JP2023030122A - コロナウイルス、コロナウイルスを備えるワクチン、および疾患予防方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、コロナウイルス、コロナウイルスを備えるワクチン、および疾患予防方法を提供する。【解決手段】本発明の実施形態の1つには、非構造タンパク質nsp15を備えるポリタンパク質をコードする、変異レプリカーゼ遺伝子を備え、該レプリカーゼ遺伝子は、nsp15をコードし、nsp15の安定性または活性に影響を与える変異および/または欠失を含む変更を生じさせる、生でかつ弱毒である、コロナウイルスが含まれる。【選択図】なし
Description
本出願は、2017年3月3日に出願された米国特許仮出願第62/466,779号に基づく優先権の利益を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により付与された認可または契約番号第R01Al085089号、および、アメリカ合衆国農務省により付与された農業研究局プロジェクト第5050-118-11Sに基づく、アメリカ合衆国政府の支援を伴いなされたものである。
本発明はコロナウイルスに関する。より具体的には、本発明は、既存のおよび新たに出現するコロナウイルスに対するワクチンおよびワクチンの製造方法に関する。
コロナウイルスは、コロナウイルス科のコロナウイルス亜科に属するウイルスの種であり、ヒトおよび動物に感染し、呼吸器、胃腸、または神経性の疾患を発症させるプラス鎖RNAウイルスである。コロナウイルスは、保菌動物から出現して、ヒトに対して大規模な伝染病を引き起こすことが可能であり、たとえば、2002年および2003年に流行した重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(SARS-CoV)、および、中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS-CoV)などが挙げられ、2012年に出現ウイルスの一つとして認識されようになった。注目すべきことに、これらのウイルスは、侵入する病原体を検出および除去するための重要かつ生得のセンチネルとして機能すると考えられている細胞の一種である、マクロファージの細胞質において複製される。コロナウイルスは、I型インターフェロン(IFN)およびインターフェロン誘導性遺伝子(ISG)群の活性化を妨げたり遅延させたりする機能を有する複数のアンタゴニスト(拮抗物質)をコードする。一群のアンタゴニストの発現は発病の一因となる。SARS-CoVに感染したマウスを用いた最近の研究により、インターフェロンの産生の遅延および抑制が病気の一因となることが明らかにされている。
コロナウイルス疾患に対する既存のワクチンを用いた手段は、自発性の自然減衰、ウイルスの不活化、および、発現ベクターを介した組み換えウイルス構造タンパク質に基礎を置いている。既存のワクチン候補は、強力な防御免疫反応を引き出さない。長期間にわたる保護が実現できないことが、適応免疫および免疫記憶を促進するための重要な分子であるI型インターフェロンなどの自然免疫応答の非効率な誘導に起因している可能性がある。
このことから、コロナウイルス感染症を治療する継続的な需要があり、かつ、強い自然免疫応答および効果的な適応性のある免疫保護の両者を刺激できるワクチンを含む、ヒト対象に接種可能であるコロナウイルスに対するワクチンが要望されていると認められる。
本発明は、変異コロナウイルス、変異コロナウイルスを備えるワクチン、ワクチンの製造方法、および、ヒト対象の疾患を予防する方法を提供する。
本発明の一態様によれば、非構造タンパク質(nsp)-15を備えるポリタンパク質をコードする変異型レプリカーゼ遺伝子を含む、弱毒化された生コロナウイルスが提供される。該レプリカーゼ遺伝子は、nsp15をコードし、nsp15の安定性または活性に影響を与える変異および/または欠失を含む変更を生じさせる。
本発明のその他の態様は、前記コロナウイルスを備える変異型レプリカーゼ遺伝子、かかる変異型レプリカーゼ遺伝子によりコードされるタンパク質、かかる変異型レプリカーゼ遺伝子を備えるプラスミド、前記コロナウイルスを備えるワクチン、および、かかるワクチンをヒト対象に投与することによりヒト対象の疾患を治療または予防するための方法を含む。
本発明の別の態様によれば、ヒト対象のI型インターフェロンを活性化させることにより、コロナウイルスの病原性を低減させることを含む、ヒト対象の疾患を防止する方法が提供される。
本発明の別の態様によれば、野生型コロナウイルスを変性させて、ポリタンパク質をコードし、非構造タンパク質(nsp)-15の安定性または活性に影響を与える、nsp15における変異および/または欠失を含む変更を生じさせる、変異型レプリカーゼ遺伝子を備える、弱毒化された生コロナウイルスを製造することを含む、ワクチンの製造方法が提供される。前記コロナウイルスおよびキャリアを含むワクチンが製造可能である。該ワクチンをヒト対象に投与することにより、ヒト対象のI型インターフェロンが活性化され、前記野生型コロナウイルスの病原性を低減させることができる。
上述したコロナウイルスの技術的効果は、ウイルスの複製、拡散、およびウイルス性疾患を制限する、I型インターフェロンを活性化させるコロナウイルスをヒト対象に接種させる能力を含むことが好ましい。
本発明のその他の態様および利点は、以下の詳細な説明により明らかにされる。
[図1]
図1A~図1Dは、非構造タンパク質15および保存残基トレオニン98(T98)をハイライトしたマウスコロナウイルスゲノムの模式図を含む。図1Aは、マウス肝炎ウイルス(MHV)A59(MHV-A59)ゲノムの模式図である。PLP1/2:パパイン様プロテアーゼ1/2、ADRP:ADP-リボース-1′-モノホスファターゼ、3CLpro:3C様プロテアーゼ、RDRP:RNA依存性RNAポリメラーゼ、Hel:ヘリカーゼ、ExoN:3′→5′エキソヌクレアーゼ、NendoU:ニドウイルスウリジル酸特異エンドリボヌクレアーゼ、2′OMT:リボース-2′-O-メチルトランスフェラーゼ、である。図1Bは、nsp15の結晶構造を示し、Nドメイン、Mドメイン、Cドメインは90度回転して示されている。T98は、L57(Nドメイン)および触媒残基(Cドメイン)に関連して示される。タンパク質データベースIDは、2GTHである。図1Cは、各コロナウイルスの遺伝子型における変異部位と、ウイルス感染した骨髄由来マクロファージ(BMDM)におけるI型インターフェロンの誘導を示す。図1Dは、ClustalW(クラスタルダブル)を用いたコロナウイルスのサブグループの代表株群からのnsp15 T98領域の配列アライメントを示す。
図1A~図1Dは、非構造タンパク質15および保存残基トレオニン98(T98)をハイライトしたマウスコロナウイルスゲノムの模式図を含む。図1Aは、マウス肝炎ウイルス(MHV)A59(MHV-A59)ゲノムの模式図である。PLP1/2:パパイン様プロテアーゼ1/2、ADRP:ADP-リボース-1′-モノホスファターゼ、3CLpro:3C様プロテアーゼ、RDRP:RNA依存性RNAポリメラーゼ、Hel:ヘリカーゼ、ExoN:3′→5′エキソヌクレアーゼ、NendoU:ニドウイルスウリジル酸特異エンドリボヌクレアーゼ、2′OMT:リボース-2′-O-メチルトランスフェラーゼ、である。図1Bは、nsp15の結晶構造を示し、Nドメイン、Mドメイン、Cドメインは90度回転して示されている。T98は、L57(Nドメイン)および触媒残基(Cドメイン)に関連して示される。タンパク質データベースIDは、2GTHである。図1Cは、各コロナウイルスの遺伝子型における変異部位と、ウイルス感染した骨髄由来マクロファージ(BMDM)におけるI型インターフェロンの誘導を示す。図1Dは、ClustalW(クラスタルダブル)を用いたコロナウイルスのサブグループの代表株群からのnsp15 T98領域の配列アライメントを示す。
[図2]
図2A~図2Dは、MHVnsp15変異ウイルスが、I型インターフェロンの発現を活性化し、および、BMDMにおける複製が損なわれることを示す。図2Aは、定量RT-PCRにより、野生型(WT)MHVまたはN15m1に感染したBMDMにおけるIFN-α11mRNAレベルを示す。値は、βアクチンにより標準化され、独立T検定を用いて分析された。図2Bは、定量ELISA法によって検出された、感染したBMDMの上清中における分泌されたIFNαタンパク質レベルを示す。値は、2元配置分散分析テストを用いて分析された。図2Cおよび図2Dは、B6BMDMおよびifnar-/-BMDMにおけるWTおよびN15m1の増殖速度をそれぞれ示す(MOI(感染多重度)=0.1)。表示されたhpi(感染後時間)において上清のウイルスを収集し、17Cl-1細胞を用いたプラークアッセイによってウイルス価を判定した。値は、独立T検定を用いて分析された。データは2~3の独立した実験の代表であり、平均±SDで示されている。
図2A~図2Dは、MHVnsp15変異ウイルスが、I型インターフェロンの発現を活性化し、および、BMDMにおける複製が損なわれることを示す。図2Aは、定量RT-PCRにより、野生型(WT)MHVまたはN15m1に感染したBMDMにおけるIFN-α11mRNAレベルを示す。値は、βアクチンにより標準化され、独立T検定を用いて分析された。図2Bは、定量ELISA法によって検出された、感染したBMDMの上清中における分泌されたIFNαタンパク質レベルを示す。値は、2元配置分散分析テストを用いて分析された。図2Cおよび図2Dは、B6BMDMおよびifnar-/-BMDMにおけるWTおよびN15m1の増殖速度をそれぞれ示す(MOI(感染多重度)=0.1)。表示されたhpi(感染後時間)において上清のウイルスを収集し、17Cl-1細胞を用いたプラークアッセイによってウイルス価を判定した。値は、独立T検定を用いて分析された。データは2~3の独立した実験の代表であり、平均±SDで示されている。
[図3]
図3A~図3Dは、MHV nsp15変異ウイルスが、BMDMにおける急速なアポトーシス細胞死を誘導することを示す。図3Aは、BMDMがWT、N15m1、または紫外線で不活性化したN15m1(UV-N15m1)のMHVにそれぞれ感染したことを示す。24hpi(感染後24時間)における、ウイルスに感染したBMDMの細胞生存率は、CellTiterGloアッセイを用いて定量化された。値は、独立T検定を用いて分析された。図3Bは、BMDMがWTまたはN15m1のMHVに感染し、その後、DMSO(ジメチルスルホキシド)、zVAD(20μM)、ネクロスタチン-1(Nec-1)(25μM)、またはVX-765(20μM)のいずれかによって処理されたことを示す。細胞生存率は、24hpiにCellTiterGloアッセイによって計測された。値は、独立T検定を用いて分析された。図3Cは、BMDMにWTまたはN15m1のMHVを接種し、培地にzVAD(20μM)が追加されたことを示す。24hpiにおけるカスパーゼ3/7活性が、カスパーゼ3/7―Glo活性化アッセイによって判定された。値は、相対発光量(RLU)で示され、2元配置分散分析テストを用いて分析された。図3Dは、BMDMがWTまたはN15m1のMHVに感染し、表示された時点ごとに細胞溶解物を回収したことを示す。切断されたカスパーゼ3およびNタンパク質のウエスタンブロット試験の結果を示す。すべての感染はMOI=0.1におけるものである。データは、2~3の独立した実験を代表するものであり、平均値±SDとして表される。
図3A~図3Dは、MHV nsp15変異ウイルスが、BMDMにおける急速なアポトーシス細胞死を誘導することを示す。図3Aは、BMDMがWT、N15m1、または紫外線で不活性化したN15m1(UV-N15m1)のMHVにそれぞれ感染したことを示す。24hpi(感染後24時間)における、ウイルスに感染したBMDMの細胞生存率は、CellTiterGloアッセイを用いて定量化された。値は、独立T検定を用いて分析された。図3Bは、BMDMがWTまたはN15m1のMHVに感染し、その後、DMSO(ジメチルスルホキシド)、zVAD(20μM)、ネクロスタチン-1(Nec-1)(25μM)、またはVX-765(20μM)のいずれかによって処理されたことを示す。細胞生存率は、24hpiにCellTiterGloアッセイによって計測された。値は、独立T検定を用いて分析された。図3Cは、BMDMにWTまたはN15m1のMHVを接種し、培地にzVAD(20μM)が追加されたことを示す。24hpiにおけるカスパーゼ3/7活性が、カスパーゼ3/7―Glo活性化アッセイによって判定された。値は、相対発光量(RLU)で示され、2元配置分散分析テストを用いて分析された。図3Dは、BMDMがWTまたはN15m1のMHVに感染し、表示された時点ごとに細胞溶解物を回収したことを示す。切断されたカスパーゼ3およびNタンパク質のウエスタンブロット試験の結果を示す。すべての感染はMOI=0.1におけるものである。データは、2~3の独立した実験を代表するものであり、平均値±SDとして表される。
