JP2007534295A - ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコンベクターおよびパラミクソウイルスタンパク質抗原を含む免疫原性組成物 - Google Patents
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Abstract
自己増殖融合ブレブは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団で感染した細胞から産生される。ブレブの自己増殖融合性は、複製欠損レプリコン粒子中に組み入れられた、ウイルス融合タンパク質をエンコードするヘテロローガスな遺伝子の発現から誘導される。得られるブレブは、重度の細胞変性効果を示す細胞の上清から収穫することができる。ブレブは、免疫原性組成物を形成し、パラインフルエンザウイルス3型などのパラミクソウイルスに対して哺乳動物を免疫化する方法を考案するために使用される。
Description
(技術分野)
本発明は、パラインフルエンザウイルス3型などのパラミクソウイルスにより引き起こされる感染性疾患を治療または予防するための免疫原性組成物の分野に関する。本発明はまた、宿主細胞において外来遺伝子を発現するための組み換えDNAの分野および方法の分野にも関する。
本発明は、パラインフルエンザウイルス3型などのパラミクソウイルスにより引き起こされる感染性疾患を治療または予防するための免疫原性組成物の分野に関する。本発明はまた、宿主細胞において外来遺伝子を発現するための組み換えDNAの分野および方法の分野にも関する。
(従来技術)
パラミクソウイルスは、その膜が非常に感染性であり、流行性であり、疾患を引き起こす封入された(−)非セグメント化一本鎖RNAウイルスである。例としては、麻疹、流行性耳下腺炎、呼吸器合胞体ウイルス、およびパラインフルエンザウイルスが挙げられる。世界保健機構(WHO)により麻疹ウイルスなどのパラミクソウイルスを撲滅させるために協調努力がなされている。他のパラミクソウイルス、例えばニューカッスル病ウイルスは家畜集団に大損害をもたらす。
アメリカ合衆国において、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)およびパラインフルエンザウイルス(PIV)1、2、3、および4型は、幼児ならびに成人における呼吸器疾患での入院の主な原因である。例えば、RSVおよびPIVは小児における細気管支炎およびクループの症例の主な原因である。同様に、RSVおよびPIVは小児における肺炎およびインフルエンザに似た疾患の症例のほぼ半分の原因である。加えて、両ウイルスは、エアロゾル液滴により伝播させることができ、従って院内感染の原因である。
パラミクソウイルスは、その膜が非常に感染性であり、流行性であり、疾患を引き起こす封入された(−)非セグメント化一本鎖RNAウイルスである。例としては、麻疹、流行性耳下腺炎、呼吸器合胞体ウイルス、およびパラインフルエンザウイルスが挙げられる。世界保健機構(WHO)により麻疹ウイルスなどのパラミクソウイルスを撲滅させるために協調努力がなされている。他のパラミクソウイルス、例えばニューカッスル病ウイルスは家畜集団に大損害をもたらす。
アメリカ合衆国において、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)およびパラインフルエンザウイルス(PIV)1、2、3、および4型は、幼児ならびに成人における呼吸器疾患での入院の主な原因である。例えば、RSVおよびPIVは小児における細気管支炎およびクループの症例の主な原因である。同様に、RSVおよびPIVは小児における肺炎およびインフルエンザに似た疾患の症例のほぼ半分の原因である。加えて、両ウイルスは、エアロゾル液滴により伝播させることができ、従って院内感染の原因である。
ヒトの健康および世界経済に対するRSVおよびPIVの影響を軽減するための試みが30年以上も前に始まったが、ほとんど成功していない。例えば、RSVにおけるワクチン開発は、ホルマリン不活化全ウイルスRSVワクチンに関する期待はずれの結果により早期に阻まれた。この件において、ホルマリン不活化全ウイルスで免疫化された対象は免疫化後さらに重度の疾患にかかった。Kimら、Am.J.Epidemiol.89:422−434(1969)参照。有効なホルムアルデヒド−不活化PIVおよびRSVワクチンを作るための従来の試みは、感染症に対する適切な防御をもたらすことができなかった。Chin,J.,ら、Am.J.Epidemiol.89:449−463(1969)参照。
現在、2種の生弱毒化ワクチン候補、PIV3(JS株)のコールド・パッセージ誘導体(cp45)およびウシパラインフルエンザウイルス3型が臨床試験において評価されている。Jones,T.、Current Opinion in Investigational Drugs,2(7):890−892(2001)参照。結果として、cp45は期待できるPIV3ワクチンと考えられる。
RSVおよびPIV研究のもう一つ別の重要な態様は、依然として、高齢者また肺炎および下気道感染症などの既存の病状をもった人たちにおける合併症の予防にとどまる。この点に関して、感染した対象集団に投与するためのベクターベースの精製されたタンパク質抗原を開発することが試みられてきた。Crowe,J.E.,ら、Virus Genes 13(3):26−273 (1996)参照。
RSVおよびPIV研究のもう一つ別の重要な態様は、依然として、高齢者また肺炎および下気道感染症などの既存の病状をもった人たちにおける合併症の予防にとどまる。この点に関して、感染した対象集団に投与するためのベクターベースの精製されたタンパク質抗原を開発することが試みられてきた。Crowe,J.E.,ら、Virus Genes 13(3):26−273 (1996)参照。
パラミクソウイルス科のウイルスのヘテロローガスな遺伝子を組み入れ、発現する能力について様々なベクターが調べられてきた。これらとしては、例えば、野生型ワクシニアまたは弱毒化修飾アンカラワクシニア(MVA)(Durbinら、Vaccine 16:1234−1330(1998);Elango,N.,ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA83:1906−1910(1986))複製能力ヒトアデノウイルスベクター(Mittal S.K.,ら、Intervirology 41(6):253−260(1998))、水疱性口内炎ウイルス(VSV)(Kahn S.J.、J. Virol 75(22):11079−87(2001))、セムリキ森林熱ウイルス(SFV)(Peroulis、I.ら、Archives of Virology、144:107−116(1999))、PIV1/2または麻疹ウイルスゲノムを有する有効なベクターとしてのヒトPIV3(Skiadopoulos M.H.ら、Virology 29(1):136−152(2002))およびヒトPIV3ゲノムを有するウシPIV3(Haller A.A.,ら、J. Virology 74(24):11626−35(2000))が挙げられる。前記ベクターの全てについての前臨床研究から、対応する病原体に対して有望な防御効果が示された。
RSVおよびPIV病の流行および重度およびワクチンを製造するための従来の多くの試みにもかかわらず、これらの感染症を予防するための免疫原性組成物は現在のところ存在しない。従って、RSV、PIVおよび他のパラミクソウイルスに対して防御免疫を誘発する免疫原性組成物および方法が必要とされている。
Kimら、Am.J.Epidemiol.89:422−434(1969) Chin,J.,ら、Am.J.Epidemiol.89:449−463(1969) Jones,T.、Current Opinion in Investigational Drugs,2(7):890−892(2001) Crowe,J.E.,ら、Virus Genes 13(3):26−273 (1996) Durbinら、Vaccine 16:1234−1330(1998) Elango,N.,ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA83:1906−1910(1986) Mittal S.K.,ら、Intervirology 41(6):253−260(1998) Kahn S.J.、J. Virol 75(22):11079−87(2001) Peroulis、I.ら、Archives of Virology、144:107−116(1999) Skiadopoulos M.H.ら、Virology 29(1):136−152(2002) Haller A.A.,ら、J. Virology 74(24):11626−35(2000)
Kimら、Am.J.Epidemiol.89:422−434(1969) Chin,J.,ら、Am.J.Epidemiol.89:449−463(1969) Jones,T.、Current Opinion in Investigational Drugs,2(7):890−892(2001) Crowe,J.E.,ら、Virus Genes 13(3):26−273 (1996) Durbinら、Vaccine 16:1234−1330(1998) Elango,N.,ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA83:1906−1910(1986) Mittal S.K.,ら、Intervirology 41(6):253−260(1998) Kahn S.J.、J. Virol 75(22):11079−87(2001) Peroulis、I.ら、Archives of Virology、144:107−116(1999) Skiadopoulos M.H.ら、Virology 29(1):136−152(2002) Haller A.A.,ら、J. Virology 74(24):11626−35(2000)
(発明の開示)
本発明は、パラミクソウイルス、例えばRSVおよびPIVに対して哺乳動物を免疫化するための免疫原性組成物に関する。さらに詳細には、本発明は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団を含む免疫原性組成物に関する。ある具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子は、BHK培養細胞の単層を感染させるために用いられた場合に細胞変性効果を誘発する。もう一つ別の具体例において。前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合に前記レプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発する。特定の具体例において、BHK培養細胞における細胞変性効果は合胞体形成、単層破壊またはアポトーシスである。さらにもう一つ別の具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団は検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有しない。一具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子は哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する。ある具体例において、防御免疫反応は哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス3型による下気道の感染を予防する。もう一つ別の具体例において、防御免疫反応は、哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス3型による上気道の感染の重篤度を軽減する。特定の具体例において、免疫原性組成物は医薬的に許容される担体および/またはアジュバントをさらに含む。
本発明は、パラミクソウイルス、例えばRSVおよびPIVに対して哺乳動物を免疫化するための免疫原性組成物に関する。さらに詳細には、本発明は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団を含む免疫原性組成物に関する。ある具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子は、BHK培養細胞の単層を感染させるために用いられた場合に細胞変性効果を誘発する。もう一つ別の具体例において。前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合に前記レプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発する。特定の具体例において、BHK培養細胞における細胞変性効果は合胞体形成、単層破壊またはアポトーシスである。さらにもう一つ別の具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団は検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有しない。一具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子は哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する。ある具体例において、防御免疫反応は哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス3型による下気道の感染を予防する。もう一つ別の具体例において、防御免疫反応は、哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス3型による上気道の感染の重篤度を軽減する。特定の具体例において、免疫原性組成物は医薬的に許容される担体および/またはアジュバントをさらに含む。
一具体例において、本発明は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、および少なくとも1種のパラミクソウイルス糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団を含む免疫原性組成物を提供する。ある具体例において、パラミクソウイルスは、パラインフルエンザウイルス1型、パラインフルエンザウイルス2型、パラインフルエンザウイルス3型、パラインフルエンザウイルス4型および呼吸器合胞体ウイルスからなる群から選択される。もう一つ別の具体例において、パラミクソウイルス糖タンパク質は、パラインフルエンザウイルス1型HN、パラインフルエンザウイルス1型F、パラインフルエンザウイルス2型HN、パラインフルエンザウイルス2型F、パラインフルエンザウイルス3型HN、パラインフルエンザウイルス3型F、パラインフルエンザウイルス4型HN、パラインフルエンザウイルス4型Fからなる群から選択される。さらにもう一つ別の具体例において、特定のパラインフルエンザウイルスのHNおよびF糖タンパク質の両方は組み合わせられ、パラインフルエンザウイルス1型F糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス1型HN糖タンパク質遺伝子;パラインフルエンザウイルス2型F糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス2型HN糖タンパク質遺伝子;パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子;およびパラインフルエンザウイルス4型F糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス4型HN糖タンパク質遺伝子から選択される。別の具体例において、パラミクソウイルスは、呼吸器合胞体ウイルスであり、糖タンパク質は呼吸器合胞体ウイルス付着(G)糖タンパク質、および/または呼吸器合胞体ウイルス融合(F)糖タンパク質である。本発明の一具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子は、BHK培養細胞の単層を感染させるために用いられる場合に細胞変性効果を誘発する。もう一つ別の具体例において、前記レプリコン粒子に感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合に前記レプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発する。本発明の特定の具体例において、細胞変性効果は、合胞体形成、単層破壊およびアポトーシスからなる群から選択される。
一具体例において、本発明は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質をエンコードする単離された組換え核酸分子を提供する。もう一つ別の具体例において、本発明は、配列番号3に示される核酸配列を有するベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質をエンコードする組換え核酸分子を提供する。別の具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質は配列番号1に示される核酸によりエンコードされる。特定の具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質は、配列番号2;配列番号3、および配列番号4に記載されるアミノ酸配列を含む。別の具体例において、免疫原性組成物はさらに医薬的に許容される担体および/またはアジュバントを含む。
一具体例において、本発明はパラミクソウイルスによる気道の感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、前記対象に免疫学的に有効な量の:(a)ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質および少なくとも1種のパラミクソウイルス糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団を含む免疫原性組成物;および(b)医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で投与することを含む方法を提供する。特定の具体例において、パラミクソウイルスはパラインフルエンザウイルス3型であり、糖タンパク質はパラインフルエンザウイルス3型ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ(HN)糖タンパク質またはパラインフルエンザウイルス3型融合(F)糖タンパク質である。もう一つ別の具体例において、糖タンパク質はパラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質およびHN糖タンパク質のどちらも含む。さらにもう一つ別の具体例において、レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合にレプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発する。特定の具体例において、BHK培養細胞における細胞変性効果は、合胞体形成、単層破壊またはアポトーシスである。特定の具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)は検出可能な複製能力ベネズエウマ脳炎ウイルスを含有しない。もう一つ別の具体例において、パラミクソウイルスは呼吸器合胞体ウイルスであり、糖タンパク質は呼吸器合胞体ウイルス付着(G)糖タンパク質または呼吸器合胞体ウイルス融合(F)糖タンパク質である。別の具体例において、糖タンパク質は、呼吸器合胞体ウイルスG糖タンパク質およびF糖タンパク質のどちらも含む。ある具体例において、感染は下気道においてである。一方、もう一つ別の具体例においては、感染は上気道においてである。
