JP2017538435A - 哺乳類細胞の培養方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれている、2014年12月22日に出願した、米国仮特許出願番号第62/095,734号の優先権を主張するものである。
記載される方法のいずれかにおける培養工程(例えば、灌流培養工程)は、培養物における細胞維持、および増殖を可能にする条件下で、20L〜約8,000L(例えば、約20L〜約7,000L、約20L〜約6,000L、約20L〜約5,000L、約20L〜約4,000L、約20L〜約3,000L、約20L〜約2,500L、約20L〜約2,000L、約20L〜約1,500L、約20L〜約1,000L、約20L〜約500L、約20L〜約200L、約20L〜約100L、約100L〜約8,000L、約100L〜約7,000L、約100L〜約6,000L、約100L〜約5,000L、約100L〜約4,000L、約100L〜約3,000L、約100L〜約2,000L、約100L〜約1,500L、約100L〜約1,000L、約100L〜約800L、約100L〜約700L、約100L〜約600L、約100L〜約500L、約100L〜約400L、約100L〜約300L、約100L〜約200L、約500L〜約8,000L、約500L〜約7,000L、約500L〜約6,000L、約500L〜約5,000L、約500L〜約4,000L、約500L〜約3,000L、約500L〜約2,000L、約500L〜約1,500L、約500L〜約1,000L、約500L〜約750L、約1,000L〜約8,000L、約1,000L〜約7,000L、約1,000L〜約6,000L、約1,000L〜約5,000L、約1,000L〜約4,000L、約1,000L〜約3,000L、約1,000L〜約2,000L、約1,000L〜約1,500L、約2,000L〜約8,000L、約2,000L〜約7,000L、約2,000L〜約6,000L、約2,000L〜約5,000L、約2,000L〜約4,000L、約2,000L〜約3,000L、約3,000L〜約8,000L、約3,000L〜約7,000L、約3,000L〜約6,000L、約3,000L〜約5,000L、約3,000L〜約4,000L、約4,000L〜約8,000L、約4,000L〜約7,000L、約4,000L〜約6,000L、約4,000L〜約5,000L、約5,000L〜約8,000L、約5,000L〜約7,000L、約5,000L〜約6,000L、約6,000L〜約8,000L、約6,000L〜約7,000L、または約7,000L〜約8,000L)の体積を有する細胞培養物をインキュベートすることを含む。
本明細書において記載される方法のいずれかにおける培養(例えば、灌流培養)は、約3日〜約100日(例えば、約3日〜約95日、約3日〜約90日、約3日〜約85日、約3日〜約80日、約3日〜約75日、約3日〜約70日、約3日〜約65日、約3日〜約60日、約3日〜約55日、約3日〜約50日、約3日〜約45日、約3日〜約40日、約3日〜約35日、約3日〜約30日、約3日〜約25日、約3日〜約20日、約3日〜約15日、約3日〜約10日、約5日〜約100日、約5日〜約95日、約5日〜約90日、約5日〜約85日、約5日〜約80日、約5日〜約75日、約5日〜約70日、約5日〜約65日、約5日〜約60日、約5日〜約55日、約5日〜約50日、約5日〜約45日、約5日〜約40日、約5日〜約35日、約5日〜約30日、約5日〜約25日、約5日〜約20日、約5日〜約15日、約5日〜約10日、約10日〜約100日、約10日〜約95日、約10日〜約90日、約10日〜約85日、約10日〜約80日、約10日〜約75日、約10日〜約70日、約10日〜約65日、約10日〜約60日、約10日〜約55日、約10日〜約50日、約10日〜約45日、約10日〜約40日、約10日〜約35日、約10日〜約30日、約10日〜約25日、約10日〜約20日、約10日〜約15日、約15日〜約100日、約15日〜約95日、約15日〜約90日、約15日〜約85日、約15日〜約80日、約15日〜約75日、約15日〜約70日、約15日〜約65日、約15日〜約60日、約15日〜約55日、約15日〜約50日、約15日〜約45日、約15日〜約40日、約15日〜約35日、約15日〜約30日、約15日〜約25日、約15日〜約20日、約20日〜約100日、約20日〜約95日、約20日〜約90日、約20日〜約85日、約20日〜約80日、約20日〜約75日、約20日〜約70日、約20日〜約65日、約20日〜約60日、約20日〜約55日、約20日〜約50日、約20日〜約45日、約20日〜約40日、約20日〜約35日、約20日〜約30日、約20日〜約25日、約25日〜約100日、約25日〜約95日、約25日〜約90日、約25日〜約85日、約25日〜約80日、約25日〜約75日、約25日〜約70日、約25日〜約65日、約25日〜約60日、約25日〜約55日、約25日〜約50日、約25日〜約45日、約25日〜約40日、約25日〜約35日、約25日〜約30日、約30日〜約100日、約30日〜約90日、約30日〜約80日、約30日〜約70日、約30日〜約60日、約30日〜約50日、約30日〜約40日、約40日〜約100日、約40日〜約90日、約40日〜約80日、約40日〜約70日、約40日〜約60日、約40日〜約50日、約50日〜約100日、約50日〜約90日、約50日〜約80日、約50日〜約70日、約50日〜約60日、約60日〜約100日、約60日〜約90日、約60日〜約80日、約60日〜約70日、約70日〜約100日、約70日〜約90日、約70日〜約80日、約80日〜約100日、約80日〜約90日、または約90日〜約100日)の期間に渡り行われる。
本明細書において提供される方法において培養される(例えば、灌流培養される)哺乳類細胞は、懸濁液において成長する細胞、または接着細胞である。本明細書において記載される方法のいずれかにおいて培養される哺乳類細胞の非限定的な例は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(例えば、CHO DG44細胞、またはCHO−K1s細胞)、Sp2.0、ミエローマ細胞(例えば、NS/0)、B細胞、ハイブリドーマ細胞、T細胞、ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞(例えば、HEK293E、およびHEK293F)、アフリカミドリザル腎臓上皮(Vero)細胞、NSO細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、PerC6細胞、Vero細胞、HT−1080細胞、ならびにメイディンダービーイヌ(コッカースパニエル)腎臓上皮(MDCK)細胞を含む。接着細胞が培養されるいくつかの例では、培養物はまた、複数のマイクロキャリア(例えば、1つまたはそれ以上の孔を含有するマイクロキャリア)も含有する。本明細書に記載される方法のいずれかにおいて培養されるさらなる哺乳類細胞は、当該技術分野において公知である。
本明細書において記載される方法のいずれかにおける培養工程は、バイオリアクター(例えば、灌流バイオリアクター、または流加バイオリアクター)を使用して行われる。培養工程を行うために使用されるバイオリアクター(例えば、灌流バイオリアクター、または流加バイオリアクター)は、約24L〜約25,000L(例えば、約24L〜約20,000L、約24L〜約15,000L、約24L〜約10,000L、約24L〜約9,500L、約24L〜約9,000L、約24L〜約8,500L、約24L〜約8,000L、約24L〜約7,500L、約24L〜約7,000L、約24L〜約6,500L、約24L〜約6,000L、約24L〜約5,500L、約24L〜約5,000L、約24L〜約4,500L、約24L〜約4,000L、約24L〜約3,500L、約24L〜約3,000L、約24L〜約2,500L、約24L〜約2,000L、約24L〜約1,500L、約24L〜約1,000L、約24L〜約900L、約24L〜約800L、約24L〜約700L、約24L〜約600L、約24L〜約500L、約24L〜約400L、約24L〜約300L、約24L〜約200L、約24L〜約100L、約100L〜約25,000L、約100L〜約20,000L、約100L〜約15,000L、約100L〜約10,000L、約100L〜約9,500L、約100L〜約9,000L、約100L〜約8,500L、約100L〜約8,000L、約100L〜約7,500L、約100L〜約7,000L、約100L〜約6,500L、約100L〜約6,000L、約100L〜約5,500L、約100L〜約5,000L、約100L〜約4,500L、約100L〜約4,000L、約100L〜約3,500L、約100L〜約3,000L、約100L〜約2,500L、約100L〜約2,000L、約100L〜約1,500L、約100L〜約1,000L、約100L〜約900L、約100L〜約800L、約100L〜約700L、約100L〜約600L、約100L〜約500L、約100L〜約400L、約100L〜約300L、約100L〜約200L、約200L〜約25,000L、約200L〜約20,000L、約200L〜約15,000L、約200L〜約10,000L、約200L〜約9,500L、約200L〜約9,000L、約200L〜約8,500L、約200L〜約8,000L、約200L〜約7,500L、約200L〜約7,000L、約200L〜約6,500L、約200L〜約6,000L、約200L〜約5,500L、約200L〜約5,000L、約200L〜約4,500L、約200L〜約4,000L、約200L〜約3,500L、約200L〜約3,000L、約200L〜約2,500L、約200L〜約2,000L、約200L〜約1,500L、約200L〜約1,000L、約200L〜約900L、約200L〜約800L、約200L〜約700L、約200L〜約600L、約200L〜約500L、約200L〜約400L、約200L〜約300L、約500L〜約25,000L、約500L〜約20,000L、約500L〜約15,000L、約500L〜約10,000L、