CN112353951A - 新型冠状病毒动物模型及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开新型冠状病毒动物模型及应用。本发明的动物模型在感染MHV和SARS‑CoV‑2后，其肺部的免疫反应均表现为抗细菌免疫反应的显著增强，并能够引起未成熟中心粒细胞的异常增生，与重症病人中未成熟中性粒细胞异常增生的结果相一致。这种增生现象是冠状病毒感染引起的独有的特征，可以作为冠状病毒感染程度和疾病进展程度的重要评价指标。通过用小分子药物本发明的动物模型是新型冠状病毒肺炎病理状态和药物评价的有效模型。

Description

新型冠状病毒动物模型及应用
技术领域
本发明涉及领域医药领域，具体涉及用于鉴定新型冠状病毒有用的化合物的动物模型及应用。
背景技术
冠状病毒是一种以蝙蝠和禽类为主要宿主的单链RNA病毒。在近几十年中，几种冠状病毒突破了蝙蝠与人类的物种界限，严重危害了人们的生命安全，造成了很大的社会恐慌。
在新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的肺炎中，重症患者通常会最终发展为不受控制的高强度炎性细胞因子风暴，而这种失控的炎症不仅不会修复损伤的肺组织反而是冠状病毒肺炎后期致命性多器官衰竭的元凶。炎症风暴是从初步少量的炎性细胞因子分泌招募炎症细胞浸润活化，然后活化的炎症细胞进一步分泌炎症因子一步步信号放大导致的。因此有效的抑制异常的炎症反应是治疗新冠重症病例的有效策略，而目前在临床中应用的药物均不能有效抑制异常炎症反应。而新药的开发和研制又遇到了很大的瓶颈，最重要的制约因素有两个：1. 没有有效的重症动物模型，在已知的动物模型中，包括AEC2人源化小鼠、雪貂和猴子，均不能在动物中引起重症肺炎，因此无法在现有模型中进行针对重症的药物评价；2. SARS-CoV-2为安全等级三级的病原生物，绝大部分实验室，无法满足操作需求，也就无法进行进一步的生理功能和药物评价工作。
发明内容
鉴于现有技术中存在的技术问题，发明人应用恒河猴和人源ACE2转基因小鼠，建立SARS-CoV2肺部感染动物模型，并进一步验证了该动物模型在药物筛选或鉴定中的有效性。至少部分地基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种用于鉴定对预防、治疗或减缓冠状病毒有用的化合物的方法，其包括将待测化合物施用至具有重症肺炎表现的动物模型的步骤，其中所述动物模型为IFNAR基因敲除动物。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，通过感染MHV使所述动物模型具有重症肺炎表现。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法进一步包括检测动物模型中未成熟中性粒细胞的步骤。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，所述动物包括小鼠、雪貂和猴。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，所述冠状病毒包括SARS-CoV-2和/或MHV-A59。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法具体包括以下步骤：
(1) 通过感染MHV使所述动物模型具有重症肺炎表现；
(2) 将待测化合物施用至具有重症肺炎表现的动物模型；和
(3) 如果动物模型的重症肺炎表现减轻、缓解或消除，则将所述待测化合物鉴定对预防、治疗或减缓冠状病毒有用的化合物，否则将所述待测化合物鉴定不是对预防、治疗或减缓冠状病毒有用的化合物。
本发明的第二方面，提供一种用于鉴定对预防、治疗或减缓冠状病毒有用的化合物的方法，其包括以下步骤：
(1) 用MHV感染动物模型，然后检测所述动物模型体内未成熟中性粒细胞增生或活化情况的步骤，其中所述动物模型为IFNAR基因敲除动物；
(2) 将待测化合物施用至感染后的动物模型，然后检测所述动物模型中未成熟中性粒细胞增生或活化情况的步骤；
(3) 如果步骤(2)中未成熟中性粒细胞增生或活化被抑制或减缓，则将所述待测化合物鉴定对预防、治疗或减缓冠状病毒有用的化合物，否则将所述待测化合物鉴定不是对预防、治疗或减缓冠状病毒有用的化合物。