[図4]
図4A~図4Dは、MHVnsp15変異ウイルスの感染が、ホストのdsRNA(二重鎖リボ核酸)センサを活性化させることを示す。図4Aは、BMDMがWTまたはN15m1のMHV(MOI=0.1)に感染したことを示す。16hpiにおいて、細胞を溶解し、40μgの細胞溶解物について、ホスホ(p)-elF2α、elF2α、およびウイルス性Nタンパク質の検出をウエスタンブロットにより行った。カルネキシンは、ローディング管理として機能する。図4Bは、PKR(RNA活性化プロテインキナーゼ)阻害物質が、B6BMDMにおけるN15m1による誘導アポトーシスを阻止することを示す。細胞は、WTまたはN15m1(MOI=0.1)に感染し、その後、PKE阻害剤C16(1μM)で処理された。細胞を収集し、表示時点ごとに、カスパーゼ3/7活性について評価した。値は、相対発光量(RLU)で示され、2元配置分散分析テストを用いて分析された。図4Cは、バイオアナライザ(MOI=1)を用いた、感染したBMDMから抽出した全RNA300ngのRNA分解パターンを示す。RIN(RNA integrity number)、並びに、28S、18S、rRNA、およびtRNAの位置は、図面の下部と右側にそれぞれ示した。図4Dは、18hpiにおいてC16阻害剤(1μM)またはzVAD(20μM)で処理した、感染したBMDM(MOI=0.1)から得たRNAのRNA分解パターンを示す。データは2~3の独立した実験の代表である。
図4A~図4Dは、MHVnsp15変異ウイルスの感染が、ホストのdsRNA(二重鎖リボ核酸)センサを活性化させることを示す。図4Aは、BMDMがWTまたはN15m1のMHV(MOI=0.1)に感染したことを示す。16hpiにおいて、細胞を溶解し、40μgの細胞溶解物について、ホスホ(p)-elF2α、elF2α、およびウイルス性Nタンパク質の検出をウエスタンブロットにより行った。カルネキシンは、ローディング管理として機能する。図4Bは、PKR(RNA活性化プロテインキナーゼ)阻害物質が、B6BMDMにおけるN15m1による誘導アポトーシスを阻止することを示す。細胞は、WTまたはN15m1(MOI=0.1)に感染し、その後、PKE阻害剤C16(1μM)で処理された。細胞を収集し、表示時点ごとに、カスパーゼ3/7活性について評価した。値は、相対発光量(RLU)で示され、2元配置分散分析テストを用いて分析された。図4Cは、バイオアナライザ(MOI=1)を用いた、感染したBMDMから抽出した全RNA300ngのRNA分解パターンを示す。RIN(RNA integrity number)、並びに、28S、18S、rRNA、およびtRNAの位置は、図面の下部と右側にそれぞれ示した。図4Dは、18hpiにおいてC16阻害剤(1μM)またはzVAD(20μM)で処理した、感染したBMDM(MOI=0.1)から得たRNAのRNA分解パターンを示す。データは2~3の独立した実験の代表である。
[図5]
図5A~図5Dは、T98Mの変異が、nsp15タンパク質の不安定性を生じさせることを示す。図5Aは、MOI=0.1における、WTまたはN15m1のウイルスに感染したBMDMを、16hpiにおいて溶解し、ウイルス性Nタンパク質、nsp15、およびβアクチンが、ウエスタンブロット法によって検出した結果を示す。図5Bは、大腸菌から発現し精製された、WTのnsp15とT98M変異のnsp15を示す。クーマシーブルー染色は、ウエスタンブロット法(下部)を用いてnsp15抗体に検出された、精製されたSUMOタグ付きnsp15およびT98Mを示す。図5Cは、野生型nsp15タンパク質(黒色)およびnsp15-T98M変異タンパク質(赤色)についての示差走査蛍光定量法(DSF)熱シフト分析を示す。図5Dは、5mMのMn2+存在下における、野生型(WT)のnsp15またはT98Mを用いて時間をかけて処理された、放射標識されたRNA分子であるR16.4を示す。表示時点ごとに、一定分量の反応を変性20%ポリアクリルアミドゲル上で分析した。RNA R16.4の配列を、ゲル画像の上部に示す。位置13に存在する唯一のウリジラートに下線を引いた。データは2~3の独立した実験の代表である。
図5A~図5Dは、T98Mの変異が、nsp15タンパク質の不安定性を生じさせることを示す。図5Aは、MOI=0.1における、WTまたはN15m1のウイルスに感染したBMDMを、16hpiにおいて溶解し、ウイルス性Nタンパク質、nsp15、およびβアクチンが、ウエスタンブロット法によって検出した結果を示す。図5Bは、大腸菌から発現し精製された、WTのnsp15とT98M変異のnsp15を示す。クーマシーブルー染色は、ウエスタンブロット法(下部)を用いてnsp15抗体に検出された、精製されたSUMOタグ付きnsp15およびT98Mを示す。図5Cは、野生型nsp15タンパク質(黒色)およびnsp15-T98M変異タンパク質(赤色)についての示差走査蛍光定量法(DSF)熱シフト分析を示す。図5Dは、5mMのMn2+存在下における、野生型(WT)のnsp15またはT98Mを用いて時間をかけて処理された、放射標識されたRNA分子であるR16.4を示す。表示時点ごとに、一定分量の反応を変性20%ポリアクリルアミドゲル上で分析した。RNA R16.4の配列を、ゲル画像の上部に示す。位置13に存在する唯一のウリジラートに下線を引いた。データは2~3の独立した実験の代表である。
[図6]
図6A~図6Dは、N15m3ウイルス(nsp15-H262A)が、インターフェロン拮抗作用の不在下において、N15m1ウイルスの表現型模写を行うことを示す。図6Aは、BMDMがWTまたはnsp15変異ウイルス(N15m1またはN15m3)に感染したことを示す(MOI=0.1)。12hpiにおいて、すべてのRNAを抽出して、IFN-α11mRNAレベルについて分析した。値は、平均±SDとして示され、独立T検定を用いて分析された。図6Bは、B6またはifnar-/-BMDMが、WTまたはN15m3に感染したことを示す(MOI=0.1)。表示時点ごとに、17CL-1細胞におけるプラークアッセイのために細胞上清を収集した。値は、平均±SDとして示され、独立T検定を用いて分析された。図6Cは、B6BMDMがWTまたはN15m3に感染し(MOI=0.1)、表示時点ごとに収集され、カスパーゼ3/7活性の分析を行った結果を示す。値は、平均±SDとして示され、独立T検定を用いて分析された。図6Dは、感染したBMDMからバイオアナライザ(MOI=0.1)を用いて抽出した、500ngの全RNAのRNA分解パターンを示す。RINを底部に示し、28Sと18SのrRNAの位置は、図面にそれぞれ矢印で示した。データは2~3の独立した実験の代表である。
図6A~図6Dは、N15m3ウイルス(nsp15-H262A)が、インターフェロン拮抗作用の不在下において、N15m1ウイルスの表現型模写を行うことを示す。図6Aは、BMDMがWTまたはnsp15変異ウイルス(N15m1またはN15m3)に感染したことを示す(MOI=0.1)。12hpiにおいて、すべてのRNAを抽出して、IFN-α11mRNAレベルについて分析した。値は、平均±SDとして示され、独立T検定を用いて分析された。図6Bは、B6またはifnar-/-BMDMが、WTまたはN15m3に感染したことを示す(MOI=0.1)。表示時点ごとに、17CL-1細胞におけるプラークアッセイのために細胞上清を収集した。値は、平均±SDとして示され、独立T検定を用いて分析された。図6Cは、B6BMDMがWTまたはN15m3に感染し(MOI=0.1)、表示時点ごとに収集され、カスパーゼ3/7活性の分析を行った結果を示す。値は、平均±SDとして示され、独立T検定を用いて分析された。図6Dは、感染したBMDMからバイオアナライザ(MOI=0.1)を用いて抽出した、500ngの全RNAのRNA分解パターンを示す。RINを底部に示し、28Sと18SのrRNAの位置は、図面にそれぞれ矢印で示した。データは2~3の独立した実験の代表である。
[図7]
図7Aおよび図7Bは、nsp15の変異が、ウイルス感染したBMDMにおけるdsRNA分布に影響を与えることを示す。図7Aおよび図7Bにおいて、BMDMは、WTまたはN15m3に感染した(MOI=0.1)。細胞を6hpiにおいて固定し、抗dsRNA、抗nsp2/3、およびHoechst33342を用いて(図7A)、または、抗dsRNA、抗nsp15、およびHoechst33342を用いて(図7B)、それぞれ染色した。dsRNA蛍光に基づき、斑点を有する表面が形成され、それぞれの表面内においてnsp蛍光が計測された。25点の画像における蛍光輝点の数は、IMARISソフトウェアプログラムを用いて計測された。dsRNA/nsp2/3の比は、総dsRNA蛍光輝点の数をnsp2/3蛍光輝点の数で除することにより算出した(図7A)。dsRNAとのnsp15の共局在率は、dsRNA+nsp15+の蛍光輝点を、総dsRNA蛍光輝点で除することにより算出した。値は、独立T検定によって分析された。スケールバーは、5μMである。
図7Aおよび図7Bは、nsp15の変異が、ウイルス感染したBMDMにおけるdsRNA分布に影響を与えることを示す。図7Aおよび図7Bにおいて、BMDMは、WTまたはN15m3に感染した(MOI=0.1)。細胞を6hpiにおいて固定し、抗dsRNA、抗nsp2/3、およびHoechst33342を用いて(図7A)、または、抗dsRNA、抗nsp15、およびHoechst33342を用いて(図7B)、それぞれ染色した。dsRNA蛍光に基づき、斑点を有する表面が形成され、それぞれの表面内においてnsp蛍光が計測された。25点の画像における蛍光輝点の数は、IMARISソフトウェアプログラムを用いて計測された。dsRNA/nsp2/3の比は、総dsRNA蛍光輝点の数をnsp2/3蛍光輝点の数で除することにより算出した(図7A)。dsRNAとのnsp15の共局在率は、dsRNA+nsp15+の蛍光輝点を、総dsRNA蛍光輝点で除することにより算出した。値は、独立T検定によって分析された。スケールバーは、5μMである。
[図8]
図8A~図8Gは、MHV nsp15変異ウイルスが、マウスにおいては非常に弱毒であり、防御免疫反応を誘導することを示す。図8Aは、WTまたはN15m1ウイルスに感染したマウスの臓器におけるウイルス負荷を示す。生後6週のC57BL/6Jマウス(n=4)に、6.0×104PFRウイルスを腹腔内接種した。表示時点ごとに、肝臓および脾臓を摘出し、プラークアッセイによりウイルス価をテストした。赤色の破線は、検出限界を示す。図8Bは、C57BL/6Jマウスに、6.0×104PFUウイルスを腹腔内接種したしたことを示す。24hpiに、腸間膜リンパ節(MLN)を摘出し、ウイルスゲノムを、N遺伝子を標的とする定量RT-PCRによって計測した。値は、βアクチンに標準化される。***、p<0.001、独立T検定。図8Cは、WTおよびN15m1に感染したマウスにおける、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色による肝病理を、矢印で示す。データは、マウス5匹の代表である。図8Dおよび図8Eは、600PFUのWTまたはN15m1ウイルスを頭蓋内(IC)注射によりマウスに接種した結果を示す。ウイルスの病原性について、体重減少率(図8D)および生存率(図8E)によって計測した。図8Fおよび図8Gにおいて、生後13週の生まれたままのマウスと、図8DでN15m1に感染したマウスに対し、6.0×103PFUのWTウイルスを頭蓋内(IC)注射した。ウイルスの病原性は、体重減少率(図8F)および生存率(図8G)によって計測した。マウスの数(n)を図示した。生存率のp値は、ログランク検定を用いて算出した。
