JP2018173306A - 分離材及びカラム - Google Patents
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Abstract
Description
[1]多孔質ポリマ粒子、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する高分子を含む被覆層、並びに、該多孔質ポリマ粒子と該被覆層との間に形成された、カテコール及びカテコール誘導体の少なくとも一方を含む膜を備え、上記多孔質ポリマ粒子が、二重結合を2つ以上有するモノマに由来するモノマ単位を90質量%以上含有する架橋ポリマであり、上記水酸基を有する高分子が、アクリルモノマ及びビニルモノマの少なくとも一方のモノマに由来するモノマ単位を含有するポリマを含む、分離材。
[2]上記膜が、ジヒドロキシインドール及びポリドーパミンの少なくとも一方を含む、[1]に記載の分離材。
[3]上記カテコール及びカテコール誘導体の少なくとも一方と上記水酸基を有する高分子とが共有結合を介して結合している、[1]又は[2]に記載の分離材。
[4]上記二重結合を2つ以上有するモノマが、芳香族基と該芳香族基に結合した2以上のビニル基とを有する架橋性モノマである、[1]〜[3]のいずれかに記載の分離材。
[5]上記分離材が充填されたカラムに、該カラム内の圧力が0.3MPaとなるように水を通液させたときに、水の通液速度が800cm/h以上である、[1]〜[4]のいずれかに記載の分離材。
[6]上記多孔質ポリマ粒子の平均細孔径が0.1〜0.5μmである、[1]〜[5]のいずれかに記載の分離材。
[7]上記被覆層が、陽イオン交換基又は陰イオン交換基を更に有する、[1]〜[6]のいずれかに記載の分離材。
[8]上記被覆層が、アフィニティリガンドを更に有する、[1]〜[7]のいずれかに記載の分離材。
[9][1]〜[8]のいずれかに記載の分離材を備えるカラム。
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層、及び、該多孔質ポリマ粒子と該被覆層との間に形成された膜を備える。なお、本明細中、「多孔質ポリマ粒子の表面」とは、多孔質ポリマ粒子の外側の表面のみでなく、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。また、本明細書中(メタ)アクリル酸とは、アクリル酸又はメタクリル酸を意味し、(メタ)アクリレート等の類似の表現においても同様である。
本実施形態における多孔質ポリマ粒子は、1種以上のモノマに由来するモノマ単位を含有するポリマを含む多孔質粒子であり、二重結合を2つ以上有するモノマに由来するモノマ単位を90質量%以上含有する架橋ポリマである。多孔質ポリマ粒子は、例えば、多孔質化剤を含むモノマを重合させて得られる粒子である。多孔質ポリマ粒子は、例えば、従来の懸濁重合、乳化重合等によって合成することができる。
1)粒子を、超音波分散装置を使用して水(界面活性剤等の分散剤を含む)に分散させ、1質量%の多孔質ポリマ粒子を含む分散液を調製する。
2)粒度分布計(シスメックスフロー、シスメックス株式会社製)を用いて、上記分散液中の粒子約1万個の画像により平均粒径及び粒径のC.V.(変動係数)を測定する。
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子と、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する高分子を含む被覆層との間に、カテコール及びカテコール誘導体の少なくとも一方を含む膜を備える。当該膜は、多孔質ポリマ粒子の表面の、水酸基を有する高分子を含む被覆層で被覆されていない部分を被覆していてもよい。
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層を備える。多孔質ポリマ粒子と、被覆層との間には、上述のカテコール及びカテコール誘導体の少なくとも一方を含む膜が少なくとも一部形成されているが、被覆層が当該膜を介さずに多孔質ポリマ粒子の表面に直接被覆されている部分があってもよい。被覆層は、水酸基を有する高分子を含む。分離材が、水酸基を有する高分子を含む被覆層を備えることにより、タンパク質の非特異吸着を抑制することが可能となる上、官能基を導入した際のタンパク質吸着量を充分高いものとすることが可能となる。
分離材は、イオン交換基、リガンド(プロテインA)等を、粒子表面の水酸基等を介して導入することにより、イオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基(イオン交換用官能基)は、陰イオン交換基又は陽イオン交換基であってよい。イオン交換基の導入方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。
500mLの三口フラスコに、モノマとして純度96%のジビニルベンゼン(DVB960、新日鉄住金社製)16g、油溶性界面活性剤としてSPAN80を6g、重合開始剤として過酸化ベンゾイル0.64gを加えたものをモノマ相として用意し、ポリビニルアルコール(0.5質量%)水溶液を連続相として用意した。上記モノマ相及び連続相を使用してマイクロプロセスサーバーにより乳化した後、得られた乳化液をフラスコに移し、80℃のウォーターバスで加熱しながら、攪拌機を用いて約8時間攪拌した。得られた粒子をろ過後、アセトンで洗浄し、多孔質ポリマ粒子を得た。
