JP2006304685A - ラビリンチュラ類を形質転換可能なベクター - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 (1)ラビリンチュラ類の染色体DNAと相同組み換え可能である該染色体DNAの一部に対して相同な塩基配列、(2)上流にプロモーター配列を有し、下流にターミネーター配列を有する選択マーカー遺伝子、及び(3)上流にプロモーター配列を有し、下流にターミネーター配列を有する導入遺伝子挿入用のクローニング部位を少なくとも含む、ラビリンチュラ類を導入遺伝子で形質転換するためのベクター。
【選択図】 なし
Description
好ましくは、ラビリンチュラ類の染色体DNAと相同組み換え可能である該染色体DNAの一部に対して相同な塩基配列は、配列番号1に記載のSchizochytrium sp CB15-5の18SrRNAの塩基配列である。
好ましくは、選択マーカーはゼオシン(ブレオマイシン)耐性遺伝子である。
好ましくは、ラビリンチュラ類はSchizochytrium sp CB15-5である。
好ましくは、プロモーターは、アクチン遺伝子、elongation factor 1α (ef1α)遺伝子、又はグリセルアルデヒド3 -ホスフェートデヒドロゲナーゼ(gapdh)遺伝子の何れかのプロモーターである。
好ましくは、プロモーターの塩基配列は配列番号2から4の何れかである。
好ましくは、ターミネーターの塩基配列は配列番号5から7の何れかである。
好ましくは、本発明のベクターはプラスミドpUC18をバックボーンとするものであるか、プラスミドprGPZTをバックボーンとするものである。
好ましくは、導入遺伝子は、脂肪酸合成酵素遺伝子である。
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の形質転換されたラビリンチュラ類細胞を用いて脂質又は脂肪酸を製造する方法が提供される。
本発明によるラビリンチュラ類を導入遺伝子で形質転換するためのベクターは、(1)ラビリンチュラ類の染色体DNAと相同組み換え可能である該染色体DNAの一部に対して相同な塩基配列、(2)上流にプロモーター配列を有し、下流にターミネーター配列を有する選択マーカー遺伝子、及び(3)上流にプロモーターを有し、下流にターミネーター配列を有する導入遺伝子挿入用のクローニング部位を少なくとも含むことを特徴とする。
本発明では、線状化ベクターを使用することが好ましい。なお、導入するベクターを組換えたい部位で切断して線状化した場合はその部位で相同組換えが起こるが、組換え部位を限定しなければ環状ベクターでも形質転換は可能である。従って、目的によっては環状ベクターも利用可能である。
培養期間は、例えば3〜7日間とすることができ、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養で培養を行なうことができる。
(1)使用菌株
Schizochytrium 属CB15-5 株
GPY medium (pH 7.4)
3.0% D-Glucose
1.5% Polypepton
0.5% Yeast Extract
50.0% Sea water
3.0% D-Glucose
0.6% Polypepton
0.2% Yeast Extract
50.0% Sea water
50 mM sucrose
温度 : 28 ℃
振盪速度: 170 min-1
前培養時間:1日
本培養液時間:1〜4日
培養温度:28 ℃
前培養まで行った菌体を1000 倍希釈し、ゼオシンの濃度が0〜50μg/ml となるGPY プレート培地に100μl まき、72時間, 28 ℃に遮光してインキュベートし、コロニー数とコロニーの大きさを測定した。
1日の本培養後の菌体5 ml を15 ml のファルコンチューブに入れ遠心分離で集菌し、冷PBSで洗浄したあとTNE buffer ( 10 mM Tris-HCl / pH 7.5 + 0.1 M NaCl + 0.1 mM EDTA ) 5ml を加え、voltex で懸濁した。次に10% SDS (フィルター滅菌済み) を50μl, 20 mg / mlのProteinaseK を25μl 加え、手でおだやかに転倒攪拌した。これを60 ℃の恒温器にいれ2時間放置した。次にフェノールを等量加え(フェノールは8-ヒドロキシキノリンを加え、1 M Tris-HCl でpH 8.0 に平衡化したもの) 、おだやかに20分転倒攪拌した後、3000 rpmで15分遠心分離した。上清を先端を切ったチップで新しいファルコンに入れ、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1) を等量加え、おだやかに20分転倒攪拌した後、3000 rpm で15分遠心分離した。上清を1.5 ml 容のマイクロチューブに小分けし、それぞれに等量の冷イソプロパノ-ルを加えておだやかに転倒攪拌した後、15000 rpm で15分遠心分離した。上清を捨て、70%冷却エタノールを500μl 加え、15000rpm で5分遠心分離した。上清を捨て、DNA をスピードバックで5分乾燥させた後、TE buffer (10 mM Tris-HCl / pH 7.5 + 1 mM EDTA ) を200μl 加えてDNA を溶かし、さらにRNase (1 mg / ml ) 溶液を2.5μl 加えて、これを37 ℃で1時間反応させた。すべてのチューブの溶液を1 本のチューブにまとめ、これに等量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1) を加えておだやかに5 min 転倒攪拌した後、15000 rpm で5 分遠心分離した。この操作を2 回繰り返した。上清を1.5 ml のマイクロチューブに移し、3 M酢酸ナトリウム40μl (1/10 容) と等量の冷エタノール1 ml を加えておだやかに転倒攪拌した後、15000 rpm で10分遠心分離した。上清を捨て、70%冷却エタノールを700μl 加え、15000 rpm で5分遠心分離した。上清を捨て、DNA をスピードバックで5分乾燥させた後、TE buffer を200μl 加えてDNA を溶かし-20℃で保存した。
PCR条件
プライマー18S1,18S12 各0.5μM
genomic DNA 500 ng
10×Ex taq buffer 5 μl
dNTP 0.2 mM
Ex taq (5 units/μl) 0.25 μl
滅菌水q.s.
Total 50.0μl
95 ℃ 5 分の後、(95 ℃ 30 秒、55 ℃ 30 秒、72 ℃ 1 分)を35サイクル
PCR精製キット< Marligen Rapid PCR Purification System (Marligen) > を用いて精製した。
ライゲーション
Vector 5 ng
インサートDNA 5 ng〜50 ng
2 × Rapid ligation buffer 5.0μl
T4DNA Ligase (3 unit/μl) 1.0μl
滅菌水q.s.
