JP2022533001A - 無限遠補正顕微鏡のための自己較正および方向集束のシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

顕微鏡システムにおける対物レンズを自動集束させるためのシステムおよび方法。自己較正自動集束システムは、光源と、偏心開口と、画像捕捉デバイスとを含む。システムは、光源が、対物レンズとサンプル保持コンポーネントの近位にある基準表面を有するプレートとを含む光学経路上に光を発生させるように、顕微鏡システムに接続され得る。画像捕捉デバイスは、対物レンズが一連のｚ位置まで移動するにつれて、基準表面からの光の反射を撮像する。基準較正勾配が、対物レンズのｚ位置において撮影される画像の位置を決定することによって、対物レンズのために発生させられる。特定の属性を有する少なくとも１つの画像が、最良焦点位置に対応する。対物レンズは、基準較正勾配を使用して較正された最良焦点から、予測される最良焦点または好ましいオフセットに移動させられる。

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、その内容が参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる２０１９年４月２９日に出願された米国仮出願第１６／３９７，６６５号の優先権を主張する。
（開示の分野）

本主題は、顕微鏡を集束させるためのシステムおよび方法に関し、より具体的に、顕微鏡の対物レンズを自動集束させるために最良焦点位置を較正するためのシステムおよび方法に関する。

顕微鏡は、ユーザが個々のスライドから画像を視認することを可能にする光学系の独立型配置から、トレイまたはプレート（「マイクロウェル」、「マイクロタイタ」、および「マイクロプレート」としても公知である）に形成される複数のサンプルウェル内に堆積させられるサンプルの画像を発生させる高スループット撮像システムに進化している。顕微鏡システム内の光学系は、コンピュータプログラム制御下の電気機械デバイスによって制御され得る。画像は、例えば、カメラ、電荷結合素子、または他の画像捕捉デバイス等の画像捕捉デバイスを使用して収集され得る。

現代の顕微鏡システムは、光学信号特性を検出および測定するために使用され得る。いくつかのシステムでは、サンプルウェルは、例えば、光の放出を引き起こすマーカまたは反応性成分を用いて処理されている生物学的材料等の材料を含み得る。顕微鏡は、単に画像を捕捉することと対照的に、光の強度レベルおよびパターンを検出するために使用され得る。したがって、顕微鏡は、信号検出器デバイスおよび画像捕捉デバイスを使用し、光レベルの測定値を取得し得る。顕微鏡の検出コンポーネントは、したがって、画像捕捉デバイスに加えて、例えば、光電子増倍管、光検出器、および光検出器アレイを含み得る。顕微鏡システムは、例えば、コヒーレント（レーザ）または非コヒーレント光源、または選択された波長においてフィルタ処理された光源等の代替照明システムも提供し得る。フィルタ、ビーム分割器、および他の光学デバイスが、光源とサンプルとの間、またはサンプルと検出コンポーネントとの間における光学経路内の種々の場所において挿入され、所望の様式においてサンプルを励起すること、またはある波長における強度および他の特性を含む選択された光学特性を測定することのうちのいずれかを行い得る。

画像内のパターンを捕捉または判別することにおいて、または光学信号を測定することにおいて、レンズ、ミラー、フィルタ等の光学デバイスが、光源から画像捕捉デバイスまで光学経路に沿って配置される。撮像レンズは、対物レンズが基準表面上に集束すると、光源を画像捕捉デバイスの画像面上に集束させるように調節される。焦点の欠如は、画像において、ぶれまたはぼやけとして出現する。同様に、集束させられていない対物レンズから得られる光学測定は、正確な強度レベルおよびピクセルをもたらさないこともあり、それらは、焦点ぼけであるときの画像の広がりに起因して、予期されるものよりも明るいことも、あまり明るくないこともある。対物レンズは、典型的に、撮像または光学測定が、顕微鏡システムによって実施される前、サンプル上に集束するように位置付けられるべきである。

顕微鏡が多数のサンプルの画像または光学信号測定値を捕捉するために使用され得る高スループット顕微鏡システムでは、集束ステップが、可能な限り迅速に何度も実施される必要があり得る。集束プロセスは、敏感かつ正確でもありながら、可能な限り複雑性を追加せず、サンプルを混乱させないものであるべきである。集束プロセスは、自動集束プロセス、または可能な限りユーザによる関与を伴わずに実施されるプロセスでもあるべきである。蛍光顕微鏡が、１つ以上の蛍光色素分子で標識される生物学的サンプルを分析することにおいて使用される。蛍光色素分子および生物学的サンプルに対して光学的損傷を引き起こすことを回避することが、重要である。

顕微鏡システムは、典型的に、処理されている各サンプルに関してハードウェアベースの自動集束を実施する。高スループット顕微鏡システムでは、プレート上に支持されるサンプルウェルが、サンプルウェル底部表面とプレート底部表面とを有する。サンプルウェル底部表面およびプレート底部表面は、少なくとも部分的に反射性である。ハードウェアベースの自動集束システムに対する１つのアプローチでは、サンプルウェルが、サンプルウェル内のサンプルに実施されるべき撮像または光学測定において使用されるべき対物レンズを通して照明される。対物レンズは、画像およびピクセル強度が、各位置においてチェックされる間、対物レンズが進行する光軸に沿った一連の位置に位置付けられる。対物レンズが進行する光軸は、「ｚ軸」と称され得、対物レンズの運動は、「ｚ軸に沿った走査」と称され得る。

図１Ａは、プレート１１０上に配置されるサンプルウェル１１２内のサンプル１１４を撮像するために顕微鏡１００のハードウェアベースの自動集束を実施するためのプロセスの動作を図示する顕微鏡１００の概略図である。図１Ａ内の顕微鏡１００は、自動集束のための主要コンポーネント、すなわち、対物レンズ１０２と、検出器１０４と、ビーム分割器１０６と、光源１０８とを含む。顕微鏡１００は、対物レンズ１０２およびプレート１１０の状態および運動を制御するように構成されるコンポーネントを含むシステム内に実装され得る。そのようなコンポーネントは、光源１０８の状態および検出器１０４の動作を制御するようにも構成され得る。例えば、ｚ軸に沿った対物レンズ１０２の移動は、コンピュータプログラムの制御下の電動モータを有する線形アクチュエータを使用して制御され得る。対物レンズ１０２は、ｚ軸上の位置（すなわち、ｚ位置）に移動させられる。検出器１０４は、画像を捕捉し、画像のデジタルコンテンツをコンピュータに転送するようにコンピュータプログラムによって制御される電荷結合素子または他の画像捕捉デバイスとして実装され得る。

例示的なハードウェアベースの自動集束プロセスでは、ユーザが、対物レンズ１０２のタイプと、プレート１１０のタイプと、光源１０８とに従って顕微鏡を構成するための構成データ入力するためのユーザインターフェースを提供され得る。システムは、次いで、対物レンズ１０２をプレート１１０に好適に近接するｚ軸上の開始場所に位置付け得る。開始位置は、異なるプレートがｚ軸に沿った異なる位置においてプレート底部表面を有し得るため、プレート１１０のタイプに依存し得る。対物レンズ１０２は、最良焦点位置が見出され得る作業距離または走査範囲に沿って移動するように制御され得る。このプロセスは、典型的に、対物レンズ１０２を走査範囲内の各ｚ位置に位置付けることと、各ｚ位置において画像を捕捉することとを伴う。