本発明はさらに、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物も提供する。特定の具体例において、ブレブは融合性である。もう一つ別の具体例において、自己増殖ブレブは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスF糖タンパク質遺伝子、およびパラインフルエンザウイルスHN糖タンパク質遺伝子を含む。もう一つ別の具体例において、自己増殖ブレブは、BHK培養細胞の単層を感染させるために用いられる場合に細胞変性効果を誘発する。さらに詳細には、自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発する。本発明の特定の具体例において、ブレブはBHK培養細胞において以下の細胞変性効果:合胞体形成、単層破壊およびアポトーシスのうちの1つまたはそれ以上を誘発する。もう一つ別の具体例において、ブレブ集団は検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有しない。ある具体例において、自己増殖ブレブは、哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する。特定の具体例において、防御免疫反応は、哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス3型による下気道の感染を予防する。もう一つ別の具体例において、防御免疫反応は、哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス3型による上気道の感染を予防するか、または感染の重篤度を軽減する。
本発明の実施形態は、パラミクソウイルスによる感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法を提供する。例えば、このような1つの方法は、免疫学的に有効な量の、(a)ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、少なくとも1種のパラミクソウイルス糖タンパク質遺伝子および少なくとも1種のパラミクソウイルス糖タンパク質、(b)医薬的に許容される担体を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物を対象に投与することを含み、前記免疫原性組成物は、免疫反応を惹起するために十分な量で投与される。ある具体例において、自己増殖ブレブは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、および少なくとも1種のパラミクソウイルス糖タンパク質遺伝子を含む。ある具体例において、パラミクソウイルスは、パラインフルエンザウイルス1型、パラインフルエンザウイルス2型、パラインフルエンザウイルス3型、パラインフルエンザウイルス4型および呼吸器合胞体ウイルスからなる群から選択される。もう一つ別の具体例において、パラミクソウイルス糖タンパク質は、パラインフルエンザウイルス1型HN、パラインフルエンザウイルス1型F、パラインフルエンザウイルス2型HN、パラインフルエンザウイルス2型F、パラインフルエンザウイルス3型HN、パラインフルエンザウイルス3型F、パラインフルエンザウイルス4型HN、パラインフルエンザウイルス4型Fからなる群から選択される。特定の具体例において、特定のパラインフルエンザウイルスについてのHNおよびF糖タンパク質の両方は組み合わせられ、パラインフルエンザウイルス1型F糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス1型HN糖タンパク質遺伝子;パラインフルエンザウイルス2型F糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス2型HN糖タンパク質遺伝子;パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子;パラインフルエンザウイルス4型F糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス4型HN糖タンパク質遺伝子からなる群から選択される。もう一つ別の具体例において、パラミクソウイルスは呼吸器合胞体ウイルスであり、糖タンパク質は呼吸器合胞体ウイルス付着(G)糖タンパク質、および/または呼吸器合胞体ウイルス融合(F)糖タンパク質である。もう一つ別の具体例において、ブレブは融合性である。本発明の一具体例において、ブレブはBHK培養細胞の単層を感染させるために用いられる場合に細胞変性効果を誘発する。もう一つ別の具体例において、ブレブで感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合にレプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発する。本発明の特定の具体例において、細胞変性効果は、合胞体形成、単層破壊およびアポトーシスからなる群から選択される。
別の具体例において、自己増殖融合性ブレブを含む免疫原性組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む。もう一つ別の具体例において、自己増殖融合性ブレブを含む免疫原性組成物はアジュバントをさらに含む。
本発明はまた、パラミクソウイルスによる気道の感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、前記対象に免疫学的に有効な量の:(a)ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルスF糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルスF糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスHN糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルスHN糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物;(b)医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で投与することを含む。一具体例において、自己増殖ブレブは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスF糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルスHN糖タンパク質遺伝子を含む。ある具体例において、前記集団は検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず、自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する。もう一つ別の具体例において、パラインフルエンザウイルスは、パラインフルエンザウイルス1型、パラインフルエンザウイルス2型、パラインフルエンザウイルス3型、およびパラインフルエンザウイルス4型からなる群から選択される。もう一つ別の具体例において、HN糖タンパク質はパラインフルエンザウイルス3型ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ(HN)糖タンパク質であり、F糖タンパク質はパラインフルエンザウイルス3型融合(F)糖タンパク質である。特定の具体例において、糖タンパク質はパラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質およびHN糖タンパク質のどちらも含む。
本発明はまた、パラミクソウイルスによる気道の感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、前記対象に免疫学的に有効な量の:(a)ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルスF糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルスF糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスHN糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルスHN糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物;(b)医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で投与することを含む。一具体例において、自己増殖ブレブは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスF糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルスHN糖タンパク質遺伝子を含む。ある具体例において、前記集団は検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず、自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する。もう一つ別の具体例において、パラインフルエンザウイルスは、パラインフルエンザウイルス1型、パラインフルエンザウイルス2型、パラインフルエンザウイルス3型、およびパラインフルエンザウイルス4型からなる群から選択される。もう一つ別の具体例において、HN糖タンパク質はパラインフルエンザウイルス3型ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ(HN)糖タンパク質であり、F糖タンパク質はパラインフルエンザウイルス3型融合(F)糖タンパク質である。特定の具体例において、糖タンパク質はパラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質およびHN糖タンパク質のどちらも含む。
一具体例において、本発明は、パラインフルエンザウイルス3型による感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、前記対象に、免疫学的に有効な量の:(a)ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子、およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物;(b)医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で投与することを含む方法を提供する。もう一つ別の具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質は、配列番号2、配列番号3および配列番号4に示されるアミノ酸配列を有する。特定の具体例において、自己増殖ブレブは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質を、免疫反応を惹起するために十分な量で含む。もう一つ別の具体例において、前記集団は、検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有しない。特定の具体例において、自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する
(図面の簡単な記載)
図1は、VEEレプリカーゼ遺伝子、PIV3F遺伝子およびPIV3HN遺伝子を示すVRP−F/HNレプリコンプラスミドの図である。
図1は、VEEレプリカーゼ遺伝子、PIV3F遺伝子およびPIV3HN遺伝子を示すVRP−F/HNレプリコンプラスミドの図である。
(発明の詳細な記載)
アルファウイルスはインビボおよびエクスビボ用途のために哺乳動物および昆虫細胞遺伝子送達系として遺伝子操作されてきた。アルファウイルスゲノムは、5’非構造タンパク質(NSP)遺伝子とそれに続く、構造遺伝子の転写を調節するサブゲノムプロモーターの2つの領域に分割される単鎖(+)RNAからなる。NSP遺伝子は、ウイルスコアが細胞質中に放出された直後に翻訳される。NSP複合体は、完全長アンチゲノムおよびゲノムを合成するためのレプリカーゼとして、また構造遺伝子をエンコードするサブゲノム転写物を合成するトランスクリプターゼとして機能する。アルファウイルスの例としては、ベネズエラウマ脳炎(VEE)ウイルス、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林熱ウイルスが挙げられる。
アルファウイルスはインビボおよびエクスビボ用途のために哺乳動物および昆虫細胞遺伝子送達系として遺伝子操作されてきた。アルファウイルスゲノムは、5’非構造タンパク質(NSP)遺伝子とそれに続く、構造遺伝子の転写を調節するサブゲノムプロモーターの2つの領域に分割される単鎖(+)RNAからなる。NSP遺伝子は、ウイルスコアが細胞質中に放出された直後に翻訳される。NSP複合体は、完全長アンチゲノムおよびゲノムを合成するためのレプリカーゼとして、また構造遺伝子をエンコードするサブゲノム転写物を合成するトランスクリプターゼとして機能する。アルファウイルスの例としては、ベネズエラウマ脳炎(VEE)ウイルス、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林熱ウイルスが挙げられる。
アルファウイルスの複製は、構造遺伝子に依存し;従って、これらは除去することができ、外来遺伝子をその代わりに導入することができる。このように組み換えRNAを細胞中に導入すると、その結果、外来遺伝子産物の複製および発現の1ラウンドを引き起こす。従って、これらのゲノムは「自殺」ベクターまたは「レプリコン」と呼ばれる。アルファベクターで外来遺伝子を送達する2つの主な利点は:1)高レベルの発現が得られること、および2)感染した細胞のアポトーシス(すなわち、プログラムされた細胞の死)であり、この結果、免疫系を変更し、強固な免疫反応を惹起する「危険な」シグナルが生じる。
レプリコンベクターは、cDNAとして真核細胞pol IIプロモーターベースのプラスミド送達ビヒクル中に組み入れられた裸のRNAの形態で使用することができるか、あるいは感染性ウイルス様レプリコン粒子中に封入される。レプリコンベクターの有効な送達の結果、強固な外来遺伝子発現およびプログラムされた細胞の死がもたらされる。あらゆる場合において、ベクターは1ラウンドの複製のみを受け、生ウイルスと違って細胞から細胞への拡大を停止する。
レプリコンベクターは、cDNAとして真核細胞pol IIプロモーターベースのプラスミド送達ビヒクル中に組み入れられた裸のRNAの形態で使用することができるか、あるいは感染性ウイルス様レプリコン粒子中に封入される。レプリコンベクターの有効な送達の結果、強固な外来遺伝子発現およびプログラムされた細胞の死がもたらされる。あらゆる場合において、ベクターは1ラウンドの複製のみを受け、生ウイルスと違って細胞から細胞への拡大を停止する。
レプリコンシステムは、以下の米国特許:米国特許第5185440号(標題「ベネズエラウマ脳炎ウイルスをコードするcDNAクローンおよびその弱毒化突然変異体」、N.L.Davisら);米国特許第5505947号(標題「ベネズエラウマ脳炎ウイルスにおける弱毒化突然変異」、R.E.Johnstonら);米国特許第6156558号(標題「アルファウイルスRNAレプリコンシステム」、R.E.Johnstonら);および米国特許第6531135号(標題「アルファウイルスRNAレプリコンシステム」、R.E.Johnstonら)(その開示は全体として本発明の一部として参照される)において詳細に記載されている。
本発明は、レプリコン発現ベクターを送達する新規方法を記載する。ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEE)レプリコンベクターは、パラミクソウイルス、パラインフルエンザウイルス3型(PIV)のヘマグルチニン(HN)および融合(F)タンパク質を同時に発現するために遺伝子操作された。VEEレプリコン粒子(VRP)のキャラクタライゼーションの間、レプリコンについて知られていることと反対に、このシステムは組織培養においてVRP−F/HNレプリコン感染に際して感染性粒子を産生することが観察された。これらの感染性粒子は:1)PIV3HN、F、およびVEE NSP複合体を発現し、2)自己増殖可能であり、3)その表面上にHNおよびFタンパク質を含有し、4)繰り返す凍結−解凍サイクル中ずっと安定であり、5)サイズが異質であり、その一部は0.2ミクロンフィルターを通して濾過可能であり、6)高度に免疫原性であり、そして7)ゴールデンハムスターモデルにおけるPIV感染に対する有効な免疫原性組成物として使用できた。本発明を以下に詳細に記載する。
これらの研究の過程において、PIV3HNおよびF遺伝子はレプリコンベクター中にクローンされた。結果として得られるベクター(VRP−F/HN)は高度に免疫原性であり、鼻内または筋肉内経路により、1×104感染単位(IU)もの低い投与量でPIV3感染からハムスターを防御した。VRPパッケージング中のHNおよびFの同時発現の結果、大きな合胞体形成が起こり;その結果、この特定のVRPの力価はパッケージング反応あたり1×105VRP以上に達することはないことが観察され、力価104〜5は他のVRPベクターよりも低い。
感染性または「自己増殖」ブレブは、細胞をVRP−F/HNで感染させることによるか、または細胞をVEE−H/HNレプリコンベクターRNA単独でトランスフェクトすることにより生成させることができる。「感染性ブレブ」または「自己増殖ブレブ」とは、PIV3HNおよびF遺伝子または他のウイルス融合タンパク質を表面上に有し、自己増殖可能な外膜融合性ベシクルまたは融合性粒子を意味する。「感染性ブレブ」、「自己増殖ブレブ」、および「融合性粒子」なる用語は時々交換可能に用いられる。ブレブは、免疫原性組成物として投与された場合に、104合胞体形成単位(SFU)の低い投与量でゴールデンハムスターの上および下気道をPIV3感染に対して防御することができた。これらの臨床前研究から、感染性粒子はPIV3の免疫原性組成物として使用できることが示された。
感染性または「自己増殖」ブレブは、細胞をVRP−F/HNで感染させることによるか、または細胞をVEE−H/HNレプリコンベクターRNA単独でトランスフェクトすることにより生成させることができる。「感染性ブレブ」または「自己増殖ブレブ」とは、PIV3HNおよびF遺伝子または他のウイルス融合タンパク質を表面上に有し、自己増殖可能な外膜融合性ベシクルまたは融合性粒子を意味する。「感染性ブレブ」、「自己増殖ブレブ」、および「融合性粒子」なる用語は時々交換可能に用いられる。ブレブは、免疫原性組成物として投与された場合に、104合胞体形成単位(SFU)の低い投与量でゴールデンハムスターの上および下気道をPIV3感染に対して防御することができた。これらの臨床前研究から、感染性粒子はPIV3の免疫原性組成物として使用できることが示された。
本発明はいくつかの当座の有用性を有する。第一に、PIV3のHNおよびF遺伝子を同時に発現するためのVEEレプリコン粒子の使用。第二に、表面上にPIVまたは他の融合性タンパク質/糖タンパク質を有する自己増殖ブレブを生成させるためのVEEレプリコン粒子の使用。第三に免疫原としての融合性自己増殖ブレブの使用。
本発明の一具体例において、HNおよびF遺伝子の同時発現は、ゴールデンハムスターモデルにおいてPIV3に対する免疫を生じさせるのに、いずれかの遺伝子単独、または個々の発現後の[HN+F]の組み合わせよりも有効であることが示された。理論に限定されないが、このベクターの免疫原性は、F/HN複合体の向上された提示レベルおよび/またはより長い半減期に関連する。あるいは、感染した細胞から放出される融合性粒子またはブレブは、発現の寿命および/または感染するようになる細胞の数を増大させることができる。