Total 10.0μl
↓
16℃で一晩
ライゲーションを行ったDNA 溶液10μl にコンピテントセル100μl を加え、5分氷冷後37 ℃,3分インキュベート(heat shock) し、直ちに氷上に戻し5分おいた。この菌体懸濁液をあらかじめIPTG (100 mM) 40μl, X-gal (20 mg/ml) 40μl をスプレッドしておいたLB 培地(50μg/ml ampicillin) にまき、37 ℃, 12時間培養した。
プラスミド抽出キット< Marligen Rapid Plasmid System (Marligen) > のprotocol に従って行った。
<DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit ( Amersham Biosciences ) > 及び
AutoSeq G-50 ( Amersham Biosciences ) のprotocol に従って行った。シークエンス解析は、< ABI PRISMR310 Genetic Analyzer ( Biosystem ) > により、操作ガイドに従って行った。
プライマー配列 (5'-3')
18S-1 CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA (配列番号11)
18S-2 CATTCAAGTTTCTGCCCTATC (配列番号12)
18S-3 CAGGCTCCCTCTCCGGAATC (配列番号13)
18S-4 GCAGCCGCGGTAATTCCAGC (配列番号14)
18S-5 ACTACGAGCTTTTTAACTGG (配列番号15)
18S-6 GTCAGAGGTGAAATTCTTGG (配列番号16)
18S-7 TCCTTGGTAAATGCTTTCGC (配列番号17)
18S-8 GGATTGACAGATTGAGAGCT (配列番号18)
18S-9 AACTAAGAACGGCCATGCACC (配列番号19)
18S-10 AGGTCTGTGATGCCCTTAGA (配列番号20)
18S-11 CGTTTACTAGGAATTCCTCG (配列番号21)
18S-12 CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT (配列番号22)
系統樹は、neighbor-joinig (NJ) 法 (Saitou and Nei 1987)とmaximun-likelihood (ML)
法(Felsenstein 1981) を用いて作成した。NJ 分析はPAUP version 4.0d64 (Swofford 1998) を用いて行った。距離は、Felsenstein's (1984) (F84) model を用いたML method により見積もった。
遺伝子配列上にない酵素を選択し、その酵素でgenome を完全消化した。次にそのサンプルにLigase を加えて反応させ、self ligation genome を作製した。self ligation genome を鋳型に、遺伝子特異的の逆向きprimer を用いてPCR を行った。
PCR条件
プライマー18SF3,18SR3 各0.5 μM
self ligation genomic DNA 100 ng
10×La PCR buffer 5 μl
dNTP 0.4mM
MgCl2 2.5 mM
La taq (5 units/μl) 0.5 μl
滅菌水q.s.
Total 50.0 μl
94 ℃ 2分の後、(94 ℃ 20秒、68 ℃ 分、72 ℃ 10分)を25サイクル
プライマー配列(5'-3')
18SF TACACTGATGGGTTCATCGG (配列番号23)
18SR CCCGTTATAGTCACCGTAGT (配列番号24)
ゲル抽出キット< Marligen Rapid Gel Extraction System (Marligen) > を用いて精製した。
1日の本培養後の菌体(1〜5 g)を集菌し、適量の液体窒素、Trisol (GIBCO) 5 ml を加え石英砂により粉状になるまで破砕した。そこへ60 ℃に保温しておいた5 ml のTrisol を加えvortex で30秒攪拌し、15分, 60 ℃でインキュベートした。その後遠心分離(14,000 rpm, 15分, 4 ℃) し、その上清を1.5 ml マイクロチューブに1 mlずつ分注し、各チューブに200μl ずつクロロホルムを加え、5分室温でインキュベートした後、vortex でエマルジョンになるまで激しく攪拌した。その後、遠心分離(14,000 rpm, 15分, 4 ℃) し、2 層に分かれた上層部分を別のマイクロチューブにとり、それに500μl のイソプロパノールを加え10分、室温で静置し、遠心分離(14,000 rpm, 10分, 4 ℃) した。上清を除き、残存した沈殿に300μl の氷冷した4 M LiCl を加え、ピペッティングにより溶解し、遠心分離(6,500 rpm,10分, RT)した。上清を除き沈殿物に200μl の0.5% SDS-TE buffer と200μl のクロロホルムを加えvoltex で攪拌した後、遠心分離(6,500 rpm, 5分, RT) した。上層の水層部分を別のマイクロチューブにとり1/10 量の3 M 酢酸ナトリウムと2.5 倍量のエタノールを加え5 min 静置した後、遠心分離(14,000 rpm, 10分, 4 ℃) した。上清を除き沈殿したRNA に75%エタノールでリンスし、風乾後DEPC 処理水に溶解しtotal RNA サンプルとした。
3' RACE システム<3' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Endsz ( Invitrogen ) >のprotocol に従って行った。
PCR条件
プライマーactin (a2, a6)、ef1α (ef2, ef5)、gapdh (g1, g4) 各々0.5 μM
cDNA 50 ng
10×La PCR buffer 5μl
dNTP 0.4 mM
MgCl2 2.5 mM
La taq (5 units/μl) 0.5 μl
滅菌水q.s.
