图像中，可以估计一个位置上盖玻片外围和显微镜载玻片外围的高度值。可选地，也可以连续放大盖玻片外围的一个位置和显微镜载玻片外围的位置，其中在每种情况下，在两个位置上记录一个或多个显微镜图像，用于确定各个外围的高度。
作为确定聚焦设置的一部分，还可以确定显微镜载玻片的倾斜度。为此，在概览图像中确定边界的至少三个位置。在这些位置处(也就是可以通过x-y坐标定义的横向位置)，在每种情况下都要确定其聚焦设置，该聚焦设置指示相应位置的高度位置，即z坐标。然后基于至少三个高度位置，来确定显微镜载玻片的倾斜度，例如通过放置穿过三个确定点的平面来确定。原则上，也可以通过将高度位置与两个横向偏移的位置进行比较，来获取一条倾斜度信息。以这种方式，例如在正确或错误样品布置之后的分类是可能的。
可以选择，确定其高度位置以确定显微镜载玻片倾斜度的边界，使得样品横向位于这些边界的位置之间。例如，如果盖玻片的相对边缘用于确定聚焦设置，就是这种情况。由此，可以做出关于样品位置的更精确的陈述。另外，所选边界的位置因此彼此相对远离，这有利于倾斜度确定的精度，其随着所选边界的位置的横向距离增加而增加。
可以根据这些边界之间的横向距离，来选择用于确定显微镜载玻片倾斜度的边界数量。特别地，所选边界的位置之间的横向距离越小，所选的数量可以越大。
现在可以将确定的显微镜载玻片倾斜度考虑，用于后续样品检查中的聚焦设置。对于样品的不同横向位置，因此可以根据显微镜载玻片的倾斜度，来调整各自的聚焦设置。以这种方式，可以以稳定的聚焦进行自动平铺记录，也就是说，记录了多个样品细节的图像，这些图像平行于显微镜载玻片彼此偏移。如果样品图像的记录是通过扫描进行的，则所确定的显微镜载玻片倾斜度还可用于根据瞬时扫描位置的x-y坐标，来调整聚焦的z坐标。
作为确定聚焦设置的一部分，还可以建立方向对齐。方向对齐指示样品容器是否绕错了方向。特别是在带有盖玻片的显微镜载玻片的情况下，可能出现使用者将其错误放置的情况。因此，可期望自动确定盖玻片位于显微镜载玻片的哪一侧。在这方面，图像处理算法首先在概览图像中，确定盖玻片外围的位置和显微镜载玻片的边界(例如，显微镜载玻片外围或显微镜载玻片，与另一个物体，如标签或显微镜幻灯片上的文字的边界)。现在分别在盖玻片和显微镜载玻片的边界处，确定聚焦设置并因此确定高度位置。通过使用比较盖玻片和显微镜载玻片的边界的高度位置，可以确定盖玻片是位于显微镜载玻片的上方还是下方。
所确定的显微镜载玻片倾斜度也可以考虑用于确定方向对齐。特别地，可以针对待比较的高度位置，计算基于显微镜载玻片倾斜度的高度偏移。这样，可以避免将倾斜的显微镜载玻片与错误放置的显微镜载玻片错误地混淆。
如果使用带有盖玻片的显微镜载玻片，则可以利用以下知识，进行更精确的聚焦：显微镜载玻片和盖玻片的z位置，定义了样品所位于的上边界和下边界。最初，可以确定至少一个盖玻片外围和一个显微镜载玻片边界，作为概览图像中的边界。显微镜载玻片边界可以是例如显微镜载玻片外围或显微镜载玻片与标签或文本之间的边界。接下来，在每一情况下，分别确定聚焦设置，并因此确定盖玻片边界和显微镜载玻片边界的高度位置。现在，将用于后续样品检查的聚焦设置，设置为所确定的盖玻片边界和显微镜载玻片边界的高度位置之间的高度位置。
术语“盖玻片”旨在由其作为样品的盖玻片的功能来定义，而不由材料选择来定义。特别地，盖玻片可以由塑料或玻璃组成。聚焦设置指定检测平面的z位置或高度位置，该位置由光学显微镜相对于样品，清晰地成像到光学显微镜的图像传感器上。因此，不同的聚焦点设置在聚焦相对于样本的z位置方面有所不同。