光源１０８からの光は、光源１０８からビーム分割器１０６までの１０１における第１の光学経路を辿る。ビーム分割器１０６は、対物レンズ１０２に向かって光の一部を反射し、対物レンズ１０２は、光を光学経路１０５に沿ってサンプルウェル１１２の方に向ける。光は、プレート１１０の上部表面および／または底部表面から対物レンズ１０２に向かって戻るように、ビーム分割器１０６を通して、光学経路１０７に沿って、検出器１０４まで反射する。対物レンズ１０２の位置が、対物レンズ１０２がプレート１１０の反射面上に集束する位置に十分に近接している場合、光は、検出器１０４において、ある直径とある強度とを有するビームスポットとして出現する。対物レンズ１０２が、ｚ軸に沿って移動させられるにつれて、システムは、検出器１０４を制御し、各ｚ軸位置において画像を捕捉する。各画像が、分析され、例えば、各スポットのピクセルの平均強度、最大信号、標準偏差、分散、または共分散、サイズ、形態、位置、および他のものを含み得る焦点メトリックに基づいて、焦点スコアを決定する。最小かつ最も明るいスポットが、典型的に、「最良焦点」を有すると見なされる。焦点スコアは、グラフ１２０内に、各画像が捕捉されるｚ位置に対してプロットされ得る。グラフ１２０（図１Ｂ参照）では、最小かつ最も明るいスポットは、その強度およびｚ位置値に関して１２４においてピークを形成し得る。グラフ１２０は、最も明るいピクセルをピーク１２２および１２６として示し得る。（図１Ｂの１２４における）最高焦点スコアにおけるｚ位置が、最良焦点位置であるとして識別される。

プレート１１０上の２つの表面からの反射を示す２つのピークが、グラフ内に形成され得ることに留意されたい。ピークまたは複数のピークが、識別され、対応するｚ位置が、各ピークに関して識別されると、このプロセスは、最良焦点位置をピークの選択されたものに対応するｚ位置として識別する。すなわち、最良焦点位置は、プレート１１０の上部表面または底部表面のうちのいずれかから反射される光によって形成されるスポットが、最良焦点スコアを有する位置である。

図１Ａを参照して説明される自動集束手順の文脈における最良焦点位置は、基準表面から反射される光ビームの最も鮮明かつ最も明確な投影を生産する対物レンズ１０２のｚ位置である。図１Ａに示されるシステムでは、基準表面は、プレート１１０の上部表面または底部表面のいずれかである。例えば、細胞の集合物等のサンプル（図１Ａの１１４）上に良好な焦点を伴って撮像するために、対物レンズ１０２は、サンプル１１４上に集束するように移動させられるべきである。いくつかの実装では、ｚ軸に沿ったオフセットが、サンプルタイプ、対物レンズ、プレートタイプ、および／または他の好適なパラメータに従って定義され得る。最良焦点位置が、決定されると、対物レンズ１０２は、オフセットに従って移動させられ、撮像を始め得る。いくつかの実装では、システムは、ハードウェアベースの自動集束の後、画像ベースの自動集束を実施し得る。画像ベースの集束は、サンプルの焦点が合うまで、サンプルの実際の画像をチェックする間、対物レンズ１０２をｚ軸に沿って移動させることを伴う。

図１Ａを参照して説明される自動集束手順は、プレート１１０上の基準表面を見出すためのハードウェアベースの自動集束と、サンプル上に集束するためのオフセットによる移動、またはサンプル１１４を見出すための画像ベースの集束のいずれかとを伴い得る。ハードウェアベースの自動集束、または画像ベースの自動集束、または両方は、対物レンズが交換されなくとも、新しいサンプルウェルが撮像のために提供される度に実施される必要があり得る。サンプルウェルが配置されるマイクロプレートは、完全に平坦でないこともあり、サンプルウェル底部の厚さは、一貫していないこともある。異なるサンプルまたは異なる光源も、再集束を必要とし得る。

現在のハードウェアベースの自動集束手順は、対物レンズ１０２の作業距離内の各ｚ位置からデータ点を収集する必要性によって、減速される。顕微鏡が多数のサンプルを撮像するために使用されるシステムでは、顕微鏡の対物レンズを集束させることにおける短い遅延でさえも、長すぎる場合がある。使用される他のプロセスは、複雑性、正確度の低下、集束の間に撮像された光束を反射する表面に対する感度、高コスト等のトレードオフおよび他の限界を伴う。

一側面によると、顕微鏡システムにおける対物レンズのための自己較正自動集束手順を実施する方法が、提供される。例示的方法では、基準較正勾配が、対物レンズの一連のｚ位置において撮影された複数の画像のそれぞれの位置を決定することによって、発生させられる。画像が、分析され、最良焦点位置に対応する特定の属性を決定する。自動集束手順が、次いで、少なくとも部分的に基準較正勾配および最良焦点位置に基づいて、対物レンズに対して実施され得る。

別の側面では、基準較正勾配は、基準画像が画像面内を平行移動するときの一連の対物レンズ位置と画像面上の側方位置との間の線形関係を示す。

別の側面では、基準画像は、基準表面から反射され、画像捕捉デバイス上に投影されるビームスポットであり得る。代替として、基準画像は、パターン化された画像であり得る。

別の側面では、自動集束のためのシステムが、提供される。自動集束システムの一実施は、光源と、偏心開口と、画像捕捉デバイスに向かって光学経路を形成するための光学コンポーネントとを含む。自動集束システムは、顕微鏡システムの対物レンズを含む光学経路を伴う顕微鏡システムに接続され得る。自動集束システムは、顕微鏡システムのサブシステムとしても動作し得る。自動集束システムは、コントローラも含むか、または、顕微鏡システム内で動作するコントローラを使用して動作する。コントローラは、プロセッサによって実行されると、自己較正自動集束方法を実施する機械命令のためのストレージを含み得る。

図面は、類似の要素が共通の参照番号によって参照される開示される発明の実施形態の設計および有用性を図示する。これらの図面は、必ずしも縮尺通りに描かれているわけではない。これらの図面は、開示される発明の典型的実施形態のみを描写し、したがって、その範囲を限定すると見なされるべきではない。

図１Ａは、ハードウェアまたは画像ベースの自動集束手順を実施するように構成された公知の顕微鏡システムのある例である。

図１Ｂは、対物レンズに関するｚ位置の走査のためのサンプルウェルにおける２つの表面から反射される光の強度測定値に関する焦点スコアのグラフのある例である。

図２Ａは、最良焦点位置を較正し、顕微鏡システムにおける対物レンズを自動集束させるためのシステムの例示的実装である。

図２Ｂは、最良焦点位置を較正し、顕微鏡システムにおける対物レンズを自動集束させるための例示的システムの動作を図示するフローチャートである。

図３Ａは、顕微鏡システムにおける対物レンズのための最良焦点位置の較正中の線形アレイ検出器の表現上にオーバーレイされるビームスポットの側方平行移動を図示する複数の画像のある例の略図である。

図３Ｂは、対物レンズのｚ位置の走査の間の検出器上の側方平行移動ビームスポット場所の例示的質量中心プロットである。

図４Ａ－４Ｃは、基準較正勾配が対物レンズのために利用可能であるときの自動集束のためのプロセスを図示する対物レンズの異なるｚ位置において捕捉される画像の例の略図である。

