JP2018121660A - 微細藻類における異種ポリペプチド、微細藻類細胞外体、組成物の産生、ならびにそれらの作製および使用の方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、組み換え微細藻類細胞および異種ポリペプチドの産生におけるその使用、微細藻類細胞外体における異種ポリペプチドの産生の方法、異種ポリペプチドを含む微細藻類細胞外体、ならびにそれらを含む組成物に関する。
[1] 培地中で組み換え微細藻類細胞を培養する段階を含む、血球凝集素(HA)タンパク質、ノイラミニダーゼ(NA)タンパク質、融合(F)タンパク質、糖タンパク質(G)タンパク質、エンベロープ(E)タンパク質、120 kDaの糖タンパク質(gp120)、41 kDaの糖タンパク質(gp41)、マトリックスタンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるウイルスタンパク質の産生のための方法であって、該組み換え微細藻類細胞が、ウイルスタンパク質を産生するために、ウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んだ核酸分子を含む、前記方法。
[2] ウイルスタンパク質が分泌される、[1]記載の方法。
[3] ウイルスタンパク質を培地から回収する段階をさらに含む、[1]または[2]記載の方法。
[4] ウイルスタンパク質が微細藻類細胞中に蓄積する、[1]記載の方法。
[5] ウイルスタンパク質が微細藻類細胞の膜中に蓄積する、[1]〜[4]のいずれか一項記載の方法。
[6] ウイルスタンパク質がHAタンパク質である、[1]〜[5]のいずれか一項記載の方法。
[7] HAタンパク質がSEQ ID NO: 77と少なくとも90%同一である、[6]記載の方法。
[8] 微細藻類細胞が、外因性プロテアーゼの非存在下でHA1およびHA2断片を産生するためのHAタンパク質の翻訳後プロセッシングの能力をもつ、[6]または[7]記載の方法。
[9] ウイルスタンパク質がNAタンパク質である、[1]〜[5]のいずれか一項記載の方法。
[10] NAタンパク質がSEQ ID NO: 100と少なくとも90%同一である、[9]記載の方法。
[11] ウイルスタンパク質がFタンパク質である、[1]〜[5]のいずれか一項記載の方法。
[12] Fタンパク質がSEQ ID NO: 102と少なくとも90%同一である、[11]記載の方法。
[13] ウイルスタンパク質がGタンパク質である、[1]〜[5]のいずれか一項記載の方法。
[14] Gタンパク質がSEQ ID NO: 103と少なくとも90%同一である、[13]記載の方法。
[15] 微細藻類細胞がヤブレツボカビ目(Thraustochytriales)の一員である、[1]〜[14]のいずれか一項記載の方法。
[16] 微細藻類細胞がシゾキトリウム属(Schizochytrium)またはヤブレツボカビ属(Thraustochytrium)である、[1]〜[15]のいずれか一項記載の方法。
[17] ウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列がHA膜ドメインをさらに含む、[1]〜[16]のいずれか一項記載の方法。
[18] 核酸分子が、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるポリヌクレオチド配列をさらに含む、[1]〜[17]のいずれか一項記載の方法。
[19] [1]〜[18]のいずれか一項記載の方法によって産生される、単離されたウイルスタンパク質。
[20] 血球凝集素(HA)タンパク質、ノイラミニダーゼ(NA)タンパク質、融合(F)タンパク質、糖タンパク質(G)タンパク質、エンベロープ(E)タンパク質、120 kDaの糖タンパク質(gp120)、41 kDaの糖タンパク質(gp41)、マトリックスタンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んだ核酸分子を含む、組み換え微細藻類細胞。
[21] 膜ドメインを含む異種ポリペプチドを、微細藻類宿主細胞において発現させる段階と、
異種ポリペプチドを含む細胞外体を産生するのに十分な条件下で微細藻類宿主細胞を培養する段階であって、該細胞外体が宿主細胞の原形質膜と不連続である、段階と
を含む、異種ポリペプチドを含む微細藻類細胞外体を産生する方法。
[22] 膜ドメインを含む異種ポリペプチドを、微細藻類宿主細胞において発現させる段階と、
異種ポリペプチドを含む微細藻類細胞外体を産生するのに十分な条件下で微細藻類宿主細胞を培養する段階であって、該細胞外体が宿主細胞の原形質膜と不連続である、段階と
を含む、微細藻類細胞外体と異種ポリペプチドとを含む組成物を産生する方法であって、
該組成物が、細胞外体を含む培養上清として産生される、前記方法。
[23] 前記組成物から培養上清を取り出す段階および細胞外体を水性液体担体に再懸濁する段階をさらに含む、[22]記載の方法。
[24] 宿主細胞がラビリンチュラ菌門(Labyrinthulomycota)の宿主細胞である、[21]〜[23]のいずれか一項記載の方法。
[25] 宿主細胞がシゾキトリウム属またはヤブレツボカビ属の宿主細胞である、[21]〜[24]のいずれか一項記載の方法。
[26] [21]記載の方法によって産生される細胞外体。
[27] [22]記載の方法によって産生される組成物。
[28] 異種ポリペプチドを含む微細藻類細胞外体であって、微細藻類細胞の原形質膜と不連続な微細藻類細胞外体。
[29] 小胞、ミセル、膜断片、膜凝集体、またはそれらの混合物である、[28]記載の細胞外体。
[30] 小胞および膜断片の混合物である、[28]または[29]記載の細胞外体。
[31] 小胞である、[28]または[29]記載の細胞外体。
[32] 異種ポリペプチドが膜ドメインを含む、[28]〜[31]のいずれか一項記載の細胞外体。
[33] 異種ポリペプチドが糖タンパク質である、[28]〜[32]のいずれか一項記載の細胞外体。
[34] 糖タンパク質が高マンノースオリゴ糖を含む、[33]記載の細胞外体。
[35] 糖タンパク質がシアル酸を実質的に含まない、[33]または[34]記載の細胞外体。
[36] [28]〜[35]のいずれか一項記載の細胞外体と水性液体担体とを含む、組成物。
[37] 水性液体担体が培養上清である、[36]記載の組成物。
本発明は、微細藻類宿主細胞において異種ポリペプチドを産生するための方法を対象とする。本発明は同様に、本方法によって産生される異種ポリペプチドを対象とし、異種ポリペプチドを含む微細藻類細胞を対象とし、および異種ポリペプチドを含む組成物を対象とする。本発明は同様に、宿主細胞の原形質膜と不連続な微細藻類細胞外体と結び付いている異種ポリペプチドの、微細藻類宿主細胞における産生を対象とする。本発明は同様に、異種ポリペプチドを含む微細藻類細胞外体の産生、およびそれを含む組成物の産生を対象とする。本発明はさらに、異種ポリペプチドを含む微細藻類細胞外体、組成物、およびその使用を対象とする。
微小藻類としても知られる微細藻類は、淡水および海洋系において見られることが多い。微細藻類は単細胞であるが、しかし鎖および群で増殖することもできる。個々の細胞はサイズが数マイクロメートルから数百マイクロメートルに及ぶ。それらの細胞は水性懸濁液中で増殖できるので、栄養素および水性環境に効率的にアクセスできる。
界: ストラメノパイル(クロミスタ)
門: ラビリンチュラ菌門(不等毛藻)
網: ラビリンチュラ網(Labyrinthulomycetes)ラビリンチュラ網(Labyrinthulae)
目: ラビリンチュラ目
科: ラビリンチュラ科
目: ヤブレツボカビ目
科: ヤブレツボカビ科
微細藻類宿主細胞における異種ポリペプチドの発現のために使われる発現系は、微細藻類細胞において活性な調節制御要素を含む。いくつかの態様において、発現系は、ラビリンチュラ菌門の細胞において活性な調節制御要素を含む。いくつかの態様において、発現系は、ヤブレツボカビ科生物において活性な調節制御要素を含む。いくつかの態様において、発現系は、シゾキトリウム属またはヤブレツボカビ属において活性な調節制御要素を含む。さまざまなプロモーターを含む多くの調節制御要素が、いくつかの多様な種において活性である。それゆえ、調節配列は、それらが単離された細胞と同一な細胞種において利用されてもよく、またはそれらが単離された細胞とは異なる細胞種において利用されてもよい。そのような発現カセットのデザインおよび構築では、当業者に公知の標準的な分子生物学技法を用いる。例えば、Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd editionを参照されたい。
本発明によれば、単離された核酸分子はその自然環境から取り出された(すなわち、人的操作に供された)核酸分子であり、その自然環境はその核酸分子が本来見出されるゲノムまたは染色体である。したがって、「単離された」とは、必ずしも、その核酸分子が精製されたという程度までを反映しているとは限らず、その核酸分子が本来見出されるゲノム全体または染色体全体をその分子が含んでいないことを示す。単離された核酸分子は、DNA、RNA(例えば、mRNA)、またはDNAもしくはRNAのいずれかの誘導体(例えば、cDNA)を含みうる。「核酸分子」という語句はそもそも物質的な核酸分子を指し、「核酸配列」または「ポリヌクレオチド配列」という語句はそもそも核酸分子上のヌクレオチドの配列を指すが、これらの語句は、異種ポリペプチドをコードする能力がある核酸分子、ポリヌクレオチド配列、または核酸配列については特に、互換的に用いられる。いくつかの態様において、本発明の単離された核酸分子は、組み換えDNA技術(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、クローニング)または化学的合成を用いて産生される。単離された核酸分子は、改変によってコードされる異種ポリペプチドの配列、機能および/または生物学的活性に望ましい効果を与えるような形でヌクレオチドが挿入、欠失、置換および/または反転されている改変された核酸分子ならびに天然の対立遺伝子の変種を含むが、これらに限定されない、天然の核酸分子およびその相同体を含む。
プロモーターは、関連しているコード領域の転写を指令するDNAの領域である。
ターミネーター領域は、転写のためにゲノムDNA中の遺伝子配列の末端に印を付ける遺伝子配列の部分である。
