JP2018501221A

JP2018501221A - 安定したエクソソーム製剤の製造方法

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Publication number: JP2018501221A
Application number: JP2017529773A
Authority: JP
Inventors: クレク，ミッチェル; スミス，レイチェル; ハンスコム，ピーター; ペック，キール; イブラヒム，アーメド
Original assignee: カプリコール，インコーポレイテッド
Priority date: 2014-12-03
Filing date: 2015-12-03
Publication date: 2018-01-18
Anticipated expiration: 2035-12-03
Also published as: JP6716564B2; JP2017537630A; US20170360842A1; US20160158291A1; EP3226875A1; EP3226875B1; EP3227434A4; WO2016090178A2; EP3753552A1; US20160160181A1; JP2020138983A; WO2016090183A1; EP3227434A2; WO2016090178A3; EP3226875A4

Abstract

本発明は、安定したエクソソーム製剤の生成方法及び安定したエクソソーム製剤を包含する。前記エクソソーム製剤は安定した液体エクソソーム製剤及び安定した凍結乾燥エクソソーム製剤を包含する。いくつかの実施形態において、前記エクソソーム製剤は限外濾過及び透析濾過によって生成され得る。前記エクソソーム製剤はヒトへの投与に好適でもあり得る。

Description

エクソソームは膜結合小胞である（Ｈｏｎｇｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＯＮＥ９（８）：ｅ１０３３１０．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１０３３１０.）。エクソソームは、尿、血漿及び腹水などの体液中で発見される（同上）。エクソソームはエンドソーム多小胞体の内側への出芽によって生成される（同上）。エクソソームのカーゴとしては、細胞膜上で発現したタンパク質／糖タンパク質、並びに親細胞のサイトゾルに存在する分子及び可溶性因子が挙げられる（同上）。エクソソームは通常４０−１００ｎｍの範囲の直径をもつ。Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，ＯｎｃｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ８：１７０１ −１７０６２０１４エクソソームは特異的タンパク質、脂質、ＲＮＡ及びマイクロＲＮＡを含有する（同上）。

心筋球由来細胞（Ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ‐ＤｅｒｉｖｅｄＣｅｌｌ）から生成したエクソソームは脈管形成を増強し、心筋細胞の生存及び増殖を促進する。参照により本明細書に組み込まれるＩｂｒａｈｉｍｅｔａｌ．，２０１４Ｍａｙ８；２（５）：６０６−１９。心筋球由来細胞から生成されたエクソソームはｍｉＲ−１４６ａが豊富である。

米国における主要な死因は依然として心臓病である。Ｋｏｃｈａｎｅｋｅｔａｌ．，ＮａｔｌＶｉｔａｌＳｔａｔＲｅｐ．２０１１；６０：１−１１６．老人人口に合わせて、虚血性心疾患の全世界の発生率及び死亡率は、主要有害心イベント（ＭＡＣＥ）における現在のケア基準の改善によって減少している（Ｍｏｒａｎｅｔａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１４；１２９：１４９３−１５０１．）。しかし、その結果、非致死性虚血性心疾患に起因する心臓発作生存者数及び身体障害年齢が増加し、このことは全体として虚血性心疾患の世界的な経済負担に大きく関わっている（同上）。このことは、現在のケア基準に対するＭＡＣＥの改善から、慢性狭心症及び心不全を罹患した生存患者のクオリティオブライフ、適応度及び生命力の改善への移行が必要とされていることを示唆する（同上）。

心筋球由来細胞（ＣＤＣ）は臨床実験中である。２つの臨床試験（ＣＡＤＵＣＥＵＳ及びＡＬＬＳＴＡＲ）において心筋梗塞（ＭＩ）後に投与したＣＤＣが梗塞サイズの減少及び生存可能な心筋の増加に安全かつ有効であることが示されている。エクソソームは代表的な再生医療の次世代治療プラットフォームである。これらのナノサイズの細胞外膜小胞は、機能的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及びＤＮＡ分子の強力な輸送媒体であり、増えてきた証拠が、これらの細胞外膜小胞は親細胞として類似の治療的利益を付与しうることを示唆する。ＣＤＣ由来エクソソームは、現在多数の前臨床モデルでＣＤＣの効果を再現することが示されている。ｄｅＣｏｕｔｏｅｔａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１４；１３０；Ｉｂｒａｈｉｍｅｔａｌ．，ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ］．２０１４；２：６０６−６１９；Ｔｓｅｌｉｏｕｅｔａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１４；１３０．調査から、ＣＤＣは、心筋細胞増殖、分岐血管新生を刺激し、及びＭＩモデルにおける機能回復を改善する特定のｍｉＲＮＡを含有するエクソソームを分泌することがわかった。前臨床データの全体性は、エクソソームがＣＤＣの心臓組織修復と関連する主要作用機序（ＭＯＡ）に必須な分泌有効成分（ＡＰＩ）であることを示す。

ＣＤＣ及びそれらの単離エクソソームは、心臓疾病の世界的負担を軽減する大きな治療的可能性を保持する。第１相ＣＡＤＵＣＥＵＳ及びＡＬＬＳＴＡＲ臨床試験では、ＣＤＣが梗塞サイズを縮小し、心筋組織生存能力を増加させることが示された（図１参照）。Ｍａｌｌｉａｒａｓｅｔａｌ．，ＪＡｍＣｏｌｌＣａｒｄｉｏｌ．２０１４；６３：１１０−１２２；ＭａｋｋａｒＲｅｔａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．２０１２；３７９：８９５−９０４；Ｍａｋｋａｒｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ．２０１４；６４．

ＣＡＤＵＣＥＵＳは、治療再生を示唆する生存可能な心筋の増加を観察するための最初の臨床試験である。ＭａｋｋａｒＲｅｔａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．２０１２；３７９：８９５−９０４．５年のサブスタディと共に進行中のＡＬＬＳＴＡＲ第２相試験は、クオリティオブライフ指標並びに入院期間及び死亡率に与える影響力を評価するであろう。

ナノサイズのエクソソームは、微生物捕捉フィルタ（例えば０．２２μｍ以下のフィルタ）を使用する方法で滅菌保証を増加させる能力など、細胞に対する大きな生成利点及び毒物学利点を有する。非生物エクソソームは、まさに非生物としての特質に起因して悪性腫瘍形成及び免疫原性応答リスクが潜在的に低下する。また、エクソソームは、細胞と比較して、安定した薬物貯蔵温度の選択肢でより大きい柔軟性（例えば室温及び低温対液体窒素）を有する。ＣＤＣ−エクソソーム生成に関する現在の研究過程は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有条件下での初めての播種及びコンフルエントまでのＣＤＣ増殖が関わる。エクソソーム生成では、ＣＤＣのコンフルエント層を洗浄し、無血清（ＦＢＳ−エクソソームを含まない）下で培養し、通常酸素圧条件の下で１５日間培養した。次いで、沈降法（研究だけに用いることにした）によって、解凍した条件培地（エクソソーム含有）からエクソソームを単離し、基本無血清培地（研究グレード試薬）で定式化した。

