CN110892063A - 冠状病毒、包含其的疫苗以及预防疾病的方法 - Google Patents

冠状病毒、包含其的疫苗以及预防疾病的方法 Download PDF

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Abstract

一种冠状病毒、包含其的疫苗和预防疾病的方法。这类的一个实施方式包括活的减毒冠状病毒，其包含编码多蛋白的变体复制酶基因，所述多蛋白包含非结构蛋白（nsp）‑15，所述复制酶基因编码nsp15并引起影响nsp15稳定性或活性的任何变化，包括突变和/或缺失。

Description

冠状病毒、包含其的疫苗以及预防疾病的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年3月3日提交的美国临时申请号为62/466,779的权益，其内容通过引用结合至本申请。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的资助或合同号R01 AI085089以及美国农业部授予的农业研究服务项目5030-32000-118-11S的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
本发明通常涉及冠状病毒。本发明特别涉及用于现有的和新兴的冠状病毒的疫苗及其生产方法。
冠状病毒为冠状病毒科中属于冠状病毒亚科的病毒种类，是感染人类和动物并引起呼吸道、胃肠道或神经系统疾病的正义RNA病毒。冠状病毒可以从动物宿主中出现，在人类中引起重大流行病，例如2002-2003年的严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，其被认为是2012年的一种新兴的病毒。值得注意的是，这些病毒可以在巨噬细胞的细胞质中复制，巨噬细胞被认为是一种用于检测和消除入侵病原体的关键的先天哨兵的细胞类型。冠状病毒编码多种干扰素拮抗剂，其可能阻碍和延迟I型干扰素(IFN)和干扰素刺激基因(ISG)的激活，并且一系列拮抗剂的表达导致发病。最近一项使用SARS-CoV感染小鼠的研究记录了导致疾病的干扰素的延迟和有限产生。
用于冠状病毒疾病的现有疫苗方法基于通过表达载体的自发性天然减毒、病毒灭活和重组病毒结构蛋白。现有候选疫苗不会引发强烈的保护性免疫应答。缺乏长期保护可能是由于先天免疫反应的低效诱导，例如1型干扰素，它是促进适应性免疫和免疫记忆的关键分子。
鉴于上述情况，可以理解，存在对于治疗冠状病毒的持续期望，并且如果疫苗为可用于接种针对各种冠状病毒受试者的疫苗，包括可以刺激强烈的先天免疫应答和有效的适应性免疫保护的疫苗，将会是理想的。
发明内容
本发明提供突变体冠状病毒、包含突变体冠状病毒的疫苗、制备疫苗的方法和个体预防疾病的方法。
根据本发明的一个方面，提供了一种活的减毒冠状病毒，其包括编码多蛋白的变体复制酶基因，所述多蛋白包含非结构蛋白(nsp)-15。所述复制酶基因编码nsp15，并引起影响nsp15稳定性或活性的任何变化，包括突变和/或缺失。
本发明的其它方面包括包含上述冠状病毒的变体复制酶基因、由所述变体复制酶基因编码的蛋白质、包含此类变体复制酶基因的质粒、包含上述冠状病毒的疫苗，以及通过向个体施用所述疫苗来治疗或预防个体疾病的方法。
根据本发明的另一方面，提供了一种预防个体疾病的方法，包括在个体中激活I型干扰素，其中I型干扰素的激活降低了冠状病毒的致病性。
根据本发明的另一方面，提供了一种生产疫苗的方法，包括修饰野生型冠状病毒以产生活的减毒冠状病毒，其包含编码多蛋白的变体复制酶基因并在非结构蛋白(nsp)-15中产生影响nsp15稳定性或活性的变化，包括突变和/或缺失。包括冠状病毒和载体的疫苗可以被生产。给个体施用疫苗会引起个体中I型干扰素的激活，这降低了野生型冠状病毒的致病性。
如上所述的冠状病毒的技术效果优选包括能够使用冠状病毒接种个体，所述冠状病毒引起I型干扰素的激活，其将限制病毒的复制、传播和疾病。
从以下详细描述中将进一步理解本发明的其它方面和优点。
附图说明
图1A至1D包括突出非结构蛋白15和保守残基苏氨酸98的鼠冠状病毒基因组的示意图。图1A是小鼠肝炎病毒(MHV)A59(MHV-A59)基因组的示意图。PLP1/2：木瓜蛋白酶样蛋白酶1/2；ADRP，ADP-核糖-1'-单磷酸酶；3CLpro，3C样蛋白酶；RDRP，RNA依赖性RNA聚合酶；Hel，解旋酶；ExoN，3'→5'核酸外切酶；NendoU，套式病毒尿苷酸特异性内切核糖核酸酶；2'OMT，核糖-2'-O-甲基转移酶。图1B表示nsp15的晶体结构，其中N结构域、M结构域、C结构域以90℃旋转表示。T98显示与L57(N结构域)和催化残基(C结构域)相关。蛋白质数据库ID：2GTH。图1C表示每种冠状病毒基因型的突变位点和病毒感染的骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)中I型干扰素的诱导指示。图1D使用Clustal W示出来自冠状病毒亚组的代表性株的nsp15T98区域的序列比对。
图2A至2D表明MHV nsp15突变体病毒激活I型干扰素的表达，并且在BMDM中复制而受损。图2A显示通过定量RT-PCR的感染野生型(WT)MHV或N15m1的BMDM中的IFN-α11 mRNA水平。将数值标准化为β-肌动蛋白并使用非配对T检验进行分析。图2B显示通过定量ELISA检测的感染的BMDM的上清液中分泌的IFNα蛋白水平。使用双向方差测试分析数值。图2C和2D分别表示WT和N15m1在B6 BMDM和ifnar-/-BMDM中的生长动力学(MOI为0.1)。在指定的hpi收集上清液的病毒滴度，并使用17CI-1细胞通过噬斑测定法测定滴度。使用非配对T检验分析数值。数据代表2-3个独立实验，并以平均值±SD表示。
图3A至3D表明MHV nsp15突变体病毒在BMDM中诱导快速凋亡细胞死亡。图3A表明BMDM被WT、N15m1或紫外线(UV)灭活的N15m1(UV-N15m1)MHV感染。在24hpi，使用CellTiterGlo测定法定量病毒感染的BMDM的细胞活力。使用非配对T检验分析数值。图3B表示BMDM用WT或N15m1 MHV感染，随后用DMSO，zVAD(20μM)，坏死性凋亡抑制剂-1(Necrostatin-1，Nec-1)(25μM)或VX-765(20μM)处理。通过CellTiter Glo测定法在24hpi测量细胞活力。使用非配对T检验分析数值。图3C表示用WT或N15m1 MHV接种BMDM，并向培养基中加入zVAD(20μM)。在24hpi，通过半胱天冬酶3/7-Glo活性测定法测定半胱天冬酶3/7活性。数值以相对光单位(RLU)显示并使用双向方差测试进行分析。图3D表示BMDM被WT或N15m1 MHV感染，并且在指定的时间点收集细胞裂解物。蛋白质印迹检测裂解的半胱天冬酶3和N蛋白。所有感染的MOI均为0.1。数据代表2-3个独立实验，并以平均值±SD表示。
图4A至4D表明MHV nsp15突变体病毒感染激活宿主双链RNA(dsRNA)传感器。图4A表明BMDM用WT或N15m1 MHV(MOI为0.1)感染。在16hpi，裂解细胞，通过蛋白质印迹检测磷酸化-eIF2α、eIF2α和病毒N蛋白的40μg细胞裂解物。钙联接蛋白用作内参对照。图4B显示PKR抑制剂阻断N15m1诱导的B6 BMDM中的细胞凋亡。用WT或N15m1(MOI为0.1)感染细胞，随后用PKR抑制剂C16(1μM)处理。收集细胞并在指定的时间点评估半胱天冬酶3/7的活性。数值以相对光单位(RLU)显示并使用双向方差测试进行分析。图4C表示使用生物分析仪(MOI为1)从感染的BMDM中提取的300ng总RNA的RNA降解模式。RNA完整性数(RIN)以及28S、18S的rRNA和tRNA的位置分别显示在图像的底部和右侧。图4D显示在18hpi来自用C16抑制剂(1μM)或zVAD(20μM)处理的感染的BMDM(MOI为0.1)的RNA的RNA降解模式。数据代表2-3个独立实验。