Total 50.0 μl
94 ℃ 2分で後、(94 ℃ 20秒、64 ℃ 5分、72 ℃ 10 分)を30サイクル
プライマー配列(5'-3')
a2 GCTCCTCGCGCTGTGTTCCC (配列番号25)
a6 GAAGCACTTGCGGTGGACAAT (配列番号26)
ef2 ACCACCACTGGTCACCTGAT (配列番号27)
ef5 ACGTTGAAGCCCACGTTGTC (配列番号28)
gap1 GGTATCAACGGCTTTGGCCGCA (配列番号29)
gap4 ACCTTGCCCACAGCCTTGGC (配列番号30)
3' RACE システム< 3' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Endsz ( Invitrogen )> のprotocol に従って行った。
GSP1-プライマー actin ( a1 ), ef1α ( ef2 ), gapdh ( gap2 )
GSP2-プライマー actin ( AF ), ef1α( EF ), gapdh ( GF )
プライマー配列(5'-3')
a1 GACAACGGTTCCGGTATGTGC (配列番号31)
AF GGTTATCATGGTCGGCATGG (配列番号32)
ef2 ACCACCACTGGTCACCTGAT (配列番号33)
EF CTCAAGGCCGAGCGTGAGCG (配列番号34)
gap2 AACGGCTTTGGCCGCATCGGTCG (配列番号35)
GF GCCTCCTGCACCACTAACTG (配列番号36)
5' RACE、バージョン2.0 システム< 5' RACE System, Version 2.0 ( Invitrogen ) > のprotocol に従って行った。
GSP1-プライマー actin ( a8 ), ef1α ( ef7 ), gapdh ( gap4 )
GSP2-プライマー actin ( AR ), ef1α ( e9 ), gapdh ( GR )
GSP3-プライマー actin ( a11 ), ef1α ( ER ), gapdh ( g8 )
プライマー配列(5'-3')
a8 AGCGAGGCGCATCTCCTCGT (配列番号37)
AR ACGCGGAGCTCGTTGTAGAA (配列番号38)
a11 GGTCACGATACCGTGCTCAA (配列番号39)
ef7 GTACTCAGTGAAGGACTCAACG (配列番号40)
e9 CGTAGCCAGCGCGGATCTCA (配列番号41)
ER GGCAACATCGGCCTGGGAGG (配列番号42)
gap4 ACCTTGCCCACAGCCTTGGC (配列番号43)
GR CCAGCACGCCAGTCCTTTCC (配列番号44)
g8 CCATCCTTGATCTCAATAGT (配列番号45)
(i)標準曲線用standard sample の調製
PCR法により各遺伝子の特異的primerを用いて増幅させた断片をゲル抽出し、吸光度計を用いて濃度を測定し、1μg/mlのstandard sampleを作製した。各sampleにおいて1×10-3〜10-6μg/mlまでの希釈系列を作製し実験に用いた。
プライマー actin ( a7, a8 )、ef1α ( e8, e9 ) 、gapdh ( g7, g8 ) 各0.5μM
cDNA 100 ng
10×Ex taq buffer 5μl
dNTP 0.2 mM
Ex taq(5 units/μl) 0.25μl
滅菌水q.s.
Total 50.0 μl
94 ℃ 2分の後、(94 ℃ 30秒、57 ℃ 30秒、72 ℃ 30秒)を30サイクル
4.5μg のtotal RNA からsuper scriptIIによりcDNA ( 0.2μg/ml )を合成し、そのsample をCO とした。ゲノムのコンタミを考慮して、同じ操作で、super scriptIIの代わりに滅菌水を使用したsample をCX とした。各sample を10 倍希釈して実験に用いた。
(Light-Cycler-FastStart DNA マスターSYBR Green I < Roche > ) のprotocol に従い、standard sample 及びcDNA sample をreal time PCR を行った。
プライマー actin (a7, a8)、ef1α (e8, e9) 、gapdh (g7, g8)各々0.5μM
CO, CX, 各standard sample 2μl
MgCl2 Stock Sol. 1.6μl
LD-DNA Master Sybr Green 2μl
滅菌水q.s.
Total 20.0μl
S10-3=standard (1×10-3 μg/ml)
S10-4= standard (1×10-4 μg/ml)
S10-5= standard (1×10-5 μg/ml)
S10-6= standard (1×10-6 μg/ml)
95 ℃ 10 分(変性)
↓
95 ℃ 10 s (PCR)
65 ( actin ), 60 ( ef1 ), 63 ( gapdh ) ℃ 5秒
72 ℃ 10 秒
87 ( actin ), 84 ( ef1 ), 88 ( gapdh ) ℃ 1秒(33 サイクル)
↓
95 ℃ 0秒 (融解)
70 (actin) , 65 (ef1) ,68 (gapdh) ℃ 15 秒
95 ℃ 0 秒
プライマー配列(5'-3')
a7 GGCCGTGACCTCACTGACTA (アクチンのreal time PCR)(配列番号46)
a8 AGCGAGGCGCATCTCCTCGT (アクチンのreal time PCR)(配列番号47)
e8 TTGGCTTCAACGTCAAGAAC (ef1αのreal time PCR) (配列番号48)
e9 CGTAGCCAGCGCGGATCTCA (ef1αのreal time PCR)(配列番号49)
g7 GACGCCTCGTGTTCCGCACG (gapdhのreal time PCR)(配列番号50)
g8 CCATCCTTGATCTCAATAGT (gapdhのreal time PCR) (配列番号51)
遺伝子配列上にない酵素を選択し、その酵素でgenome を完全消化した。次にそのサンプルにLigase を加えて反応させ、self ligation genome を作製した。self ligation genome を鋳型に、遺伝子特異的の逆向きprimer を用いてPCR を行った。
選択した制限酵素:actin (Kpn I, Nhe I, EcoR I) , ef1α(Hind III, Nhe I, EcoR I) , gapdh(Kpn I, Hind III, Nhe I)
プライマー actin (a9, AR)、ef1α (e10, ER)、gapdh (g9, g8) 各々 0.5μM
酵素はLa Taq を使用し、上記の18S rRNA gene のprotocol と同じ条件で行った。
プライマー配列(5'-3')
a9 ATCTCCAAGCAGGAGTACGA (Inverse PCR of actin) (配列番号52)
AR ACGCGGAGCTCGTTGTAGAA (Inverse PCR of actin) (配列番号53)
e10 GGTGTCATCAAGGAGGTTGA (Inverse PCR of ef1α) (配列番号54)
ER GGCAACATCGGCCTGGGAGG (Inverse PCR of ef1α) (配列番号55)
g9 CTCATCAGCTGGTACGATAA (Inverse PCR of gapdh) (配列番号56)
g8 CCATCCTTGATCTCAATAGT (Inverse PCR of gapdh) (配列番号57)
a12 TGAACTTCGTCGTCAGCCAT (sequencing of actin) (配列番号58)
a13 TCCACCGCAAGTGCTTCTAA (sequencing of actin) (配列番号59)
ae14 TGTGCGTCTAGTCCAACCTT (sequencing of actin) (配列番号60)
ak14 TTGGAAGACGCTCCTAGTAG (sequencing of actin) (配列番号61)
ak15 GACTTCAACTATGTCCAGGC (sequencing of actin) (配列番号62)
ak16 GTAGTCAGAGGTACTGAGTT (sequencing of actin) (配列番号63)
ak17-2 CATGTGGTTATGTAGAACGGCA (sequencing of actin) (配列番号64)
ak18 AGTATCTCGTGAAAGCGGGA (sequencing of actin) (配列番号65)