ＣＤＣエクソソームは、心臓機能を改善し、血管形成及び心筋細胞増殖を刺激し、及び心筋細胞アポトーシスを阻害することが可能であるが、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）由来エクソソームは否定的である。エクソソーム分泌がＧＷ４８６９で阻害されるとＣＤＣの心臓機能的利点が縮小された。

ＣＤＣエクソソームマイクロＲＮＡ組成物をｍｉＲＮＡアレイで特徴付けた。ｍｉＲ−２１０及びｍｉＲ−１４６ａは、ＮＨＤＦエクソソームと比較してＣＤＣエクソソームでアップレギュレーションされることがわかった。

ｍｉＲ−２１０は細胞性低酸素応答の中心的存在であり、内皮及び心筋細胞の細胞生存率及びミトコンドリア代謝を調節することができる。低酸素誘導性因子１−α（ＨＩＦ１α）は、近位ｍｉＲ−２１０プロモータ上で低酸素応答性領域（ＨｙｐｏｘｉａＲｅｓｐｏｎｓｅＥｌｅｍｅｎｔ（ＨＲＥ））に直接結合する。ＨＩＦ１α経路の下流標的はストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）である。ｍｉＲ−２１０は、プロセスパラメータを評価するための主要ＣＤＣエクソソームｍｉＲＮＡ定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）パネルの一部である。

ｍｉＲ−１４６ａは、様々な疾患の重要免疫調節分子であり、インターロイキン１（ＩＬ−１）受容体関連キナーゼ１（ＩＲＡＫ１）のダウンレギュレーションをもたらす活性化Ｂ細胞核因子カッパ−軽鎖エンハンサー（ＮＦ−κＢ）依存性シグナル伝達経路におけるトール様受容体４（ＴＬＲ４）の活性化と同時に誘導される。ｍｉＲ−１４６ａの分子標的は、先天性及び適応性免疫応答並びに、ＳＤＦ−１の７回膜貫通型受容体Ｇタンパク質共役受容体であるＣＸＣＲ４経路に関与する。ｍｉＲ−１４６ａは、プロセスパラメータを評価するための主要ＣＤＣエクソソームｍｉＲＮＡ定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）パネルの一部である。

特に臨床用途の技術分野では、より良好で安定したエクソソーム標品が必要である。本発明は、当該技術分野でこの必要性を満たす。

本発明は、安定したエクソソーム製剤の生成方法及び安定したエクソソーム製剤を包含する。

本発明は、少なくとも１０^６のエクソソームを含有するヒトへの投与に適した安定した凍結乾燥エクソソーム製剤であって、凍結乾燥エクソソームは、凍結乾燥前のエクソソーム製剤の少なくとも９０％レベルのｍｉＲ−２１０ＲＮＡ及びｍｉＲ−１４６Ａを維持することを包含する。

本発明は、少なくとも１０^６のエクソソームを含むヒトへの投与に適した安定した凍結乾燥エクソソーム製剤であって、凍結乾燥エクソソームは、凍結乾燥前のエクソソーム標品の少なくとも９０％レベルのインビトロ生物活性を維持することを包含する。

本発明は、少なくとも１０^６のエクソソームを含むヒトへの投与に適した安定した凍結乾燥エクソソーム製剤であって、凍結乾燥エクソソームは、凍結乾燥前のエクソソーム標品の少なくとも９０％レベルのインビボ生物活性を維持することを包含する。

本発明は、少なくとも１０^６ＣＤＣエクソソームを含むヒトへの投与に適した安定した液体心筋球由来細胞（ＣＤＣ）エクソソーム製剤であって、エクソソーム製剤は、４℃、３０日間で開始エクソソーム製剤の少なくとも７５％レベルのｍｉＲ−２１０ＲＮＡ及びｍｉＲ−１４６Ａを維持することを包含する。

好ましくは、エクソソーム製剤が少なくとも１０^８のエクソソームを包含する。

好ましくは、エクソソーム製剤は心筋球由来細胞（ＣＤＣ）から生成され、最も好ましくは、限外濾過及び透析濾過によって生成される。

図１Ａ及びＢは、ナノサイトによるナノ粒子追跡分析を用いたブラウン運動で定量された、限外濾過（ＵＦＣ）分離後の種々の温度条件（４〜−８０℃）におけるＤＣ由来エクソソーム安定性を示す。図１Ｃ及びＤは、ナノサイトによるナノ粒子追跡分析を用いたブラウン運動で定量された、限外濾過（ＵＦＣ）分離後の種々の温度条件（４〜−８０℃）におけるＤＣ由来エクソソーム安定性を示す。図２は、−８０℃で７〜９０日間貯蔵した濃縮ＣＤＣ由来エクソソームにおける安定したｍｉＲ−１４６Ａ及びｍｉＲ−２１０発現を示す。濃縮ＣＤＣ由来エクソソームを−２０℃及び４℃で３０〜９０日間貯蔵したときにｍｉＲ−２１０及びｍｉＲ−１４６Ａの発現が低下した。図３は、限外濾過（ＵＦＣ）コントロールと比較して、ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥＡ、ＲＩＮＧＥＲＳ及びＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥＡ＋デキストロース注射剤溶液又はＢＳＳプラスフラッシュ溶液の製剤化ＣＤＣ由来エクソソームにおける類似のアップレギュレーションｍｉＲ−１４６Ａ及びｍｉＲ−２１０発現を示す。図４は、ＵＦＣコントロールと比較して、４℃、−２０℃及び−８０℃で約３０日間貯蔵したＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥＡ、ＲＩＮＧＥＲＳ及びＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥＡ＋デキストロースの製剤化ＣＤＣ由来エクソソームにおける安定したｍｉＲ−１４６Ａ及びｍｉＲ−２１０発現を示す。図５及び６は、ＵＦＣコントロールと比較して、ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥＡ（プラズマライト）、ＲＩＮＧＥＲＳ（リンゲル液）及びＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥＡ＋デキストロース（Ｐ＋Ｄ）の製剤化ＣＤＣ由来エクソソームの生物活性を示す。マクロファージ表現型の心臓保護的表現型への変化によって示された生物活性がＡｒｇ１及びＮｏｓ２アップレギュレーションによって示された。点線は初代マクロファージのベースライン発現（１）を示す。図５及び６は、ＵＦＣコントロールと比較して、ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥＡ（プラズマライト）、ＲＩＮＧＥＲＳ（リンゲル液）及びＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥＡ＋デキストロース（Ｐ＋Ｄ）の製剤化ＣＤＣ由来エクソソームの生物活性を示す。マクロファージ表現型の心臓保護的表現型への変化によって示された生物活性がＡｒｇ１及びＮｏｓ２アップレギュレーションによって示された。点線は初代マクロファージのベースライン発現（１）を示す。図７Ａ−Ｃは、Ａ）Ａｒｇ１及びＮｏｓ２アップレギュレーションによって示された、マクロファージ表現型の心臓保護的表現型への変化、及びＢ）ラットＡＭＩ再灌流モデルにおける梗塞量の減少によって示された凍結乾燥（フリーズドライ）ＣＤＣ由来エクソソームの生物活性を示す。Ｃ）ｍｉＲ−１４６Ａ及びｍｉＲ−２１０の発現は、遠心分離による限外濾過（ＵＦＣ）とＵＦＣ凍結乾燥エクソソームで類似した。図８は、凍結乾燥前（Ｐｒｅ−Ｌｙｏ）及び凍結乾燥後（Ｐｏｓｔ−Ｌｙｏ）のＣＤＣ由来エクソソームに関して、アップレギュレーションしたｍｉＲ−１４６Ａ及びｍｉＲ−２１０発現を示す。図９は、透析濾過の有り無しでのｐＨ変化を示す。濾過したＣＭ：限外濾過による濃縮前に回収した後の出発物質。ＵＦＣ：透析濾過なしで濃縮されたエクソソーム産物。透析濾過前の開始ｐＨの代表。プラズマライト（ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ）：６．９−７．２の範囲で得られた一貫した結果。プラズマライト＋デキストロース：プラズマライト単独使用のときに見られた結果と類似した結果。リンゲル液：他の緩衝剤と比べて割合に大きなｐＨ変化。必要に応じて非常に広範な緩衝能力の潜在性。ＢＳＳプラス：ｐＨの大きな上方シフト。