本发明的第三方面，提供用于检测未成熟中性粒细胞增生或活化的试剂或仪器在用于制备评价新型冠状病毒感染程度或疾病进展程度的组合物或工具中的用途。
在某些实施方案中，根据本发明的用途，其中，所述未成熟中性粒细胞增生或活化为IFNAR基因敲除的动物模型内的增生或活化。
在某些实施方案中，根据本发明的用途，其中，所述试剂包括抗体，所述仪器包括血流式细胞仪。
附图说明
图1为SARS-CoV2感染早期的肺部转录活性聚类分析结果。
图2为中性粒细胞数量上升以及炎症风暴趋化聚类分析结果。
图3为基于S100A8基因的警戒素蛋白分析结果。
图4为SARS-CoV2肺炎患者的肺组织转录本分析结果。
图5为人源ACE2转基因小鼠感染SARS-CoV2的肺组织转录本分析结果。
图6为IFNar基因敲除小鼠感染MHV后S100A8基因表达结果。
图7为IFNar敲除小鼠以及人源ACE2小鼠感染呼吸道病毒IAV后S100A8基因表达结果。
图8为基于全基因组的差异表达分析结果。
图9为IFNAR基因缺陷小鼠死于SARS-CoV-2和MHV-A59的感染。A.野生型和IFNAR基因缺陷小鼠通过滴鼻的方式用MHV-A59感染(100pfu/每只小鼠)。B. A.野生型和IFNAR基因缺陷小鼠，先用包装ACE2的慢病毒感染，再用通过滴鼻的方式用SARS-CoV-2感染(100pfu/每只小鼠)。
图10 AEC2人源化小鼠在SARS-CoV-2感染之后不会引起重症。AEC2人源化小鼠通过滴鼻的方式用SARS-CoV-2感染(100pfu/每只小鼠)。
图11 SARS-CoV-2和MHV-A59的感染造成IFNAR基因缺陷小鼠肺部严重损伤。野生型和IFNAR基因缺陷小鼠通过滴鼻的方式用MHV-A59感染(100pfu/每只小鼠)。野生型和IFNAR基因缺陷小鼠,先用包装ACE2的慢病毒感染，再用通过滴鼻的方式用SARS-CoV-2感染(100pfu/每只小鼠)。然后取肺部进行切片和HE染色。
图12 SARS-CoV-2和MHV-A59的感染在IFNAR基因缺陷小鼠中引起相似的免疫反应。野生型和IFNAR基因缺陷小鼠通过滴鼻的方式用MHV-A59感染(100pfu/每只小鼠)。野生型和IFNAR基因缺陷小鼠，先用包装ACE2的慢病毒感染，再用通过滴鼻的方式用SARS-CoV-2感染(100pfu/每只小鼠)。然后取肺部组织进行RNAseq，并对诱导上调表达的基因进行功能性聚类分析。
图13 SARS-CoV-2和MHV-A59的感染IFNAR基因缺陷小鼠中中性粒细胞的异常活化。野生型和IFNAR基因缺陷小鼠通过滴鼻的方式用MHV-A59、IAV、EMCV、HSV-1和LPS感染(100pfu/每只小鼠)或者处理(LPS)。野生型和IFNAR基因缺陷小鼠,先用包装ACE2的慢病毒感染，再用通过滴鼻的方式用SARS-CoV-2感染(100pfu/每只小鼠)。然后取血液进行流式细胞术分析(抗体是LY6G和CD11b)。
图14药物处理抑制SARS-CoV-2感染IFNAR基因缺陷小鼠中中性粒细胞的异常活化。野生型和IFNAR基因缺陷小鼠,先用包装ACE2的慢病毒感染，再用通过滴鼻的方式用SARS-CoV-2感染(100pfu/每只小鼠)。然后取血液进行流式细胞术分析(抗体是LY6G和CD11b)。
图15药物处理抑制MHV-A59感染IFNAR基因缺陷小鼠中中性粒细胞的异常活化。野生型和IFNAR基因缺陷小鼠通过滴鼻的方式用MHV-A59感染(100pfu/每只小鼠)。然后取血液进行流式细胞术分析(抗体是LY6G和CD11b)。
图16野生型和IFNAR基因缺陷小鼠通过滴鼻的方式用MHV-A59感染(100pfu/每只小鼠)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本公开中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本公开的内容为准。除非另有说明，否则“%”或“量”均为基于重量的百分数。
实施例
应用恒河猴和人源ACE2转基因小鼠，建立SARS-CoV2肺部感染动物模型。探究在SARS-CoV2感染早期机体发生的固有免疫特征，发现S100A8蛋白是启动炎症风暴的根源，并成为SARS-CoV2感染患者早期诊断的免疫指标。随后通过药物帕喹莫德(paquinimod)抑制S100A8/S100A9蛋白的功能最终抑制组织中病毒滴度，炎症水平下降，有效地遏制了动物模型中SARS-CoV2肺炎的发生发展。
