KR20090096890A

KR20090096890A - 대장균에서 조류인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다제 ｎ1을발현하기 위한 벡터 및 방법, 이의 사용방법, 및뉴라미니다제 저해제

Info

Publication number: KR20090096890A
Application number: KR1020080021970A
Authority: KR
Inventors: 김도만; 김영민; 김도원; 훵충리; 잉따우; 브레통 빙상
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2008-03-10
Filing date: 2008-03-10
Publication date: 2009-09-15
Also published as: WO2009113795A2; WO2009113795A3

Abstract

본 발명은 대장균에서 조류인플루엔자(AI; Avian Influenza) 바이러스의 뉴라미니다제(neuraminidase) N1을 발현하기 위한 벡터 및 방법, 이를 사용하여 뉴라미니다제 N1의 활성 저해제를 스크리닝하는 방법, 및 상기 방법에 의해 스크리닝된 새로운 뉴라미니다제 N1 활성 저해제에 관한 것으로서, 대장균에서 AI 바이러스 뉴라미니다제 N1을 발현시켜 이를 대량으로 신속하게 생산할 수 있으며, 생산된 뉴라미니다제를 이용하여 시험관 내에서(in vitro) AI 바이러스 뉴라미니다제 N1 저해 후보 물질의 활성을 측정 평가하여 활성이 우수한 AI 바이러스 뉴라미니다제 N1 저해제를 효율적으로 스크리닝할 수 있으며, 그 결과 AI 바이러스 뉴라미니다제 N1 활성을 효율적으로 저해하는 62종의 화합물을 새로이 밝혀내었다.

H5N1, 조류인플루엔자, 타미플루, 오셀타미비르, 뉴라미니다제, 대장균, 뉴라미니다제 활성 저해제

Description

대장균에서 조류인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다제 Ｎ1을 발현하기 위한 벡터 및 방법, 이의 사용방법, 및 뉴라미니다제 저해제{Vectors and processes for expression of neuraminidase N1 of avian influenza virus in E. coli, methods of using the same, and agents for inhibiting activities of the neuraminidase}

본 발명은 대장균에서 조류인플루엔자(Avian Influenza, 이하 'AI'라고도 함) 바이러스 뉴라미니다제(neuraminidase) N1의 생산 및 그의 활성 저해제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 대장균에서 AI 바이러스의 뉴라미니다제 N1을 발현하기 위한 벡터 및 방법, 이를 사용하여 뉴라미니다제의 활성 저해제를 스크리닝하는 방법, 및 상기 방법에 의해 스크리닝된 뉴라미니다제 활성 저해제에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 오르소믹소비리대(Orthomyxoviridae)과에 속하는 바이러스로서 독감의 원인 바이러스이다. 인플루엔자 바이러스는 A, B 및 C형으로 나누어지며 이중 A형과 B형이 사람에게 빈번하게 감염된다. 특히, A형 인플루엔자 바이러스의 혈청형(serotype)은 혈구응집소(H; hemagglutinin)와 뉴라미니다제(N; neuraminidase) 단백질의 아미노산 서열의 차이에 따라 결정된다. A형 인플루엔자 바이러스의 혈구응집소(H)에는 15개의 다른 아형(subtype)이 존재하며 뉴라미니다 제(N)는 9개의 다른 아형이 존재하는데, 혈구응집소 단백질 아형과 뉴라미니다제 단백질 아형의 조합이 어떻게 이루어지는가에 따라 새로운 변이형이 결정되며(예: H5N1), 두 가지 단백질의 조합에 의해 총 135종류의 혈청형으로 나뉜다. 이 중 아시아 지역에 유행하는 조류인플루엔자 바이러스는 혈청형이 'H5N1'이다. 그 동안 조류인플루엔자는 조류와 돼지 사이에서만 전염된다고 생각했으나, 1997년 홍콩에서 조류인플루엔자에 감염된 조류와 접촉한 사람들 중 18명이 감염되고 그 중 6명이 사망하는 사건이 발생해 사람도 감염되는 것으로 알려졌다. 2003년에는 홍콩에서 감염자 2명 중 1명이, 네덜란드에서는 83명 중 수의사 1명이 숨졌는데, 홍콩은 H5N1, 네덜란드는 H7N7 바이러스가 원인이었다. 1999년 홍콩에서 발생한 조류인플루엔자에서는 H9N2 바이러스가 검출되었다. 또한 숙주의 면역체계에 대한 적응도에 따라서 새로운 변이형이 나올 수도 있다(문헌 [Yuen, K.Y. and Wong, S.S.Y., 2005. Hong Kong Med, 11:189-199]). 그러나 혈구응집소 단백질 15개 아형과 뉴라미니다제 단백질 9개 아형이 모두 사람에게 감염되는 것은 아니고, 혈구응집소 단백질 3개 아형(H1, 2 및 3)과 뉴라미니다제 단백질 2개 아형(N1 및 N2)이 사람에게 감염될 수 있는 능력을 가지고 있는 것으로 알려져 있으나, 닭이나 오리 등의 조류에서 발견되는 H5N1형도 사람에게 감염될 수 있다(문헌 [Kigon, B.L., 2005. Semin Pediatr. Infect Dis 16:325-335]).

인플루엔자 바이러스의 새로운 변이종의 빈번한 발생은 백신 혹은 치료제의 효용성을 낮추고 있을 뿐만 아니라, 백신은 조류인플루엔자와 같은 인체에 감염능력을 가진 새로운 인플루엔자 바이러스에는 대처할 수 없다. 따라서 인플루엔자 바이러스에 대처할 수 있는 다양한 치료제의 개발이 필요하다.

인플루엔자 바이러스의 증식을 억제하는 저해제에는 2가지 형태가 있다. 하나는 아만타딘(amantadine)으로 1964년 듀퐁(Dupont)사에 의해 개발된 M2 이온 채널 억제제로서 1980년까지 A형 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하는데 사용되었으며, 구역질, 졸음, 만성적 불면증을 초래한다(문헌 [Long, J.K., et al., 2000. Cleve Clin J. Med., 67:92~95]). 이후 아만타딘보다 부작용이 작은 리만타딘(rimantadine)이 개발되었으나, 리만타틴 역시 부작용 발생률이 높은 편이다(문헌 [Jefferson et al., 2004. Cochrane Database Syst. Rev., 3:CD001169]). 다른 하나는 뉴라미니다제 효소 저해 활성을 가진 약제로 자나미비르(zanamivir)와 오셀타미비르(oseltamivir) 등이 인플루엔자 바이러스 치료제로 사용되고 있다(문헌 [Dreitlein W.R. et al., 2001. Clin Ther., 23:327-355]). 자나미비르는 글락소웰컴(Glaxo Wellcome)사에서 리렌자(Relenza)라는 상품명으로 판매되고 있으며, 흡입형으로 되어 있어 코로 약제 가루를 흡입하도록 되어 있다. 오셀타미비르는 로슈(Roche)사에서 타미플루(Tamiflu)라는 상품명으로 판매하고 있고, 아만타딘과 같이 구강 복용제로 사용하고 있다. 리렌자는 호흡하는데 문제가 생길 수 있어 천식이 악화될 가능성 있고, 타미플루는 구역, 구토를 일으키며(문헌 [McNicholl and McNicholl. 2001, Ann. Pharmacother. 35(1):57-70]), 인체 내 간에서 오셀타미비르 카르복실레이트로 대사되어 심각한 정신장해를 일으키고(문헌 [Izumi Y., et al., 2007, Neuroscience Letters, 426:54-58]) 환경오염을 초래하며 자연적인 돌연변이체를 유도하는(문헌 [Fick, J., et al., 2007, PLos ONE 2(10):3986] 및 [Singer, A.C., et al., 2007, Env. Health Persp. 115:102-106]) 등의 부작용이 발생하고 있다. 특히, 최근 일본에서 타미플루를 복용한 환자 가운데 8명이 숨졌으며, 이 가운데 10대가 5명이었다. 타미플루를 복용한 10대 청소년들이 차량으로 뛰어들거나 투신자살을 하는 등 정신이상 증세를 보여 일본의 후생노동성이 투약금지 조치를 취하였고, 한국 식품의약품안전청(KFDA)에서도 2007년 3월 5일자로 10~19세의 미성년자에게 투약금지 조치를 내렸다. FDA는 타미플루에 신경정신 문제(소아나 청소년들은 복용 직후부터 환각, 망상, 공격성, 자살관념 등)에 관한 경고를 추가할 것을 권고하였다.