種々の濃度でのエクソソーム貯蔵の影響を調査した。（図１）本実験では、限外濾過で調製したエクソソームを、４℃、−２０℃及び−８０℃で７日間貯蔵した。エクソソームの合計数は、これらの時間帯の間、種々の温度で大幅に減少しなかった。

バルク濃縮ＣＤＣ由来エクソソームを限外濾過によって調製した。−８０℃で７〜９０日間貯蔵したときに、濃縮ＣＤＣ由来エクソソームは安定したｍｉＲ−１４６Ａ及びｍｉＲ−２１０発現を示した。（図２）濃縮ＣＤＣ由来エクソソームを−２０℃及び４℃で３０〜９０日間貯蔵したときにｍｉＲ−２１０及びｍｉＲ−１４６Ａの発現が低下した。−２０℃及び４℃では、３０日間でエクソソームに含まれるｍｉＲ−１４６Ａ及びｍｉＲ−２１０は５０％未満のレベルであった。

−２０℃及び４℃でのエクソソーム安定性改良のために、ＣＤＣ由来エクソソームの製剤化を透析濾過によってＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥＡ、ＲＩＮＧＥＲＳ及びＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥＡ＋デキストロース注射剤溶液又はＢＳＳプラスフラッシュ（Ｐｌｕｓｆｌｕｓｈ）溶液中で行い、限外濾過（ＵＦＣ）コントロールと比較した。（図３）全製剤がｍｉＲ−１４６Ａ及びｍｉＲ−２１０ＲＮＡの類似レベルを示した。しかし、リンゲル液及びＢＳＳでは相対的に大きなｐＨ変化が見られた。（図９）

種々の製剤の長期安定性を比較するために、ＣＤＣ由来エクソソームをＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥＡ、ＲＩＮＧＥＲＳ及びＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥＡ＋デキストロースで製剤化し、次いで３０日間、４℃、−２０℃及び−８０℃で貯蔵した。ＵＦＣコントロールは、−８０℃での貯蔵と比べて４℃及び−２０℃で、約２０−３０％のｍｉＲ−１４６Ａ及びｍｉＲ−２１０レベルの減少を示した（図４）。他の全ての製剤がより低い減少を示し、ＲＮＡの安定性がコントロールと比較して改善したことを示す。

ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥＡ（プラズマライト）、ＲＩＮＧＥＲＳ（リンゲル液）及びＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥＡ＋デキストロース（Ｐ＋Ｄ）で製剤化したＣＤＣ由来エクソソームは、インビトロ生物活性モデルでＵＦＣコントロールに匹敵した。（図５及び６）全標品が生物活性を示し、ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥＡが最良の生物活性を示した。

エクソソームが凍結乾燥されて生物活性を保持できるかどうかを決定するために、最初の実験を行ってこの提案を評価した。ＳｐｅｅｄＶａｃの使用によってエクソソームの不安定度が増加し、エクソソーム生物活性が喪失した。バルクＵＦＣ濃縮ＣＤＣ由来エクソソームを１０^６で凍結乾燥した一方で、昇華状態の間は実施例５の凍結乾燥プロトコルを使用して低温を維持し、−８０℃で少なくとも３０日間貯蔵し、水で再水和した。次いで、インビトロでマクロファージ生物活性アッセイを試験した。（図７Ａ）凍結乾燥エクソソームは、非凍結乾燥エクソソームと同様に、マクロファージ表現型の心臓保護的表現型への変化によって実証されたような優れた生物活性を示した。従って、エクソソームの凍結乾燥及び再水和に起因する少しの有意な減少もインビトロ生物活性にはなかった。

凍結乾燥エクソソームは、ラットＡＭＩ再灌流モデルでも生物活性について評価した。（図７Ｂ）凍結乾燥ＣＤＣ由来エクソソームは、梗塞量の減少によって実証されたような優れた生物活性を示した。従って、エクソソームの凍結乾燥及び再水和に起因する少しの有意な減少もインビボでの生物活性にはなかった。

ｍｉＲ−１４６Ａ及びｍｉＲ−２１０の発現もＰＣＲで評価し、類似レベルの発現が、遠心分離による限外濾過（ＵＦＣ）とＵＦＣ凍結乾燥エクソソームで観察された。（図７Ｃ）従って、予想外にも、エクソソームは凍結乾燥及び再水和が可能であり、インビトロアッセイ及びインビボアッセイの両方を用いて、有意なｍｉＲＮＡの喪失及び生物活性の喪失を起こさなかった。

類似レベルのアップレギュレーションｍｉＲ−１４６Ａ及びｍｉＲ−２１０発現が、凍結乾燥前（Ｐｒｅ−Ｌｙｏ）と−８０℃で少なくとも３０日間化貯蔵した凍結乾燥後（Ｐｏｓｔ−Ｌｙｏ）で観察された。（図８）従って、凍結乾燥エクソソームは、ｍｉＲＮＡレベルを維持しながら長期間貯蔵が可能である。