いくつかの態様において、単離された核酸分子は、ラビリンチュラ菌門の微生物からの分泌タンパク質のシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの態様において、微生物はヤブレツボカビ科生物である。いくつかの態様において、微生物はシゾキトリウム属またはヤブレツボカビ属である。
blastnの場合、以下の0 BLOSUM62マトリックスを用いる。
一致についての報酬 = 1
不一致についてのペナルティ = -2
オープンギャップ(5)および伸長ギャップ(2)ペナルティ
ギャップx_ドロップオフ(50)期待(10)ワードサイズ(11)フィルタ(オン)
blastpの場合、以下の0 BLOSUM62マトリックスを用いる。
オープンギャップ(11)および伸長ギャップ(1)ペナルティ
ギャップx_ドロップオフ(50)期待(10)ワードサイズ(3)フィルタ(オン)
本明細書で用いる「異種」という用語は、微細藻類宿主細胞において天然には見られない配列を指す。いくつかの態様において、本発明の組み換え宿主細胞により産生される異種ポリペプチドは、治療用タンパク質を含むが、これに限定されることはない。本明細書で用いる「治療用タンパク質」は、動物およびヒトにおける疾患、病態または障害の処置または予防に有用なタンパク質を含む。
本発明は同様に、原形質膜と不連続な微細藻類細胞外体を対象とする。「原形質膜と不連続な」とは、微細藻類細胞外体が宿主細胞の原形質膜とつながっていないことを意味する。いくつかの態様において、細胞外体は膜である。いくつかの態様において、細胞外体は小胞、ミセル、膜断片、膜凝集体、またはそれらの混合物である。本明細書で用いる「小胞」という用語は、脂質二重層(単位膜)を含む閉構造、例えば、細胞膜によって形成された泡様構造を指す。本明細書で用いる「膜凝集体」という用語は、単一の塊として結び付くようになる膜構造の任意の集まりを指す。膜凝集体は、限定されるものではないが、膜小胞の集まりのような単一種の膜構造の集まりであり得、または限定されるものではないが、小胞、ミセル、もしくは膜断片の少なくとも2つの集まりのような、単一種を超える膜構造の集まりであり得る。本明細書で用いる「膜断片」という用語は、本明細書に記載する異種ポリペプチドを含みうる膜の任意の部分を指す。いくつかの態様において、膜断片は膜シートである。いくつかの態様において、細胞外体は小胞および膜断片の混合物である。いくつかの態様において、細胞外体は小胞である。いくつかの態様において、小胞は崩壊した小胞である。いくつかの態様において、小胞はウイルス様粒子である。いくつかの態様において、細胞外体は、宿主細胞により産生される天然ポリペプチドおよび異種ポリペプチドを含む生物材料の凝集体である。いくつかの態様において、細胞外体は天然ポリペプチドおよび異種ポリペプチドの凝集体である。いくつかの態様において、細胞外体は異種ポリペプチドの凝集体である。
pH: 5.5〜9.5、6.5〜8.0、または6.3〜7.3
温度: 15℃〜45℃、18℃〜35℃、または20℃〜30℃
溶存酸素: 0.1%〜100%飽和、5%〜50%飽和、または10%〜30%飽和
グルコース制御: 5 g/L〜100 g/L、10 g/L〜40 g/L、または15 g/L〜35 g/L
1)1型膜タンパク質: これらのタンパク質は成熟タンパク質において単一膜貫通ドメインを有する。N末端は細胞外にあり、C末端は細胞質にある。タンパク質のN末端は、ERへの移入に向けてタンパク質を指令する古典的なシグナルペプチド配列を特徴的に有する。このタンパク質はIa型(切断可能なシグナル配列を含む)およびIb型(切断可能なシグナル配列がない)に細分される。I型膜タンパク質の例としては、インフルエンザHA、インスリン受容体、グリコホリン、LDL受容体、およびウイルスGタンパク質が挙げられるが、これらに限定されることはない。
2)II型膜タンパク質: これらの単一膜ドメインタンパク質の場合、C末端は細胞外にあり、N末端は細胞質にある。N末端はシグナルアンカー配列を持ちうる。このタンパク質種の例としては、インフルエンザノイラミニダーゼ、ゴルジガラクトシルトランスフェラーゼ、ゴルジシアリルトランスフェラーゼ、スクラーゼ・イソマルターゼ前駆体、アシアロ糖タンパク質受容体、およびトランスフェリン受容体が挙げられるが、これらに限定されることはない。
3)複数回膜貫通タンパク質: I型およびII型膜タンパク質では、ポリペプチドは脂質二重層を一回横断するが、複数回貫通膜タンパク質では、ポリペプチドは膜を複数回横断する。複数回膜貫通タンパク質はまた、IIIa型およびIIIb型に細分される。IIIa型タンパク質は切断可能なシグナル配列を有する。IIIb型タンパク質は、そのアミノ末端が膜の外面に曝露されているが、切断可能なシグナル配列を持たない。IIIa型タンパク質は、光反応中心のMおよびLペプチドを含むが、これらに限定されることはない。IIIb型タンパク質は、チトクロムP450および大腸菌のリーダーペプチダーゼを含むが、これらに限定されることはない。複数回膜貫通タンパク質のさらなる例は、膜輸送体、例えば糖輸送体(グルコース、キシロース)およびイオン輸送体である。
4)脂質鎖アンカー膜タンパク質: これらのタンパク質は、1つもしくは複数の共有結合している脂肪酸鎖またはプレニル基と呼ばれる他の種類の脂肪鎖によって、膜二重層と結び付いている。
5)GPIアンカー膜タンパク質: これらのタンパク質は、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーによって膜に結合される。
6)表在性膜タンパク質: これらのタンパク質は、他の膜タンパク質との非共有相互作用によって間接的に膜に結合される。
ウイルスエンベロープタンパク質は、ウイルス粒子の外層を形成する膜タンパク質である。これらのタンパク質の合成では、タンパク質を原形質膜に向けるために、細胞標的化シグナルのような膜ドメインを利用する。エンベロープコートタンパク質は、いくつかの主要な群に分類され、これにはHまたはHA(血球凝集素)タンパク質、NまたはNA(ノイラミニダーゼ)タンパク質、F(融合)タンパク質、G(糖タンパク質)タンパク質、Eまたはenv(エンベロープ)タンパク質、gp120(120 kDaの糖タンパク質)、およびgp41(41 kDaの糖タンパク質)が含まれるが、これらに限定されることはない。「マトリックス」タンパク質とよくいわれる構造タンパク質は、ウイルスの安定化を補助する働きをする。マトリックスタンパク質はM1、M2(膜チャネルタンパク質)、およびGagを含むが、これらに限定されることはない。エンベロープもマトリックスタンパク質もウイルスの組織化および機能に関与しうる。例えば、単独でのまたはウイルスマトリックスタンパク質との関連でのウイルスエンベロープコートタンパク質の発現は、ウイルス様粒子(VLP)の形成をもたらしうる。
いくつかの態様において、本発明の微細藻類細胞外体は、タンパク質活性または機能のための媒体として有用である。いくつかの態様において、タンパク質活性または機能は細胞外体中にまたは細胞外体上に存在する異種ポリペプチドと関連している。いくつかの態様において、異種ポリペプチドは膜タンパク質である。いくつかの態様において、タンパク質活性または機能は、細胞外体中に存在する膜タンパク質に結合するポリペプチドと関連している。いくつかの態様において、タンパク質は、可溶性の場合に機能的ではないが、本発明の細胞外体の一部の場合に機能的である。いくつかの態様において、糖輸送体(例えば、キシロース、スクロース、またはグルコース輸送体のような)を含んだ微細藻類細胞外体を用いて、ろ過または遠心分離を含むさまざまな方法によって分離できる小胞内に糖を捕捉することにより、糖または他の低分子量溶質の混合物を含有する培地から微量の糖を枯渇させることができる。
pCL0143発現ベクターの構築
pCL0143発現ベクター(図2)を合成し、DNA 2.0(Menlo Park, CA)によるSanger配列決定によりその配列を検証した。pCL0143ベクターは、HA導入遺伝子の発現を推進するためのシゾキトリウム属伸長因子-1遺伝子(EF1)由来のプロモーター、HA導入遺伝子の後のOrfCターミネーター(PFA3ターミネーターとしても公知)、および抗生物質パロモマイシンに対する耐性を与える選択マーカーカセットを含む。
シゾキトリウム属において産生されたHAタンパク質の発現および特徴付け
Biolistic(商標)パーティクルボンバーダー(BioRad, Hercules, CA)を用いたベクターpCL0143による形質転換用の宿主細胞としてシゾキトリウム種ATCC 20888を用いた。手短に言えば、シゾキトリウム種ATCC番号20888の培養物を、10 g/Lグルコース、0.8 g/L(NH4)2SO4、5 g/L Na2SO4、2 g/L MgS04・7H2O、0.5 g/L KH2PO4、0.5 g/L KCl、0.1 g/L CaCl2・2H2O、0.1 M MES(pH 6.0)、0.1% PB26金属、および0.1% PB26ビタミン(v/v)からなるM2B培地中で増殖させた。PB26ビタミンは50 mg/mLビタミンB12、100 μg/mLチアミン、および100 μg/mLパントテン酸Caからなった。PB26金属はpH 4.5に調整され、3 g/L FeSO4・7H2O、1 g/L MnCl2・4H2O、800 mg/mL ZnSO4・7H2O、20 mg/mL CoCl2・6H2O、10 mg/mL Na2MoO4・2H2O、600 mg/mL CuSO4・5H2O、および800 mg/mL NiSO4・6H2Oからなった。PB26ストック溶液を別々にろ過滅菌し、加圧滅菌後に培養液に添加した。グルコース、KH2PO4、およびCaCl2・2H2Oはそれぞれ、塩沈殿および糖質のカラメル化反応を防ぐため、混合する前に培養液の成分の残りとは別に加圧滅菌した。全ての培地成分はSigma Chemical(St. Louis, MO)から購入した。シゾキトリウム属の培養物を対数期まで増殖させ、Biolistic(商標)パーティクルボンバーダー(BioRad, Hercules, CA)を用いて形質転換した。Biolistic(商標)形質転換手順は過去に記載されているのと本質的に同じものであった(Apt et al., J. Cell. Sci. 115(Pt 21):4061-9(1996)および米国特許第7,001,772号を参照のこと)。一次形質転換体を、27℃で2〜6日のインキュベーションの後に20 g/L寒天(VWR, West Chester, PA)、10 μg/mLスルホメツロンメチル(SMM)(Chem Service, Westchester, PA)を含有する固形M2B培地上で選択した。