따라서 단기간 내에 독성과 부작용이 적은 조류인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스제의 개발이 필요하다. 더군다나 저해제에 내성을 지닌 돌연변이의 빈번한 출현에 대비하여 저렴한 비용과 신속한 고병원성 조류인플루엔자 뉴라미니다제 저해제 개발이 시급하다. 또한, 약제 내성을 지닌 돌연변이의 출현에 대비하여 다양한 형태의 저해제가 필요하다. 신속한 저해제 개발을 위해서는 돌연변이 가능성이 있는 재조합 효소를 제작할 필요가 있다. 재조합 뉴라미니다제 발현에는 배큘러바이러스(Baculovirus)와 곤충세포를 이용하는 방법(문헌 [Dalakouras, T. et al., 2006. 1136, 48-56, Journal of Chromatography A])과 MDCK(Madin-Darby canine kidney) 세포를 이용하는 방법이 주로 사용되어 왔다(문헌 [Govorkova, E.A., et al., 2001, 45(10) 2723-2732, Antimicrobial Agents and Chemotheraphy] 및 [Yen, H.L., et al., 2006, 80(17) 8787-8795, J. of Virology]). 그러나 빈번한 돌연변이유발에 따른 저해제 개발을 위해서는 신속한 재조합 뉴라미니다제의 생 산이 필수적이나, 이를 위해 대장균을 이용한 조류인플루엔자 바이러스의 재조합 뉴라미니다제 발현의 성공사례는 아직까지 없었다.

새로운 질병과 돌연변이가 빈번하게 발생하는 질병의 예방과 치료를 위한 약품의 개발은 정해진 표적(target)에 대한 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 실험을 통해 수행된다. 일반적인 방법은 특정한 후보 물질들의 라이브러리를 바탕으로 이루어지며, 이는 직접적인 치료가능물질을 제시할 수 있는 방법이다. 그러나 조류인플루엔자와 같은 경우에는 약제 내성 돌연변이가 빈번하게 출현하므로, 이의 치료를 위해서는 "약품의 개발을 위한 시간"이 가장 중요한 요건이 되고 있다. 그럼에도 불구하고, 현재의 방법으로 새로운 치료제를 개발하는 것은 10~12 년에 달하는 장기간이 소요되고 많은 비용을 필요로 한다. 더군다나, 이 방법은 기존의 약제에 내성을 지닌 돌연변이의 출현에는 그다지 효과적인 방법이라 할 수 없다.

최근, 새로운 활성의 소재를 광범위한 후보 물질들의 라이브러리로부터 개발하기 위하여 가상 스크리닝을 이용한 도킹 연구가 수행되고 있다. 가장 최근에는, 유럽연합 팀을 중심으로 시도되고 있는 국제 그리드 망(International Grid Network)을 활용한 인실리코(In silico) 가상 스크리닝 방법(EGEE 프로그램-Enabling Grid for E-sciencE)이 많은 관심을 얻고 새롭게 수행되고 있다. 그러나 아직까지 이 방법에 의해 제시된 의약품 소재의 활성은 시험관 내 방법으로 확인되지 않았는데, 그 이유는 조류인플루엔자 바이러스의 표적 단백질인 뉴라미니다제의 활성 단백질을 얻을 수 없었기 때문이다.

본 발명자들은 H5N1형 AI 바이러스의 저해제를 개발하기 위하여, 대장균에서 재조합 뉴라미니다제 N1을 효율적으로 발현할 수 있는 벡터를 제작하고, 상기 벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 뉴라미니다제 N1을 생산 및 분리·정제하는데 성공하였다. 나아가, 얻어진 재조합 뉴라미니다제를 이용하여, 기존에 사용되고 있는 치료제인 자나미비르나 오셀타미비르 보다 강력하거나 동등한 저해특성을 나타내는 물질을 새로이 밝혀내었다. 이와 같이 밝혀진 화학물질은 H5N1형 고병원성 조류인플루엔자의 치료제로 활용될 가능성이 있다.

따라서 본 발명의 목적은 대장균에서 AI 바이러스의 뉴라미니다제 N1을 발현하기 위한 벡터를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현 벡터로 형질전환된 대장균을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 대장균을 이용하여 AI 바이러스의 뉴라미니다제 N1을 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 시험관 내에서 AI 바이러스의 뉴라미니다제 N1 저해 후보 물질이 AI 바이러스의 뉴라미니다제 N1 활성에 미치는 영향을 조사하고, 뉴라미니다제 N1 활성을 저해하는 물질을 선별하는 단계를 포함하는, AI 바이러스 뉴라미니다제 N1 저해제의 스크리닝 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 스크리닝된 AI 바이러스의 뉴라 미니다제 N1 활성 저해제를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제1면은 pET-23d 벡터의 다중 클로닝 부위(multiple cloning site)에 AI 바이러스 뉴라미니다제 N1 유전자가 삽입되어 있고, 도 2의 개열지도(cleavage map)를 갖는, 대장균에서 AI 바이러스 뉴라미니다제 N1을 발현하기 위한 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 제2면은 상기 발현 벡터로 형질전환된 대장균에 관한 것이다.

본 발명의 제3면은 상기 형질전환된 대장균을 배양하여 배양액을 얻는 단계를 포함하는, AI 바이러스 뉴라미니다제 N1의 생산방법에 관한 것이다.

본 발명의 제4면은 시험관 내에서 AI 바이러스의 뉴라미니다제 N1 저해 후보 물질이 AI 바이러스의 뉴라미니다제 N1 활성에 미치는 영향을 조사하고, 뉴라미니다제 N1 활성을 저해하는 물질을 선별하는 단계를 포함하는, AI 바이러스 뉴라미니다제 N1 저해제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제5면은 유효성분으로서, 하기 화합물 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 에스테르를 포함하는, AI 바이러스의 뉴라미니다제 N1 활성 저해용 조성물에 관한 것이다:

(1) 1-(3-브로모페닐)-4-{[5-(2-클로로-5-니트로페닐)-2-퓨릴]메틸렌}-3,5-피라졸리딘디온;

(2) 6-아미노-4-(4-클로로-3-니트로페닐)-3-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보니트릴;

(3) 3-{2-[(4-클로로-2-메틸페녹시)아세틸]카보노하이드라조노일}페닐 4-니트로벤조에이트;

(4) 8-니트로-3-(페녹시메틸)[1,2,4]트리아졸로[3,4-b][1,3,4]벤조티아디아제핀;

(5) N-[3-(5,7-디클로로-1,3-벤족사졸-2-일)페닐]-2-니트로벤즈아미드;

(6) 3-(4-메톡시페닐)-N'-[3-(2-메톡시페닐)-2-프로펜-1-일리덴]-1H-피라졸-5-카보하이드라지드;

(7) N-1-(2-아미노에틸)-N-3-벤질-4-니트로-1,3-벤젠디아민 하이드로클로라이드;

(8) N'-(2-브로모-3-페닐-2-프로펜-1-일리덴)-4-메틸-3-페닐-1H-피라졸-5-카보하이드라지드;

(9) 4-[3-(4-클로로벤조일)-4-하이드록시-5-옥소-2-페닐-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일]부탄산:

(10) 3-하이드록시-5-(3-니트로페닐)-1-(1,3,4-티아디아졸-2-일)-4-(2-티에닐카보닐)-1,5-디하이드로-2H-피롤-2-온;

(11) 에틸 6-[(벤질티오)메틸]-4-(3-니트로페닐)-2-옥소-1,2,3,4-테트라하이드로-5-피리미딘 카복실레이트;

(12) 2-아미노-6-메틸-5-(3-니트로-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-4-페닐-4H-피란-3-카보니트릴;

(13) N-(4-{[(3-메톡시-2-피라지닐)아미노]설포닐}페닐)-3-(5-니트로-2-티에 닐)아크릴아미드;

(14) N'-[(5-하이드록시-3-메틸-1-페닐-1H-피라졸-4-일)메틸렌]-2,3-디하이드로-1,4-벤조디옥신-2-카보하이드라지드;

(15) N-[3-(5,7-디메틸-1,3-벤족사졸-2-일)페닐]-3-(3-니트로페닐)아크릴아미드;

(16) 6-아미노-7-(1H-벤즈이미다졸-2-일)-5-[3-(디에틸아미노)프로필]-5H-피롤로[2,3-b]피라진-2,3-디카보니트릴;

(17) 2-[5-(4-니트로벤질리덴)-4-옥소-2-디옥소-1,3-티아졸리딘-3-일]-3-페닐프로판산;

(18) 4-{[3-(1-카복시-2-페닐에틸)-4-옥소-2-티옥소-1,3-티아졸리딘-5-일리덴]메틸}벤조산;

(19) 1-[3-(디에틸아미노)프로필]-3-하이드록시-4-(5-메틸-2-퓨로일)-5-(4-니트로페닐)-1,5-디하이드로-2H-피롤-2-온;