本発明は、安定したエクソソーム製剤の生成を可能にする。本発明は、これらのエクソソーム製剤及びそれらの製造方法を包含する。
エクソソームの生成方法

本発明は細胞を培養することを含むエクソソームの生成方法を包含する。本発明は、２０％未満の酸素で少なくとも２日間細胞を培養すること、及び細胞からエクソソームを採取することを含むエクソソームの生成方法を包含する。

好ましくは、細胞培養は、少なくとも１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、又は１０^１２の細胞を含む。

好ましくは、細胞は初代細胞である。初代細胞は、少なくとも継代数を２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０とすることができる。不死化細胞も本発明によって包含される。

好ましくは、細胞はヒト細胞である。特に好ましい細胞型は心筋球由来細胞（ＣＤＣ）である。他の好ましい細胞型は、心臓組織由来幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、神経組織由来幹細胞及び他の組織由来幹細胞である。

１つの実施形態において、細胞は、ルーチンな培養条件、例えば２０％Ｏ_２、３７℃で、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ中にＴ１７５フラスコ当たり１０^６の細胞を播種することによって増殖させることができる。

種々の実施形態において、酸素濃度は、１−２％、２−３％、４−５％、５−６％、６−７％、７−８％、８−９％、９−１０％、１０−１１％、１１−１２％、１２−１３％、１３−１４％、１４−１５％、１５−１６％、１７−１８％、又は１８−１９％である。好ましくは、酸素濃度は２−８％、３−７％酸素、４−６％酸素、又は４．５−５．５％酸素である。

細胞は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０日間培養できる。好ましくは、細胞を５−１５日間、５−１０日間、又は１０−１５日間培養する。

好ましくは、細胞培養はインスリンサプリメン及び／又は化学的に定義された脂質濃縮物及びコレステロール脂質濃縮物を含む。
エクソソーム標品

本発明は、本発明の細胞培養から生成されたエクソソーム標品を包含する。種々の実施形態において、エクソソーム標品は直径５０〜２５０ｎｍのエクソソームを含有する。好ましくは、少なくとも２５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％のエクソソームは、少なくとも５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、又は１６０ｎｍである。好ましくは、少なくとも２５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％のエクソソームは、直径で少なくとも２５０ｎｍ未満、２４０ｎｍ、２３０ｎｍ、２２０ｎｍ、２１０ｎｍ、２００ｎｍ、１９０ｎｍ、１８０ｎｍ、１７０ｎｍ、１６０ｎｍ、１５０ｎｍ、又は１４０ｎｍである。従って、本発明は、少なくとも２５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％のエクソソームが直径５０〜２５０ｎｍ、直径６０〜２５０ｎｍ、直径６０〜２４０ｎｍ、直径５０〜２４０ｎｍなどであるエクソソーム標品を含む。

いくつかの実施形態において、エクソソーム標品は、少なくとも１０^５、５ｘ１０^５、１０^６、５ｘ１０^６、１０^７、５ｘ１０^７、１０^８、５ｘ１０^８、１０^９、５ｘ１０^９、１０^１０、５ｘ１０^１０、１０^１１、５ｘ１０^１１、又は１０^１２、又は５ｘ１０^１２のエクソソームを含有する。いくつかの実施形態において、エクソソーム標品は、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、又は１０^１１〜１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、又は１０^１２などのエクソソームを含有する。

いくつかの実施形態において、エクソソーム標品は、マイクロＲＮＡを含有する１つ以上のエクソソームを含む。種々の実施形態において、これらのマイクロＲＮＡはｍｉＲ−１４６Ａ及び／又はｍｉＲ−２１０を含みうる。いくつかの実施形態において、エクソソーム標品は、ｍｉＲ−２１０が濃縮されたエクソソームを含む。

種々の実施形態において、エクソソームを生成する細胞培養での酸素濃度は、１−２％、２−３％、４−５％、５−６％、６−７％、７−８％、８−９％、９−１０％、１０−１１％、１１−１２％、１２−１３％、１３−１４％、１４−１５％、１５−１６％、１７−１８％、又は１８−１９％である。好ましくは、酸素濃度は２−８％、３−７％酸素、４−６％酸素、又は４．５−５．５％酸素である。より低い酸素濃度（例えば２−８％酸素）で培養した細胞から生成されたエクソソームは、２０％酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームと、ＲＮＡ及びタンパク質構成成分が異なる。

１つの実施形態において、２−８％酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームのタンパク質含量は、２０％酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームのものより高い。１つの実施形態において、２−８％酸素で培養した細胞から生成したエクソソームの全ＲＮＡ含量は２０％酸素で培養した細胞から生成したエクソソームの全ＲＮＡ含量より高い。１つの実施形態において、２−８％酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームのｍｉＲ−１４６ＡＲＮＡ含量は２０％酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームのものより高い。１つの実施形態において、２−８％酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームのｍｉＲ−２１０ＲＮＡ含量は２０％酸素で培養した細胞から生成されたエクソソームのものより高い。
安定した液体ＣＤＣエクソソーム製剤

いくつかの実施形態において、本発明は安定した液体エクソソーム製剤を包含する。本発明の「安定した液体ＣＤＣエクソソーム製剤」の文脈内で、「液体」という用語は、２０℃での製剤の状態を意味する。従って、安定した液体ＣＤＣエクソソーム製剤は−２０℃で凍結するときに液体の場合がある。「ヒトへの投与に適した」という句は、製剤が、製剤の無菌性を維持する条件下で薬剤的に許容される組成で調製されたことを意味する。

安定した液体ＣＤＣエクソソーム製剤は、少なくとも１０^５、５ｘ１０^５、１０^６、５ｘ１０^６、１０^７、５ｘ１０^７、１０^８、５ｘ１０^８、１０^９、５ｘ１０^９、１０^１０、５ｘ１０^１０、１０^１１、５ｘ１０^１１、又は１０^１２、又は５ｘ１０^１２のＣＤＣエクソソームを含有しうる。いくつかの実施形態において、安定した液体ＣＤＣエクソソーム製剤は、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、又は１０^１１から１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、又は１０^１２など迄のエクソソームを含有する。ＣＤＣエクソソーム好ましくは、安定した液体ＣＤＣエクソソーム製剤は、少なくとも１０^６又は１０^８エクソソームを含む。

いくつかの実施形態において、安定した液体エクソソーム製剤中のｍｉＲ−２１０ＲＮＡ及びｍｉＲ−１４６Ａレベルは、少なくとも７、１４、２１、２３、３０、６０、９０日間などの間、少なくとも開始レベルの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％などのレベルで維持される。安定した液体エクソソーム製剤中のｍｉＲ−２１０ＲＮＡ及びｍｉＲ−１４６Ａのレベルが、少なくとも７、１４日間などの間、開始レベルの少なくとも１０％、２０％などのレベルで維持されるかどうかを実施例に記載されたアッセイ、及び類似のアッセイを用いて測定することができる。

いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−２１０ＲＮＡ及びｍｉＲ−１４６Ａのレベルは、２０℃、１０℃、４℃、０℃、−１０℃、−２０℃、−４０℃、−８０℃などで、少なくとも７、１４日間などの間、開始レベルの少なくとも１０％、２０％などのレベルで維持される。好ましくは、ｍｉＲ−２１０ＲＮＡ及びｍｉＲ−１４６Ａのレベルは、４℃、−２０℃、又は−８０℃で、少なくとも３０日間開始レベルの少なくとも３０％のレベルで維持される。

いくつかの実施形態において、安定した液体エクソソーム製剤は、１．０％未満、０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％などのポリエチレングリコール（ｗ／ｖ）を含む。好ましくは、安定した液体エクソソーム製剤は０．０１％未満のポリエチレングリコールを含む。

好ましくは、安定した液体エクソソーム製剤は限外濾過によって生成される。最も好ましくは、安定した液体エクソソーム製剤は、限外濾過による心筋球由来細胞（ＣＤＣ）からの限外濾過によって生成される。

好ましくは、安定した液体エクソソーム製剤は、２２００−３０００ｍｇの塩化ナトリウム、１６０−２００ｍｇの塩化カリウム、約１５０ｍｇの塩化マグネシウム六水和物、７０ｍＥｑのナトリウム、約１８００ｍｇの酢酸ナトリウム三水和物、及び約２５００のグルコン酸ナトリウムのレベル（５００ｍｌ当たり）で含有する溶液を含む。

好ましくは、安定した液体エクソソーム製剤は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％などの開始エクソソーム製剤のインビトロ生物活性レベルを、少なくとも７、１４、２１、２３、３０、６０、９０日間などの間維持する。インビトロ生物活性レベルは参照により本明細書に組み込まれるｄｅＣｏｕｔｏｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．２０１５Ａｕｇ３；１２５（８）：３１４７−６２の技術を用い、実施例に記載したマクロファージアッセイを用いて測定することができる。

好ましくは、安定した液体エクソソーム製剤は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％などの開始エクソソーム製剤のインビボ生物活性レベルを、少なくとも７、１４、２１、２３、３０、６０、９０日間などの間維持する。インビボ生物活性レベルは、参照により本明細書に組み込まれるｄｅＣｏｕｔｏｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．２０１５Ａｕｇ３；１２５（８）：３１４７−６２の技術による実施例に記載したラットＡＭＩ再灌流モデルアッセイを用いて測定することができる。
安定した凍結乾燥エクソソーム製剤

いくつかの実施形態において、本発明は安定した凍結乾燥エクソソーム製剤を包含する。本発明の「安定した凍結乾燥エクソソーム製剤」の文脈内で、「凍結乾燥された（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）」という用語は、予め凍結乾燥（すなわちフリーズドライ）処置を受けたエクソソームの標品を意味する。従って、「安定した凍結乾燥エクソソーム製剤」は、乾燥エクソソーム標品又は凍結乾燥を受けて、その後水溶液中に懸濁されたエクソソームの標品を意味する場合がある。「ヒトへの投与に適した」という句は、製剤が、製剤の無菌性を維持する条件下で薬剤的に許容される組成で調製されたことを意味する。

安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は、少なくとも１０^５、５ｘ１０^５、１０^６、５ｘ１０^６、１０^７、５ｘ１０^７、１０^８、５ｘ１０^８、１０^９、５ｘ１０^９、１０^１０、５ｘ１０^１０、１０^１１、５ｘ１０^１１、又は１０^１２、又は５ｘ１０^１２のエクソソームを含有しうる。いくつかの実施形態において、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、又は１０^１１から１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、又は１０^１２など迄のエクソソームを含有する。好ましくは、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は、少なくとも１０^６又は１０^８のエクソソームを含む。

いくつかの実施形態において、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤中のｍｉＲ−２１０ＲＮＡ及びｍｉＲ−１４６Ａレベルは、凍結乾燥前製剤の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％などのレベルを、好ましくは、少なくとも７、１４、２１、２３、３０、６０、９０日間など間、維持される。安定した凍結乾燥エクソソーム製剤中のｍｉＲ−２１０ＲＮＡ及びｍｉＲ−１４６Ａのレベルが、少なくとも７、１４日間などの間、凍結乾燥前製剤の少なくとも１０％、２０％などのレベルで維持されるかどうかを実施例に記載されたアッセイ及び類似アッセイ、すなわち凍結乾燥前後でｍｉＲＮＡを測定することによって決定することができる。

いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−２１０ＲＮＡ及びｍｉＲ−１４６Ａのレベルは、２０℃、１０℃、４℃、０℃、−１０℃、−２０℃、−４０℃、−８０℃などで、少なくとも７、１４日間などの間、凍結乾燥前製剤の少なくとも１０％、２０％などのレベルで維持される。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−２１０ＲＮＡ及びｍｉＲ−１４６Ａのレベルは、冷凍なしで少なくとも７、１４日間などの間、凍結乾燥前製剤の少なくとも１０％、２０％などのレベルで維持される。好ましくは、ｍｉＲ−２１０ＲＮＡ及びｍｉＲ−１４６Ａのレベルは４℃、−２０℃、又は−８０℃で少なくとも７日間、凍結乾燥前製剤の少なくとも７０％のレベルで維持される。更に好ましくは、ｍｉＲ−２１０ＲＮＡ及びｍｉＲ−１４６Ａのレベルは、４℃、−２０℃、又は−８０℃で少なくとも７日間、凍結乾燥前製剤の少なくとも９０％のレベルで維持される。最も好ましくは、ｍｉＲ−２１０ＲＮＡ及びｍｉＲ−１４６Ａのレベルは、冷凍なしで少なくとも７日間、凍結乾燥前製剤の少なくとも９０％で維持される。

本発明は、少なくとも１０^６のエクソソームを含む安定した凍結乾燥エクソソーム製剤であって、凍結乾燥エクソソームが凍結乾燥前エクソソーム製剤の少なくとも９０％のレベルのｍｉＲ−２１０ＲＮＡ及びｍｉＲ−１４６Ａを維持することを包含する。

好ましくは、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％などの凍結乾燥前のエクソソーム製剤のインビトロ生物活性レベルを、好ましくは少なくとも７、１４、２１、２３、３０、６０、９０日間などの間維持する。凍結乾燥前後のインビトロ生物活性レベルは参照により本明細書に組み込まれるｄｅＣｏｕｔｏｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．２０１５Ａｕｇ３；１２５（８）：３１４７−６２の技術による実施例に記載したマクロファージアッセイを使用して測定することができる。

好ましくは、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％などの凍結乾燥前のエクソソーム製剤のインビボ生物活性レベルを、好ましくは少なくとも７、１４、２１、２３、３０、６０、９０日間などの間維持する。凍結乾燥前後のインビボ生物活性レベルは参照により本明細書に組み込まれるｄｅＣｏｕｔｏｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．２０１５Ａｕｇ３；１２５（８）：３１４７−６２の技術による実施例に記載したラットＡＭＩ再灌流モデルアッセイを用いて測定することができる。