約500L〜約9,500L、約500L〜約9,000L、約500L〜約8,500L、約500L〜約8,000L、約500L〜約7,500L、約500L〜約7,000L、約500L〜約6,500L、約500L〜約6,000L、約500L〜約5,500L、約500L〜約5,000L、約500L〜約4,500L、約500L〜約4,000L、約500L〜約3,500L、約500L〜約3,000L、約500L〜約2,500L、約500L〜約2,000L、約500L〜約1,500L、約500L〜約1,000L、約500L〜約900L、約500L〜約800L、約500L〜約700L、約500L〜約600L、約1,000L〜約25,000L、約1,000L〜約20,000L、約1,000L〜約15,000L、約1,000L〜約10,000L、約1,000L〜約9,500L、約1,000L〜約9,000L、約1,000L〜約8,500L、約1,000L〜約8,000L、約1,000L〜約7,500L、約1,000L〜約7,000L、約1,000L〜約6,500L、約1,000L〜約6,000L、約1,000L〜約5,500L、約1,000L〜約5,000L、約1,000L〜約4,500L、約1,000L〜約4,000L、約1,000L〜約3,500L、約1,000L〜約3,000L、約1,000L〜約2,500L、約1,000L〜約2,000L、約1,000L〜約1,500L、約2,000L〜約25,000L、約2,000L〜約20,000L、約2,000L〜約15,000L、約2,000L〜約10,000L、約2,000L〜約9,500L、約2,000L〜約9,000L、約2,000L〜約8,500L、約2,000L〜約8,000L、約2,000L〜約7,500L、約2,000L〜約7,000L、約2,000L〜約6,500L、約2,000L〜約6,000L、約2,000L〜約5,500L、約2,000L〜約5,000L、約2,000L〜約4,500L、約2,000L〜約4,000L、約2,000L〜約3,500L、約2,000L〜約3,000L、約2,000L〜約2,500L、約3,000L〜約25,000L、約3,000L〜約20,000L、約3,000L〜約15,000L、約3,000L〜約10,000L、約3,000L〜約9,500L、約3,000L〜約9,000L、約3,000L〜約8,500L、約3,000L〜約8,000L、約3,000L〜約7,500L、約3,000L〜約7,000L、約3,000L〜約6,500L、約3,000L〜約6,000L、約3,000L〜約5,500L、約3,000L〜約5,000L、約3,000L〜約4,500L、約3,000L〜約4,000L、約3,000L〜約3,500L、約4,000L〜約9,000L、約4,000L〜約25,000L、約4,000L〜約20,000L、約4,000L〜約15,000L、約4,000L〜約10,000L、約4,000L〜約9,500L、約4,000L〜約9,000L、約4,000L〜約8,500L、約4,000L〜約8,000L、約4,000L〜約7,500L、約4,000L〜約7,000L、約4,000L〜約6,500L、約4,000L〜約6,000L、約4,000L〜約5,500L、約4,000L〜約5,000L、約4,000L〜約4,500L、約5,000L〜約25,000L、約5,000L〜約20,000L、約5,000L〜約15,000L、約5,000L〜約10,000L、約5,000L〜約9,500L、約5,000L〜約9,000L、約5,000L〜約8,500L、約5,000L〜約8,000L、約5,000L〜約7,500L、約5,000L〜約7,000L、約5,000L〜約6,500L、約5,000L〜約6,000L、約5,000L〜約5,500L、約6,000L〜約25,000L、約6,000L〜約20,000L、約6,000L〜約15,000L、約6.000L〜約10,000L、約6,000L〜約9,500L、約6,000L〜約9,000L、約6,000L〜約8,500L、約6,000L〜約8,000L、約6,000L〜約7,500L、約6,000L〜約7,000L、約6,000L〜約6,500L、7,000L〜約25,000L、約7,000L〜約20,000L、約7,000L〜約15,000L、約7,000L〜約10,000L、約7,000L〜約9,500L、約7,000L〜約9,000L、約7,000L〜約8,500L、約7,000L〜約8,000L、約7,000L〜約7,500L、約8,000L〜約25,000L、約8,000L〜約20,000L、約8,000L〜約15,000L、約8,000L〜約10,000L、約8,000L〜約9,500L、約8,000L〜約9,000L、約8,000L〜約8,500L、約9,000L〜約25,000L、約9,000L〜約20,000L、約9,000L〜約15,000L、約9,000L〜約10,000L、約9,000L〜約9,500L、約10,000L〜約25,000L、約10,000L〜約20,000L、約10,000L〜約15,000L、約15,000L〜約25,000L、約15,000L〜約20,000L、または約20,000L〜約25,000L)の内部体積(収容能力)を有する。
本明細書において記載される方法のいくつかは、容器と、該容器内に配置された液体培地(例えば、本明細書において記載される培養培地のいずれか)と、該容器内に配置されたスパージャであって、該スパージャを介して該液体培地中にガスを分配するように構成された複数の孔を含む該スパージャとを含む培養系(例えば、灌流培養系)を使用する。容器は、約24L〜約20,000L(例えば、約24L〜約15,000L、約24L〜約10,000L、約24L〜約9,500L、約24L〜約9,000L、約24L〜約8,500L、約24L〜約8,000L、約24L〜約7,500L、約24L〜約7,000L、約24L〜約6,500L、約24L〜約6,000L、約24L〜約5,500L、約24L〜約5,000L、約24L〜約4,500L、約24L〜約4,000L、約24L〜約3,500L、約24L〜約3,000L、約24L〜約2,500L、約24L〜約2,000L、約24L〜約1,500L、約24L〜約1,000L、約24L〜約900L、約24L〜約800L、約24L〜約700L、約24L〜約600L、約24L〜約500L、約24L〜約400L、約24L〜約300L、約24L〜約200L、約24L〜約100L、約100L〜約20,000L、約100L〜約15,000L、約100L〜約10,000L、約100L〜約9,500L、約100L〜約9,000L、約100L〜約8,500L、約100L〜約8,000L、約100L〜約7,500L、約100L〜約7,000L、約100L〜約6,500L、約100L〜約6,000L、約100L〜約5,500L、約100L〜約5,000L、約100L〜約4,500L、約100L〜約4,000L、約100L〜約3,500L、約100L〜約3,000L、約100L〜約2,500L、約100L〜約2,000L、約100L〜約1,500L、約100L〜約1,000L、約100L〜約900L、約100L〜約800L、約100L〜約700L、約100L〜約600L、約100L〜約500L、約100L〜約400L、約100L〜約300L、約100L〜約200L、約200L〜約20,000L、約200L〜約15,000L、約200L〜約10,000L、約200L〜約9,500L、約200L〜約9,000L、約200L〜約8,500L、約200L〜約8,000L、約200L〜約7,500L、約200L〜約7,000L、約200L〜約6,500L、約200L〜約6,000L、約200L〜約5,500L、約200L〜約5,000L、約200L〜約4,500L、約200L〜約4,000L、約200L〜約3,500L、約200L〜約3,000L、約200L〜約2,500L、約200L〜約2,000L、約200L〜約1,500L、約200L〜約1,000L、約200L〜約900L、約200L〜約800L、約200L〜約700L、約200L〜約600L、約200L〜約500L、約200L〜約400L、約200L〜約300L、約500L〜約20,000L、約500L〜約15,000L、約500L〜約10,000L、約500L〜約9,500L、約500L〜約9,000L、約500L〜約8,500L、約500L〜約8,000L、約500L〜約7,500L、約500L〜約7,000L、約500L〜約6,500L、約500L〜約6,000L、約500L〜約5,500L、約500L〜約5,000L、約500L〜約4,500L、約500L〜約4,000L、約500L〜約3,500L、約500L〜約3,000L、約500L〜約2,500L、約500L〜約2,000L、約500L〜約1,500L、約500L〜約1,000L、約500L〜約900L、約500L〜約800L、約500L〜約700L、約500L〜約600L、約1,000L〜約25,000L、約1,000L〜約20,000L、約1,000L〜約15,000L、約1,000L〜約10,000L、約1,000L〜約9,500L、約1,000L〜約9,000L、約1,000L〜約8,500L、約1,000L〜約8,000L、約1,000L〜約7,500L、約1,000L〜約7,000L、約1,000L〜約6,500L、約1,000L〜約6,000L、約1,000L〜約5,500L、約1,000L〜約5,000L、約1,000L〜約4,500L、約1,000L〜約4,000L、約1,000L〜約3,500L、約1,000L〜約3,000L、約1,000L〜約2,500L、約1,000L〜約2,000L、約1,000L〜約1,500L、約2,000L〜約20,000L、約2,000L〜約15,000L、約2,000L〜約10,000L、約2,000L〜約9,500L、約2,000L〜約9,000L、約2,000L〜約8,500L、約2,000L〜約8,000L、約2,000L〜約7,500L、約2,000L〜約7,000L、約2,000L〜約6,500L、約2,000L〜約6,000L、約2,000L〜約