(20) 메틸 4-(4-하이드록시-3-니트로페닐)-2-메틸-5-옥소-7-(2-티에닐)-1,4,5,6,7,8-헥사하이드로-3-퀴놀린 카복실레이트;

(21) 소듐 5-아세틸-3-[2-(아세틸아미노)에틸]-1H-인돌-2-카복실레이트;

(22) 4,6-디메틸-1-[(4-니트로벤질리덴)아미노]-2-옥소-1,2-디하이드로-3-피리딘 카복사미드;

(23) 1-[2-(디에틸아미노)에틸]-4-(4-플루오로벤조일)-3-하이드록시-5-(4-니트로페닐)-1,5-디하이드로-2H-피롤-2-온;

(24) N'-(2-브로모-3-페닐-2-프로펜-1-일리덴)-3-(2-나프틸)-1H-피라졸-5-카보하이드라지드;

(25) 2-{3-니트로-5-[2-(1-피롤리디닐카보닐)페녹시]-1H-1,2,4-트리아졸-1-일}아세트아미드;

(26) N'-(3,4-디하이드로-1(2H)-나프탈레닐리덴)-3-니트로벤조하이드라지드;

(27) 2-(1H-벤즈이미다졸-2-일티오)-N'-(2-니트로벤질리덴)아세토하이드라지드;

(28) 2-[(4-메틸페닐)아미노]-N'-{[5-(3-니트로페닐)-2-퓨릴]메틸렌}아세토하이드라지드;

(29) 2-[알릴(1-메틸-3-페닐프로필)아미노]-1-(3-니트로페닐)에탄올 하이드로클로라이드;

(30) 2-(1-나프틸)-N'-[(5-니트로-2-퓨릴)메틸렌]아세토하이드라지드;

(31) 3-(4-플루오로페닐)-2-(2-메틸페닐)-5-(3-니트로페닐)디하이드로-2H-피롤로[3,4-d]이속사졸-4,6(3H,5H)-디온:

(32) 4,6-디메틸-1-[(4-니트로벤질리덴)아미노]-2-옥소-1,2-디하이드로-3-피리딘 카복사미드;

(33) 4-(4-클로로벤조일)-3-하이드록시-1-메틸-5-(3-니트로페닐)-1,5-디하이드로-2H-피롤-2-온;

(34) 2-이소프로필-5-메틸벤조-1,4-퀴논 1-[O-(3-니트로벤조일)옥심];

(35) 3-(4-에톡시페닐)-N'-[(2-메틸-1H-인돌-3-일)메틸렌]-1H-피라졸-5-카보 하이드라지드;

(36) 2-[4-(3-클로로페닐)-1-피페라지닐]-5-(4-하이드록시-3-니트로벤질리덴)-1,3-티아졸-4(5H)-온;

(37) 4-[3-벤조일-4-하이드록시-2-(4-니트로페닐)-5-옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일]부탄산;

(38) 4-(4-클로로벤조일)-3-하이드록시-1-[3-(4-모르폴리닐)프로필]-5-(3-니트로페닐)-1,5-디하이드로-2H-피롤-2-온;

(39) 4-(4-클로로벤조일)-1-(4,5-디메틸-1,3-티아졸-2-일)-3-하이드록시-5-(3-니트로페닐)-1,5-디하이드로-2H-피롤-2-온;

(40) 2-(1-나프틸)-N'-[(6-니트로-1,3-벤조디옥솔-5-일)메틸렌]아세토하이드라지드;

(41) 2-이소프로필-5-메틸벤조-1,4-퀴논 1-[O-(3-니트로벤조일)옥심];

(42) N-{[(4-클로로벤질)아미노][(4,6-디메틸-2-피리미디닐)아미노]메틸렌}-4-메틸벤젠설폰아미드;

(43) N-(2,3-디하이드로-1,4-벤조디옥신-6-일)-2-{[5-(4-메틸페닐)[1,3]티아졸로[2,3-c][1,2,4]트리아졸-3-일]티오}아세트아미드;

(44) 9,9-디메틸-12-(4-메틸-3-니트로페닐)-8,9,10,12-테트라하이드로벤조[a]아크리딘-11(7H)-온;

(45) 5-[2-(1-나프틸메톡시)-5-니트로벤질리덴]-2-티옥소-1,3-티아졸리딘-4-온;

(46) 1-(4-니트로페닐)-1H-피롤-2-카바알데히드 티오세미카바존:

(47) 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-하이드록시-4-(4-메톡시벤조일)-5-(3-니트로페닐)-1,5-디하이드로-2H-피롤-2-온;

(48) 2-[(4-클로로-3-니트로벤조일)아미노]-N-(2-퓨릴메틸)-4,5,6,7-테트라하이드로-1-벤조티오펜-3-카복사미드;

(49) 1-[2-(디메틸아미노)에틸]-3-하이드록시-4-(4-메틸벤조일)-5-(3-니트로페닐)-1,5-디하이드로-2H-피롤-2-온;

(50) 2-{3-니트로-5-[2-(1-피롤리디닐카보닐)페녹시]-1H-1,2,4-트리아졸-1-일}아세트아미드;

(51) 3-(3-메틸-4-{[5-(4-메틸-2-니트로페닐)-2-퓨릴]메틸렌}-5-옥소-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)벤조산;

(52) 6-아미노-7-(1H-벤즈아미다졸-2-일)-5-[3-(디에틸아미노)프로필]-5H-피롤로[2,3-b]피라진-2,3-디카보니트릴;

(53) 4-[(3-니트로벤질리덴)아미노]-5-(페녹시메틸)-4H-1,2,4-트리아졸-3-티올;

(54) N'-(2-브로모-3-페닐-2-프로펜-1-일리덴)-3-(2-나프틸)-1H-피라졸-5-카보하이드라지드;

(55) 에틸 7-메틸-2-(3-니트로벤질리덴)-3-옥소-5-페닐-2,3-디하이드로-5H-[1,3]티아졸로[3,2-a]피리미딘-6-카복실레이트;

(56) 4-(4-클로로벤조일)-1-(4,5-디메틸-1,3-티아졸-2-일)-3-하이드록시-5- (3-니트로페닐)-1,5-디하이드로-2H-피롤-2-온;

(57) 3-(4-클로로-3-니트로페닐)-N-[3-(5,7-디메틸-1,3-벤족사졸-2-일)페닐]아크릴아미드;

(58) 4-벤질-3-(2-퓨릴)-5-[(4-니트로벤질)티오]-4H-1,2,4-트리아졸;

(59) 에틸 7-메틸-2-[(5-메틸-2-퓨릴)메틸렌]-5-(3-니트로페닐)-3-옥소-2,3-디하이드로-5H-[1,3]트리아졸로[3,2-a]피리미딘-6-카복실레이트;

(60) 부틸 3-{[3-(4-니트로-1,3-디옥소-1,3-디하이드로-2H-이소인돌-2-일)프로파노일]아미노}벤조에이트;

(61) 2-(4-니트로페닐)-2-옥소에틸 2-(벤조일아미노)벤조에이트; 및

(62) 2-페닐에틸 7-(4-메톡시페닐)-2-메틸-4-(6-니트로-1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-옥소-1,4,5,6,7,8-헥사하이드로-3-퀴놀린 카복실레이트.

본 발명에 따르면, 대장균에서 AI 바이러스 뉴라미니다제 N1을 발현시켜 이를 대량으로 신속하게 생산할 수 있으며, 생산된 뉴라미니다제를 이용하여 시험관 내에서 AI 바이러스 뉴라미니다제 N1 저해 후보 물질의 활성을 측정 평가하여 활성이 우수한 AI 바이러스 뉴라미니다제 N1 저해제를 효율적으로 스크리닝할 수 있으며, 그 결과 AI 바이러스 뉴라미니다제 N1 활성을 효율적으로 저해하는 62종의 화합물을 새로이 밝혀내었다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는, 공지의 H5N1 유전정보(서열번호 1 및 2, 및 도 1 참조)를 바탕으로 뉴라미니다제(N1) 유전자를 합성하고, 이를 pET-23d 벡터(노바젠(Novagen), 독일)의 다중 클로닝 위치에 삽입하여 N1 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pET-23d-N1을 제작하였다. 도 2는 제작된 pET-23d-N1의 개열지도이다. 컴피턴트(competent) 대장균 세포, 예를 들어 대장균 BL21(노바젠, 미국)을 제작된 발현 벡터로 형질전환시키고(예: 열충격 또는 전기충격), 형질전환된 대장균을 배양한다. 얻어진 배양액으로부터 재조합 뉴라미니다제 단백질을 예를 들어 Ni-NTA(Nickel-NitriloTriacetic Acid) 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제한다(도 3). 도 4에 순수 정제된 재조합 뉴라미니다제의 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) 결과를 나타내었다. 본 발명에 따라 생산된 재조합 뉴라미니다제는 C-말단에 6개의 히스티딘 택(Histidine tag)이 붙어있어 정제가 용이하다.