図8A~図8Gは、MHV nsp15変異ウイルスが、マウスにおいては非常に弱毒であり、防御免疫反応を誘導することを示す。図8Aは、WTまたはN15m1ウイルスに感染したマウスの臓器におけるウイルス負荷を示す。生後6週のC57BL/6Jマウス(n=4)に、6.0×104PFRウイルスを腹腔内接種した。表示時点ごとに、肝臓および脾臓を摘出し、プラークアッセイによりウイルス価をテストした。赤色の破線は、検出限界を示す。図8Bは、C57BL/6Jマウスに、6.0×104PFUウイルスを腹腔内接種したしたことを示す。24hpiに、腸間膜リンパ節(MLN)を摘出し、ウイルスゲノムを、N遺伝子を標的とする定量RT-PCRによって計測した。値は、βアクチンに標準化される。***、p<0.001、独立T検定。図8Cは、WTおよびN15m1に感染したマウスにおける、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色による肝病理を、矢印で示す。データは、マウス5匹の代表である。図8Dおよび図8Eは、600PFUのWTまたはN15m1ウイルスを頭蓋内(IC)注射によりマウスに接種した結果を示す。ウイルスの病原性について、体重減少率(図8D)および生存率(図8E)によって計測した。図8Fおよび図8Gにおいて、生後13週の生まれたままのマウスと、図8DでN15m1に感染したマウスに対し、6.0×103PFUのWTウイルスを頭蓋内(IC)注射した。ウイルスの病原性は、体重減少率(図8F)および生存率(図8G)によって計測した。マウスの数(n)を図示した。生存率のp値は、ログランク検定を用いて算出した。
[図9]
図9Aおよび図9Bは、ブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)EndoU欠損変異が、感染したブタのマクロファージ内におけるI型インターフェロンを増強させることを示す。図9Aは、野生型PEDV(icPEDV)およびPEDV nsp15変異ウイルス(icPEDV-deEndoU)の感染性クローンの模式図である。図9Bは、0.1プラーク形成ユニット/細胞のicPEDVまたはicPEDV-deEndoUに、ベロ細胞が感染したことを示す。表示時点ごとに、ウイルス滴定のために細胞上清を収集した。データは、icPEDVおよびicPEDV-deEndoUのいずれもベロ細胞において効率的に増殖し、同等の増殖速度であったことを示す。図9Cは、生まれたままのブタ肺胞マクロファージ(PAM)がicPEDVまたはicPEDV-deEndoUウイルスのいずれかに感染し、表示時点ごとに採取されたことを示す。採取された細胞から全RNAを抽出し、cDNAに転写した。I型インターフェロン(IFN-αおよびIFN-β)の生産は、定量PCRを用いたmRNAレベルを検査することにより評価した。データは、PEDV-deEndoU変異ウイルスは、野生型PEDV感染と比較すると、非常に高レベルでI型IFN生産を刺激することを示す(N.D.は、非検出を意味する)。
図9Aおよび図9Bは、ブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)EndoU欠損変異が、感染したブタのマクロファージ内におけるI型インターフェロンを増強させることを示す。図9Aは、野生型PEDV(icPEDV)およびPEDV nsp15変異ウイルス(icPEDV-deEndoU)の感染性クローンの模式図である。図9Bは、0.1プラーク形成ユニット/細胞のicPEDVまたはicPEDV-deEndoUに、ベロ細胞が感染したことを示す。表示時点ごとに、ウイルス滴定のために細胞上清を収集した。データは、icPEDVおよびicPEDV-deEndoUのいずれもベロ細胞において効率的に増殖し、同等の増殖速度であったことを示す。図9Cは、生まれたままのブタ肺胞マクロファージ(PAM)がicPEDVまたはicPEDV-deEndoUウイルスのいずれかに感染し、表示時点ごとに採取されたことを示す。採取された細胞から全RNAを抽出し、cDNAに転写した。I型インターフェロン(IFN-αおよびIFN-β)の生産は、定量PCRを用いたmRNAレベルを検査することにより評価した。データは、PEDV-deEndoU変異ウイルスは、野生型PEDV感染と比較すると、非常に高レベルでI型IFN生産を刺激することを示す(N.D.は、非検出を意味する)。
[図10]
図10Aおよび10Bは、N15m1がIFN活性化を誘導するが、N3mウイルスはIFN活性化を誘導しないことを示す。図10Aは、BMDMがWTまたはN15m1のMHVに感染したことを示す(MOI=0.1)。12hpiにおいて、感染した細胞を4%ホルムアルデヒドで固定し、Hoechst33342(核;青色)、抗ヌクレオカプシド(N;赤色)、および抗ISG54(緑色)で染色した。共焦点顕微鏡によって免疫蛍光を検出した。図10Bは、BMDMが、WT、N3m、またはN15m1のMHVに感染したことを示す(MOI=0.1)。IFN-α11 mRNAレベルは、12hpiにおいて定量RT-PCRによって判定された。値は、βアクチンに標準化された。n.s.は、有意でないことを示す。独立T検定が用いられた。
図10Aおよび10Bは、N15m1がIFN活性化を誘導するが、N3mウイルスはIFN活性化を誘導しないことを示す。図10Aは、BMDMがWTまたはN15m1のMHVに感染したことを示す(MOI=0.1)。12hpiにおいて、感染した細胞を4%ホルムアルデヒドで固定し、Hoechst33342(核;青色)、抗ヌクレオカプシド(N;赤色)、および抗ISG54(緑色)で染色した。共焦点顕微鏡によって免疫蛍光を検出した。図10Bは、BMDMが、WT、N3m、またはN15m1のMHVに感染したことを示す(MOI=0.1)。IFN-α11 mRNAレベルは、12hpiにおいて定量RT-PCRによって判定された。値は、βアクチンに標準化された。n.s.は、有意でないことを示す。独立T検定が用いられた。
[図11]
図11Aおよび図11Bは、N15m1が急速なアポトーシス細胞死を誘導することを示す。図11Aは、B6 BMDMが、WT、N15m11、または紫外線で不活性化されたN15m1(UV-N15m1)のMHVに感染したことを示す。24hpiにおいて、明視野顕微鏡のもとで細胞変性効果が確認された。図11Bは、スタウロスポリン(1μM)で処理され、WTまたはN15m1のMHVに感染した、BMDMにおいて、16hpiにおいてアポトーシスが生じていることが、電子顕微鏡により観察された核クロマチン(黒色矢印)の凝縮により確認されたことを示す。
図11Aおよび図11Bは、N15m1が急速なアポトーシス細胞死を誘導することを示す。図11Aは、B6 BMDMが、WT、N15m11、または紫外線で不活性化されたN15m1(UV-N15m1)のMHVに感染したことを示す。24hpiにおいて、明視野顕微鏡のもとで細胞変性効果が確認された。図11Bは、スタウロスポリン(1μM)で処理され、WTまたはN15m1のMHVに感染した、BMDMにおいて、16hpiにおいてアポトーシスが生じていることが、電子顕微鏡により観察された核クロマチン(黒色矢印)の凝縮により確認されたことを示す。
[図12]
図12Aおよび図12Bは、N15m1の誘導によるアポトーシスは、PKR阻害剤C16によって阻止され、I型IFN受容体が必要であることを示す。図12Aは、B6 BMDMが、WTまたはN15m1に感染したことを示す(MOI=0.1)。細胞変性効果および細胞生存率を、18hpiにおいて評価した。****、p<0.0001、独立T検定。図12Bは、B6またはifnar-/-BMDMが、WTまたはN15m1に感染したことを示す(MOI=0.1)。カスパーゼ3/7活性は、18hpiにおいて、カスパーゼ3/7―Gloアッセイによって計測した。****、p<0.00001、2元配置分散分析テスト。データは、2~3の独立した実験の代表である。図12Bに示したデータは、相対発光量(RLU)および平均±SDで表される。
図12Aおよび図12Bは、N15m1の誘導によるアポトーシスは、PKR阻害剤C16によって阻止され、I型IFN受容体が必要であることを示す。図12Aは、B6 BMDMが、WTまたはN15m1に感染したことを示す(MOI=0.1)。細胞変性効果および細胞生存率を、18hpiにおいて評価した。****、p<0.0001、独立T検定。図12Bは、B6またはifnar-/-BMDMが、WTまたはN15m1に感染したことを示す(MOI=0.1)。カスパーゼ3/7活性は、18hpiにおいて、カスパーゼ3/7―Gloアッセイによって計測した。****、p<0.00001、2元配置分散分析テスト。データは、2~3の独立した実験の代表である。図12Bに示したデータは、相対発光量(RLU)および平均±SDで表される。
[図13]
図13は、T98M変異が、nsp15のオリゴマー化を変更させることを示す。動的光散乱法により、WTおよびT98M nsp15の濃度を増加させながら、モノマーとヘキサマーの割合を評価した。
図13は、T98M変異が、nsp15のオリゴマー化を変更させることを示す。動的光散乱法により、WTおよびT98M nsp15の濃度を増加させながら、モノマーとヘキサマーの割合を評価した。
[図14]
図14Aおよび図14Bは、N15m3が、B6 BMDMにおいて急速な細胞死を誘導することを示す。B6 BMDMは、WT、N15m1、またはN15m3のウイルスに感染した(MOI=0.1)。図14Aは、CellTiterGloアッセイを用いて判定した、24hpiにおける細胞生存率を示す。図14Bは、12hpiにおいて細胞を採取し、20ugの全溶解液を用いて行った、nsp15、Nタンパク質、およびローディングコントロール(βアクチン)の検出結果を示す。
図14Aおよび図14Bは、N15m3が、B6 BMDMにおいて急速な細胞死を誘導することを示す。B6 BMDMは、WT、N15m1、またはN15m3のウイルスに感染した(MOI=0.1)。図14Aは、CellTiterGloアッセイを用いて判定した、24hpiにおける細胞生存率を示す。図14Bは、12hpiにおいて細胞を採取し、20ugの全溶解液を用いて行った、nsp15、Nタンパク質、およびローディングコントロール(βアクチン)の検出結果を示す。
[図15]
図15Aおよび図15Bは、nsp15のエンドヌクレアーゼ活性は、感染したBMDMにおけるdsRNA量を変化させないことを示す。B6(図15A)またはifnar-/-BMDM(図15B)は、WTまたはN15m3のウイルスに感染した(MOI=0.1)。6hpiにおいて、細胞にdsRNA用の染色を施し、流動細胞計測法によって分析した。
図15Aおよび図15Bは、nsp15のエンドヌクレアーゼ活性は、感染したBMDMにおけるdsRNA量を変化させないことを示す。B6(図15A)またはifnar-/-BMDM(図15B)は、WTまたはN15m3のウイルスに感染した(MOI=0.1)。6hpiにおいて、細胞にdsRNA用の染色を施し、流動細胞計測法によって分析した。
[図16]
図16Aおよび図16Bは、nsp15が、感染したBMDMにおけるdsRNAの分布に影響を与えることを示す。BMDMは、WTまたはN15m3に感染した(MOI=0.1)。細胞を6hpiで固定し、抗dsRNA、抗nsp2/3、およびHoechst33342で染色した。25点の画像から、IMARISソフトウェアプログラムを用いて蛍光輝点数をカウントした。図16Aは、ifnar-/-BMDMにおける、dsRNAおよびnsp2/3の蛍光輝点数を示す。図16Bは、B6 BMDMにおける、dsRNAおよびnsp2/3の局在性を示す。dsRNAおよびnsp2/3の蛍光輝点をカウントし、dsRNA/nsp2/3の比は、総dsRNA蛍光輝点数をnsp2/3蛍光輝点数で除することにより算出した(図16A)。値は、独立T検定によって分析された。スケールバーは、5μMである。
図16Aおよび図16Bは、nsp15が、感染したBMDMにおけるdsRNAの分布に影響を与えることを示す。BMDMは、WTまたはN15m3に感染した(MOI=0.1)。細胞を6hpiで固定し、抗dsRNA、抗nsp2/3、およびHoechst33342で染色した。25点の画像から、IMARISソフトウェアプログラムを用いて蛍光輝点数をカウントした。図16Aは、ifnar-/-BMDMにおける、dsRNAおよびnsp2/3の蛍光輝点数を示す。図16Bは、B6 BMDMにおける、dsRNAおよびnsp2/3の局在性を示す。dsRNAおよびnsp2/3の蛍光輝点をカウントし、dsRNA/nsp2/3の比は、総dsRNA蛍光輝点数をnsp2/3蛍光輝点数で除することにより算出した(図16A)。値は、独立T検定によって分析された。スケールバーは、5μMである。
[図17]
図17Aおよび図17Bは、nsp15変異ウイルスが、C57BL/6マウスにおいては弱毒であるが、ifnar-/-マウスにおいては弱毒化されないことを示す。生後6週のC57BL/6マウス(n=5)に、6.0×104PFUウイルスを腹腔内接種した。5dpi(感染後5日)において、H&E染色によって肝病理を判定した(図17A)。3dpiおよび5dpiにおいて肝臓を摘出し、17Cl-1細胞を用いたプラークアッセイによってウイルス価を測定した。赤色の破線は検出限界を示す。