e12 TGCTCCTTCGTCTTGCCCAT (sequencing of ef1α) (配列番号66)
e13 TATGAAGCTAGGATGTGCGT (sequencing of ef1α) (配列番号67)
e14 CACCTACCTTGGCTCCTCGT (sequencing of ef1α) (配列番号68)
e15 CGATATCGCAACTGTGTCGA (sequencing of ef1α) (配列番号69)
en16 GAAAACGTTGGAGAGCCTGA (sequencing of ef1α) (配列番号70)
e17 ACAGTGACGGTATCTCTGCT (sequencing of ef1α) (配列番号71)
en18 ACCGTAACGGCCATAAGAAG (sequencing of ef1α) (配列番号72)
g12 ATAGGTGCGTCGGCAGACAT (sequencing of gapdh) (配列番号73)
g13 TAAGCACTGAAGAAGCGAGT (sequencing of gapdh) (配列番号74)
g14 CGTACCAGTCGGAACCTCTG (sequencing of gapdh) (配列番号75)
g15 CTTAGGGCTCATCGTCAACA (sequencing of gapdh) (配列番号76)
gh16 ACAGCACGCCTTACTTACCT (sequencing of gapdh) (配列番号77)
g17 CCTTCAATCCTAAACACCATGC (sequencing of gapdh) (配列番号78)
gh18 TGAGGAGAACTGCAAGCACC (sequencing of gapdh) (配列番号79)
(i)insert の作製
各断片をPCR により増幅し、ゲル抽出して濃度を測定した。各遺伝子のターミネーターはSal I とSph I で消化し、PCR 精製キットで精製した。18S rRNA gene は、一度pUC18 にサブクローニングし、次に精製したプラスミドをKpn I で消化し、ゲル抽出した。
プライマー
actin プロモーター (pAF, zAR)
ef1α プロモーター (pEF, zER)
gapdh プロモーター (pGF, zGR)
actin ターミネーター (salAF, sphAR)
ef1α ターミネーター (salEF, sphER)
gapdh ターミネーター (salGF, sphGR)
18srRNA遺伝子(kpn18rF, kpn18rR) 各々50 pmol
genomic DNA 100 ng
buffer#1 5 μl
dNTP 0.2 mM
MgCl2 1 mM
KOD DNA polymerase 2.5 U
滅菌水q.s.
Total 50.0 μl
プライマー
actin (aZF, pZR)
ef1α (eZF, pZR)
gapdh (gZF,p ZR) 各々50 pmoll
pPhaT1 20 ng
buffer#1 5 μl
dNTP 0.2 mM
MgCl2 1 mM
KOD DNA polymerase 2.5 U
滅菌水q.s.
Total 50.0 μl
(98 ℃ 15 秒、63 ℃ (プロモーター)又は65 ℃ (18S rRNA) 2秒、74 ℃ 30秒)を25サイクル
(98 ℃ 15秒、68 ℃ 30秒)を25サイクル
プライマー配列(5'-3')
pAF TCGAGCTCGGTACCCCTTCATACTCTCGCATTTCC(配列番号80)
zAR TTGGCCATTTTGCTAGTTGGGTGCTTGTTCTT(配列番号81)
pEF TCGAGCTCGGTACCCTCATGCTCCTTTCCCGCCAA(配列番号82)
zER TTGGCCATTTTGTTTGGTGCTAGTAGCTTCGA(配列番号83)
pGF TCGAGCTCGGTACCCTTGATCTTGTGAGGGCTCCA(配列番号84)
zGR TTGGCCATTTTGCTTGGTGTTTATGTGTGCGC(配列番号85)
aZF CTAGCAAAATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTT(配列番号86)
eZF CAAACAAAATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTT(配列番号87)
gZF CAAGCAAAATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTT(配列番号88)
pZR CTCTAGAGGATCCCCTCAGTCCTGCTCCTCGGCCA(配列番号89)
salAF AGAGTCGACATTGGAGTGATGGAATGCCC(配列番号90)
sphAR CTTGCATGCTGTTGAAAGAGCTGAGGCCA(配列番号91)
salEF AGAGTCGACGTGGTTTGACCTCTTATACT(配列番号92)
sphER CTTGCATGCGTTTCCCAACTCACGTTGTG(配列番号93)
salGF AGAGTCGACATGTACCCAATACCACACCG(配列番号94)
sphGR CTTGCATGCCTTGAAGCACTAGAAGAGCA(配列番号95)
kpn18rF CGGGGTACCCCAGTAGTCATATGCTCGTC(配列番号96)
kpn18rR CGGGGTACCCCTTGTTACGACTTCACCTT(配列番号97)
(a) pUC18 はSma Iで消化し、ゲル抽出したのち濃度を測定した。(BD In-FisionTM
Dry-Down PCR Cloning Kit <BD Biosciences> ) のprotocolに従い、各遺伝子プロモーターとブレオマイシン耐性蛋白質遺伝子をFausion EnzymeをもちいてpUC18 のSma I部位に導入した。次に、シークエンスによりブレオマイシン耐性蛋白質遺伝子に変異がないことを確かめた。
(i)プラスミドの調製
高速プラスミド大量(midi) 精製システム<PureYieldTM Plasmid Midiprep System (Promega) > のprotocolに従ってプラスミドを大量抽出し、吸光度計で濃度を測定した。線状プラスミドサンプルは、Sac llを用いて消化した。10μgのサンプルをEthachinmate (NIPPON GENE) を用いて濃縮し10μlの滅菌水に溶解した。
本培養液をfilter (5μm <MILLIPORE> ) に通し、遠心(12,000 g, 5 min, 4 ℃) し上清を捨て、BSS buffer (10 mM KCl, 10 mM NaCl, 3 mM CaCl2) を加え、遠心(12,000 g, 5 分,4 ℃) し上清を捨てた。次に50 mM sucroseを加え遠心(12,000 g, 5分, 4 ℃) し上清を捨てる操作を2 回行った。血球計数盤を用いて細胞数を測定し、最後に4×107/ 80μlになるよう50 mM sucroseに懸濁した。
本培養液を1.5 ml マイクロチューブに入れ遠心(12,000 g, 5分,4 ℃)し上清を捨て、BSS buffer を加え遠心(12,000 g, 5分, 4 ℃) し上清を捨てた。次に50 mM sucrose を加え遠心(12,000 g, 5分, 4 ℃) し上清を捨てる操作を2 回行った。最後に全量100 μl になるよう50 mM sucrose を加えて、vortex し懸濁した。
調整した細胞80μl とプラスミド10μl を混合して、冷却していたキュベット(2 mm gap <BM 機器> )にいれ、5分(氷上) インキュベートした。次に、キュベットをelectropolation装置(ECM600 <BTX> ) にセットし、200 V, 500 V, 1500 V, 2500 V (50μF,13Ω) の各条件でパルスを1 回かけた。次に、1 ml のGPYS liquid medium を加え、エッペンに移し、28 ℃の湯浴で1時間インキュベートした。その後、遠心(12,000 g, 5分, RT)し、全量100 μlになるよう上清をすてvortex し、100μg/ml のゼオシン含有GPYS培地にまいて、28 ℃で2日間培養した。
前培養まで行った菌体を20 cells/μl に希釈し、ゼオシンの濃度が0-6000μg/mlとなるGPY プレート培地に1μl スポットし、60時間、28℃で遮光してインキュベートした。
PCR条件
プライマー 各々0.5 μM
genomic DNA 500 ng
10×Ex taq buffer 5 μl
dNTP 0.2 mM
Ex taq (5 units/μl) 0.25 μl
滅菌水q.s.