本発明の一具体例において、HNおよびF遺伝子の同時発現は、ゴールデンハムスターモデルにおいてPIV3に対する免疫を生じさせるのに、いずれかの遺伝子単独、または個々の発現後の[HN+F]の組み合わせよりも有効であることが示された。理論に限定されないが、このベクターの免疫原性は、F/HN複合体の向上された提示レベルおよび/またはより長い半減期に関連する。あるいは、感染した細胞から放出される融合性粒子またはブレブは、発現の寿命および/または感染するようになる細胞の数を増大させることができる。
本発明のもう一つ別の具体例において、表面上にHNおよびFを含有する融合性粒子またはブレブは、ゴールデンハムスターモデルにおいてPIV感染に対して有効な免疫原性組成物でもある。約10〜100のブレブがインビトロで感染した細胞あたり産生され、この系を大規模産生に好適にする。ブレブは、凍結−解凍サイクルを通して安定であった。自己増殖ブレブは、VRP−F/HNまたはブレブで細胞を感染させるか、あるいはVEEレプリコン−F/HN RNAのエレクトロポレーションにより生成させることができる。
本発明の一具体例は、ヘテロローガスな病原体に対して防御を与えることができる追加の1または2の遺伝子を含むことである。融合性粒子が自己増殖性であるという事実により、インビトロで生成された免疫原性組成物よりも優れた利点がもたらされる。例えば、他のウイルス(麻疹、SV5、またはHIV)から得られる他の融合性タンパク質は、PIV3HNおよびFの代わりに用いることもでき、従って免疫原性組成物のレパートリーを増大させる。
ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)から誘導されるレプリコンは、免疫原性組成物の設計のための別のベクター系を表す。VEEレプリコンは、様々な動物細胞型を感染させることができることが証明されている。VEEレプリコンは、ウイルスならびに細菌抗原の抗原送達に用いられており[Davis N.L.ら、J. Virology 70(6):3781−3787(1996);Lee J.S.ら、.、J. Infect. Dis.、185(8):1192−6(2002)]、樹状細胞を目標とすることにより首尾よく強力な体液性ならびに細胞性免疫を誘発する[MacDonald G.H.ら、J. Virology、74(2):914−922(2000)]。
ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)から誘導されるレプリコンは、免疫原性組成物の設計のための別のベクター系を表す。VEEレプリコンは、様々な動物細胞型を感染させることができることが証明されている。VEEレプリコンは、ウイルスならびに細菌抗原の抗原送達に用いられており[Davis N.L.ら、J. Virology 70(6):3781−3787(1996);Lee J.S.ら、.、J. Infect. Dis.、185(8):1192−6(2002)]、樹状細胞を目標とすることにより首尾よく強力な体液性ならびに細胞性免疫を誘発する[MacDonald G.H.ら、J. Virology、74(2):914−922(2000)]。
VEEレプリコンは、親ベネズエラウマ脳炎ウイルスのアル特性を利用する。ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEE)は、トガウイルス科のアルファウイルス属のメンバーである。ウイルスゲノムは、5’末端においてメチル化キャップで、また3’末端において可変長ポリ(A)トラクトで修飾された一本鎖(+)RNAである。一本鎖ウイルスカプシドタンパク質(c)を含有する構造サブユニットは、二十面体ヌクレオカプシドにおいてRNAゲノムと結合する。ビリオンにおいて、カプシドは、膜貫通型タンパク質スパイクの規則的な列で覆われた脂質エンベロープにより取り囲まれており、そのそれぞれは2種の糖タンパク質E1およびE2のヘテロダイマー複合体からなる。Pedersen、C.E.およびEddy、G.A.、J. Mol. Biol. 168:1−15(1974)参照。VEEゲノムの構成およびVEE遺伝子発現の全体的な方法は、プロトタイプアルファウイルス、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林熱ウイルスのものに匹敵する。(概説については、Schlesinger、S.およびSchlesinger、M.J.、The Togaviridae and Flaviviridae. Plenum Publishing Corp.、New York (1986)参照。)例えば、VEEのトリニダードロバ株の部分ゲノム配列の詳細は、VEE構造タンパク質が、ウイルスゲノムの3’側1/3に相当する266サブゲノムmRNAからポリタンパク質の形態で翻訳されることを明らかにする。タンパク分解処理により、成熟ビリオンにおいて見いだされるタンパク質が生じる。アルファウイルス非構造タンパク質遺伝子は、NSP1、NSP2、NSP3およびNSP4の順序でゲノムの5’側の2/3に位置する。タンパク質はまずポリタンパク質前駆体として発現され、次いでタンパク分解処理されてその成熟形態にされる。成熟非構造タンパク質は、ゲノムRNAの複製および26SサブゲノムmRNAの合成に必要とされる。
VEEゲノムは、(+)単鎖RNA分子からなる。これは長さ約11kbで5’−キャップ構造および3’−ポリAテールを有する。複製は、(−)鎖RNA中間体を経由して進行し、これは、追加のウイルスゲノムの合成およびサブゲノムmRNAの転写用テンプレートとして使用される。遺伝子送達のためのベクターとして使用される場合、ウイルスRNA複製に必要でないウイルス構造タンパク質をエンコードするゲノムの3’側1/2を削除し、興味のある抗原をエンコードする遺伝子と置換する。これらのレプリコンのパッケージングは、VEE構造タンパク質をエンコードする欠損ヘルパーRNAの共トランスフェクションにより達成される。結果として得られるレプリコン粒子は、興味のある抗原をエンコードする遺伝子を組み入れるが、もはや感染性ウイルス粒子を生成させることができない。しかしながら、レプリコンは多量のヘテロローガスな遺伝子産物の発現を行うことができ、従って、抗原を送達するための有効な手段としての働きをする。
VEEレプリコン粒子がパラミクソウイルス科ウイルスの免疫原性組成物の設計においてベクターとして使用できるかどうかを評価するために、パラミクソウイルスの免疫原性組成物に関する研究のための実験用ウイルスとしての広範囲の用途のためにPIV3ウイルスが選択された。PIVおよびRSVサブユニットワクチンの開発は、個々のウイルスタンパク質それ自体の抗原性および免疫原性の理解が十分でないことにより阻害される。例えば、PIV3ゲノムは6のオープンリーディングフレーム(ORF)を含有し、これは次の非構造内部タンパク質:ヌクレオカプシド(NP)、マトリックス(M)、リンタンパク質(P)、ラージポリメラーゼ(L)タンパク質および2つの表面糖タンパク質、ヘマグルチニンノイラミニダーゼ(HN)、および融合(F)をエンコードする。ORFはまた、それぞれRNA変更および別の翻訳開始のために発現される2つの他のタンパク質CおよびVもエンコードする。第三のタンパク質Dは、おそらくは発現されるが、このタンパク質の機能は現在のところ確認されていない。今までのところ、PIV3感染に対する防御におけるこれらの内部タンパク質の役割についてごくわずかの情報しか得られていない。PIV3のNPと約85%の相同性を共有するPIV1の核タンパク質(NP)は、優性MHCクラスI結合ペプチドをエンコードし、非常に強力なMHCクラスI限定応答を誘発し、マウスをPIV1感染から防御することが証明された。さらに、HNおよびFは、HNについて少なくとも6、Fについて8の中和部位を含有する2つの主な中和抗原である。
VEEレプリコン粒子がパラミクソウイルス科ウイルスの免疫原性組成物の設計においてベクターとして使用できるかどうかを評価するために、パラミクソウイルスの免疫原性組成物に関する研究のための実験用ウイルスとしての広範囲の用途のためにPIV3ウイルスが選択された。PIVおよびRSVサブユニットワクチンの開発は、個々のウイルスタンパク質それ自体の抗原性および免疫原性の理解が十分でないことにより阻害される。例えば、PIV3ゲノムは6のオープンリーディングフレーム(ORF)を含有し、これは次の非構造内部タンパク質:ヌクレオカプシド(NP)、マトリックス(M)、リンタンパク質(P)、ラージポリメラーゼ(L)タンパク質および2つの表面糖タンパク質、ヘマグルチニンノイラミニダーゼ(HN)、および融合(F)をエンコードする。ORFはまた、それぞれRNA変更および別の翻訳開始のために発現される2つの他のタンパク質CおよびVもエンコードする。第三のタンパク質Dは、おそらくは発現されるが、このタンパク質の機能は現在のところ確認されていない。今までのところ、PIV3感染に対する防御におけるこれらの内部タンパク質の役割についてごくわずかの情報しか得られていない。PIV3のNPと約85%の相同性を共有するPIV1の核タンパク質(NP)は、優性MHCクラスI結合ペプチドをエンコードし、非常に強力なMHCクラスI限定応答を誘発し、マウスをPIV1感染から防御することが証明された。さらに、HNおよびFは、HNについて少なくとも6、Fについて8の中和部位を含有する2つの主な中和抗原である。
HNは、内部赤血球凝集反応およびノイラミニダーゼ活性を有するII型糖タンパク質である。HNは細胞に対するウイルス付着を媒介し、融合プロセスを促進する。これはシアリン酸を除去してウイルス粒子を放出させ、凝集を防止する。Fタンパク質はI型糖タンパク質であり、ウイルス浸透および合胞体形成に重要である。Foのタンパク分解開裂は、2つのジスルフィド結合で結合したサブユニットF1およびF2を生じさせ、融合活性に必要である。Fのインビトロ融合活性はHNタンパク質の存在を必要とするので、ウイルス表面上でHNおよびFが共存することは、生物学的に重要であると思われる。PIV3サブユニットを含有する免疫原性組成物に関する臨床前研究から、HNおよびFを予防御抗体として用いる重要性に関するデータが得られた。
一般に、パラミクソウイルス、例えばパラインフルエンザウイルス(PIV)および呼吸器合胞体ウイルス(RSV)に対する免疫原性組成物の設計は、下気道(LRT)における感染を予防するために行われる。例えば、アジュバントの援助を受けて精製された、またはベクター発現されたPIV3HNタンパク質は、動物モデルにおけるLRTに対して防御を提供し、一方、精製またはベクター発現Fタンパク質は、部分的に防御を提供するか、または全く提供しなかった。組み換えHNおよびFの組み合わせまたはキメラタンパク質F/HNを用いる方法は、LRT感染に対して防御を示した。研究は、HNおよびFタンパク質を同時に発現するVRPを構築するために本明細書において記載されたようにして開始した。強力な有効性に潜在的に寄与し得る新規特性を有する有効なVEEベースのPIVサブユニット免疫原性組成物を本明細書において記載する。
本明細書において用いられる場合、「感染性ブレブ」または「自己増殖ブレブ」、または「ブレブ」なる用語は、自己増殖できる、表面上にPIV3HNおよびF遺伝子(または他のウイルス融合タンパク質)を有する外膜融合性ベシクルを意味する。「感染性ブレブ」、「自己増殖ブレブ」、ブレブ、および「融合性粒子」なる用語は、時々交換可能に用いられる。自己増殖は、ブレブ表面上の融合タンパク質を介してタンパク質により行われる。しかしながら、ブレブは、レプリコンRNAも含有するので、新規細胞との融合に際して、レプリコンRNAは転写され、融合タンパク質が細胞表面上に発現され、プロセスが再び開始される。本発明の自己増殖ブレブは、PIV3に対する免疫原性組成物として有効であることが示された。約10〜100の自己増殖ブレブがインビトロで感染細胞あたり産生され、このシステムを大規模産生に好適にする。自己増殖ブレブは凍結−解凍サイクル全体にわたって安定であった。自己増殖ブレブは、細胞をVRP−F/HNでまたは融合性粒子で感染させるか、またはVEEレプリコン−F/HN RNAのエレクトロポレーションにより生成された。感染性ブレブが自己増殖性であるという事実により、インビトロで生成したサブユニットタンパク質よりも優れた利点がもたらされる。
「アルファウイルス」なる用語は、当該分野におけるその通常の意味を有し、アルファウイルスの様々な種、例えばイースタンウマ脳炎ウイルス(EEE)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEE)、ウェスタンウマ脳炎ウイルス(WEE)、シンドビスウイルス、南アフリカアルボウイルスNo.86、セムリキ森林熱ウイルスなどが挙げられる。概論に関しては、Field’s Virology,第4版、第30章:Alphaviruses pp. 917−962 by Griffin、D.E.、Publisher: Lippincott Williams & Wilkins、New York(2001)(その開示は全体として本発明の一部として参照される)参照。本発明のける使用に好ましいアルファウイルスRNA転写物としては、VEE、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林熱ウイルスが挙げられる。
本発明の方法において用いられるアルファウイルス許容細胞は、ウイルスRNA転写物でのトランスフェクションに際してウイルス粒子を産生できる細胞である。アルファウイルスは、広い宿主範囲を有する。好適な哺乳動物宿主としては、これらに限定されないが、ベロ細胞、新生児ハムスター腎臓(BHK)細胞、ニワトリ胚線維芽(CEF)細胞およびアカゲザル腎臓細胞(LLC−MK2)が挙げられる。
VRPをBHK−21系からの細胞において増殖させた。この場合において、BHK細胞は、擬似表現型特性を共有しない他のBHKクローン集団から区別するために、CCL−10クローンから誘導された。本発明において定義されるように、細胞はBHK21または単にBHK細胞と称する。
本明細書において用いられるように「非構造タンパク質」または「NSP」なる用語は、レプリコンのポリメラーゼ機能を意味する。例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEE)において、ポリメラーゼ機能は、1つのポリタンパク質として翻訳されたNSP1、NSP2、NSP3およびNSP4タンパク質により提供される。非構造タンパク質遺伝子は、自律性複製のためのレプリコンRNAの一部として必要とされる。
VRPをBHK−21系からの細胞において増殖させた。この場合において、BHK細胞は、擬似表現型特性を共有しない他のBHKクローン集団から区別するために、CCL−10クローンから誘導された。本発明において定義されるように、細胞はBHK21または単にBHK細胞と称する。
本明細書において用いられるように「非構造タンパク質」または「NSP」なる用語は、レプリコンのポリメラーゼ機能を意味する。例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEE)において、ポリメラーゼ機能は、1つのポリタンパク質として翻訳されたNSP1、NSP2、NSP3およびNSP4タンパク質により提供される。非構造タンパク質遺伝子は、自律性複製のためのレプリコンRNAの一部として必要とされる。
本明細書において用いられる「構造タンパク質」または「アルファウイルス構造タンパク質」なる語句は、RNAレプリコンの複製に必要とされるエンコードされたタンパク質を意味し、カプシドタンパク質、E1糖タンパク質、およびE2糖タンパク質を包含する。本明細書において記載されるように、アルファウイルスの構造タンパク質は、1以上のヘルパーRNA(すなわち、第一ヘルパーRNAおよび第二ヘルパーRNA)上でエンコードされる。加えて、少なくとも1つの構造タンパク質をエンコードする領域がレプリコンRNAから欠失しているので、前記レプリコンおよび結果として得られるアルファウイルス粒子が複製欠損であるとするならば、1以上の構造タンパク質を、レプリコンRNAとして同じRNA分子上でエンコードすることができる。本明細書において用いられる場合、「欠失した」または「欠失」なる用語は、特定の核酸セグメントの全体的な欠失または特定のセグメントを標準的用法にしたがって操作不能または非構造的にするために十分な前記セグメントの部分の欠失を意味する。例えば、米国特許第4650764号(Teminら)参照。本明細書において用いられるように「複製欠損」なる用語は、レプリコンRNAがヘルパーRNAの不在下で宿主細胞において新規ウイルス粒子を形成できないことを意味する。レプリコンRNAは複製に必要なアルファウイルス構造タンパク質の全てをエンコードするわけではないので、レプリコンRNAは複製欠損であり、必要とされる構造タンパク質の少なくとも1つがここから欠失している。
感染性複製欠損アルファウイルス粒子を発現するためのヘルパー細胞は、上述のように1組のRNAを含む。RNAの組は、第一ヘルパーRNAおよび第二ヘルパーRNAを含む。第一ヘルパーRNAは、少なくとも1つのアルファウイルス構造タンパク質をエンコードするRNAを含むが、すべてのアルファウイルス構造タンパク質をエンコードするわけではない。言い換えれば、第一ヘルパーRNAは少なくとも1つのアルファウイルス構造タンパク質をエンコードせず;少なくとも1つのコードされないアルファウイルス構造タンパク質が第一ヘルパーRNAから欠失している。一具体例において、第一ヘルパーRNAは、アルファウイルスE1糖タンパク質をエンコードするRNAを含み、アルファウイルスカプシドタンパク質およびアルファウイルスE2糖タンパク質が第一ヘルパーRNAから欠失している。もう一つ別の具体例において、第一ヘルパーRNAは、アルファウイルスE2糖タンパク質をエンコードするRNAを含み、アルファウイルスカプシドタンパク質およびアルファウイルスE1糖タンパク質が第一ヘルパーRNAから欠失している。第三の具体例において、第一ヘルパーRNAは、アルファウイルスE1糖タンパク質およびアルファウイルスE2糖タンパク質をエンコードするRNAを含み、アルファウイルスカプシドタンパク質は第一ヘルパーRNAから欠失している。
第二のヘルパーRNAは、第一ヘルパーRNAによりエンコードされる少なくとも1つの構造タンパク質と異なる少なくとも1つのアルファウイルス構造タンパク質をエンコードするRNAを含む。従って、第二のヘルパーRNAは、第一ヘルパーRNAによりエンコードされる少なくとも1つの構造タンパク質によりエンコードされない少なくとも1つのアルファウイルス構造タンパク質をエンコードする。第二のヘルパーRNAは、第一ヘルパーRNAによりエンコードされる少なくとも1つのアルファウイルス構造タンパク質をエンコードせず、従って第一および第二のヘルパーRNAは二重構造タンパク質をエンコードしない。第二のヘルパーRNAは、第一ヘルパーRNAによりエンコードされるものと異なる構造タンパク質をエンコードする。第一ヘルパーRNAがアルファウイルスE1糖タンパク質のみをエンコードするRNAを含む具体例において、第二のヘルパーRNAは、第一ヘルパーRNAから欠失しているアデノウイルスカプシドタンパク質およびアルファウイルスE2糖タンパク質の一方または両方をエンコードするRNAを含み得る。第一ヘルパーRNAがアルファウイルスE2糖タンパク質のみをエンコードするRNAを含む具体例において、第二のヘルパーRNAは、第一ヘルパーRNAから欠失しているアルファウイルスカプシドタンパク質およびアルファウイルスE1糖タンパク質の一方または両方をエンコードするRNAを含み得る。第一ヘルパーRNAがアルファウイルスE1糖タンパク質およびアルファウイルスE2糖タンパク質の両方をエンコードするRNAを含む具体例において、第二のヘルパーRNAは、第一ヘルパーRNAから欠失しているアルファウイルスカプシドタンパク質をエンコードするRNAを含み得る。
一具体例において、パッケージングセグメントまたは「カプシド化配列」は、少なくとも第一ヘルパーRNAから欠失している。もう一つ別の具体例において、パッケージングセグメントは、第一ヘルパーRNAおよび第二ヘルパーRNAおよび第二ヘルパーの両方から欠失している。