図17Aおよび図17Bは、nsp15変異ウイルスが、C57BL/6マウスにおいては弱毒であるが、ifnar-/-マウスにおいては弱毒化されないことを示す。生後6週のC57BL/6マウス(n=5)に、6.0×104PFUウイルスを腹腔内接種した。5dpi(感染後5日)において、H&E染色によって肝病理を判定した(図17A)。3dpiおよび5dpiにおいて肝臓を摘出し、17Cl-1細胞を用いたプラークアッセイによってウイルス価を測定した。赤色の破線は検出限界を示す。
本発明は、変異コロナウイルス、変異コロナウイルスを備えるワクチン、ワクチンの製造方法、および、疾患の予防方法を提供する。
dsRNA(二重鎖RNA)中間体を介して複製されるRNAウイルスは、細胞質のRIG様受容体(RLR)を含む、ホストのdsRNAセンサによって「非自己」であるとして検出される。RIG様受容体の活性化は、PKR(プロテインキナーゼR)およびOAS(2′,5′-オリゴアデニル酸シンテターゼ)/RNase(リボヌクレアーゼ)Lシステムなどの追加的なdsRNAを増加させるインターフェロンと、数百の抗ウイルスインターフェロン誘導遺伝子(ISG)の生産を刺激する。さらに、dsRNAを感知する、ウイルスに感染した細胞から分泌されたインターフェロンは、隣接する細胞内において抗ウイルス状態を誘導し、侵入の可能性があるRNAウイルスの複製を制限する。このため、多くのウイルスは、ホストセンサによる検出を逃れるためにdsRNAを隔離する戦略を進化させている。本明細書では、これまで認識されずにいた、マクロファージ内におけるdsRNAセンサの活性化を阻害するコロナウイルスのnsp(非構造タンパク質)15の役割を開示し、子ウイルスの複製および播種を可能にするものである。
インターフェロン応答のコロナウイルス拮抗作用を調査するための、本発明に至る調査では、マクロファージを含む複数のマウス細胞タイプにおいて複製し、投与部位に応じて急性肝炎または致死的な脳炎を引き起こす、典型的なコロナウイルスである、マウス肝炎ウイルス株A59(MHV-A59)をテストした。ウイルスゲノムRNAは32キロベースであり、ゲノムの3分の2は大きなレプリカーゼポリタンパク質をコードし、残りのゲノムは構造タンパク質および株特異的補助タンパク質をコードする(図1A)。レプリカーゼポリタンパク質は、ウイルスプロテアーゼによって16の非構造タンパク質(nsp)に変換される。ウイルスnspは、ホスト小胞体とともに、ウイルスRNA合成の部位である回旋状の膜組織と二重膜構造ベシクル(DMV)を生成する。コロナウイルスRNAの複製は、新規なプラス鎖ゲノムおよびmRNAの合成のためのテンプレートとして機能するマイナス鎖RNAの入れ子セットの生成を介して行われる。細胞質の先天性のセンサの有力な刺激要因である二重鎖RNA(dsRNA)中間体は、この工程中に生産され、DMVとともに視覚化される。コロナウイルスのDMVの潜在的な機能は、ウイルスdsRNAをホストのdsRNAセンサから隔離することである。しかしながら、DMVのみで、ホストの自然免疫反応の活性化を阻止するために十分であるかについては不明である。本明細書に記載した調査では、意外にも、エンドリボヌクレアーゼ活性を備えた、高度に保存されたニドウイルス(コロナウイルスおよびアルテリウイルス)の構成成分である、コロナウイルス非構造タンパク質15(nsp15)が、ウイルス複製複合体とともに、ウイルスdsRNAのホストdsRNAセンサへの暴露を制限するために機能することが示されたのである。
nsp15は、レプリカーゼポリタンパク質のウイルスプロテアーゼ媒介処理によって生成される、非構造タンパク質である(図1A)。生物情報学的分析により、nsp15は、NendoUと呼ばれる、脊椎動物をホストとするニドウイルスにおいて高度に保存される細胞性エンドリボヌクレアーゼと、遠い同族性を有するドメインを含むことが明らかになった。構造および生化学的研究により、SARS-CoVおよびMHVnsp15、並びに、アルテリウイルスのオルソログ(相同分子株)であるnsp11は、オリゴマーを形成するために集合し、ssRNAおよびdsRNA分子を3′ウリジニル酸選択により分裂させることが明らかとなった。しかしながら、ニドウイルス複製および発病についてのエンドリボヌクレアーゼ活性の役割については、これまでよく解明されていなかった。研究者は、エンドリボヌクレアーゼ触媒部位の変異をコードするヒトCoV229Eウイルスを回復させることができなかったため、nsp15はコロナウイルスの複製に必須である一方、nsp15触媒部位の変異をコードするMHVを複製することで、線維芽細胞株における力価(ウイルス価)を低減させる(約1ログ)ことができるとの結論が得られた。
本発明に至る調査では、nsp15は、ウイルスRNA合成自体には不要であるが、ホストdsRNAセンサの回避を仲介する機能を有すると特定された。具体的には、nsp15における変異をコードするコロナウイルスは、nsp15を不安定化またはエンドリボヌクレアーゼ活性を無効化し、インターフェロンおよびdsRNAセンサであるPKRおよびOASを活性化し、マクロファージにおけるアポトーシス細胞死を促進させる。したがって、nsp15は、ウイルス感染およびマウス内での播殖に必要であり、また、nsp15変異ウイルスは防御免疫反応を誘導することが可能である。
本発明の限定されない実施例を、発明に至るまでの実験的調査に関連して説明する。
自然免疫反応、特にI型インターフェロン(IFN-α/β)の活性化をブロックするためにコロナウイルスが用いるメカニズムを特定するために、スクリーニング法を用いた。その結果、マウス骨髄由来マクロファージ(BMDM)に感染時にIFN-αの生産を誘導する、N15m1と呼ばれるウイルス単離株が特定された(図1Cに概略を示す)。ウイルスゲノムRNAのディープシーケンシングにより、N15m1は、nsp15(トレオニン98からメチオニン[T98m])、および、nsp3(アルギニン971からアラニン[R971A])において、変異を含むことが明らかとなった。マクロファージがN15m1に感染すると、IFN-αの転写が活性化されることが、定量PCR(qPCR)によって検出され(図2A)、IFN-αタンパク質の分泌量が増加することが、ELISAにより検出された(図2B)。I型インターフェロンの活性化の結果、インターフェロン刺激遺伝子ISG54の発現増加が生じることが、免疫蛍光染色によって検出された(図10A)。nsp15におけるトレオニン98残基は、コロナウイルスにおいて高度に保存され(図1D)、機能性の点で重要である。さらに、N3mと呼ばれる、クリーンなnsp3変異ウイルス(図1C)は、R971A変異のみを保有するよう設計された。N3mは、WTウイルスと同様にインターフェロンに拮抗する能力を有するが(図10B)、さらに、nsp15におけるT98Mの変異がIFN-αの拮抗作用の喪失に関与することを示唆する。
IFN-αおよびISGの発現が、ウイルスの複製速度またはウイルス価を変化させたか否かを判定するために、野生株(B6)のBMDMおよびI型インターフェロン受容体欠損(ifnar-/-)のBMDMに、WTウイルスまたはN15m1ウイルスに低多重度(MOI=0.1)で感染させ、時間の経過に応じてウイルスの産生を観察した。B6のBMDMでは、N15m1の複製は大幅に遅れかつ複製量は低く、産生された子ウイルス量は、8hpi後のWTウイルス量よりも大幅に低かった(図2C)。ifnar-/-のBMDMでは、N15m1は、WTウイルスと同様の反応速度を有し、N15m1の複製不足は確認されなかった(図2D)。このことは、インターフェロンがウイルスの複製を制限する理論と一致する。また、nsp15におけるT98Mの変異により、ウイルスが、マクロファージにおけるI型インターフェロンの活性化を阻害することができなくなると結論づけられた。これらの結果から、野生株のnsp15は、ウイルス感染においてI型IFNのアンタゴニスト(拮抗物質)として機能することが示された。
前記増殖速度実験を行ったところ、N15m1に感染したマクロファージは、WTウイルスまたは紫外線不活性化ウイルスのいずれかに感染した細胞よりも早く細胞死することが確認された。図3Aに示すように、N15m1に感染したBMDMは、24hpiにおいて非常に低い細胞生存率を示した(図11Aも参照)。また、汎カスパーゼ阻害剤zVADは、ウイルスに誘発される細胞死を阻止したが、RIPK1阻害剤Nec-1、カスパーゼ-1阻害剤VX-765には、このような効果はなかった(図3B)。これらの結果から、N15m1感染は、RIPK1/RIPK3依存のネクロトーシス、あるいは、カスパーゼ-1を介したピロトーシスではなく、アポトーシス細胞死を活性化させることが示された。この発見は、アポトーシスのその他の特徴を評価することによって支持された。すなわち、N15m1に感染したBMDMにけるカスパーゼ3/7活性の増強は、zVADにより阻害される(図3C)。カスパーゼ3/7に依存するアポトーシス経路の活性化は、切断されたカスパーゼ3生成物のレベルが増加することによっても実証された(図3D)。WT感染BMDMとの比較において、、N15m1感染BMDMにおいて、凝縮かつ衰退化したクロマチンおよび核断片化が電子顕微鏡によって確認された(図11B)。これらのデータが、N15m1感染が、マクロファージにおけるアポトーシスを誘発することを示したことから、WTのnsp15が、I型インターフェロンの活性化に拮抗するだけでなく、アポトーシス細胞死をも阻止することが示唆された。
I型インターフェロンの合成とアポトーシス細胞死は、ウイルスdsRNAを認識する、ホストの膜に関連するセンサあるいは細胞質センサによって、引き起こされる。インターフェロン誘導遺伝子2′5′-オリゴアデニル酸シンテターゼ(OAS)およびタンパク質キナーゼR(PKR)のdsRNAに依存した活性化は、アポトーシス細胞死を引き起こす。これまでの研究により、SARS-CoVおよびMHVのnsp15は、ウイルスエンドリボヌクレアーゼであり、両者ともRNA分子(ssRNAおよびdsRNA)の結合および切断ができることがわかっている。したがって、WTのnsp15が、dsRNAをホストのセンサから隔離することにより、インターフェロンの合成を阻害し、アポトーシスを阻止していると仮定された。nsp15がdsRNAセンサの活性化を阻止するか否かを検証するために、リン酸化elF2α、PKR活性指示薬、リボソームRNA(rRNA)の分解、活性2′5′―OAS/RNaseLシステムシグナリング指示薬のレベルをそれぞれ評価した。WTウイルス感染BMDMとの比較において、N15m1感染BMDMでは、elF2αのリン酸化が増加したことが確認された(図4A)。特定のPKRキナーゼ阻害剤C16を添加すると、N15m1に感染した細胞における、アポトーシスに関係するカスパーゼ3/7活性のレベルが非常に低減した(図4Bおよび図12A)。
12hpiおよび24hpiにおけるrRNAの分解(図4C)から、2′5′-OAS/RNaseL経路の活性化も確認された。ホストrRNAの分解は、zVADまたはC16によって阻害されておらず(図4D)、2′5′―OAS/RNaseLの活性化は、アポトーシスの結果ではないこと、および、PKR経路とは無関係であることが示された。最後に、N15m1に感染したマクロファージにおける、カスパーゼ-3の切断またはカスパーゼ-3/7の活性化は、IFN受容体に依存しており(図4Cおよび図12B)、観察されたアポトーシスがインターフェロン誘導遺伝子に依存していることをさらに示唆している。これらのデータは、マクロファージがN15m1に感染すると、ウイルスのdsRNAの検出が、elF2αaのリン酸化、RNAの分解、カスパーゼ3/7の活性化、およびアポトーシスを誘発することを示唆する。これらの結果は、WTのnsp15が、dsRNAを介した自然免疫反応の活性化を阻止する機能があるという仮説を支持する。
T98Mの変異は、nsp15のN末端ドメインと中間(M)ドメインとの境界面に存在するため(図1B)、オリゴマーの安定性または集合に影響を与える可能性がある。実際に、nsp15のレベルは、WTに感染した細胞と比較すると、N15m1に感染した細胞内においては非常に低減した一方で、Nタンパク質のレベルは微減したのみであった(図5A)。N15m1に感染したifnar-/-BMDMにおいても、nsp15の低減が観察された(図5A)が、いずれのウイルスも、同等のNタンパク質レベルおよび増殖速度を有していた(図2D)ことから、N15m1に感染したB6のBMDMにおいてnsp15のレベルが低減した理由は、ウイルスの複製が低減したことだけに起因するものではない。大腸菌から精製された野生型のタンパク質およびT98Mnsp15タンパク質のいずれもが、等しくnsp15ポリクローナル抗血清によって検出されているため(図5B、底部)、前記検出が減少した理由は、変異タンパク質に対するnsp15抗体の類似性に起因するものでもない。これらの結果は、T98Mの変異が、nsp15を不安定化し、N15m1に感染した細胞におけるタンパク質の定常状態レベルを低下させたことを示す。