シゾキトリウム属形質転換体を培地50 ml中で増殖させた。培養物25 mlを50 mlのコニカルバイアルの中へ無菌的にピペッティングし、3000×gで4分間遠心分離してペレットを形成させた。上清を除去し、ペレットを使用まで-80℃で貯蔵した。ペレットを50 mlのコニカルバイアル中の、20 mM Tris pH 8、10 mM EDTA、50 mM NaCl、0.5% SDSおよび100 μg/mlのプロテイナーゼKからなる溶液およそ4〜5容量に再懸濁した。1時間穏やかに揺らしながらペレットを50℃でインキュベートした。溶解したら、100 μg/mlのRNase Aを添加し、溶液を37℃で10分間揺り動かした。次に、2容量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールを添加し、溶液を1時間室温で揺り動かし、その後、15分間8000×gで遠心分離した。上清をきれいな試験管の中に移し入れた。再度、2容量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールを添加し、溶液を1時間室温で揺り動かし、その後、15分間8000×gで遠心分離し、上清をきれいな試験管の中に移し入れた。得られた上清に等量のクロロホルムを添加し、溶液を30分間室温で揺り動かした。溶液を15分間8000×gで遠心分離し、上清をきれいな試験管の中に移し入れた。得られた上清に等量のクロロホルムを添加し、溶液を30分間室温で揺り動かした。溶液を15分間8000×gで遠心分離し、上清をきれいな試験管の中に移し入れた。0.3容量の3 M NaOAcおよび2容量の100% EtOHを上清に添加し、これを数分間穏やかに揺り動かした。DNAを無菌のガラス棒で巻き取り、1〜2分間70% EtOHの中に浸した。DNAを1.7 mlの微量遠心管の中に移し入れ、10分間風乾させた。最大で0.5 mlまでの予洗されたEBをDNAに添加し、これを終夜4℃に置いた。
遺伝子導入シゾキトリウム属CL0143-9(「E」)由来の組み換えHAタンパク質の発現を、標準的な免疫ブロッティング手順にしたがって、免疫ブロット分析により検証した。無細胞上清(CFS)由来のタンパク質を、他に指定のない限り、MOPS SDS泳動用緩衝液を用いた還元条件の下、NuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)12%ビス-トリスゲル(Invitrogen, Carlsbad, CA)上にてドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分離した。タンパク質を次に、クマシーブルー(SimplyBlue Safe Stain, Invitrogen, Carlsbad, CA)で染色するか、またはポリフッ化ビニリデン膜上に転写し、ウサギ由来の抗インフルエンザA/プエルトリコ/8/34(H1N1)ウイルス抗血清(1000分の1希釈、Dr. Albert D.M.E. Osterhausからの寄贈; Fouchier R.A.M. et al., J. Virol. 79:2814-2822(2005))と、その後、アルカリホスファターゼと結合している抗ウサギIgG(Fc)二次抗体(2000分の1希釈、#S3731、Promega Corporation. Madison, WI)でHAタンパク質の存在を探索した。この膜を次に、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸/ニトロブルーテトラゾリウム溶液(BCIP/NBT)で製造元の使用説明書(KPL, Gaithersburg, MD)にしたがって処理した。さまざまなpH(5.5、6.0、6.5および7.0)ならびにさまざまな温度(25℃、27℃、29℃)で増殖させた遺伝子導入シゾキトリウム属CL0143-9(「E」)に対する抗H1N1免疫ブロットを図4Aに示す。陰性対照(「C」)はシゾキトリウム種ATCC 20888の野生型株であった。組み換えHAタンパク質はpH 6.5にて無細胞上清中で検出され(図4A)、検出された血球凝集活性はpH 6.5, 27℃で最も高かった(図4A)。pH 6.5, 27℃で増殖させたCL0143-9(「E」)に対するクマシーブルー染色ゲル(「クマシー」)および対応する抗H1N1免疫ブロット(「IB: 抗-H1N1」)を、非還元条件および還元条件の下で、図4Bに示す。陰性対照(「C」)は、シゾキトリウム種ATCC 20888の野生型株であった。
シゾキトリウム属において産生されたHAタンパク質の活性を血球凝集活性のアッセイにより評価した。機能的HAタンパク質は、標準的な血球凝集活性のアッセイによって容易に検出される血球凝集活性を示す。手短に言えば、低速上清のPBS 2倍希釈液50 μLを96ウェルマイクロタイタープレート中で調製した。PBS, pH 7.4中およそ1%のニワトリ赤血球溶液(Fitzgerald Industries, Acton, MA)の等量を次に、各ウェルに添加し、その後、30分間室温でのインキュベーションを行った。凝集度を次いで、視覚的に分析した。血球凝集活性単位(HAU)は、ウェル中で可視的な血球凝集を引き起こす最も高い希釈度と定義される。
無細胞上清の100,000×gの遠心分離から得られた不溶性画分(「UP」)をスクロース密度勾配に対してさらに分画し、血球凝集活性のアッセイ(図6B)によって示されるように、HAタンパク質を含有する画分を、上記のように、SDS-PAGEによって分離し、クマシーブルーで染色するかまたはPVDFに転写し、ウサギ由来の抗H1N1抗血清で免疫ブロットした(図6A)。免疫ブロットにおいて交差反応に対応するバンド(HA1およびHA2)をクマシーブルー染色ゲルから切り出し、ペプチド配列分析を行った。手短に言えば、関心対象のバンドを洗浄し/50%エタノール、5%酢酸中で脱染した。ゲル片を次いで、アセトニトリル中で脱水し、SpeedVac(登録商標)(Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA)中で乾燥させ、50 mM重炭酸アンモニウム中10 ng/μLのトリプシン5 μLを添加して室温で終夜インキュベートすることにより、トリプシンで消化した。形成されたペプチドを、ポリアクリルアミドから、5%ギ酸を含む50%アセトニトリル30 μLの2アリコット中に抽出した。これらの抽出物を混ぜ合わせ、SpeedVac(登録商標)中で10 μL未満まで蒸発させ、次に1%酢酸中に再懸濁してLC-MS分析用におよそ30 μLの終容量とした。LC-MSシステムは、FinniganTM LTQTM直線イオントラップ質量分析計(Linear Ion Trap Mass Spectrometer)(Thermo Electron Corporation, Waltham, MA)であった。HPLCカラムは、自己充填性の9 cm×75 μm Phenomenex JupiterTM C18逆相キャピラリークロマトグラフィーカラム(Phenomenex, Torrance, CA)であった。次いで、抽出物のμL容量を注入し、ペプチドを、0.25 μL/分の流速でアセトニトリル/0.1%ギ酸の勾配によってカラムから溶出し、オンラインの質量分析計の供給源へ導入した。マイクロエレクトロスプレイイオン源を2.5 kVで操作した。質量分析計によってLC実験の全過程にわたり一連のm/z比が細分化される選択反応(SRM)実験を用いて、消化物を分析した。次に関心対象のペプチドの断片化パターンを用いて、クロマトグラムを生成した。各ペプチドに対するピーク面積を決定し、内部標準物質に対して規準化した。この分析において用いた内部標準物質は、試験されているサンプル間で不変の存在量を有するタンパク質であった。2つのシステム間の最終の比較は、各ペプチドに対して規準化されたピーク比を比較することによって決定された。衝突誘起解離スペクトルを次に、NCBIデータベースに対して探索した。HAタンパク質は、タンパク質配列の42%を網羅する計27ペプチドによって特定された。配列決定された特異的ペプチドは図7に太字体で強調されている。より具体的には、HA1は計17ペプチドにより特定され、HA2は計9ペプチドにより特定された。これは、397位の前で切断されているHA N末端ポリペプチドと一致する。HA1およびHA2に対して特定されたペプチドの配置は、HAタンパク質の全アミノ酸配列内に示されている。HA内の推定切断部位はアミノ酸番号343と344の間に位置している(R^Gとして示されている)。アミノ酸番号402の位置で始まるイタリック体のペプチド配列はHA2ポリペプチドと関連しているが、HA1において特定されたペプチドで見られ、これはおそらく、HA1に対して切り出されたバンドにおけるHA2ペプチドの微量の持込みに起因する。例えば、Wright et al., BMC Genomics 10:61(2009)の図3を参照されたい。
HAタンパク質上のグリカンの存在を酵素処理によって評価した。遺伝子導入シゾキトリウム属「CL0143-9」の60%スクロース画分をEndoHまたはPNGase Fにより製造元の使用説明書(New England Biolabs, Ipswich, MA)にしたがって消化した。次いで、MOPS SDS泳動用緩衝液を用いたNuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)12%ビス-トリスゲル(Invitrogen, Carlsbad, CA)上でのSDS-PAGEによりタンパク質を分離し、その後、クマシーブルー(「クマシー」)での染色を行うかまたは抗H1N1抗血清(「IB: 抗-H1N1」)での免疫ブロッティングを行った場合に予想される移動度の変化によって、グリカンの除去を特定した(図8)。酵素処理に対する陰性対照は、酵素なしでインキュベートされた(「NT」= 無処理)遺伝子導入シゾキトリウム属「CL0143-9」であった。少なくとも5つの異なる種を免疫ブロット上でHA1の位置に特定することができ、2つの異なる種を免疫ブロット上でHA2の位置に特定することができる。これは、文献において報告されているように、HA1上の複数のグリコシル化部位およびHA2上の単一のグリコシル化部位と一致している。
シゾキトリウム属培養上清由来のタンパク質の特徴付け
シゾキトリウム種ATCC 20888を上記のように典型的な発酵条件の下で増殖させた。培養上清のサンプルを培養20時間から52時間まで4時間の間隔で収集し、68時間の時点で最後の収集を行った。