图5A至5D表明T98M突变导致nsp15蛋白不稳定。图5A表示在16hpi时裂解MOI为0.1的WT或N15m1病毒感染的BMDM，并通过蛋白质印迹检测病毒N蛋白、nsp15和β-肌动蛋白。图5B表示从大肠杆菌表达并纯化nsp15的WT和T98M突变体。考马斯蓝染色显示纯化的Sumo标记的nsp15和T98M，其使用蛋白质印迹(底部)通过nsp15抗体进行检测。图5C表示nsp15野生型(黑色)和nsp15-T98M突变体(红色)蛋白的差示扫描荧光测定(DSF)热变换分析。图5D表示在5mM Mn2+存在下用WT Nsp15或T98M随时间处理放射性标记的RNA分子R16.4。在指定的时间点，在变性的20％聚丙烯酰胺凝胶上分析反应的等分试样。RNA R16.4的序列显示在凝胶图像上方。在13号位，唯一的尿嘧啶带有下划线。数据代表2-3个独立实验。
图6A至6D表示失去干扰素拮抗作用的N15m3病毒(nsp15-H262A)拟表型N15m1病毒。图6A表示B6 BMDM用MOI为0.1的WT或nsp15突变体病毒(N15m1或N15m3)感染。在12hpi时，提取总RNA并分析IFN-α11 mRNA水平。数值表示为平均值±SD，并使用非配对T检验进行分析。图6B表示B6或ifnar-/-BMDM用MOI为0.1的WT或N15m3感染。在指定的时间点，收集细胞上清液用于17CL-1细胞中的噬斑测定。数值表示为平均值±SD，并使用非配对T检验进行分析。图6C表示B6 BMDM用MOI为0.1的WT或N15m3感染，并收获用于在指定时间点分析半胱天冬酶3/7的活性。数值表示为平均值±SD，并使用非配对T检验进行分析。图6D表示使用生物分析仪(MOI为0.1)从感染的BMDM中提取的500ng总RNA的RNA降解模式。RNA完整性数(RIN)以及28S和18S的rRNA的位置分别指向图像的底部和右侧。数据代表2-3个独立实验。
图7A和7B表明Nsp15的突变影响病毒感染的BMDM中的双链RNA(dsRNA)分布。在图7A和7B中，BMDM用MOI为0.1的WT或N15m3感染。将细胞在6hpi固定，并用抗dsRNA、抗nsp2/3和Hoescht 33342(图7A)或抗dsRNA、抗nsp15和Hoescht 33342(图7B)染色。基于dsRNA荧光产生斑点的表面，并在每个表面内测量nsp荧光。使用IMARIS软件程序计算来自25个图像的焦点数。通过将总dsRNA焦点除以nsp2/3焦点来计算dsRNA/nsp2/3的比值(图7A)。通过将dsRNA+nsp15+焦点除以总dsRNA焦点来计算nsp15与dsRNA的共定位百分比。通过非配对T检验分析数值。比例尺：5μM。
图8A至8G表明MHV Nsp15突变体病毒在小鼠中高度减毒并诱导保护性免疫应答。图8A显示来自感染WT或N15m1病毒的小鼠的器官中的病毒负荷。用6.0×104PFU病毒腹膜内接种6周龄的C57BL/6J小鼠(n＝4)。在指定的时间点收获肝脏和脾脏，并通过噬斑测定法测试病毒滴度。红色虚线表示检测限。图8B表示用6.0x104 PFU病毒腹膜内接种C57BL/6J小鼠。在24hpi，收获肠系膜淋巴结(MLN)并通过定量RT-PCR靶向N基因来测量病毒基因组。将数值标准化为β-肌动蛋白。***，p<0.001，非配对t检验。图8C表示通过WT和N15m1感染的小鼠中的箭头所示的苏木精和伊红(H&E)染色的肝脏病理学。数据代表5只小鼠。在图8D和8E中，通过颅内(IC)注射用600PFU的WT或N15m1病毒接种小鼠。通过体重减轻百分比(图8D)和存活百分比(图8E)测量病毒致病性。在图8F和8G中，来自图8D的13周龄首次接受试验的(naive)小鼠和N15m1感染的小鼠，通过颅内(IC)接种，用6.0x103 PFU WT病毒攻击。通过体重减轻百分比(图8F)和存活百分比(图8G)测量病毒致病性。鼠数量(n)被显示。使用对数秩检验计算存活率的p值。
图9A和9B表示猪流行性腹泻病毒(PEDV)EndoU缺陷型突变体增加感染的猪巨噬细胞中的I型干扰素产生。图9A是野生型PEDV的感染性克隆(icPEDV)和PEDV nsp15突变体病毒的感染性克隆(icPEDV-deEndoU)的示意图。图9B表示Vero细胞用0.1噬斑形成单位/细胞的icPEDV或icPEDV-deEndoU感染。在指定的时间点，收集细胞上清液用于病毒滴定。数据表明icPEDV和icPEDV-deEndoU都在Vero细胞中有效繁殖并表现出类似的生长动力学。图9C表示用icPEDV或icPEDV-deEndoU病毒感染原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)并在指定的时间点收获。从收获的细胞中提取总RNA并转录成cDNA。通过使用定量PCR检查其mRNA水平来评估I型干扰素(IFN-α和IFN-β)的产生。数据表明，与野生型PEDV感染(N.D.＝未检测到)相比，PEDVdeEndoU突变体病毒在PAM中刺激显著高水平的I型IFN产生。
图10A和10B表示N15m1，但不是N3m病毒，诱导IFN活化。图10A表明BMDM被WT或N15m1 MHV感染(MOI为0.1)。在12hpi时，感染的细胞用4％的甲醛固定，并用Hoechst 33342(细胞核，蓝色)、抗核衣壳(N，红色)和抗ISG54(绿色)染色。通过共聚焦显微镜检测免疫荧光。图10B表示BMDM被WT、N3m或N15m1 MHV感染(MOI为0.1)。通过定量RT-PCR在12hpi测定IFN-α11 mRNA水平。数值被标准化为β-肌动蛋白。n.s.，不显著的，非配对t检验。
图11A和11B表明N15m1诱导快速凋亡细胞死亡。图11A显示B6 BMDM用WT、N15m1或UV灭活的N15m1(UV-N15m1)MHV感染。在24hpi，在明视野显微镜下观察到细胞病变效应。图11B表示通过电子显微镜在用星形孢菌素(1μM)处理或在16hpi用WT或N15m1 MHV感染的BMDM中测定指示细胞凋亡的核染色质(黑色箭头)凝聚。
图12A和12B表明N15m1诱导的细胞凋亡可以被PKR抑制剂C16抑制并且需要I型IFN受体。图12A表示B6 BMDM用MOI为0.1的WT或N15m1感染。在18hpi评估细胞病变效应和细胞活力。****，p<0.0001，未配对T检验。图12B表示B6或ifnar-/-BMDM使用MOI为在18hpi通过Caspase 3/7-Glo测定法测量半胱天冬酶3/7活性的WT或N15m1感染。****，p<0.0001，双向方差测试。数据代表2-3个独立实验。图12B中的数据以相对光单位(RLU)显示并表示为平均值±SD。
图13表明T98M突变改变了nsp15的寡聚化。动态光散射用于评估在WT和T98Mnsp15浓度增加时存在的单体和六聚体的百分比。
图14A和14B表明N15m3在B6 BMDM中诱导快速的细胞死亡。B6 BMDM用WT、N15m1或N15m3病毒感染，MOI为0.1。图14A表示在24hpi，使用CellTiter Glo测定法测定细胞活力。通过非配对T检验分析数值。图14B表示在12hpi时，收获细胞并使用20ug总裂解物检测nsp15、N蛋白和内参对照(β-肌动蛋白)。
图15A和15B表明Nsp15内切核酸酶活性不改变感染的BMDM中dsRNA的量。B6(图15A)或ifnar-/-BMDM(图15B)用MOI为0.1的WT或N15m3病毒感染。在6hpi时，对细胞进行dsRNA染色并通过流式细胞术分析。
图16A和16B表明Nsp15影响感染的BMDM中dsRNA的分布。用MOI为0.1的WT或N15m3感染BMDM。将细胞在6hpi固定并用抗dsRNA、抗nsp2/3和Hoescht 33342染色。使用IMARIS软件程序计数来自25个图像的焦点数。图16A表示在ifnar-/-BMDM中计数dsRNA和nsp2/3焦点的数目。图16B表示dsRNA和nsp2/3在B6 BMDM中的定位。计数dsRNA和nsp2/3焦点的数目，并通过将总dsRNA焦点除以nsp2/3焦点的数量来计算dsRNA/nsp2/3的比值(图16A)。通过非配对T检验分析数值。比例尺：5μM。
