JP2018061519A - 細胞培養用キット - Google Patents
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Abstract
Description
このような細胞の大量培養では、培養容器を用いて自動的に細胞培養を行う自動細胞培養装置を好適に用いることができる。
自動細胞培養装置を使用するにあたっては、コンタミネーションのリスクを低減すべく、閉鎖系で行うことが重要である。しかしながら、細胞注入から培地追加、サンプリング、回収までを、閉鎖系を維持しながら自動培養可能な簡便な細胞培養用キットは、これまで存在していなかった。
具体的には、培養容器を用いて自動的に細胞培養を行う自動細胞培養装置として、例えば特許文献1に記載の細胞培養装置を挙げることができる。この装置では、培地貯留手段、機能発現用培養容器、及び増殖用培養容器が閉鎖系で構成されている(請求項7参照)。しかし、この細胞培養装置では、廃液バックから細胞回収バックに交換する際については閉鎖系を維持できる構成は見られず、開放系で行われていると考えられる。また、その他にも、細胞注入から回収までを閉鎖系を維持したまま実現可能にするための細胞培養用キットは見当たらなかった。
さらに、冷蔵された培地は気体の溶解度が高く、多量の炭酸ガスや酸素が溶け込んでいる。これを培養容器に移して加温すると、気体の溶解度は液温が高くなるにつれて低くなるため、培養容器内で気泡が発生するという問題があった。培養容器内で発生した気泡は、容器内を攪拌する際に細かく泡立ち、細胞に対して悪影響を与える。また、容器内部を観察する際に気泡が邪魔になり、観察しにくくなるという問題があった。
このような問題の対策として、培地貯蔵容器自体を加温しておくことが考えられるが、培地は加温時間が長くなると細胞の培養効率が低下してしまう。このため、なるべく培養する直前までは、培地を冷蔵保存することが望ましい。
また、培地の温度を調整するための温度調整容器を備えた細胞培養用キットの提供を目的とする。
さらに、本発明の細胞培養用キットを、培地等の温度を調整するための温度調整容器が、培養容器と培地貯蔵容器を連結する導管から分岐して設けられた構成とすることが好ましく、培地貯蔵容器において冷蔵された培地等の一部又は全部が、温度調整容器に移送されて所定の温度に昇温された後、培養容器に移送される構成とすることも好ましい。
まず、図1を参照して、本発明の第一実施形態について説明する。同図は、本実施形態の細胞培養用キットの構成を示す図である。
本実施形態の細胞培養用キットは、培養容器10、培地貯蔵容器20、細胞注入容器30、細胞回収容器40を備えている。また、サンプリング容器50を備えることが好ましい。
培養容器10は、細胞の培養に必要なガス透過性を有していることが必要である。具体的には、5000ml/m2・day・atm(37℃−80%RH)以上の酸素透過率を有することが好ましい。
また、内容物を確認できるように、培養容器10の全部又は一部は、透明性を有していることが好ましい。図1において、培養容器10上には、シワが生じ難く、内部の観察をし易くすることができる観察枠11が示されている。
さらに、培養容器10は、高い細胞増殖効率を実現するために、低細胞毒性、低溶出性、及び放射線滅菌適性を有することが好ましい。
なお、本実施形態の細胞培養用キットにおいて、1つのポートのみを備えた培地貯蔵容器20を用いて、このポートから培地を培地貯蔵容器20に充填した後に、同ポートから培地を培養容器10へ移送することもできる。
この細胞注入容器30には、少なくとも1つのポートが備えられる。そして、このポートを介して、細胞注入容器30から培養容器10へ培養開始時の細胞と培地が送られる。
細胞回収容器40には、少なくとも1つのポートが備えられ、このポートを介して、培養容器10から細胞回収容器40へ細胞と培地の一部が送られる。
サンプリング容器50には、2つのポートが備えられ、このうち一方のポートには、培養容器10と連結する導管(チューブ)が接続され、培養容器10から細胞懸濁液がサンプリング容器50へ送られる。また、もう一方のポートは、各種分析を行うためにサンプリング容器50内の細胞懸濁液の一部取り出すために用いられる。なお、これらを共に行う1つのポートを備えたものとすることや、3つ以上のポートを備え、複数回の分取を可能とする構成にすることもできる。