本発明は、少なくとも１０^６のエクソソームを含む安定した凍結乾燥エクソソーム製剤であって、凍結乾燥エクソソームは、凍結乾燥前エクソソーム標品の少なくとも９０％のレベルのインビトロ生物活性を維持することを包含する。

本発明は、少なくとも１０^６のエクソソームを含む安定した凍結乾燥エクソソーム製剤であって、凍結乾燥エクソソームは、凍結乾燥前エクソソーム標品の少なくとも９０％のレベルのインビボ生物活性を維持することを包含する。

いくつかの実施形態において、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は、１．０％未満、０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％などのポリエチレングリコール（ｗ／ｖ）を含む。好ましくは、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は０．０１％未満のポリエチレングリコールを含む。

いくつかの実施形態において、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は心筋球由来細胞（ＣＤＣ）から生成される。いくつかの実施形態において、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は間充織幹細胞（ＭＳＣ）、心臓組織由来幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、神経組織由来幹細胞及び他の組織由来幹細胞から生成される。

好ましくは、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は限外濾過によって生成される。最も好ましくは、安定した凍結乾燥エクソソーム製剤は、限外濾過による心筋球由来細胞（ＣＤＣ）からの限外濾過によって生成される。
エクソソーム採取

エクソソームは、ルーチン技術によって細胞培養から採取することができる。例えば、細胞はコンフルエントに達したときに、２５ｍｌのＰＢＳで３回洗浄され、３０ｍｌのＩＭＤＭが加えられ（ＦＢＳなし）、特定の酸素濃度にある恒温器に戻すことができる。一定時間の後、ＩＭＤＭ培地を取り除き、５０ｍｌの円すい管に配置することができる。培地は、細胞残屑を除去するため３０００ｘｇで１５分間遠心分離することができる。培地は、１５ｍｌの円すい管に１０ｍｌの画分で分割され、−８０℃で保存される。

エクソソームは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５日間培養した後に採取することができる。

いくつかの実施形態において、エクソソームは、培養の２、３、４、又は５日おきに採取する。
エクソソーム精製

エクソソーム標品は、当該技術分野におけるルーチン技術によって調製することができる。いくつかの実施形態において、エクソソームの調製は、細胞の遠心分離及び／又は細胞によるコンディション化培地を含む。いくつかの実施形態において、超遠心分離法が使用される。いくつかの実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製はサイズ排除濾過による。いくつかの実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製は、不連続密度勾配、免疫親和性、限外濾過及び／又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の使用を含む。

いくつかの実施形態において、細胞由来のエクソソームからより大きいサイズの粒子を分離するために、少なくとも１０００ｘｇ、２０００ｘｇ、３０００ｘｇ、４０００ｘｇ、５０００ｘｇ、６０００ｘｇ，７０００ｘｇ，８０００ｘｇ，又は９０００ｘｇから２０００ｘｇ，３０００ｘｇ，４０００ｘｇ、５０００ｘｇ、６０００ｘｇ、７０００ｘｇ、８０００ｘｇ、９０００ｘｇ、１０，０００ｘｇ、又はそれ以上迄の遠心力を使用することを含め、異なる超遠心分離が使用される。

いくつかの実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製は、濾過又は限外濾過の使用を含む。特定の実施形態において、異なる細孔寸法のサイズ排除膜が使用される。例えば、サイズ排除膜は、少なくとも０．１、０．５μm、１．０μm、２．５μm、５μmから０．５μm、１．０μm、２．５μm、５μm、又はそれ以上迄の細孔寸法をもつフィルタの使用を含むことができる。いくつかの実施形態において、細孔寸法は約０．２μmである。いくつかの実施形態において、濾過又は限外濾過は、０．１ｋＤａ、０．５ｋＤａ、１ｋＤａ、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２５ｋＤａ、５０ｋＤａ，１００ｋＤａ，又は２５０ｋＤａから０．５ｋＤａ，１ｋＤａ，２ｋＤａ，５ｋＤａ，１０ｋＤａ、２５ｋＤａ、５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、２５０ｋＤａ、５００ｋＤａ、又はそれ以上迄の範囲のサイズ排除を含む。

好ましくは、単離したエクソソームは、０．２２μmの微生物排除フィルタを用いてフィルタ滅菌される。好ましくは、エクソソームは、０．４５μmを使用して細胞残屑を除去する。

種々の実施形態において、かかる系は可変流体流系を組み合わせて使用される。他の実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製は、エクソソーム画分を精製及び／又は濃縮するために使用される接線流濾過（ＴＦＦ）系の使用を含む。他の実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製は、（ＨＰＬＣ）を使用してエクソソームを均一にサイズ化した粒子に精製することを含む。種々の実施形態において、使用される密度勾配は、例えばショ糖密度勾配での遠心分離又は調製で離散型糖クッション（ｄｉｓｃｒｅｔｅｓｕｇａｒｃｕｓｈｉｏｎ）の応用である。

他の実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製は沈殿剤の使用を含む。例えば、ＥＸＯＱＵＩＣＫ（登録商標）などの沈殿剤は、コンディション化細胞培地に加えて、迅速かつ急速にエクソソーム集団を沈殿させることができる。いくつかの実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製は、容量排除ポリマー（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ））の使用を含む。別の実施形態において、細胞集団からのエクソソームの調製は、フローフィールドフローフラクショネーション（ＦｌＦＦＦ）、溶出ベース技術の使用を含む。

いくつかの実施形態において、ＰＥＧを５％、１０％、１５％、又は２０％の最終濃度で使用し、エクソソームを沈殿させる。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは約４０００、６０００、８０００、１００００、１２０００、１５０００、又は２３０００ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは約４０００−６０００、６０００−８０００、８０００−１００００、１００００−１２０００、１２０００−１５０００、又は１５０００−２３０００ダルトンの分子量を有する。

特定の実施形態において、エクソソームの調製は、特異的バイオマーカーを有する、又は特定の生体分子を含む１つ以上のエクソソームを単離するための１つ以上の捕捉剤の使用を含む。１つの実施形態において、１つ以上の捕捉剤が少なくとも１つの抗体を含む。例えば、エクソソーム関連抗原を認識する抗体免疫親和性を利用して特異的エクソソームを捕捉する。他の実施形態において、少なくとも１つの抗体が、電磁ビーズ、クロマトグラフィーマトリックス、プレート又はマイクロ流体デバイスなどの固定化表面に接合し、それによって対象の特異的エクソソーム集団の単離を可能にする。