나아가, 본 발명에서는 시험관 내에서 AI 바이러스의 뉴라미니다제 N1 저해 후보 물질이 AI 바이러스의 뉴라미니다제 N1 활성에 미치는 영향을 조사하고, 뉴라미니다제 N1 활성을 저해하는 물질을 선별하여, AI 바이러스 뉴라미니다제 N1 저해제를 선별하였다. 2006년 4월부터 타이완의 아카데미아 시니카(Academia Sinica)와 프랑스의 CNRS-IN2P3 팀에 의해 컴퓨터 한 대로 100년 정도의 시간이 걸릴 작업을 국제 슈퍼컴퓨터 그리드 망을 이용하여 6 주 정도의 시간을 소요하여 오토덕(AutoDock) 프로그램을 이용하고 ZINC(문헌 [Irwin and Shoichet, 2005. J. Chem. Inf. Model., 45(1):177-182])로부터 확보된 가상공간의 화합물 라이브러 리(300,000개)로부터 H5N1의 뉴라미니다제의 활성부위에 잘 결합할 수 있는 화합물을 가상공간에서 계산하여 제시하였다(문헌 [WISDOM, Kasam, v., et al., J. Chem. Inf. Model. 2007. 47(5):1818-1828] 및 [Lee, H.C. et al., 2006, 5(4):288-295, IEEE Trans Nanobioscience]). 이 국제 그리드를 활용한 집중 화학물질의 라이브러리 확보과정을 다음과 같다.

⑴ 뉴라미니다제의 결합정도를 확인하기 위한 화학물질들의 데이터베이스 (300,000 가지)와 단백질의 3차 구조 모델 준비 및 활성과 관련된 결합 부위 결정

⑵ 대상 단백질의 결합 부위에 각각의 화학물질을 가상적으로 결합시키고, 결합 에너지를 계산한 후, 좋은 결합을 보이는 화학물질(상위 5%)들을 분자역학을 고려하여 2차 분석

⑶ 이 중 가장 결합력이 우수한 상위 5% 이내의 물질들의 제시

본 발명에서는, 이렇게 제시된 화합물 중 308가지를 캠브리지(Cambridge)사(미국)로부터 구입하여 가상 스크리닝 결과의 유효성을 확인하고, 기존의 저해제 보다 더 우수하거나 동등한 저해 활성을 갖는 화학물질을 선별하였다. 가상 스크리닝에서 선별한 화합물들의 뉴라미니다제에 대한 저해활성은 기질, 재조합 효소 및 효소반응액에 화합물(0.2 nM~2 M)을 첨가하여 첨가하지 않은 샘플을 기준으로 활성 감소 정도를 측정하였다. 기준물질로는 현재 약품으로 사용 중인 타미플루(오셀타미비르 포스페이트)를 정제하여 사용하였다.

아래 표 1에 선별된 화학물질들의 명칭, 분자량 및 상대적 저해 활성을 나타내었다. 저해 활성의 기준은 정제된 타미플루의 저해 능력을 100%라 하고 타미플 루보다 더 나은 저해 효과에 의해 나타나는 활성을 %로 표시하였다. 즉 더 낮은 %의 수치는 더 높은 효소 저해 특성을 나타낸다.

상기 표 1에 나타낸 62종의 화합물들은 오셀타미비르 포스페이트에 비해 보다 우수하거나 동등한 뉴라미니다제 활성 저해효과를 나타내는 바, 고병원성 조류 인플루엔자바이러스 감염의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다. 상기 화합물을 고병원성 조류 인플루엔자바이러스 감염의 예방 또는 치료제로 사용하는 경우, 1 ㎍/㎏ 체중 내지 50 ㎎/㎏ 체중의 1일 용량으로 투여하는 것이 바람직하지만, 이는 투여대상의 연령, 성별, 식이, 건강상태, 상태의 중증도, 투여방법, 투여시간, 약제혼합 등에 따라 적의 증감될 수 있다.

상기 화합물은 당업계에 알려져 있는 통상적인 투여방법에 따라 투여할 수 있으며, 예를 들어, 경구 또는 비경구, 바람직하게는 경구로 투여할 수 있다. 따라서 상기 화합물을 약제학적으로 허용되는 통상적인 담체와 함께 배합하여 투여 목적에 따라, 정제, 경질 또는 연질 캡슐제, 과립제, 츄잉정, 환제, 분말, 엘릭시르, 현탁제, 에멀젼, 용액, 시럽과 경구 투여용 제제 또는 에어로졸, 새세이, 멸균 주사용액 또는 멸균 분말 등과 같은 비경구 투여용 제제의 형태로 제형화할 수 있다. 경구 투여의 목적으로 본 발명의 유효성분을 정제, 캡슐제, 과립제, 츄잉정, 환제, 분말, 엘릭시르, 현탁제, 에멀젼, 용액, 시럽 등의 제제로 제형화하는 경우에는, 아라비아 고무, 옥수수 전분, 미세결정질 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 인산이칼슘 또는 락토오즈와 같은 부형제, 알긴산, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 붕해제, 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제, 슈크로오즈 또는 사카린과 같은 감미제 및 페퍼민트, 메틸 살리실산염 또는 과일향과 같은 향미제가 포함될 수 있다. 단위 제형이 캡슐제인 경우에는 상기 성분 외에도 폴리에틸렌 글리콜 또는 지방유와 같은 액상 담체가 포함될 수도 있다. 또한, 비경구 투여를 위한 용액 또는 현탁액 형태의 주사제는 비경구적으로, 예를 들면 피하, 정맥내, 근육내 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일반적으로, 주사가능한 용액 또는 현탁액은 물, 염수, 수성 덱스트로스 및 관련된 설탕 용액제, 비휘발성 오일, 에탄올, 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜류 등의 약제학적으로 허용되는 액상 담체 중에 유효량의 유효성분을 균질하게 혼합시켜 제조할 수 있다. 이외에도 필요에 따라 항세균제, 킬레이트제, 완충제, 보존제와 같은 보조제를 포함시킬 수도 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체로는 약제학적으로 순수하고, 실질적으로 무독성이며, 유효성분의 작용을 저해하지 않는 임의의 모든 보조제를 사용할 수 있다.

상기 화합물들은, 목적하는 뉴라미니다제 활성 저해효과를 나타내는 한, 유리 화합물, 약제학적으로 허용되는 염, 수화물을 포함한 용매화물, 에스테르, 입체이성체의 어떠한 형태로도 사용가능하며, 이들은 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것이다. 본 발명에서 약제학적으로 허용되는 염은 약제학적으로 허용되는 산 부가염을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻어지는 것일 수 있다. 구체적인 예로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 들 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하나, 이들에 의해 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 유전자 확보 및 재조합 발현 벡터 구축

H5N1[A/Viet Nam/3046/2004(H5N1)]의 유전정보(서열번호 1 및 2, 및 도 1 참조)를 바탕으로 뉴라미니다제(N1) 유전자를 합성하였다. 활성 단백질을 발현하기 위하여 pET-23d(노바젠, 독일) 벡터의 다중 클로닝 위치에 도입하여 N1 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pET-23d-N1을 제작하였다. pET-23d-N1은 도 2에 나타낸 바와 같은 개열지도를 갖는다.

실시예 2: 대장균의 형질전환

준비된 컴피턴트 세포인 대장균 BL21(노바젠, 미국)에 실시예 1에서 얻은 재조합 DNA(5 ㎕)를 넣고 얼음에서 1 시간 동안 방치하였다. DNA를 삽입하기 위하여 42 ℃에서 90 초간 열충격을 가하였다. 그 후, LB 배지[1%(w/v) 트립톤, 0.5%(w/v) 효모 추출액, 0.5%(w/v) NaC1] 1 ㎖를 넣어주고 37 ℃에서 1 시간 배양하였다. 이 배양액을 앰피실린(50 ㎍/㎖)이 첨가된 LB 배지에서 37 ℃에서 10 시간 동안 배양하였다.