パッケージングセグメントが第一ヘルパーRNAおよび第二ヘルパーの両方から欠失している具体例において、好ましくは、ヘルパー細胞は第一ヘルパーRNAおよび第二ヘルパーRNAに加えてレプリコンRNAを含有する。レプリコンRNAは、パッケージングセグメントおよび挿入されたヘテロローガスなRNAをエンコードする。挿入されたヘテロローガスなRNAは、ウイルス融合タンパク質をエンコードするRNA、または融合活性を生じさせるために必要なタンパク質、または融合活性を媒介できるペプチドをエンコードするRNAである。典型的には、挿入されたヘテロローガスなRNAは、タンパク質またはペプチドをエンコードし、これは望ましくは宿主、アデノウイルス許容細胞または自己増殖ブレブの融合パートナーにより発現され、前記細胞における前記タンパク質またはペプチドの発現に必要なプロモーターおよび調節セグメントを含む。好適な挿入されたヘテロローガスなRNAの例としては、これらに限定されないが、パラインフルエンザウイルス1型、パラインフルエンザウイルス2型、パラインフルエンザウイルス3型、パラインフルエンザウイルス4型、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、水疱性口内炎ウイルスおよびインフルエンザウイルスをはじめとする広範囲のウイルスから得られるウイルスRNAが挙げられる。
パッケージングセグメントが第一ヘルパーRNAおよび第二ヘルパーの両方から欠失している具体例において、好ましくは、ヘルパー細胞は第一ヘルパーRNAおよび第二ヘルパーRNAに加えてレプリコンRNAを含有する。レプリコンRNAは、パッケージングセグメントおよび挿入されたヘテロローガスなRNAをエンコードする。挿入されたヘテロローガスなRNAは、ウイルス融合タンパク質をエンコードするRNA、または融合活性を生じさせるために必要なタンパク質、または融合活性を媒介できるペプチドをエンコードするRNAである。典型的には、挿入されたヘテロローガスなRNAは、タンパク質またはペプチドをエンコードし、これは望ましくは宿主、アデノウイルス許容細胞または自己増殖ブレブの融合パートナーにより発現され、前記細胞における前記タンパク質またはペプチドの発現に必要なプロモーターおよび調節セグメントを含む。好適な挿入されたヘテロローガスなRNAの例としては、これらに限定されないが、パラインフルエンザウイルス1型、パラインフルエンザウイルス2型、パラインフルエンザウイルス3型、パラインフルエンザウイルス4型、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、水疱性口内炎ウイルスおよびインフルエンザウイルスをはじめとする広範囲のウイルスから得られるウイルスRNAが挙げられる。
挿入されたヘテロローガスなRNAを提供するために使用できる好適なウイルスRNA遺伝子の例としては、これらに限定されないが、パラインフルエンザウイルス1〜4型のHNおよびF遺伝子、特にパラインフルエンザウイルス3型のHNおよびF、インフルエンザヘマグルチニン遺伝子、インフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子、レンチウイルス糖タンパク質エンベロープ遺伝子、HIVエンベロープgp160遺伝子、およびHIVマトリックスカプシド融合遺伝子が挙げられる。本発明のもう一つ別の具体例において、挿入されたヘテロローガスなRNAは、呼吸器合胞体ウイルス融合(F)糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス付着(G)糖タンパク質または呼吸器合胞体ウイルスFおよびGタンパク質の両方をエンコードする。
一具体例において、レプリコンRNA、第一ヘルパーRNAおよび第二ヘルパーRNAは、第一分子、すなわちレプリコンRNAが、パッケージングセグメントをエンコードするRNAおよび融合活性をエンコードする挿入されたヘテロローガスなRNAを含み、第二の分子、すなわち第一ヘルパーRNAが、必要とされるアルファウイルス構造タンパク質の少なくとも1つをエンコードするが、全部をエンコードするわけではないRNAを含み、第三の分子、すなわち第二のヘルパーRNAが、必要とされるアルファウイルス構造タンパク質の少なくとも1つをエンコードするが、全部をエンコードするわけではないRNAを含むように、独立した分子上に提供される。例えば、本発明のもう一つ別の具体例において、ヘルパー細胞は、(a)アルファウイルスパッケージング配列をエンコードするRNAおよび融合活性をエンコードする挿入されたヘテロローガスなRNAを含むレプリコンRNA、(b)アルファウイルスE1糖タンパク質およびアルファウイルスE2糖タンパク質をエンコードするRNAを含む第一ヘルパーRNA、ならびに(c)アルファウイルスE1糖タンパク質、アルファウイルスE2糖タンパク質およびカプシドタンパク質が宿主細胞において集合してアルファウイルスレプリコン粒子を形成するように、アルファウイルスカプシドタンパク質をエンコードするRNAを含む第二のヘルパーRNAを含むRNAの組み合わせを含む。
別の具体例において、レプリコンRNAおよび第一ヘルパーRNAは、別の分子上にあり、レプリコンRNAおよび第二のヘルパーRNAは1つの分子上に一緒にあるので、第一分子、すなわち第一ヘルパーRNAは必要とされるアルファウイルス構造タンパク質の少なくとも1つをエンコードするが、全部をエンコードするわけではないRNAを含み、第二の分子、すなわちレプリコンRNAおよび第二のヘルパーRNAは、パッケージングセグメント、挿入されたヘテロローガスなDNAおよびカプシドタンパク質をエンコードするRNAを含む。従って、カプシドタンパク質は、第二のヘルパーRNAによりエンコードされるが、第二のヘルパーRNAはレプリコンRNAと一緒に第二の分子上に位置する。例えば、本発明の一具体例において、ヘルパー細胞は:(a)アルファウイルスパッケージング配列、挿入されたヘテロローガスなRNA、およびアルファウイルスカプシドタンパク質をエンコードするRNAを含むレプリコンRNA、および(b)アルファウイルスE1糖タンパク質およびアルファウイルスE2糖タンパク質をエンコードするRNAを含む第一ヘルパーRNAを含む一組のRNAを含むので、アルファウイルスE1糖タンパク質、アルファウイルスE2糖タンパク質およびカプシドタンパク質は宿主細胞において集合してアルファウイルス粒子を形成する。
本明細書において用いられる場合、「細胞変性効果(CPE)」なる用語は、個々の培養された細胞またはウイルス感染による細胞において誘発される著しい形態上の変化を意味する。一般に、CPEは光学顕微鏡下で容易に見ることができる。CPEは、これらに限定されないが、以下の細胞現象を包含する:合胞体形成、単層破壊、円形化、収縮、屈折率の増大、融合、凝集、付着性の損失または溶解。これらの現象は、特定のウイルス、細胞型および状態に応じて単独または組み合わせで起こり得る。
本発明の免疫原性組成物は、アジュバントを含むことができる。アジュバントは、免疫原または抗原と一緒に投与された場合に免疫反応を向上させる物質である。これらに限定されないが、インターロイキン1−α、1−β、2、4、5、6、7、8、10、12(例えば、米国特許第5723127号参照)、13、14、15、16、17および18(およびその突然変異形態)、インターフェロン−α、βおよびγ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(例えば、米国特許第5078996号参照)、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、GSF、および腫瘍壊死因子αおよびβをはじめとする多くのサイトカインまたはリンホカインが免疫調節活性を有することが証明されており、従ってアジュバントとして使用することができる。本発明において有用なさらに別のアジュバントとしては、これらに限定されないが、MCP−1、MIP−1α、MIP−1β、およびRANTESをはじめとするケモカインが挙げられる。付着分子、例えばセレクチン、たとえはL−セレクチン、P−セレクチンおよびE−セレクチンもアジュバントとして有用である。さらに別の有用なアジュバントとしては、制限なく、ムチン様分子、例えばCD34、GlyCAM−1およびMadCAM−1、インテグリン科のメンバー、例えばLAF−1、VLA−1、Mac−1およびp150.95、イムノグロブリン超科のメンバー、例えばPECAM、ICAMs、例えばICAM−1、ICAM−2およびICAM−3、CD2およびLFA−3、副刺激分子、例えばCD40およびCD40L、血管成長因子、神経成長因子、繊維芽細胞成長因子、表皮成長因子、B7.2、PDGF、BL−1、および血管内皮成長因子をはじめとする成長因子、Fas、TNFレセプター、Flt、Apo−1、p55、WSL−1、DR3、TRAMP、Apo−3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL−R2、TRICK2、およびDR6をはじめとするレセプター分子が挙げられる。さらに別のアジュバント分子としては、カスパーゼ(ICE)が挙げられる。国際特許公開番号WO98/17799およびWO99/43839(本発明の一部として参照される)を参照。
免疫反応を向上させるために使用される好適なアジュバントとしては、制限なく、MPL(3−O−デアシル化モノホスホリルリピッド;Corixa,Hamilton,MT)(米国特許第4912094号(本発明の一部として参照される)に記載)が挙げられる。合成リピッドA類似体またはアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物(AGP)、またはCorixa(Hamilton,MT)から入手可能であり、米国特許第6113918号(本発明の一部として参照される)に記載されているその誘導体または類似体もアジュバントとしての使用に好適である。このようなAGPの1つは、2−[(R)−3−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]エチル2−デオキシ−4−O−ホスホノ−3−O−[(R)−3−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]−2−[(R)−3−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル−アミノ]−b−D−グルコピラノシド(529とも称する(以前はRC529と称していた)である。この529アジュバントは、水性形態として、または安定なエマルジョンとして処方される。
さらに他のアジュバントとしては、鉱物油および水エマルジョン、アルミニウム塩(alum)、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなど、Amphigen、Avridine、L121/スクアレン、D−ラクチド−ポリアクチド/グリコシド、プルロニックポリオール、ムラミルジペプチド、死菌ボルデテラ、サポニン、例えばStimulon QS−21(Antigenics、Framingham、MA.)(米国特許第5057540号(本発明の一部として参照される)に記載)、およびこれから生じる粒子、例えばISCOMS(免疫刺激複合体)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、細菌リポ多糖類、合成ポリヌクレオチド、例えばCpGモチーフを含有するオリゴヌクレオチド(米国特許第6207646号(本発明の一部として参照される)に記載)、百日咳毒素(PT)、またはイー・コリ易熱性毒素(LT)、特にLT−K63、LT−R72、PT−K9/G129が挙げられ;例えば国際特許公開番号WO93/13302およびWO92/19265参照。
国際特許公開番号WO00/18434に記載されているもの(アミノ酸位29のグルタミン酸が別のアミノ酸(アスパラギン酸以外)、好ましくはヒスチジンにより置換されているもの)を包含するコレラ毒素およびその突然変異体もアジュバントとして有用である。同様にCT毒素または突然変異体は、公開国際特許出願番号WO02/098368(アミノ酸位16のイソロイシンが別のアミノ酸により、単独またはアミノ酸位68のセリンの別のアミノ酸による置換と組み合わせて置換されている;および/またはアミノ酸位72のバリンが別のアミノ酸により置換されている)に記載されている。他のCT毒素は、公開国際特許出願番号WO02/098369(アミノ酸位25のアルギニンが別のアミノ酸により置換されている;および/またはアミノ酸がアミノ酸位49に挿入されている;および/または2つのアミノ酸がアミノ酸位35および36で挿入されている)に記載されている。
実施例
本発明を以下の実施例により説明する。しかしながら、本明細書のどこにおいてもこれらまたは他の実施例の使用は例示のみであり、本発明の範囲および意味または任意の例示された用語を限定するものではない。同様に、本発明は本明細書に記載されている特定の具体例に限定されない。実際、本発明の多くの修飾および変更は、本明細書を読むと当業者には明らかであり、その精神および範囲を逸脱することなく行うことができる。
本発明を以下の実施例により説明する。しかしながら、本明細書のどこにおいてもこれらまたは他の実施例の使用は例示のみであり、本発明の範囲および意味または任意の例示された用語を限定するものではない。同様に、本発明は本明細書に記載されている特定の具体例に限定されない。実際、本発明の多くの修飾および変更は、本明細書を読むと当業者には明らかであり、その精神および範囲を逸脱することなく行うことができる。
実施例1:PIVタンパク質を発現するVRPのプラスミド構築
本発明は、ヒトPIV−3をモデルパラインフルエンザウイルスとして使用する。ヒトPIV3ウイルスストック(Washington 47885/57株)を既に記載されているようにして調製した。Stokes、A.ら、 Virus Research 25:91−103(1992)参照。ウイルスストックをポリエチレングリコール(PEG)沈降により精製した。Trizol−LS(Life Technologies)によりRNAを抽出し、Titan One Tube RT−PCRシステム(Roche)を用いた逆転写PCRのテンプレートとして使用した。5’Kozakコンセンサス配列を含むN、P、M、C、HN、およびFのオープンリーディングフレーム(ORF)全体にわたるフラグメントを増幅するためにプライマーを使用した。得られたフラグメントを次いで次の制限エンドヌクレアーゼで消化した:FについてClaIおよびHindIII、HNについてEcoRIおよびBamHI、NPについてPstIおよびEcoRI、PおよびCについてAccIおよびXbaI、ならびにMについてHindIIIおよびXbaI。得られたフラグメントをシャトルプラスミドpKSR1中にクローンした。その後、シャトルプラスミドから得られるApaI−ORF−NotIカセットを、VEEV 26サブゲノムプロモーターの下流で、その制御下にあるpVR200中にサブクローンして、レプリコン発現プラスミドpVR(NP)、pVR(P)、pVR(M)、pVR(C)、pVR(F)およびpVR(HN)を生成させた。
本発明は、ヒトPIV−3をモデルパラインフルエンザウイルスとして使用する。ヒトPIV3ウイルスストック(Washington 47885/57株)を既に記載されているようにして調製した。Stokes、A.ら、 Virus Research 25:91−103(1992)参照。ウイルスストックをポリエチレングリコール(PEG)沈降により精製した。Trizol−LS(Life Technologies)によりRNAを抽出し、Titan One Tube RT−PCRシステム(Roche)を用いた逆転写PCRのテンプレートとして使用した。5’Kozakコンセンサス配列を含むN、P、M、C、HN、およびFのオープンリーディングフレーム(ORF)全体にわたるフラグメントを増幅するためにプライマーを使用した。得られたフラグメントを次いで次の制限エンドヌクレアーゼで消化した:FについてClaIおよびHindIII、HNについてEcoRIおよびBamHI、NPについてPstIおよびEcoRI、PおよびCについてAccIおよびXbaI、ならびにMについてHindIIIおよびXbaI。得られたフラグメントをシャトルプラスミドpKSR1中にクローンした。その後、シャトルプラスミドから得られるApaI−ORF−NotIカセットを、VEEV 26サブゲノムプロモーターの下流で、その制御下にあるpVR200中にサブクローンして、レプリコン発現プラスミドpVR(NP)、pVR(P)、pVR(M)、pVR(C)、pVR(F)およびpVR(HN)を生成させた。
2つのPIV遺伝子を含有するレプリコンを生成させるために、第二のApaI−ORF(HN)−NotIカセットをF遺伝子の下流のpVR(F)プラスミド中にサブクローンし、2つの外因性遺伝子を含有するレプリコンプラスミドpVR−F/HNを生成させた。図1参照。加えて、VEEカプシドタンパク質(pV3014delta520−7505delta8495−11229)または表面糖タンパク質gpE1/E2(pV3014delta520−7505delta7565−8386)を発現できる2つのヘルパープラスミドをレプリコンパッケージングに使用した。Pushkoら、Virology 239:389−401(1997)(その開示は全体として本発明の一部として参照される)参照。ダイターミネーターサイクルシーケンシングおよび377ABI DNAシーケンサー(Applied Biosystems、Foster City、CA)を用いて得られるプラスミドを配列決定した。
実施例2:VRP産生
この実施例は、実施例1において構築されたプラスミドからRNAをBHK21細胞中にエレクトロポレーションすることによりPIV3の抗原のそれぞれを発現するVRPがどのように生成したかを説明する。もとのVEEプラスミドpVR100、および2つのヘルパープラスミドpHC(カプシド)およびpHC(gpE1/E2)をAlphaVax(Durham、NC)から入手した。Pushkoら、Virology 239:389−401(1997)(その開示は全体として本発明の一部として参照される)参照。PIV3糖タンパク質遺伝子のRT−PCRフラグメントをpVR200中に個々にまたはpVR100中に(HNとF一緒に)クローンした。生成したプラスミドを次いでインビトロ転写に付して、RNAを生成させた。RNAを次いでBHK21細胞中にエレクトロポレーションして、NP、M、P、C、Fおよび/またはHN遺伝子(VRP−NP、−M,−P,−C、−HN、−F、−F/HN)のいずれかをそれぞれエンコードするVRPを生成させた。
この実施例は、実施例1において構築されたプラスミドからRNAをBHK21細胞中にエレクトロポレーションすることによりPIV3の抗原のそれぞれを発現するVRPがどのように生成したかを説明する。もとのVEEプラスミドpVR100、および2つのヘルパープラスミドpHC(カプシド)およびpHC(gpE1/E2)をAlphaVax(Durham、NC)から入手した。Pushkoら、Virology 239:389−401(1997)(その開示は全体として本発明の一部として参照される)参照。PIV3糖タンパク質遺伝子のRT−PCRフラグメントをpVR200中に個々にまたはpVR100中に(HNとF一緒に)クローンした。生成したプラスミドを次いでインビトロ転写に付して、RNAを生成させた。RNAを次いでBHK21細胞中にエレクトロポレーションして、NP、M、P、C、Fおよび/またはHN遺伝子(VRP−NP、−M,−P,−C、−HN、−F、−F/HN)のいずれかをそれぞれエンコードするVRPを生成させた。