図４Ｄは、基準画像として画像捕捉デバイス上に投影され得るパターン化された画像のある例である。

図５は、コリメートされた照明経路内に偏心開口５０２を伴う自己較正自動集束を実施するように構成される、顕微鏡システムの別の例である。

図６は、検出器側におけるコリメートされた戻り放出経路内に偏心開口６０２を伴う自己較正自動集束を実施するように構成される、顕微鏡システムの別の例である。

図７は、自己較正自動集束を実施するように構成された顕微鏡システムの別の例である。

全ての数値が、本明細書では、明示的に示されているかどうかにかかわらず、用語「約」または「およそ」によって修飾されると想定され、用語「約」および「およそ」は、概して、当業者が、列挙される値と同等である（すなわち、同一の機能または結果を有する）と見なすであろう、ある範囲の数を指す。いくつかの事例では、用語「約」および「およそ」は、再近傍の有効数字に丸められた数を含み得る。エンドポイントによる数値範囲の列挙は、その範囲内の全ての数値を含む（例えば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、および５を含む）。

本明細書および添付の請求項において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ（前記）」は、コンテンツが別様に明確に指示しない限り、複数の指示物を含む。本明細書および添付の請求項において使用されるように、用語「または」は、概して、コンテンツが別様に明確に指示しない限り、「および／または」を含むその意味において採用される。付随の図に図示される、開示される発明の描写される実施形態を説明することでは、具体的な専門用語が、説明の明確性およびし易さのために採用される。しかしながら、本特許明細書の開示は、そのように選択された具体的な専門用語に限定されることを意図しておらず、各具体的な要素が、類似の様式において動作する全ての技術的同等物を含むことを理解されたい。さらに、異なる例証的実施形態の種々の要素および／または特徴が、本開示および添付の請求項の範囲内において可能性として考えられる場合に、互いに組み合わせられる、および／または互いに代用され得ることを理解されたい。

開示される発明の種々の実施形態が、以降において、図を参照して説明される。図面が、縮尺通りに描かれていないこと、および類似構造または機能の要素が、図の全体を通して同様の参照番号によって表されることに留意されたい。図が実施形態の説明を促進することのみを意図することにも留意されたい。それらは、本発明の包括的説明として、または添付の請求項およびそれらの同等物のみによって定義される開示される発明の範囲に関する限定として意図されていない。加えて、開示される発明の図示される実施形態は、示される側面または利点の全てを有する必要はない。例えば、開示される発明の特定の実施形態と併せて説明されるある側面またはある利点が、必ずしもその実施形態に限定されるわけではなく、そのように図示されていない場合でも、任意の他の実施形態において実践されることができる。

顕微鏡システムにおける対物レンズのための最良焦点位置を決定するためのシステムおよび方法が、下記に説明される。下記に説明される方法およびシステムは、種々の既知のパラメータに対応する基準勾配を発生させる較正プロセスを開示する。本発明の概念に固有であることとして、偏心開口が、利用され、較正基準勾配を形成するように方略的にマップされる複数のｚ位置における波面のサンプリングを提供する。較正プロセスを通して導出されるこの基準勾配は、次いで、有利なこととして、下記にさらに詳細に議論されるであろうように、最良焦点位置からのオフセットを決定するために使用され得る。このアプローチは、システムが、画像入手中に迅速に較正し最良焦点に戻すこと、誤差を最小化すること、およびスループットを改良することを可能にする。

下記の説明において使用される場合、用語「最良焦点位置」は、対物レンズが基準表面上に投影される基準画像上に最良の集束を提供する対物レンズのｚ位置を意味するものとする。したがって、最良焦点位置は、対物レンズがサンプル上に集束する位置ではないこともある。最良焦点位置を決定するために使用される基準表面は、サンプルが撮像のために提示されるときのサンプルのｚ位置レベルの下方または上方にあり得る。いくつかの例示的実装において、および、ある撮像手順または光学測定手順に関して、最良焦点位置からのオフセットが、撮像されているサンプルのタイプおよび撮像のために使用されている対物レンズに基づいて、定義され得る。さらなる精度が、要求されるとき、ハードウェア集束が、図１Ａおよび１Ｂを参照して上で説明されるものと同様に実施され得る。最良焦点位置への近接近場所からそのようなハードウェアベースの集束を開始することに対する利点は、最良焦点位置から開始しない上で説明される手順を用いるものよりも少ないｚ位置が、使用されることである。

下記の説明において使用される場合、用語「撮像」、「画像捕捉」、「画像の捕捉」、または「画像を検出すること」は、画像捕捉デバイスから光学データを収集するための任意のプロセスを指すものとする。画像は、記憶のためのデジタル画像を捕捉すること、または、強度、色、または他のタイプのデータ等の光学特性を測定することを含む基準較正勾配、サンプルの画像を取得するための基準画像であり得る。

下記の説明において使用される場合、用語「サンプルウェル」は、撮像するために、または光学測定値を取得するために提示されるべきサンプルを含むための任意の好適な構造物を指すものとする。サンプルウェルは、例えば、サンプルが堆積させられ得る下記に定義されるようなマイクロウェルプレート上に形成される陥凹状構造物を含み得る。サンプルウェルは、用語が本明細書に定義されるように、カバー、またはサンプルを含むための任意の他の好適な構造物を伴う、または伴わないスライドも含み得る。

下記の説明において使用される場合、用語「プレート」は、サンプルが堆積させられ得る容器を支持するように構成された任意のサンプル保持構造物を指すものとする。特に、用語「プレート」は、「マイクロウェル」、「消耗品」、「マイクロタイタ」、および「マイクロプレート」を含む用語によって当技術分野において公知であるトレイまたはそのようなサンプル保持構造物を含む類似構造物を含み得る。「プレート」は、単一のサンプルウェルまたは複数のサンプルウェルを保持することが可能である構造物を指すように理解されるものとする。下記に説明される例では、プレートは、最良焦点位置を決定するための基準表面を提供するために使用される。用語「プレート」は、別様に記載されない限り、下記の説明において、下記に説明されるプロセスのための基準表面を提供し得る任意の構造物を意味するものとして理解されるものとする。

上記に手短に議論されるように、本発明は、顕微鏡システムにおける対物レンズのための最良焦点位置を較正し、次いで、最良焦点位置較正を使用し、従来の自動集束技法を用いる場合よりも迅速かつ効率的に対物レンズを集束させるためのシステムおよび方法を開示する。
サンプルが較正された対物レンズを使用した測定のために位置付けられたとき、および、対物レンズが再位置付けされた後、最良焦点位置較正が、使用され、その最良焦点位置に対する対物レンズの位置を見出す。サンプル上に集束するために、対物レンズは、最良焦点位置に移動させられ得るか、または、最良焦点からの所定のオフセットを移動させられ得る。