培養上清材料の陰性染色および電子顕微鏡検査
シゾキトリウム種ATCC 20888(対照)および遺伝子導入シゾキトリウム属CL0143-9(実験)を上記のように典型的なフラスコ条件の下で増殖させた。培養物を50 mLのコニカル試験管に移し入れ、15分間3000×gまたは4500×gで遠心分離した。この無細胞上清を1時間100,000×gでさらに超遠心分離し、得られたペレットをPBS, pH 7.4に再懸濁した。この懸濁液を不連続の15%〜60%スクロース勾配にて遠心分離し(120,000×g、18時間、4℃)、60%の画分を陰性染色および電子顕微鏡法による検査に用いた。
キシロース輸送体、キシロースイソメラーゼ、およびキシルロースキナーゼ発現ベクターの構築
ベクターpAB0018(ATCCアクセッション番号PTA-9616)をHindIIIで消化し、マングビーンヌクレアーゼで処理し、精製し、その後、KpnIでさらに消化して、さまざまなサイズの4つの断片を作出した。2552 bpの断片を、寒天ゲル中での標準的な電気泳動技法によって単離し、市販のDNA精製キットを用いて精製した。次いでPmeIおよびKpnによるpAB0018の2回目の消化を行った。6732 bpの断片を単離し、この消化物から精製し、2552 bpの断片に核酸連結した。次に核酸連結産物を用いて、製造元のプロトコルによりコンピテントなDH5-α大腸菌細胞(Invitrogen)の市販株を形質転換した。アンピシリン耐性クローン由来のプラスミドを繁殖させ、精製し、その後、制限消化またはPCRによりスクリーニングして、予想されるプラスミド構造が核酸連結により作出されたことを確認した。検証されたプラスミドの1つをpCL0120と名付けた。図15を参照されたい。
シゾキトリウム属において産生されたキシロース輸送体、キシロースイソメラーゼ、およびキシルロースキナーゼタンパク質の発現および特徴付け
シゾキトリウム種ATCC 20888を、ベクターpCL0130、pCL0131、pCL0132またはpCL0136個々での形質転換用の宿主細胞として用いた。
細胞をM50-20培地(米国特許出願公開第2008/0022422号を参照のこと)50 mL中にて、振盪機上200 rpmで30℃にて2日間増殖させた。細胞をM2B培地(次の段落を参照のこと)の中に100分の1で希釈し、終夜(16〜24時間)増殖させ、対数増殖中期の増殖(OD600 1.5〜2.5)に達するように試みた。細胞を50 mlのコニカル試験管の中で3000×gにて5分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を1 Mマンニトール、pH 5.5の適当な容量の中に再懸濁し、2 OD600単位の終濃度に到達させた。細胞5 mLを25 mLの振盪フラスコ中に分注し、10 mM CaCl2(1.0 Mストック液、ろ過滅菌済み)および0.25 mg/mLのプロテアーゼXIV(10 mg/mLのストック液、ろ過滅菌済み; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)で改変した。フラスコを振盪機上100 rpmおよび30℃で4時間インキュベートした。細胞を顕微鏡下でモニタリングし、プロトプラスト化の程度を、単細胞を所望として、判定した。細胞を丸底試験管(すなわち、14 mLのFalcon(商標)試験管、BD Biosciences, San Jose, CA)の中で2500×gにて5分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を氷冷10%グリセロール5 mLで穏やかに再懸濁した。細胞を丸底試験管の中で2500×gにて5分間、再び遠心分離した。上清を除去し、細胞を大孔径ピペットチップにより、氷冷10%グリセロール500 μLで穏やかに再懸濁した。細胞90 μLを、予冷したエレクトロキュベット(Gene Pulser(登録商標)キュベット - 0.2 cmのギャップ, Bio-Rad, Hercules, CA)の中に分注した。DNA 1 μg〜5 μg(容量10 μL以下で)をキュベットに添加し、ピペットチップで穏やかに混合し、5分間氷上に置いた。細胞を200オーム(抵抗)、25 μF(電気容量)、および500 Vでエレクトロポレーションした。M50-20培地0.5 mLをキュベットに速やかに添加した。次いで細胞を25 mLの振盪フラスコ中のM50-20培地4.5 mLに移し、振盪機上100 rpmおよび30℃で2〜3時間インキュベートした。細胞を丸底試験管の中で2500×gにて5分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットをM50-20培地0.5 mLに再懸濁した。細胞を適切な選択により(必要なら)適切な数(2〜5枚)のM2Bプレート上にプレーティングし、30℃でインキュベートした。
pCL0140およびpCL0149発現ベクターの構築
ベクターpCL0120をBamHIおよびNdeIで消化し、長さが837塩基対(bp)および8454 bpの2つの断片を生み出した。8454 bpの断片を、寒天ゲル中での標準的な電気泳動技法によって分画し、市販のDNA精製キットを用いて精製し、BamHIおよびNdeIで同様に予め消化されていた合成配列(SEQ ID NO: 100またはSEQ ID NO: 101; 図26を参照のこと)に核酸連結した。SEQ ID NO: 100(図26)はA型インフルエンザウイルス(A/プエルトリコ/8/34/マウントサイナイ(H1N1))のNAタンパク質をコードする。タンパク質配列はGenBankアクセッション番号NP_040981のそれと適合する。SEQ ID NO: 100の特異的核酸配列を、シゾキトリウム属での発現のためにDNA 2.0によって、図16に示されるシゾキトリウム属コドン使用頻度表によってガイドされるようにコドン最適化し、合成した。SEQ ID NO: 101(図26)は、SEQ ID NO: 100と同じNAタンパク質をコードするが、コード領域のC末端にV5タグ配列およびポリヒスチジン配列を含む。
シゾキトリウム属において産生されたNAタンパク質の発現および特徴付け
実施例2に記載のように、Biolistic(商標)パーティクルボンバーダー(BioRad, Hercules, CA)を用いたベクターpCL0140およびpCL0149による形質転換用の宿主細胞としてシゾキトリウム種ATCC 20888を用いた。適切な抗生物質を含有する固体培地上での増殖について形質転換体を選択した。前述(実施例2)のように、一次形質転換体由来のgDNAを抽出し、精製し、導入遺伝子の存在を調べるためにPCRの鋳型として用いた。
遺伝子導入シゾキトリウム属株CL0140-26をインフルエンザNAタンパク質の部分的精製に用いて、その発現および分泌の成功をペプチド配列分析により確認した。精製手順はTarigan et al., JITV 14(1):75-82(2008)から適合し、続いて、上記のように、NA活性を測定することによって行った(図29A)。手短に言えば、遺伝子導入株CL0140-26の無細胞上清を4℃にて1時間100,000×gでさらに遠心分離した。得られた上清を、Centriprep(商標)重力式濃縮機(Millipore, Billerica, MA)を用いて100倍濃縮し(図29A中の画分「cCFS」)、0.1% Triton X-100を含有する0.1 M重炭酸ナトリウム緩衝液(pH 9.1)で元の容量に希釈し戻した(図29A中の画分「D」)。この希釈サンプルをアフィニティークロマトグラフィーによる精製に用いた。0.1% Triton X-100を含有する0.1 M重炭酸ナトリウム緩衝液(pH 9.1)6カラム容量(CV)と、その後0.1% Triton X-100を含有する0.05 M酢酸ナトリウム緩衝液pH 5.5 5 CVとで洗浄することにより活性化された、PD-10カラム(BioRad, Hercules, CA)の中に、N-(p-アミノフェニル)オキサミド酸アガロース(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を充填した。希釈サンプル(画分「D」)をカラムにロードした; 0.1% Triton X-100を含有する0.15 M酢酸ナトリウム緩衝液10 CVでカラムを洗浄することにより、未結合の材料を除去した(図29A中の画分「W」)。0.1% Triton X-100および2 mM CaCl2を含有する0.1 M重炭酸ナトリウム緩衝液5 CVで、カラムから結合したNAを溶出させた(図29A中の画分「E」)。NAに富む画分Eの溶液を、10 kDaの分子カットオフのスピン濃縮器を用いて元の容量の約10%にまで濃縮し、画分cEをもたらした。
遺伝子導入シゾキトリウム属CL0149(クローン10、11、12)由来の組み換えNAタンパク質の発現を、標準的な免疫ブロッティング手順にしたがって、免疫ブロット分析により試験した(図31B)。無細胞上清(CFS)由来のタンパク質を、MOPS SDS泳動用緩衝液を用いた還元条件の下、NuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)12%ビス-トリスゲル(Invitrogen, Carlsbad, CA)上にて、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により分離した。これらのタンパク質を次に、クマシーブルー(SimplyBlue Safe Stain, Invitrogen, Carlsbad, CA)で染色するかまたはポリフッ化ビニリデン膜上に転写し、抗V5-AP結合マウスモノクローナル抗体(1000分の1希釈, #962-25, Invitrogen, Carlsbad, CA)で、NAタンパク質の存在を探索した。次に製造元の使用説明書(KPL, Gaithersburg, MD)にしたがって、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸/ニトロブルーテトラゾリウム溶液(BCIP/NBT)で、この膜を処理した。クローン11の無細胞上清において、組み換えNAタンパク質が検出された(図31B)。陰性対照(「-」)は、シゾキトリウム種ATCC 20888の野生型株であった。陽性対照(「+」)は、Positope(商標)抗体対照タンパク質(#R900-50, Invitrogen, Carlsbad, CA)であった。対応するノイラミニダーゼ活性を図31Aに提示する。
シゾキトリウム属におけるインフルエンザHAおよびNAの同時発現