5,500L、約2,000L〜約5,000L、約2,000L〜約4,500L、約2,000L〜約4,000L、約2,000L〜約3,500L、約2,000L〜約3,000L、約2,000L〜約2,500L、約3,000L〜約20,000L、約3,000L〜約15,000L、約3,000L〜約10,000L、約3,000L〜約9,500L、約3,000L〜約9,000L、約3,000L〜約8,500L、約3,000L〜約8,000L、約3,000L〜約7,500L、約3,000L〜約7,000L、約3,000L〜約6,500L、約3,000L〜約6,000L、約3,000L〜約5,500L、約3,000L〜約5,000L、約3,000L〜約4,500L、約3,000L〜約4,000L、約3,000L〜約3,500L、約4,000L〜約20,000L、約4,000L〜約15,000L、約4,000L〜約10,000L、約4,000L〜約9,500L、約4,000L〜約9,000L、約4,000L〜約8,500L、約4,000L〜約8,000L、約4,000L〜約7,500L、約4,000L〜約7,000L、約4,000L〜約6,500L、約4,000L〜約6,000L、約4,000L〜約5,500L、約4,000L〜約5,000L、約4,000L〜約4,500L、約5,000L〜約20,000L、約5,000L〜約15,000L、約5,000L〜約10,000L、約5,000L〜約9,500L、約5,000L〜約9,000L、約5,000L〜約8,500L、約5,000L〜約8,000L、約5,000L〜約7,500L、約5,000L〜約7,000L、約5,000L〜約6,500L、約5,000L〜約6,000L、約5,000L〜約5,500L、約6,000L〜約20,000L、約6,000L〜約10,000L、約6,000L〜約9,500L、約6,000L〜約9,000L、約6,000L〜約8,500L、約6,000L〜約8,000L、約6,000L〜約7,500L、約6,000L〜約7,000L、約6,000L〜約6,500L、約7,000L〜約20,000L、約7,000L〜約15,000L、約7,000L〜約10,000L、約7,000L〜約9,500L、約7,000L〜約9,000L、約7,000L〜約8,500L、約7,000L〜約8,000L、約7,000L〜約7,500L、約8,000L〜約20,000L、約8,000L〜約15,000L、約8,000L〜約10,000L、約8,000L〜約9,500L、約8,000L〜約9,000L、約8,000L〜約8,500L、約9,000L〜約20,000L、約9,000L〜約15,000L、約9,000L〜約10,000L、約9,000L〜約9,500L、約10,000L〜約20,000L、約10,000L〜約15,000L、または約15,000L〜約20,000L)の内部体積(収容能力)を有する。容器は、金属(例えば、ステンレススチール)、プラスチック、もしくはガラス、またはその任意の組み合わせから作られる。
本明細書において記載される方法のいずれかにおいて、培養工程は、灌流培養である。当該技術分野において公知である通り、灌流培養は、バイオリアクターから第1の体積の第1の液体培地を取り出すこと、およびバイオリアクターに第2の体積の第2の液体培地を添加することを含み、第1の体積と第2の体積はほぼ等しい。哺乳類細胞は、ある細胞保持装置により、またはコーン分級器における細胞沈殿のような、技術を介して、バイオリアクターにおいて保持される。
本明細書において記載される方法における培養工程は、流加培養(fed-batch culturing)を含む。当該技術分野において公知である通り、流加培養は、細胞培養物から第1の液体培地を実質的にまたは著しく取り出すことなく、フィード液体培地を開始細胞培養物に増加的または連続的に添加することを含む。いくつかの場合に、フィード液体培地は、第1の液体培地と同じである。フィード培地(feed medium)は、液体形態(フィード液体培地)、または乾燥粉末のいずれかである。他の場合に、フィード液体培地は、第1の液体培地の濃縮された形態であるか、および/または乾燥粉末として添加される。
ポロクサマー−188は、当該技術分野において公知の分子である。ポロクサマー−188は、エチレンオキシドとプロピレンオキシドの非イオン性合成ブロック共重合体である。ポロクサマー−188は、約7680〜約9510の平均子量を有し、その組成の約81.8重量%±1.9重量%は、オキシエチレンにより表される。例えば、ポロクサマー−188は、以下の式I(式中、aは80であり、bは27である)において示される構造を有する。ポロクサマー−188は、9003−11−6のCAS番号を有する。
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約8.0g/L〜約11.2g/L、約8.0g/L〜約11.0g/L、約8.0g/L〜約10.8g/L、約8.0g/L〜約10.6g/L、約8.0g/L〜約10.4g/L、約8.0g/L〜約10.2g/L、約8.0g/L〜約10.0g/L、約8.0g/L〜約9.8g/L、約8.0g/L〜約9.6g/L、約8.0g/L〜約9.4g/L、約8.0g/L〜約9.2g/L、約8.0g/L〜約9.0g/L、約8.5g/L〜約16.0g/L、約8.5g/L〜約15.5g/L、約8.5g/L〜約15.0g/L、約8.5g/L〜約14.5g/L、約8.5g/L〜約14.0g/L、約8.5g/L〜約13.5g/L、約8.5g/L〜約13.0g/L、約8.5g/L〜約12.5g/L、約8.5g/L〜約12.0g/L、約8.5g/L〜約11.5g/L、約8.5g/L〜約11.0g/L、約8.5g/L〜約10.5g/L、約8.5g/L〜約10.0g/L、約8.5g/L〜約9.5g/L、約9.0g/L〜約16.0g/L、約9.0g/L〜約15.5g/L、約9.0g/L〜約15.0g/L、約9.0g/L〜約14.5g/L、約9.0g/L〜約14.0g/L、約9.0g/L〜約13.5g/L、約9.0g/L〜約13.0g/L、約9.0g/L〜約12.5g/L、約9.0g/L〜約12.0g/L、約9.0g/L〜約11.5g/L、約9.0g/L〜約11.0g/L、約9.0g/L〜約10.5g/L、約9.0g/L〜約10.0g/L、約9.5g/L〜約16.0g/L、約9.5g/L〜約15.5g/L、約9.5g/L〜約15.0g/L、約9.5g/L〜約14.5g/L、約9.5g/L〜約14.0g/L、約9.5g/L〜約13.5g/L、約9.5g/L〜約13.0g/L、約9.5g/L〜約12.5g/L、約9.5g/L〜約12.0g/L、約9.5g/L〜約11.5g/L、約9.5g/L〜約11.0g/L、約9.5g/L〜約10.5g/L、約10.0g/L〜約16.0g/L、約10.0g/L〜約15.5g/L、約10.0g/L〜約15.0g/L、約10.0g/L〜約14.5g/L、約10.0g/L〜約14.0g/L、約10.0g/L〜約13.5g/L、約10.0g/L〜約13.0g/L、約10.0g/L〜約12.5g/L、約10.0g/L〜約12.0g/L、約10.0g/L〜約11.5g/L、約10.0g/L〜約11.0g/L、約10.5g/L〜約16.0g/L、約10.5g/L〜約15.5g/L、約10.5g/L〜約15.0g/L、約10.5g/L〜約14.5g/L、約10.5g/L〜約14.0g/L、約10.5g/L〜約13.5g/L、約10.5g/L〜約13.0g/L、約10.5g/L〜約12.5g/L、約10.5g/L〜約12.0g/L、約10.5g/L〜約11.5g/L、約11.0g/L〜約16.0g/L、約11.0g/L〜約15.5g/L、約11.0g/L〜約15.0g/L、約11.0g/L〜約14.5g/L、約11.0g/L〜約14.0g/L、約11.0g/L〜約13.5g/L、約11.0g/L〜約13.0g/L、約11.0g/L〜約12.5g/L、約11.0g/L〜約12.0g/L、約11.5g/L〜約16.0g/L、約11.5g/L〜約15.5g/L、約11.5g/L〜約15.0g/L、約11.5g/L〜約14.5g/L、約11.5g/L〜約14.0g/L、約11.5g/L〜約13.5g/L、約11.5g/L〜約13.0g/L、約11.5g/L〜約12.5g/L、約12.0g/L〜約16.0g/L、約12.0g/L〜約15.5g/L、約12.0g/L〜約15.0g/L、約12.0g/L〜約14.5g/L、約12.0g/L〜約14.0g/L、約12.0g/L〜約13.5g/L、約12.0g/L〜約13.0g/L、約12.5g/L〜約16.0g/L、約12.5g/L〜約15.5g/L、約12.5g/L〜約15.0g/L、約12.5g/L〜約14.5g/L、約12.5g/L〜約14.0g/L、約12.5g/L〜約13.5g/L、約13.0g/L〜約16.0g/L、約13.0g/L〜約15.5g/L、約13.0g/L〜約15.0g/L、約13.0g/L〜約14.5g/L、約13.0g/L〜約14.0g/L、約13.5g/L〜約16.0g/L、約13.5g/L〜約15.5g/L、約13.5g/L〜約15.0g/L、約13.5g/L〜約14.5g/L、約14.0g/L〜約16.0g/L、約14.0g/L〜約15.5g/L、約14.0g/L〜約15.0g/L、約14.5g/L〜約16.0g/L、約14.5g/L〜約15.5g/L、または約15.0g/L〜約16.0g/L)の濃度のポロクサマー−188を含む液体培地において、哺乳類細胞(例えば、組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞)を培養することを含む。
本明細書において記載される方法のいくつかの実施形態は、孔サイズ、孔タイプ、ガス流速、培地中の生細胞密度、および細胞ストレスに関連するマーカーの群から選択される1つまたはそれ以上の因子に基づき選択されるポロクサマー−188濃度を含む液体培地において、哺乳類細胞を培養することを含む。