nsp15タンパク質におけるT98Mの変異の効果をさらに評価するため、コドンを最適化させた野生型nsp15タンパク質およびT98M nsp15タンパク質をクローン化し、大腸菌におけるSUMOフュージョンタンパク質として発現させた(図3B、上部)。nsp15の構造に基づき、SUMOタグは、nsp15について上述したヘキサマーなどのオリゴマーの集合には影響を与えない。T98Mの変異がタンパク質を不安定化させるかについてさらに評価するため、示差走査蛍光定量法(DSF)を用いて、熱に対するnsp15の安定性を測定した(図5C)。WTのnsp15は、47℃において変性状態への主な遷移を示す。対照的に、T98M変異nsp15は、WTのnsp15よりも7℃低い40℃で変性し、T98Mの変異がnsp15を不安定にすることをさらに示している。
動的光散乱(DLS)分光法を用いることにより、WTnsp15の大半はタンパク質濃度0.05mg/mlにおいてオリゴマーを形成するために集合することが確認された(図13)。対照的に、nsp15-T98M変異は、これらの条件下においてモノマーの形態で検出された(図13)。nsp15-T98Mのオリゴマー化の障害または欠如がエンドリボヌクレアーゼ活性に影響を与えたか否かを判断するための評価を行った結果、T98Mの変異は、WTタンパク質と比較すると、RNA切断活性に関して大きな減少を示した(図5D)。また、WTおよびT98Mのnsp15タンパク質の生体外特性評価は、T98Mの変異は、タンパク質の安定性を低下させ、エンドリボヌクレアーゼ活性を阻害することを示した。これらの結果は、nsp15を備えるポリタンパク質をコードし、nsp15における変異および/または欠失を含む変更を生じさせる、変異レプリカーゼ遺伝子が、nsp15の安定性(不安定化)または活性(不活性化)に影響を与えることをさらに示すものと解釈される。
変異T98Mは、タンパク質の欠損を引き起こし、nsp15のエンドリボヌクレアーゼ活性を阻害することから、ホストのdsRNAセンサの回避に、エンドリボヌクレアーゼ活性が重要であるのかを判定するための実験を行った。エンドヌクレアーゼ不活性型nps15(H262A)を備える変異ウイルスN15m3を生成した。マクロファージがN15m3に感染すると、IFN-αの転写が促進され(図6A)、B6のBMDMでは複製が不十分となるが、ifnar-/-BMDMにおいては複製が不十分とはならず(図6B)、急速なアポトーシス細胞死が生じ(図6Cおよび図14A)、および、rRNAの分解が生ずる(図6D)。このことから、N15m3は、N15m1ウイルスの表現型模写を行うことが示されている。N15m1と異なり、N15m3は、ifnar-/-BMDMにおいてWTウイルスと同等レベルのnsp15を発現したため(図14B)、H262の変異は、nsp15の定常レベルに影響を与えなかったといえる。したがって、エンドリボヌクレアーゼ活性(H262A)の欠損が、T98Mの変異によるnsp15タンパク質の欠損に関連する表現型の再現をもたらすと判断された。これらの結果は、nsp15のエンドリボヌクレアーゼ活性が、ホストのdsRNAセンサの回避に重要であることを示す。
大腸菌からの精製MHVは、マンガンの存在下においてエンドヌクレアーゼ活性を示し、触媒ヒスチジン262からアラニン(H262A)への置換により、不活性酵素が生じる結果となった。したがって、ホストのdsRNAセンサの活性化を阻止する際のエンドリボヌクレアーゼ活性の役割をさらに判定するために、触媒不活性型のnsp15(H262A)を保有するN15m3ウイルスが選択された。CoVの感染により、ウイルス複製中にdsRNA中間体が生成されるため、nsp15がdsRNAの蓄積を阻止するためにウイルスdsRNAを分解させるとの仮定がなされた。この仮説を検証するため、B6のBMDMまたはifnar-/-BMDMをWTウイルスまたはN15m3ウイルスに感染させ、dsRNAレベルを計測した。驚くべきことに、dsRNAの蛍光発光強度あるいは流動細胞計測法を用いたdsRNA陽性細胞の割合から測定される、N15m3感染細胞におけるdsRNAレベルの増加が観察されなかった。このことは、nsp15の拮抗機能が、ウイルスdsRNAの分解に媒介されるものではないことを示唆する。
これまでは、CoVのdsRNAは、主に複製複合体に関連し、ホストのセンサからウイルスRNAを保護すると考えられたDMVよって隠されていると考えられていた。したがって、nsp15はdsRNAと複製複合体との関連性を維持する、あるいは、DMVへのdsRNAのパッキングを促進するように機能すると仮定された。そこで、nsp15変異ウイルスは、より多くのフリーなdsRNAを生成し、これらのフリーなdsRNAがホストセンサを活性化させることが予測された。この仮説を検証するため、dsRNAおよび複製複合体(インジケータとしてのnsp2/3)の細胞内局在を、特異抗体を用いた免疫蛍光法で評価した。N15m3の感染は、特にifnar-/-BMDMにおいて、nsp2/3とは共局在化しなかったdsRNAの蛍光輝点をより多く生成することが確認された(図7A)。
フリーなdsRNAを定量化するため、IMARISソフトウェアプログラムを用いて、dsRNAの蛍光輝点およびnsp2/3の蛍光輝点をカウントした。ifnar-/-BMDMにおけるnsp2/3の蛍光輝点と同等数を有する場合に、N15m3は、WTウイルスよりも多くdsRNA蛍光輝点を生産した(図7A左パネルおよび図16A)。フリーなdsRNAの蛍光輝点数とN15m3のdsRNA/nsp2/3の比は、WTウイルスよりも非常に高かった(図7A右パネル)。B6のBMDMにおいては、N15m3ウイルスは同等数のdsRNA蛍光輝点を生産したが、複製障害により、nsp2/3蛍光輝点数は非常に少なかった(図6B)。dsRNA/nsp2/3の比は、WTウイルスよりもN15m3において依然として高いことが確認され(図16B)、ifnar-/-BMDMで得られた結果(図7A)と一致していた。以上のことから、これらのデータは、nsp15は、細胞中のdsRNA量には影響を与えないが、dsRNAとnsp2/3との関係と、後述するdsRNAのDMVへのパッキングを維持するよう機能すると考えられる。
nsp15とdsRNAとの関係をさらに理解するために、nsp15およびdsRNAの局在化を調べた。nsp15は、ウイルスレプリカーゼタンパク質を含む固有の斑点において新規に合成されたウイルスRNAに関係し、ウイルスRNA合成用のサイトであると考えられている。nsp15およびdsRNAは、特異抗体を用いた免疫蛍光法によって視覚化された。nsp15と共局在化されたdsRNAの蛍光輝点数は、WT感染細胞と比較して、N15m3感染細胞において非常に低減していた(図7B)。これらの結果は、nsp15はdsRNAおよびウイルス複製複合体と関係する可能性をさらに支持する。したがって、エンドリボヌクレアーゼ活性が喪失することにより、dsRNAと複製複合体との結びつきが破壊されるため、より多くのフリーなdsRNAが、ホストのセンサにより感知されたと結論付けられる。
nsp15変異ウイルスは、強力なインターフェロン応答を誘発し、ホストのdsRNAセンサを活性化させることから、nsp15を介した自然免疫反応の拮抗作用の喪失が、マウスコロナウイルスの病原性を変更するか否かを判定するため、さらなる調査が行われた。この目的を達成するため、感染後5日目(5dpi)に、WTのMHV-A59のウイルス価がピークを迎えると考えられる非致死モデルの感染を採用した。マウスに60,000PFUを腹腔内注射し、ウイルスの複製を計測するために、感染後3日目および5日目に肝臓および脾臓を摘出した。感染粒子を数えるための通常のプラークアッセイでは、N15m1を接種したマウスにおけるウイルスについては陰性であった(図8A)。MHVのN遺伝子mRNAを検出するための、より感度の高いRT-qPCRアッセイでは、感染後1日目における腸間膜リンパ節(MLN)において最小レベルのN15m1のRNAを識別したが、それ以降では確認されなかった(図8B、データ図示せず)。肝臓の組織学的検査では、WTのMHVによる感染に伴う典型的な病変が示されたが、N15m1に感染したマウスでは確認されなかった(図8C)。同様に、N15m3に感染したマウスは、N15m1に感染したマウスと同様に肝病理を一切示さなかった(図17A)。
N15m1ウイルスが弱毒であるか否かを判定するために、致死的な攻撃モデルを利用した。600PFUのWTウイルスは、マウスの頭蓋内に接種するだけで、致死的な脳炎を引き起こす。WTに感染したマウスは、体重が減少し、感染後7日までに感染症により死亡する。対照的に、N15m1に感染したマウスはすべて、感染後も生存し続け、感染後1日目に一時的な体重の減少を示した後、時間の経過とともに体重が増加した(図8Dおよび図8E)。これらのデータは、敏感な生体モデルにおいても、N15m1は非常に弱毒であり、一切の病因とならなかったことを示す。さらに、ifnar-/-マウスの腹腔内に50PFUのWTまたは変異ウイルスを接種したところ、すべてのマウスが感染症により急速に死亡したことから、変異ウイルスにおけるnsp15のIFN拮抗作用を喪失することは、B6のマウスの感染中における弱毒化に寄与するという理論が裏付けられる(図17B)。重要なことに、マウスにN15m1を接種することにより、6000PFU(10倍の致死量)のWTのMHVによる攻撃から完全に保護された。
これらの実験的な調査により、WTウイルス感染中において、ウイルスdsRNAがホストセンサを活性化することを防止するnsp15の役割が示された。ウイルス複製中にnsp15を喪失することにより、高速なdsRNAの感知、I型インターフェロン、2′5′-OAS/RNaseLおよびPKRの活性化がなされ、これによってウイルスの複製、拡散、および疾患が制限される。IFNシグナルの不在下においては、nsp15変異ウイルスはWTウイルスと同様に複製することから、ウイルスRNAを合成するにあたりnsp15のエンドリボヌクレアーゼ活性は不要であることが示された。一方、nsp15は、マクロファージにおけるコロナウイルス複製に対する自然免疫反応を妨げるのに重要である。
dsRNAセンサのアンタゴニスト(拮抗物質)としてのnsp15の効果は、これまでのコロナウイルスレプリカーゼにコードされたアンタゴニストの研究により明らかである。CoVは、ホストPRR認識を回避するために、自身のmRNAの5′末端にキャップ構造を提供するよう2′O-メチルトランスフェラーゼ(nsp16)をコードする。2′O-メチルトランスフェラーゼ活性を有しないSARS-CoVおよびMHV変異ウイルスは、I型IFN応答を引き起こし、マクロファージおよびマウス内において弱毒であった。SARS-CoVおよびMHVのnsp1は、ホストのmRNAを分解させることによってIFN誘導を阻止することができる。しかしながら、nsp1欠失変異体を有するマクロファージの感染はIFN誘導を変化させず、むしろB6マウス内において弱毒であった。CoVは、nsp3内において必須パパイン様プロテアーゼ(PLP2またはPLpro)ドメインをコードし、細胞基質からユビキチン分子を切断することにより自然免疫反応を調節不全にすることができる。nsp15は、通常の風邪を引き起こす、HCoV-229EやOC43などの比較的良性のコロナウイルスを含む、すべてのコロナウイルス内において高度に保存されていることから、ウイルスにとって、マクロファージ内においてホストdsRNAセンサによる認識を阻止し、標識組織においてウイルスの播殖を可能とするために、nsp15は必須である。