图17A和17B表明Nsp15突变体病毒在C57BL/6小鼠中减毒，但在ifnar-/-小鼠中没有减毒。用6.0×104PFU病毒腹膜内接种6周龄C57BL/6小鼠(n＝5)。在5dpi时，通过H&E染色确定肝脏病理学(图17A)。在3和5dpi收获肝脏，并使用17CI-1细胞通过噬斑测定测试病毒滴度(图17B)。红色虚线表示检测限。
具体实施方式
本公开提供了突变体冠状病毒、包含突变体冠状病毒的疫苗、制备疫苗的方法和预防疾病的方法。
通过dsRNA中间体复制的RNA病毒可以通过宿主dsRNA传感器检测为“非己”，包括细胞质RIG样受体(RLRs)。RLR的激活刺激干扰素的产生，干扰素上调其它dsRNA传感器，如PKR和OAS/RNase L系统，以及数百种抗病毒干扰素刺激基因(ISGs)。此外，成功感知dsRNA的病毒感染细胞分泌的干扰素可诱导邻近细胞的抗病毒状态，并限制潜在入侵RNA病毒的复制。因此，许多病毒已经发展出隔离(sequester)dsRNA以逃避宿主传感器检测的策略。本公开提出了冠状病毒nsp15在阻断巨噬细胞中dsRNA传感器激活方面的先前未被认识的作用，从而使病毒复制和后代病毒的传播成为可能。
为了研究冠状病毒对干扰素反应的拮抗作用，本发明开展了对小鼠肝炎病毒株A59(MHV-A59)的研究测试，其为在多种鼠类细胞类型(包括巨噬细胞)中复制并且可以引起急性肝炎或致死性脑炎(取决于注射部位)的模型冠状病毒。病毒基因组RNA是32千碱基，基因组的三分之二编码大的复制酶多蛋白，而基因组的其余部分编码结构蛋白和株特异性辅助蛋白(图1A)。复制酶多蛋白由病毒蛋白酶加工成十六种非结构蛋白(nsp)。病毒非结构蛋白(nsp)与宿主内质网一起组装以产生复杂的膜和双膜囊泡(DMV)，其为病毒RNA合成的位点。冠状病毒RNA复制是通过产生嵌套的(nested-set)负链RNA进行的，所述负链RNA用作合成新的正链基因组和mRNA的模板。双链RNA(dsRNA)中间体，细胞质先天传感器的有效刺激物，在此过程中产生，并与DMV可视化结合。冠状病毒DMV的潜在功能可以是将病毒dsRNA与宿主dsRNA传感器隔离开来。然而，尚不清楚单独的DMV是否足以阻止宿主先天免疫应答的激活。本文报道的研究令人惊讶地显示冠状病毒非结构蛋白15(nsp15)，一种具有内切核糖核酸酶活性的高度保守的套式病毒(冠状病毒和动脉炎病毒(anterivuses))组分，与病毒复制复合物一起作用以限制病毒dsRNA暴露于宿主dsRNA传感器。
Nsp15是通过病毒蛋白酶介导的复制酶多蛋白加工产生的非结构蛋白(图1A)。生物信息学分析显示，nsp15含有与细胞内切核糖核酸酶具有远端同源性的结构域，称为NendoU，其在脊椎动物套式病毒中高度保守。结构和生物化学研究表明，SARS-CoV和MHVnsp15以及动脉炎病毒直系同源物nsp11可以组装形成寡聚体，并优先使用3'尿苷酸切割ssRNA和dsRNA分子。然而，内切核糖核酸酶活性在套式病毒复制和发病机制中的作用以前尚未得到很好的理解。研究人员无法恢复编码内切核糖核酸酶催化位点突变体的人CoV229E病毒，因此得出结论，nsp15对于冠状病毒复制至关重要；而编码nsp15催化位点突变的MHV在成纤维细胞系中复制至降低的滴度(约1log)。
本发明的研究确定nsp15本身不是病毒RNA合成所必需的，但是用于介导逃避宿主dsRNA传感器。具体而言，使nsp15不稳定或使内切核糖核酸酶活性失效的编码nsp15突变的冠状病毒，激活干扰素和dsRNA传感器PKR和OAS以促进巨噬细胞中的凋亡性细胞死亡。因此，nsp15对于小鼠中的病毒感染和传播是必需的，并且nsp15突变体病毒可以诱导保护性免疫应答。
现在将参考引出本发明的实验研究来描述本发明的非限制性实施方式。
筛选方法用于鉴定冠状病毒用于阻断先天免疫应答的机制，特别是I型干扰素(IFN-α/β)的激活。这些筛选鉴定出一种病毒分离物，命名为N15m1，其在感染鼠骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)时引发IFN-α的产生(总结于图1C)。病毒基因组RNA的深度测序显示N15m1含有nsp15中的突变(苏氨酸98至甲硫氨酸[T98M])和nsp3中的突变(精氨酸971至丙氨酸[R971A])。正如定量PCR(qPCR)所测得的，用N15m1感染巨噬细胞激活了IFN-α的转录(图2A)，并且，正如ELISA所测得的，增加了分泌的IFN-α蛋白的量(图2B)。正如免疫荧光染色检测的，I型干扰素激活的一个结果是干扰素刺激的ISG54的上调(图10A)。nsp15中的苏氨酸-98残基在冠状病毒中高度保守(图1D)，并且可能对功能性至关重要。此外，设计了一种“干净的”nsp3突变体病毒，命名为N3m(图1C)，其仅含有R971A突变。N3m保留了作为WT病毒拮抗干扰素的能力(图10B)，进一步表明nsp15中的T98M突变导致IFN-α拮抗作用的丧失。
为了确定IFN-α和ISG的表达是否改变病毒复制动力学或滴度，野生型(B6)和I型干扰素受体缺陷(ifnar-/-)BMDM被低感染复数(MOI为0.1)的WT或N15m1病毒感染，并随着时间的推移监测病毒的产生。N15m1的复制在B6 BMDM中显著延迟和降低，并且在8hpi后产生的子代病毒水平显著低于WT病毒的子代病毒水平(图2C)。由于N15m1具有与WT病毒相似的动力学(图2D)，因此在ifnar-/-BMDM中未观察到N15m1的复制缺陷，这与干扰素限制病毒复制的想法一致。总之，结论是nsp15中的T98M突变导致病毒不能阻断巨噬细胞中I型干扰素的激活。这些结果表明野生型nsp15在病毒感染的情况下作为I型IFN拮抗剂起作用。
在进行上述生长动力学实验时，观察到N15m1感染的巨噬细胞比用WT病毒或UV灭活病毒感染的细胞死亡得更快。如图3A所示，N15m1感染的BMDM在24hpi时具有显著降低的细胞活力(还参见图11A)。此外，泛半胱天冬酶抑制剂zVAD，但不是RIPK1抑制剂Nec-1或半胱天冬酶-1抑制剂VX-765，阻止了病毒诱导的细胞死亡(图3B)。这些结果表明N15m1感染激活凋亡性细胞死亡而不是RIPK1/RIPK3依赖性坏死性凋亡或半胱天冬酶-1介导的细胞焦亡。通过评估细胞凋亡的其它特征来支持这一发现：在受到zVAD抑制的N15m1感染的BMDM中增强的半胱天冬酶-3/7活性(图3C)；通过检测裂解的半胱天冬酶-3产物水平的增加也证实了半胱天冬酶3/7依赖性细胞凋亡途径的激活(图3D)；与WT感染的BMDM相比，通过电子显微镜(EM)在N15m1中观察到凝聚的、边缘化的染色质和核碎裂(图11B)。总之，这些数据证明N15m1感染诱导巨噬细胞中的细胞凋亡，表明WT nsp15不仅拮抗I型干扰素的激活，而且还防止凋亡性细胞死亡。
I型干扰素合成和凋亡性细胞死亡由识别病毒dsRNA的宿主膜相关或细胞质传感器触发。干扰素刺激的基因2'5'-寡腺苷酸合成酶(OAS)和蛋白激酶R(PKR)的dsRNA依赖性激活可以引发凋亡性细胞死亡。在先研究表明，SARS-CoV和MHV nsp15是病毒内切核糖核酸酶，并且其均可结合并切割RNA分子(ssRNA和dsRNA)。因此，假设WT nsp15可以通过从宿主传感器中隔离dsRNA来阻断干扰素合成并防止细胞凋亡。为了解决nsp15是否阻止dsRNA传感器的激活，评估磷酸化的eIF2α(PKR激活的指示物)和核糖体RNA(rRNA)的降解(活性2'5'-OAS/核糖核酸酶L(RNaseL)系统信号传导的指示物)。与WT病毒感染相比，在用N15m1感染的BMDM中观察到eIF2α的磷酸化增加(图4A)。添加特异性PKR激酶抑制剂C16显著降低了与N15m1感染细胞中的细胞凋亡相关的半胱天冬酶3/7的激活水平(图4B和12A)。