いくつかの実施形態において、ＰＥＧは１−２％、２−３％、３−４％、４−５％、５−６％、６−７％、７−８％、８−９％、又は９−１０％の最終濃度に調製した後、エクソソーム標品に加える。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは約４０００、６０００、８０００、１００００、１２０００、１５０００、又は２３０００ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは約４０００−６０００、６０００−８０００、８０００−１００００、１００００−１２０００、１２０００−１５０００、又は１５０００−２３０００ダルトンの分子量を有する。

いくつかの実施形態において、エクソソームの凝集を起こす薬剤を、精製前又は精製後にエクソソーム標品に加える。
安定した液体エクソソーム製剤を製造する方法

本発明は、安定した液体エクソソーム製剤の製造方法を包含する。１つの実施形態において、エクソソームを限外濾過にかける。好ましくは、限外濾過は２、３、５、１０、２０、４０、５０、８０、又は１００ｋＤフィルタを用いる。

いくつかの実施形態において、微生物排除膜を使用して予想される微生物汚染を除去する（＜０．２２μmフィルタ）。

いくつかの実施形態において、安定した液体エクソソーム製剤は心筋球由来細胞（ＣＤＣ）から生成される。いくつかの実施形態において、安定した液体エクソソーム製剤は間充織幹細胞（ＭＳＣ）、心臓組織由来幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、神経組織由来幹細胞及び他の組織由来幹細胞から生成される。

いくつかの実施形態において、本方法は緩衝生理食塩水への緩衝剤の交換を含む。好ましくは、本方法は透析濾過を含む。
安定した凍結乾燥エクソソーム製剤を製造する方法

本発明は、安定した液体エクソソーム製剤の製造方法を包含する。好ましい実施形態において、昇華状態の間は低温が維持される。１つの実施形態において、実施例のプロトコルが凍結乾燥に使用される。

好ましい実施形態において、エクソソームはＩＭＤＭ又はＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥの溶液で提供される。

１つの実施形態において、エクソソームは昇華前に−７０℃に冷凍される。

１つの実施形態において、本方法は、エクソソームを−７０℃で２００ｍＴの真空にかけることを含む。種々の実施形態において、本方法は、−４０℃〜−０℃、好ましくは、−４０℃、−３０℃、−１０℃、又は０℃の温度で８０−４８０分間、１００ｍＴ／−７０℃でエクソソームを保持することを含む。好ましくは、凍結乾燥エクソソームを含むバイアルを窒素で充填（バックフィル）する。

好ましい実施形態では、凍結乾燥エクソソームを水溶液、好ましくは水に懸濁する。
安定したエクソソーム製剤を貯蔵する方法

いくつかの実施形態において、本発明は安定したエクソソーム製剤の貯蔵方法を包含する。いくつかの実施形態において、製剤は室温環境で維持される。いくつかの実施形態において、製剤は２０℃又は以下、１０℃、４℃、０℃、−１０℃、−２０℃、−４０℃、−８０℃などで維持される。いくつかの実施形態において、製剤は室温環境で維持される。いくつかの実施形態において、製剤は、少なくとも１週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年間など所定の温度で維持される。本発明は、２０℃以下、１０℃、４℃、０℃、−１０℃、−２０℃、−４０℃、−８０℃などで、少なくとも１週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年間など貯蔵されるエクソソーム標品を包含する。
エクソソーム分析

２０％未満の酸素で培養した細胞のエクソソーム標品は、分析することができる。エクソソームは、２０％酸素で培養した類似の細胞から調製したエクソソームと比較することができる。２０％未満の酸素（例えば２−８％酸素）で培養した細胞から生成されたエクソソームのタンパク質又はＲＮＡ含量が、２０％酸素で培養した細胞から生成されたものより高いかどうかは、本明細書に記載した技術又は他の類似の技術を用いて決定することができる。

エクソソームの数及びサイズは、例えばナノサイトによる定量法を用いて定量が可能である。

エクソソームのタンパク質含量は、総タンパク質レベルの測定に対してはルーチン技術を使用して、又は特異的タンパク質レベルの測定に対してはルーチンなタンパク質検出技術（例えばウエスタンブロット）を使用して分析することができる。

エクソソームのＲＮＡ含量は、全ＲＮＡレベルの測定に対してはルーチン技術を使用して、又は特異的ＲＮＡレベルの測定に対してはルーチンな核酸検出法（例えば、ＰＣＲ又はプローブハイブリダイゼーション）を使用して分析することができる。好ましいＲＮＡは、マイクロＲＮＡ、特にｍｉＲ−１４６Ａ及びｍｉＲ−２１０ＲＮＡである。

実施例１
エクソソーム標品

受領次第直ちに、心臓を肉眼的に解剖し、外植片と称した、それぞれ約２５ｍｇ（５００μπιｘ５００μπιｘ５００μπι；いくつかの実施形態では他のサイズを使用する）の生検サイズの塊に切断した。ヒト心臓は、以前に記載（米国特許ＵＳ２０１５０２１６９０５Ａ１を参照）した自動ティッシュスライサー（Ｚｉｍｍｅｒ（登録商標）Ｄｅｒｍａｔｏｍｅ）及び自動ティッシュチョッパー（Ｍｃｌｌｗａｉｎ（商標）ＴｉｓｓｕｅＣｈｏｐｐｅｒ，ＴｅｄＰｅｌｌａ，Ｉｎｃ．）を使用して切断した。次いで、外植片を、以前に記載（例えば、本明細書に参照として全体が組み込まれているＳｍｉｔｈｅｔａｌ．２００７並びに米国特許出願第１１／６６６，６８５号（２００７年４月２１出願）及び第１３／４１２，０５１号（２０１２年３月５日出願）を参照）したように処理した。

同種異系のＣＤＣを生成するために、外植片をＣＥＬＬＢＩＮＤ（登録商標）ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）容器（ＣｏｒｎｉｎｇＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）上に配置した。１−２週間後、外植片から新たに出現した細胞増生がコンフルエントになった。これらの外植片由来細胞（ＥＤＣ）をＩＸＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って採取した。ＥＤＣは、ＭａｓｔｅｒＣｅｌｌＢａｎｋ（ＭＣＢ）として凍結保存し、次いで心筋球（ＣＳｐｓ）として培養するか、又はＣＳｐ培養条件に直ちに配置した。ＣＳｐは、ＵｌｔｒａＬｏｗ（登録商標）ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）容器（ＣｏｒｎｉｎｇＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）面で増殖させた。

同種異系ＣＤＣをフィブロネクチンコートＮｕｎｃ＊ＴｒｉｐｌｅＦｌａｓｋｓ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）面に播種して増殖させ、コンフルエントになったときに細胞を継代した。様々な継代数でＣＤＣをフィブロネクチンコートＣｅｌｌＢｉｎｄ多層培養器上に播種し、エクソソーム生成用コンフルエントにすることができた。コンフルエントと同時に、培地を無血清条件（例えば、ＨＥＰＥＳ及びＬ−グルタミンを含むイスコフ改変ダルベッコ培地）と交換した。細胞は、５又は１５日間で培地に順化できた。
実施例２
エクソソーム単離