所与の対物レンズのための最良焦点位置の較正は、対物レンズの進行軸上の位置と、画像捕捉デバイスの画像面上での画像（または基準画像）の平行移動との間の関係を決定することを伴う。顕微鏡システム内の自動集束サブシステムまたはモジュールは、好適な光源と、偏心開口と、基準表面と、撮像光学系と、画像捕捉デバイスとを含み得る。基準表面は、光学測定が実施されるであろうサンプルを含むサンプルウェルを保持するために使用され得るプレート（すなわち、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロタイタ等）であり得る。コンポーネントは、光源を用いて、顕微鏡システムの対物レンズを通して基準表面を照明するように配置され得る。光学コンポーネントは、例えば、図２Ａおよび５－７に示されるように、画像捕捉デバイス上に基準画像を投影する。偏心開口は、全光の一部を対物レンズの入射瞳を通してサンプリングし、例えば、ビームスポットとして画像捕捉デバイス上に投影するように位置付けられ、サイズを決定される。対物レンズが、その進行軸に沿って移動させられるにつれて、ビームスポットは、線形に平行移動し、焦点を変更する。このパターンは、下記にさらに詳細に議論されるであろうように、基準勾配を生成するために方略的に利用され、基準勾配は、ビームスポットの位置を複数のｚ位置にマップする。

図２Ａは、最良焦点位置を較正し、顕微鏡システムのための対物レンズ２０２を自動集束させるための自動集束システム２００の例示的実装である。自動集束システム２００は、画像捕捉デバイス２０４と、光源２０６と、第１の撮像レンズ２０８と、ビーム分割器２１０と、第２の撮像レンズ２４０と、自動集束開口２３０とを含む。対物レンズ２０２は、サンプルウェル２１４内に堆積させられ得るサンプルに関する撮像および／または光学測定を実施するように構成される顕微鏡システムのコンポーネントである。顕微鏡システムの他のコンポーネントは、基準表面２１２ａ、２１２ｂを伴うプレート２１２を支持する任意のサンプル保持構造物を含む。

図２Ａの自動集束システム２００は、顕微鏡システムのモジュールまたはサブシステムとして実装される。例えば、励起光源、フィルタ、ビーム分割器、およびサンプル画像捕捉デバイス等、顕微鏡システムがサンプルを撮像するために使用する他のコンポーネントが、図２Ａに、サンプル撮像コンポーネント２２１として表される。サンプル撮像コンポーネント２２１は、例えば、顕微鏡システムがサンプルを撮像するために使用されるときの対物レンズ２０２と、プレート２１２とを含む光学経路を形成する、レンズ、フィルタ、または他の光学デバイスを含み得る。顕微鏡システム２００は、実施されている撮像または測定のタイプに基づいて、異なる光源または異なるサンプル画像捕捉デバイスも使用し得る。光学デバイスは、図２Ａの対物レンズの下方、ビーム分割器２１０の上方の２２１ａにおいて、または偏心開口２３０の上方の２２１ｂにおいて挿入され得る。図２Ａに示される例内のサンプルウェル２１４は、自動集束手順のための底部基準表面２１２ａと、上部基準表面２１２ｂとを提供するプレート２１２上に形成される。

最良焦点位置の自己較正が、所与の対物レンズ２０２に関して実施されると、後続の撮像または光学測定においてその対物レンズ２０２を集束させるプロセスが、最小限のさらなる撮像を用いて実施され得る。最良焦点位置の較正は、基準較正勾配として記憶され得、それは、システムデータ記憶システム２２３内に対物レンズ２０２を特徴付けるデータとともに記憶されるか、または、含まれ得る。

第１の撮像レンズ２０８は、光源２０６からの光を光学経路２０１に沿ってコリメートし、コリメート光をビーム分割器２１０に渡す。ビーム分割器２１０は、光の一部を光学経路２０３に沿って対物レンズ２０２に向かって、光学経路２０５上のプレート２１２に向かって反射する。プレート２１２は、光を対物レンズ２０２に戻るように、光学経路２０７上のビーム分割器２１０に向かって反射する。ビーム分割器２１０は、光の一部を光学経路２０９に沿って、偏心開口２３０に向かって通す。光が、開口２３０上に衝突する全光ビームより小さい開口２３０上の中心から外れた開口部を通過する。開口２３０の残りの部分が、開口を通されていない光ビームの一部を塞ぐ。開口２３０を通過する光は、第２の撮像レンズ２４０および画像捕捉デバイス２０４に向けられる。偏心開口２３０は、対物レンズ２０２から平面波面の一部をサンプリングすることによって動作する。光のサンプリングされた部分は、第２の撮像レンズ２４０によって集束させられ、検出器の方に向けられるが、偏心開口によって、非対称的な周辺光線として拘束される。これは、コンポーネント設定のいかなるものも変更することなく、光および最良焦点の位置を視認することを可能にする。異なるサイズおよび／または位置を有する異なる偏心開口が、感度の調節または対物レンズ２０２の異なるサイズの瞳直径を可能にするために使用され得ることを理解されたい。

図２Ａに示される光学経路２０１、２０３、２０５、２０７、および２０９が、画像捕捉デバイス２０４上に衝突する光ビームを形成する、光学経路に沿った光のみを示すことに留意されたい。示されていない光の部分は、自動集束開口２３０の遮断部分によって塞がれる光の部分である。

対物レンズ２０２は、ｚ軸上の光学経路２０３および２０５に沿って移動するように構成され、ｚ軸は、プレート２１２が延びているｘｙ平面に対して直角である（図２Ａに示される）。下記の説明は、明確性を提供する方法として、対物レンズの位置をｚ軸上にあるものとして参照し、基準画像の位置、または側方位置をｘｙ平面上にあるものとして参照する。基準画像は、画像面上の線形経路に沿って平行移動する。この線形経路は、「ｙ軸」と称される。空間呼称を提供するための「ｚ軸」または「ｙ軸」の使用が、限定的であることを意図していないことを理解されたい。任意の好適な座標系が、使用され得る。さらに、例示的実装が、非垂直方向において進行する、対物レンズ２０２を伴い得ることに留意されたい。

プレート２１２は、図２Ａに示されるように、サンプルウェル２１４を含み得、サンプルウェル２１４は、顕微鏡システムの普通の機能および動作に従って、その中に堆積させられ得るサンプルを撮像するために位置付けられ得る。図２Ａに示される例示的システムでは、サンプルウェルの底部表面である、プレート２１２は、第１の表面２１２ａと、第２の表面２１２ｂとを有する。第１の表面２１２ａおよび／または第２の表面２１２ｂは、少なくとも部分反射性であり、それによって、自己較正自動集束手順中に使用するための反射性基準表面を提供し得る。基準表面は、サンプルウェル２１４の底部表面に近接する光学経路内に配置されるカバーガラス上、またはスライドまたは他の平面状材料の表面上にも提供され得る。

対物レンズ２０２は、コントローラ２２０によって制御される線形作動モータを使用して、ｚ軸に沿って移動させられ得る。対物レンズ２０２は、対物レンズ２０２を移動させる線形作動モータを含むものとして、図２Ａに図式的に表される。対物レンズ２０２は、顕微鏡システム２００がサンプル上を撮像するように制御されるとき、光源からの光をサンプル２１６上に集束させるように構成された選択された光学系を含む。自動集束手順中、対物レンズ２０２は、基準表面（プレート２１２上の２１２ａまたは２１２ｂ）上に集束するように制御される。いくつかの実装では、対物レンズ２０２を移動させるモータは、線形アクチュエータを伴うステッパモータまたはサーボモータであり得る。