Total 50.0 μl
94 ℃ 2分の後、(94 ℃ 30秒、68 ℃ 30秒、72 ℃ 30秒)を30サイクル
プライマー配列(5'-3')
ZEOF TACCGGTTCAACTGGTCACGGC(配列番号98)
ZEOR TCAGTCCTGCTCCTCTTCCA(配列番号99)
PCR条件
プライマー18srDT, ZEOR 各々各0.5μM
genomic DNA 500 ng
10×La PCR buffer 5μl
dNTP 0.4 mM
MgCl2 2.5 mM
La taq (5 units/μl) 0.5 μl
滅菌水q.s.
Total 50.0 μl
94 ℃ 2分の後、(94℃ 20秒、64℃ 5分、72℃ 10分)を30サイクル
プライマー配列(5'-3')
18srDT CGCAGGTTCACCTACGGAAA(配列番号100)
ZEOR TCAGTCCTGCTCCTCTTCCA(配列番号101)
(i)インサートの作製
各断片をPCR により増幅し、ゲル抽出して濃度を測定した。
プライマー epELOF、etELOR 各50 pmoll
pYES2 20 ng
buffer#1 5 μl
dNTP 0.2 mM
MgCl2 1 mM
KOD DNA polymerase 2.5 U
滅菌水q.s.
Total 50.0 μl
98 ℃ 15秒、68 ℃ 30秒を25サイクル
プライマー
ef1αプロモーター <elongase> (psac I EPF, eloEPR)
ef1αプロモーター <elongaseなし> (psac I EPF, etEPR)
ef1αターミネーター <elongese> (eloETF, psac I ETR)
ef1αターミネーター<elongaseなし> (epETF , psac I ETR) 各々0.5μM
genomic DNA 500ng
10×La PCR buffer 5μl
dNTP 0.4 mM
MgCl2 2.5 mM
La taq (5 units/μl) 0.5μl
滅菌水q.s.
Total 50.0 μl
94 ℃ 2分の後、(94 ℃ 30秒、60 ℃ 30秒、72 ℃ 30秒)を25サイクル
プライマー配列(5'-3')
psac I EPF ATGATTACGAATTCGAATGACTGGCTTCAAGTTTG(配列番号102)
eloEPR GACATGTTCATTTTGTTTGGTGCTAGTAGCTT(配列番号103)
epELOF CAAACAAAATGAACATGTCAGTGTTGACTTTA(配列番号104)
etELOR CAAACCACCTACTCGGCCTTCGTCGCTTTCTT(配列番号105)
eloETF CCGAGTAGGTGGTTTGACCTCTTATACTTGATCGA(配列番号106)
psac I ETR GATTGACAGATTGAGCTCTCAAACATACAAAAGAATT(配列番号107)
etEPR ACCACTTACATTTTGTTTGGTGCTAGTAGCTT(配列番号108)
epETF ACAAAATGTAAGTGGTTTGACCTCTTATACTTGAT(配列番号109)
gapdhプロモーター、ブレオマイシン耐性蛋白質遺伝子、ターミネーター、18S rRNA遺伝子を導入したprGPZT (5396 bp) をSac I で消化し、ゲル抽出し濃度を測定した。(BD In-FisionTM Dry-Down PCR Cloning Kit <BD Biosciences> ) のprotocol に従い、ef1 プロモーター<elongase> とラットelongase 2遺伝子とef1ターミネーター<elongase>をFausion EnzymeをもちいてprGPZTのSac I siteに導入し、prGPZT-EPELOT (7999 bp) とした。次に、シークエンスによりラットelongase2遺伝子に変異がないことを確かめた。negative controlとして同様にef1プロモーター<elongaseなし> とef1ターミネーター<elongaseなし> をprGPZTのSac I siteに導入し、prGPZT-EPT (7210 bp) とした(図20)。
(1)CB15-5 株の薬剤感受性試験
選択マーカーを決めるため、DNA 構造破壊物質であるゼオシンに対する薬剤感受性を調べた結果、10〜30μg/ml のゼオシンを含む培地においてコロニー数及びコロニーサイズに関して濃度依存的に減少傾向が見られた(図2)。そこで、選択マーカーとしては、ゼオシンの類似物質であるブレオマイシンに対して耐性を与える遺伝子を用いることにした。
相同組換え遺伝子としては、染色体上に多コピーで存在すると考えられる18S rRNA 遺伝子を用いることにし、同類株との相同性にもとづいてPCRで単離し、さらにその上流と下流をinverse PCR で単離した(配列番号1) 。それを、他のラビリンチュラ類の18S rRNA 遺伝子と比較するため分子系統樹を作製した結果、ドコサヘキサエン酸の高生産株であるSchizochytrium 属limacinum や、カロテノイド生産株であるSchizochytrium 属KH105 株などと高い相同性を有することがわかった(図3)。
ブレオマイシン耐性遺伝子の発現を制御するプロモーター及びターミネーター遺伝子は、恒常的発現が予想されるアクチン、ef1α、gapdh の各遺伝子のものを用いることにした。そこで、まずラビリンチュラにおいて配列情報のないアクチン, ef1α, gapdh の各遺伝子の部分断片を他種生物との相同性にもとづいてCB15-5 株cDNA からPCR法を用いて取得し、さらに5'RACE及び3'RACE 法により全長を取得した。アクチン遺伝子の塩基配列を配列番号8(コード領域は塩基番号1504〜2634)に示し、ef1α遺伝子の塩基配列を配列番号9(コード領域は塩基番号1487〜2791)に示し、gapdh遺伝子の塩基配列を配列番号10(コード領域は塩基番号1358〜2377)に示す。それらにコードされるアミノ酸配列について近縁微生物との各々の相同性を調べた結果、高い相同性が得られたとともに、CB15-5の配列の中に各タンパクで保存された領域が存在したので、目的遺伝子が得られたと判断した(図4〜6)。
各遺伝子特異的プライマーを用いてCB15-5 株cDNA を用いてSYBER Green によるReal time PCR を行った。得られた各遺伝子の蛍光値データを(Light-Cycler Software Ver.3.5 <Roche> ) のFit Point 法を用いて解析し、standard による標準曲線を作成し、サンプル濃度を算出した(図7〜9) 。そこから得られたサンプル濃度10 × (CO-CX) を各PCR 産物の分子量を用いて、モル濃度を算出した結果、発現量はアクチンが最も多く、次にef1α、gapdh の順であることがわかった(図10)。アクチンとef1α は少なくとも、gapdh より発現量が多いことがわかりプロモーターとして使用できることが示唆された。また、gapdh も絶対量はわからないが発現は確認できたので、同様にプロモーターを取得することにした。
獲得法としては各遺伝子配列上に認識配列をもたない制限酵素で完全消化したのちself ligation させたgenome DNA を鋳型に、各遺伝子の配列に対応するプライマーを用いて、inverse PCR をおこない得られた断片を配列決定することにした(図11)。各遺伝子の遺伝子上にない酵素(Kpn I , Nhe I , EcoR I < actin >, Hind III, Nhe I, EcoR I<ef1α>, Kpn I, Hind III, Nhe I <gapdh> )を3個づつ選択した。それらの各制限酵素で完全消化したのちself ligation させたgenome DNA を鋳型に、上記遺伝子の配列に対応するプライマーを用いて、inverse PCR をおこなった結果、2〜9 Kb のバンドが得られた(図12)。
まずef1αのプロモーターを持つ導入プラスミド(図15) をsacllで線状プラスミドとし、本培養液(3日) を調整し、5μm以下のラビリンチュラ細胞(50 mM sucrose懸濁液<3×107cell/80μl> ) に、200 V, 500 V, 1500 V, 2500 V (50μF, 13Ω) の各条件下でelectropolationにより導入し、100μg/mlのゼオシン含有培地にまいた。その結果、200 V, 500Vにおいてゼオシン耐性を示すコロニーが得られた。また、500 Vにおいて最も多くのコロニーが得られ、1500 V, 2500 Vでは得られなかった(表1)。そこで、以後の実験は、500 Vで行うことにした。
得られたtransformant のゼオシンに対する感受性を調べた結果、野生型が20μg/mlで完全に生育不能になるのに対し、アクチンでは4000μg/ml, ef1α では6000μg/ml, gapdh では2000μg/ml まで生育可能であった(図17)。
ブレオマイシン耐性遺伝子が導入されたことを確認するため、得られたtransformant のgenomeDNA を鋳型として、ブレオマイシン耐性遺伝子特異的primer を用いたPCR を行った。その結果、コントロールプラスミドで得られたものと同じサイズのバンドが得られたことから遺伝子導入がされていることがわかった(図18)。
18SrRNA 遺伝子座において相同組換えが起こったことを確認するため、ゲノムDNA のみに存在する18SrRNA 遺伝子下流に対応するプライマーと導入したブレオマイシン耐性遺伝子の特異的プライマーを用いたPCR を行った。その結果、transformant において予想される3600bp にバンドが得られたことから相同組換えによる染色体DNA への遺伝子導入がおこっていることが示された(図19)。
<110> Fuji Photo Film Co.Ltd.,
<120> A vector capable of transforming labyrinthulida
<130> A51366A
<160> 109
<210> 1
<211> 1787
<212> DNA
<213> Schizochytrium
<400> 1
aaacatagca attctggttg atcctgccag tagtcatatg ctcgtctcaa agattaagcc 60
atgcatgtgt aagtataagc gattgtactg tgagactgcg aacggctcat tatatcagta 120
ataatttctt cggtagtttc ttttatatgg atacctgcag taattctgga aataatacat 180
gctgtaagag ccctgtctgg ggctgcactt attagattga agccgatttt attggtgaat 240
catgataatt gagcagattg acttttttag tcgatgaatc gtttgagttt ctgccccatc 300
agttgtcgac ggtagtgtat tggactacgg tgactataac gggtgacgga gagttagggc 360