個々のPIV遺伝子を得、これらを適当な発現ベクター中にクローンした後、NotI直線化プラスミドテンプレートおよびmMessage mMACHINE T7 RNAポリメラーゼキット(Ambion、Austin、TX)を用いてキャップされたRNA転写物を次いでインビトロで調製した。製造業者の指示に従って反応を行った。いずれかのプラスミドpVR(NP)、pVR(M)、pVR(P)、pVR(C)、pVR(HN)、pVR(F)、pVR(HN)+pVR(F)、またはpVR−F/HNから得られる50μgの各RNAを、ヘルパープラスミドから得られる50μgのRNAと共にBHK21細胞中にエレクトロポレーションすることによりレプリコン粒子産生細胞を生成させた。Pushkoら、Virology 239:389−401(1997)(その開示は全体として本発明の一部として参照される)参照。処理されたBHK細胞を次いでT−175フラスコ中、37℃、5%CO2でインキュベートした。培地は、ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)と高グルコース、10%ウシ胎仔血清および1%ピルビン酸ナトリウムから構成されていた。次に、培養上清をエレクトロポレーション後48時間に収穫し、3200rpmで遠心分離することにより清澄化させた。VRPをPBS中に再懸濁させ、BHK21細胞を感染させ、適当なPVI3特異性抗体を用いて免疫染色することにより力価を決定した。
実施例3:VRPおよびPIVのウイルス価
PIVタンパク質および糖タンパク質を発現するVEEレプリコン(VRPs)を免疫組織化学法により滴定した。VRPをBHK−21系中で増殖させた。この場合、BHK細胞は、擬似表現型特性を共有しない他のBHKクローン集団から区別するために、CCL−10クローンから誘導された。本明細書において定義されるように、細胞はBHK21または単にBHK細胞と称する。BHK21単層を連続希釈されたVEEレプリコン:VRP−NP;VRP−P;VRP−M;VRP−C;VRP−HN;VRP−F; VRP−F/HNおよびVRP−GFPで感染させ、37℃で16〜20時間インキュベートした。単層を次いで1:1アセトン/メタノールで5分間固定し、細菌から発現されたウサギ抗VEE NSP1タンパク質、ポリクローナルAb r835またはウマ抗PIV3血清のいずれかで染色した。cyTM3接合ヤギ抗ウサギ抗体(Jackson ImmunoResearch、West Grove、PA)またはホースラディッシュパーオキシダーゼ(HOURP)接合抗ウマAb(Kirkegaard & Perry、Maryland、MD)+アミノエチルカルバゾール(AEC)パーオキシダーゼ基質キット(Enzo Life Sciences、Farmingdale、NY)の何れかによりプラークを次いで検出した。プラークの数を顕微鏡下で計測し、VEEレプリコンについては1mlあたりの感染単位(iu/ml)として、またはVRP−F/HNレプリコン感染から生じた二次感染粒子については1mlあたりの合胞体形成単位(sfu/ml)として記録した。
PIVタンパク質および糖タンパク質を発現するVEEレプリコン(VRPs)を免疫組織化学法により滴定した。VRPをBHK−21系中で増殖させた。この場合、BHK細胞は、擬似表現型特性を共有しない他のBHKクローン集団から区別するために、CCL−10クローンから誘導された。本明細書において定義されるように、細胞はBHK21または単にBHK細胞と称する。BHK21単層を連続希釈されたVEEレプリコン:VRP−NP;VRP−P;VRP−M;VRP−C;VRP−HN;VRP−F; VRP−F/HNおよびVRP−GFPで感染させ、37℃で16〜20時間インキュベートした。単層を次いで1:1アセトン/メタノールで5分間固定し、細菌から発現されたウサギ抗VEE NSP1タンパク質、ポリクローナルAb r835またはウマ抗PIV3血清のいずれかで染色した。cyTM3接合ヤギ抗ウサギ抗体(Jackson ImmunoResearch、West Grove、PA)またはホースラディッシュパーオキシダーゼ(HOURP)接合抗ウマAb(Kirkegaard & Perry、Maryland、MD)+アミノエチルカルバゾール(AEC)パーオキシダーゼ基質キット(Enzo Life Sciences、Farmingdale、NY)の何れかによりプラークを次いで検出した。プラークの数を顕微鏡下で計測し、VEEレプリコンについては1mlあたりの感染単位(iu/ml)として、またはVRP−F/HNレプリコン感染から生じた二次感染粒子については1mlあたりの合胞体形成単位(sfu/ml)として記録した。
PIV3 Wash47885/57ウイルスストックまたは組織ホモジネートを、記載されているような修飾Hemadsorption検定(HAD)プロトコルにより測定した。Durbinら、Virology 235:323−332 (1997);Durbinら、Vaccine 16:1234−1330 (1998)参照。簡単に説明すると、10倍連続希釈されたサンプルをLLC−MK2単層の96穴プレート中、37℃で滴定した。培養中、上清を6〜7日後に集め、0.5%モルモット赤血球を用いたHA検定に付した。サンプル1mlあたりの平均Log10TCI50を計算した。
実施例4:動物免疫化および攻撃
非免疫ハムスターの特定のPIVタンパク質を発現するVRPレプリコンでの免疫化は、その後のPIV感染からの防御免疫を惹起する。PIV3に対して血清反応陰性の5〜8週令のゴールデンハムスターをVEEレプリコン:VRP−NP;VRP−P;VRP−M;VRP−C(PIV−3タンパク質NP、P、M、PIV3のCまたはGFPを対照として発現)で、鼻内(i.n.)または筋肉内(i.m.)のいずれかで免疫化した。用量を表1に示す。動物を初期免疫化の3週間および5週間後に同じ用量(表1)で追加免疫した。7週間後に、ハムスターを1×106LogTCID50のPIV3(Wash47885/57ウイルス株)で攻撃した。攻撃後4日に、鼻介骨および肺組織を集め、均質化した。Durbinら、Virology 235:323−332 (1997);Durbinら、Vaccine 16:1234−1330 (1998)参照。これらのホモジネートにおけるPIV3複製を前記実施例3において記載されているようにしてHADアッセイにより分析した。全てのゴールデンハムスターおよびBALB/cマウスはチャールズ・リバー・ラボラトリー(Wilmington、MA)から購入し、現行のNIHの“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals,”および連邦政府および州法およびWyeth Research’s BioResourcesにより維持されている現在行われている手順に従って飼育した。
本発明の一具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子は、BHK培養細胞の単層を感染させるために使用される場合に細胞変性効果を誘発する。もう一つ別の具体例において、レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合に、レプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発する。本発明のもう一つ別の具体例において、細胞変性効果は、合胞体形成、単層破壊およびアポトーシスからなる群から選択される。
非免疫ハムスターの特定のPIVタンパク質を発現するVRPレプリコンでの免疫化は、その後のPIV感染からの防御免疫を惹起する。PIV3に対して血清反応陰性の5〜8週令のゴールデンハムスターをVEEレプリコン:VRP−NP;VRP−P;VRP−M;VRP−C(PIV−3タンパク質NP、P、M、PIV3のCまたはGFPを対照として発現)で、鼻内(i.n.)または筋肉内(i.m.)のいずれかで免疫化した。用量を表1に示す。動物を初期免疫化の3週間および5週間後に同じ用量(表1)で追加免疫した。7週間後に、ハムスターを1×106LogTCID50のPIV3(Wash47885/57ウイルス株)で攻撃した。攻撃後4日に、鼻介骨および肺組織を集め、均質化した。Durbinら、Virology 235:323−332 (1997);Durbinら、Vaccine 16:1234−1330 (1998)参照。これらのホモジネートにおけるPIV3複製を前記実施例3において記載されているようにしてHADアッセイにより分析した。全てのゴールデンハムスターおよびBALB/cマウスはチャールズ・リバー・ラボラトリー(Wilmington、MA)から購入し、現行のNIHの“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals,”および連邦政府および州法およびWyeth Research’s BioResourcesにより維持されている現在行われている手順に従って飼育した。
本発明の一具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子は、BHK培養細胞の単層を感染させるために使用される場合に細胞変性効果を誘発する。もう一つ別の具体例において、レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合に、レプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発する。本発明のもう一つ別の具体例において、細胞変性効果は、合胞体形成、単層破壊およびアポトーシスからなる群から選択される。
ハムスターはPIV3複製およびVEE感染を支持する最小の動物モデルであるので、実験モデルとしてハムスターを使用して、PIV3の内部タンパク質が動物においてPIV3感染に対して防御を提供する能力を調査した。Durbinら、Vaccine 16:1234−1330 (1999)参照。表1は、免疫化および攻撃後のLRTおよびURTにおいて得られるウイルス価を示す。i.n.またはi.m.により投与された1×106〜1×107i.uの範囲の用量でNP、P、M、またはCのいずれかを発現した全てのVRPは、VRP−GFPおよびPBS群と比較して明らかな防御を示さなかった(表1)。生弱毒化PIV3ウイルスであるcp45のみが、ハムスターをPIV3感染から防御できた。従って、内部タンパク質NP、P、M、およびCはPIV3に対する免疫原性組成物中に封入するための候補としての効率をほとんどまたは全く有さないと結論づけられた。
VRP発現HNおよび/またはFの防御を提供する能力を次に調べた。ハムスターを同じスケジュールおよび表2に示す用量で免疫化した。表2に示される結果は、VRP−F/HN免疫化動物のみがURTにおいてほとんど完全に防御されたことを示す。VRP−HN単独で免疫化されたハムスターは、URTにおいて約100倍ウイルス価が減少した。ハムスターをVRP−F/HNではなくVRP−HN+VRP−Fでi.n.免疫化すると、URTにおいて10倍しかウイルス複製が減少しなかった。さらに、VRP−F免疫化は、URTにおいて血清中和価および防御を惹起せず、LRTにおいてウイルス複製が10倍だけ減少した(表2、実験1)。従って、i.n.免疫化により、VRP−F/HNを含む免疫原性組成物は、有意なレベルの中和価、ならびにLRTにおいてPIV3感染に対する完全な防御を誘発し、URTにおいてPIV3感染の重篤度を軽減した。
一般に、筋肉内免疫化は、PIV3に対する防御免疫の惹起において鼻内免疫化よりも有効でない。例えば、筋肉内(i.m.)によりVRP−HNおよびVRP−HN+VRP−Fで免疫化された動物は、LRTにおいてその後の攻撃感染から完全な防御をもたらしたこれらのレプリコンでの鼻内免疫化と比べて、約3log10LRTにおいてウイルス価が減少した(表2、実験1)。
ここでも、最も有効な免疫原性は、VRP−F/HNで得られ、これはi.m.およびi.n.免疫化のどちらについてもLRTにおけるその後の攻撃感染から完全な防御をもたらした(表2、実験2)。完全な防御は、VRP−F/HN以外のVRPを用いたi.m.免疫化により達成されなかった(表2)。
データから、i.m.免疫化によりURTにおいてウイルス価の減少および感染の重篤度の軽減という形態での一連の防御が可能であることが示された。特に、VRP−HN、VRP−F、VRP−HN+VRP−Fを用いた筋肉内免疫化の結果、PBS対照と比較して約10倍〜約100倍の範囲でウイルス価が減少した(表2、実験1および2)。VRP−F/HNは、i.n.免疫化ほど有効でないが、i.m.により投与された場合にLRT感染に対して防御するための最良の候補であった。
ここでも、最も有効な免疫原性は、VRP−F/HNで得られ、これはi.m.およびi.n.免疫化のどちらについてもLRTにおけるその後の攻撃感染から完全な防御をもたらした(表2、実験2)。完全な防御は、VRP−F/HN以外のVRPを用いたi.m.免疫化により達成されなかった(表2)。
データから、i.m.免疫化によりURTにおいてウイルス価の減少および感染の重篤度の軽減という形態での一連の防御が可能であることが示された。特に、VRP−HN、VRP−F、VRP−HN+VRP−Fを用いた筋肉内免疫化の結果、PBS対照と比較して約10倍〜約100倍の範囲でウイルス価が減少した(表2、実験1および2)。VRP−F/HNは、i.n.免疫化ほど有効でないが、i.m.により投与された場合にLRT感染に対して防御するための最良の候補であった。
実施例4’:PIVに対する体液性応答
A.PIV3特異性B細胞ELISPOT:
マウスのリンパ節におけるPIV3特異性Ig分泌細胞をB細胞ELISPOTアッセイにより測定した。簡単に説明すると、免疫化マウスのリンパ節から得られる単細胞懸濁液を、37℃、5%CO2中、一夜、100ngの製剤で分裂させたPIV3ウイルスでコートされた96穴イムロンIIプレート上(Millipore, Bedford, Mass.)でインキュベートした。細胞を次いで洗浄し、プレートに結合したPIV3−特異性全IgまたはIgAを、それぞれアルカリホスファターゼ接合体ヤギ抗マウスIgM+IgG+IgAの混合物またはIgA単独により検出した。スポットを次に、アルカリホスファターゼ基質キット(Bio−Rad)を用いて展開させ、Olympus解剖顕微鏡(Leeds Precision Instruments, Inc., Minneapolis, Minn.)下で計測することにより定量化した。結果を1x106細胞あたりのスポット形成細胞(SFC)の数として記録する。
A.PIV3特異性B細胞ELISPOT:
マウスのリンパ節におけるPIV3特異性Ig分泌細胞をB細胞ELISPOTアッセイにより測定した。簡単に説明すると、免疫化マウスのリンパ節から得られる単細胞懸濁液を、37℃、5%CO2中、一夜、100ngの製剤で分裂させたPIV3ウイルスでコートされた96穴イムロンIIプレート上(Millipore, Bedford, Mass.)でインキュベートした。細胞を次いで洗浄し、プレートに結合したPIV3−特異性全IgまたはIgAを、それぞれアルカリホスファターゼ接合体ヤギ抗マウスIgM+IgG+IgAの混合物またはIgA単独により検出した。スポットを次に、アルカリホスファターゼ基質キット(Bio−Rad)を用いて展開させ、Olympus解剖顕微鏡(Leeds Precision Instruments, Inc., Minneapolis, Minn.)下で計測することにより定量化した。結果を1x106細胞あたりのスポット形成細胞(SFC)の数として記録する。
B.ウイルス中和検定
ハムスター血清がPIV3ウイルス粒子を中和する能力を、ヘマグルチン化阻害検定(HI)により測定した。簡単に言うと、熱不活化血清を、レポーター破壊酵素(RDE)(Denka Seiken Co. Ltd., Tokyo, Japan)で18〜20時間37℃で処理して、0.4%モルモットRBC(gpRBC)で4℃で1時間インキュベートすることにより非特異性アグルチニンをさらに除去する前に、非特異性阻害剤を除去した。0.5%gpRBCを凝集させるために、PIV3ウイルスの4HA単位を阻害するために、連続希釈処理された血清の終点を次に決定した。
VRP−F/HNの示された保護有効性が、その保護効果の調査につながった。呼吸器病原体からの防御は、一般に粘膜免疫と関連する。したがって、肺または鼻のいずれかを排液する縦隔リンパ節(MLN)および頚部リンパ節(CLN)におけるIgA産生細胞の誘発を評価した。この場合、ハムスターの適当な検出試薬が入手できなかったので、マウスモデルを使用した。BALB/cマウスを、ハムスターについてと同じ免疫化スケジュールにしたがってVRP−HNまたはVRP−F/HNで免疫化した(i.n.)。個々のCLNを集め、MLNをプールした。単細胞懸濁液をLNから調製し、全Ig分泌細胞またはIgA分泌細胞をB細胞ELISPOT技術により分析した。
ハムスター血清がPIV3ウイルス粒子を中和する能力を、ヘマグルチン化阻害検定(HI)により測定した。簡単に言うと、熱不活化血清を、レポーター破壊酵素(RDE)(Denka Seiken Co. Ltd., Tokyo, Japan)で18〜20時間37℃で処理して、0.4%モルモットRBC(gpRBC)で4℃で1時間インキュベートすることにより非特異性アグルチニンをさらに除去する前に、非特異性阻害剤を除去した。0.5%gpRBCを凝集させるために、PIV3ウイルスの4HA単位を阻害するために、連続希釈処理された血清の終点を次に決定した。
VRP−F/HNの示された保護有効性が、その保護効果の調査につながった。呼吸器病原体からの防御は、一般に粘膜免疫と関連する。したがって、肺または鼻のいずれかを排液する縦隔リンパ節(MLN)および頚部リンパ節(CLN)におけるIgA産生細胞の誘発を評価した。この場合、ハムスターの適当な検出試薬が入手できなかったので、マウスモデルを使用した。BALB/cマウスを、ハムスターについてと同じ免疫化スケジュールにしたがってVRP−HNまたはVRP−F/HNで免疫化した(i.n.)。個々のCLNを集め、MLNをプールした。単細胞懸濁液をLNから調製し、全Ig分泌細胞またはIgA分泌細胞をB細胞ELISPOT技術により分析した。
VRP−F/HNでの免疫化は、他のVRPでの免疫化と比較して高レベルの抗原特異性IgAを誘発した。例えば、VRP−HNでの免疫化は、CLNにおいてPIV3特異性Ig分泌細胞1x106個あたり約800SFCを誘発した。これらのうち、わずか約10%のIg分泌細胞がPIV−3特異性IgA分泌細胞であった(1x106細胞あたり100SFC未満)。対照的に、VRP−F/HN免疫化は、CLNにおいて1x106個のPIV3特異性Ig−SFCあたり約400SFCを誘発した。重要なことに、抗原特異性IgA SFCの数は、VRP−HN(1x106細胞あたり約250SFC)よりもパーセンテージ基準でずっと多かった。この場合、VRP−F/HN免疫化群におけるIg分泌細胞の60%より多くがIgAであった。従って、VRP−F/HNはURTにおける抗原特異性IgA産生を優先的に誘発し、これはより良好な防御効率と相関した(表2)。
MLNにおいて、PIV−3特異性全Ig分泌細胞またはIgA分泌細胞の量は、VRP−HNおよびVRP−F/HN免疫化の両方について類似し、両免疫化がハムスターのLRTにおけるウイルス複製を完全に除去したという事実と一致した(表2)。
ウイルス攻撃後の防御免疫における中和抗体の役割を調べた。血清サンプルをPIV3攻撃の2日前に集め、PIV中和価を測定した。表2は、中和価は、PBS対照群において検出されず、LRTおよびURTにおけるウイルス複製はそれぞれ5.8±0.4および5.2±0.2のレベルまでであったことを示す。全実験群のうち、VRP−HN、VRP−F/HN、またはVRP−HNおよびVRP−Fの組み合わせ(VRP−HN+VRP−F)の免疫化により、著しいレベルのHI価が誘発され、それぞれ6.3、7.1、および7.5のレベルに達し、これはcp45免疫化群(データは省略)に匹敵し、LRTにおいて完全な防御を示した。
ウイルス攻撃後の防御免疫における中和抗体の役割を調べた。血清サンプルをPIV3攻撃の2日前に集め、PIV中和価を測定した。表2は、中和価は、PBS対照群において検出されず、LRTおよびURTにおけるウイルス複製はそれぞれ5.8±0.4および5.2±0.2のレベルまでであったことを示す。全実験群のうち、VRP−HN、VRP−F/HN、またはVRP−HNおよびVRP−Fの組み合わせ(VRP−HN+VRP−F)の免疫化により、著しいレベルのHI価が誘発され、それぞれ6.3、7.1、および7.5のレベルに達し、これはcp45免疫化群(データは省略)に匹敵し、LRTにおいて完全な防御を示した。
実施例5:PIV防御の最小投与量