実施例2に記載のように、Biolistic(商標)パーティクルボンバーダー(BioRad, Hercules, CA)を用いたベクターpCL0140(図25A)およびpCL0143(図2)による同時形質転換用の宿主細胞として、シゾキトリウム種ATCC 20888を用いた。
シゾキトリウム属において産生されたパラインフルエンザFタンパク質を含む細胞外体の発現および特徴付け
ヒトパラインフルエンザ3ウイルス株NIH 47885のFタンパク質(GenBankアクセッション番号P06828)をコードする配列を含むベクターによる形質転換用の宿主細胞として、シゾキトリウム種ATCC 20888を用いる。Fタンパク質の代表的な配列はSEQ ID NO: 102として提供されている。一部の細胞は、Fタンパク質に付随する天然シグナルペプチド配列をコードする配列を含んだベクターで形質転換する。他の細胞は、Fタンパク質が異種シグナルペプチド配列とともに発現されるように、Fタンパク質をコードする配列に融合されている異なるシグナルペプチド配列(例えば、シゾキトリウム属シグナルアンカー配列のような)をコードする配列を含んだベクターで形質転換する。他の細胞は、Fタンパク質が異種膜ドメインとともに発現されるように、Fタンパク質をコードする配列に融合されている異なる膜ドメイン(例えば、HA膜ドメインのような)をコードする配列を含んだベクターで形質転換する。Fタンパク質はC末端の近くに1回膜貫通ドメインを含む。Fタンパク質は、フリン切断部位(アミノ酸番号109)で二つのペプチドに分けることができる。F2と名付けられたタンパク質の最初の部分は、完全なFタンパク質のN末端部分を含む。F2領域が、異種シグナルペプチドをコードする配列に個別に融合されてもよい。Fタンパク質のC末端部分を含むウイルスFタンパク質の残部は、F1と名付けられている。F1領域が、異種シグナルペプチドをコードする配列に個別に融合されてもよい。ウイルスFタンパク質のF1およびF2部分を含むベクターが、個別にまたは組み合わせで発現されてもよい。完全なFタンパク質を発現するベクターが、フリン切断部位でタンパク質を切断するフリン酵素と同時発現されてもよい。あるいは、Fタンパク質のフリン切断部位をコードする配列が、異なるプロテアーゼにより認識かつ切断される別のプロテアーゼ切断部位をコードする配列と置き換えられてもよい。別のプロテアーゼ切断部位を含むFタンパク質が、この別のプロテアーゼ切断部位を認識かつ切断する対応のプロテアーゼと同時発現されてもよい。
シゾキトリウム属において産生された水疱性口炎(G Vesicular Stomatitus)ウイルスGタンパク質を含む細胞外体の発現および特徴付け
シゾキトリウム種ATCC 20888を、水疱性口炎ウイルスG(VSV-G)タンパク質をコードする配列を含むベクターでの形質転換用の宿主細胞として用いる。VSV-Gタンパク質の代表的な配列は、SEQ ID NO: 103(GenBankアクセッション番号M35214由来)として提供されている。一部の細胞は、VSV-Gタンパク質に付随する天然シグナルペプチド配列をコードする配列を含んだベクターで形質転換する。他の細胞は、VSV-Gタンパク質が異種シグナルペプチド配列とともに発現されるように、VSV-Gタンパク質をコードする配列に融合されている異なるシグナルペプチド配列(例えば、シゾキトリウム属シグナルアンカー配列のような)をコードする配列を含んだベクターで形質転換する。他の細胞は、VSV-Gタンパク質が異種膜ドメインとともに発現されるように、VSV-Gタンパク質をコードする配列に融合されている異なる膜ドメイン(例えば、HA膜ドメインのような)をコードする配列を含んだベクターで形質転換する。形質転換を行い、本明細書において記載した方法のいずれかにしたがって、冷凍保存ストックを増殖させ繁殖させる。シゾキトリウム属の培養物を50 mLのコニカル試験管に移し入れ、15分間3000×gまたは4500×gで遠心分離して低速上清を得る。低速上清を1時間100,000×gでさらに超遠心分離する。図3を参照されたい。得られた、VSV-Gタンパク質を含有する不溶性画分のペレットをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁し、実施例2に記載のようにペプチド配列分析およびグリコシル化分析に用いる。
シゾキトリウム属において産生されたeGFP融合タンパク質を含む細胞外体の発現および特徴付け
eGFPをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターによるシゾキトリウム種ATCC 20888の形質転換および形質転換されたシゾキトリウム属におけるeGFPの発現が記載されてきた。参照により全体が本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2010/0233760号およびWO 2010/107709を参照されたい。
ヤブレツボカビ科生物の培養物において産生された異種ポリペプチドの検出
適切な発酵条件の下で発酵槽中にて、少なくとも1種の異種ポリペプチドを含むヤブレツボカビ科生物の宿主細胞の培養物を調製する。発酵槽は、例えば、炭素(グルコース)、窒素、リン、塩、微量金属、およびビタミンを含有する培地でバッチ処理する。発酵槽に典型的な種培養物を接種し、その後、70〜120時間培養し、炭素(例えば、グルコース)原料を供給する。炭素原料は発酵の間中、供給され消費される。72〜120時間後、発酵槽を回収し、ブロスを遠心分離して上清からバイオマスを分離する。
微細藻類培養物からのウイルス様粒子の調製
1つまたは複数のウイルスエンベロープポリペプチドが、上記の条件下で微細藻類宿主細胞において異種発現され、そのためウイルスポリペプチドは培養条件の下で産生される微細藻類細胞外体に局在化される。適切な培養条件および調節制御要素を用いて過剰発現されると、微細藻類細胞外体におけるウイルスエンベロープポリペプチドは、感染性ウイルスに形態学的に類似している粒子へ自発的に自己組織化する。
Claims (22)
- 以下の段階を含む、膜タンパク質を産生する方法;
膜ドメインを含む異種膜タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む異種核酸分子を含む組み換え微細藻類宿主細胞を含む培養物を提供する段階、
異種膜タンパク質を含む微細藻類細胞外体を産生するのに十分な条件下で該組み換え微細藻類宿主細胞を培養する段階、および
微細藻類宿主細胞から該微細藻類細胞外体を分離する段階;
ここで、該細胞外体は、宿主細胞の原形質膜とつながっていない、かつ、
さらにここで、該細胞外体は、小胞、ミセル、膜断片、膜凝集体、またはそれらの混合物である。 - 該細胞外体を実質的に純粋な形態で単離する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 単離された該細胞外体を水性液体担体に再懸濁する段階をさらに含む、請求項2記載の方法。
- 微細藻類宿主細胞がヤブレツボカビ細胞であり、さらにここで、産生される異種膜タンパク質がヤブレツボカビ細胞における発現に特徴的なグリコシル化パターンを有する、請求項1記載の方法。
- 膜タンパク質がウイルスエンベロープタンパク質である、請求項1記載の方法。
- ウイルスエンベロープタンパク質が、血球凝集素(HA)タンパク質、ノイラミニダーゼ(NA)タンパク質、融合(F)タンパク質、糖タンパク質(G)タンパク質、エンベロープ(Env)タンパク質、120 kDaの糖タンパク質(gp120)、41 kDaの糖タンパク質(gp41)、および、これらの組み合わせから選択される、請求項5記載の方法。
- ウイルスエンベロープタンパク質が、HAタンパク質、NAタンパク質、およびHNタンパク質から選択される、請求項5記載の方法。
- ウイルスエンベロープタンパク質がインフルエンザHAタンパク質である、請求項5記載の方法。
- 膜ドメインを含む異種膜タンパク質を含む単離された微細藻類細胞外体;
ここで、該細胞外体は、宿主細胞の原形質膜とつながっていない、かつ、
さらにここで、該細胞外体は、小胞、ミセル、膜断片、膜凝集体、またはそれらの混合物である。 - 異種膜タンパク質が少なくとも一つの膜貫通ドメインを含む、請求項9記載の微細藻類細胞外体。
- 微細藻類細胞外体がヤブレツボカビ細胞外体であり、さらにここで、異種膜タンパク質がヤブレツボカビグリコシル化パターンを有する、請求項9記載の微細藻類細胞外体。
- 膜タンパク質がウイルスエンベロープタンパク質である、請求項9記載の微細藻類細胞外体。
- ウイルスエンベロープタンパク質が、血球凝集素(HA)タンパク質、ノイラミニダーゼ(NA)タンパク質、融合(F)タンパク質、糖タンパク質(G)タンパク質、エンベロープ(Env)タンパク質、120 kDaの糖タンパク質(gp120)、41 kDaの糖タンパク質(gp41)、および、これらの組み合わせから選択される、請求項12記載の微細藻類細胞外体。
- ウイルスエンベロープタンパク質が、HAタンパク質、NAタンパク質、およびHNタンパク質から選択される、請求項12記載の微細藻類細胞外体。
- ウイルスエンベロープタンパク質がインフルエンザHAタンパク質である、請求項12記載の微細藻類細胞外体。
- 請求項9〜15のいずれか一項記載の微細藻類細胞外体を含む組成物であって、微細藻類細胞を含まない、組成物。
- 少なくとも一つの薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項16記載の組成物。
- 請求項9記載の微細藻類細胞外体を含むワクチン組成物であって、微細藻類細胞を含まない、ワクチン組成物。
- 膜タンパク質がウイルスエンベロープタンパク質である、請求項18記載のワクチン組成物。
- ウイルスエンベロープタンパク質が、血球凝集素(HA)タンパク質、ノイラミニダーゼ(NA)タンパク質、融合(F)タンパク質、糖タンパク質(G)タンパク質、エンベロープ(Env)タンパク質、120 kDaの糖タンパク質(gp120)、41 kDaの糖タンパク質(gp41)、および、これらの組み合わせから選択される、請求項19記載のワクチン組成物。
- ウイルスエンベロープタンパク質が、HAタンパク質、NAタンパク質、およびHNタンパク質から選択される、請求項19記載のワクチン組成物。
- ウイルスエンベロープタンパク質がインフルエンザHAタンパク質である、請求項19記載のワクチン組成物。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020004144A1 (ja) | 2018-06-27 | 2020-01-02 | 住友電気工業株式会社 | フレキシブルプリント配線板の原形体、フレキシブルプリント配線板の製造方法、集光型太陽光発電モジュール、及び、発光モジュール |