当按预期使用时，描述为附加设备特征的本发明的特性，还产生根据本发明的方法的变型。相反，根据本发明的光学显微镜，也可配置为，执行所描述的方法变型。特别地，控制和评估设备可配置为，执行所描述的方法步骤，或驱动相应的显微镜部件以执行该方法步骤，也就是说，例如驱动部件以进行聚焦调节、侧向样品位移、物镜交换、或图像记录。所描述的方法也可以是聚焦方法的一部分，在聚焦方法中，取决于在概览图像中检测到的样品结构，在样品结构上或者如上所述确定聚焦设置。
附图说明
下面将参考所附的示意图描述本发明的其他优点和特征：
图1示出了根据本发明的光学显微镜的示例性实施例；
图2示出了使用图1的光学显微镜记录的概览图像；
图3A，图3B示出了使用图1的光学显微镜记录的不同聚焦的显微镜图像；
图4示出了不同聚焦的显微镜图像堆栈；
图5示出了来自图4的显微镜图像的各个图像清晰度质量因子；
图6显示了不同聚焦和不同倍数的显微镜图像各自的图像清晰度质量因子；
图7显示了多孔板的概览图像。
在图中，相同且作用相同的组成部分通常由相同的附图标记标识。
具体实施方式
图1示出了根据本发明的光学显微镜100的示例性实施例。光学显微镜100包括用于发射照明光5的光源10。光源10可以包括例如一个或多个激光器或LED单元。照明光5通过光学元件11-13引导至样品区域，在该样品区域中可以布置样品62。来自样本62的检测光6沿着检测光束路径7行进，并且经由光学元件11-16引导到图像传感器30上。根据光学显微镜100的设计，检测光6可以是例如，以下一项或多项：
-散射在样品62或样品区域的照明光，特别是在暗场显微镜的情况下，
-由样品62或在样品区域中发射的荧光，
-由样品62或在样品区域中，进行相位调制，并通过相衬方法生成相衬图像的照明光，或
-透射通过样品62或样品区域的透射照明光，其中被样品62或样品区域吸收或散射的光在记录的图像中显得暗，尤其是在明场显微镜的情况下。
在所示的光学显微镜100中，测量是在反射光中进行的，也就是说，照明光5和检测光6均部分地通过相同的光学元件11-13行进，其中分束器19，例如颜色或偏振光分束器19，布置在公共光束路径中。在所示示例中，分束器19对于检测光6是透射的，对于照明光5是反射的，尽管这也可相反地设计为。在所示的示例中，照明光5和检测光6也经由相同的物镜20或20B行进，但是本发明不限于这种设计。在根据本发明的其他设计中，不在反射光内进行测量，并且照明光5和检测光6不经由相同的光学元件或相同的物镜传播。
首先，使用光学显微镜100记录样本62的概览图像。使用概览图像确定聚焦的一个或多个合适位置。接下来，可以记录成像图像(放大倍率)比概览图像大的样品图像。概览图像的记录和随后的测量可以通过不同的物镜20、20B来实现。取决于设置，相同的图像传感器30或不同的图像传感器，可以用于概览图像的记录，以及用于确定聚焦设置或记录样本图像的后续测量。
本发明使得自动聚焦成为可能，其中必要的计算和控制步骤由电子控制和评估设备50执行。控制和评估设备50配置为评估图像传感器30的图像数据，改变光学显微镜的聚焦和设置样品62的侧向位置。为了设置样品62的侧向位置，控制和评估设备50控制例如致动装置42，特别地，该致动装置可以包括可移动的样品台。可选地，扫描仪也可以由控制和评估设备50驱动，以扫描特定的侧面区域。横向位置表示样品62垂直于检测轴的位置，也就是说，垂直于检测光束入射到样品62上的检测光束路径的方向。聚焦在检测轴的方向上进行，也称为z方向。因此，横向位置由x-y坐标定义。不同的聚焦设置在样品62和检测平面之间的相对z位置不同，该检测平面通过物镜20或20B和光学元件11-16清晰地成像到图像传感器30上。为了改变聚焦，控制和评估设备50可在z方向上，特别是通过可移动的样品台上，调节样品62本身。可选地，可以存在变焦光学单元，并且由控制和评估设备50驱动该变焦光学单元，使得该变焦光学单元实现聚焦调节。变焦光学单元可以形成在物镜20、20B中或与其分离地形成。
现在将参考图2至图5更详细地描述自动聚焦。