これらの導管の材料は、使用目的に応じて適切なものを適宜選択することが望ましい。例えば、シリコーン樹脂、軟質塩化ビニル樹脂、ポリブタジエン樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、スチレン系エラストマー、例えば、SBS(スチレン・ブタジエン・スチレン)、SIS(スチレン・イソプレン・スチレン)、SEBS(スチレン・エチレン・ブチレン・スチレン)、SEPS(スチレン・エチレン・プロピレン・スチレン)、ポリオレフィン樹脂、フッ素系樹脂等を用いることができる。
すなわち、培養容器10と培地貯蔵容器20を接続するための培地供給用チューブと、その他の容器の組み合わせの間を接続する培地移送用チューブである。
培養容器10と培地貯蔵容器20を接続するための培地供給用チューブとしては、特にポリオレフィンまたはシリコーン樹脂からなるものを用いることが好ましい。培地供給用チューブは、培養期間を通じて、培地を少しずつ培養容器10へ移送するものであるため、特に優れた低細胞毒性、低溶出性等を有することが望ましい。一方、この培地供給用チューブは、培養工程において、特に溶断する必要性はない。そこで、これらを考慮して、上記材料からなるものを用いることが好ましいとしている。
図1において、培地貯蔵容器接続チューブ22は、このような培地供給用チューブで構成することを想定しており、例えば内径3.5mm、外径6.0mmのシリコンチューブなどを好適に用いることができる。
そこで、これらの容器に接続される培地移送用チューブとして、少なくとも一箇所が、熱可塑性樹脂で形成されたものを用いることが好ましい。また、培地移送用チューブの全体を熱可塑性樹脂で形成することもできる。
図1において、細胞注入容器接続チューブ31、細胞回収容器接続チューブ41、及びサンプリング容器接続チューブ51は、このような培地移送用チューブで構成することを想定しており、例えば内径3.3mm、外径5.0mmの塩ビチューブなどを好適に用いることができる。
すなわち、本実施形態の細胞培養用キットでは、培養容器10に第一ポート12が備えられ、この第一ポート12に培地貯蔵容器接続チューブ22を介して培地貯蔵容器20が接続される。そして、この培地貯蔵容器接続チューブ22に、その他の容器が接続される構成となっている。
また、培地貯蔵容器接続チューブ22における連結部分には、キャップ付き又はカバー付きのルアーコネクター(ニードレスコネクター)などを用いることができる。
まず、図1に示す細胞培養用キットにおいて、培地を充填した培地貯蔵容器20の培地貯蔵容器接続チューブ22におけるコネクターを連結すると共に、細胞と培地を充填した細胞注入容器30の細胞注入容器接続チューブ31をコネクターによって接続する。
次に、細胞注入容器30から培養容器10へ細胞と培地を移送する。このとき、細胞注入容器30のポートを下側にして縦にし、細胞注入容器30に入っている空気を上部に集めることなどにより、空気を培養容器10へ送ることなく、細胞と培地のみを培養容器10へ移送することができる。
そして、培養容器10に所定量の培地と細胞が充填されると、適宜振とうやかく拌が行われて、一定期間細胞の培養が行われる。細胞培養中には、サンプルを培養容器10からサンプリング容器50へ適宜移送することにより、調査や分析に用いることができる。
すなわち、まず培養容器10を静止させて細胞を下部に沈降させた後に、細胞懸濁液の上澄みを培養容器10から培地貯蔵容器20へ移送させる。これによって、培養容器10における細胞懸濁液を濃縮することができ、細胞回収容器40へ移送する液量を低減することができる。次いで、この濃縮された細胞懸濁液を培養容器10から細胞回収容器40に回収する。
このように、本実施形態の細胞培養用キットを用いることで、閉鎖系で細胞培養を行うことができる。
次に、図2を参照して、本発明の第二実施形態について説明する。同図は、本実施形態の細胞培養用キットの構成を示す図である。