Families Citing this family (37)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI350854B (en) | 2001-04-16 | 2011-10-21 | Martek Biosciences Corp | Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms |
AU2010225930B2 (en) | 2009-03-16 | 2017-01-12 | Dsm Ip Assets B.V. | Protein production in microorganisms of the phylum Labyrinthulomycota |
AU2010339544B2 (en) * | 2009-12-28 | 2015-11-12 | Merial Limited | Production of hemagglutinin-neuraminidase protein in microalgae |
CA2785653C (en) * | 2009-12-28 | 2018-05-01 | Merial Limited | Recombinant ndv antigen and uses thereof |
EP2444495A1 (en) * | 2010-10-20 | 2012-04-25 | Algenics | Secretion of recombinant polypeptides in the extracellular medium of diatoms |
CN103649313B (zh) * | 2011-03-07 | 2017-10-24 | Dsm营养产品股份公司 | 工程化破囊壶菌属微生物 |
CN103748226A (zh) | 2011-08-24 | 2014-04-23 | 诺维信股份有限公司 | 获得丝状真菌宿主细胞的阳性转化体的方法 |
US9982249B2 (en) | 2012-07-24 | 2018-05-29 | Bp Corporation North America Inc. | Xylose isomerases and their uses |
US20150232900A1 (en) * | 2012-09-18 | 2015-08-20 | Myko Tech Private Limited | Paper folding method and device for manufacturing filter cartridges |
BR112017005388B1 (pt) | 2014-10-02 | 2022-09-13 | Evonik Operations Gmbh | Alimento para animais contendo biomassa de aurantiochytrium |
BR112017006833B1 (pt) | 2014-10-02 | 2022-09-13 | Evonik Operations Gmbh | Alimento para animais contendo ácido graxo poli-insaturado e processo para produzir o mesmo |
WO2016050552A1 (de) | 2014-10-02 | 2016-04-07 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur herstellung einer pufas enthaltenden biomasse mit hoher zellstabilität |
ES2873094T3 (es) * | 2014-10-02 | 2021-11-03 | Evonik Operations Gmbh | Procedimiento para la producción de un pienso que contiene PUFAs mediante extrusión de una biomasa que contiene PUFAs de tipo Labyrinthulomycetes |
EP3265567B1 (en) | 2015-03-02 | 2020-07-29 | Conagen Inc. | Regulatory elements from labyrinthulomycetes microorganisms |
JP6977231B2 (ja) * | 2015-07-13 | 2021-12-08 | マラ リニューアブルズ コーポレーション | C5有機炭素の微生物による代謝の増強 |
FR3038913B1 (fr) * | 2015-07-17 | 2020-05-01 | Fermentalg | Biomasse de thraustochytrides, procede de culture et utilisations |
US20190216857A1 (en) * | 2016-09-09 | 2019-07-18 | Cornell University | Delivery of nucleic acids, proteins and small molecules in vitreous vesicular bodies |
US10633454B2 (en) | 2016-11-01 | 2020-04-28 | Conagen Inc. | Expression of modified glycoproteins and glycopeptides |
US10954280B2 (en) | 2016-11-27 | 2021-03-23 | Triton Algae Innovations, Inc. | Method of purification of recombinant osteopontin from micro algae |
EP3762485A4 (en) * | 2018-03-05 | 2021-12-08 | Conagen Inc. | ORGANISMS AND PROCESSES FOR THE PRODUCTION OF LOW SULPHATION GLYCOMOLECULES |
JP2022501438A (ja) | 2018-09-21 | 2022-01-06 | アウフバウ・メディカル・イノベイションズ・リミテッドAufbau Medical Innovations Limited | 緑内障用の組成物および方法 |
CN109161576B (zh) * | 2018-09-26 | 2020-08-07 | 武汉中科光谷绿色生物技术有限公司 | 促进枯草芽孢杆菌发酵生产n-乙酰神经氨酸的方法 |
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IT201900024580A1 (it) * | 2019-12-18 | 2021-06-18 | Consiglio Nazionale Ricerche | Vescicole extracellulari da microalghe |
CN111363045B (zh) * | 2020-02-18 | 2021-12-17 | 厦门大学 | 一种流感、hiv嵌合蛋白及嵌合病毒疫苗的制备方法 |
CN111621471B (zh) * | 2020-06-12 | 2022-03-11 | 成都世联康健生物科技有限公司 | 一种软组织胞外囊泡的提取方法及应用 |
JP2022028997A (ja) * | 2020-07-31 | 2022-02-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
CN112452506A (zh) * | 2020-11-06 | 2021-03-09 | 五原县沃丰生物科技有限责任公司 | 一种培养基粉末的生产方法 |
US11175293B1 (en) | 2021-01-04 | 2021-11-16 | University Of Utah Research Foundation | Rapid assay for detection of SARS-CoV-2 antibodies |
WO2022269557A1 (en) * | 2021-06-24 | 2022-12-29 | Reliance Industries Limited | Recombinant algae and production of spider silk protein from the recombinant algae |
CN113698451B (zh) * | 2021-08-02 | 2023-04-11 | 广东海洋大学 | 一种微藻多肽及其制备方法和应用 |
CA3237139A1 (en) | 2021-11-05 | 2023-05-11 | Sanofi | Hybrid multivalent influenza vaccines comprising hemagglutinin and neuraminidase and methods of using the same |
CA3237134A1 (en) | 2021-11-05 | 2023-05-11 | Timothy ALEFANTIS | Multivalent influenza vaccines comprising recombinant hemagglutinin and neuraminidase and methods of using the same |
CA3239417A1 (en) | 2021-11-30 | 2023-06-08 | Yvonne CHAN | Human metapneumovirus vaccines |
WO2023232976A1 (en) * | 2022-06-03 | 2023-12-07 | Ags Therapeutics Sas | Extracellular vesicles from genetically-modified microalgae containing endogenously-loaded cargo, their preparation, and uses |
WO2023242605A1 (en) | 2022-06-14 | 2023-12-21 | Támogatott Kutatócsoportok Irodája | Extracellular vesicles for use in therapy |