如通过12和24hpi的rRNA降解所揭示的，还观察到2'5'-OAS/核糖核酸酶L(RNaseL)途径的激活(图4C)。宿主rRNA的降解不受zVAD或C16的抑制(图4D)，表明2'5'-OAS/RNaseL的激活不是细胞凋亡的结果，并且不依赖于PKR途径。最后，在N15m1感染的巨噬细胞中半胱天冬酶-3裂解或半胱天冬酶-3/7的激活依赖于IFN受体(图4C和12B)，进一步表明观察到的细胞凋亡依赖于干扰素刺激的基因。总之，这些数据表明在N15m1感染巨噬细胞期间，病毒dsRNA检测触发了eIF2α磷酸化、RNA降解、半胱天冬酶3/7的激活和细胞凋亡。这些结果支持WT nsp15用于阻止dsRNA介导的先天免疫应答激活的假设。
T98M突变位于nsp15的N-末端结构域和中间结构域之间的界面处(图1B)，其可以影响寡聚体的稳定性或组装。发现与WT感染的细胞相比，在N15m1感染的细胞中nsp15的水平确实显著降低，而N蛋白的水平只有极小的减少(图5A)。N15m1感染的B6 BMDM中nsp15水平的降低不仅仅是由于病毒复制的减少，因为在N15m1感染的ifnar-/-BMDM中也观察到该减少(图5A)，其中两种病毒具有相似的N蛋白水平和类似的生长动力学(图2D)。降低的检测也不是由于nsp15抗体对突变蛋白的亲和力，因为通过nsp15多克隆抗血清等效地检测到从大肠杆菌纯化的野生型和T98M nsp15蛋白(图5B，下图)。这些结果表明T98M突变使nsp15不稳定，导致N15m1感染细胞中蛋白质的稳态水平降低。
为了进一步评估T98M突变对nsp15蛋白的影响，克隆了野生型和T98M nsp15蛋白的密码子优化形式，并在大肠杆菌中表达为SUMO-融合蛋白(图3B，上图)。基于nsp15的结构，SUMO标签(tag)不会影响低聚物的组装，例如先前报道的nsp15的六聚体。为了进一步评估T98M突变是否使蛋白质不稳定，使用差示扫描荧光测定法(DSF)测量nsp15响应于热的稳定性(图5C)。WT nsp15在47℃下表现出向变性状态的主要转变。相反，T98M突变体在40℃变性，比WT nsp15低7度，进一步表明T98M突变使nsp15更不稳定。
使用动态光散射(DLS)光谱测定法，发现大多数WT nsp15组装形成蛋白质浓度为0.05mg/ml的寡聚体(图13)。相反，在这些条件下以单体形式检测到nsp15-T98M突变体的主要部分(图13)。为了确定nsp15-T98M的寡聚化受损或缺乏是否影响内切核糖核酸酶活性，进行了评估，发现与WT蛋白相比，T98M突变体表现出RNA切割活性的显著降低(图5D)。总之，WT和T98M nsp15蛋白的体外表征证明T98M突变降低蛋白质稳定性并损害内切核糖核酸酶活性。这些结果被解释为进一步证明编码包含nsp15的多蛋白并且在nsp15中引起任何变化(包括突变和/或缺失)的变体复制酶基因具有影响nsp15稳定性(使不稳定)或活性(使失活)的能力。
由于T98M突变导致蛋白质损失并损害nsp15的内切核糖核酸酶活性，因此进行实验以确定内切核糖核酸酶活性是否对逃避宿主dsRNA传感器至关重要。生成具有内切核酸酶无活性形式的nsp15(H262A)的突变体病毒，命名为N15m3。发现用N15m3感染巨噬细胞会导致IFN-α的转录提高(图6A)，B6中存在复制缺陷，但在ifnar-/-BMDM中则没有(图6B)，快速凋亡性细胞死亡(图6C和14A)和rRNA降解(图6D)，证明N15m3拟表型为N15m1病毒。H262A突变不影响nsp15的稳态水平，因为与N15m1不同，N15m3在ifnar-/-BMDM中表达与WT病毒相似的nsp15水平(图14B)。因此，确定内切核糖核酸酶活性(H262A)的丧失概括了与T98M突变导致的nsp15蛋白丧失相关的拟表型。总之，这些结果表明nsp15内切核糖核酸酶活性对于逃避宿主dsRNA传感器是重要的。
来自大肠杆菌的纯化的MHV nsp15在锰存在下表现出内切核酸酶活性，并且用丙氨酸(H262A)取代催化组氨酸262导致无活性的酶。因此，选择N15m3病毒，因为它含有催化失活形式的nsp15(H262A)，以进一步确定内切核糖核酸酶活性在阻止宿主dsRNA传感器活化中的作用。由于CoV感染在病毒复制期间产生dsRNA中间体，因此假设nsp15可以降解病毒dsRNA以防止dsRNA的积累。为了测试该假设，用WT或N15m3病毒感染B6或ifnar-/-BMDM并测量dsRNA的水平。令人惊讶的是，未观察到通过dsRNA的荧光强度测量的N15m3感染细胞中dsRNA水平的增加或使用流式细胞术检测的dsRNA阳性细胞的百分比(图15)，暗示nsp15的拮抗功能可能不会通过病毒dsRNA的降解而被介导。
据信CoV dsRNA主要与复制复合物结合并埋藏在DMV中，DMV被认为保护病毒RNA免受宿主传感器的影响。因此，假设nsp15可以起到维持dsRNA与复制复合物的结合或促进dsRNA包装成DMV的作用。因此，预测nsp15突变体病毒可以产生更多“游离”dsRNA，并且这些游离dsRNA激活宿主传感器。为了测试该假设，使用特异性抗体通过免疫荧光评估dsRNA和复制复合物(nsp2/3作为指示物)的亚细胞定位。有趣的是，发现N15m3感染产生更多的dsRNA焦点，其不与nsp2/3共定位，特别是在ifnar-/-BMDM中(图7A)。
为了量化“游离”dsRNA，使用IMARIS软件程序计数dsRNA和nsp2/3的焦点。发现在ifnar-/-BMDM中具有相似数量的nsp2/3焦点的情况下，N15m3比WT病毒产生更多的dsRNA焦点(图7A左图和16A)。N15m3的“游离”dsRNA焦点的数量以及dsRNA/nsp2/3的比率显著高于WT病毒的“游离”dsRNA焦点数量以及dsRNA/nsp2/3的比率(图7A右图)。在B6 BMDM中，N15m3病毒产生相似数量的dsRNA焦点，但由于复制受损而产生显著减少的nsp2/3焦点(图6B)。观察到N15m3中dsRNA/nsp2/3的比率仍然高于WT病毒中dsRNA/nsp2/3的比率(图16B)，这与从ifnar-/-BMDM获得的结果一致(图7A)。总之，这些数据表明nsp15可能不影响细胞中dsRNA的量，但确实起到维持dsRNA与nsp2/3的关系，以及后来dsRNA包装成DMV的作用。
为了进一步理解nsp15和dsRNA之间的关系，检查了nsp15和dsRNA的定位。据信nsp15与包含病毒复制酶蛋白的特征性斑点中新合成的病毒RNA相关，并且被认为是病毒RNA合成的位点。使用特异性抗体通过免疫荧光显现nsp15和dsRNA。发现与WT感染的细胞相比，在N15m3感染的细胞中与nsp15共定位的dsRNA焦点的数量显著减少(图7B)。这些结果进一步支持nsp15可以与dsRNA和病毒复制复合物结合。因此，可以得出结论，内切核糖核酸酶活性的丧失可能破坏dsRNA和复制复合物的结合，导致宿主传感器感知更多的“游离”dsRNA。
由于nsp15突变体病毒诱导稳健的干扰素应答并激活宿主dsRNA传感器，因此进行了另外的研究以确定nsp15介导的先天免疫应答拮抗作用的丧失是否改变了小鼠冠状病毒的发病机制。为此，使用非致死性感染模型，其中预期WT MHV-A59滴度在感染后第5天达到峰值。给小鼠腹膜内注射60,000PFU，并在感染后第3天和第5天收获肝脏和脾脏以测量病毒复制。有趣的是，用N15m1接种的小鼠中用于计数感染性颗粒的标准噬斑测定对病毒是阴性的(图8A)。用于检测MHV N基因mRNA的更灵敏的RT-qPCR测定法在感染后第1天在肠系膜淋巴结(MLN)中鉴定出最低水平的N15m1 RNA，但在稍后的时间则没有(图8B，数据未示出)。肝脏的组织学检查显示与WT MHV感染相关的典型损伤，但在N15m1感染的小鼠中则没有(图8C)。类似地，N15m3感染的小鼠显示没有与N15m1感染的小鼠类似的肝脏病理学迹象(图17A)。
使用致死攻击模型来确定N15m1病毒是否减毒。仅需要将600PFU的WT病毒引入小鼠颅内以诱导致死性脑炎。感染了WT的小鼠体重减轻并在感染后第7天死于感染。相反，所有N15m1感染的小鼠在感染后存活，在感染后第一天仅表现出短暂的体重减轻，并且随时间增加体重(图8D和8E)。这些数据表明，即使在这种敏感的体内模型中，N15m1也会严重减毒并且没有发病机制。此外，ifnar-/-小鼠覆膜内感染50PFU的WT或突变体病毒，并且所有小鼠迅速死于感染，支持突变体病毒中nsp15的IFN拮抗功能丧失是B6小鼠感染期间减毒的原因这一观念(图17B)。重要的是，接种N15m1完全保护小鼠免受6000PFU(10倍致死剂量)的WTMHV的攻击(图8F和8G)。