首先对恒河猴滴鼻感染SARS-CoV2，取第0、3、5天的肺组织进行RNA-seq测序，分析SARS-CoV2感染早期的肺部转录活性改变。如图1结果所示，通过GO分析发现，上调的基因主要都聚类在免疫、炎症以及中性粒细胞趋化方向上。揭示了在SARS-CoV2感染早期，恒河猴肺部已经出现了炎症风暴倾向以及中性粒细胞的浸润和活化，证明SARS-CoV2感染恒河猴动物模型建立成功，也提示SARS-CoV2感染患者的临床症状中，中心粒细胞的增多是一个早期病理学事件。
通过比对中性粒细胞趋化聚类中的基因，阐释SARS-CoV2肺炎不同于常见病毒引起中性粒细胞数量上升以及炎症风暴的原因。比对结果如图2所示，在所有上调基因中，最为明显的是S100A8基因，且其在中性粒细胞趋化中发挥重要功能。
S100A8蛋白是经典的警戒素蛋白。机体细胞受外来压力刺激(如DAMP信号通路活化)或组织发生损伤会导致警戒素转录并分泌，从而招募炎症细胞浸润介导炎症反应发生。通过对已知警戒素进行分析，分析结果如图3所示，可以发现在SARS-CoV2感染早期，恒河猴肺部组织并没有广泛上调警戒素表达，S100A8基因表达的上调在SARS-CoV2感染早期是极为特异的。提示S100A8蛋白是SARS-CoV2肺炎致病过程中导致炎症风暴的重要一环。
为了进一步确认S100A8基因表达上调是SARS-CoV2肺炎的重要标志，我们同时对SARS-CoV2肺炎患者的肺组织以及人源ACE2转基因小鼠感染SARS-CoV2的肺组织进行了转录本分析。SARS-CoV2肺炎患者的肺组织转录本分析结果如图4所示，人源ACE2转基因小鼠感染SARS-CoV2的肺组织转录本分析结果如图5所示。结果显示SARS-CoV2肺炎患者和人源ACE2转基因小鼠感染SARS-CoV2的肺组织均出现了S100A8基因表达上调。
患者肺组织样本S100A8基因表达上调不是很强，可能是因为样本是感染后期的缘故。而小鼠样本显示在加毒感染第一天S100A8基因就已经上调表达，在第五天到达峰值。证明了S100A8基因表达上调启动于感染的早期阶段，在炎症风暴的放大过程中处于靠近起始的位置。且S100A8基因表达的上调趋势揭示了S100A8蛋白在SARS-CoV2肺炎中介导中性粒细胞浸润活化的作用。
实验通过对不同病毒感染的小鼠动物模型进行研究，探究S100A8的上调是SARS-CoV2特异的还是具有普适性。首先是对另一种以小鼠为宿主的冠状病毒MHV进行研究，实验结果如图6所示，IFNar基因敲除小鼠感染MHV导致S100A8基因表达上调。对另一种以小鼠为宿主的呼吸道病毒IAV实验结果如图6和图7所示，对IFNar敲除小鼠以及人源ACE2小鼠感染呼吸道病毒IAV则并不会引起S100A8上调。从而证明了S100A8基因表达的上调是冠状病毒特异的，揭示S100A8引起的中性粒细胞增生成为冠状病毒感染早期诊断的免疫学指标的可能性。
细胞在正常生理状态下，S100A8蛋白本底表达量不高，S100A9蛋白正常表达并定位于细胞质。在收到信号刺激的情况下，S100A8蛋白大量表达，与S100A9蛋白在细胞质中形成二聚体并被分泌到胞外，招募中性粒细胞并结合其膜受体TLR4，激活下游炎症信号启动炎症反应。TLR4是著名的模式识别受体(PRR)，大量研究证明其主要功能是识别革兰氏阴性菌病原相关分子模式(PAMP)脂多糖(LPS)，进而激活下游信号通路启动固有免疫以及炎症反应。S100A8蛋白在冠状病毒感染中的特异性上调进而激活TLR4受体，如图8所示，这样就解释了为何冠状病毒肺炎不同于常见病毒感染出现的淋巴细胞的上升、中性粒细胞下降，反而会出现类似于细菌感染的中性粒细胞上升、淋巴细胞减少的血象。