本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、培地中の生細胞密度に基づき、培地中のポロクサマー−188濃度を経時的に増大させることを含む。例えば、本明細書において記載される方法のいずれかは、培地中の生細胞密度が約20×106細胞/mL〜約60×106細胞/mL(例えば、約20×106細胞/mL〜約58×106細胞/mL、約20×106細胞/mL〜約56×106細胞/mL、約20×106細胞/mL〜約54×106細胞/mL、約20×106細胞/mL〜約52×106細胞/mL、約20×106細胞/mL〜約50×106細胞/mL、約20×106細胞/mL〜約48×106細胞/mL、約20×106細胞/mL〜約46×106細胞/mL、約20×106細胞/mL〜約44×106細胞/mL、約20×106細胞/mL〜約42×106細胞/mL、約20×106細胞/mL〜約40×106細胞/mL、約20×106細胞/mL〜約38×106細胞/mL、約20×106細胞/mL〜約36×106細胞/mL、約20×106細胞/mL〜約34×106細胞/mL、約20×106細胞/mL〜約32×106細胞/mL、約20×106細胞/mL〜約30×106細胞/mL、約20×106細胞/mL〜約28×106細胞/mL、約20×106細胞/mL〜約26×106細胞/mL、約20×106細胞/mL〜約24×106細胞/mL、約20×106細胞/mL〜約22×106細胞/mL、約22×106細胞/mL〜約60×106細胞/mL、約22×106細胞/mL〜約58×106細胞/mL、約22×106細胞/mL〜約56×106細胞/mL、約22×106細胞/mL〜約54×106細胞/mL、約22×106細胞/mL〜約52×106細胞/mL、約22×106細胞/mL〜約50×106細胞/mL、約22×106細胞/mL〜約48×106細胞/mL、約22×106細胞/mL〜約46×106細胞/mL、約22×106細胞/mL〜約44×106細胞/mL、約22×106細胞/mL〜約42×106細胞/mL、約22×106細胞/mL〜約40×106細胞/mL、約22×106細胞/mL〜約38×106細胞/mL、約22×106細胞/mL〜約36×106細胞/mL、約22×106細胞/mL〜約34×106細胞/mL、約22×106細胞/mL〜約32×106細胞/mL、約22×106細胞/mL〜約30×106細胞/mL、約22×106細胞/mL〜約28×106細胞/mL、約22×106細胞/mL〜約26×106細胞/mL、約22×106細胞/mL〜約24×106細胞/mL、約24×106細胞/mL〜約60×106細胞/mL、約24×106細胞/mL〜約58×106細胞/mL、約24×106細胞/mL〜約56×106細胞/mL、約24×106細胞/mL〜約54×106細胞/mL、約24×106細胞/mL〜約52×106細胞/mL、約24×106細胞/mL〜約50×106細胞/mL、約24×106細胞/mL〜約48×106細胞/mL、約24×106細胞/mL〜約46×106細胞/mL、約24×106細胞/mL〜約44×106細胞/mL、約24×106細胞/mL〜約42×106細胞/mL、約24×106細胞/mL〜約40×106細胞/mL、約24×106細胞/mL〜約38×106細胞/mL、約24×106細胞/mL〜約36×106細胞/mL、約24×106細胞/mL〜約34×106細胞/mL、約24×106細胞/mL〜約32×106細胞/mL、約24×106細胞/mL〜約30×106細胞/mL、約24×106細胞/mL〜約28×106細胞/mL、約24×106細胞/mL〜約26×106細胞/mL、約26×106細胞/mL〜約60×106細胞/mL、約26×106細胞/mL〜約58×106細胞/mL、約26×106細胞/mL〜約56×106細胞/mL、約26×106細胞/mL〜約54×106細胞/mL、約26×106細胞/mL〜約52×106細胞/mL、約26×106細胞/mL〜約50×106細胞/mL、約26×106細胞/mL〜約48×106細胞/mL、約26×106細胞/mL〜約46×106細胞/mL、約26×106細胞/mL〜約44×106細胞/mL、約26×106細胞/mL〜約42×106細胞/mL、約26×106細胞/mL〜約40×106細胞/mL、約26×106細胞/mL〜約38×106細胞/mL、約26×106細胞/mL〜約36×106細胞/mL、約26×106細胞/mL〜約34×106細胞/mL、約26×106細胞/mL〜約32×106細胞/mL、約26×106細胞/mL〜約30×106細胞/mL、約26×106細胞/mL〜約28×106細胞/mL、約28×106細胞/mL〜約60×106細胞/mL、約28×106細胞/mL〜約58×106細胞/mL、約28×106細胞/mL〜約56×106細胞/mL、約28×106細胞/mL〜約54×106細胞/mL、約28×106細胞/mL〜約52×106細胞/mL、約28×106細胞/mL〜約50×106細胞/mL、約28×106細胞/mL〜約48×106細胞/mL、約28×106細胞/mL〜約46×106細胞/mL、約28×106細胞/mL〜約44×106細胞/mL、約28×106細胞/mL〜約42×106細胞/mL、約28×106細胞/mL〜約40×106細胞/mL、約28×106細胞/mL〜約38×106細胞/mL、約28×106細胞/mL〜約36×106細胞/mL、約28×106細胞/mL〜約34×106細胞/mL、約28×106細胞/mL〜約32×106細胞/mL、約28×106細胞/mL〜約30×106細胞/mL、約30×106細胞/mL〜約60×106細胞/mL、約30×106細胞/mL〜約58×106細胞/mL、約30×106細胞/mL〜約56×106細胞/mL、約30×106細胞/mL〜約54×106細胞/mL、約30×106細胞/mL〜約52×106細胞/mL、約30×106細胞/mL〜約50×106細胞/mL、約30×106細胞/mL〜約48×106細胞/mL、約30×106細胞/mL〜約46×106細胞/mL、約30×106細胞/mL〜約44×106細胞/mL、約30×106細胞/mL〜約42×106細胞/mL、約30×106細胞/mL〜約40×106細胞/mL、約30×106細胞/mL〜約38×106細胞/mL、約30×106細胞/mL〜約36×106細胞/mL、約30×106細胞/mL〜約34×106細胞/mL、約30×106細胞/mL〜約32×106細胞/mL、約32×106細胞/mL〜約60×106細胞/mL、約32×106細胞/mL〜約58×106細胞/mL、約32×106細胞/mL〜約56×106細胞/mL、約32×106細胞/mL〜約54×106細胞/mL、約32×106細胞/mL〜約52×106細胞/mL、約32×106細胞/mL〜約50×106細胞/mL、約32×106細胞/mL〜約48×106細胞/mL、約32×106細胞/mL〜約46×106細胞/mL、約32×106細胞/mL〜約44×106細胞/mL、約32×106細胞/mL〜約42×106細胞/mL、約32×106細胞/mL〜約40×106細胞/mL、約32×106細胞/mL〜約38×106細胞/mL、約32×106細胞/mL〜約36×106細胞/mL、約32×106細胞/mL〜約34×106細胞/mL、約34×106細胞/mL〜約60×106細胞/mL、約34×106細胞/mL〜約58×106細胞/mL、約34×106細胞/mL〜約56×106細胞/mL、約34×106細胞/mL〜約54×106細胞/mL、約34×106細胞/mL〜約52×106細胞/mL、約34×106細胞/mL〜約50×106細胞/mL、約34×106細胞/mL〜約48×106細胞/mL、約34×106細胞/mL〜約46×106細胞/mL、約34×106細胞/mL〜約44×106細胞/mL、約34×106細胞/mL〜約42×106細胞/mL、約34×106細胞/mL〜約40×106細胞/mL、約34×106細胞/mL〜約38×106細胞/mL、約34×106細胞/mL〜約36×106細胞/mL、約36×106細胞/mL〜約60×106細胞/mL、約36×106細胞/mL〜約58×106細胞/mL、約36×106細胞/mL〜約56×106細胞/mL、
約36×106細胞/mL〜約54×106細胞/mL、約36×106細胞/mL〜約52×106細胞/mL、約36×106細胞/mL〜約50×106細胞/mL、約36×106細胞/mL〜約48×106細胞/mL、約36×106細胞/mL〜約46×106細胞/mL、約36×106細胞/mL〜約44×106細胞/mL、約36×106細胞/mL〜約42×106細胞/mL、約36×106細胞/mL〜約40×106細胞/mL、約36×106細胞/mL〜約38×106細胞/mL、約38×106細胞/mL〜約60×106細胞/mL、約38×106細胞/mL〜約58×106細胞/mL、約38×106細胞/mL〜約56×106細胞/mL、約38×106細胞/mL〜約54×106細胞/mL、約38×106細胞/mL〜約52×106細胞/mL、約38×106細胞/mL〜約50×106細胞/mL、約38×106細胞/mL〜約48×106細胞/mL、約38×106細胞/mL〜約46×106細胞/mL、約38×106細胞/mL〜約44×106細胞/mL、約38×106細胞/mL〜約42×106細胞/mL、約38×106細胞/mL〜約40×106細胞/mL、約40×106細胞/mL〜約60×106細胞/mL、約40×106細胞/mL〜約58×106細胞/mL、約40×106細胞/mL〜約56×106細胞/mL、約40×106細胞/mL〜約54×106細胞/mL、約40×106細胞/mL〜約52×106細胞/mL、約40×106細胞/mL〜約50×106細胞/mL、約40×106細胞/mL〜約48×106細胞/mL、約40×106細胞/mL〜約46×106細胞/mL、約40×106細胞/mL〜約44×106細胞/mL、約40×106細胞/mL〜約42×106細胞/mL、約42×106細胞/mL〜約60×106細胞/mL、約42×106細胞/mL〜約58×106細胞/mL、約42×106細胞/mL〜約56×106細胞/mL、約42×106細胞/mL〜約54×106細胞/mL、約42×106細胞/mL〜約52×106細胞/mL、約42×106細胞/mL〜約50×106細胞/mL、約42×106細胞/mL〜約48×106細胞/mL、約42×106細胞/mL〜