总之，这些实验研究证明了nsp15在WT病毒感染期间在防止病毒dsRNA激活宿主传感器中的作用。在病毒复制期间，nsp15的缺失导致dsRNA的快速感知，I型干扰素、2'5'-OAS/核糖核酸酶L(RNaseL)和PKR的激活，这限制了病毒复制、传播和疾病。显示在不存在IFN信号传导的情况下，nsp15突变体病毒与WT病毒类似地复制，表明病毒RNA合成不需要nsp15内切核糖核酸酶活性。相反，nsp15对于破坏巨噬细胞中冠状病毒复制的先天免疫应答是至关重要的。
nsp15作为dsRNA传感器的拮抗剂的作用不同于先前对冠状病毒复制酶编码的拮抗剂的研究。CoV编码2'O-甲基转移酶(nsp16)以在其mRNA的5'末端提供帽结构以逃避宿主PRR识别。缺乏2'O-甲基转移酶活性的SARS-CoV和MHV突变体病毒引发I型IFN反应并在巨噬细胞和小鼠中减毒。SARS-CoV和MHV nsp1可通过降解宿主mRNA来预防IFN诱导；然而，用nsp1缺失突变体感染巨噬细胞不改变IFN诱导，而是在B6小鼠中减毒。CoVs编码nsp3中必需的木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLP2或PLpro)结构域，其可通过从细胞底物中切割泛素蛋白分子来异常调节(dysregulate)先天免疫应答。由于nsp15在所有冠状病毒中都是高度保守的，包括相对良性的冠状病毒，例如引起普通感冒的HCoV-229E和OC43，因此nsp15可能是病毒防止巨噬细胞中宿主dsRNA传感器识别的能力的基础，其用于将病毒传播到靶器官。
在先研究表明，冠状病毒编码病毒因子以阻止dsRNA介导的宿主传感器的激活，如OAS/核糖核酸酶L(RNase L)系统和PKR。例如，在上述研究中使用的鼠冠状病毒株也编码附属蛋白ns2，其为OAS/核糖核酸酶L(RNase L)系统的另一种重要拮抗剂。Ns2编码2'，5'-磷酸二酯酶(PDE)酶，其切割OAS的产物2'，5'-寡腺苷酸，以防止RNase L介导的巨噬细胞中rRNA降解。有趣的是，冠状病毒ns2赋予肝脏特异性作用，因为ns2突变体病毒颅内感染仍然是致命的。发现具有完整ns2的nsp15突变体病毒能够诱导巨噬细胞中的rRNA降解，并且在肝炎和脑炎小鼠模型中高度减毒。对MERS-CoV的辅助蛋白的研究显示NS4b具有与MHV ns2类似的PDE活性并抑制核糖核酸酶L(RNase L)活性。MERS-CoV NS4a编码一种限制PKR激活的dsRNA结合蛋白。在病毒环境下，缺失NS4a不足以激活PKR和产生应激反应，因此，MERS-CoV必须具有冗余机制来抑制dsRNA传感器的识别和激活。这里给出的结果表明，nsp15可以在CoV感染期间作为保守的病毒因子抑制dsRNA传感器的激活，并且ns2、NS4a或NS4b对PKR和/或OAS/核糖核酸酶L(RNase L)的额外抑制可以提供可能导致病毒发病机制的组织特异性或冗余控制机制。
nsp15用于抑制病毒RNA传感器激活的确切机制仍有待确定，特别是关于nsp15内切核糖核酸酶活性在dsRNA传感器拮抗作用中的作用。关于核糖核酸酶活性，已经显示两种编码核糖核酸酶活性的病毒在抑制先天免疫应答中起作用。瘟病毒核糖核酸酶(RNase)Erns充当酶活性诱饵受体，其降解内溶酶体区室中的病毒RNA，这限制了RNA暴露于宿主dsRNA传感器。来自拉沙病毒的核蛋白还含有3'至5'核酸外切酶结构域，其消化游离dsRNA并且对于抑制干扰素调节因子3的易位和宿主先天免疫应答系统的激活是必需的。因此，假设nsp15可降解病毒dsRNA以阻止宿主dsRNA传感器的检测是合理的。尽管如此，在用nsp15突变体病毒感染的巨噬细胞中未观察到增加的dsRNA水平(图14)，表明nsp15可能具有特异性靶标而不是广泛降解RNA。这些研究表明，nsp15可以维持dsRNA与复制复合物的结合或介导dsRNA的DMV包装。
鉴于上述情况，上述研究提供了对冠状病毒有效调节巨噬细胞中先天免疫应答的机制的理解，并为靶向nsp15的疗法的开发和活减毒疫苗的开发提供了几个新方向。例如，据信通过应用包含活减毒冠状病毒的疫苗接种受试者以抵抗各种冠状病毒，所述活减毒冠状病毒包含编码多蛋白的变体复制酶基因并在nsp15中引起变化，包括突变或缺失，所述改变影响nsp15的稳定性或活性，作为特定但非限制性的实例，一种蛋白质包括在98位的苏氨酸变为甲硫氨酸的氨基酸突变或在262位的催化组氨酸变为丙氨酸的氨基酸突变。所述疫苗可包括药学上可接受的载体，例如但是不限于水、盐水、缓冲盐水、磷酸盐缓冲液、醇/水溶液、乳液或悬浮液。
由于nsp15在所有冠状病毒中高度保守，因此认为可以扩展上述方法以产生所有现有和新出现的冠状病毒(冠状病毒科)的疫苗。因此，认为通过在各种冠状病毒的nsp-15中形成突变可以成功地产生疫苗，各种冠状病毒包括但不限于严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、人冠状病毒229E(HCoV-229E)、OC43(HCoV-OC43)、HKU1(HCoV-HKU1)和NL63(HCoV-NL63)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、犬冠状病毒(CCoV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、牛冠状病毒(BoCoV)和猪冠状病毒，包括传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪三角洲冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)和猪血凝性脑脊髓炎冠状病毒(PHE-CoV)。
通过突变感染性克隆使猪流行性腹泻病毒(PEDV)的nsp15/EndoU失活，导致病毒在组织培养中有效复制但激活先天免疫应答以在感染的巨噬细胞中产生干扰素(图9)。感染人或动物的任何冠状病毒中nsp15/EndoU活性的失活将产生该病毒的疫苗株。这种失活允许在病毒感染的巨噬细胞中快速激活干扰素，然后其可以刺激适应性免疫应答。这可以在多种冠状病毒中得到证实，并且产生刺激先天免疫应答激活的病毒，例如I型干扰素应答。
上文讨论的研究方面和结论的确证已发表在Deng等人的文章(Coronavirusnonstructural protein 15 mediates evasion of dsRNA sensors and limitsapoptosis in macrophages，Proceedings of the National Academy of Sciences，2017年5月，114(21)E4251-E4260；DOI：10.1073/pnas.1618310114)和Kindler等的文章(Earlyendonuclease-mediated evasion of RNA sensing ensures efficient coronavirusreplication，PLoS Pathog 13(2)：e1006195.doi：10.1371/journal.ppat.1006195(2017))中。这两篇论文的全部内容在此引入作为参考。
下面提供与本文描述的研究有关的其它细节作为在研究期间使用的实验程序的讨论。这些讨论并非旨在构成对本发明范围的限制，而是提供用于公开研究的范围和具体细节。
以下讨论描述了涉及图1A至8G的某些实验程序。