偏心開口２３０を通過する光学経路に沿った光は、第２の撮像レンズ２４０を通して画像捕捉デバイス２０４まで進行し、投影された源が、検出器平面上で撮像される。焦点ぼけであると、画像捕捉デバイス２０４上の光ビームは、サイズが広がり、より低い強度および／または低コントラストを有する。対物レンズ２０２の焦点が合っているとき、基準画像は、最大強度、最小サイズ、およびその最高コントラストにおいて捕捉される。対物レンズ２０２を集束させるプロセスは、対物レンズ２０２を移動させ、ｚ軸上の最良焦点位置を見出すことを伴う。各対物レンズ２０２のｚ位置において捕捉される各基準画像内の各ビームスポットは、画像面内のある位置に出現し、その位置は、前の画像上のスポット位置からオフセットされている。

例示的実装では、自動集束システム２００内の画像捕捉デバイス２０４は、対物レンズ２０２が一連のｚ位置に移動するように制御されるにつれて、基準画像の画像を捕捉するようにコントローラ２２０によって制御され得る線形アレイ検出器、電荷結合素子、位置感受性ダイオード、画像捕捉デバイスのような２Ｄセンサアレイ、または任意の好適なデバイスであり得る。自動集束システム２００内の光源２０６は、レーザ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、またはＬＥＤアレイ、白色光、蛍光光源、赤外光等の任意の好適な光放出デバイスであり得る。

コントローラ２２０は、ハードウェアインターフェースを有する任意のコンピュータプログラマブルシステムを使用して実装され得、ハードウェアインターフェースは、少なくとも、画像捕捉デバイス２０４、および対物レンズ２０２を移動させるように構成されるモータに接続される。いくつかの実装では、コントローラ２２０も、対物レンズが自動集束させられている顕微鏡システム２２１のコンポーネントであり得る。自己較正自動集束手順は、コントローラ２２０がアクセスしているデータ記憶媒体２２３内にソフトウェアとして記憶される機能であり得る。

所与の対物レンズに関する自己較正および自動集束手順は、基準較正勾配を取得する第１のプロセスを実施することを伴う。基準較正勾配は、次いで、その後、対物レンズを自動集束させるために使用され得る。図２Ｂのフローチャートは、最初に、２６０において基準較正勾配を取得することによって、および２７０において基準較正勾配を使用し、対物レンズ２０２の最良焦点位置を決定することによって、対物レンズを自動集束させるための例示的方法２５０の動作を図示する。対物レンズ２０２は、次いで、最良焦点位置からのオフセットを使用して、または、図１Ａを参照して上で説明されるハードウェアベースの方法に類似するハードウェアベースの集束をサンプルに実施すること等の他の方法を使用して、サンプル上に集束するように移動させられ得る。

（下記に参照されるコンポーネントに関して）図２Ａおよび２Ｂを参照すると、自己較正および自動集束手順は、ステップ２５２において、対物レンズ２０２が、顕微鏡システム２００内での使用のために挿入されると、開始され得る。ステップ２５４において、システムは、選択されている特定の対物レンズ２０２を使用するために、開始または設定機能を実施し得る。１つの開始ステップは、決定ブロック２５６において、基準較正勾配が、対物レンズ２０２のために発生させられているかどうかを決定することを含み得る。基準較正勾配が、発生させられていない場合（方法２６０への「いいえ」の経路によって示される）、開始点場所は、ステップ２６２における自動集束手順に関して決定される。

対物レンズ２０２が、顕微鏡システム内に挿入または据え付けられているとき、ｚ軸に沿った対物レンズ２０２の位置は、典型的に、システムに既知ではない。システム２００は、対物レンズ２０２または対物レンズ２０２の構造物に取り付けられるセンサによって、移動するにつれて感知され得るホーム構造物に基づいて、対物レンズ２０２を既知の位置に位置付けるホーム機能を実施し得る。他の実装では、対物レンズ２０２は、プレート２１２からその最も遠い場所に位置付けられ得る。

対物レンズ２０２が、既知の位置またはホーム位置内にあると、コントローラ２２０は、ステップ２６３において、自動集束手順を始めるために、対物レンズ２０２をホーム位置から離れた所定の距離に位置付け得る。所定の距離は、対物レンズ２０２のデータ記述に記憶された開始位置であり得る。開始位置は、対物レンズの全てまたは大部分のために使用されるパラメータであり得る。

ステップ２６４において、基準画像が、対物レンズ２０２の現在の位置において捕捉される。対物レンズ２０２は、次いで、一連のｚ位置に位置付けられ、対物レンズが移動させられるにつれて、基準表面を走査する。走査は、各ｚ位置において基準画像を捕捉することを伴う。ｚ位置は、決定ブロック２６５に示されるように、チェックされ、走査が完了したかどうかを決定する。決定ブロック２６５において使用されるチェックのための図２Ｂの例は、基準画像が走査の各ｚ位置に関して捕捉されているかどうかをチェックすることによって、走査が完了したかどうかを決定する。走査は、設定された数のｚ位置を用いて、または対物レンズ上での進行限界が到達されるまで実施され得る。走査が、完了していない場合、対物レンズ２０２は、（「いいえ」の決定経路に沿った）ステップ２６６における次のｚ位置に移動させられる。ステップ２６４において、基準画像が、次のｚ位置において捕捉される。走査が、完了した場合、ステップ２６８（決定ブロック２６５の「はい」の経路）において、各ｚ位置において捕捉された基準画像が、分析される。

図３Ａは、顕微鏡システムにおける対物レンズのための最良焦点位置の較正中の線形アレイ検出器３０４の表現上にオーバーレイされたビームスポット３０２ａ－ｏの（ｙ軸に沿った）側方平行移動を図示する複数の画像３００のある例の略図である。

図３Ａのビームスポット３０２ａ－ｏは、対物レンズ２０２（図２Ａ）の１６個の対応するｚ位置において捕捉される画像に関する線形アレイ検出器３０４の画像面上の１６個の場所において示される。図３Ａが、このプロセスを図示するために、１６個の場所を示しているが、毎回、ｚ位置あたり、単一の画像面が、入手されることに留意されたい。図示される実施形態は、１６個のビームスポットを示しているが、任意の数のｚ位置および対応するビームスポットも、同様に使用され得ることを理解されたい。

各画像内のビームスポット３０２が、分析され、各ビームスポットの場所を決定する。撮像された物体の質量中心場所の決定は、周知であり、さらに詳細に説明される必要はない。各基準画像の各ビームスポット３０２の質量中心のｙ軸場所が、決定され、各画像が捕捉されたときの対物レンズのｚ位置に関連付けられる。図３Ａは、基準画像が相互の上にオーバーレイされる際のビームスポット３０２の側方平行移動を図示する。ビームスポット３０２は、各ビームスポットが捕捉された基準画像においてビームスポットが出現したｙ軸に沿って位置する。

各ビームスポット３０２ａ－ｏは、図３Ａでは、ｙ＝１からｙ＝６等の初期のｙ軸場所において集束させられていないとして示されている。集束のレベルは、ビームスポット３０２の属性を測定することから決定される。ビームスポット３０２ａ－ｅは、より低い強度を有し、それは、例えば、各スポットのより明るい陰影によって図３Ａの例内に示されている。ｙ＝７において、ビームスポット３０２ｆは、より集束させられ、それは、ビームスポット画像３０２ｆのより小さいサイズおよびより高い強度によって決定される。より高い強度は、ビームスポット３０２ｆの暗くなる陰影によって示される。ビームスポット３０２ｈは、図３Ａの最も暗い（最も高い光強度）および最小のスポットである。