接下来，发明人针对炎症反应相关的基因编辑小鼠进行了系统性的筛选，发现IFNAR基因缺陷小鼠感染新型冠状病毒(SARS-CoV-2)和小鼠冠状病毒(MHV-A59)之后表现出显著的重症肺炎表型，并在10天以内全部死亡(图9)。而SARS-CoV-2感染的ACE2人源化小鼠会出现体重的减轻。但是在7天左右就会完全恢复，不会引起重症以及小鼠的死亡(图10)。小鼠的肺部切片显示，IFNAR敲除小鼠发生了严重的肺部损伤(图11)。通过提取感染小鼠的肺部的RNA，并进行全基因组的RNA-seq分析，再进一步对差异表达的基因进行GO功能性分析，发现感染MHV和SARS-CoV-2后，IFNAR小鼠肺部的免疫反应均表现为抗细菌免疫反应的显著增强(图12)，与临床上的表现一致(4)。对于小鼠血液免疫细胞的分析更进一步证实了这一点，MHV和SARS-CoV-2感染能够引起未成熟中心粒细胞的异常增生，与重症病人中未成熟中性粒细胞异常增生的结果相一致(4)。同时在其他病毒感染的过程当中，并没有发现未成熟中性粒细胞异常增生(图13)。说明了未成熟中性细胞增生是冠状病毒感染引起的独有的特征，可以作为冠状病毒感染程度和疾病进展程度的重要评价指标。重要的MHV感染和SARS-CoV-2感染一样，也能够引起未成熟中性粒细胞异常增生。因此，MHV感染IFNAR小鼠之后，其未成熟中心粒细胞激增，可以作为在安全等级2级的条件下，评价相关药物有效性和病理变化重要模型和指标。
接下来，发明人用靶向S100A8/A9以及TLR4的小分子药物处理SARS-CoV-2和MHV感染的小鼠。药物处理能够明显抑制SARS-CoV-2和MHV感染引起的未成熟中心粒细胞增生(图14和图15)，并且能够挽救MHV感染引起的小鼠的死亡(图16)。进步说明了MHV感染IFNAR敲除小鼠能够作为，新冠肺炎病理状态和药物评价的有效模型。
尽管已经参考示例性实施方案对本发明进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对示例性实施方案做多种调整或变化。本发明的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (10)

1.一种用于鉴定对预防、治疗或减缓冠状病毒有用的化合物的方法，其特征在于，包括将待测化合物施用至具有重症肺炎表现的动物模型的步骤，其中所述动物模型为IFNAR基因敲除动物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过感染MHV使所述动物模型具有重症肺炎表现。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，进一步包括检测动物模型中未成熟中性粒细胞的步骤。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述动物包括小鼠、雪貂和猴。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述冠状病毒包括SARS-CoV-2和/或MHV-A59。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 通过感染MHV使所述动物模型具有重症肺炎表现；
(2) 将待测化合物施用至具有重症肺炎表现的动物模型；和
(3)如果动物模型的重症肺炎表现减轻、缓解或消除，则将所述待测化合物鉴定对预防、治疗或减缓冠状病毒有用的化合物，否则将所述待测化合物鉴定不是对预防、治疗或减缓冠状病毒有用的化合物。
7.一种用于鉴定对预防、治疗或减缓冠状病毒有用的化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用MHV感染动物模型，然后检测所述动物模型体内未成熟中性粒细胞增生或活化情况的步骤，其中所述动物模型为IFNAR基因敲除动物；
(2) 将待测化合物施用至感染后的动物模型，然后检测所述动物模型中未成熟中性粒细胞增生或活化情况的步骤；
(3) 如果步骤(2)中未成熟中性粒细胞增生或活化被抑制或减缓，则将所述待测化合物鉴定对预防、治疗或减缓冠状病毒有用的化合物，否则将所述待测化合物鉴定不是对预防、治疗或减缓冠状病毒有用的化合物。
8.动物模型或用于检测未成熟中性粒细胞增生或活化的试剂或仪器在用于制备评价新型冠状病毒感染程度或疾病进展程度的组合物或工具中的用途，其特征在于，所述动物模型为具有重症肺炎表现且IFNAR基因敲除的动物模型。
9.一种用于新型冠状病毒肺炎病理状态和药物评价的方法，其特征在于，包括使用具有重症肺炎表现且IFNAR基因敲除的动物模型的步骤。
10.一种用于新型冠状病毒肺炎病理状态和药物评价的方法，其特征在于，包括检测动物模型内未成熟中性粒细胞异常增生的步骤。
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