これまでの研究により、コロナウイルスは、OAS/RNaseLシステムやPKRなどのホストのセンサのdsRNAを介した活性化を阻害するウイルス因子をコードすることが示されている。たとえば、上述した調査で使用されたマウスコロナウイルス株も、OAS/RNaseLシステムのもう一つの重要なアンタゴニストであるアクセサリータンパク質ns2をコードする。Ns2は、マクロファージにおけるRNaseLを介したrRNA分解を阻止するため、OASの産物である2′,5′-オリゴアデニル酸を切断する、2′,5′-ホスホジエステラーゼ(PDE)酵素をコードする。ns2変異ウイルスによる頭蓋内感染は致死的であることから、コロナウイルスns2は肝特異効果を付与する。そのままのns2を有するnsp15変異ウイルスは、マクロファージにおいてrRNA分解を誘発することができ、肝炎および脳炎マウスモデルのいずれにおいても非常に弱毒であることがわかった。MERS-CoVのアクセサリータンパク質に関する調査により、NS4bは、MHVのns2と同様のPDE活性を有し、RNaseL活性を阻止することが示された。MERS-CoVのNS4aは、PKRの活性化を制限するdsRNA結合タンパク質をコードする。ウイルスに関してNS4aを削除することは、PKRの活性化およびストレス応答の生成には不十分であるため、MERS-CoVは、dsRNAセンサの識別と活性化を抑制するために冗長メカニズムを有さなければならない。本明細書中に示した結果は、nsp15は、CoV感染中にdsRNAセンサの活性化を抑制する保護されたウイルス因子として働き、ns2、NS4a、またはNS4bによるPKRおよび/またはOAS/RNaseLの追加的な抑制は、ウイルス病原に貢献する可能性のある組織特異的メカニズムまたは冗長メカニズムによる制御を提供することを示す。
ウイルスRNAセンサの活性化を抑制するためにnsp15が用いる正確なメカニズムの解明が残されている。特に、dsRNAセンサの拮抗作用におけるnsp15のエンドリボヌクレアーゼ活性の役割は不明である。リボヌクレアーゼ活性については、リボヌクレアーゼ活性をコードする2つのウイルスが自然免疫反応を抑制する機能を示している。ペスチウイルスRNase Ernsは、リソソーム内でウイルスRNAを分解させる、酵素活性誘発受容体として機能し、これにより、ホストのdsRNAセンサに対するRNAの暴露が制限される。ラッサ熱ウイルスの核タンパク質も、フリーなdsRNAを消化し、インターフェロン調節因子3の転座およびホストの自然免疫反応システムの活性化を抑制するために必須である、3′~5′エキソヌクレアーゼドメインを含む。したがって、nps15が、ホストのdsRNAセンサによる検出を防止するために、ウイルスdsRNAを分解させているだろうと仮説を立てることは合理的であった。それにも拘わらず、nsp15変異ウイルスに感染したマクロファージにおいて、dsRNAレベルの増加は確認されなかったため(図14)、nsp15はRNAを広範囲に分解するのではなく、特定の標的を有する可能性が示唆された。これらの調査により、nsp15は、dsRNAと複製複合体との関連性を維持するか、dsRNAのDMVパッキングを仲介する可能性があることが示された。
以上から、上述した調査は、マクロファージにおける自然免疫反応を効果的に調節するためにコロナウイルスによって利用されるメカニズムに対する理解を提供するとともに、nsp15を標的とする治療法の開発と、生かつ弱毒のワクチンの開発に対するいくつかの新しい指針を提供する。たとえば、ポリタンパク質をコードする変異レプリカーゼ遺伝子を備える生かつ弱毒のコロナウイルスを備えるワクチンを投与することにより、さまざまなコロナウイルスに対してヒト対象被験者に接種を行うことで、nsp15の安定性または活性に影響を与える変異または欠失を含む変化を生じさせることができる。非限定的であるが特定の例として、位置98においてトレオニンからメチオニンへのアミノ酸変異、あるいは、位置262において触媒ヒスチジンからアラニンへのアミノ酸変異を備えるタンパク質を挙げることができる。該ワクチンは、水、生理食塩水、緩衝食塩水、リン酸緩衝液、アルコール/水溶液、乳液または懸濁液などの薬剤的に許容されるキャリアを含む。
nsp15はすべてのコロナウイルス内で高度に保存されているため、上述したアプローチを、既存のコロナウイルスから新型コロナウイルスまでのコロナウイルス科に属するすべてのコロナウイルスに対するワクチンの製造に適用することができると考えられる。したがって、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(SARS-CoV)、中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS-CoV)、ヒトコロナウイルス229E(HCoV-229E)、OC43(HCoV-OC43)、HKU1(HCoV-HKU1)、およびNL63(HCoV-NL63)、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス(FIPV)、イヌコロナウイルス(CCoV)、鶏伝染性気管支炎ウイルス(IBV)、ウシコロナウイルス(B0C0V)、および、伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)、ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)、ブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)、ブタ呼吸器コロナウイルス(PRCV)、ブタ血球凝集性脳脊髄炎コロナウイルス(PHE-CoV)を含むブタコロナウイルスなどのさまざまなコロナウイルスのnsp-15において変異を形成することにより、ワクチンを製造することが可能であると考えられる。
感染性クローンの変異によるブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)のnsp15/EndoUの不活化により、組織培養において効率的に複製するともに、感染したマクロファージにおいてインターフェロンを生成する自然免疫反応を活性化させる(図9)、ウイルスが提供される。ヒトまたは動物に感染するコロナウイルスにおけるnsp15/EndoU活性の不活化は、該ウイルスのワクチン株を生成する。この不活化により、ウイルス感染したマクロファージにおけるインターフェロンの急速な活性化が可能となり、適応免疫反応が刺激される。この効果は複数種のコロナウイルスにおいて発揮されうる。たとえば、I型インターフェロン応答などの自然免疫反応の活性化を刺激するウイルスが提供される。
上述した研究の態様と結論の裏付けは、以下の刊行物よって開示されている。Dengらの『マクロファージにおけるコロナウイルス非構造タンパク質15を介したdsRNAセンサの回避およびアポトーシスの制限(Coronavirus nonstructural protein 15 mediates evasion of dsRNAsensors and limits apoptosis in macrophages)』(米国科学アカデミー(National Academy of Sciences)論文集、2017年5月、114(21)E4251-E4260;DOI:10.1073/pnas.16183101 14)、および、Kindlerらの『エンドヌクレアーゼを介したRNAセンシングの早期回避による効率的なコロナウイルス複製の確立(Early endonuclease-mediated evasion of RNA sensing ensures efficientcoronavirus replication)』(PLoS Pathog 13(2):e1006195. doi:10.1371/journal. ppat.1006195(2017))である。これらの2つの文献のすべての内容は、参照により本明細書の一部に組み込まれるものとする。
本明細書に記載した調査に関連する以下の追加的な詳細は、調査の際に用いられた実験手順の説明である。かかる説明により、本発明の範囲は限定されるものではなく、あくまでも調査の範囲や具体的内容を開示することを目的とする。
以下、図1A~図8Gに関連する特定の実験手順を説明する。
細胞、抗体、および化学物質。遅延脳腫瘍(DBT)細胞を、10%トリプトースリン酸ブロス、5%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)、2%ペニシリン/ストレプトマイシン、および2%グルタミンで補充した基礎培地(MEM)において、成長させた。MHV受容体(BHK-R)を発現するBHK-21細胞を、10%FCSおよびG418(0.8mg/ml)(SV30069、HyClone社)で補充したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で培養した。17CI-1細胞系は、5%FCSのDMEMにおいて維持した。ウサギ抗nsp2/3血清(抗D3)および抗nsp15血清(抗D23)。マウス抗ヌクレオカプシド(J3.3)は、ウィスコンシン大学マディソン校から得たものである。抗体は市販のものを購入した:dsRNA(K1、Scicons社)、ISG54(PA3845、ThermoFisher社)、elF2α(sc-133132)およびp-elF2α(sc-12412)は、Santa Cruz社から得た。化学阻害剤は以下の入手源から得た。汎カスパーゼ阻害剤zVAD(627610、Millipore社)、ネクロスタチン-1(Nec-1)(480065、Millipore社)、PKR阻害剤C16(527450、Millipore社)、スタウロスポリン(ALX-380-014、Enzo Life Sciences社)およびVX-765(F7120、UBPbio社)。
ウイルスおよびディープシーケンシング。WTのMHV株A59(GenBank accession #AY910861)をリバースジェネティクスによって生成した。MHV変異ウイルスを生成するため、PCR変異導入(プライマーは要求に応じて入手可能)を通じて、MHV-A59ゲノムのcDNAフラグメントにヌクレオチド変化を組み込んだ。リバースジェネティクスにより、その後のウイルス生成を行った。レスキューされたウイルスをプラーク精製し、BHK-R細胞上で増殖し、17CI-1細胞上においてウイルス価を測定した。変異ウイルスは、BHK-R細胞においてのみ維持された。本研究で使用されたすべてのウイルスストック調製物およびプラーク精製分離物は、全ゲノムについてディープシーケンスしたものである(カンザス州立大学臨床検査室)。
感染およびマウス実験。12ウェルまたは24ウェルのウェルプレート中のBMDMを、無血清培地において、MOI(感染多重度)=0.1またはMOI=1で、指示されたウイルス株に感染させた。増殖速度分析については、指示時点ごとに、細胞培養上清を回収し、17Cl-1細胞上にてプラークアッセイによってウイルス価を測定した。マウス感染については、すべての実験はロヨラ大学シカゴIACUCによって審査され承認されたプロトコルを用いて行われた。頭蓋内(i.e.)感染については、生後6週のC57BL/6J雌マウス(Jackson Laboratory社)に対してウイルスを600PFU接種し、体重を毎日観察し、IACUCプロトコルに基づいて25%以上の体重減少が確認された場合には安楽死させた。腹腔内(i.p.)感染については、生後6週のマウスに対し、60,000PFUを接種し、指示時点ごとに臓器を摘出した。H&E染色により、肝病理を判定した。
細胞死アッセイ。細胞生存率およびカスパーゼ3/7活性は、CellTiter Glo(G7571、Promega社)、または。Caspase-Glo3/7(G8091、Promega社)をそれぞれ用い、メーカーのプロトコルに基づき、修正を加えて計測された。
示差走査蛍光分析(DSF)アッセイ。示差走査蛍光分析は、Stratagene MX3005P real-time PCR装置内で行われた。サンプルは、1x(1倍の)SYPRO Orange、組換タンパク質10μMを含む。すべてのサンプルは、0.5℃/分の速度で加熱され、その蛍光強度およびTm(融解温度)が特定された。
RNA切断アッセイ。標準RNA切断アッセイは、1×104CPMの5′末端放射標識RNA基質(1μMの最終RNA濃度)および0.025μMのnsp15を、50mMのTris-HCl(トリスヒドロキシメチルアミノメタンー塩酸)(pH 7.5)、50mMの塩化カリウム、1mMのジチオトレイトール、5mMの塩化マンガン中で、30℃で使用した。エンドリボヌクレアーゼ反応は、7.5Mの尿素を含むゲルローディングバッファの添加により終了した。生成物は、7.5Mの尿素7.5を含む20%ポリアクリルアミドにおいて電気泳動により分離した。ゲルはラップで包み、定量化のためにMolecular Dynamics社のソフトウェアを用いて、ホスフォイメージャースクリーンに曝した。
以下、図10A~図17Bに関連する特定の実験手順を説明する。