対物レンズ２０２が、走査において一連のｚ位置に沿って、ｙ＝９を越えてさらに移動させられるにつれて、ビームスポット３０２ｉ－３０２ｏは、より大きくなり、基準画像の焦点がずれていることを示すより明るい陰影を有する。図２Ｂを参照すると、最良焦点位置は、ステップ２６８において示されるように、最小かつ最も明るいビームスポットを識別し、画像が捕捉されたｚ位置を最良焦点位置として設定することによって、決定され得る。図３Ａに示される例では、最良焦点位置は、ビームスポット３０２ｈのｙ位置に対応するｚ位置である。上記に示されるように、他の光学特性も、強度以外の最良焦点位置を決定するために使用され得、上記の例は、限定するものとして読み取られるべきではない。加えて、（図３Ａの）各ビームスポット３０２に関する強度の決定は、スポットを形成する全てのピクセル平均強度または他の測定値に基づき得る。例示的実装では、強度またはコントラストが、各スポットに関する焦点スコアを決定するために使用され得る。

ステップ２６８において、さらなる分析が、ビームスポットのｙ位置（図３Ａの３０２ａ－ｏ）をｚ位置と比較し、ｙ位置とｚ位置との間の線形関係を決定する。線形関係は、次いで、ステップ２６９において、基準較正勾配として記憶され得る。

データのプロットは、基準較正勾配を記憶するために必要ではないが、図３Ｂは、プレート２１２ａに対する基準画像位置ｙ対ｚ対物レンズ位置のプロットのある例を図示する。便宜上、ｙ軸およびｘ軸は、原点における最良焦点位置に対してシフトされている。図３Ｂに示されるように、図３Ａを参照して説明される走査から識別されるｙｚ点は、線Ｌによって近似され得る曲線Ｃ上に存在し得る。対物レンズ２０２のための基準較正勾配は、線Ｌのための一次式（すなわち、ｙ＝ｍｚ＋Ｂ）であるものとして示され得、それは、図示される例では、ｙ＝１．３７ｚ＋８．８１４である。対物レンズ２０２に関して、ビームスポット３０２等の基準画像は、対物レンズ２０２が位置付けられるいかなる場所においても捕捉され得る。ビームスポット３０２のｙ軸上の位置が、決定され得る。最良焦点位置からの現在の距離が、次いで、ｙ＝１．３７ｚ＋８．８１４を使用して決定され、システムの線形範囲内の１つ以上の基準画像から、ｚに関して解決し得る。

基準較正勾配は、好ましくは、非ゼロの勾配ｍである。ｍ＝０の基準較正勾配は、偏心開口または撮像レンズが、自動集束システム内で使用されていない場合、結果として生じるであろう。ビームスポットは、対物レンズの位置にかかわらず、全ての基準画像内の同じ位置にあるであろうから、平坦な水平線は、最良焦点位置の決定を可能にしないであろう。基準較正勾配は、開口サイズおよび開口の一部を通過する光の場所に従って偏心開口を選択することによって、調節され得る。撮像レンズも、基準較正勾配の大きさを調節するために、偏心開口の前または後で自動集束システムに追加され得る。センサ上の基準画像位置の軌跡へのセンサの整列が、センサに対する偏心開口の向きによって、容易に設定され得ることにも留意されたい。

図２Ｂに戻って参照すると、決定ブロック２５６において、ステップ２５２において挿入された対物レンズが、最良焦点位置に関してすでに較正されていることもある。該当する場合、基準較正勾配が、対物レンズ２０２に関して見出され（「はい」の決定経路が、辿られる）、方法２７０が、焦点を取得するために実施される。対物レンズ２０２のための基準較正勾配が、ステップ２７２において読み出され、ステップ２７６において開始位置に移動させられる。ステップ２７８において、画像が、開始位置において捕捉される。ステップ２８０において、画像が、分析され、画像内のビームスポットの質量中心のｙ軸上の位置を決定する。画像のｙ位置は、次いで、ステップ２８２において、基準較正勾配内で使用され、対物レンズ２０２の現在の位置と最良焦点位置との間の現在の距離を決定する。

顕微鏡システムの（図２Ａの）サンプル撮像コンポーネント２２１が、ここで、対物レンズ２０２を使用してサンプルを撮像するために展開され得る。対物レンズ２０２は、ステップ２８４において、最良焦点位置および所定のオフセットをｚ軸に沿って移動することによって、サンプル上に集束するように移動させられ得る。所定のオフセットは、撮像されているサンプルのタイプ、またはサンプルを保持するために使用されているプレートに従って決定され得る。いくつかの実装では、オフセットは、対物レンズ、サンプル、または縦方向の色オフセットに依存し得る。対物レンズは、標的基準画像を最良焦点から離れるようにシフトさせること、および較正勾配によるシフトをスケーリングすることによって、所定のオフセットまで移動するように制御され得る。

いくつかの光学測定値は、焦点のずれに対する高い感度を要求し得る。上記に記載されるように、対物レンズは、図１Ａおよび１Ｂを参照して上で説明されるように、ハードウェアベースの集束を使用してサンプル上に集束させられ得るが、図２Ｂの方法２５０を使用して決定される最良焦点位置から開始する。図１Ａおよび１Ｂを参照して説明されるプロファイル方法を偏心開口および較正勾配の予測的性質と組み合わせることが、より小さい検索範囲を定義することによって、本方法の速度を改良するであろう。より小さい検索範囲は、適切な対物レンズ位置を予測する１つ以上の測定値に基づき得るが、焦点のずれに対する感度を最大化する。

図２Ｂに戻って参照すると、最良焦点位置までのより精密な距離が、必要とされる場合、対物レンズは、いくつかの異なるｚ位置に移動させられ得、ステップ２７８－２８２が、対物レンズ２０２が移動させられる各ｚ位置に関して繰り返され得る。このように、基準較正勾配を定義する線形関係が、確認されるのみならず、焦点のずれに対する分解能を改良するための適合、補間、または他の方法による最良焦点の周囲の焦点メトリックに基づいて、最良焦点を見出し得る。このプロセスは、図４Ａ－４Ｃを参照して図示される。図４Ａ－４Ｃは、図２Ｂの方法２７０の例を使用して、異なるｚ位置において、対物レンズを用いて捕捉される、ビームスポット４２０の画像のグラフ表現４００、４０２、４０６を示す。図４Ａ－４Ｃの各スポット４２０は、スポットの略中心におけるより小さいスポットとしての質量中心４２１を伴って示される。図４Ｂの画像４０２は、最良焦点位置またはその近傍における、ビームスポット４２０を示す。図４Ａの画像４００は、対物レンズ２０２が最良焦点から離れるように１方向において焦点がずれていることを示すｙ位置におけるビームスポット４２０を示す。図４Ｃの画像４０６は、対物レンズ２０２が最良焦点から離れるような、図４Ａのビームスポット４２０の反対方向において焦点がずれていることを示すｙ位置におけるビームスポット４２０を示す。３つのビームスポットの画像が、例証的目のために、図４Ａ－４Ｃに示される。３つのビームスポットは、実際に、較正された最良焦点の周囲に中心を置かれた画像センサより小さくあり得る着目領域（ＲＯＩ）の走査を表し得、対物レンズの測定可能な焦点ずれの動的範囲全体を切り取る。例示的実装では、ビームスポットの多くのさらなる画像が、特に、より小さいＲＯＩに関して、分解能を改良するために、捕捉され、分析され得る。