细胞、抗体和化学物质。迟发性脑肿瘤(DBT)细胞在补充有10％胰蛋白胨磷酸盐液体培养基、5％热灭活胎牛血清(FCS)、2％青霉素/链霉素和2％谷氨酰胺的MEM中生长。表达MHV受体(BHK-R)的BHK-21细胞在补充有10％FCS和G418(0.8mg/ml)(SV30069，HyClone)的DMEM中培养。将17CI-1细胞系维持在5％FCS DMEM中。兔抗nsp2/3血清(抗D3)和抗nsp15血清(抗D23)。小鼠抗核衣壳(J3.3)来自威斯康星大学麦迪逊分校。商业上购买的抗体：dsRNA(K1，Scicons)、ISG54(PA3845，赛默飞世尔)、来自圣克鲁兹的eIF2α(sc-133132)和p-eIF2α(sc-12412)。化学抑制剂来自以下来源：泛半胱天冬酶抑制剂zVAD(627610，密理博)、坏死性凋亡抑制剂-1(Nec-1)(480065，密理博)、PKR抑制剂C16(527450，密理博)、星形孢菌素(ALX-380-014，Enzo Life Sciences)和VX-765(F7120，UBPbio)。
病毒和深度测序。通过反向遗传学产生WT MHV毒株A59(GenBank登录号#AY910861)。为了产生MHV突变体病毒，通过PCR诱变将核苷酸变化并入MHV-A59基因组的cDNA片段中(可根据要求提供引物)。通过反向遗传学进行随后的病毒生成。将获救的病毒噬斑纯化，在BHK-R细胞上繁殖，并在17CI-1细胞上滴定。突变体病毒仅维持在BHK-R细胞中。对本研究中使用的所有病毒原液制剂(stock preparation)和噬斑纯化的分离物进行全基因组深度测序(堪萨斯州立大学诊断实验室)。
感染和小鼠实验。在无血清培养基中，用MOI为0.1或1的指定的病毒株感染12-或24-孔板中的BMDM。对于生长动力学分析，在指定的时间点收集细胞培养物上清液，并通过在17CI-1细胞上的噬斑测定法进行滴定。对于小鼠感染，所有实验均使用由芝加哥洛约拉大学IACUC审查和批准的协议进行。对于颅内(i.e.)感染，用600PFU病毒接种6周龄C57BL/6J雌性小鼠(杰克逊实验室)并每天监测体重，并根据IACUC协议，当体重减轻超过25％时实施安乐死。对于腹膜内(i.p.)感染，给6周龄小鼠注射60,000PFU，并在指定的时间点收集器官。通过H&E染色确定肝脏病理学的证据。
细胞死亡测定。根据制造商的协议，分别使用CellTiter Glo(G7571，普洛麦格)或CaspaseGlo 3/7(G8091，普洛麦格)测量细胞活力和半胱天冬酶3/7活性，并进行改性。
差示扫描荧光测定(DSF)试验。DSF在Stratagene MX3005P实时PCR机中进行。样品含有1x宝石橙蛋白染色试剂(SYPRO Orange)、10μM重组蛋白。所有样品以0.5℃/min的速率加热，测定荧光强度和Tm(熔化温度)。
RNA切割测定。标准RNA切割测定在30℃下使用1×104CPM的5'-末端放射性标记的RNA底物(1μM最终RNA浓度)以及在50mM Tris-HCl(pH 7.5)、50mM KCl、1mM二硫苏糖醇、5mMMnCl2中的0.026μM Nsp15。通过加入含有7.5M尿素的凝胶上样缓冲液(gel-loadingbuffer)终止内切核糖核酸酶反应。通过在含有7.5M尿素的20％聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离产物。将凝胶包裹在塑料中并暴露于PhosphorImager筛网以使用分子动力学(MolecularDynamics)软件进行定量。
以下讨论描述了涉及图10A至17B的某些实验程序。
细胞、抗体和其它试剂。迟发性脑肿瘤(DBT)细胞在补充有10％胰蛋白胨磷酸盐液体培养基、5％热灭活胎牛血清(FCS)、2％青霉素/链霉素和2％谷氨酰胺的最小必需培养基(MEM)(61100-061，Gibco)中生长。表达MHV受体(BHK-R)的幼仓鼠肾21细胞在杜氏改良Eagle培养基(DMEM)(12100-046，Gibco)中培养，其补充有10％热灭活的FCS和G418(0.8mg/ml)(SV30069，HyClone)以维持MHV受体表达的选择。将17CI-1细胞系维持在5％FCS DMEM中。WT MHV株A59(GenBank登录号#AY910861)通过反向遗传学和全基因组测序产生。已分化的(见下文)骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)维持在含有DMEM(10-017-CV，康宁)的骨髓巨噬细胞(BMM)培养基中，其补充有30％L929细胞上清液、20％FCS、1％L-谷氨酰胺、1％丙酮酸钠和1％青霉素/链霉素。兔抗nsp2/3血清(抗D3)和抗nsp15血清(抗D23)。小鼠抗核衣壳(J3.3)来自威斯康星大学麦迪逊分校。商业上购买的抗体：小鼠抗β肌动蛋白(A00702，金斯瑞)、小鼠抗钙联接蛋白(610523，BD)、驴抗兔-HRP(711-035-152，JacksonImmunoResearch)、山羊抗小鼠-HRP(1010-05，SouthernBiotech)、dsRNA(K1，Scicons)、ISG54(PA3845，赛默飞世尔)、来自圣克鲁兹的eIF2α(sc-133132)和p-eIF2α(sc-12412)。化学抑制剂来自以下来源：泛半胱天冬酶抑制剂zVAD(627610，Millipore)、坏死性凋亡抑制剂-1(Nec-1)(480065，Millipore)、PKR抑制剂C16(527450，Millipore)和VX-765(F7120，UBPbio)。
产生骨髓来源的巨噬细胞。从C57BL/6J(000664，Jackson Labs)或从圣路易斯的华盛顿大学获得的ifnar-/-小鼠的股骨收集骨髓。将5×106个骨髓细胞置于100×26mm培养皿(25387-030，VWR)中，其中15mL BMM培养基含有50μM的β-巯基乙醇。在37℃/5％CO2下孵育3天后，加入10mL BMM培养基。在另外3天的分化后，将BMDM在冷的1xPBS中洗涤，在4℃下，在10mL 1xPBS中孵育30分钟，然后通过手动移液从板中轻轻冲洗。将1×107个细胞/mL悬浮于含有10％DMSO的BMM培养基中，并储存在液氮液相中直至使用。为制备L929细胞上清液，将3.75×105个L929细胞置于T150烧瓶(10-126-34，赛默飞世尔)中的75mL培养基(DMEM[10-017-CV，康宁]、10％FCS、1％L-谷氨酰胺、1％丙酮酸钠、1％非必需氨基酸和1％青霉素/链霉素)中。在37℃/5％CO2下孵育6天后，收获上清液，过滤，并储存在-20℃直至使用。对于病毒感染，将BMDM解冻并置于不含β-巯基乙醇的BMM培养基中的100×26mm培养皿中。在37℃/5％CO2下孵育3天后，将细胞置于组织培养皿上，用于孵育24小时后的感染实验。
突变体病毒和深度测序。为了产生MHV突变体病毒，通过PCR诱变(根据要求可获得的引物)将核苷酸变化并入cDNA片段的MHV-A59基因组中。通过反向遗传学进行随后的病毒生成。将来自连接的cDNA片段的体外转录的病毒基因组RNA(mMESSAGE mMACHINE T7转录试剂盒；AM1344，Invitrogen Ambion)电穿孔到BHK-R细胞中。在观察细胞病变效应后，收集细胞上清液作为病毒原液。将感染性克隆噬斑纯化，在BHK-R细胞上繁殖，并在17CI-1细胞上滴定。突变体病毒仅维持在BHK-R细胞中，其不产生或响应干扰素。对本研究中使用的所有病毒原液制剂和噬斑纯化的分离物进行全基因组深度测序(堪萨斯州立大学诊断实验室)。简而言之，使用QIAamp MinElute Virus Spin Kit(57704，QIAGEN)从病毒悬液(virusstock)中提取病毒RNA，用于产生cDNA文库并通过Miseq或Ion Torrent技术测序。将突变体MHV序列与野生型MHV-A59合成构建体(GenBank登录号#AY910861)比对。
通过噬斑测定评估病毒复制。为了确定病毒生长动力学，在无血清培养基中，用MOI为0.1的指定病毒株感染24孔板中的BMDM。孵育1小时后，用新鲜的完全培养基替换接种物。在指定的时间点收集细胞培养物上清液，并通过在17CI-1细胞上的噬斑测定法进行滴定。为了确定器官中的病毒滴度，将一部分组织用1.0mm直径的氧化锆/硅珠(11079110z，BioSpec Products)在无血清的DMEM中使用自动均质器(6.0m/s，持续40秒)(MPBiomedicals)进行均质化。将均质化的器官以10,000×g离心5分钟，并将澄清的上清液在17CI-1细胞上为病毒噬斑进行滴定。对于每个样品，从三次独立测定获得滴度。使用Prism7软件(GraphPad Software,Inc.)产生病毒动力学图形。