細胞、抗体、および他の試薬。遅延脳腫瘍(DBT)細胞を、10%トリプトースリン酸ブロス、5%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)、2%ペニシリン/ストレプトマイシン、および2%グルタミンを補充した基礎培地(MEM)(61 100-061、Gibco社)で成長させた。MHV受容体発現の選択を維持するため、MHV受容体(BHK-R)を発現しているベビーハムスター腎臓21細胞を、熱不活化FCSおよびG418(0.8mg/ml)(SV30069、HyClone)を補充したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(12100-046、Gibco)で培養した。17CI-1細胞系は、5%FCSのDMEM中で維持した。WTのMHV株A59(GenBank accession #AY910861)を逆遺伝学によって生産し、全ゲノムについてシーケンスした。分化した(下記参照)骨髄由来マクロファージ(BMDM)は、30%L929細胞上清、20%FCS、1%L-グルタミン、1%ピルビン酸ナトリウム、および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM(10-017-CV、Corning社)を含む骨髄マクロファージ(BMM)培地において維持した。ウサギ抗nsp2/3血清(抗D3)および抗nsp15血清(抗D23)。マウス抗ヌクレオカプシド(J3.3)は、ウィスコンシン大学マディソン校から得た。抗体は市販のものを購入した。マウス抗βアクチン(A00702、Genscript社)、マウス抗カルネキシン(610523、BD)、ロバ抗ウサギHRP(711-035-152、Jackson Immuno Research社)、ヤギ抗マウスHRP(1010-05、Southern Biotech社)、dsRNA(K1、Scicons社)、ISG54(PA3845、Thermo Fisher社)、elF2α(sc-133132)、およびp-elF2α(sc-12412)はSanta Cruz社から得た。化学阻害剤は、以下の入手源から得た。汎カスパーゼ阻害剤zVAD(627610、Millipore社)、ネクロスタチン1(Nec-1)(480065、Millipore社)、PKR阻害剤C16(527450、Millipore社)、およびVX-765(F7120、UBPbio社)。
骨髄由来マクロファージの生成。骨髄は、C57BL/6J(000664、Jackson Labs社)マウスあるいはセントルイスのワシントン大学から入手したifnar-/-マウスの大腿骨から得た。5×106の骨髄細胞を、50μMのβ-メルカプトエタノールを含む、15mLのBMM培地を備える100×26mmのペトリ皿(25387-030、VWR社)で培養した。37℃/5%CO2で3日間培養後、BMM培地を10mL追加した。さらに3日間の分化後、BMDMを冷たい1x(1倍の)PBSで洗浄し、10mLの1xPBSで30分間4℃で培養し、手動ピペットでプレートから穏やかに洗い流した。1×107細胞/mLを、10%DMSOを含むBMM培地で懸濁し、使用するまで液体窒素液相で保存した。L929細胞の上清を調製するために、3.75×105のL929細胞を、T150フラスコ(10-126-34、Thermo Fisher社)中で、75mLの培地(DMEM[10-017-CV、Corning社]、10%FCS、1%L-グルタミン、1%ピルビン酸ナトリウム、1%非必須アミノ酸、および1%ペニシリン/ストレプトマイシン)に播いた。37℃/5%CO2で6日間培養後、上清を採取し、濾過し、使用するまで-20℃で保存した。ウイルス感染のため、BMDMを解凍し、BMM培地における100×26mmのペトリ皿に、β-メルカプトエタノールを用いずに播いた。37℃/5%CO2で3日間培養後、24時間培養後の感染実験用の組織培養皿に、細胞を播いた。
変異ウイルスおよびディープシーケンシング。MHV変異ウイルスを生成するため、cDNAフラグメントのPCR変異導入(プライマーは要求に応じて入手可能)を通じて、MHV-A59ゲノムにヌクレオチド変化を組み込んだ。リバースジェネティクスによるウイルスのその後の生成を行った。連結されたcDNAフラグメントの生体外転写(mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit;AM1344、Invitrogen Ambion社)からのウイルスゲノムRNAを、BHK-R細胞にエレクトロポレーション法で導入した。細胞上清は、細胞変性効果の観察後にウイルスストックとして回収した。感染性クローンをプラーク精製し、BHK-R細胞上で増殖させ、17CI-1細胞上でウイルス価を測定した。変異ウイルスは、インターフェロンの生成またはインターフェロンへの応答をしないBHK-R細胞のみで維持された。本研究で使用されたすべてのウイルスストック調整物およびプラーク精製分離物は、全ゲノムについてディープシーケンスされた(カンザス州立大学臨床検査室)。簡潔には、ウイルスRNAは、QIAamp MinElute Virus Spin Kit(57704、QIAGEN社)を用いてウイルスストックから抽出され、cDNAライブラリを生成するために使用され、MiseqまたはIon Torrentの技術によってシーケンス解読された。変異MHVシーケンスは、野生型MHV-A59合成構築物(GenBank accession #AY910861)に、シーケンスアラインメントされた。
プラークアッセイによるウイルス複製の評価。ウイルスの増殖速度を判定するために、無血清培地において、24ウェルのウェルプレート中のBMDMを、MOI=0.1で指示されたウイルス株に感染させた。1時間の培養後、接種材料を新鮮で完全な培地で交換した。細胞培養上清を指示された時点において回収し、17CI-1細胞上でプラークアッセイによってウイルス価を測定した。臓器におけるウイルス価を判定するために、組織の一部を、自動ホモジナイザー(6.0m/秒、40秒間)(MP Biomedicals社)を用いて、無血清DMEM中で、直径1.0mmのジルコニア/シリコンビーズ(11079110z、BioSpec Products社)と均質化した。均質化した臓器は、10,000×gで5分間遠心分離し、清澄化された上清を17CI-1細胞上のウイルスプラークに対してウイルス価測定を行った。ウイルス価は、それぞれのサンプルについて3つの独立したアッセイから得た。ウイルス増殖速度のグラフは、Prism7ソフトウェア(GraphPad Software社)を用いて作成した。
細胞死アッセイ。細胞生存率およびカスパーゼ3/7活性は、CellTiter Glo(G7571、Promega社)とCaspase-Glo 3/7(G8091、Promega社)をそれぞれについて用い、メーカーのプロトコルに基づき、修正を加えて計測された。簡潔には、3.0×105BMDM/ウェルを、24ウェルのウェルプレートに播き、無血清培地において1時間、MOI=0.1で感染させた。培地を完全な培地と交換する、あるいは、化学阻害剤を追加するために、ウイルス接種材料は指示された濃度の阻害剤を含む完全なBMM培地と交換された。感染したBMDMは、24時間、37℃/5%Co2で培養した。BMDMを1xPBSで2回洗浄し、100μLのGlo試薬/培地混合物(1:1)で溶解した。発光シグナルを計測するために、50μLの細胞溶解物を使用した。標準偏差および独立T検定を技術的に3回繰り返し行い、データは3つの独立した実験の代表である。細胞生存率のグラフは、Prism7ソフトウェア(GraphPad Software社)を用いて作成した。
免疫蛍光。BMDM(1.5×105細胞/ウェル)を24ウェルのウェルプレートのガラスカバースリップにて24時間培養し、その後、無血清培地において、MOI=0.1の野生型ウイルスまたは変異ウイルスに感染させた。6hpiまたは12hpiにおいて、感染した細胞を0.095 M PIPESバッファ(P1851、Sigma社)において、4%ホルムアルデヒドで固定し、1xPBSにおいて、0.1%Triton×-100(T8787、Sigma社)で透過処理し、2%BSAでブロックした。一次および二次抗体を次の通り使用した。抗NSP2/3(1:1500)、抗dsRNA(1:500)、抗ISG54(1:500)、抗ヌクレオカプシド(1:500)、ロバ抗ウサギIgG Alexa Fluor 488(1:1000)(A-21441、Invitrogen社)、およびヤギ抗マウスIgG Alexa Fluor 568(1:1000)(A11004、Thermofisher社)。核は、Hoechst33342(1:2500)(H1339、Life Technologies社)で視覚化した。細胞は、デジタルカメラ(CoolSNAP HQ、Photometries社)を備えるDeltaVision広視野蛍光顕微鏡(Applied Precision、GE社)によって、Z-スタック画像を収集することにより画像化された。画像は、20xまたは100xレンズで撮影された。サンプルは、Insight SSIソリッドステート照明モジュール(Applied Precision、GE社)によって生成された光と、SoftWoRxでデコンボリューションソフトウェア(Applied Precision、GE社)によってデコンボリューション(逆重畳積分)処理された。すべての画像は、同一の取得条件下で収集され、Imaris 7.6.4(Bitplane社)を用いて処理された。
FACS分析。BMDM(6.0×105)を12ウェルのウェルプレート(Corning社)にて24時間培養し、その後、MOI=0.1の野生型ウイルスまたは変異ウイルスに感染させた。6hpiにおいて細胞を回収し、1xPBSにおいて4%ホルムアルデヒドで固定し、1xPBSにおいて0.1%Triton×-100で透過処理し、2%FCSおよび0.5%アジ化ナトリウムを含む1xPBSでブロックした。細胞を、生死判別染色試薬(65-0865-14、eBioscience社)、指示された一次抗体および二次抗体に対する抗体、および、ロバ抗ウサギAlexaFluor488およびAlexaFluor568でラベル化されたヤギ抗マウス一次抗体により、ラベル化した。細胞は、LSR Fortessaセルアナライザー(BD Bioscience社)を用いて分析した。フローサイトメトリーデータは、FlowJoソフトウェア(Treestar社)を用いて分析した。
逆転写定量PCR(RT-qPCR)およびELISAによるIFN-α生産の定量化。12ウェルまたは24ウェルのウェルプレートにおけるBMDMは、MOI=0.1のウイルスにモック感染または感染させた。指示された時点において、RNeasy Miniキット(74104、QIAGEN社)を用いたRNA抽出に単層細胞を使用し、細胞培養上清をELISA用に回収した。IFN-α11、βアクチンまたはMHV-A59N遺伝子のmRNA生産を判定するため、全RNAを抽出し、同量のRNA(~1μg)を、Rt2HT First Standard Kit(330401、QIAGEN社)を用いたcDNA合成に使用した。定量PCRは、特定のプライマーとともに、マウスIFN-α11(PPM03050B-200、QIAGEN社)、マウスβアクチン(PPM02945B-200、QIAGEN社)またはMHV-A59N遺伝子について、Bio-Rad CFX96システムにおけるRT2SYBR Green qPCR Mastermix(330502、QIAGEN社)を用いて行われた。サーモサイクラーは、以下の通り設定した。95℃での1ステップ(10分)、95℃の40サイクル(15秒)、60℃(1分)およびプレートリード、95℃での1ステップ(10秒)および65℃~95℃から0.5℃/0.05秒で増加する融解曲線。サンプルは、三通りで評価し、データは3つの独立した実験の代表である。分泌されたIFN-αを計測するため、マウスIFN-α ELISAキット(BMS6027、eBioscience社)を用いたアッセイのために50μLの細胞培養上清をメーカーの指示通りに使用した。グラフは、Prism7ソフトウェア(GraphPad Software社)を用いて作成した。
電子顕微鏡法。1mLのBMM培地において、12ウェルのウェルプレート(Corning社)のウェル毎に、6.0×105B6のBMDMを播いた。24時間後、無血清DMEMにおいて、MOI=0.1のウイルスに感染させた。対照細胞は、BMM培地で処理した。37℃/5%CO2で1時間培養後、培地をBMM培地と交換した。感染していない対照細胞は、アポトーシスを誘発するためにBMM培地に準備された1μMのスタウロスポリン(ALX-380-014、Enzo Life Sciences社)で処理した。細胞を37℃/5%CO2で16時間さらに培養した後、EMのための準備をした。細胞を1xPBSで洗浄し、1xPBSにおいて4℃で30分間培養した。ピペットを用いて、プレートから細胞を丁寧に回収し、1200rpmかつ4℃で5分間ペレット化し、固定した(カコジル酸緩衝液0.1Mにおける4%グルタルアルデヒド)。細胞切片を用意し、イリノイ州シカゴ郊外メイウッドのロヨラ大学における電子顕微鏡コア・ファシリティによって画像化した。