本実施形態の細胞培養用キットは、2ポート仕様となっている点で第一実施形態と異なり、その他の点では、第一実施形態の細胞培養用キットと同様の構成となっている。すなわち、本実施形態の細胞培養用キットは、培養容器110、培地貯蔵容器20、細胞注入容器30、細胞回収容器40を備え、またサンプリング容器50を備えることが好ましい。
第一ポート112には、第一実施形態と同様に、培地貯蔵容器20が培地貯蔵容器接続チューブ22を介して接続されている。第二ポート113には、細胞回収容器40が細胞回収容器接続チューブ41を介して接続されている。培地貯蔵容器接続チューブ22及び細胞回収容器接続チューブ41には、それぞれチューブポンプが用いられ、それぞれ培地、細胞懸濁液の移送が行われる。
また、細胞注入容器30は細胞注入容器接続チューブ31を介して培地貯蔵容器接続チューブ22に接続され、サンプリング容器50はサンプリング容器接続チューブ51を介して培地貯蔵容器接続チューブ22に接続されている。
次に、図3を参照して、本発明の第三実施形態について説明する。同図は、本実施形態の細胞培養用キットの構成を示す図である。
本実施形態の細胞培養用キットは、3ポート仕様となっている点で第一実施形態と異なっており、その他の点では、第一実施形態の細胞培養用キットと同様の構成となっている。すなわち、本実施形態の細胞培養用キットは、培養容器210、培地貯蔵容器20、細胞注入容器30、細胞回収容器40、廃液容器60を備え、またサンプリング容器50を備えることが好ましい。また、培地貯蔵容器20として、培地貯蔵容器20aと20bの2つが備えられている。
本実施形態では、第一ポートには、サンプリング容器50と廃液容器60がそれぞれサンプリング容器接続チューブ51、廃液容器接続チューブ61を介して接続されている。また、これらのチューブが合流したチューブ部分には、チューブポンプが用いられ、サンプリング容器50への細胞懸濁液の移送、及び廃液容器60への上澄み液の移送がそれぞれ行われる。
また、第三ポート214には、細胞回収容器40が細胞回収容器接続チューブ41を介して接続されており、チューブポンプにより、細胞懸濁液が培養容器210から細胞回収容器40へ移送される。
また、細胞培養中には、サンプルを培養容器210からサンプリング容器50へ適宜移送することにより、調査や分析に用いることができる。
本実施形態の細胞培養用キットによれば、複数の動作を同時に行うことが可能となる。特に培地貯蔵容器20や培地貯蔵容器接続チューブ22にまだ培地が残存している場合でも、サンプリング容器50へのサンプリングを行うことができ、培地の供給とサンプリングのタイミングを柔軟に調整することが可能となる。
次に、図4〜図6を参照して、本発明の第四実施形態について説明する。これらの図は、本実施形態の細胞培養用キットの構成を示す図である。
本実施形態の細胞培養用キットは、第一実施形態〜第三実施形態の構成に加えて、培地の温度を調整するための温度調整容器70及び温度調整容器接続チューブ71を備える点に特徴がある。その他の構成については、第一実施形態〜第三実施形態におけるものと同様のものとすることができる。
以下、第一実施形態の細胞培養用キットに温度調整容器70及び温度調整容器接続チューブ71を追加した本実施形態の細胞培養用キットを示す図4を用いて説明するが、図5,6における温度調整容器70及び温度調整容器接続チューブ71についても図4と同様である。
また、温度調整容器70をインキュベータの外部に配置して、例えば別個の加温装置によって温度調整容器70を加温し、温度調整容器70内の培地温度を調整することも好ましい。この場合は、例えば30〜37℃などの温度範囲に調整することができる。
さらに、温度調整容器70をインキュベータの外部に配置して、特別な加温装置を設けることなく静置させておくことで、温度調整容器70内の培地温度を常温(室温)に戻すことも可能である。
また、本実施形態の細胞培養用キットにおいて、温度調整容器70を2以上備えることもできる。これにより、同時に2倍量以上の培地やその他の物質の温度を調節することが可能となる。
また、このように温度調整容器によって培地を昇温できるため、培地貯蔵容器内の培地はこれまで通り冷蔵保存可能であり、培地の加熱時間が長くなる場合に細胞の培養効率が低下するという問題の発生を防止することが可能となる。