約46×106細胞/mL、約42×106細胞/mL〜約44×106細胞/mL、約44×106細胞/mL〜約60×106細胞/mL、約44×106細胞/mL〜約58×106細胞/mL、約44×106細胞/mL〜約56×106細胞/mL、約44×106細胞/mL〜約54×106細胞/mL、約44×106細胞/mL〜約52×106細胞/mL、約44×106細胞/mL〜約50×106細胞/mL、約44×106細胞/mL〜約48×106細胞/mL、約44×106細胞/mL〜約46×106細胞/mL、約46×106細胞/mL〜約60×106細胞/mL、約46×106細胞/mL〜約58×106細胞/mL、約46×106細胞/mL〜約56×106細胞/mL、約46×106細胞/mL〜約54×106細胞/mL、約46×106細胞/mL〜約52×106細胞/mL、約46×106細胞/mL〜約50×106細胞/mL、約46×106細胞/mL〜約48×106細胞/mL、約48×106細胞/mL〜約60×106細胞/mL、約48×106細胞/mL〜約58×106細胞/mL、約48×106細胞/mL〜約56×106細胞/mL、約48×106細胞/mL〜約54×106細胞/mL、約48×106細胞/mL〜約52×106細胞/mL、約48×106細胞/mL〜約50×106細胞/mL、約50×106細胞/mL〜約60×106細胞/mL、約50×106細胞/mL〜約58×106細胞/mL、約50×106細胞/mL〜約56×106細胞/mL、約50×106細胞/mL〜約54×106細胞/mL、約50×106細胞/mL〜約52×106細胞/mL、約52×106細胞/mL〜約60×106細胞/mL、約52×106細胞/mL〜約58×106細胞/mL、約52×106細胞/mL〜約56×106細胞/mL、約52×106細胞/mL〜約54×106細胞/mL、約54×106細胞/mL〜約60×106細胞/mL、約54×106細胞/mL〜約58×106細胞/mL、約54×106細胞/mL〜約56×106細胞/mL、約56×106細胞/mL〜約60×106細胞/mL、約56×106細胞/mL〜約58×106細胞/mL、または約58×106細胞/mL〜約60×106細胞/mL)である場合、培地中のポロクサマー−188濃度を1.8g/Lより高く(例えば、約1.8g/L〜約3.0g/L、約1.8g/L〜約2.9g/L、約1.8g/L〜約2.8g/L、約1.8g/L〜約2.7g/L、約1.8g/L〜約2.5g/L、約1.8g/L〜約2.4g/L、約1.8g/L〜約2.3g/L、約1.8g/L〜約2.2g/L、約1.8g/L〜約2.1g/L、約1.8g/L〜約2.0g/L、約1.9g/L〜約3.0g/L、約1.9g/L〜約2.9g/L、約1.9g/L〜約2.8g/L、約1.9g/L〜約2.7g/L、約1.9g/L〜約2.6g/L、約1.9g/L〜約2.5g/L、約1.9g/L〜約2.4g/L、約1.9g/L〜約2.3g/L、約1.9g/L〜約2.2g/L、約1.9g/L〜約2.1g/L、約2.0g/L〜約3.0g/L、約2.0g/L〜約2.9g/L、約2.0g/L〜約2.8g/L、約2.0g/L〜約2.7g/L、約2.0g/L〜約2.6g/L、約2.0g/L〜約2.5g/L、約2.0g/L〜約2.4g/L、約2.0g/L〜約2.3g/L、約2.0g/L〜約2.2g/L、約2.1g/L〜約3.0g/L、約2.1g/L〜約2.9g/L、約2.1g/L〜約2.8g/L、約2.1g/L〜約2.7g/L、約2.1g/L〜約2.6g/L、約2.1g/L〜約2.5g/L、約2.1g/L〜約2.4g/L、約2.1g/L〜約2.3g/L、約2.2g/L〜約3.0g/L、約2.2g/L〜約2.9g/L、約2.2g/L〜約2.8g/L、約2.2g/L〜約2.7g/L、約2.2g/L〜約2.6g/L、約2.2g/L〜約2.5g/L、約2.2g/L〜約2.4g/L、約2.3g/L〜約3.0g/L、約2.3g/L〜約2.9g/L、約2.3g/L〜約2.8g/L、約2.3g/L〜約2.7g/L、約2.3g/L〜約2.6g/L、約2.3g/L〜約2.5g/L、約2.4g/L〜約3.0g/L、約2.4g/L〜約2.9g/L、約2.4g/L〜約2.8g/L、約2.4g/L〜約2.7g/L、約2.4g/L〜約2.6g/L、約2.5g/L〜約3.0g/L、約2.5g/L〜約2.9g/L、約2.5g/L〜約2.8g/L、約2.5g/L〜約2.7g/L、約2.6g/L〜約3.0g/L、約2.6g/L〜約2.9g/L、約2.6g/L〜約2.8g/L、約2.7g/L〜約3.0g/L、約2.7g/L〜約2.9g/L、または約2.8g/L〜約3.0g/L)まで増大させることを含む。
培地中のポロクサマー−188濃度を約3.0g/L〜約6.0g/L(例えば、約3.0g/L〜約5.9g/L、約3.0g/L〜約5.8g/L、約3.0g/L〜約5.7g/L、約3.0g/L〜約5.6g/L、約3.0g/L〜約5.5g/L、約3.0g/L〜約5.4g/L、約3.0g/L〜約5.3g/L、約3.0g/L〜約5.2g/L、約3.0g/L〜約5.1g/L、約3.0g/L〜約5.0g/L、約3.0g/L〜約4.9g/L、約3.0g/L〜約4.8g/L、約3.0g/L〜約4.7g/L、約3.0g/L〜約4.6g/L、約3.0g/L〜約4.5g/L、約3.0g/L〜約4.4g/L、約3.0g/L〜約4.3g/L、約3.0g/L〜約4.2g/L、約3.0g/L〜約4.1g/L、約3.0g/L〜約4.0g/L、約3.0g/L〜約3.9g/L、約3.0g/L〜約3.8g/L、約3.0g/L〜約3.7g/L、約3.0g/L〜約3.6g/L、約3.0g/L〜約3.5g/L、約3.0g/L〜約3.4g/L、約3.0g/L〜約3.3g/L、約3.0g/L〜約3.2g/L、約3.1g/L〜約6.0g/L、約3.1g/L〜約5.9g/L、約3.1g/L〜約5.8g/L、約3.1g/L〜約5.7g/L、約3.1g/L〜約5.6g/L、約3.1g/L〜約5.5g/L、約3.1g/L〜約5.4g/L、約3.1g/L〜約5.3g/L、約3.1g/L〜約5.2g/L、約3.1g/L〜約5.1g/L、約3.1g/L〜約5.0g/L、約3.1g/L〜約4.9g/L、約3.1g/L〜約4.8g/L、約3.1g/L〜約4.7g/L、約3.1g/L〜約4.6g/L、約3.1g/L〜約4.5g/L、約3.1g/L〜約4.4g/L、約3.1g/L〜約4.3g/L、約3.1g/L〜約4.2g/L、約3.1g/L〜約4.1g/L、約3.1g/L〜約4.0g/L、約3.1g/L〜約3.9g/L、約3.1g/L〜約3.8g/L、約3.1g/L〜約3.7g/L、約3.1g/L〜約3.6g/L、約3.1g/L〜約3.5g/L、約3.1g/L〜約3.4g/L、約3.1g/L〜約3.3g/L、約3.2g/L〜約6.0g/L、約3.2g/L〜約5.9g/L、約3.2g/L〜約5.8g/L、約3.2g/L〜約5.7g/L、約3.2g/L〜約5.6g/L、約3.2g/L〜約5.5g/L、約3.2g/L〜約5.4g/L、約3.2g/L〜約5.3g/L、約3.2g/L〜約5.2g/L、約3.2g/L〜約5.1g/L、約3.2g/L〜約5.0g/L、約3.2g/L〜約4.9g/L、約3.2g/L〜約4.8g/L、約3.2g/L〜約4.7g/L、約3.2g/L〜約4.6g/L、約3.2g/L〜約4.5g/L、約3.2g/L〜約4.4g/L、約3.2g/L〜約4.3g/L、約3.2g/L〜約4.2g/L、約3.2g/L〜約4.1g/L、約3.2g/L〜約4.0g/L、約3.2g/L〜約3.9g/L、約3.2g/L〜約3.8g/L、約3.2g/L〜約3.7g/L、約3.2g/L〜約3.6g/L、約3.2g/L〜約3.5g/L、約3.2g/L〜約3.4g/L、約3.3g/L〜約6.0g/L、約3.3g/L〜約5.9g/L、約3.3g/L〜約5.8g/L、約3.3g/L〜約5.7g/L、約3.3g/L〜約5.6g/L、約3.3g/L〜約5.5g/L、約3.3g/L〜約5.4g/L、約3.3g/L〜約5.3g/L、約3.3g/L〜約5.2g/L、約3.3g/L〜約5.1g/L、約3.3g/L〜約5.0g/L、約3.3g/L〜約4.9g/L、約3.3g/L〜約4.8g/L、約3.3g/L〜約4.7g/L、約3.3g/L〜約4.6g/L、約3.3g/L〜約4.5g/L、約3.3g/L〜約4.4g/L、約3.3g/L〜約4.3g/L、約3.3g/L〜約4.2g/L、約3.3g/L〜約4.1g/L、約3.3g/L〜約4.0g/L、約3.3g/L〜約3.9g/L、約3.3g/L〜約3.8g/L、約3.3g/L〜約3.7g/L、約3.3g/L〜約3.6g/L、約3.3g/L〜約3.5g/L、約3.4g/L〜約6.0g/L、約3.4g/L〜約5.9g/L、約3.4g/L〜約5.8g/L、約3.4g/L〜約5.7g/L、約3.4g/L〜約5.6g/L、約3.4g/L〜約5.5g/L、約3.4g/L〜約5.4g/L、約3.4g/L〜約5.3g/L、約3.4g/L〜約5.2g/L、約3.4g/L〜約5.1g/L、約3.4g/L〜約5.0g/L、約3.4g/L〜約4.9g/L、約3.4g/L〜約4.8g/L、約3.4g/L〜約4.7g/L、約3.4g/L〜約4.6g/L、約3.4g/L〜約4.5g/L、約3.4g/L〜約4.4g/L、約3.4g/L〜約4.3g/L、約3.4g/L〜約4.2g/L、約3.4g/L〜約4.1g/L、約3.4g/L〜約4.0g/L、約3.4g/L〜約3.9g/L、約3.4g/L〜約3.8g/L、約3.4g/L〜約3.7g/L、約3.4g/L〜約3.6g/L、約3.5g/L〜約6.0g/L、約3.5g/L〜約5.9g/L、約3.5g/L〜約5.8g/L、約3.5g/L〜約5.7g/L、約3.5g/L〜約5.6g/L、約3.5g/L〜約5.5g/L、約3.5g/L〜約5.4g/L、約3.5g/L〜約5.3g/L、約3.5g/L〜約5.2g/L、約3.5g/L〜約5.1g/L、約3.5g/L〜約5.0g/L、約3.5g/L〜約4.9g/L、約3.5g/L〜約4.8g/L、約3.5g/L〜約4.7g/L、約3.5g/L〜約4.6g/L、約3.5g/L〜約4.5g/L、約3.5g/L〜約4.4g/L、約3.5g/L〜約4.3g/L