0.02gのドーパミン塩酸塩、2−ブロモイソブチルブロマイド0.049g、及びトリエチルアミン0.021gをDMF5mLに加え、液を3時間攪拌した。その後、多孔質ポリマ粒子を0.2g添加後、トリスヒドロキシメチルアミノメタン0.0121gを5gの水に溶解させた20mMのTris緩衝液を5mL添加し、室温で24時間攪拌した。粒子をろ過、水洗した後、粒子を過ヨウ素酸ナトリウム5mmol/l液中に浸漬し、24時間室温で攪拌し、架橋させた。得られた粒子をろ過、水洗し、リビングラジカル開始基を有する、カテコール誘導体を含む膜を備える粒子を得た。
得られた粒子0.2gに、臭化銅(II)0.0008g、Me6TREN 0.0017g、ブレンマーGLM(日油株式会社、グリセリンモノメタクリレート)6g、メタノール15gを添加し、窒素バブリングを行った。その後、アスコルビン酸0.315gを溶解させた。そこにメタノール5gを添加し、室温で24時間反応させた。重合後の粒子をろ過洗浄し、水酸基を有する高分子を含む被覆層を備える分離材を得た。
多孔質ポリマ粒子1g当たりの被覆層量(mg)は、示差熱熱重量測定装置(TG−DTA)を用いて測定される、粒子の5%重量減少温度におけるTGから算出した。測定は、40℃で30分保持した後、40〜500℃の温度範囲で行い、昇温速度は10℃/minとした。被覆層量は下記式より算出した。結果を表1に示す。
被覆層量(mg/粒子g)=R/(100−R)×1000
R(%)=95%−T
R(%):分離材に対する被覆量の割合
T(%):多孔質ポリマ粒子の5%重量減少温度における分離材のTG
得られた分離材0.2gをBSA(Bovine Serum Albumin)濃度24mg/mLのTris−塩酸緩衝液(pH8.0)20mLに投入し、24時間室温で攪拌した。その後、24時間静置し、遠心分離で上澄みをとった後、分光光度計で上澄み液のBSA濃度を測定し、当該濃度に基づいて、分離材に吸着したBSA量を算出した。BSAの濃度は分光光度計を用いて280nmの吸光度を測定することにより確認した。分離材1g当たりのBSA吸着量(非特異吸着量)が5mg以下を「○」、5mg超10mg未満を「△」、10mg以上を「×」とした。結果を表1に示す。
分離材を含む分散液から遠心分離により水を除去した後、20gのジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩を溶解させた水溶液100mLに分離材を分散させ、70℃で10分攪拌した。そこに、70℃に加温したNaOH水溶液5M100mLを添加し、1時間反応させた。反応終了後、ろ過し、水/エタノール(体積比8/2)で2回洗浄し、ジエチルアミノエチル(DEAE)基をイオン交換基として有する分離材(DEAE変性分離材)を得た。得られた粒子の平均細孔径を水銀圧入法にて測定した。
非特異吸着の評価が「○」であった分離材について、カラム特性を評価した。DEAE変性した分離材をメタノールと混合して、濃度30質量%のスラリーを調製した。当該スラリーをφ7.8×300mmのステンレスカラムに15分かけて充填した。
上記カラムに流速を変えながら水を流し、流速とカラム内圧力(カラム圧)との関係を調べた。カラム圧が0.3MPaのときの線流速(通液速度)を測定した。結果を表1に示す。
非特異吸着評価が「○」であった分離材について、静的吸着量(SBC)を評価した。2−アミノ−2−ヒドロキシメチル−1,3−プロパンジオール(以下「Tris」と略す)6.06gをポリカップに秤量し、純水を900mLまで加えてスターラーで攪拌した。30分攪拌後、1N塩酸を加えてpH8.0に調整した。これをメスフラスコに移し、総量1Lとなるように純水を加えてメスアップし、0.5M Tris緩衝液(pH8.0)とした。
上記方法により吸着させたタンパク質を以下の方法によって脱離した。上澄み分取後の、DEAE変性分離材を含む残存溶液にNaClを0.5Mになるように調整して投入し、24時間室温で攪拌を行って、タンパク質を分離材から脱離した。その後、遠心分離で上澄みをとった後、分光光度計で当該上澄み液のBSA濃度を測定し、当該濃度に基づいて、粒子から脱離したBSA量を算出した。BSAの濃度は分光光度計により280nmの吸光度から確認した。吸着したタンパク質全量が脱離した場合を100%として、脱離率を算出した。結果を表1に示す。
非特異吸着評価が「○」であった分離材について、逆滴定法によってイオン交換基を定量した。DEAE変性分離材0.2gを秤量し、純水中に分散させた。分離材を吸引ろ過し、0.1Nの水酸化ナトリウム溶液20mLを用いて、ろ紙上の分離材をポリカップに移した後、シェーカーで30分攪拌した。その後、吸引ろ過を行い、洗浄液のpHが8以下になるまで純水洗浄した。その後、0.1N硫酸水溶液10mLでろ紙上の分離材をポリカップに移した。シェーカーを用いて、室温で0.5時間液を攪拌した。再度吸引ろ過を行い、約800mlの純水で洗浄した。この洗浄液を、自動電位差滴定装置を使用し、0.1N水酸化ナトリウム水溶液で滴定して、イオン交換基密度を求めた。