ウエスタンブロット法。BMM培地に6.0×105 B6 BMDM/ウェルを含む12ウェルのウェルプレート(Corning社)を、培養処理するか、無血清DMEMにおいてMOI=0.1で1時間、37℃/5%CO2でウイルスに感染させた。培地を新鮮なBMM培地に交換し、細胞はインキュベータに戻した。6時間、12時間または24時間後、細胞は100μLの冷たい溶解バッファ(20mMのトリス、pH7.5、150mMの塩化ナトリウム、1mMのEGTA、1mMのEDTA、1%のTriton X-100、2.5mMのピロリン酸ナトリウム、1mMのβ-グリセロリン酸、1mMのオルトバナジン酸ナトリウム、1μg/mLのロイペプチン、1mMのPSMF)で溶解し、細胞はチューブに削り採られた。溶解バッファ中の細胞は、氷上で10分間培養した後、4℃で10分間14,000rpmでペレット化した。無細胞上清は、2×サンプルバッファ(10%のグリセロール、5%のβ-ΜΕ、3%のSDS、7.5mg/mLのTris緩衝塩基、ブロモフェノールブルー)において希釈した。サンプルは12%アクリルアミドPAGEゲルを介して電気泳動によって分離し、セミドライ輸送システム(Bio-Rad社)を用いてPVDFイムノブロットメンブレン(162-0177、Bio-Rad社)に輸送した。メンブレンは、室温で1.5時間、1xTBST(トリス緩衝食塩水+1%Tween-20)に5%w/vの脱脂粉乳を含む、ブロッキングバッファで懸濁した。活性化されたカスパーゼ3を検出するために、ウサギモノクローナル抗体を切断したカスパーゼ3(Asp175;Cell Signaling Technology社)に夜通し4℃で穏やかに揺すりながら添加した(1:1000)。メンブレンの2番目のセットは、マウス抗βアクチン(1:5000)を介して細胞のタンパク質発現を判定するため、あるいは、マウス抗J3.3Nタンパク質(1:200)を介して相対的なウイルス複製を判定するために使用されるものであり、室温で1.5時間培養した。すべてのメンブレンを1xTBSTで3回洗浄し、二次抗体、カスパーゼ3モノクローナル用のロバ抗ウサギ-HRP(1:2500)、あるいは、Nタンパク質およびβアクチン用のヤギ抗マウス-HRP(1:5000)を、室温で1.5時間穏やかに揺すりながら添加した。メンブレンを1xTBSTで3回洗浄し、Western Lightning Plus-ECL試薬(50-904-9326、PerkinElmer社)を用いて化学発光を視覚化した。
大腸菌からの組換MHVのnsp15タンパク質の精製。WTのMHVのnsp15およびT98MのcDNA配列は、適切なプライマーを用いて増幅され、融合PCRを用いてpET-His-SUMOベクターにサブクローン化された。WTのnsp15またはT98Mの変異遺伝子を保有する構築物は、Rosetta(DE3)pLys細胞に転換された。50μg/mLのアンピシリンと17μg/mLのクロラムフェニコールの存在下において、100mLのTB培地に、単一コロニーを接種し、37℃で夜通し培養した。培養したものを3LのTB培地に移し、OD600が0.8に到達するまで培養した。温度は16℃まで下げ、最終濃度0.2mMとなるよう、20時間でIPTG(イソプロピルチオガラクトシド)を添加した。細胞を10分間8000×gで遠心分離することにより回収し、細胞ペレットを、10%のグリセロール、50mMのHEPES(pH 7.0)、400mMの塩化ナトリウム、5mMのβ-ΜΕ、および10mMのイミダゾールを含む溶解バッファで懸濁した。溶解物を30分間、15,000×gで遠心分離し、上清をNi-NTAカラムにロードした。その後、Ni-NTAカラムを、20mMのイミダゾールを含む溶解バッファで3回洗浄した。タンパク質は、500mMのイミダゾールを含む溶出バッファで溶出した後、バッファを、10%のグリセロール、20mMのトリス-CI(pH 7.5)、および5mMのβ-ΜΕに変更した。サンプルを、0~1Mの塩化ナトリウムを含むトリスバッファの勾配を有するMono Q-Sepharoseによってさらに精製した。nsp15は、BSAの既知の濃度と比較してSDS-PAGEによって定量化され、10%のグリセロール、20mMのトリス-CI、pH7.5、300mMの塩化ナトリウム、および10mMのβ-ΜΕを含むバッファにおいて-80℃で保存された。
動的光散乱法(DLS)。組換MHVのnsp15またはT98Mタンパク質を、ストレージバッファ(10%のグリセロール、20mMのトリス-CI、pH7.5、300mMの塩化ナトリウム、および5mMのβ-ΜΕ)において異なる濃度で希釈した。サイズの計測は、室温においてZetasizer Nano-S動的光散乱装置(Malvern Instruments社)によって行われた。それぞれのサンプルは、少なくとも3回計測された。平均強度およびサイズを示した。
示差走査蛍光分析(DSF)アッセイ。DSFは、Stratagene MX3005PリアルタイムPCR装置内で行われた。サンプルは、1xSYPRO Orange、10μMの組換タンパク質を含む。すべてのサンプルは、0.5℃/分の速度で加熱され、蛍光強度およびTm(融解温度)が特定された。
バイオアナライザRNA分析。BMDMから精製した全RNAの等量を、RNA Nano LabChipsを用いた、Agilent 2100 Bioanalyzerで分析した。
マウスの実験。すべての実験は、ロヨラ大学シカゴIACUCによって審査され承認されたプロトコルを用いて行われた。C57BL/6Jマウスは、ジャクソン研究所から購入した。頭蓋内(i.e.)感染については、生後6週のマウスに対し、WTまたはMHV変異体600PFU/20μLを接種した。感染したマウスについては体重を毎日観察し、IACUCプロトコルに基づいて25%以上の体重減少が確認された場合には安楽死させた。生存率のグラフは、Prism7ソフトウェア(GraphPad Software社)を用いて作成した。生存率の統計分析は、ログランク検定を用いて実施した。腹腔内(i.p.)感染については、生後6週のマウスに対し、100μLの1xPBS内の60,000PFUを接種した。指示された時点において臓器を摘出し、ウイルス複製について評価した。ウイルス病原の証拠は、H&E染色によって判定された。
配列アライメント。Clustal Wを用いたコロナウイルスのサブグループの代表株からのnsp15 T98領域。アルファコロナウイルス:NL63(アムステルダムI株、AY567487)、PEDV(CV777株、NC_003436);ベータコロナウイルス:MHV,(A59株、AY910861);SARS-CoV(MA15株、FJ882957);MERS-CoV(EMC株、JX869059);ガンマコロナウイルス:IBV(Beaudette株、NC_001451);デルタコロナウイルス:PDCoV(KJ567050)。
本発明は、特定または具体的な実施形態および調査について説明したが、当該分野における当業者によって改変が適用可能であることは明らかである。たとえば、特定の変異コロナウイルスは、上述したものとは異なり得るし、さらなる変異を有することも可能である。したがって、本発明は、本明細書または図面に記載された実施形態により不必要に限定されるものではない。本明細書中に使用された語法と用語は、開示された実施形態と調査を説明する目的で使用されたのであり、本発明の範囲を限定するものではない。したがって、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
Claims (18)
- 非構造タンパク質nsp15を備えるポリタンパク質をコードする、変異レプリカーゼ遺伝子を備え、該レプリカーゼ遺伝子は、前記nsp15をコードして、前記nsp15の安定性および活性に影響を与える、変異および/または欠失を含む変更を生じさせる、生でかつ弱毒である、コロナウイルス。
- 前記変更は、位置98におけるトレオニンからメチオニンへのアミノ酸変異、または、位置262における触媒ヒスチジンからアラニンへのアミノ酸変異からなる、請求項1に記載のコロナウイルス。
- 前記コロナウイルスは、野生型コロナウイルスの変種である、請求項1に記載のコロナウイルス。
- 前記野生型コロナウイルスは、コロナウイルス亜科に属するコロナウイルスからなる、請求項3に記載のコロナウイルス。
- 前記コロナウイルス亜科に属するコロナウイルスは、SARSコロナウイルス、MERSコロナウイルス、ヒトコロナウイルス229E、ヒトコロナウイルスOC43、ヒトコロナウイルスHKU1、ヒトコロナウイルスNL63、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、イヌコロナウイルス、鶏伝染性気管支炎ウイルス、ウシコロナウイルス、および、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタデルタコロナウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ呼吸器型コロナウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎コロナウイルスを含むブタコロナウイルスからなる群から選択される、請求項4に記載のコロナウイルス。
- 請求項1に記載の前記変異レプリカーゼ遺伝子。
- 請求項6に記載の前記変異レプリカーゼ遺伝子によりコードされたタンパク質。
- 請求項6に記載の前記変異レプリカーゼ遺伝子を備えるプラスミド。
- キャリアと、請求項1に記載のコロナウイルスとを備えるワクチン。
- 請求項9に記載したワクチンをヒト対象に投与することからなる、ヒト対象の疾患を予防する方法。
- 前記ワクチンを投与することにより、ヒト対象のI型インターフェロンを活性化させ、対応する野生型レプリカーゼ遺伝子を発現するコロナウイルスに関して、該コロナウイルスの病原性を低減させる、請求項10に記載のヒト対象の疾患を予防する方法。
- ヒト対象のI型インターフェロンを活性化させて、該I型インターフェロンの活性化により、コロナウイルスの病原性を低減させる、ヒト対象の疾患を予防する方法。
- 野生型コロナウイルスを改質して、ポリタンパク質をコードし、nsp15の安定性および活性に影響を与える、該nsp15における変異および/または欠失を含む変更を生じさせる、変異レプリカーゼ遺伝子を備える、生でかつ弱毒である、コロナウイルスを生産し、および、
該コロナウイルと、キャリアとを備え、ヒト対象に投与されることで、該ヒト対象のI型インターフェロンを活性化させ、前記野生型コロナウイルスの行現姓を低減させることが可能である、ワクチンを生産する、
ワクチンの製造方法。 - 前記変更は、位置98におけるトレオニンからメチオニンへのアミノ酸変異、または、位置262における触媒ヒスチジンからアラニンへのアミノ酸変位からなる、請求項13に記載のワクチンの製造方法。
- 前記野生型コロナウイルスは、コロナウイルス亜科に属するコロナウイルスからなる、請求項13に記載のワクチンの製造方法。
- 前記コロナウイルス亜科に属するコロナウイルスは、SARSコロナウイルス、MERSコロナウイルス、ヒトコロナウイルス229E、ヒトコロナウイルスOC43、ヒトコロナウイルスHKU1、ヒトコロナウイルスNL63、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、イヌコロナウイルス、鶏伝染性気管支炎ウイルス、ウシコロナウイルス、および、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタデルタコロナウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ呼吸器型コロナウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎コロナウイルスを含むブタコロナウイルスからなる群から選択される、請求項13に記載のワクチンの製造方法。
- 前記ヒト対象に前記ワクチンを投与することをさらに備える、請求項16に記載のワクチンの製造方法。
- 前記ヒト対象に前記ワクチンを投与することをさらに備える、請求項13に記載のワクチンの製造方法。
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