CN115992052A (zh) * | 2022-11-18 | 2023-04-21 | 暨南大学 | 一种微藻类外泌体、其制备方法和应用 |
Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5824309A (en) * | 1995-12-05 | 1998-10-20 | University Of Massachusetts | Recombinant gas vesicles and uses thereof |
JP2005503125A (ja) * | 2001-04-16 | 2005-02-03 | マーテック・バイオサイエンスィズ・コーポレーション | トラウストチトリアレス微生物の形質転換についての産物および方法 |
WO2006013572A2 (en) * | 2004-08-05 | 2006-02-09 | Ben Gurion University Of The Negev Research And Development Authority | Red microalgae expressing exogenous polypeptides and methods of generating and utilizing same |
JP2006304686A (ja) * | 2005-04-28 | 2006-11-09 | Fuji Photo Film Co Ltd | ラビリンチュラ類への遺伝子導入法 |
JP2006304685A (ja) * | 2005-04-28 | 2006-11-09 | Fuji Photo Film Co Ltd | ラビリンチュラ類を形質転換可能なベクター |
US20070270494A1 (en) * | 2006-03-15 | 2007-11-22 | Martek Biosciences Corporation | Polyunsaturated fatty acid production in heterologous organisms using pufa polyketide synthase systems |
JP2007534295A (ja) * | 2003-06-05 | 2007-11-29 | ワイス・ホールディングズ・コーポレイション | ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコンベクターおよびパラミクソウイルスタンパク質抗原を含む免疫原性組成物 |
US20080022422A1 (en) * | 1999-01-14 | 2008-01-24 | Martek Biosciences Corporation | Chimeric pufa polyketide synthase systems and uses thereof |
WO2009101160A1 (en) * | 2008-02-12 | 2009-08-20 | Institut Francais De Recherche Pour L'exploitation De La Mer (Ifremer) | Production of glycosylated polypeptides in microalgae |
JP2013515502A (ja) * | 2009-12-28 | 2013-05-09 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー.ブイ. | 微細藻類におけるヘマグルチニン−ノイラミニダーゼタンパク質の産生方法 |
Family Cites Families (35)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4659669A (en) * | 1981-03-02 | 1987-04-21 | Regents Of The Univ. Of California | Microbial expression of human influenza hemagglutinin proteins |
US4537769A (en) * | 1982-04-06 | 1985-08-27 | American Cyanamid Company | Stabilization of influenza virus vaccine |
US4752473A (en) * | 1984-10-12 | 1988-06-21 | The Regents Of The University Of California | Expression of glycosylated human influenza hemagglutinin proteins |
US5340742A (en) * | 1988-09-07 | 1994-08-23 | Omegatech Inc. | Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids |
US5762939A (en) * | 1993-09-13 | 1998-06-09 | Mg-Pmc, Llc | Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus |
BR9506484A (pt) * | 1994-01-11 | 1997-10-07 | Vlaams Interuniv Inst Biotech | Neuraminidase recombinate seu vetor processo para sua manufatura e uso como vacina contra influenza |
KR20000075076A (ko) * | 1999-05-28 | 2000-12-15 | 최태진 | 형질전환된 미세조류를 이용하여 외래 단백질을 생산하는 방법 |
WO2002000885A2 (en) * | 2000-06-23 | 2002-01-03 | American Cyanamid Company | Assembly of wild-type and chimeric influenza virus-like particles (vlps) |
US7029872B2 (en) | 2000-06-28 | 2006-04-18 | Glycofi, Inc | Methods for producing modified glycoproteins |
US7625756B2 (en) | 2000-06-28 | 2009-12-01 | GycoFi, Inc. | Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells |
US7795002B2 (en) | 2000-06-28 | 2010-09-14 | Glycofi, Inc. | Production of galactosylated glycoproteins in lower eukaryotes |
US20060257399A1 (en) * | 2000-06-28 | 2006-11-16 | Glycofi, Inc. | Immunoglobulins comprising predominantly a Man5GIcNAc2 glycoform |
US20060029604A1 (en) | 2000-06-28 | 2006-02-09 | Gerngross Tillman U | Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAc2Man3GlcNAc2 glycoform |
AU2007249124B2 (en) * | 2001-04-16 | 2012-05-17 | Dsm Ip Assets B.V. | Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms |
AU2003219760A1 (en) * | 2002-02-14 | 2003-09-04 | Novavax, Inc. | Optimization of gene sequences of virus-like particles for expression in insect cells |
WO2003086453A1 (en) * | 2002-04-12 | 2003-10-23 | Ilaria Capua | Purified subfragment codifying for neuroaminidase, recombinant neuroaminidase and its use in zooprophylaxis |
WO2004042001A2 (en) * | 2002-05-17 | 2004-05-21 | Emory University | Virus-like particles, methods of preparation, and immonogenic compositions |
US7332299B2 (en) | 2003-02-20 | 2008-02-19 | Glycofi, Inc. | Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes |
US20070026076A1 (en) * | 2003-02-24 | 2007-02-01 | Tzyy-Choou Wu | Molecular vaccines employing nucleic acid encoding anti-apoptotic proteins |
CA2822895A1 (en) * | 2004-05-25 | 2005-12-08 | Medimmune, Llc | Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants |
CA2594040A1 (en) * | 2005-01-06 | 2006-07-13 | The Johns Hopkins University | Rna interference that blocks expression of pro-apoptotic proteins potentiates immunity induced by dna and transfected dendritic cell vaccines |