图2示出了概览图像60，其由光学显微镜100以足够大的视场记录，使得不仅样本62，而且样本62的环境也成像到图像传感器上。该环境包括样品容器或其一部分。在所示的示例中，样品62位于显微镜载玻片61和布置在其上的盖玻片63之间。在某些情况下，样品62在所记录的图像中几乎不产生对比度。仅基于样本62，很难找到将样本62清晰地成像到图像传感器上的聚焦设置。
本发明利用这样的知识，即，其他结构，特别是通常不是样品本身的独享的边缘通常明显地更容易看到，可以以自动化的方式更容易地被检测到，并且由于大的捕获区域而适合确定聚焦设置。为此，作为控制和评估设备50的一部分的图像处理算法首先确定对象的边界。在所示示例中，对象为盖玻片63，并且盖玻片63的边界63A由其边缘63B至63E形成。
图像处理算法可以包括分割算法或检测算法，以识别边界框。在这种情况下，可以使用先前针对此类对象训练的机器学习算法。利用了与特定样本无关的经常使用均匀且规则形状的物体的知识。例如，盖玻片通常是矩形或圆形的。如果对具有相同类型的盖玻片的不同样本(或相同样本)进行多次测量，则盖玻片的尺寸也可以轻松地进行训练。为了训练图像处理算法以寻找边界框，可以考虑以下因素：边界形成对称形状，例如矩形、正方形、圆形、或者特别是在布置不精确的情况下，平行四边形、梯形或椭圆形。根据概览图像60记录的视场，还可以整体上看到对象，从而使边界框形成闭合形状。
在所示的示例中，图像处理算法确定边界63A，即盖玻片63的边界。现在，盖玻片边界63A的位置65用于随后的聚焦设置的确定。位置65表示边界63A的区域，例如是盖玻片边缘63B-63E的一部分，或者如所示示例中那样，是两个盖玻片边缘63D，63E相交的盖玻片角。
现在，控制和评估设备移动样品台，使得检测光束路径位于位置65的中心。原则上，样品和检测光束路径之间的这种横向移动也可以以不同的方式实现。随后，以比概览图像更大的放大倍率记录在z聚焦上不同的多个图像(以下：显微镜图像)。为了设置不同的聚焦，如上所述，控制和评估设备改变样品的z位置或检测聚焦的z位置。在图3A和3B中，示出了以不同聚焦记录的两个这样的显微镜图像70和71。这样的显微镜图像68-73堆栈在图4中示出。在显微镜图像68-73中，图像处理算法或进一步的图像处理算法确定图像清晰度的质量因子，即例如清晰度本身，或相关变量。在所示的示例中，显微镜图像70具有所有记录的显微镜图像中最高的图像清晰度。这在图5中示出，其示出了在z方向上偏移的显微镜图像的图像清晰度质量因子Q。记录最清晰的显微镜图像70的聚焦设置，将聚焦对准图5中z值z1的平面。此聚焦设置或从中导出的聚焦设置用于后续处理。
例如，可以利用由此确定的聚焦设置来记录不同的样本图像。为了更清楚地定义术语，样品图像旨在指定图像传感器的记录，该记录指向样本62本身，而不是指向与样本本身无关的对象(盖玻片63)的外围，例如前所述的显微镜图像70、71。按照定义的术语，为确定聚焦而记录的显微镜图像在xy位置上与样品图像不同。
可选地，由此确定的聚焦设置也可认为为粗略的聚焦设置，并且在记录样本图像之前用于随后的精细聚焦。毕竟，由于例如盖玻片的厚度，在确定的聚焦设置中，检测平面和样品的z位置之间可能会出现微小的偏差。例如，精度可以在大约20μm的典型盖玻片厚度范围内。在精细聚焦中，检测光束路径可以特别地指向样品62本身，然后可以利用围绕先前确定的(粗)聚焦设置的不同精细聚焦设置来记录图像。接下来，确定所记录的图像具有最大质量因子的精细聚焦设置，并将其用于随后的样品记录。
可以以所述方式可靠地执行自动聚焦。有利地，捕获范围较大，即，不同的z聚焦设置的范围，可以从中确定聚焦调整到清晰成像的聚焦设置。