さらに、昇温により培地に溶解していたガスが抜けるため、温度調整容器から培養容器に培地のみを移送することができ、培養容器内に気泡が混入するのを防止することが可能となる。
例えば、実施形態では特定サイズのチューブを用いる例が示されており、また特定のコネクターが使用されているが、本発明の技術的範囲の範囲内において、同じ機能が得られる他の部品を用いるなど適宜変更することが可能である。また、培養中の培地に追加するための生理活性物質やサイトカインその他様々な物質を充填済みの容器を実施形態のキットに付加して取り付けておくことも可能である。
Claims (11)
- 細胞を培養するための閉鎖系細胞培養用キットであって、
細胞を培養するための培養容器と、
培地等を貯蔵しておくための培地貯蔵容器と、
細胞を注入するための細胞注入容器と、
培養後の細胞懸濁液を回収する細胞回収容器と、をそれぞれ少なくとも1つ以上有し、
前記培地貯蔵容器が、培養後の培地を回収する廃液容器としても用いられ、
前記培養容器、前記培地貯蔵容器、前記細胞注入容器、及び前記細胞回収容器が導管によって連結され、
前記細胞注入容器が、前記培地貯蔵容器と前記培養容器を連結する導管における、前記培養容器の際から分岐し、
前記細胞注入容器は、前記培養容器へ移送される前記細胞に加えて、前記培地貯蔵容器の前記培地等の一部と、前記導管の内部に存在していた空気の一部とが、その内部に移送され、前記細胞と前記培地貯蔵容器から移送された前記培地とが前記培養容器へ送り出されるように構成される
ことを特徴とする細胞培養用キット。 - 培養中の細胞懸濁液の一部をサンプリングすることが可能なサンプリング容器と、前記培地貯蔵容器とは別個に、培養中又は培養後の培地を回収する廃液容器とのいずれか一方、又は両方を少なくとも1つ以上有し、
前記サンプリング容器と、前記廃液容器とのいずれか一方、又は両方が、導管によって前記培養容器に連結された
ことを特徴とする請求項1記載の細胞培養用キット。 - 前記細胞注入容器、前記細胞回収容器、前記サンプリング容器、及び前記廃液容器への導管の少なくとも一箇所が、熱可塑性樹脂で形成されることを特徴とする請求項2に記載の細胞培養用キット。
- 前記培地貯蔵容器を2つ有し、それぞれに同一の又は異なる培地が充填されることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の細胞培養用キット。
- 培地等の温度を調整するための温度調整容器が、前記培養容器と前記培地貯蔵容器を連結する導管から分岐して設けられたことを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の細胞培養用キット。
- 前記培地貯蔵容器において冷蔵された培地等の一部又は全部が、前記温度調整容器に移送されて所定の温度に昇温された後、前記培養容器に移送されることを特徴とする請求項5記載の細胞培養用キット。
- 前記各容器が、可撓性素材で袋状に形成されていることを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の細胞培養用キット。
- 前記培地貯蔵容器が1000ml/m2・day・atm(23℃−80%RH)以下の二酸化炭素透過率を有し、前記培養容器が5000ml/m2・day・atm(37℃−80%RH)以上の酸素透過率を有することを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の細胞培養用キット。
- 前記培地貯蔵容器に少なくとも2つの導管があり、前記培養容器と連結されていない導管が、軟質塩化ビニル樹脂で形成されることを特徴とする請求項1〜8のいずれかに記載の細胞培養用キット。
- 前記培地貯蔵容器、及び前記細胞注入容器の少なくともいずれかが、前記細胞培養用キットから、取り外し可能であることを特徴とする請求項1〜9のいずれかに記載の細胞培養用キット。
- 前記培地貯蔵容器と前記培養容器間の導管が、ポリオレフィンまたはシリコーン樹脂であることを特徴とする請求項1〜10のいずれかに記載の細胞培養用キット。
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