図４Ａ－４Ｃのビームスポット４２０は、３つのビームスポットの走査に基づいて最良焦点位置および較正勾配を決定するために、分析され得る。最良焦点位置は、３つのビームスポット走査からのピーク焦点メトリックを補間、適合、または採取し、次いで、元の最良焦点位置と比較することによって、見出され得る。３つのビームスポット走査を分析することによって見出された較正勾配も、元の基準較正勾配と比較され得る。最良焦点位置および基準較正勾配は、許容可能誤差内であるべきである。いずれかが、許容可能誤差内ではない場合、走査が、より多くのデータ点を用いて、またはより大きいＲＯＩを用いて繰り返され得る。

基準画像が、ビームスポットまたはパターン化された画像であり得ることに留意されたい。光源２０６は、白色光または好適な波長の任意の他の光を単純な光ビームとして、またはパターン化された画像として発生させるように構成され得る。図４Ｄは、基準表面２１２ａまたは２１２ｂ上に投影され、画像捕捉デバイスによって基準画像として検出され得るパターン化された画像のある例である。パターン化された画像が、使用される場合、最良焦点は、例えば、フーリエ変換等の好ましいデータ変換を使用して基準画像を分析し、次いで、相関を計算することによって決定され得る。パターン化された画像は、次いで、ビームスポットに関して上で説明される技法と同様に、最良焦点に対応する光学属性に関して分析され得る。側方位置は、質量中心または最も明るいピクセルのいずれかとして決定され得、最高コントラストは、最良焦点を決定するための好ましい画像属性であり得る。パターン化された画像も、パターン認識方法を使用して分析され得、元のパターンに対する最良パターン合致が、最良焦点を示す。

自己較正自動集束システムは、種々の構成において実装され得る。図５－７は、代替構成の例である。図５－７に示される構成は、異なる数値で標識される任意の追加されたコンポーネントを伴う図２Ａの自動集束システム２００のコンポーネントを描写する。加えて、コントローラ２２０およびサンプル撮像のためのコンポーネント２２１は、示されていない。

図５は、偏心開口５０２を位置付けるための別の場所を図示する顕微鏡システム（図示せず）内で自己較正自動集束を実施するように構成される自動集束システム５００のある例である。偏心開口５０２は、ビーム分割器２１０の後と対照的に、第１の撮像レンズ２０８とビーム分割器２１０との間に配置される。図５に示される光学経路は、偏心開口５０２に通される全光の一部のみである。

図６は、自己較正自動集束を実施するように構成される自動集束システム６００の別の例である。光源２０６および第１の撮像レンズ２０８は、対物レンズ２０２の入射瞳を満たす光ビームを発生させるように構成され得る。対物レンズ２０２の入射瞳を満たす光ビームを使用することは、整列誤差を低減させ、感度を最大化し得る。図６のシステム６００は、ビーム平行移動の方向および感度を制御するために第２の撮像レンズ６０４の上方に挿入される偏心開口６０２を含む。例示的実装では、偏心開口６０２は、最良焦点位置を見出すステップにおける光スループットおよび精度を向上させる方法を提供するために、（当業者に公知の方法において光学的または機械的に）切り替え可能である。

図７は、自己較正自動集束を実施するように構成される自動集束システム７００の別の例である。図７の自動集束システム７００は、軸外撮像レンズ７０２と、偏心開口７０６の上方に位置付けられる、ビーム拡大レンズ７０４とを含む。

軸外撮像レンズ７０２は、光ビームの一部のみが、軸外撮像レンズ７０２を通過するように、軸外に位置付けられる。軸外撮像レンズ７０２を通過する光は、ビーム拡大レンズ７０４に向けられる。光は、次いで、偏心開口７０６に進み、それは、ビームの側方位位置をさらに強調する。

ハードウェアおよび／またはソフトウェアの任意の組み合わせが、本明細書に説明される自動集束システム２００を実装するために使用され得ることが、当業者に明白であるはずである。図２－７に関連して説明されるプロセス、サブプロセス、およびプロセスステップのうちの１つ以上のものが、１つ以上の電子またはデジタル制御デバイス上でハードウェア、ソフトウェア、またはハードウェアとソフトウェアとの組み合わせによって実施され得ることを理解されたい。ソフトウェアは、例えば、図２－７に図式的に描写される、機能システム、コントローラ、デバイス、コンポーネント、モジュール、またはサブモジュールのうちの１つ以上のもの等の好適な電子処理コンポーネントまたはシステム内のソフトウェアメモリ（図示せず）内に常駐し得る。ソフトウェアメモリは、論理機能（すなわち、デジタル式の回路網またはソースコード等のデジタル形態において、またはアナログ電気、音、またはビデオ信号等のアナログソース等のアナログ形態において実装され得る「論理」）を実装するための実行可能命令の順序付けられる列挙物を含み得る。命令は、例えば、１つ以上のマイクロプロセッサ、汎用目的プロセッサ、プロセッサ、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）の組み合わせを含む処理モジュールまたはコントローラ（例えば、図２の顕微鏡コントローラ２２０）内で実行され得る。さらに、概略図は、機能のアーキテクチャまたは物理的レイアウトによって限定されない、物理的（ハードウェアおよび／またはソフトウェア）実装を有する機能の論理分割を説明する。本願において説明される例示的システムは、種々の構成内に実装され、単一のハードウェア／ソフトウェアユニット内、または別個のハードウェア／ソフトウェアユニット内でハードウェア／ソフトウェアコンポーネントとして動作し得る。

実行可能命令は、電子システムの処理モジュールによって実行されると、電子システムに命令を行うように指示するその中に記憶される命令を有するコンピュータプログラム製品として実装され得る。コンピュータプログラム製品は、命令実行システム、装置、またはデバイスからの命令を選択的にフェッチし、命令を実行し得る電子コンピュータベースのシステム、プロセッサ含有システム、または他のシステム等の命令実行システム、装置、またはデバイスによる、またはそれに関連する使用のための任意の非一過性コンピュータ読み取り可能な記憶媒体内で選択的に具現化され得る。本書の文脈において、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体は、命令実行システム、装置、またはデバイスによる、またはそれに関連する使用のための、プログラムを記憶し得る任意の非一過性手段である。非一過性コンピュータ読み取り可能な記憶媒体は、選択的に、例えば、電子、磁気、光学、電磁気、赤外線、または半導体システム、装置、またはデバイスであり得る。非一過性コンピュータ読み取り可能な媒体のより具体的な例の非包括的なリストは、１つ以上のワイヤを有する電気接続（電子）、ポータブルコンピュータディスケット（磁気）、ランダムアクセス、すなわち、揮発性メモリ（電子）、読取専用メモリ（電子）、例えば、フラッシュメモリ（電子）等の消去可能なプログラマブル読取専用メモリ、例えば、ＣＤ－ＲＯＭ、ＣＤ－Ｒ、ＣＤ－ＲＷ（光学）等のコンパクトディスクメモリ、およびデジタル多用途ディスクメモリ、すなわち、ＤＶＤ（光学）を含む。