실시예 3: 재조합 뉴라미니다제 생산

실시예 2에서 얻은 형질전환 균주를 앰피실린(50 ㎍/㎖)을 포함하는 LB 배지에서 37 ℃에서 3~5 시간 배양하였다. 그 후, 활성화 인자로서 락토스 또는 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 최종농도가 1 mM이 되도록 가한 후, 16 ℃로 옮겨 24 시간 배양하였다. 얻어진 배양액의 상등액과 초음파파쇄기를 통해 얻어진 세포파쇄액을 뉴라미니다제 활성을 확인하는데 사용하였다. 재조합 뉴라미니다제는 도 1에 나타낸 바와 같이 메티오닌을 시작으로 475개의 아미노산으로 구성되며, C-말단에는 6개의 히스티딘 택이 붙어있어 단백질 정제가 용이하다.

실시예 4: 재조합 뉴라미니다제에 대한 저해활성을 갖는 화합물을 선별하기 위한 시험관 내 실험

재조합 뉴라미니다제의 활성을 확인하기 위하여, 기질 메틸움벨리페릴-뉴라민산(4-MU-Neu5Ac; 4-methylumbelliferyl-neuraminic acid)을 10~40 ㎛ 농도로 40 mM 인산나트륨 완충액(pH 6~7.5)에 녹여 사용하였다. 실시예 3에서 얻은 뉴라미니다제 조효소를 저해 후보 물질(0.2 nM~2 M)과 혼합하여 30 ℃에서 10 분 내지 2 시간 반응시킨 후 잔존 활성을 측정하였다. 효소 반응 후, 메틸움벨리페롤(4-methylumbelliferol)을 362 ㎚에서 활성화시키고, 방출된 형광을 448 ㎚에서 사파이어(Safire) 2(테칸(Tecan), 독일) 기기를 이용하여 측정하였다. 효소의 1 유닛(Unit)은 기질로부터 1 분당 1 마이크로몰의 메틸움벨리페론(4-methylumbelliferone)을 생산하는 양으로 측정하였다.

재조합 뉴라미니다제 저해 활성을 비교하기 위하여, 현재 뉴라미니다제 저해제로 사용되는 타미플루(오셀타미비르 포스페이트, 로슈, 미국)를 구입하여 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피와 HPLC(TSK amide 80(4.6×300 ㎜), 85%(v/v) 아세토니트릴, 유속 0.8 ㎖/분, 검출기 UV 226 ㎚)로 정제한 후 활성 확인을 위한 반응액에 희석하여 사용하였다.

그 결과 상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 타미플루 보다 우수하거나 이와 동등한 저해 활성을 나타내는 62종의 화합물을 선별하였다.

실시예 5: 재조합 뉴라미니다제의 분리 정제

실시예 3에서 얻어진 세포파쇄액으로부터 재조합 뉴라미니다제를 다음과 같은 방법으로 순수하게 분리 정제하였다. 세포파쇄액을 평형화 완충액[20 mM 인산나트륨(pH 7.2)와 0.5 M NaCl]을 포함하는 용액에 현탁하였다. 평형화 완충액으로 미리 평형화된 니켈-세파로스 칼럼[아머샴 파마시아 바이오텍(Amersham Pharmacia Biotech)]에 흡착시키고 0~0.5 M 이미다졸을 포함하는 평형화 완충액을 이용하여 선형 농도 구배에 의해 용출하였다. 용출액을 분획 수집기(fraction collector)를 이용하여 3 ㎖씩 분주하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

각 분획의 활성을 측정하기 위하여, 실시예 4와 동일한 방법으로 활성을 측정하였다. 활성을 보인 분획 중에 뉴라미니다제 효소의 존재를 확인하기 위하여, 12% 폴리아크릴아미드 젤 상에서 50 mA의 조건으로 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 후, 젤을 염색 용액(쿠마시에 브릴리언트 블루 R-250 1 g, 아세트산 100 ㎖, 메탄올 450 ㎖, 증류수, 450 ㎖)으로 염색하고, 탈색용액(메탄올 100 ㎖, 아세트산 10 ㎖, 증류수 800 ㎖) 300 ㎖를 3~5회 교환해주면서 탈색하였다. 단백질의 크기는 바이오래드(Bio-Rad)사(미국)의 표준 단백질[레인 M, 크기 마커(미오신, 209 kDa; β-갈락토시다제, 124 kDa; 소 혈청 알부민(BSA), 80 kDa; 난백알부민, 49.1 kDa; 카보닉 언하이드라제, 34.8 kDa; 대두 트립신 저해제, 28.4 kDa)]을 기준으로 결정하였고, 뉴라미니다제의 크기는 약 50 kDa임을 확인하였다(도 4 참조). SM은 바이오래드사의 크기 마커이고, 레인 1은 세포파쇄 후의 조효소이며, 레인 2~5는 활성을 지닌 분획의 샘플이다.

도 1은 H5N1형 조류인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다제(N1) 유전자의 염기서열 및 예상되는 아미노산 서열을 나타낸 도면이고;

도 2는 본 발명의 재조합 벡터 pET-23d-N1의 개열지도이며;

도 3은 발현된 재조합 뉴라미니다제의 Ni-NTA 칼럼 크로마토그래피 결과를 보여주는 도면이고;

도 4는 순수 정제된 재조합 뉴라미니다제의 SDS-PAGE 결과를 보여주는 도면이다.