、約3.5g/L〜約4.2g/L、約3.5g/L〜約4.1g/L、約3.5g/L〜約4.0g/L、約3.5g/L〜約3.9g/L、約3.5g/L〜約3.8g/L、約3.5g/L〜約3.7g/L、約3.6g/L〜約6.0g/L、約3.6g/L〜約5.9g/L、約3.6g/L〜約5.8g/L、約3.6g/L〜約5.7g/L、約3.6g/L〜約5.6g/L、約3.6g/L〜約5.5g/L、約3.6g/L〜約5.4g/L、約3.6g/L〜約5.3g/L、約3.6g/L〜約5.2g/L、約3.6g/L〜約5.1g/L、約3.6g/L〜約5.0g/L、約3.6g/L〜約4.9g/L、約3.6g/L〜約4.8g/L、約3.6g/L〜約4.7g/L、約3.6g/L〜約4.6g/L、約3.6g/L〜約4.5g/L、約3.6g/L〜約4.4g/L、約3.6g/L〜約4.3g/L、約3.6g/L〜約4.2g/L、約3.6g/L〜約4.1g/L、約3.6g/L〜約4.0g/L、約3.6g/L〜約3.9g/L、約3.6g/L〜約3.8g/L、約3.7g/L〜約6.0g/L、約3.7g/L〜約5.9g/L、約3.7g/L〜約5.8g/L、約3.7g/L〜約5.7g/L、約3.7g/L〜約5.6g/L、約3.7g/L〜約5.5g/L、約3.7g/L〜約5.4g/L、約3.7g/L〜約5.3g/L、約3.7g/L〜約5.2g/L、約3.7g/L〜約5.1g/L、約3.7g/L〜約5.0g/L、約3.7g/L〜約4.9g/L、約3.7g/L〜約4.8g/L、約3.7g/L〜約4.7g/L、約3.7g/L〜約4.6g/L、約3.7g/L〜約4.5g/L、約3.7g/L〜約4.4g/L、約3.7g/L〜約4.3g/L、約3.7g/L〜約4.2g/L、約3.7g/L〜約4.1g/L、約3.7g/L〜約4.0g/L、約3.7g/L〜約3.9g/L、約3.8g/L〜約6.0g/L、約3.8g/L〜約5.9g/L、約3.8g/L〜約5.8g/L、約3.8g/L〜約5.7g/L、約3.8g/L〜約5.6g/L、約3.8g/L〜約5.5g/L、約3.8g/L〜約5.4g/L、約3.8g/L〜約5.3g/L、約3.8g/L〜約5.2g/L、約3.8g/L〜約5.1g/L、約3.8g/L〜約5.0g/L、約3.8g/L〜約4.9g/L、約3.8g/L〜約4.8g/L、約3.8g/L〜約4.7g/L、約3.8g/L〜約4.6g/L、約3.8g/L〜約4.5g/L、約3.8g/L〜約4.4g/L、約3.8g/L〜約4.3g/L、約3.8g/L〜約4.2g/L、約3.8g/L〜約4.1g/L、約3.8g/L〜約4.0g/L、約3.9g/L〜約6.0g/L、約3.9g/L〜約5.9g/L、約3.9g/L〜約5.8g/L、約3.9g/L〜約5.7g/L、約3.9g/L〜約5.6g/L、約3.9g/L〜約5.5g/L、約3.9g/L〜約5.4g/L、約3.9g/L〜約5.3g/L、約3.9g/L〜約5.2g/L、約3.9g/L〜約5.1g/L、約3.9g/L〜約5.0g/L、約3.9g/L〜約4.9g/L、約3.9g/L〜約4.8g/L、約3.9g/L〜約4.7g/L、約3.9g/L〜約4.6g/L、約3.9g/L〜約4.5g/L、約3.9g/L〜約4.4g/L、約3.9g/L〜約4.3g/L、約3.9g/L〜約4.2g/L、約3.9g/L〜約4.1g/L、約4.0g/L〜約6.0g/L、約4.0g/L〜約5.9g/L、約4.0g/L〜約5.8g/L、約4.0g/L〜約5.7g/L、約4.0g/L〜約5.6g/L、約4.0g/L〜約5.5g/L、約4.0g/L〜約5.4g/L、約4.0g/L〜約5.3g/L、約4.0g/L〜約5.2g/L、約4.0g/L〜約5.1g/L、約4.0g/L〜約5.0g/L、約4.0g/L〜約4.9g/L、約4.0g/L〜約4.8g/L、約4.0g/L〜約4.7g/L、約4.0g/L〜約4.6g/L、約4.0g/L〜約4.5g/L、約4.0g/L〜約4.4g/L、約4.0g/L〜約4.3g/L、約4.0g/L〜約4.2g/L、約4.1g/L〜約6.0g/L、約4.1g/L〜約5.9g/L、約4.1g/L〜約5.8g/L、約4.1g/L〜約5.7g/L、約4.1g/L〜約5.6g/L、約4.1g/L〜約5.5g/L、約4.1g/L〜約5.4g/L、約4.1g/L〜約5.3g/L、約4.1g/L〜約5.2g/L、約4.1g/L〜約5.1g/L、約4.1g/L〜約5.0g/L、約4.1g/L〜約4.9g/L、約4.1g/L〜約4.8g/L、約4.1g/L〜約4.7g/L、約4.1g/L〜約4.6g/L、約4.1g/L〜約4.5g/L、約4.1g/L〜約4.4g/L、約4.1g/L〜約4.3g/L、約4.2g/L〜約6.0g/L、約4.2g/L〜約5.9g/L、約4.2g/L〜約5.8g/L、約4.2g/L〜約5.7g/L、約4.2g/L〜約5.6g/L、約4.2g/L〜約5.5g/L、約4.2g/L〜約5.4g/L、約4.2g/L〜約5.3g/L、約4.2g/L〜約5.2g/L、約4.2g/L〜約5.1g/L、約4.2g/L〜約5.0g/L、約4.2g/L〜約4.9g/L、約4.2g/L〜約4.8g/L、約4.2g/L〜約4.7g/L、約4.2g/L〜約4.6g/L、約4.2g/L〜約4.5g/L、約4.2g/L〜約4.4g/L、約4.3g/L〜約6.0g/L、約4.3g/L〜約5.9g/L、約4.3g/L〜約5.8g/L、約4.3g/L〜約5.7g/L、約4.3g/L〜約5.6g/L、約4.3g/L〜約5.5g/L、約4.3g/L〜約5.4g/L、約4.3g/L〜約5.3g/L、約4.3g/L〜約5.2g/L、約4.3g/L〜約5.1g/L、約4.3g/L〜約5.0g/L、約4.3g/L〜約4.9g/L、約4.3g/L〜約4.8g/L、約4.3g/L〜約4.7g/L、約4.3g/L〜約4.6g/L、約4.3g/L〜約4.5g/L、約4.4g/L〜約6.0g/L、約4.4g/L〜約5.9g/L、約4.4g/L〜約5.8g/L、
約4.4g/L〜約5.7g/L、約4.4g/L〜約5.6g/L、約4.4g/L〜約5.5g/L、約4.4g/L〜約5.4g/L、約4.4g/L〜約5.3g/L、約4.4g/L〜約5.2g/L、約4.4g/L〜約5.1g/L、約4.4g/L〜約5.0g/L、約4.4g/L〜約4.9g/L、約4.4g/L〜約4.8g/L、約4.4g/L〜約4.7g/L、約4.4g/L〜約4.6g/L、約4.5g/L〜約6.0g/L、約4.5g/L〜約5.9g/L、約4.5g/L〜約5.8g/L、約4.5g/L〜約5.7g/L、約4.5g/L〜約5.6g/L、約4.5g/L〜約5.5g/L、約4.5g/L〜約5.4g/L、約4.5g/L〜約5.3g/L、約4.5g/L〜約5.2g/L、約4.5g/L〜約5.1g/L、約4.5g/L〜約5.0g/L、約4.5g/L〜約4.9g/L、約4.5g/L〜約4.8g/L、約4.5g/L〜約4.7g/L、約4.6g/L〜約6.0g/L、約4.6g/L〜約5.9g/L、約4.6g/L〜約5.8g/L、約4.6g/L〜約5.7g/L、約4.6g/L〜約5.6g/L、約4.6g/L〜約5.5g/L、約4.6g/L〜約5.4g/L、約4.6g/L〜約5.3g/L、約4.6g/L〜約5.2g/L、約4.6g/L〜約5.1g/L、約4.6g/L〜約5.0g/L、約4.6g/L〜約4.9g/L、約4.6g/L〜約4.8g/L、約4.7g/L〜約6.0g/L、約4.7g/L〜約5.9g/L、約4.7g/L〜約5.8g/L、約4.7g/L〜約5.7g/L、約4.7g/L〜約5.6g/L、約4.7g/L〜約5.5g/L、約4.7g/L〜約5.4g/L、約4.7g/L〜約5.3g/L、約4.7g/L〜約5.2g/L、約4.7g/L〜約5.1g/L、約4.7g/L〜約5.0g/L、約4.7g/L〜約4.9g/L、約4.8g/L〜約6.0g/L、約4.8g/L〜約5.9g/L、約4.8g/L〜約5.8g/L、約4.8g/L〜約5.7g/L、約4.8g/L〜約5.6g/L、約4.8g/L〜約5.5g/L、約4.8g/L〜約5.4g/L、約4.8g/L〜約5.3g/L、約4.8g/L〜約5.2g/L、約4.8g/L〜約5.1g/L、約4.8g/L〜約5.0g/L、約4.9g/L〜約6.0g/L、約4.9g/L〜約5.9g/L、約4.9g/L〜約5.8g/L、約4.9g/L〜約5.7g/L、約4.9g/L〜約5.6g/L、約4.9g/L〜約5.5g/L、約4.9g/L〜約5.4g/L、約4.9g/L〜約5.3g/L、約4.9g/L〜約5.2g/L、約4.9g/L〜約5.1g/L、約5.0g/L〜約6.0g/L、約5.0g/L〜約5.9g/L、約5.0g/L〜約5.8g/L、約5.0g/L〜約5.7g/L、約5.0g/L〜約5.6g/L、約5.0g/L〜約5.5g/L、約5.0g/L〜約5.4g/L、約5.0g/L〜約5.3g/L、約5.0g/L〜約5.2g/L、約5.1g/L〜約6.0g/L、約5.1g/L〜約5.9g/L、約5.1g/L〜約5.8g/L、約5.1g/L〜約5.7g/L、約5.1g/L〜約5.6g/L、約5.1g/L〜約5.5g/L、約5.1g/L〜約5.4g/L、約5.1g/L〜約5.3g/L、約5.2g/L〜約6.0g/L、約5.2g/L〜約5.9g/L、約5.2g/L〜約5.8g/L、約5.2g/L〜約5.7g/L、約5.2g/L〜約5.6g/L、約5.2g/L〜約5.5g/L、約5.2g/L〜約5.4g/L、約5.3g/L〜約6.0g/L、約5.3g/L〜約5.9g/L、約5.3g/L〜約5.8g/L、約5.3g/L〜約5.7g/L、約5.3g/L〜約5.6g/L、約5.3g/L〜約5.5g/L、約5.4g/L〜約6.0g/L、約5.4g/L〜約5.9g/L、約5.4g/L〜約5.8g/L、約5.4g/L〜約5.7g/L、約5.4g/L〜約5.6g/L、約5.5g/L〜約6.0g/L、約5.5g/L〜約5.9g/L、約5.5g/L〜約5.8g/L、約5.5g/L〜約5.7g/L、約5.6g/L〜約6.0g/L、約5.6g/L〜約5.9g/L、約5.6g/L〜約5.8g/L、約5.7g/L〜約6.0g/L、約5.7g/L〜約5.9g/L、または約5.8g/L〜約6.0g/L)まで増大させることを含む。