tcgactccgg agagggagcc tgagagacgg ctaccatatc caaggatagc agcaggcgcg 420
taaattaccc actgtggact ccacgaggta gtgacgagaa atatcgatgc gaagcgtgta 480
tgcgctttgc tatcggaatg agagcaatgt aaaaccctca tcgaggatca actggagggc 540
aagtctggtg ccagcagccg cggtaattcc agctccagaa gcatatgcta aagttgttgc 600
agttaaaaag ctcgtagttg aatttctggc atgggcgacc ggtgctttcc ctgaatgggg 660
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ctgtaatcaa agcagagtgt tccaagcagg tcgtatgacc ggtatgttta ttatgggatg 780
ataagatagg acttgggtgc tattttgttg gtttgcacgc ctgagtaatg gttaatagga 840
acagttgggg gtattcgtat ttaggagcta gaggtgaaat tcttggattt ccgaaagacg 900
aactagagcg aaggcattta ccaagcatgt tttcattaat caagaacgaa agtctgggga 960
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gggtgcttta tacatgggcc tcagcagcag cacatgagaa atcaaagtct ttgggttccg 1080
gggggagtat ggtcgcaagg ctgaaactta aaggaattga cggaagggca ccaccaggag 1140
tggagcctgc ggcttaattt gactcaacac gggaaaactt accaggtcca gacataggta 1200
ggattgacag attgagagct ctttcatgat tctatgggtg gtggtgcatg gccgttctta 1260
gttggtggag tgatttgtct ggttaattcc gttaacgaac gagacctcgg cctactaaat 1320
agtgcgtggt atggcaacat agtgcgtttt tacttcttag agggacatgt ccggtttacg 1380
ggcaggaagt tcgaggcaat aacaggtctg tgatgccctt agatgttctg ggccgcacgc 1440
gcgctacact gatgggttca tcgggtttta attctgtttt tatggaattg agtgcttggt 1500
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gaggaaggtg aagtcgtaac aaggtttccg taggtgaacc tgcggaa 1787
<210> 2
<211> 1503
<212> DNA
<213> Schizochytrium
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cttcatactc tcgcatttcc taatttattt gagcacgagc caacacaagc tccctcgtaa 60
gagaaggtag taggtacttt agcagtgagc atctgggtag aggtatctgc cttctaatat 120
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actactccac gagggaatcc cgctttcacg agatactcaa cttggactat caacgacata 240
cattctcagc cagtaggcac ccagcactct gtagtagctg tacctaatgg aagactagat 300
gctctgacac tcaacttacc tacttctgtt tctgcggtgt ggaatatcgc agttattaac 360
taaaaacagg ataaaaatga gaatactatg taagtttaat ttattattag tagcaatcat 420
atctcatata tggaatcttt ttctaaagat aaagcaaaaa caaacattat tttggaaata 480
aaaagagttg ttaatcaaag cgtaagacgt cctatacagc tgcctgtatg atgggacatt 540
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ctaagtgatt caagttgttt tgaccttgag ttttttaccg caagttaaaa gatctcaact 660
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atctttatat agtcgggata caacagaaaa gggcaatgaa aatcgacttt gggcgggcga 960
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gatagaggta tctctcacaa acactgtaaa tagttttgtg agtaaataca cacacgagca 1260
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aggctcacgg ccagcttggc agataggata gttctcatat ctattgctga tcgttcccgt 300
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ggcactccac ccgcgcttca acgctcgctc gagtgcgtgc ttatttgcct tcaacgcggc 600
gcggcggtta atatagtccc agcactcctt aaggggggca tcgcagggat taccttttta 660
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ctaagtttta taacctacac cccttgtggg gtaggggcga attctatgta cacagcacct 780
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atggcagcgc atcagcacca gcaacgacag ctgcgaggag cgcagggccg atctggacgc 1080
gccggagccg cacgaccaat gccgacgcaa cgctgattct tctggattcc ctctttacat 1140
gcatatatgt gtagaggtgc ggatgaaatg ccctgcgaat aaatgactgg cttcaagttt 1200
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<212> DNA
<213> Schizochytrium
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ttgatcttgt gagggctcca ctggaatttt ccgacacaag aaagtgccag tggacaaagg 60
gggaagtggg cctcgaaata gcggtatggt tatgtgaggg atacggggcg gagttccggc 120
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aataatcttg tatggaaatg tgaagcgcaa gtgcgcagaa cctagaaaat ctaaaacaaa 240
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gctgtgcggg agcgcccccg gccagtcagt gttggagctt gggatgagtt gcatctgcgc 360
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tgtctgataa ggtaaaaggg gacggcttct gtactttcct tcttcgctcg ctcccgatcg 540
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ctatcgatct agtgtgagcc gaattgagcc tcctgtcaat gtagcaggag gaactacaga 840
ggttccgact ggtacggaac aaacgaatcg gcgaaacgga gagtaggcat gaagttgttg 900
ttgtccaaga tcaaaaagat agaaacgaat atctttcttg ttctgctacc tacattgaaa 960
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tgtaatgaag aacatggcat gaaagaacga acagggggga ctgacgattt gagggactga 1200
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<212> DNA
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<212> DNA
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gtcgcccagg acttcgacga ggagatgcgc ctcgctgccg agtcctccgc cctcgagaag 2220
tcctacgagc ttccggacgg taacttcatc accatcggca acgagcgctt ccgtgccccg 2280
aggttcctct tccagccgtc cttcatcggc aaggaggccc agggtgtcca cgacaccatg 2340
ttccagacca tcatgaagtg tgacgtcgat atccgtaagg acctctacgc caacatcgtc 2400
atgtctggtg gctccaccat gtacgagggt ctcgccgctc gtctcgagaa ggagatgatc 2460
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gtgtggatcg gtggctccat tcttgcctcc ctctccacct tccagcagat gtggatctcc 2580