US9216212B2 (en) * | 2005-08-05 | 2015-12-22 | University Of Massachusetts | Virus-like particles as vaccines for paramyxovirus |
WO2007022425A2 (en) * | 2005-08-16 | 2007-02-22 | Hawaii Biotech, Inc. | Influenza recombinant subunit vaccine |
WO2007100584A2 (en) * | 2006-02-16 | 2007-09-07 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Antiviral agents and vaccines against influenza |
CA2638760A1 (en) * | 2006-03-07 | 2007-09-13 | Vaxinnate Corporation | Compositions that include hemagglutinin, methods of making and methods of use thereof |
US8778353B2 (en) * | 2006-05-01 | 2014-07-15 | Technovax, Inc. | Influenza virus-like particle (VLP) compositions |
CA2657955A1 (en) * | 2006-07-27 | 2008-08-07 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric virus-like particles |
WO2008024844A2 (en) * | 2006-08-22 | 2008-02-28 | The Johns Hopkins University | Anticancer combination therapies |
CA2615372A1 (en) * | 2007-07-13 | 2009-01-13 | Marc-Andre D'aoust | Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin |
EP2610345B1 (en) * | 2007-11-27 | 2015-08-19 | Medicago Inc. | Recombinant influenza virus-like particles (VLPS) produced in transgenic plants expressing hemagglutinin |
KR20090096890A (ko) * | 2008-03-10 | 2009-09-15 | 전남대학교산학협력단 | 대장균에서 조류인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다제 n1을발현하기 위한 벡터 및 방법, 이의 사용방법, 및뉴라미니다제 저해제 |
FR2928926B1 (fr) * | 2008-03-18 | 2015-08-21 | Centre Nat Rech Scient | Polynucleotides et polypeptides chimeriques permettant la secretion d'un polypeptide d'interet en association avec des exosomes et leur utilisation pour la production de compositions immunogenes |
US8202363B2 (en) * | 2008-03-19 | 2012-06-19 | Momentive Specialty Chemicals Inc. | Modifier for concrete and cement formulations and methods of preparing the same |
AU2010225930B2 (en) | 2009-03-16 | 2017-01-12 | Dsm Ip Assets B.V. | Protein production in microorganisms of the phylum Labyrinthulomycota |
CA2785653C (en) * | 2009-12-28 | 2018-05-01 | Merial Limited | Recombinant ndv antigen and uses thereof |
-
2010
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2014
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2015
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2017
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2018
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2019
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-
2020
- 2020-02-21 JP JP2020027762A patent/JP2020096635A/ja active Pending
-
2022
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-
2023
- 2023-04-26 JP JP2023072538A patent/JP2023101420A/ja active Pending
Patent Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5824309A (en) * | 1995-12-05 | 1998-10-20 | University Of Massachusetts | Recombinant gas vesicles and uses thereof |
US20080022422A1 (en) * | 1999-01-14 | 2008-01-24 | Martek Biosciences Corporation | Chimeric pufa polyketide synthase systems and uses thereof |
JP2005503125A (ja) * | 2001-04-16 | 2005-02-03 | マーテック・バイオサイエンスィズ・コーポレーション | トラウストチトリアレス微生物の形質転換についての産物および方法 |
JP2007534295A (ja) * | 2003-06-05 | 2007-11-29 | ワイス・ホールディングズ・コーポレイション | ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコンベクターおよびパラミクソウイルスタンパク質抗原を含む免疫原性組成物 |
WO2006013572A2 (en) * | 2004-08-05 | 2006-02-09 | Ben Gurion University Of The Negev Research And Development Authority | Red microalgae expressing exogenous polypeptides and methods of generating and utilizing same |
JP2006304686A (ja) * | 2005-04-28 | 2006-11-09 | Fuji Photo Film Co Ltd | ラビリンチュラ類への遺伝子導入法 |
JP2006304685A (ja) * | 2005-04-28 | 2006-11-09 | Fuji Photo Film Co Ltd | ラビリンチュラ類を形質転換可能なベクター |
US20070270494A1 (en) * | 2006-03-15 | 2007-11-22 | Martek Biosciences Corporation | Polyunsaturated fatty acid production in heterologous organisms using pufa polyketide synthase systems |
WO2009101160A1 (en) * | 2008-02-12 | 2009-08-20 | Institut Francais De Recherche Pour L'exploitation De La Mer (Ifremer) | Production of glycosylated polypeptides in microalgae |
JP2013515502A (ja) * | 2009-12-28 | 2013-05-09 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー.ブイ. | 微細藻類におけるヘマグルチニン−ノイラミニダーゼタンパク質の産生方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
BIOTECHNOLOGY LETTERS, vol. 25, JPN6019015423, 2003, pages 1087 - 1092, ISSN: 0004026035 * |
MOLECULAR DIAGNOSIS OF INFECTIOUS DISEASE, vol. 94, JPN6019015424, 2004, pages 191 - 195, ISSN: 0004026036 * |
PLANT CELL REPORTS, vol. 24, JPN6019015425, 2005, pages 629 - 641, ISSN: 0004026037 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020004144A1 (ja) | 2018-06-27 | 2020-01-02 | 住友電気工業株式会社 | フレキシブルプリント配線板の原形体、フレキシブルプリント配線板の製造方法、集光型太陽光発電モジュール、及び、発光モジュール |
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