在图2中，选择了盖玻片边界63A的单个位置65，以便以所述方式确定聚焦设置。然而，盖玻片边界63A的不同位置，例如不同的盖玻片角或盖玻片边缘63B-63E，也可以以上述方式连续放大，并分别用于确定聚焦设置。如果在多个位置确定聚焦设置，则可以提高精度。另外，由此可以确定显微镜载玻片的倾斜度。如果例如在盖玻片周缘63A的三个或更多个位置处确定相应的聚焦设置，则对于每个所述位置(也就是说，对于每个盖玻片边界63A的所述xy位置)确定盖玻片边界63A的相关联的z位置或高度位置。盖玻片63或其界面被假定为平面。因此，可以从盖玻片边界63A的三个x-y-z坐标确定盖玻片的位置和/或倾斜度。显微镜载玻片可以由平行于盖玻片的平面描述，由此可以认为显微镜载玻片的倾斜度与盖玻片的倾斜度相同。
在上述示例中，盖玻片边界63A通过图像处理算法检测为不是样本62本身的对象的边界。但是，图像处理算法也可设计为，额外地或可选地确定其他边界框。例如，它可以识别概览图像60中的显微镜载玻片边界61A，并选择边界61B-61E之一的一部分或显微镜载玻片61的一个角的一部分，作为显微镜载玻片边界61A的位置，以用于随后的确定聚焦设置。
在其他可选实施例中，选择其他边界框，例如，显微镜载玻片61上的标签或印刷区域64的边界64A。但是，在这种情况下，标签/印刷区域64是否位于显微镜载玻片61的样品上，或是否位于显微镜载玻片61的相反侧，不一定是已知的。
在其他实施方式中，使用其他样品容器，例如多孔板。图7示意性地示出了概览图像60，其中布置了在各个孔(凹陷)中具有多个样品62的多孔板66。孔外围66A容易看到。与上面的描述类似，在这种情况下，也可以将孔外围66A识别为边界，并将它们用于确定聚焦设置。
在一种发明变型中，额外地确定盖玻片的厚度。在这种情况下，在盖玻片的边框位置记录了显微镜图像堆栈68-73，如图4所示。如果穿过此处的z区域同时覆盖了盖玻片的上边缘和下边缘，如图6所示，图像清晰度质量因子的z相关曲线可能会有两个最大值。这两个z值z1和z2之间的差值为盖玻片厚度的量度。
因此，本发明使得可靠的自动聚焦成为可能，其中，作为确定合适的聚焦设置的一部分，还可选地获得额外的测量结果，例如与盖玻片厚度、显微镜载玻片倾斜度或显微镜载玻片方向有关。无需聚焦即可清楚看到样品。根据本发明的计算机程序产品也可以用常规的光学显微镜来实现，也就是说，在这种光学显微镜的情况下绝对不需要额外的硬件。
参考标识清单
5 照明光
6 检测光
7 检测光束路径
10 光源
11-16 光学元件
19 分束器
20 确定聚焦的物镜
20B 记录概览图像的物镜
30 图像传感器
42 用于移动样品的致动设备
50 控制与评估设备
60 概览图像
61 显微镜载玻片
61A 显微镜载玻片的边界/外围
61B-61E 显微镜玻片的边缘61
62 样品
63 盖玻片
63A 盖玻片的边界/外围
63B-63E 盖玻片的边缘63
64 显微镜载玻片61上的标签/印刷区域
64A 标签/印刷区域64和显微镜载玻片61之间的边界/外围
65 确定聚焦设置的边界位置
66 多孔板
66A 多孔板66的孔边界
68-73 具有不同z聚焦的显微镜图像
100 光学显微镜
Q 显微镜图像68-73的图像清晰度质量因子

Claims (19)

1.一种在检测轴的方向上自动聚焦显微镜的方法，包括
借助于图像处理算法，确定显示样本(62)和环境的概览图像(60)中，本身不是样本(62)的对象(61、63、64、66)的至少一个边界(61A，63A，64A，66A)，其中物体的至少一个边界包括以下：盖玻片(63)、显微镜载玻片(61)、室载玻片、多孔板(66)或多孔板(66)的孔、细胞培养管或细胞培养皿、样品架或样品容器之一的外围(61B-61E、63B-63E)或拐角，或其中至少一个边界为文本的边界或印刷区域(64)的边界(64A)，以及在检测轴的方向上确定所确定的盖玻片(63)、显微镜载玻片(61)、室载玻片、多孔板(66)或多孔板(66)的孔、细胞培养管或细胞培养皿、样品架或样品容器之一的外围(61B-61E、63B-63E)或拐角中至少一个的位置(65)处的聚焦设置。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