有効な防御のために必要なVRP−F/HN免疫化の最小投与量を評価した。2x104iuの用量でのVRP−F/HNは、i.n.投与された場合に、感染からLRTを防御し、ウイルス複製を100倍低下させることによりURT感染に対して部分的防御をもたらした(表3、実施例1)。さらに、3回目の注射は不必要に思われ、LRT感染を予防するためには、1x104i.u.の用量での2回の注射で十分であった。1x104iuのVRP−F/HNを1回投与するだけでは十分でなかった(表3、実験2)。従って、ハムスターモデルにおいて、VRP−F/HNは、下および上気道におけるPIV3複製の確立を予防するための最も有効な方法であった。LRT感染に対抗するために有効なVRP−F/HNの投与量は、1x104iuで2回免疫化程度の低さであってよい。
データから、LRTにおけるウイルス複製を検出不能なレベルまで減少させ、URTにおいてウイルス複製のレベルを約100倍減少させるために、1×104iuのVRP−F/HNを2回投与することによる免疫化で十分であることが示された。これは、PIVおよびRSV随伴肺炎などのある種の合併症を予防できるサブユニット組成物を調製するための一方法を示唆するので、意味のある功績である。データは、HNおよびFがPIV3サブユニットワクチンデザインに必要な2つの重要な抗原であることを示す。
有効な防御のために必要なVRP−F/HN免疫化の最小投与量を評価した。2x104iuの用量でのVRP−F/HNは、i.n.投与された場合に、感染からLRTを防御し、ウイルス複製を100倍低下させることによりURT感染に対して部分的防御をもたらした(表3、実施例1)。さらに、3回目の注射は不必要に思われ、LRT感染を予防するためには、1x104i.u.の用量での2回の注射で十分であった。1x104iuのVRP−F/HNを1回投与するだけでは十分でなかった(表3、実験2)。従って、ハムスターモデルにおいて、VRP−F/HNは、下および上気道におけるPIV3複製の確立を予防するための最も有効な方法であった。LRT感染に対抗するために有効なVRP−F/HNの投与量は、1x104iuで2回免疫化程度の低さであってよい。
データから、LRTにおけるウイルス複製を検出不能なレベルまで減少させ、URTにおいてウイルス複製のレベルを約100倍減少させるために、1×104iuのVRP−F/HNを2回投与することによる免疫化で十分であることが示された。これは、PIVおよびRSV随伴肺炎などのある種の合併症を予防できるサブユニット組成物を調製するための一方法を示唆するので、意味のある功績である。データは、HNおよびFがPIV3サブユニットワクチンデザインに必要な2つの重要な抗原であることを示す。
実施例6:VRP−F/HN感染から起こる細胞変性効果
A.アポトーシス
VRP−HN、VRP−F、またはVRP−HN+VRP−Fと比較すると、免疫原性組成物としてのVRP−F/HNの有効性は、作用機序の調査につながった。VRP−F/HN感染が培養における他のVRP感染と比較して独自のCPEに至ることが観察された。これらのVRPが培地中で増殖された場合のアポトーシスに至る可能性を調査した。BHK21単層をVRP−F/HNまたはVRP−HNで、MOI=0.5で感染させるか、または感染させなかった(対照として)。表4参照。単層形態を位相差顕微鏡下、100倍の倍率で、感染後24、48、および72時間に観察した。表4参照。CPEデータを、BHK単層が破壊されて軽度のCPEを示すか(+)、または単層細胞がひどく破壊され、膜ブレブが形成されているかどうか(++)または単層が完全に除去されて、ブレブおよびデブリスが上清中に残っているかどうか(+++)により特徴づけた。表4参照。
A.アポトーシス
VRP−HN、VRP−F、またはVRP−HN+VRP−Fと比較すると、免疫原性組成物としてのVRP−F/HNの有効性は、作用機序の調査につながった。VRP−F/HN感染が培養における他のVRP感染と比較して独自のCPEに至ることが観察された。これらのVRPが培地中で増殖された場合のアポトーシスに至る可能性を調査した。BHK21単層をVRP−F/HNまたはVRP−HNで、MOI=0.5で感染させるか、または感染させなかった(対照として)。表4参照。単層形態を位相差顕微鏡下、100倍の倍率で、感染後24、48、および72時間に観察した。表4参照。CPEデータを、BHK単層が破壊されて軽度のCPEを示すか(+)、または単層細胞がひどく破壊され、膜ブレブが形成されているかどうか(++)または単層が完全に除去されて、ブレブおよびデブリスが上清中に残っているかどうか(+++)により特徴づけた。表4参照。
表4に示されるように、BHK細胞がVRP−F/HNで感染した場合、24時間後に、BHK単層はVRP−HNまたは他のVRP(データは省略)感染と比較して、破壊された。48時間後、VRP−F/HNでの感染は、単層破壊を誘発し、明確な合胞体および膜ブレブが形成された。72時間までに、単層は完全に除去され、ブレブおよびデブリスが上清中に残され、一方、VRP−HNで感染した群は、無傷の単層と全体を通してのアポトーシス事象による円形化を示した。表4参照。
B.プラーク形態
従来の研究は、Fタンパク質の融合特性は、HNタンパク質の存在を必要とし(Ebata, S. N.ら、Virology 183:437−441(1991))、一方、それ自体はHNもFも合胞体形成を誘発できなかったことを示していた。VRP−F/HN感染による独自のCPEが合胞体形成による可能性を次に調べた。
細胞のBHK21単層を異なるVRP、例えばVRP−HN、VRP−F、VRP−HN+VRP−FまたはVRP−F/HNで15〜18時間感染させ、単層を次いで固定し、ウマ抗PIV3ポリクローナルAb、次いで基質としてホースラディッシュパーオキシダーゼ接合抗ウマAb+アミノエチルカルバゾールパーオキシダーゼで;あるいはウサギ抗VEE NSP1ポリクローナルAb r835+cyTM3接合ヤギ抗ウサギ抗体で染色した。明視野または蛍光顕微鏡下、100倍の倍率で写真を撮影した。
従来の研究は、Fタンパク質の融合特性は、HNタンパク質の存在を必要とし(Ebata, S. N.ら、Virology 183:437−441(1991))、一方、それ自体はHNもFも合胞体形成を誘発できなかったことを示していた。VRP−F/HN感染による独自のCPEが合胞体形成による可能性を次に調べた。
細胞のBHK21単層を異なるVRP、例えばVRP−HN、VRP−F、VRP−HN+VRP−FまたはVRP−F/HNで15〜18時間感染させ、単層を次いで固定し、ウマ抗PIV3ポリクローナルAb、次いで基質としてホースラディッシュパーオキシダーゼ接合抗ウマAb+アミノエチルカルバゾールパーオキシダーゼで;あるいはウサギ抗VEE NSP1ポリクローナルAb r835+cyTM3接合ヤギ抗ウサギ抗体で染色した。明視野または蛍光顕微鏡下、100倍の倍率で写真を撮影した。
予想されるように、VRP−HNまたはVRP−Fはそれ自体、個々のVRP感染により形成される明らかなHN−またはF−発現プラークを示した。しかしながら、VRP−F/HN感染群における「プラーク」は、非常に大きなサイズを有し、容易に肉眼で見ることができた。多核化細胞がこれらの「プラーク」内で明らかに見られるので、これらの大きな「プラーク」は、実際に合胞体の形成を表した[合胞体形成に基づく滴定は、単一のレプリコンおよび複数の細胞に基づくので、感染単位(iu)の代わりに合胞体形成単位(sfu)を要求した]。細胞がVRP−HNおよびVRP−Fに同時に感染した場合、合胞体形態を示す「プラーク」は少なかった(1%未満)。しかしながら、プラークは、VRP−HNまたはVRP−F感染単独により形成されるものと類似していた。プラークが抗VEE NSP1Abで染色された場合に同じプラーク特性が見られた。合胞体形成も、VRP−F/HNからのHNおよびFタンパク質の同時発現をさらに裏付けた。VRP−F/HN感染は実際に2つの異なるCPEプロセス、アポトーシスおよび合胞体形成に至ると結論づけられた。
実施例7:HNおよびFの同時発現は感染性粒子を産生した
細胞の単層(「単層」)は非常に低い感染多重度(MOI)(<0.001、データは省略)により破壊されるので、VRP−F/HN誘発CPEは非常に「伝染性」であることに注目された。従って、第二のレプリコンまたは感染性粒子のある形態が独自のCPEから生成したと推測された。第二のレプリコンまたは感染性粒子は自己増殖性であり、HNおよびF糖タンパク質に結合した膜を使用することにより他の細胞を感染させると融合プロセスが誘発された。
非レプリコン感染性薬剤が産生されたかどうかを評価するために、BHK単層がVRP−F/HNまたは他のVRPで0.5のMOIで30分間感染させる実験をデザインした。単層を次いで3回洗浄して残存するVRPを除去し、新鮮な培地を補充し、48時間培養した。次に単層を、HNおよびF発現について評価するためにウマ抗PIV血清で染色するか、またはレプリコンNSP1タンパク質の存在を確認するためにVEEのウサギ抗NSP1で染色した。48時間の最後に、細胞からの上清のアリコートを単層から除去し、新鮮なBHK単層を30分間「感染」させるために使用した。30分後、細胞を洗浄し、新鮮な培地を補充し、48時間インキュベートした。単層を次いでCPEについて評価し、HNおよびF発現についてはウマ抗PIV3血清で、あるいはレプリコンタンパク質の存在を確認するためにはVEEのウサギ抗NSP1で染色した。最初の転移(第一転移)、もう一つの転移(第二転移)、および転移(第三転移)を通して工程を行った。全ての細胞を、HNおよびF発現については抗PIV3またはVEE NSP1発現については抗VEE NSP1のいずれかで染色した。抗PIV抗体については明視野下で、あるいは抗VEE NSP1抗体については蛍光顕微鏡下100倍の倍率で写真を撮影した。免疫染色による発現の規模を、(−)から(+++++)により表す。結果を表5に示す。
細胞の単層(「単層」)は非常に低い感染多重度(MOI)(<0.001、データは省略)により破壊されるので、VRP−F/HN誘発CPEは非常に「伝染性」であることに注目された。従って、第二のレプリコンまたは感染性粒子のある形態が独自のCPEから生成したと推測された。第二のレプリコンまたは感染性粒子は自己増殖性であり、HNおよびF糖タンパク質に結合した膜を使用することにより他の細胞を感染させると融合プロセスが誘発された。
非レプリコン感染性薬剤が産生されたかどうかを評価するために、BHK単層がVRP−F/HNまたは他のVRPで0.5のMOIで30分間感染させる実験をデザインした。単層を次いで3回洗浄して残存するVRPを除去し、新鮮な培地を補充し、48時間培養した。次に単層を、HNおよびF発現について評価するためにウマ抗PIV血清で染色するか、またはレプリコンNSP1タンパク質の存在を確認するためにVEEのウサギ抗NSP1で染色した。48時間の最後に、細胞からの上清のアリコートを単層から除去し、新鮮なBHK単層を30分間「感染」させるために使用した。30分後、細胞を洗浄し、新鮮な培地を補充し、48時間インキュベートした。単層を次いでCPEについて評価し、HNおよびF発現についてはウマ抗PIV3血清で、あるいはレプリコンタンパク質の存在を確認するためにはVEEのウサギ抗NSP1で染色した。最初の転移(第一転移)、もう一つの転移(第二転移)、および転移(第三転移)を通して工程を行った。全ての細胞を、HNおよびF発現については抗PIV3またはVEE NSP1発現については抗VEE NSP1のいずれかで染色した。抗PIV抗体については明視野下で、あるいは抗VEE NSP1抗体については蛍光顕微鏡下100倍の倍率で写真を撮影した。免疫染色による発現の規模を、(−)から(+++++)により表す。結果を表5に示す。
VRPレプリコンでの感染の第一ラウンドにおいて、プラークは次のレプリコンで感染した細胞系において48時間後に見ることができた:VRP−HN、VRP−F、およびVRP−HN+VRP−F。表5参照。感染のこのラウンドにおいて、ヘルパープラスミドから誘導されるVEE糖タンパク質は細胞への侵入を促進した。
初期レプリコン感染におけるCPEを考慮すると、VRP−HN+VRP−F感染細胞は、HNおよびFの日和見的同時発現のために時々合胞体形成を示した。対照的に、VRP−F/HN感染は、48時間後に細胞単層および明らかな合胞体の破壊を誘発した。表5参照。これらの全ては、VEE NSP1タンパク質を発現し、活性レプリコン活性を示した。表5参照。
感染の第二ラウンドにおいて、前記上清が新規単層に移された場合、VRP−HNおよびVRP−F処理群において新しい感染活性はなかった。表5参照。同様に、PIV3HNおよびHのさらなる発現もなく、VEE NSP1産生もなかった。表5参照。これらの群において、VEEヘルパータンパク質の入力がないことは、本発明以前に予想されるように、感染プロセスに致命的であることがわかった。
初期レプリコン感染におけるCPEを考慮すると、VRP−HN+VRP−F感染細胞は、HNおよびFの日和見的同時発現のために時々合胞体形成を示した。対照的に、VRP−F/HN感染は、48時間後に細胞単層および明らかな合胞体の破壊を誘発した。表5参照。これらの全ては、VEE NSP1タンパク質を発現し、活性レプリコン活性を示した。表5参照。
感染の第二ラウンドにおいて、前記上清が新規単層に移された場合、VRP−HNおよびVRP−F処理群において新しい感染活性はなかった。表5参照。同様に、PIV3HNおよびHのさらなる発現もなく、VEE NSP1産生もなかった。表5参照。これらの群において、VEEヘルパータンパク質の入力がないことは、本発明以前に予想されるように、感染プロセスに致命的であることがわかった。
しかしながら驚くべきことに、感染性粒子はヘルパープラスミド上のVEEタンパク質/HNの不在下で、VRP−F/HN処理細胞の上清において産生された。例えば、本発明者らは多量のPIV3糖タンパク質HNおよびHがVRP−F/HN処理細胞からの上清を未感染細胞単層に移した後に生じることを見いだした。表5参照。プロセスにおけるこの段階で、感染プロセスは細胞誘導ブレブの表面上のPIV HNおよびFタンパク質の表面発現融合活性により行われると考えられる。
加えて、NSP1タンパク質は、転移後にVRP−F/HN処理群において産生されることが確認され、このことはVRP−F/HN感染細胞上清における強力な感染活性を示す。表5参照。VEE表面糖タンパク質発現は、抗VEEポリクローナル血清での染色を用いて検出できず、従って潜在的な組み換え事象によるVEEウイルスが生成されないことを示す。従って、感染性物質は、もとのVEEレプリコンRNAからなり、これはNSP1、NSP2、NSP3、NSP4、およびPIV3HNおよびF遺伝子を含むVEEレプリカーゼを有する。加えて、本発明者らはこれらの同じタンパク質が発現されることを示す。
加えて、NSP1タンパク質は、転移後にVRP−F/HN処理群において産生されることが確認され、このことはVRP−F/HN感染細胞上清における強力な感染活性を示す。表5参照。VEE表面糖タンパク質発現は、抗VEEポリクローナル血清での染色を用いて検出できず、従って潜在的な組み換え事象によるVEEウイルスが生成されないことを示す。従って、感染性物質は、もとのVEEレプリコンRNAからなり、これはNSP1、NSP2、NSP3、NSP4、およびPIV3HNおよびF遺伝子を含むVEEレプリカーゼを有する。加えて、本発明者らはこれらの同じタンパク質が発現されることを示す。
次の転移における感染活性は、PIV3HNおよびFの同時発現により促進されるようである。PIV3糖タンパク質HNおよびF抗原染色はごくわずかの量であり、VRP−HN+VRP−F群において検出可能なNSP1発現はなかった。表5参照。この理由は、合胞体誘発活性を有するあるレプリコンは初期VRP感染に持ち越すからである。表5参照。この裏付けとして、この残存活性は第二転移に持ち越すことができず、さらなるPIV3抗原は検出されないことが見いだされた。表5参照。
VRP−HN+VRP−F処理細胞で見られる感染活性がないことと対照的に、VRP−F/HN感染の第一転移を受ける細胞からの上清は、未感染細胞に適用された場合に、合胞体形成、単層破壊、PIV3 HN&F抗原染色およびVEE NSP1抗原染色を含む「感染性」現象の別のラウンドを誘発する。ここでも、これらの感染活性の結果としての検出可能なVEE表面糖タンパク質発現はなく、さらにVEEウイルス汚染を除外する。
VRP−HN+VRP−F処理細胞で見られる感染活性がないことと対照的に、VRP−F/HN感染の第一転移を受ける細胞からの上清は、未感染細胞に適用された場合に、合胞体形成、単層破壊、PIV3 HN&F抗原染色およびVEE NSP1抗原染色を含む「感染性」現象の別のラウンドを誘発する。ここでも、これらの感染活性の結果としての検出可能なVEE表面糖タンパク質発現はなく、さらにVEEウイルス汚染を除外する。
「感染性」現象のさらなるラウンドは、VRP−F/HN感染細胞からの上清が追加のBHK単層に移された場合に生じた。表5参照。BHK単層も抗VEEポリクローナル血清で染色し、VEE表面糖タンパク質発現を示さず、VEEウイルスが生成しなかったことを示す。
前記観察は、VRP−F/HN感染細胞から生じる「感染性」タンパク質により促進される融合活性が存在し、これらの活性は連続して移されるという仮説をさらに裏付けた。
前記観察は、VRP−F/HN感染細胞から生じる「感染性」タンパク質により促進される融合活性が存在し、これらの活性は連続して移されるという仮説をさらに裏付けた。
実施例8:感染性粒子はレプリコンでなく、ブレブであった
その性質を確認するために電子顕微鏡を用いて感染性粒子の形態的性質を調べた。もっと良く調べることにより、感染性粒子がVRP−F/HNレプリコンであることが除外され、その代わりに感染性物質が感染した細胞から誘導されるブレブと確認され、これはPIV3HNおよびFを同時発現する。
まずPBS中1:20に希釈することにより、電子顕微鏡用にVRP−F/HNブレブを調製した。SlotおよびGeuzeにより1984年に開発された手順を変更したものを用いてホールブレブ、陰性染色、イムノゴールドラベリングを行った。Immunolabeling for Electron Microscopy, by Slot and Geuze, Pollack and Varndell eds.Elsevier Science Publishers, BV, Amsterdam.参照。ベシクルの液滴をパラフィルム上に置き、formvar−炭素コーティングされた金格子を各液滴上に下向きに置いた。過剰の流体を除去し、PBSおよび1%BSA(5ml)と、後に1%冷水魚肉ゼラチンを含有するPBS(10ml)を用いて2段階でブロッキングを行った。ブレブを有する格子を、湿潤チャンバー中でPBS BSA中(1h)1:50に希釈された抗F mAbクローンB−102または抗HN mAbクローン68/2上で反転させた。格子をPBS BSA中5×1mlでリンスした。6nmコロイド状金ビーズ(Jackson ImmunoResearch Labs, W. Grove, PA)と結合させたヤギ抗マウスIgG+Mとともにインキュベーションすることにより抗原を検出した。PBS中でリンスした(4×1ml)。細胞を有する格子を1%PBS中グルタルアルデヒド(3ml)で安定化させた。各サンプルを次いで希釈された水中でリンスした(5×1ml)。最後に、ベシクルを有する格子を1%PTA、pH6.5を用いて陰性染色した(30秒)。対照サンプルを一次抗体の不在下でインキュベートした。80kVで操作するZeiss10C透過型電子顕微鏡で調査を行った。
その性質を確認するために電子顕微鏡を用いて感染性粒子の形態的性質を調べた。もっと良く調べることにより、感染性粒子がVRP−F/HNレプリコンであることが除外され、その代わりに感染性物質が感染した細胞から誘導されるブレブと確認され、これはPIV3HNおよびFを同時発現する。