<110> Industry Foundation of Chonnam National University <120> Vectors and processes for expression of neuraminidase N1 of avian influenza virus in E. coli, methods of using the same,and agents for inhibiting activities of the neuraminidase <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hybrid gene of dex2 and dsrB <400> 1 atgaagcatt acctccgtct attggcctca gcatttgcgc tgctgctcct gctgccggct 60 gccggccagg agccagccgc tgcgacagaa cagaccggtt tcactgccac cggacccggc 120 cttcggacct ggtggcacaa caactacgaa tacaacccaa cctcacccac ccagaacggc 180 acagtccgcc ggtcatcctt ttacgaggtg caagtagcca cagcaacggc accaggaacg 240 cgctacgact ccttcgccta catgagcatt ccccgcagcg gaaaggggaa gaccggctac 300 acggagccgg acggagcaga gttctcttcg tcagcgaacc tctcaatgag ctggtccagc 360 tttgagtact caacggacgt ctgggtggac gtcaaactca cgacaggcca aacaatcacg 420 tctgtggatc aggtaacgat ccggcccagc aagtacacct tcgagaaaga gctggtgaac 480 cccagcacca tccgggtcaa agtcccctac tcgtcgacgg gctaccggct ctcagtggaa 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gatgccatca aggctctgca cgcaaatggc atccaagcaa tcgctgactg ggtacccgac 4800 caaatttata atttaccggg tcaagaatta gcgaccgtca cccgaacaaa ctcttatggt 4860 gataaagaca ctaactcaga tattgatcag tcactatatg tcatacaaag tcgtggtggt 4920 ggtaaatacc aagcacagta tggcggtgcc ttcttatccg atatccagaa aaaatatcca 4980 gcacttttcg aaacaaaaca aatttctaca gggctaccta tggatcctag tcagaaaata 5040 acagaatggt ctggtaaata ctttaatggc tcaaatattc aaggcaaagg ggctggctat 5100 gtcttgaaag acagtggtac cgatcaatac tataaggtta catcaaacaa taataatcgt 5160 gacttcttgc caaaacaatt aacagatgac ttatctgaaa ccggatttgt ccgcgataac 5220 attggtatgg tctattacac actgagtggc tatctagctc gaaacacctt tatacaagat 5280 gataatggca attattatta ctttgatagc accggccatc tcgttactgg cttccagaat 5340 attaataacc atcactattt cttcctacca aacggtattg aactcgttca atctttctta 5400 cagaatgctg acggttcaac gatttatttt gaccaaaaag ggcgtcaagt atttaatcaa 5460 tacattactg accaaaccgg taccgcctat tacttccaga atgatggcac aatggtcact 5520 tctggcttca ctgaaatcga tggtcataag caatacttct acaagaacgg cacacaagtc 5580 aaagggcaat ttgtatcaga cactgatggt cacgttttct acttagaagc tggtaacggc 5640 aacgtggcga cacaaagatt tgcacaaaat agtcaaggtc agtggttcta tttgggtaat 5700 gatggcattg ccttgactgg tttgcaaaca atcaatggtg ttcaaaatta tttctacgcc 5760 gatggtcatc aaagtaaggg tgattttatt acgatacaaa atcacgtatt atatactaac 5820 ccactaactg gcgctataac gacaggtatg caacaaattg gtgacaagat ttttgtcttt 5880 gacaatacgg gcaacatgtt gaccaatcaa tactatcaaa cactagatgg ccaatggtta 5940 catttaagca ctcaaggtcc agcagacact ggtttggtaa acattaatgg taatttgaaa 6000 tatttccaag ctaatggtcg gcaagtgaaa ggtcaatttg tgactgatcc tatcacgaac 6060 gtgagttatt atatgaatgc cactgatggt tcggcagtat ttaatgacta ctttacctat 6120 caaggccaat ggtatttaac ggatagtaat tatcaactcg tcaaaggatt taaagttgtt 6180 aataataagc tacaacattt tgatgaaata acaggcgtac aaactaaatc agctcatatc 6240 atcgttaata atcgaacata cattttcgat gaccaaggtt actttgtctc agtcgcttaa 6300 6300 <210> 2 <211> 6291 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hybrid gene of dsrB and dex2 <400> 2 atgctgtcta tgaccgctac ttcacaaaat gttaatgcag atagcacaaa cacagtgacg 60 gataagtcag ttactgtctc caataattcg aatacaacca atcaacacga tactgtcgtt 120 gacaaacaaa cgatacctgt caaaaatgac caaacaacac aacaaatcgc cgcaaatgcc 180 acccaagcag aaaaagtaaa agcatcagac acaacgactg atacgcaaaa gcaagctgaa 240 acggcaaaca acactaacaa ggattcgata gataatctca ccaagcagtt gccggctgtt 300 acaccaacag ctaatcaaaa aactggttat ctggaaaaag atggtaaatg gtactatgta 360 accagtgata acacacttgc taaggggttg actactgttg acaaccacaa gcagtatttt 420 gacaacaatg gcgtgcaggc aaaaggccaa ttcgttaccg ataacagtaa aacatactat 480 ctcgatccta actccggtaa cgcagtaacc gggatacaac aaattggctc acaaacatta 540 gccttcaatg acaacggtga acaagttttt gctgatttct atacagcgcc agatggcaaa 600 acttattatt ttgacgataa aggacaagca actattggtc taaaggccat taatgggcac 660 aattattact tcgatagttt gggacaacta aaaaaaggat ttaccggtgt cattgacggt 720 caagtacgct attttgatca agaatcagga caagaggtat caacaaccga ctcacaaatc 780 aaagaaggtt taacttctca gacaacagac tatacagcac ataatgccgt tcacagcacc 840 gatagcgctg atttcgacaa ttttaatggt tatttgaccg cttcttcatg gtatcgccct 900 aaagatgttt taagaaatgg tcaacactgg gaagcaacaa cagctaatga cttccggccc 960 attgtgtcag tttggtggcc tagcaagcaa acacaagtaa attacctaaa ctacatgtct 1020 caaatgggac tcattgacaa tcgtcagatg ttctcgctaa aagacaatca agccatgttg 1080 aatattgctt gcacaacagt ccaacaagca attgaaacaa aaatcggtgt ggctaatagt 1140 acagcatggc ttaaaacagc cattgatgat ttcattcgta cacagccaca atggaacatg 1200 tcgagtgaag atcccaaaaa tgatcattta caaaacggcg ctttgacttt cgtcaacagt 1260 ccattgacac cagatactaa ctctaatttc agactattaa atcgcacacc aacaaaccag 1320 acaggtgtgc caaaatatac aattgatcaa tctaagggtg gttttgaact cttactcgct 1380 aatgatgtag acaactctaa tcctgttgtg caagctgagc agttaaattg gttacactat 1440 ttgatgaatt ttggtagcat tacagcaaac gattctgctg ctaattttga tgggatacgt 1500 gtcgatgctg tcgataatgt tgacgctgat ttactccaga ttgcagcaga ttatttcaaa 1560 gctgcttatg gtgttgataa aaatgacgca acagcaaatc aacatctttc aattcttgaa 1620 gattggagcc ataacgaccc tgaatacgtg aaggattttg gtaataatca actcacaatg 1680 gatgattaca tgcataccca gttaatctgg tccttgacta aagatatgcg tatgcgtggt 1740 accatgcaac gcttcatgga ctattacctc gtcaatcgca atcacgatag taccgaaaac 1800 actgccattc caaattacag ctttgttcgc gcacacgata gtgaagtaca aacagtcatt 1860 gctcaaatta tttctgagtt acatcccgac gtaaaaaata gtttggcacc aacagcagac 1920 cagctagccg aagcctttaa aatttataat aacgatgaaa aacaggcgga taagaaatat 1980 acacaataca acatgcctag cgcctatgcg atgctgttaa ctaataaaga tacagtaccg 2040 cgcgtttatt atggtgattt atacaccgat gatggtcaat atatggcaaa taagtcccct 2100 tattttgatg ccatcaacgg cttgctaaag tcacgtatca aatatgttgc tggtggtcag 2160 tcaatggctg ttgatcaaaa cgatatcctg acaaatgttc gttatggtaa aggtgccatg 2220 agtgtgacag atagcggtaa tgcagacaca cgaacacaag gtattggtgt gattgtcagt 2280 aataaagaaa atctggcctt aaaatcaggc gacacggtga cattacacat gggtgccgct 2340 cacaaaaatc aagcattcag attattatta gggacaactg ctgacaattt gtcttattat 2400 gataatgaca acgccccagt aaagtacacc aatgatcagg gcgatttaat ttttgataat 2460 actgaaatct atggtgtccg taacccgcaa gtctctggct tcttagctgt ttgggtgcct 2520 gttggggctg acagccatca agacgcgcgt actttgtctg acgacacagc ccatcatgat 2580 ggcaaaacct tccactcaaa tgctgcttta gattctcagg ttatttacga aggtttttca 2640 aatttccaag cttttgccac aaacactgaa gactatacaa atgctgtcat tgcaaaaaat 2700 ggtcagttat tcaaagattg gggtatcaca agtttccagt tggcaccaca atatcgttca 2760 agcaccgata ccagtttctt agattcaatt atccaaaatg gttatgcctt tacagatcgt 2820 tatgatttag gctacggtac accaacaaaa tatggcacag ttgaccagtt acgcgatgcc 2880 atcaaggctc tgcacgcaaa tggcatccaa gcaatcgctg actgggtacc cgaccaaatt 2940 tataatttac cgggtcaaga attagcgacc gtcacccgaa caaactctta tggtgataaa 3000 gacactaact cagatattga tcagtcacta tatgtcatac aaagtcgtgg tggtggtaaa 3060 taccaagcac agtatggcgg tgccttctta tccgatatcc agaaaaaata tccagcactt 3120 ttcgaaacaa aacaaatttc tacagggcta cctatggatc ctagtcagaa aataacagaa 3180 tggtctggta aatactttaa tggctcaaat attcaaggca aaggggctgg ctatgtcttg 3240 aaagacagtg gtaccgatca atactataag gttacatcaa acaataataa tcgtgacttc 3300 ttgccaaaac aattaacaga tgacttatct gaaaccggat ttgtccgcga taacattggt 3360 atggtctatt acacactgag tggctatcta gctcgaaaca cctttataca agatgataat 3420 ggcaattatt attactttga tagcaccggc catctcgtta ctggcttcca gaatattaat 3480 aaccatcact atttcttcct accaaacggt attgaactcg ttcaatcttt cttacagaat 3540 gctgacggtt caacgattta ttttgaccaa aaagggcgtc aagtatttaa tcaatacatt 3600 actgaccaaa ccggtaccgc ctattacttc cagaatgatg gcacaatggt cacttctggc 3660 ttcactgaaa tcgatggtca taagcaatac ttctacaaga acggcacaca agtcaaaggg 3720 caatttgtat cagacactga tggtcacgtt ttctacttag aagctggtaa cggcaacgtg 3780 gcgacacaaa gatttgcaca aaatagtcaa ggtcagtggt tctatttggg taatgatggc 3840 attgccttga ctggtttgca aacaatcaat ggtgttcaaa attatttcta cgccgatggt 3900 catcaaagta agggtgattt tattacgata caaaatcacg tattatatac taacccacta 3960 actggcgcta taacgacagg tatgcaacaa attggtgaca agatttttgt ctttgacaat 4020 acgggcaaca tgttgaccaa tcaatactat caaacactag atggccaatg gttacattta 4080 agcactcaag gtccagcaga cactggtttg gtaaacatta atggtaattt gaaatatttc 4140 caagctaatg gtcggcaagt gaaaggtcaa tttgtgactg atcctatcac gaacgtgagt 4200 tattatatga atgccactga tggttcggca gtatttaatg actactttac ctatcaaggc 4260 caatggtatt taacggatag taattatcaa ctcgtcaaag gatttaaagt tgttaataat 4320 aagctacaac attttgatga aataacaggc gtacaaacta aatcagctca tatcatcgtt 4380 aataatcgaa catacatttt cgatgaccaa ggttactttg tctcaagatc taagcattac 4440 ctccgtctat tggcctcagc atttgcgctg ctgctcctgc tgccggctgc cggccaggag 4500 ccagccgctg cgacagaaca gaccggtttc actgccaccg gacccggcct tcggacctgg 4560 tggcacaaca actacgaata caacccaacc tcacccaccc agaacggcac agtccgccgg 4620 tcatcctttt acgaggtgca agtagccaca gcaacggcac caggaacgcg ctacgactcc 4680 ttcgcctaca tgagcattcc ccgcagcgga aaggggaaga ccggctacac ggagccggac 4740 ggagcagagt tctcttcgtc agcgaacctc tcaatgagct ggtccagctt tgagtactca 4800 acggacgtct gggtggacgt caaactcacg acaggccaaa caatcacgtc tgtggatcag 4860 gtaacgatcc ggcccagcaa gtacaccttc gagaaagagc tggtgaaccc cagcaccatc 4920 cgggtcaaag tcccctactc gtcgacgggc taccggctct cagtggaatt cgcgccccag 4980 ctcttcactg catacaacga catgtccgga acggcggggg tgttgactga aaccggtggc 5040 ggggatcacc gcgccatcca taccgaacca cggaattcca tgatgatctt cgccgagccg 5100 accctgggcg gcggcgaggc ggagcggttg attcccacct ccgcatccgg agctatcaac 5160 tatccgcagg aaggcctggt cgacaacctg gggtcggtca ccgaggagat catctacttc 5220 cggcccggga cgtattacat gggatcggac caccgggcct cgatgccgcc caacgtcaaa 5280 tggatctacc tggctcccgg ggcgtatgtc aaaggtgcct tctacttccc caactcgacg 5340 cagggcgtct acaaggtcac tggccgcggc gtgctctccg gcgaacagta cgtctatgaa 5400 gccgatacaa ccaccagcgg gtacacgcat tcaaccggcg ctaattgcca caacacctgc 5460 gtgaagatgc tggaattcac gtcttcatcg accatgcagc agtacttgga cgtggaggga 5520 atcaccatca gcgaacctcc ctaccactcc tttgtcattt acgggccgca aaacgcctat 5580 gagatggaaa tgcgggtgga taactacaag caggtgggca gctggtactg gcagaccgac 5640 gggatggaac tctacgaggg cgggcggatg aacaacacct ttttccactc caatgatgac 5700 gtcctgaagc tctaccacag caacgtgacg gtggataaca cggtgatctg gaagaacgag 5760 aacggtccgg tcatccagtg gggttgggcg ccgtacaaca ttgacaatgt ggtcgtcacc 5820 aacacagacg tcatccacaa ccgcatgtat tggaaggacg tcaaatacaa cacctgcatc 5880 atcaactcgt cctcccacta cgcggacatg ggctcctcca ccacggcgaa ccccgccacc 5940 acgatcagga atttccggct ggagaacatt actgtcgaag gaatgaccaa ctgcgccctc 6000 aggatctatg cgctttccaa caccgagaac atccacatca agaacctgaa tatcggaagc 6060 tggaacgggt tggaccacac gtcccaggtg agccacctga agcgctattc agacactgcc 6120 aacaacaagg tctggctggg caacgagact gtcgacagca gaggcatcaa gctcgagaac 6180 tacaccgtcg gcggggccag gatcgacaaa accacgacca actggagcga taaccaggcg 6240 ggccgtctcg gcttcgacgg cgaaaactgg gataactgga acgcgtggtg a 6291 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 attttatctc gagttatgct gtctatga 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ggcttttttt agttaagatc ttgagaca 28 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gatcgatgga tcagatctaa gcattac 27 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 atcaagcttc gaattccatg gtaccc 26 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 attttatctc gagttatgct gtctatga 28 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ggcttttttt agttaagatc ttgagaca 28 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gatcgatgga tcagatctaa gcattac 27 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 atcaagcttc gaattccatg gta 23 <210> 11 <211> 1374 <212> DNA <213> Avian influenza virus <400> 11 atgaatccaa atcagaagat catcaccatc ggcagtatat gtatggtgac gggaatagtc 60 tccttgatgt tgcagattgg caacatgatt agtatctggg tgagtcattc tattcacact 120 ggaaaccaac accaatctga acctatttca aatacaaact tcctgactga gaaagcagtg 180 gcttctgtta agttggctgg gaactcatct ttgtgtccca tcaacggttg ggccgtgtac 240 tccaaagata actctatcag gattggatct aaaggtgatg tgtttgtgat ccgtgagccc 300 ttcatctctt gttcacactt agagtgtcgt acattctttc taactcaggg tgctcttctg 360 aatgacaagc attctaacgg tactgtaaaa gatagatccc ctcatagaac cttgatgtca 420 tgtcctgtag gtgaagcacc ttcaccttat aactccagat ttgaatcagt tgcctggagt 480 gcatcagctt gtcatgatgg tacctcttgg ctgacaattg gtatttctgg ccctgataac 540 ggtgctgtcg ccgtgttaaa gtataacggt attataaccg acactattaa atcttggaga 600 aataacattt tgagaactca agaatctgaa tgtgcttgtg taaacggatc atgttttaca 660 gtcatgacag atggtccatc aaatggacag gcttctcaca agatcttcaa gatggaaaag 720 ggcaaggttg tcaaatccgt tgagcttgac gctcctaatt accattacga agaatgctcc 780 tgttatcctg atgcaggaga gatcacttgt gtttgtcgag acaattggca cgggtcaaat 840 cgaccacggg tttctttcaa ccaaaacctg gaataccaaa tcggctatat ctgttccggc 900 gtgtttggtg ataaccctcg tccaaacgac ggtactggat cttgtggtcc tgtgtcctct 960 aatggagcct acggtgtcaa aggcttttct tttaagtatg gaaacggagt atggatcgga 1020 agaactaaga gtactaactc tagatccggt ttcgagatga tctgggaccc taatggatgg 1080 acagaaaccg actcctcatt ctcagtgaag caggatattg ttgccatcac cgactggtca 1140 ggatattctg gaagttttgt tcaacacccc gaactgacag ggttggattg tatcagaccc 1200 tgtttttggg tagaactaat tagaggtaga cctaaggaat caacgatatg gacatctggt 1260 tcctccatat ctttttgcgg agtcaacagt gatacagttg gatggtcttg gcccgatggg 1320 gctgaacttc cattcacgat agataaactc gagcaccacc accaccacca ctga 1374