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gtgatggaat gccctctccg tgtggtgtat ccgattgaca aatcttaaac tcctccaagt 2700
agtaggcttc agtgcttcct tggaattgag acatgaaatc atgcaacatc ccaccgacag 2760
gatttatgta gtatcgcatc ctctcttgtt ttacactctt tgcccataaa ttcatgaaca 2820
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atgacaatct tttcacttag acaaacatta tagtgaatgc attgcatcat aatatattta 3000
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cagaagatag ttatgttgct atgaatcaaa tgaaaatgaa caaaaaagat ttcaggctga 3120
tatgtttcga tttgattttt tgctcaaatg caattaaaag aagacagacc tcaaggtcaa 3180
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<210> 9
<211> 3786
<212> DNA
<213> Schizochytrium
<400> 9
tcatgctcct ttcccgccaa aaagaaagaa gaggaaagca ccccgaagaa aagaaagaaa 60
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ttccatcgct cttgacctaa ctctctttct gctcctgtaa attcatccaa caaatgttta 180
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aggctcacgg ccagcttggc agataggata gttctcatat ctattgctga tcgttcccgt 300
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<213> Schizochytrium
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 18
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 20
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 22
ccttgttacg acttcacctt cctct 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 23
tacactgatg ggttcatcgg 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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cccgttatag tcaccgtagt 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 25
gctcctcgcg ctgtgttccc 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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accaccactg gtcacctgat 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 39
ggtcacgata ccgtgctcaa 20
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 41
cgtagccagc gcggatctca 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 42
ggcaacatcg gcctgggagg 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 43
accttgccca cagccttggc 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 44
ccagcacgcc agtcctttcc 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 45
ccatccttga tctcaatagt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 46
ggccgtgacc tcactgacta 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 47
agcgaggcgc atctcctcgt 20
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<212> DNA
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ttggcttcaa cgtcaagaac 20
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cgtagccagc gcggatctca 20
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gacgcctcgt gttccgcacg 20
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ccatccttga tctcaatagt 20
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atctccaagc aggagtacga 20
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acgcggagct cgttgtagaa 20
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ggtgtcatca aggaggttga 20
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ctcatcagct ggtacgataa 20
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ccatccttga tctcaatagt 20
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tgaacttcgt cgtcagccat 20
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tccaccgcaa gtgcttctaa 20
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tgtgcgtcta gtccaacctt 20
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ttggaagacg ctcctagtag 20
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gacttcaact atgtccaggc 20
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gtagtcagag gtactgagtt 20
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catgtggtta tgtagaacgg ca 22
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agtatctcgt gaaagcggga 20
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tgctccttcg tcttgcccat 20
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tatgaagcta ggatgtgcgt 20
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cacctacctt ggctcctcgt 20
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cgatatcgca actgtgtcga 20
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gaaaacgttg gagagcctga 20
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acagtgacgg tatctctgct 20
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accgtaacgg ccataagaag 20
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ataggtgcgt cggcagacat 20
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taagcactga agaagcgagt 20
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cgtaccagtc ggaacctctg 20
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cttagggctc atcgtcaaca 20
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acagcacgcc ttacttacct 20
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<211> 22
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ccttcaatcc taaacaccat gc 22
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tgaggagaac tgcaagcacc 20