まずPBS中1:20に希釈することにより、電子顕微鏡用にVRP−F/HNブレブを調製した。SlotおよびGeuzeにより1984年に開発された手順を変更したものを用いてホールブレブ、陰性染色、イムノゴールドラベリングを行った。Immunolabeling for Electron Microscopy, by Slot and Geuze, Pollack and Varndell eds.Elsevier Science Publishers, BV, Amsterdam.参照。ベシクルの液滴をパラフィルム上に置き、formvar−炭素コーティングされた金格子を各液滴上に下向きに置いた。過剰の流体を除去し、PBSおよび1%BSA(5ml)と、後に1%冷水魚肉ゼラチンを含有するPBS(10ml)を用いて2段階でブロッキングを行った。ブレブを有する格子を、湿潤チャンバー中でPBS BSA中(1h)1:50に希釈された抗F mAbクローンB−102または抗HN mAbクローン68/2上で反転させた。格子をPBS BSA中5×1mlでリンスした。6nmコロイド状金ビーズ(Jackson ImmunoResearch Labs, W. Grove, PA)と結合させたヤギ抗マウスIgG+Mとともにインキュベーションすることにより抗原を検出した。PBS中でリンスした(4×1ml)。細胞を有する格子を1%PBS中グルタルアルデヒド(3ml)で安定化させた。各サンプルを次いで希釈された水中でリンスした(5×1ml)。最後に、ベシクルを有する格子を1%PTA、pH6.5を用いて陰性染色した(30秒)。対照サンプルを一次抗体の不在下でインキュベートした。80kVで操作するZeiss10C透過型電子顕微鏡で調査を行った。
上清から得られる感染性粒子のサンプルの電子顕微鏡研究により、感染性粒子はVRP−F/HNレプリコンでないことが示された。VEEレプリコンはVEEウイルスと大きさが非常に近い70nmウイルス粒子である。Paredesら、J. Virol. 75:9532(2001)参照。陰性染色により、サイズにおける有意な量の異質性が明らかになった。対照的に、VEEレプリコンはサイズが均質であることが知られている。
感染性粒子は、PIV3HNおよびF糖タンパク質の表面発現を示し、これは感染性物質としてのVRP−F/HNレプリコンと一致しない。抗HNモノクローナル抗体「クローン68/2」および抗Fモノクローナル抗体「クローンB−102」を用いて、精製された感染性粒子をイムノゴールドラベリングに付した。結果から、ネズミIgイソタイプで染色された対照と比較して、感染性粒子は主に抗HNおよび抗Fで染色されることがわかった。この結果は、VEE糖タンパク質のみがレプリコンの表面上で発現されるので、感染性物質がレプリコンベースでないことをさらに裏付ける。VEEレプリコンのパッケージング特性に従って、PIV3−HNおよびF糖タンパク質はレプリコン粒子から除外される。Straus, J.H. & Strauss E.G., The Alphaviruses: Gene Expression, Replication and Evolution. Microbiological Reviews 58(3):491−562(1994)(その開示は全体として本発明の一部として参照される)参照。
感染性粒子は、PIV3HNおよびF糖タンパク質の表面発現を示し、これは感染性物質としてのVRP−F/HNレプリコンと一致しない。抗HNモノクローナル抗体「クローン68/2」および抗Fモノクローナル抗体「クローンB−102」を用いて、精製された感染性粒子をイムノゴールドラベリングに付した。結果から、ネズミIgイソタイプで染色された対照と比較して、感染性粒子は主に抗HNおよび抗Fで染色されることがわかった。この結果は、VEE糖タンパク質のみがレプリコンの表面上で発現されるので、感染性物質がレプリコンベースでないことをさらに裏付ける。VEEレプリコンのパッケージング特性に従って、PIV3−HNおよびF糖タンパク質はレプリコン粒子から除外される。Straus, J.H. & Strauss E.G., The Alphaviruses: Gene Expression, Replication and Evolution. Microbiological Reviews 58(3):491−562(1994)(その開示は全体として本発明の一部として参照される)参照。
実施例9:HNおよびFによる感染性ブレブの感染性
これらの感染性ブレブの細胞侵入を媒介する表面タンパク質の同一性を、特定のタンパク質に対する抗体が感染性を阻害するかどうかを評価することにより判断した。まず、GFPをエンコードする感染性ブレブまたはVEEレプリコンを様々な抗体、例えば抗PIV3血清;抗HN mAb;抗F mAb;抗HN mAb+抗F mAb;正常血清およびイソタイプ対照ネズミIgと共に2時間プレインキュベートした。次に、BHK単層を1時間、これらのプレインキュベートされた感染性ブレブまたはVEEレプリコンで感染させた。単層を次いで洗浄し、成長培地と置換した。細胞を固定し、ウサギ抗VEE NSP1およびcyTM3接合ヤギ抗ウサギ抗体で一夜染色することにより、ブレブによる感染を測定した。5時間培養後の緑色蛍光タンパク質の発現によりVEEレプリコンによる感染を調べた。感染の規模の徴候を表6において(+)、または(++)として採点した。感染の徴候が無い場合は(−)と採点した。
これらの感染性ブレブの細胞侵入を媒介する表面タンパク質の同一性を、特定のタンパク質に対する抗体が感染性を阻害するかどうかを評価することにより判断した。まず、GFPをエンコードする感染性ブレブまたはVEEレプリコンを様々な抗体、例えば抗PIV3血清;抗HN mAb;抗F mAb;抗HN mAb+抗F mAb;正常血清およびイソタイプ対照ネズミIgと共に2時間プレインキュベートした。次に、BHK単層を1時間、これらのプレインキュベートされた感染性ブレブまたはVEEレプリコンで感染させた。単層を次いで洗浄し、成長培地と置換した。細胞を固定し、ウサギ抗VEE NSP1およびcyTM3接合ヤギ抗ウサギ抗体で一夜染色することにより、ブレブによる感染を測定した。5時間培養後の緑色蛍光タンパク質の発現によりVEEレプリコンによる感染を調べた。感染の規模の徴候を表6において(+)、または(++)として採点した。感染の徴候が無い場合は(−)と採点した。
表6に示したデータから、感染性ブレブを抗PIV3ポリクローナル抗血清またはPIV3HNに対するモノクローナル抗体とともにプレインキュベーションすると、ブレブが自己増殖するかまたは新規細胞に感染する能力を完全にブロックしたことがわかる。ブレブをPIV3の融合タンパク質に対する単一のモノクローナル抗体と共にインキュベートした場合、感染性は幾分減少するが、全体的には阻害されなかった。ブレブをVEEタンパク質に対するモノクローナル抗体とともにプレインキュベーションすることは、ブレブ感染性に対して効果が無かった。
抗体プレインキュベーションのその後の感染性に対する影響は、ブレブでなくレプリコンを使用した場合には非常に異なっていた。例えば、PIV3に対するポリクローナル抗血清も、PIV3糖タンパク質HNおよびFに対するモノクローナル抗体も、VRP−HN/P感染性を阻害できなかった。表6参照。対照的に、VEE表面糖タンパク質に対するモノクローナル抗体と共にプレインキュベーションした場合だけ、VRP−F/HN感染性を阻害することができた。
感染性の抗体阻害のこれらの研究からいくつかの重要な点を引き出すことができる。まず、感染性阻害の結果は、HNおよびFタンパク質は自己増殖ブレブの表面上に位置することを示した。結果はさらに、感染性と見られる自己増殖活性が、自己増殖ブレブの表面上に位置する融合性糖タンパク質PIV3 HNおよびFにより促進されることを示した。対照的に、これらの結果は、レセプターと結合し、細胞を感染させるためにレプリコンが使用される場合に感染の第一ラウンドを行うVEE構造タンパク質E1およびE2であることを裏付けた。
抗体プレインキュベーションのその後の感染性に対する影響は、ブレブでなくレプリコンを使用した場合には非常に異なっていた。例えば、PIV3に対するポリクローナル抗血清も、PIV3糖タンパク質HNおよびFに対するモノクローナル抗体も、VRP−HN/P感染性を阻害できなかった。表6参照。対照的に、VEE表面糖タンパク質に対するモノクローナル抗体と共にプレインキュベーションした場合だけ、VRP−F/HN感染性を阻害することができた。
感染性の抗体阻害のこれらの研究からいくつかの重要な点を引き出すことができる。まず、感染性阻害の結果は、HNおよびFタンパク質は自己増殖ブレブの表面上に位置することを示した。結果はさらに、感染性と見られる自己増殖活性が、自己増殖ブレブの表面上に位置する融合性糖タンパク質PIV3 HNおよびFにより促進されることを示した。対照的に、これらの結果は、レセプターと結合し、細胞を感染させるためにレプリコンが使用される場合に感染の第一ラウンドを行うVEE構造タンパク質E1およびE2であることを裏付けた。
実施例10:感染性ブレブ対レプリコンの増幅
次に、これらの感染性自己増殖ブレブがウイルスのように増幅されるかどうか、またこのような増幅がもとのレプリコンの成長特性とどのように比較されるかを調べた。これを行うために、まず、VRP−F/HNレプリコンを次のようにして増幅した:(i)準融合性BHK細胞のT−175フラスコを約1×105iu(sfu)のVRP−F/HNで1時間感染させ;(ii)次に、細胞を洗浄し、新鮮な培地で置換し;(iii)VRP−F/HN滴定についてと同じプロトコルを用いて合胞体形成活性を経時的にモニターした。最初の16時間で、低力価の感染活性が存在することが判明した(〜300sfu)。合胞体は、滴定工程中に形成され、これはVRP−F/HNと類似した形態を示した。約40時間後、合胞体形成活性はほぼ2500倍に劇的に増大し、さらに72時間変化しないままであった。従って、レプリコン粒子のバーストサイズは約0.1と計算された。
次に、これらの感染性自己増殖ブレブがウイルスのように増幅されるかどうか、またこのような増幅がもとのレプリコンの成長特性とどのように比較されるかを調べた。これを行うために、まず、VRP−F/HNレプリコンを次のようにして増幅した:(i)準融合性BHK細胞のT−175フラスコを約1×105iu(sfu)のVRP−F/HNで1時間感染させ;(ii)次に、細胞を洗浄し、新鮮な培地で置換し;(iii)VRP−F/HN滴定についてと同じプロトコルを用いて合胞体形成活性を経時的にモニターした。最初の16時間で、低力価の感染活性が存在することが判明した(〜300sfu)。合胞体は、滴定工程中に形成され、これはVRP−F/HNと類似した形態を示した。約40時間後、合胞体形成活性はほぼ2500倍に劇的に増大し、さらに72時間変化しないままであった。従って、レプリコン粒子のバーストサイズは約0.1と計算された。
比較して、VRP−F/HN感染細胞から生じる「感染性ブレブ粒子」がレプリコンのように増幅される能力を調べた。ここでも、約80%コンフルエンシーのBHK細胞のT−175フラスコを使用し、これをVRP−F/HN感染細胞の培養上清の形態の約1×104sfuの自己増殖ブレブで1時間感染させた。次に、細胞を洗浄し、新鮮な培地で置換し、合胞体形成活性を経時的にモニターした。合胞体形成活性により測定される自己増殖ブレブの増幅は、VRP−F/HNレプリコンの増幅よりも良好であった。自己増殖ブレブの成長曲線は、最初の16時間は低い力価(〜500sfu)を示し、続いて最初の40時間で合胞体形成活性において大幅に560倍増大した。その後、最初の感染後約112時間で、合胞体形成活性の力価は約15000倍まで増大した。このデータはさらに、VRP−F/HN感染は、自己増殖ブレブと称する感染性粒子を生じさせ、これはさらに自己増殖することができたことを裏付ける。これらの第二の「感染性ブレブ」粒子は、VRP−F/HN感染からのみ生じることができ、VRP−F/HN、VRP−FまたはVRP−HN+VRP−Fからは生じなかった。この現象は、適当な防御免疫の有効なプライミングおよびPIV3感染に対する免疫原性組成物の候補としてのVRP−F/HNの有効性をさらに説明する。
実施例11:感染性ブレブのキャラクタライゼーション
典型的な物理現象、例えば凍結−乾燥、撹拌、−80℃に7日間凍結、25000pmで20分間遠心分離、および0.2μm、0.45μm、および0.8μmフィルターを通した濾過に対して自己増殖ブレブの脆弱可能性を調べた。ブレブを各物理試験に付す前後に滴定し、結果を以下の表7に示す。
これらの結果から、凍結、撹拌、および遠心分離などの日常的現象に直面した場合、物理的にブレブの感染性は強固であることがわかった。興味深いことに、感染性は撹拌により非常に向上され、これはおそらくは撹拌によりブレブの粘性または凝集性が一部破壊されるためであろう。感染性の濾過性は、ブレブは幾分凝集する傾向があることを裏付ける。
典型的な物理現象、例えば凍結−乾燥、撹拌、−80℃に7日間凍結、25000pmで20分間遠心分離、および0.2μm、0.45μm、および0.8μmフィルターを通した濾過に対して自己増殖ブレブの脆弱可能性を調べた。ブレブを各物理試験に付す前後に滴定し、結果を以下の表7に示す。
これらの結果から、凍結、撹拌、および遠心分離などの日常的現象に直面した場合、物理的にブレブの感染性は強固であることがわかった。興味深いことに、感染性は撹拌により非常に向上され、これはおそらくは撹拌によりブレブの粘性または凝集性が一部破壊されるためであろう。感染性の濾過性は、ブレブは幾分凝集する傾向があることを裏付ける。
実施例12:感染性ブレブを用いた免疫化
A.自己増殖感染性ブレブはハムスターをPIV3感染から防御した
表8は、ハムスターをVRP−F/HNまたはVRP−F/HN感染BHK細胞からの上清(ブレブ)のいずれかでワクチン接種した実験から得られた結果を示す。VRP−F/HNは1、2または3回のいずれかで接種した。表8参照。ブレブを1、2、または3回のいずれかで鼻内投与した。用量を表8に示し、初回投与2.8×104;2回目の投与2.6×103;3回目の投与1×105sfuであった。動物を全て1×106LogTCID50のPIVウイルスで初期免疫化の7週間後に攻撃し、気道におけるウイルス複製を分析した。データを平均±SEM(n=4〜6)で記録した。
表8における結果から、VRP−F/HNレプリコンで免疫化されたハムスターは、VRP−F/HN感染BHK細胞(ブレブ)で免疫化したハムスター(2回投与しか必要としなかった)と比較して、同じHI価を惹起するために3回投与を必要としたことがわかった。さらに、LRTおよびURTにおけるウイルスを除去するためにはブレブを2回投与することで十分であったが、VRP−F/HNレプリコンを2回投与して免疫化されたハムスターはLRTにおいてのみ除去した。(表8参照)。
A.自己増殖感染性ブレブはハムスターをPIV3感染から防御した
表8は、ハムスターをVRP−F/HNまたはVRP−F/HN感染BHK細胞からの上清(ブレブ)のいずれかでワクチン接種した実験から得られた結果を示す。VRP−F/HNは1、2または3回のいずれかで接種した。表8参照。ブレブを1、2、または3回のいずれかで鼻内投与した。用量を表8に示し、初回投与2.8×104;2回目の投与2.6×103;3回目の投与1×105sfuであった。動物を全て1×106LogTCID50のPIVウイルスで初期免疫化の7週間後に攻撃し、気道におけるウイルス複製を分析した。データを平均±SEM(n=4〜6)で記録した。
表8における結果から、VRP−F/HNレプリコンで免疫化されたハムスターは、VRP−F/HN感染BHK細胞(ブレブ)で免疫化したハムスター(2回投与しか必要としなかった)と比較して、同じHI価を惹起するために3回投与を必要としたことがわかった。さらに、LRTおよびURTにおけるウイルスを除去するためにはブレブを2回投与することで十分であったが、VRP−F/HNレプリコンを2回投与して免疫化されたハムスターはLRTにおいてのみ除去した。(表8参照)。
VRP−F/HN(ブレブ)での動物の防御について2回投与は最適用量のようであるので、ハムスターにおいて全体的な防御について最適経路を評価した。表9に示すこの研究において、同じHNタンパク質濃度(0.58ng)(VRP−HN、またはVRP−F/HN感染上清について)および/または同じF濃度(0.21ng)(VRP−FまたはVRP−F/HN感染上清について)を含有するブレブを鼻内(IN)または筋肉内(IM)のいずれかで2回投与してハムスターを免疫化した。全接種剤は、7000sfu/用量に等しい感染性ブレブ活性を含有するVRP−F/HN感染培養物からの上清を除いて0sfuを示した。表9参照。動物を次いで1×105LogTCID50のPIVウイルスで最後の免疫化後7週間に鼻内攻撃し、気道におけるウイルス複製、および中和価を分析した。データを平均±SEM(n=4〜6)で表した。
結果から、鼻内径路により投与されたVRP−F/HN感染BHK細胞(ブレブ)は上および下気道の両方においてウイルスを除去したが、筋肉内経路により投与された場合には、下気道(LRT)においてのみ除去したことがわかった。VRP−HN、またはVRP−F、またはVRP−HN+VRP−Fを含有するレプリコン感染細胞から得られた上清で免疫化された動物は、LRTおよびURTからウイルスを除去しなかった。
当業者らは、ただ通常の実験を用いて、本明細書に記載された本発明の特定の具体例の多くの等価なものを認識するか、または確認することができるであろう。このような等価物は請求の範囲に含まれる。
Claims (66)
- ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質をエンコードする単離された組換え核酸分子。
- 配列番号1に示される核酸配列を有する、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質をエンコードする単離された組換え核酸分子。
- ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団を含む免疫原性組成物。
- BHK培養細胞の単層を感染させるために使用される場合に、前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子が細胞変性効果を誘発する請求項3記載の免疫原性組成物。
- 未感染細胞単層に移された場合に前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する請求項4記載の免疫原性組成物。
- BHK培養細胞における前記細胞変性効果が合胞体形成である請求項4記載の免疫原性組成物。
- BHK培養細胞における前記細胞変性効果が単層の破壊である請求項4記載の免疫原性組成物。
- 前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有しない請求項4記載の免疫原性組成物。
- ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団を含む免疫原性組成物であって;
前記集団が、検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず;
前記レプリコン粒子が、培養されたBHK細胞の単層を感染させるために使用される場合、細胞変性効果を誘発し;
前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する、免疫原性組成物。 - ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団を含む免疫原性組成物であって;
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず、
前記レプリコン粒子が、培養されたBHK細胞の単層を感染させるために使用される場合に細胞変性効果を誘発し;
前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発し;
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子が哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する免疫原性組成物。 - ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子を含み、レプリコンの核酸部分が配列番号1に示される核酸配列を有する、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団を含む免疫原性組成物であって;