Claims

pET-23d 벡터의 다중 클로닝 위치(multiple cloning site)에 조류인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다제 N1 유전자가 삽입되어 있고, 도 2의 개열지도를 갖는, 대장균에서 조류인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다제 N1을 발현하기 위한 벡터.
제1항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 대장균.
제2항에 따른 형질전환된 대장균을 배양하여 배양액을 얻는 단계를 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제 N1의 생산방법.
시험관 내에서(in vitro) 조류인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다제 N1 저해 후보 물질이 조류인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다제 N1 활성에 미치는 영향을 조사하고, 뉴라미니다제 N1 활성을 저해하는 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제 N1 저해제의 스크리닝 방법.
유효성분으로서, 하기 화합물 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 에스테르를 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다제 N1 활성 저해용 조성물:

(1) 1-(3-브로모페닐)-4-{[5-(2-클로로-5-니트로페닐)-2-퓨릴]메틸렌}-3,5- 피라졸리딘디온;

(2) 6-아미노-4-(4-클로로-3-니트로페닐)-3-페닐-1,4-디하이드로피라노[2,3-c]피라졸-5-카보니트릴;

(3) 3-{2-[(4-클로로-2-메틸페녹시)아세틸]카보노하이드라조노일}페닐 4-니트로벤조에이트;

(4) 8-니트로-3-(페녹시메틸)[1,2,4]트리아졸로[3,4-b][1,3,4]벤조티아디아제핀;

(5) N-[3-(5,7-디클로로-1,3-벤족사졸-2-일)페닐]-2-니트로벤즈아미드;

(6) 3-(4-메톡시페닐)-N'-[3-(2-메톡시페닐)-2-프로펜-1-일리덴]-1H-피라졸-5-카보하이드라지드;

(7) N-1-(2-아미노에틸)-N-3-벤질-4-니트로-1,3-벤젠디아민 하이드로클로라이드;

(8) N'-(2-브로모-3-페닐-2-프로펜-1-일리덴)-4-메틸-3-페닐-1H-피라졸-5-카보하이드라지드;

(9) 4-[3-(4-클로로벤조일)-4-하이드록시-5-옥소-2-페닐-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일]부탄산:

(10) 3-하이드록시-5-(3-니트로페닐)-1-(1,3,4-티아디아졸-2-일)-4-(2-티에닐카보닐)-1,5-디하이드로-2H-피롤-2-온;

(11) 에틸 6-[(벤질티오)메틸]-4-(3-니트로페닐)-2-옥소-1,2,3,4-테트라하이드로-5-피리미딘 카복실레이트;