本書において使用されるような信号の受信および伝送が、２つ以上のシステム、デバイス、コンポーネント、モジュール、またはサブモジュールが、あるタイプの信号経路を経由して進行する信号を介して、互いに通信することが可能であることを意味することも理解されたい。信号は、第１のシステム、デバイス、コンポーネント、モジュール、またはサブモジュールから、第１および第２のシステム、デバイス、コンポーネント、モジュール、またはサブモジュールの間の信号経路に沿って、第２のシステム、デバイス、コンポーネント、モジュール、またはサブモジュールに情報、電力、またはエネルギーを通信し得る通信、電力、データ、またはエネルギー信号であり得る。信号経路は、物理、電気、磁気、電磁気、電気化学、光学、有線、または無線接続を含み得る。信号経路はまた、第１および第２のシステム、デバイス、コンポーネント、モジュール、またはサブモジュールの間に追加のシステム、デバイス、コンポーネント、モジュール、またはサブモジュールを含み得る。

本明細書に引用される、公開文書、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が、参照することによって組み込まれ、その全体として本明細書に記載されると個々にかつ具体的に示される場合と同程度に、参照することによって本明細書に組み込まれる。

本発明を説明する文脈において（特に、以下の請求項の文脈において）用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ（前記）」および類似の呼称の使用は、本明細書において別様に示される、または文脈によって明確に矛盾されない限り、単数形および複数形の両方を網羅すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別様に示されない限り、その範囲内に入る各別個の値を個々に言及する簡略的方法としての役割を果たすことを意図しているにすぎず、各別個の値は、本明細書に個々に列挙されている場合と同様に、本明細書内に組み込まれる。本明細書に説明される方法の全てが、本明細書において別様に示される、または文脈によって明確に別様に矛盾されない限り、任意の好適な順序において実施されることができる。本明細書に提供される、任意および全ての例または例示的な言い回し（例えば、「等」）の使用は、別様に請求されない限り、本開示をより明瞭に照明することを意図しているにすぎず、本開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書に、本開示を実践するために不可欠であるような、いかなる非請求要素をも示すものとして解釈されるべき言い回しは、存在しない。

本開示に対する多数の修正が、前述の説明に照らして、当業者に明白となるであろう。例証される実施形態が、例示的にすぎず、本開示の範囲を限定するものとして捉えられるべきではないことを理解されたい。

Claims (21)

1. 顕微鏡における対物レンズのための自動集束の方法であって、前記方法は、
   前記対物レンズの一連のｚ位置において撮影された複数の画像のそれぞれの位置を決定することによって、前記対物レンズのための基準較正勾配を発生させることであって、前記複数の画像のうちの少なくとも１つの画像は、最良焦点位置に対応する特定の属性を有し、前記複数の画像の捕捉中に形成される光学経路は、少なくとも部分的に偏心開口によって塞がれる、ことと、
   少なくとも部分的に前記基準較正勾配および前記最良焦点位置に基づいて、前記対物レンズを自動集束させることと
   を含む、方法。
2. 前記複数の画像は、基準表面から反射された光を画像捕捉デバイス上に投影することによって形成された各画像内のビームスポットを備えている、請求項１に記載の方法。
3. 前記複数の画像は、基準表面から反射されたパターン化された光を画像捕捉デバイス上に投影することによって形成された各画像内のパターンを備えている、請求項１に記載の方法。
4. 前記最良焦点位置に対応する前記特定の属性は、最小パターン画像サイズまたは最適コントラストである、請求項３に記載の方法。
5. 前記最良焦点位置に対応する前記特定の属性は、パターン認識技法を使用した元のパターンとの最高パターン相関である、請求項３に記載の方法。
6. 前記最良焦点位置に対応する前記特定の属性は、最高コントラストである、請求項１に記載の方法。
7. 前記最良焦点位置に対応する前記特定の属性は、最小ビームスポットサイズである、請求項１に記載の方法。
8. 前記最良焦点位置に対応する前記特定の属性は、最高照度である、請求項１に記載の方法。
9. 前記複数の前記画像の位置を決定することは、側方平行移動の軸に沿った各画像の質量中心場所を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記基準較正勾配を発生させることは、前記画像の前記質量中心場所と、前記対応するｚ位置との間の線形関係を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記対物レンズの前記光学経路内に別のサンプルウェルを位置付けることと、
    前記他のサンプルウェルのための前記最良焦点位置に前記対物レンズを移動させるための距離を識別することと
    をさらに含み、
    前記識別することは、
    別の基準画像を捕捉することと、
    前記他の基準画像の画像面上の前記側方位置を識別することと、
    前記他の基準画像の前記側方位置と、前記基準較正勾配とに基づいて、前記最良焦点位置までの距離を計算することと
    による、請求項９に記載の方法。
12. 前記最良焦点位置に前記対物レンズを位置付けることと、
    前記最良焦点位置からサンプル焦点位置までのオフセットを決定することと、
    前記対物レンズを前記最良焦点位置＋前記オフセットに位置付けることと
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
13. 前記対物レンズを前記最良焦点位置に移動させることと、
    前記サンプルに向かった方向における複数のｚ位置の各々において、サンプル画像を捕捉することと、
    スポット直径、強度、平均強度、最大信号尺度、標準偏差、分散、および、共分散を含む焦点メトリックのうちのいずれか１つ、またはそれらの組み合わせに基づいて、各対応するｚ位置における各サンプル画像に関する焦点スコアを決定することと、
    各ｚ位置に関する各サンプル画像の前記焦点スコアをプロットすることと、
    最終スコアにおける最高ピークを識別することと、
    前記対物レンズを前記最高ピークに対応する前記ｚ位置に位置付けることと
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
14. 顕微鏡システムにおける対物レンズを自動集束させるためのシステムであって、前記システムは、
    光源と、
    画像捕捉デバイスであって、前記画像捕捉デバイスは、前記対物レンズがｚ軸に沿った一連のｚ位置を通して移動させられている間、基準表面からの光の反射の画像を捕捉するように構成されている、画像捕捉デバイスと、
    前記光源からの光学経路内の偏心開口であって、前記偏心開口は、前記光源からの前記光の少なくとも一部を塞ぐ、偏心開口と、
    前記光源、前記画像捕捉デバイス、および前記対物レンズを制御するように構成されたコントローラと
    を備え、
    前記コントローラは、自己較正自動集束プロセスを実施するように構成され、前記自己較正自動集束プロセスを実施することは、
    前記対物レンズの一連のｚ位置において撮影された複数の画像のそれぞれの位置を決定することによって、前記対物レンズのための基準較正勾配を発生させることであって、前記複数の画像の少なくとも１つの画像は、最良焦点位置に対応する特定の属性を有する、ことと、
    少なくとも部分的に前記基準較正勾配と前記最良焦点位置とに基づいて、前記対物レンズを自動集束させることと
    による、システム。
15. 前記光源は、前記画像捕捉デバイス上にビームスポットを投影するように構成されている、請求項１４に記載のシステム。
16. 前記光源は、前記画像捕捉デバイス上にパターン画像を投影するように構成されている、請求項１４に記載のシステム。
17. 最良焦点に対応する前記特定の属性は、最小パターン画像サイズまたは最適コントラストである、請求項１６に記載のシステム。
18. 前記最良焦点位置に対応する前記特定の属性は、パターン認識技法を使用した元のパターンとの最高パターン相関である、請求項１６に記載のシステム。
19. 前記最良焦点位置に対応する前記特定の属性は、最高コントラストである、請求項１４に記載のシステム。
20. 前記最良焦点位置に対応する前記特定の属性は、最小ビームスポットサイズである、請求項１４に記載のシステム。
21. 前記最良焦点位置に対応する前記特定の属性は、最高照度である、請求項１４に記載のシステム。

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