前記集団は検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず;
前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する免疫原性組成物。 - ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子を含み、レプリコンの核酸部分が配列番号1に示される核酸配列を有するベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団を含む免疫原性組成物であって、
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず;
前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発し;
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子が哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する免疫原性組成物。 - ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質を含み、レプリコンの核酸部分が配列番号1に示す核酸配列を有し;
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず;
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子が哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起し;
前記レプリコン粒子が、培養されたBHK細胞の単層を感染させるために用いられる場合に、細胞変性効果を誘発し;
前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移される場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)を含む免疫原性組成物。 - ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団を含む免疫原性組成物であって;
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず;
前記レプリコン粒子に感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発し;
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子が哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する免疫原性組成物。 - 前記防御免疫反応が哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス3型による下気道の感染を予防する請求項14記載の免疫原性組成物。
- 前記防御免疫反応が、哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス3型による上気道の重篤度を軽減する請求項14記載の免疫原性組成物。
- さらに医薬的許容される担体を含む請求項14記載の免疫原性組成物。
- 前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、前記パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、および前記パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質が配列番号1において示される核酸によりエンコードされる請求項14記載の免疫原性組成物。
- 前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、前記パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、および前記パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質が配列番号2;配列番号3;および配列番号4に記載されるアミノ酸配列を含む請求項14記載の免疫原性組成物。
- さらにアジュバントを含む請求項14記載の免疫原性組成物。
- パラミクソウイルスによる気道の感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、前記対象に免疫学的に有効な量の:
(a)ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質および少なくとも1種のパラミクソウイルス糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団を含む免疫原性組成物;および
(b)医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で投与することを含み;
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず;
前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する方法。 - 前記パラミクソウイルスがパラインフルエンザウイルス3型である請求項21記載の方法。
- 前記糖タンパク質がパラインフルエンザウイルス3型ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ(HN)糖タンパク質である請求項22記載の方法。
- 前記糖タンパク質がパラインフルエンザウイルス3型融合(F)糖タンパク質である請求項22記載の方法。
- 前記糖タンパク質がパラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質およびHN糖タンパク質の両方を含む請求項21記載の方法。
- 前記パラミクソウイルスが呼吸器合胞体ウイルスである請求項21記載の方法。
- 前記糖タンパク質が呼吸器合胞体ウイルス付着(G)糖タンパク質である請求項21記載の方法。
- 前記糖タンパク質が呼吸器合胞体ウイルス融合(F)糖タンパク質である請求項21記載の方法。
- 前記糖タンパク質が呼吸器合胞体ウイルスG糖タンパク質およびF糖タンパク質の両方を含む請求項21記載の方法。
- 前記感染が下気道においてである請求項21記載の方法。
- 前記感染が上気道においてである請求項21記載の方法。
- パラインフルエンザウイルス3型による感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、前記対象に免疫学的に有効な量の:
(a)ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラミクソウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団を含む免疫原性組成物;および
(b)医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で投与することを含み;
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず;
前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する方法。 - 前記感染が下気道においてである請求項32記載の方法。
- 前記感染が上気道においてである請求項32記載の方法。
- 前記免疫原性組成物が2回投与される請求項32記載の方法。
- 前記免疫原性組成物が3回投与される請求項32記載の方法。
- ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物。
- 前記自己増殖ブレブが、BHK培養細胞の単層を感染させるために用いられる場合に、細胞変性効果を誘発する請求項37記載の免疫原性組成物。
- 前記自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する請求項38記載の免疫原性組成物。
- BHK培養細胞における前記細胞変性効果が合胞体形成である請求項38記載の免疫原性組成物。
- BHK培養細胞における前記細胞変性効果が単層破壊である請求項38記載の免疫原性組成物。
- 前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有しない請求項38記載の免疫原性組成物。
- 前記自己増殖ブレブがベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)に感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子を含む請求項38記載の免疫原性組成物。
- ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物であって;
前記自己増殖ブレブが、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子が、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスF糖タンパク質遺伝子、およびパラインフルエンザウイルスHN糖タンパク質遺伝子を含み;
自己増殖ブレブの前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有しない免疫原性組成物。 - ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物であって;
前記自己増殖ブレブが、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスF糖タンパク質遺伝子、およびパラインフルエンザウイルスHN糖タンパク質遺伝子を含み;
自己増殖ブレブの前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず;
自己増殖ブレブの前記集団が、培養されたBHK細胞の単層を感染させるために使用される場合に、細胞変性効果を誘発する免疫原性組成物。 - ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物であって;
前記自己増殖ブレブがベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子を含み;
自己増殖ブレブの前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず;
自己増殖ブレブの前記集団が、培養されたBHK細胞の単層を感染させるために使用される場合に、細胞変性効果を誘発し;
自己増殖ブレブの前記集団に感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する免疫原性組成物。 - ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物であって;
前記自己増殖ブレブが、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子を含み;
自己増殖ブレブの前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず;
自己増殖ブレブの前記集団が、培養されたBHK細胞の単層を感染させるために使用される場合に、細胞変性効果を誘発し;
自己増殖ブレブの前記集団に感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発し;
前記自己増殖ブレブが哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する免疫原性組成物。 - ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物であって;
前記自己増殖ブレブがベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子を含み;
自己増殖ブレブの前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず;
自己増殖ブレブの前記集団が、培養されたBHK細胞の単層を感染させるために使用される場合に、細胞変性効果を誘発し;
自己増殖ブレブの前記集団に感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発し;
前記自己増殖ブレブが哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する免疫原性組成物。 - 前記防御免疫反応が哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス3型による下気道の感染を予防する請求項48記載の免疫原性組成物。
- 前記防御免疫反応が哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス3型による上気道の感染の重篤度を軽減する請求項48記載の免疫原性組成物。
- さらに医薬的に許容される担体を含む請求項48記載の免疫原性組成物。
- さらにアジュバントを含む請求項48記載の免疫原性組成物。
- ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物であって;
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質が配列番号2;配列番号3;および配列番号4に示すアミノ酸配列を有し、
前記自己増殖ブレブがベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子を含み;
自己増殖ブレブの前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず;
自己増殖ブレブの前記集団が、培養されたBHK細胞の単層を感染させるために使用される場合に、細胞変性効果を誘発し;
自己増殖ブレブの前記集団に感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移される場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発し;
前記自己増殖ブレブが哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する免疫原性組成物。 - パラミクソウイルスによる気道の感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、免疫学的に有効な量の:
(a)ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルスF糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルスF糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスHN糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルスHN糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物;および
(b)医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で前記対象に投与することを含み;
前記自己増殖ブレブがベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスF糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルスHN糖タンパク質遺伝子を含み;
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず;
前記自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する方法。 - 前記パラインフルエンザウイルスが、パラインフルエンザウイルス1型、パラインフルエンザウイルス2型、パラインフルエンザウイルス3型、およびパラインフルエンザウイルス4型からなる群から選択される請求項54記載の方法。
- 前記HN糖タンパク質がパラインフルエンザウイルス3型ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ(HN)糖タンパク質である請求項55記載の方法。
- 前記F糖タンパク質がパラインフルエンザウイルス3型融合(F)糖タンパク質である請求項55記載の方法。
- 前記糖タンパク質がパラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質およびHN糖タンパク質の両方を含む請求項54記載の方法。
- 前記感染が下気道においてである請求項54記載の方法。
- 前記感染が上気道においてである請求項54記載の方法。
- パラインフルエンザウイルス3型による感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、免疫学的に有効な量の:
(a)ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物;および
(b)医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で前記対象に投与することを含み;
前記自己増殖ブレブがベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子を免疫反応を惹起するために十分な量で含み;
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず;
前記自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する方法。 - 前記感染が下気道においてである請求項61記載の方法。
- 前記感染が上気道においてである請求項61記載の方法。
- 前記免疫原性組成物が2回投与される請求項61記載の方法。
- 前記免疫原性組成物が3回投与される請求項61記載の方法。
- パラインフルエンザウイルス3型による感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、免疫学的に有効な量の:
(a)ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物
(ここで、前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質は配列番号2;配列番号3および配列番号4に示されるアミノ酸配列を有する);および
(b)医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で前記対象に投与することを含み;
前記自己増殖ブレブがベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE1糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスE2糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス3型F糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス3型HN糖タンパク質遺伝子を、免疫反応を惹起するために十分な量で含み;
前記集団は検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず;
前記自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する方法。
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