(12) 2-아미노-6-메틸-5-(3-니트로-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-4-페닐-4H-피란-3-카보니트릴;

(13) N-(4-{[(3-메톡시-2-피라지닐)아미노]설포닐}페닐)-3-(5-니트로-2-티에닐)아크릴아미드;

(14) N'-[(5-하이드록시-3-메틸-1-페닐-1H-피라졸-4-일)메틸렌]-2,3-디하이드로-1,4-벤조디옥신-2-카보하이드라지드;

(15) N-[3-(5,7-디메틸-1,3-벤족사졸-2-일)페닐]-3-(3-니트로페닐)아크릴아미드;

(16) 6-아미노-7-(1H-벤즈이미다졸-2-일)-5-[3-(디에틸아미노)프로필]-5H-피롤로[2,3-b]피라진-2,3-디카보니트릴;

(17) 2-[5-(4-니트로벤질리덴)-4-옥소-2-디옥소-1,3-티아졸리딘-3-일]-3-페닐프로판산;

(18) 4-{[3-(1-카복시-2-페닐에틸)-4-옥소-2-티옥소-1,3-티아졸리딘-5-일리덴]메틸}벤조산;

(19) 1-[3-(디에틸아미노)프로필]-3-하이드록시-4-(5-메틸-2-퓨로일)-5-(4-니트로페닐)-1,5-디하이드로-2H-피롤-2-온;

(20) 메틸 4-(4-하이드록시-3-니트로페닐)-2-메틸-5-옥소-7-(2-티에닐)-1,4,5,6,7,8-헥사하이드로-3-퀴놀린 카복실레이트;

(21) 소듐 5-아세틸-3-[2-(아세틸아미노)에틸]-1H-인돌-2-카복실레이트;

(22) 4,6-디메틸-1-[(4-니트로벤질리덴)아미노]-2-옥소-1,2-디하이드로-3-피 리딘 카복사미드;

(23) 1-[2-(디에틸아미노)에틸]-4-(4-플루오로벤조일)-3-하이드록시-5-(4-니트로페닐)-1,5-디하이드로-2H-피롤-2-온;

(24) N'-(2-브로모-3-페닐-2-프로펜-1-일리덴)-3-(2-나프틸)-1H-피라졸-5-카보하이드라지드;

(25) 2-{3-니트로-5-[2-(1-피롤리디닐카보닐)페녹시]-1H-1,2,4-트리아졸-1-일}아세트아미드;

(26) N'-(3,4-디하이드로-1(2H)-나프탈레닐리덴)-3-니트로벤조하이드라지드;

(27) 2-(1H-벤즈이미다졸-2-일티오)-N'-(2-니트로벤질리덴)아세토하이드라지드;

(28) 2-[(4-메틸페닐)아미노]-N'-{[5-(3-니트로페닐)-2-퓨릴]메틸렌}아세토하이드라지드;

(29) 2-[알릴(1-메틸-3-페닐프로필)아미노]-1-(3-니트로페닐)에탄올 하이드로클로라이드;

(30) 2-(1-나프틸)-N'-[(5-니트로-2-퓨릴)메틸렌]아세토하이드라지드;

(31) 3-(4-플루오로페닐)-2-(2-메틸페닐)-5-(3-니트로페닐)디하이드로-2H-피롤로[3,4-d]이속사졸-4,6(3H,5H)-디온:

(32) 4,6-디메틸-1-[(4-니트로벤질리덴)아미노]-2-옥소-1,2-디하이드로-3-피리딘 카복사미드;

(33) 4-(4-클로로벤조일)-3-하이드록시-1-메틸-5-(3-니트로페닐)-1,5-디하이 드로-2H-피롤-2-온;

(34) 2-이소프로필-5-메틸벤조-1,4-퀴논 1-[O-(3-니트로벤조일)옥심];

(35) 3-(4-에톡시페닐)-N'-[(2-메틸-1H-인돌-3-일)메틸렌]-1H-피라졸-5-카보하이드라지드;

(36) 2-[4-(3-클로로페닐)-1-피페라지닐]-5-(4-하이드록시-3-니트로벤질리덴)-1,3-티아졸-4(5H)-온;

(37) 4-[3-벤조일-4-하이드록시-2-(4-니트로페닐)-5-옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일]부탄산;

(38) 4-(4-클로로벤조일)-3-하이드록시-1-[3-(4-모르폴리닐)프로필]-5-(3-니트로페닐)-1,5-디하이드로-2H-피롤-2-온;

(39) 4-(4-클로로벤조일)-1-(4,5-디메틸-1,3-티아졸-2-일)-3-하이드록시-5-(3-니트로페닐)-1,5-디하이드로-2H-피롤-2-온;

(40) 2-(1-나프틸)-N'-[(6-니트로-1,3-벤조디옥솔-5-일)메틸렌]아세토하이드라지드;

(41) 2-이소프로필-5-메틸벤조-1,4-퀴논 1-[O-(3-니트로벤조일)옥심];

(42) N-{[(4-클로로벤질)아미노][(4,6-디메틸-2-피리미디닐)아미노]메틸렌}-4-메틸벤젠설폰아미드;

(43) N-(2,3-디하이드로-1,4-벤조디옥신-6-일)-2-{[5-(4-메틸페닐)[1,3]티아졸로[2,3-c][1,2,4]트리아졸-3-일]티오}아세트아미드;

(44) 9,9-디메틸-12-(4-메틸-3-니트로페닐)-8,9,10,12-테트라하이드로벤 조[a]아크리딘-11(7H)-온;

(45) 5-[2-(1-나프틸메톡시)-5-니트로벤질리덴]-2-티옥소-1,3-티아졸리딘-4-온;

(46) 1-(4-니트로페닐)-1H-피롤-2-카바알데히드 티오세미카바존:

(47) 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-하이드록시-4-(4-메톡시벤조일)-5-(3-니트로페닐)-1,5-디하이드로-2H-피롤-2-온;

(48) 2-[(4-클로로-3-니트로벤조일)아미노]-N-(2-퓨릴메틸)-4,5,6,7-테트라하이드로-1-벤조티오펜-3-카복사미드;

(49) 1-[2-(디메틸아미노)에틸]-3-하이드록시-4-(4-메틸벤조일)-5-(3-니트로페닐)-1,5-디하이드로-2H-피롤-2-온;

(50) 2-{3-니트로-5-[2-(1-피롤리디닐카보닐)페녹시]-1H-1,2,4-트리아졸-1-일}아세트아미드;

(51) 3-(3-메틸-4-{[5-(4-메틸-2-니트로페닐)-2-퓨릴]메틸렌}-5-옥소-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)벤조산;

(52) 6-아미노-7-(1H-벤즈아미다졸-2-일)-5-[3-(디에틸아미노)프로필]-5H-피롤로[2,3-b]피라진-2,3-디카보니트릴;

(53) 4-[(3-니트로벤질리덴)아미노]-5-(페녹시메틸)-4H-1,2,4-트리아졸-3-티올;

(54) N'-(2-브로모-3-페닐-2-프로펜-1-일리덴)-3-(2-나프틸)-1H-피라졸-5-카보하이드라지드;

(55) 에틸 7-메틸-2-(3-니트로벤질리덴)-3-옥소-5-페닐-2,3-디하이드로-5H-[1,3]티아졸로[3,2-a]피리미딘-6-카복실레이트;

(56) 4-(4-클로로벤조일)-1-(4,5-디메틸-1,3-티아졸-2-일)-3-하이드록시-5-(3-니트로페닐)-1,5-디하이드로-2H-피롤-2-온;

(57) 3-(4-클로로-3-니트로페닐)-N-[3-(5,7-디메틸-1,3-벤족사졸-2-일)페닐]아크릴아미드;

(58) 4-벤질-3-(2-퓨릴)-5-[(4-니트로벤질)티오]-4H-1,2,4-트리아졸;

(59) 에틸 7-메틸-2-[(5-메틸-2-퓨릴)메틸렌]-5-(3-니트로페닐)-3-옥소-2,3-디하이드로-5H-[1,3]트리아졸로[3,2-a]피리미딘-6-카복실레이트;

(60) 부틸 3-{[3-(4-니트로-1,3-디옥소-1,3-디하이드로-2H-이소인돌-2-일)프로파노일]아미노}벤조에이트;

(61) 2-(4-니트로페닐)-2-옥소에틸 2-(벤조일아미노)벤조에이트; 및

(62) 2-페닐에틸 7-(4-메톡시페닐)-2-메틸-4-(6-니트로-1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-옥소-1,4,5,6,7,8-헥사하이드로-3-퀴놀린 카복실레이트.