细胞死亡测定。根据制造商的方案，并进行修改，分别使用CellTiter Glo(G7571，普洛麦格)或CaspaseGlo 3/7(G8091，普洛麦格)测量细胞活力和半胱天冬酶3/7的活性。简言之，将3.0×105个BMDM/孔置于24孔板中，并在无血清培养基中以0.1的MOI感染1小时。用完全培养基替换培养基，或者为了添加化学抑制剂，用含有指定浓度的抑制剂的完全BMM培养基替换病毒接种物。将感染的BMDM在37℃/5％CO2下孵育24小时。用1xPBS洗涤BMDM两次，并用100μL Glo试剂/培养基混合物(1：1)裂解。将50μL细胞裂解物用于测量发光信号。对三次技术重复执行标准偏差和非配对t检验，数据代表三次独立实验。使用Prism 7软件(GraphPad Software,Inc.)产生细胞活力图形。
免疫荧光。将BMDM(1.5×105细胞/孔)置于24孔板中的玻璃盖玻片上24小时，随后在无血清培养基中用MOI为0.1的野生型或突变体病毒感染。在6或12hpi时，将感染的细胞用4％甲醛在0.095M PIPES缓冲液(P1851，Sigma)中固定，用0.1％曲拉通X-100(T8787，Sigma)在1x PBS中透化，并用2％BSA封闭。一抗和二抗使用如下：抗NSP2/3(1：1500)、抗dsRNA(1：500)、抗-ISG54(1：500)、抗核衣壳(1：500)、驴抗-兔IgG alexafluor 488(1：1000)(A-21441，Invitrogen)和山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 568(1：1000)(A11004，赛默飞世尔)。用Hoescht 33342(1：2500)(H1339，Life Technologies)显现细胞核。通过用配备有数码相机(CoolSNAP HQ，Photometries)的Deltavision宽视野荧光显微镜(AppliedPrecision，GE)收集Z-堆叠图像来对细胞成像。使用20x或100x镜头拍摄图像。用InsightSSI固态照明模块(Applied Precision，GE)产生的光激发样品，并用SoftWoRx解卷积软件(Applied Precision，GE)解卷积。在相同的采集条件下收集所有图像并使用Imaris 7.6.4(Bitplane)进行处理。
FACS分析。将BMDM(6.0×105)置于12孔板(康宁)中24小时，随后用MOI为0.1的野生型或突变体病毒感染。在6hpi时，收集细胞并用1x PBS中的4％甲醛固定，用1xPBS中的0.1％曲拉通X-100透化，并用含有2％FCS和0.5％叠氮化钠的1xPBS封闭。细胞用可固定的活力染料(65-0865-14，eBioscience)和针对指示的一抗和二抗的抗体、驴抗兔alexafluor488和用Alexa Fluor 568标记的山羊抗小鼠一抗标记。使用LSR Fortessa细胞分析仪(BDBioscience)分析细胞。使用FlowJo软件(Treestar)分析流式细胞术数据。
通过逆转录定量PCR(RT-qPCR)和ELISA来定量IFN-α的产生。12或24孔板中的BMDM被空白组(mock)感染或以0.1或1的MOI感染病毒。在指定的时间点，使用RNeasy Mini Kit(74104，QIAGEN)将单层细胞用于RNA提取，同时收集细胞培养物上清液用于ELISA。为了确定IFN-α11、β-肌动蛋白或MHV-A59 N基因mRNA的产生，提取总RNA并使用Rt2 HT FirstStrand Kit(330401，QIAGEN)将等量的RNA(～1μg)用于cDNA合成。在Bio-Rad CFX96系统中，使用RT2 SYBR Green qPCR Mastermix(330502，QIAGEN)在小鼠IFN-α11(PPM03050B-200，QIAGEN)、小鼠β-肌动蛋白(PPM02945B-200，QIAGEN)或MHV-A59 N基因的特异性引物中进行定量PCR。热循环仪设定如下：一步在95℃(10分钟)，95℃(15秒)40个循环，60℃(1分钟)和平板读数，一步在95℃(10秒)，以及从65℃至95℃以0.5℃/0.05s的增量增加的熔体曲线。重复评估样品三次，数据代表3次独立实验。为了测量分泌的IFN-α，使用小鼠IFN-αELISA试剂盒(BMS6027，eBioscience)按照制造商的说明将50μL细胞培养物上清液用于测定。使用Prism 7软件(GraphPad Software，Inc.)生成图形。
电子显微镜。在1mL BMM培养基中将6.0×105B6 BMDM置于12孔板(康宁)的每个孔中。24小时后，在无血清DMEM中以0.1MOI用病毒感染细胞。用BMM培养基处理对照细胞。在37℃/5％CO2下孵育1小时后，用BMM培养基替换培养基。用在BMM培养基中制备的1μM星形孢菌素(ALX-380-014，Enzo Life Sciences)处理未感染的对照以诱导细胞凋亡。将细胞在37℃/5％CO2下进一步孵育16小时，然后为EM作准备。将细胞在1x PBS中洗涤，然后在1x PBS中在4℃下孵育30分钟。使用移液管从平板上轻轻地地收集细胞，在4℃下以1200rpm沉淀(pelleted)5分钟并固定(4％戊二醛的0.1M二甲胂酸盐缓冲溶液)。制备细胞切片并通过位于伊利诺伊州梅伍德市芝加哥洛约拉大学的电子显微镜核心设备成像。
蛋白质印迹。将在BMM培养基中含有6.0×105B6 BMDM/孔的12孔板(康宁)进行培养基处理或用无血清DMEM中的0.1MOI的病毒在37℃/5％CO2下感染1小时。用新鲜的BMM培养基替换培养基，并将细胞返回培养箱。在6、12或24小时后，将细胞在100μL冷的裂解缓冲液(20mM三羟甲基氨基甲烷(tris)pH 7.5、150mM NaCl、1mM EGTA、1mM EDTA、1％曲拉通X-100、2.5mM焦磷酸钠、1mMβ-甘油磷酸盐、1mM原钒酸钠、1μg/mL亮抑酶肽、1mM PSMF)中裂解，并刮入管中。将裂解缓冲液中的细胞在冰上孵育10分钟，然后在4℃以14,000rpm沉淀10分钟。将无细胞上清液在2x样品缓冲液(10％甘油、5％β-ME、3％SDS、7.5mg/mL Trizma碱、溴酚蓝)中稀释。通过12％丙烯酰胺PAGE-凝胶电泳分离样品，并使用半干转移系统(Bio-Rad)转移至PVDF Immuno-Blot膜(162-0177，Bio-Rad)。将膜悬浮于封闭缓冲液中，在1xTBST(Tris缓冲盐水+1％吐温-20)中含有5％w/v的脱脂奶粉，在室温下保持1.5小时。为了检测活化的半胱天冬酶-3，将切割的半胱天冬酶-3(Asp175；Cell Signaling Technology)的兔单克隆抗体(1：1000)在4℃下轻轻摇动过夜。用于通过小鼠抗β-肌动蛋白(1：5000)测定细胞蛋白表达或通过小鼠抗J3.3N蛋白(1：200)进行相对病毒复制的第二组膜在室温下孵育1.5小时。所有膜在1x TBST中洗涤三次，二抗在室温下轻轻摇动1.5小时，对于半胱天冬酶-3单克隆应用驴抗兔-HRP(1：2500)，或对于N蛋白和β-肌动蛋白应用山羊抗小鼠-HRP(1：5000)。膜用1x TBST洗涤三次，并使用Western Lightning Plus-ECL试剂(50-904-9326，PerkinElmer，Inc.)显现化学发光。