本明細書において記載される実施形態のいずれかにおいて、液体培地は、消泡剤(例えば、消泡剤−c)を含み、培地中のポロクサマー−188(g/L)に対する消泡剤(g/L)の割合は、約0.5%〜約6.0%(例えば、約0.5%〜約5.5%、約0.5%〜約5.0%、約0.5%〜約4.5%、約0.5%〜約4.0%、約0.5%〜約3.5%、約0.5%〜約3.0%、約0.5%〜約2.5%、約0.5%〜約2.0%、約0.5%〜約1.5%、約0.5%〜約1.0%、約1.0%〜約6.0%、約1.0%〜約5.5%、約1.0%〜約5.0%、約1.0%〜約4.5%、約1.0%〜約4.0%、約1.0%〜約3.5%、約1.0%〜約3.0%、約1.0%〜約2.5%、約1.0%〜約2.0%、約1.0%〜約1.5%、約2.0%〜約6.0%、約2.0%〜約5.5%、約2.0%〜約5.0%、約2.0%〜約4.5%、約2.0%〜約4.0%、約2.0%〜約3.5%、約2.0%〜約3.0%、約2.0%〜約2.5%、約2.5%〜約6.0%、約2.5%〜約5.5%、約2.5%〜約5.0%、約2.5%〜約4.5%、約2.5%〜約4.0%、約2.5%〜約3.5%、約2.5%〜約3.0%、約3.0%〜約6.0%、約3.0%〜約5.5%、約3.0%〜約5.0%、約3.0%〜約4.5%、約3.0%〜約4.0%、約3.0%〜約3.5%、約3.5%〜約6.0%、約3.5%〜約5.5%、約3.5%〜約5.0%、約3.5%〜約4.5%、約3.5%〜約4.0%、約4.0%〜約6.0%、約4.0%〜約5.5%、約4.0%〜約5.0%、約4.0%〜約4.5%、約4.5%〜約6.0%、約4.5%〜約5.5%、約4.5%〜約5.0%、約5.0%〜約6.0%、約5.0%〜約5.5%、または約5.5%〜約6.0%)である。
液体培養培地は、当該技術分野において公知である。液体培養培地(例えば、第1および/もしくは第2の液体培地)は、哺乳類血清(例えば、ウシ胎児血清およびウシ血清)、ならびに/または成長ホルモンもしくは成長因子(例えば、インスリン、トランスフェリン、および上皮成長因子)を付加され得る。あるいは、または加えて、液体培養培地(例えば、第1および/もしくは第2の液体培地)は、既知組成の液体培養培地、動物由来の成分を含まない液体培養培地、無血清の液体培養培地、または血清を含有する液体培養培地であり得る。既知組成の液体培養培地、動物由来の成分を含まない液体培養培地、無血清の液体培養培地、および血清を含有する液体培養培地の非限定的な例が、商業的に入手可能である。
哺乳類細胞の培養の工程は、約31℃〜約40℃の温度にて行われる。当業者は、温度が、例えば、毎時または毎日を基準に、培養工程中の特定の時点で変化されることを理解するだろう。例えば、温度は、細胞(例えば、哺乳類細胞)を有するバイオリアクターの開始播種後、約1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、もしくは約20日もしくはそれ以上にて、変化されるか、またはシフトされる(例えば、増大させる、または低減させる)。例えば、温度は、上向きにシフトされる(例えば、最大もしくは約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または最大もしくは約20℃の変化)。例えば、温度は、下向きにシフトされる(例えば、最大もしくは約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または最大もしくは約20℃)。
本明細書において記載される培養工程は、バイオリアクター中の液体培地を、最大または約15%CO2(例えば、最大もしくは約14%CO2、12%CO2、10%CO2、8%CO2、6%CO2、5%CO2、4%CO2、3%CO2、2%CO2、もしくは最大もしくは約1%CO2)を含有する雰囲気に曝露させることをさらに含む。
本明細書において提供される方法により産生される組み換えタンパク質の非限定的な例は、免疫グロブリン(軽および重鎖免疫グロブリン、抗体、もしくは抗体フラグメント(例えば、本明細書において記載される抗体フラグメントのいずれか)、酵素(例えば、ガラクトシダーゼ(例えば、アルファ−ガラクトシダーゼ)、ミオザイム、もしくはセレザイム)、タンパク質(例えば、ヒトエリスロポエチン、腫瘍壊死因子(TNF)、もしくはインターフェロンアルファもしくはベータ)、または免疫原性もしくは抗原性タンパク質もしくはタンパク質フラグメント(例えば、ワクチンにおいて使用するためのタンパク質)を含む。組み換えタンパク質は、少なくとも1つの多機能組み換えタンパク質スキャフォールドを含有する操作された抗原結合ポリペプチド(例えば、Gebauerら、Current Opin.Chem.Biol.13巻:245〜255頁、2009年;および米国特許出願公開第2012/0164066号(参照により全体として本明細書に組み込まれる)において記載される、組み換え抗原結合タンパク質)である。抗体である組み換えタンパク質の非限定的な例は、パニツムマブ、オマリズマブ、アバゴボマム(abagovomab)、アブシキシマブ、アクトクマブ(actoxumab)、アダリムマブ、アデカツムマブ(adecatumumab)、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ(alacizumab)、アラシズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモバム(altumomab)、アマツキシマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ(anatumomab)、アヌルキンズマブ(anrukinzumab)、アポリズマブ、アルシツモマブ、アチヌマブ(atinumab)、トシリズマブ、バシリジマブ(basilizimab)、ベクツモブ(bectumomab)、ベリムマブ、ベバシズマブ、ベシレソマブ、ベズロトクスマブ(bezlotoxumab)、ビシロマブ(biciromab)、カナキヌマブ、セルトリズマブ、セツキシマブ、シズツムマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、デンスマブ(densumab)、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ(efungumab)、エプラツズマブ、エルツマクソマブ(ertumaxomab)、エタラシズマブ(etaracizumab)、フィギツムマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、イゴボマブ(igovomab)、イマガツズマブ(imgatuzumab)、インフリキシマブ、イノリモマブ、イノツズマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ、モキセツモマブ(moxetumomab)、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ(tralokinumab)、ツコツズマブ(tucotuzumab)、トラスツズマブ、ベルツズマブ、ザルツムマブ、およびザツキシマブ(zatuximab)を含む。本明細書において記載される方法により産生される組み換え抗体のさらなる例は、当該技術分野において公知である。本方法により産生される組み換えタンパク質のさらなる非限定的な例は、アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、アバタセプト、ガルスルファーゼ、ルトロピンアルファ、抗血友病因子、アガルシダーゼベータ、インターフェロンベータ−1a、ダルベポエチンアルファ、テネクテプラーゼ、エタネルセプト、第IX凝固因子、卵胞刺激ホルモン、インターフェロンベータ−1a、イミグルセラーゼ、ドルナーゼアルファ、エポエチンアルファ、インスリンまたはインスリン類似体、メカセルミン、第VIII因子、第VIIa因子、抗トロンビンIII、タンパク質C、ヒトアルブミン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン−11、ラロニダーゼ、イデュルスファーゼ(idursuphase)、ガルスルファーゼ、α−1−プロテアーゼ阻害剤、ラクターゼ、アデノシンデアミナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、サイロトロピンアルファ(例えば、Thyrogen(登録商標))、およびアルテプラーゼを含む。本方法により産生される組み換えタンパク質のさらなる例は、酸性α−グルコシダーゼ、アルグルコシダーゼアルファ(例えば、Myozyme(登録商標)、およびLumizyme(登録商標))、α−L−イズロニダーゼ(例えば、Aldurazyme(登録商標))、イズロン酸スルファターゼ、ヘパランN−スルファターゼ、ガラクトース−6−スルファターゼ、酸性β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、N−アセチルグルコサミン−1−ホスホトランスフェラーゼ、α−N−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、リソソーム酸性セラミダーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、β−グルコシダーゼ(例えば、Cerezyme(登録商標)、およびCeredase(登録商標))、ガラクトシルセラミダーゼ、α−ガラクトシダーゼ−A(例えば、Fabrazyme(登録商標))、酸性β−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ノイラミニダーゼ、ヘキソサミニダーゼA、ならびにヘキソサミニダーゼBを含む。
いくつかの実施形態は、組み換えタンパク質(例えば、本明細書において記載される組み換えタンパク質のいずれか)を収集することをさらに含む。いくつかの例では、収集は、哺乳類細胞を溶解することを含む。他の例では、収集は、組み換えタンパク質を培地(例えば、灌流培養が行われるとき、第1および第2の液体培地の1つもしくは両方、またはバッチ培養が行われるとき、第1の液体培地およびフィード液体培地の1つもしくは両方)から収集することを含む。