致动设备(42)在样品(62)和检测光束路径(7)之间进行相对移动，使得检测光束路径(7)指向已确定的边界(63A)的位置(65)，然后确定聚焦设置。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述图像处理算法包括分割算法或检测算法，通过所述分割算法或检测算法在概览图像(60)中确定对象(61、63、64、66)的边界(61A，63A，64A，66A)，其中，所述分割算法或检测算法基于机器学习算法。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
图像处理算法在概览图像(60)中确定一个或多个边界(61A，63A，64A，66A)的多个位置(65)，并基于已使用用于确定聚焦设置的机器学习算法教导的预定标准，选择边界(61A，63A，64A，66A)的一个或多个位置(65)。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
多个边界部分(63B-63E)之一根据边界(63A)的位置(65)所选择，其中在随后确定的聚焦设置时，根据其相对于照明方向的对齐，来选择边界部分。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
向用户提供学习模式，其中：
-表示参考样品的参考概览图像，
-为用户提供了一种标记工具，用户可以使用该标记工具在每个参考概览图像中标记一个或多个边界(61A，63A，64A，66A)，
-基于参考概览图像和用户标记的边界(61A，63A，64A，66A)，图像处理算法的机器学习算法建立用于确定聚焦设置的确定边界(61A，63A，64A，66A)的标准。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
在概览图像(60)中确定多个边缘(63B-63E)和对象(63)的至少一个角，并将该角用作为对象(63A)边界(63A)的确定聚焦设置的位置(65)。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
确定聚焦设置包括以下内容：
-在确定的边界(63A)的位置(65)处记录多个不同高度的显微镜图像(68-73)；
-确定显微镜图像(68-73)的相应图像清晰度质量因子(Q)；
-确定显微镜图像(70)或具有最大图像清晰度质量因子(Q)的那些显微镜图像；
-根据具有最大图像清晰度质量因子(Q)的显微镜图像(70)/显微镜图像，建立聚焦设置。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，
作为确定聚焦设置的一部分，还确定盖玻片的厚度，其中在概览图像(60)中确定盖玻片的外围(63A)作为对象(63)的边界(63A)，
其中，在确定具有最大图像清晰度质量因子(Q)的显微镜图像(70)期间，确定两个图像清晰度质量因子(Q)具有局部最大值的显微镜图像(70)，
其中，从两个显微镜图像(70)的高度值(z1，z2)之间的差值确定盖玻片厚度。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
根据确定的聚焦设置对样品结构进行精细聚焦，及