エクソソームは、０．４５μmを使用して濾過し、細胞残屑を除去した後、サイズ（２〜３０ｋｄａ）ベースの限外濾過、ポリエチレングリコール沈殿又はＥｘｏｑｕｉｃｋ（ＳＢＩ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）によって単離した。一定の状況で、単離したエクソソームを０．２２μmの微生物排除フィルタでフィルタ滅菌した。エクソソームを幾つかの透析濾過を使用して定式化し、緩衝剤を、許容される注射剤溶液（例えば、ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥ、ＲＩＮＧＥＲＳ溶液）に置き替えた。
実施例３
エクソソーム分析

エクソソームタンパク質は、ＤＣアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して評価した。エクソソーム粒度及び濃度は、ブラウン運動及びナノサイトによる追跡分析（ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＬｔｄ，ＭａｌｖｅｒｎＵＫ）を使用して評価した。ＲＮＡは、ｍｉＲＮｅａｓｙｍｉｃｒｏｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて単離し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ、Ｑｕｂｉｔ又はＡＡＴＩ断片化アナライザ（ＡｄｖａｎｃｅＡｎａｌｙｔｉｃｓ，Ａｎｋｅｎｙ，ＩＡ）を使用して定量した。逆転写反応及びｑＰＣＲ反応は、ＴａｑＭａｎｍｉＲプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）を使用して行った。
実施例４
エクソソーム生物活性

生物活性は、以前に記載（ｄｅＣｏｕｔｏｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．２０１５．Ａｕｇ３；１２５（８）：３１４７−６２）したＭ１又はＭ２表現型に対する骨髄由来マクロファージの遺伝子発現によってインビトロで評価した。生物活性は、以前に記載（ｄｅＣｏｕｔｏ，ｅｔａｌ２０１５）したラットＡＭＩ再環流モデルを用いてインビボで評価した。全結果は、平均±標準偏差とした提示した。２群間の統計的有意性は、ＡＮＯＶＡを使用して決定し、次いでテューキー（Ｔｕｋｅｙ）ＨＳＤ法で全ての組合せを比較した。差異は、ｐ＜０．０５の場合に有意とみなした。
実施例５
凍結乾燥プロトコル

培地中のエクソソーム製剤を凍結乾燥した一方、昇華状態の間は低温を維持した。凍結乾燥プロトコルは以下の通りであった。

できるだけ迅速に@−７０℃で凍結させ、−７０℃で６０分間保持する。

＠−７０℃で９０分間／真空（２００ｍＴで開始）で最終凍結させる。
１次乾燥：
工程１−＠１００ｍＴ、０分で−４０℃に設定
工程２−＠１００ｍＴ、９０分間、−４０℃に保持
工程３−＠１００ｍＴ、０分で−３０℃に設定
工程４−＠１００ｍＴ、４８０分間、−３０℃に保持
工程５−＠１００ｍＴ、０分で−１０℃に設定
工程６−＠１００ｍＴ、２４０分間、−１０℃に保持
工程７−＠１００ｍＴ、０分で０℃に設定
工程８−＠１００ｍＴ、１２０分間、０℃に保持
工程９−＠１００ｍＴ、０分で＋１０℃に設定
工程１０−＠１００ｍＴ、９０分間、＋１０℃に保持
２次乾燥：
＠１００ｍＴで９，９９９分間、＋２０℃（注意：無制限保持のための９，９９９入力）

バイアルを窒素＠７００，０００ｍＴで充填（バックフィル）し、真空下で塞栓し蓋をした。

Claims

少なくとも１０^６のエクソソームを含むヒトへの投与に適した安定した凍結乾燥エクソソーム製剤であって、前記凍結乾燥エクソソームは、凍結乾燥前のエクソソーム製剤の少なくとも９０％レベルのｍｉＲ−２１０ＲＮＡ及びｍｉＲ−１４６Ａを維持する前記製剤。
前記エクソソーム製剤は、少なくとも１０^８のエクソソームを含む、請求項１に記載の安定した凍結乾燥エクソソーム製剤。
前記エクソソーム製剤は、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）から生成される、請求項１〜２のいずれか１項に記載の安定した凍結乾燥エクソソーム製剤。
前記エクソソーム製剤は、限外濾過及び透析濾過によって心筋球由来細胞（ＣＤＣ）から生成される、請求項３に記載の安定した凍結乾燥エクソソーム製剤。
少なくとも１０^６のエクソソームを含むヒトへの投与に適した安定した凍結乾燥エクソソーム製剤であって、前記凍結乾燥エクソソームは、凍結乾燥前のエクソソーム標品の少なくとも９０％レベルのインビトロ生物活性を維持する前記製剤。
前記エクソソーム製剤は、少なくとも１０^８のエクソソームを含む、請求項５に記載の安定した凍結乾燥エクソソーム製剤。
前記エクソソーム製剤は、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）から生成される、請求項５〜６のいずれか１項に記載の安定した凍結乾燥エクソソーム製剤。
前記エクソソーム製剤は、限外濾過及び透析濾過によって心筋球由来細胞（ＣＤＣ）から生成される、請求項７に記載の安定した凍結乾燥エクソソーム製剤。
少なくとも１０^６のエクソソームを含むヒトへの投与に適した安定した凍結乾燥エクソソーム製剤であって、前記凍結乾燥エクソソームは、凍結乾燥前のエクソソーム標品の少なくとも９０％レベルのインビボ生物活性を維持する前記製剤。
前記エクソソーム製剤は、少なくとも１０^８のエクソソームを含む、請求項９に記載の安定した凍結乾燥エクソソーム製剤。
前記エクソソーム製剤は、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）から生成される、請求項９〜１０のいずれか１項に記載の安定した凍結乾燥エクソソーム製剤。
前記エクソソーム製剤は、限外濾過及び透析濾過によって心筋球由来細胞（ＣＤＣ）から生成される、請求項１１に記載の安定した凍結乾燥エクソソーム製剤。
少なくとも１０^６のＣＤＣエクソソームを含むヒトへの投与に適した安定した液体心筋球由来細胞（ＣＤＣ）エクソソーム製剤であって、前記エクソソーム製剤は、４℃で３０日間、開始エクソソーム製剤の少なくとも７５％レベルのｍｉＲ−２１０ＲＮＡ及びｍｉＲ−１４６Ａを維持する前記製剤。
前記エクソソーム製剤は、少なくとも１０^８のエクソソームを含む、請求項１３に記載の安定した液体ＣＤＣエクソソーム製剤。
前記エクソソーム製剤は、限外濾過及び透析濾過によって心筋球由来細胞（ＣＤＣ）から生成される、請求項１３〜１４のいずれか１項に記載の安定した液体ＣＤＣエクソソーム製剤。