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<211> 35
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tcgagctcgg taccccttca tactctcgca tttcc 35
<210> 81
<211> 32
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ttggccattt tgctagttgg gtgcttgttc tt 32
<210> 82
<211> 35
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tcgagctcgg taccctcatg ctcctttccc gccaa 35
<210> 83
<211> 32
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ttggccattt tgtttggtgc tagtagcttc ga 32
<210> 84
<211> 35
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tcgagctcgg tacccttgat cttgtgaggg ctcca 35
<210> 85
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<213> Artificial Sequence
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ttggccattt tgcttggtgt ttatgtgtgc gc 32
<210> 86
<211> 32
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ctagcaaaat ggccaagttg accagtgccg tt 32
<210> 87
<211> 32
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<400> 87
caaacaaaat ggccaagttg accagtgccg tt 32
<210> 88
<211> 32
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caagcaaaat ggccaagttg accagtgccg tt 32
<210> 89
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 89
ctctagagga tcccctcagt cctgctcctc ggcca 35
<210> 90
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 90
agagtcgaca ttggagtgat ggaatgccc 29
<210> 91
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 91
cttgcatgct gttgaaagag ctgaggcca 29
<210> 92
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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agagtcgacg tggtttgacc tcttatact 29
<210> 93
<211> 29
<212> DNA
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<400> 93
cttgcatgcg tttcccaact cacgttgtg 29
<210> 94
<211> 29
<212> DNA
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<400> 94
agagtcgaca tgtacccaat accacaccg 29
<210> 95
<211> 29
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cttgcatgcc ttgaagcact agaagagca 29
<210> 96
<211> 29
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cggggtaccc cagtagtcat atgctcgtc 29
<210> 97
<211> 29
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cggggtaccc cttgttacga cttcacctt 29
<210> 98
<211> 22
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taccggttca actggtcacg gc 22
<210> 99
<211> 20
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tcagtcctgc tcctcttcca 20
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
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<400> 100
cgcaggttca cctacggaaa 20
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 101
tcagtcctgc tcctcttcca 20
<210> 102
<211> 35
<212> DNA
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<220>
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<400> 102
atgattacga attcgaatga ctggcttcaa gtttg 35
<210> 103
<211> 32
<212> DNA
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<220>
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<400> 103
gacatgttca ttttgtttgg tgctagtagc tt 32(配列番号103)
<210> 104
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 104
caaacaaaat gaacatgtca gtgttgactt ta 32
<210> 105
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 105
caaaccacct actcggcctt cgtcgctttc tt 32
<210> 106
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 106
ccgagtaggt ggtttgacct cttatacttg atcga 35
<210> 107
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 107
gattgacaga ttgagctctc aaacatacaa aagaatt 37
<210> 108
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 108
accacttaca ttttgtttgg tgctagtagc tt 32
<210> 109
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 109
acaaaatgta agtggtttga cctcttatac ttgat 35
Claims (17)
- (1)ラビリンチュラ類の染色体DNAと相同組み換え可能である該染色体DNAの一部に対して相同な塩基配列、(2)上流にプロモーター配列を有し、下流にターミネーター配列を有する選択マーカー遺伝子、及び(3)上流にプロモーター配列を有し、下流にターミネーター配列を有する導入遺伝子挿入用のクローニング部位を少なくとも含む、ラビリンチュラ類を導入遺伝子で形質転換するためのベクター。
- ラビリンチュラ類の染色体DNAと相同組み換え可能である該染色体DNAの一部に対して相同な塩基配列が、ラビリンチュラ類の18SrRNAの遺伝子配列である、請求項1に記載のベクター。
- ラビリンチュラ類の染色体DNAと相同組み換え可能である該染色体DNAの一部に対して相同な塩基配列が、配列番号1に記載のSchizochytrium sp CB15-5の18SrRNAの塩基配列である、請求項1又は2に記載のベクター。
- 選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である、請求項1から3の何れかに記載のベクター。
- 選択マーカーがゼオシン(ブレオマイシン)耐性遺伝子である請求項4に記載のベクター。
- プロモーター及びターミネーターがラビリンチュラ類由来である、請求項1から5の何れかに記載のベクター。
- ラビリンチュラ類がSchizochytrium sp CB15-5である、請求項6に記載のベクター。
- プロモーターが、アクチン遺伝子、elongation factor 1α (ef1α)遺伝子、又はグリセルアルデヒド3 -ホスフェートデヒドロゲナーゼ(gapdh)遺伝子の何れかのプロモーターである、請求項1から7の何れかに記載のベクター。
- プロモーターの塩基配列が配列番号2から4の何れかである、請求項1から8の何れかに記載のベクター。
- ターミネーターが、アクチン遺伝子、elongation factor 1α (ef1α)遺伝子、又はグリセルアルデヒド3 -ホスフェートデヒドロゲナーゼ(gapdh)遺伝子の何れかのターミネーターである、請求項1から9の何れかに記載のベクター。
- ターミネーターの塩基配列が配列番号5から7の何れかである、請求項1から10の何れかに記載のベクター。
- プラスミドpUC18をバックボーンとする、請求項1から11の何れかに記載のベクター。
- プラスミドprGPZTをバックボーンとする、請求項1から11の何れかに記載のベクター。
- 請求項1から13の何れかに記載のベクターのクローニング部位に導入遺伝子を挿入されている、組み換えベクター。
- 導入遺伝子が、脂肪酸合成酵素遺伝子である、請求項14に記載の組み換えベクター。
- 請求項14又は15に記載の組み換えベクターで形質転換されたラビリンチュラ類細胞。
- 請求項16に記載の形質転換されたラビリンチュラ類細胞を用いて脂質又は脂肪酸を製造する方法。
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