至少一个样本图像通过精确聚焦记录。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
作为确定聚焦设置的一部分，还确定显微镜载玻片的倾斜度，其中，确定边界(61A)的至少三个位置(65)，后分别在这些位置上，确定指示各个位置(65)的高度位置(z1)的聚焦设置，
基于至少三个高度位置(z1)确定显微镜载玻片的倾斜度。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，
选择用于确定显微镜载玻片倾斜度的边界(61A)的位置，使得样品(62)横向位于边界(61A)的这些位置之间。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
根据所述位置之间的横向距离，来选择用于确定显微镜载玻片倾斜度的边界(61A，63A，64A)的位置的数量。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所确定的显微镜载玻片倾斜度用于随后的样品检查中的聚焦设置，其中对于样品(62)的不同横向位置，根据显微镜载玻片倾斜度来调节各自的聚焦设置。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
作为确定聚焦的一部分，通过以下确定方向对齐：
-在概览图像(60)中确定至少一个盖玻片外围(61A)和一个显微镜载玻片边界(63A)作为边界(61A，63A)，
-分别确定盖玻片外围(61A)和显微镜载玻片边界(63A)的聚焦设置以及相应的高度位置(z)，
-通过比较盖玻片外围(61A)和显微镜载玻片边界(63A)的高度位置(z)，确定盖玻片(63)是位于显微镜载玻片(61)的上方还是下方。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，
基于用于待比较的高度位置(z)的显微镜载玻片倾斜度，计算高度偏移量，从而将确定的显微镜载玻片倾斜度考虑于方向对齐的确定。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
确定概览图像(60)中的至少一个盖玻片周边(63A)和一个显微镜载玻片边界(61A)作为边界(61A，63A)，
分别确定盖玻片周缘(63A)和显微镜载玻片边界(61A)的聚焦设置以及高度位置，以及
将随后的样品检查的聚焦设置设置为在盖玻片外围(63A)的确定的高度位置(z)和显微镜载玻片边界(61A)之间的高度位置(z)。
18.一种包括指令的计算机程序产品，该指令在由光学显微镜的计算单元执行时，使光学显微镜执行如前述权利要求中的任一项所述的方法。
19.一种在检测轴的方向上自动聚焦光学显微镜，其特征在于，
电子控制和评估设备(50)，包括图像处理算法，其设计为在显示样品(62)和环境的概览图像(60)中，确定不是样品(62)本身的对象(61、63、64、66)的至少一个边界(61A，63A，64A，66A)，其中物体的至少一个边界包括以下：盖玻片(63)、显微镜载玻片(61)、室载玻片、多孔板(66)或多孔板(66)的孔、细胞培养管或细胞培养皿、样品架或样品容器之一的外围(61B-61E、63B-63E)或拐角，或其中至少一个边界为文本的边界或印刷区域(64)的边界(64A)，以及
其中，所述电子控制和评估设备(50)配置为，在检测轴的方向上确定所确定的盖玻片(63)、显微镜载玻片(61)、室载玻片、多孔板(66)或多孔板(66)的孔、细胞培养管或细胞培养皿、样品架或样品容器之一的外围(61B-61E、63B-63E)或拐角中至少一个的位置(65)处的聚焦设置。
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