被覆層の形成において、ブレンマーGLM(日油株式会社、グリセリンモノメタクリレート)を3gに変更した以外は実施例1と同様の処理を行って分離材を作製し、実施例2として評価した。
被覆層の形成において、ブレンマーGLMの代わりにメタクリル酸2−ヒドロキシエチル(東京化成工業株式会社)4.9gを用いた以外は、実施例1と同様の処理を行って分離材を作製し、実施例3として評価した。
被覆層の形成において、ブレンマーGLMの代わりに、以下のとおり合成した2−メタクリロイルオキシエチルウレイドマルトトリオース(2−(methacryloyloxy)ethylureidomaltotriose)13gを用い、添加するメタノールをメタノールと水との混合溶媒(水:メタノール=1:5)に変更した以外は、実施例1と同様に処理を行って分離材を作製し、実施例4として評価した。
イソマルトトリオース(東京化成工業株式会社)2g(3.96mmol)を、水30mlに溶かし、炭酸水素アンモニウム15gを3回に分けて24時間毎に添加した。37℃で96時間攪拌後、蒸留水50mlを加え、10mlまで水を留去した後、50mlの水を加え、10mlまで濃縮した。この操作をアンモニア臭が消失するまで繰り返した。凍結乾燥後、白色固体を得た。
カテコール誘導体を含む膜の形成、及び被覆層の形成をいずれも行わなかった以外は実施例1と同様に処理して分離材を作製し、比較例1として評価した。
カテコール誘導体を含む膜の形成を、以下のとおりに行い、被覆層の形成を行わなかった以外は実施例1と同様に処理して分離材を作製し、比較例2として評価した。多孔質ポリマ粒子の0.2gを、リン酸緩衝液でpHを8.5に調整したドーパミン塩酸塩水溶液10g(ドーパミン塩酸塩0.02g)に浸漬し、24時間室温にて攪拌した。その後、粒子をろ過し、水洗した後、過ヨウ素酸ナトリウム液(5mmol/l)中に浸漬し、24時間室温で攪拌し、架橋させた。架橋語、粒子をろ過し、水洗した。
カテコール誘導体を含む膜の形成を行わず、以下のとおりに被覆層を形成した以外は、実施例1と同様に処理して分離材を作製し、比較例3として評価した。
アガロース水溶液(2質量%)500mLに水酸化ナトリウム0.98g、グリシジルフェニルエーテル4.903gを添加して60℃で6時間反応させ、アガロースにフェニル基を導入した。得られた変性アガロースをイソプロピルアルコールで3回再沈殿させ、洗浄した。
カテコール誘導体を含む膜の形成を行わず、以下のとおりに被覆層を形成した以外は、実施例1と同様に処理して分離材を作製し、比較例4として評価した。
分子量(Mw)が7,000,000であるデキストラン水溶液(2質量%)500mLに水酸化ナトリウム0.98g、グリシジルフェニルエーテル9.26gを投入して60℃で6時間反応させ、デキストランにフェニル基を導入した。得られた変性デキストランをメタノールで3回再沈殿させ、洗浄した。
粒子としてCapto DEAE(GE社製)を用い、そのまま比較例5として評価した。
Claims (9)
- 多孔質ポリマ粒子、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する高分子を含む被覆層、並びに、該多孔質ポリマ粒子と該被覆層との間に形成された、カテコール及びカテコール誘導体の少なくとも一方を含む膜を備え、
前記多孔質ポリマ粒子が、二重結合を2つ以上有するモノマに由来するモノマ単位を90質量%以上含有する架橋ポリマであり、
前記水酸基を有する高分子が、アクリルモノマ及びビニルモノマの少なくとも一方のモノマに由来するモノマ単位を含有するポリマを含む、分離材。 - 前記膜が、ジヒドロキシインドール及びポリドーパミンの少なくとも一方を含む、請求項1に記載の分離材。
- 前記カテコール及びカテコール誘導体の少なくとも一方と前記水酸基を有する高分子とが共有結合を介して結合している、請求項1又は2に記載の分離材。
- 前記二重結合を2つ以上有するモノマが、芳香族基と該芳香族基に結合した2以上のビニル基とを有する架橋性モノマである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記分離材が充填されたカラムに、該カラム内の圧力が0.3MPaとなるように水を通液させたときに、水の通液速度が800cm/h以上である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記多孔質ポリマ粒子の平均細孔径が0.1〜0.5μmである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記被覆層が、陽イオン交換基又は陰イオン交換基を更に有する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記被覆層が、アフィニティリガンドを更に有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の分離材。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の分離材を備えるカラム。
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