从大肠杆菌中纯化重组MHV Nsp15蛋白。使用适当的引物扩增WT MHV Nsp15和T98M的cDNA序列，并使用融合PCR亚克隆到pET-His-SUMO载体中。将携带WT Nsp15或T98M突变基因的构建体转化到Rosetta(DE3)多聚赖氨酸(pLys)细胞中。在50μg/mL氨苄青霉素和17μg/mL氯霉素的存在下，将单菌落接种于100mL Terrific Broth(TB)中，并在37℃下孵育过夜。然后将培养物转移到3L TB培养基中并培养直至OD600达到0.8。将温度降至16℃并加入IPTG至终浓度为0.2mM，持续20小时。通过以8000×g离心10分钟收集细胞，并将细胞沉淀悬浮在含有10％甘油、50mM HEPES(pH 7.0)、400mM NaCl、5mM β-ME和10mM咪唑的裂解缓冲液中。将裂解物以15,000×g离心30分钟，并将上清液装载到Ni-NTA柱上。随后用含有20mM咪唑的裂解缓冲液洗涤Ni-NTA柱三次。用含有500mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱蛋白质，然后将缓冲液更换为10％甘油、20mM Tris-Cl(pH7.5)和5mM β-ME。通过Mono Q-Sepharose用含有0至1M NaCl的梯度Tris缓冲液进一步纯化样品。与已知浓度的BSA相比，通过SDS-PAGE定量Nsp15，并将其在-80℃下储存在含有10％甘油、20mM Tris-Cl(pH 7.5)、300mM NaCl和10mMβ-ME的缓冲液中。
动态光散射(DLS)。将重组MHV Nsp15或T98M蛋白在不同浓度的储存缓冲液(10％甘油、20mM Tris-Cl(pH 7.5)、300mM NaCl和5mM β-ME)中稀释。在室温下，通过ZetasizerNano-S动态光散射(Malvern Instruments)进行尺寸测量。每个样品至少测量三次。示出平均强度和尺寸分布。
差示扫描荧光测定(DSF)分析。在Stratagene MX3005P实时PCR机中进行DSF。样品含有1x宝石橙蛋白染色试剂、10μM重组蛋白。所有样品以0.5℃/分钟的速率加热，测定荧光强度和Tm(熔化温度)。
生物分析仪RNA分析。使用RNA Nano LabChips在Agilent 2100生物分析仪上分析从BMDM中纯化的等量总RNA。
小鼠实验。所有实验均使用芝加哥洛约拉大学IACUC审查和批准的协议进行。C57BL/6J小鼠购自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)。对于颅内(i.c.)感染，在20μL WT或突变体MHV中用600PFU接种6周龄小鼠。根据IACUC协议，每天监测感染的小鼠的体重并且当体重减轻超过25％时实施安乐死。使用Prism 7软件(GraphPad Software,Inc.)生成存活率图。用对数秩检验进行存活率的统计分析。对于腹膜内(i.p.)感染，给6周龄小鼠在100μL 1xPBS中注射60,000PFU。在指定的时间点收集器官并评估病毒复制。通过H&E染色确定病毒发病机理的证据。
序列比对。来自代表性的冠状病毒亚组株的Nsp15 T98区域使用Clustal W。α-冠状病毒：NL63(Amsterdam I株，AY567487)、PEDV(CV777株，NC_003436)；β-冠状病毒：MHV，(A59株，AY910861)；SARS-CoV(MA15株，FJ882957)；MERS-CoV(EMC株，JX869059)；γ-冠状病毒：IBV(Beaudette株，NC_001451)；δ-冠状病毒：PDCoV(KJ567050)。
虽然已经根据具体或特定的实施方式和研究描述了本发明，但是显而易见的是，本领域技术人员可以采用替代方式。例如，特异性突变冠状病毒可能与描述的不同或可能具有其它突变。因此，应该理解，本发明不必限于这里描述的或附图中示出的任何实施方式。还应该理解，上面采用的措辞和术语是为了描述所公开的实施方式和研究，并不一定用作对本发明范围的限制。因此，本发明的范围仅受以下权利要求的限制。

Claims (18)

1.一种活的减毒冠状病毒，包含编码多蛋白的变体复制酶基因，所述多蛋白包含非结构蛋白（nsp）-15，所述复制酶基因编码所述nsp15并引起影响nsp15稳定性或活性的任何变化，包括突变和/或缺失。
2.根据权利要求1所述的冠状病毒，其中所述变化包括98位的苏氨酸至甲硫氨酸的氨基酸突变，或262位的催化组氨酸至丙氨酸的氨基酸突变。
3.根据权利要求1所述的冠状病毒，其中冠状病毒是野生型冠状病毒的突变。
4.根据权利要求3所述的冠状病毒，其中野生型冠状病毒是冠状病毒科病毒。
5.根据权利要求4所述的冠状病毒，其中冠状病毒科病毒选自由如下构成的组：严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）、人冠状病毒229E（HCoV-229E）、OC43（HCoV-OC43）、HKU1（HCoV-HKU1）和NL63（HCoV-NL63）、猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）、犬冠状病毒（CCoV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、牛冠状病毒（BoCoV）和猪冠状病毒，所述猪冠状病毒包括传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪三角洲冠状病毒（PDCoV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪呼吸道冠状病毒（PRCV）和猪血凝性脑脊髓炎冠状病毒（PHE-CoV）。
6.权利要求1的变体复制酶基因。
7.一种蛋白质，由权利要求6的变体复制酶基因编码。
8.一种质粒，包含权利要求6的变体复制酶基因。
9.一种疫苗，包含权利要求1的冠状病毒和载体。
10.一种用于预防个体疾病的方法，所述方法包括向个体施用根据权利要求9所述的疫苗。
11.根据权利要求10所述的方法，其中施用疫苗引起个体中I型干扰素的激活，相对于表达相应野生型复制酶基因的冠状病毒，其降低了冠状病毒的致病性。
12.一种预防个体疾病的方法，所述方法包括激活个体中的I型干扰素，其中I型干扰素的激活降低了冠状病毒的致病性。
13.一种制备疫苗的方法，所述方法包括：
修饰野生型冠状病毒以产生活的减毒冠状病毒，其包含变体复制酶基因，所述变体复制酶基因编码多蛋白并在非结构蛋白（nsp）-15中引起影响所述nsp15稳定性或活性的变化，包括突变和/或缺失；和
生产包含冠状病毒和载体的疫苗；
其中给个体施用所述疫苗引起个体中I型干扰素的活化，其降低了野生型冠状病毒的致病性。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述变化包括在位置98位的苏氨酸至甲硫氨酸的氨基酸突变或在262位的催化组氨酸至丙氨酸的氨基酸突变。
15.根据权利要求13所述的方法，其中野生型冠状病毒是冠状病毒科病毒。
16.根据权利要求13所述的方法，其中冠状病毒科病毒由以下构成：严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）、人冠状病毒229E（HCoV-229E）、OC43（HCoV-OC43）、HKU1（HCoV-HKU1）和NL63（HCoV-NL63）、猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）、犬冠状病毒（CCoV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、牛冠状病毒（BoCoV）和猪冠状病毒，所述猪冠状病毒包括传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪三角洲冠状病毒（PDCoV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪呼吸道冠状病毒（PRCV）和猪血凝性脑脊髓炎冠状病毒（PHE-CoV）。
17.根据权利要求16所述的方法，还包括向个体施用疫苗。
18.根据权利要求13所述的方法，还包括向个体施用疫苗。
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