本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、組み換えタンパク質(例えば、収集された組み換えタンパク質)を医薬組成物に製剤化する工程をさらに含む。例えば、製剤化は、薬学的に許容し得る賦形剤を組み換えタンパク質(例えば、収集された組み換えタンパク質)に添加することを含む。製剤化は、薬学的に許容し得る賦形剤を組み換えタンパク質(例えば、収集された組み換えタンパク質)と混合することを含む。薬学的に許容し得る賦形剤(例えば、天然に存在しない薬学的に許容し得る賦形剤)の例は、当該技術分野において周知である。いくつかの実施形態において、組み換えタンパク質(例えば、収集された組み換えタンパク質)は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内投与のため製剤化される。
このセットの実験を行い、組み換え抗体をコードする核酸を含有する哺乳類細胞を含む灌流細胞培養物における、細胞成長および組み換え抗体産生に対するポロクサマー−188の増加濃度の効果を試験した。これらの実験において、全培養期間に渡り、1.8g/Lを含有するCD−CHO培地を使用する、第1の灌流細胞培養ラン、および培養期間に渡り、ポロクサマー−188の増加濃度(培養期間に渡り、1.8g/Lから6.8g/Lポロクサマー−188に増大する)を含有するCD−CHO培地を使用した、第2の灌流細胞培養ランを行った。それぞれの細胞培養ランについて、培養の12日〜33日において4リアクター体積(RV)/日の速度で、灌流を行い、培養の33日〜63日において6RV/日の速度にスイッチし、培養の63日〜72日において7RV/日の速度にスイッチした。培養の0日〜14日において1.8g/Lポロクサマー−188を含有するCD−CHO培地、培養の15日〜34日において2.8g/Lポロクサマー−188を含有するCD−CHO培地、培養の35日〜39日において3.8g/Lポロクサマー−188を含有するCD−CHO培地、培養の40日〜56日において4.8g/Lポロクサマー−188を含有するCD−CHO培地、および培養の57日〜72日において5.8g/Lポロクサマー−188を含有するCD−CHO培地を使用して、第2の細胞培養ランを行った。
セットの実験を行い、増加濃度のポロクサマー−188が、細胞培養物からの回収後、清澄化液体培地に存在する組み換えタンパク質の分解を阻害するかどうかを決定した。これらの実験において、培養物が6.8g/Lポロクサマー−188の濃度を達成した後、培養物中のポロクサマー−188濃度を3.95g/Lポロクサマー−188まで低減し、次に、3.0g/Lポロクサマー−188まで再度低減したことを除き、実施例1において記載した第2の灌流細胞培養ランと類似する灌流細胞培養ランを行った。これらの実験において、次の時点:培養物が6.8g/Lポロクサマー−188を含有したときの第1の時点、培養物が3.95g/Lポロクサマー−188の濃度を含有したときの第2の時点、および培養物が3.0g/Lポロクサマー−188の濃度を含有したときの第3の時点で培養物から、液体培地の2または3つのサンプルを取り出した。時点のそれぞれから収集した1つのサンプルを4℃で保存し、時点のそれぞれから収集した1つのサンプルを、4℃での保存の前に室温にて7日間インキュベートし、第2および第3の時点のそれぞれについて、サンプルにポロクサマー−188を付加して、それぞれのサンプルにおける6.8g/Lポロクサマー−188の濃度を達成し、次に、それぞれのサンプルを、4℃での保存の前に室温にて9日間インキュベートした。得られた無処理および処理したサンプルを、4〜20%ビス−トリスゲルに泳動し、クーマシーブルーで染色した。
セットの実験を行い、灌流細胞培養物において有益な成長および生産性特性を達成するのに必要なポロクサマー−188の量に対するスパージャ孔タイプおよびサイズの効果を試験した。これらの実験において、異なるスパージャ:20μmのサイズを有する焼結孔を有するスパージャ(1つのリアクター);200μmのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ(2つのリアクター);または500μmのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ(1つのリアクター)を使用した、異なる灌流細胞培養ランを行った。それぞれの灌流培養は、1.8g/Lポロクサマー−188を含有するCD CHO培地を最初使用し、必要に応じて、細胞生存率を維持し、細胞溶解を最小にするために、漸増量で培養物にポロクサマー−188を添加した。周知の方法を使用して、培養期間中の異なる時点で、それぞれの細胞培養物について、生細胞密度、比成長速度、比乳酸脱水素酵素生産性、生細胞のパーセンテージ、体積測定生産性、および好気性グルコース消費を行った。
さらなるセットの実験を行い、異なる孔タイプおよびサイズを有するスパージャ、ならびに培養物中のポロクサマー−188に対する消泡剤の異なる割合を使用した灌流培養において、一定の状態の細胞成長を決定した(以下の表1において示す)。
セットの実験を行い、ポロクサマー−188に対する消泡剤−cの割合0%、ポロクサマー−188に対する消泡剤−cの割合5.6%、ポロクサマー−188に対する消泡剤−cの割合11.1%、ポロクサマー−188に対する消泡剤−cの割合27.8%、またはポロクサマー−188に対する消泡剤−cの割合55.6%を含有するCD−CHO培地を使用したバッチ振盪フラスコ細胞培養ランにおいて、細胞成長に対するポロクサマー−188に対する消泡剤−cの割合の効果を試験した。振盪フラスコ細胞培養を調節し、泡を受動的に生成させて、バイオリアクターを刺激した。周知の方法を使用して、培養期間に渡るそれぞれの日で、それぞれの細胞培養ランにおける生細胞密度および比乳酸脱水素酵素生産性を決定した。
本発明が、その詳細な説明と結び付けて記載される一方、前述の説明が、添付の請求の範囲により定義される、本発明の範囲を説明し、制限しないことを意図することは、理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の請求項の範囲内である。
Claims (90)
- 哺乳類細胞を培養する方法であって、該方法は、
組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞を、組み換えタンパク質を産生するのに十分な条件下で灌流培養すること
を含み、灌流培養は、1.8g/Lの濃度または1.8g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を含む液体培地において培養することを含み、ポロクサマー−188は、培地に存在する、および/または培養工程の前に培地に添加される、および/または培養工程中に培地に添加される、前記方法。 - 培地は、1.8g/Lの濃度または1.8g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を含む、請求項1に記載の方法。
- 培地は、2.8g/Lの濃度または2.8g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を含む、請求項2に記載の方法。
- 培地は、4.0g/Lの濃度または4.0g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を含む、請求項3に記載の方法。
- 培地は、6.0g/Lの濃度または6.0g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を含む、請求項4に記載の方法。
- 培地は、8.0g/Lの濃度または8.0g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を含む、請求項5に記載の方法。
- 培地は、10.0g/Lの濃度または10.0g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を含む、請求項6に記載の方法。
- 培地は消泡剤をさらに含み、培地中のポロクサマー−188(g/L)に対する消泡剤(g/L)の割合は、液体培地中約0.5%〜約6.0%である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 培地中のポロクサマー−188(g/L)に対する消泡剤(g/L)の割合は、約1.0%〜約5.5%である、請求項8に記載の方法。
- 培地中のポロクサマー−188(g/L)に対する消泡剤(g/L)の割合は、約1.5%〜約5.0%である、請求項9に記載の方法。
- 培養工程の前にポロクサマー−188を培地に添加し、および/または培養工程中にポロクサマー−188を培地に添加して、培地中のポロクサマー−188を1.8g/Lの濃度または1.8g/Lより高い濃度にすることを含む、請求項1に記載の方法。
- ポロクサマー−188は培地に存在する、請求項1または11に記載の方法。
- 培養工程の前にポロクサマー−188を培地に添加し、および/または培養工程中にポロクサマー−188を培地に添加して、培地中のポロクサマー−188を2.8g/Lの濃度または2.8g/Lより高い濃度にすることを含む、請求項11または12に記載の方法。
- 培養工程の前にポロクサマー−188を培地に添加し、および/または培養工程中にポロクサマー−188を培地に添加して、培地中のポロクサマー−188を4.0g/Lの濃度または4.0g/Lより高い濃度にすることを含む、請求項13に記載の方法。
- 培養工程の前にポロクサマー−188を培地に添加し、および/または培養工程中にポロクサマー−188を培地に添加して、培地中のポロクサマー−188を6.0g/Lの濃度または6.0g/Lより高い濃度にすることを含む、請求項14に記載の方法。
- 培養工程の前にポロクサマー−188を培地に添加し、および/または培養工程中にポロクサマー−188を培地に添加して、培地中のポロクサマー−188を8.0g/Lの濃度または8.0g/Lより高い濃度にすることを含む、請求項15に記載の方法。
- 培養工程の前にポロクサマー−188を培地に添加し、および/または培養工程中にポロクサマー−188を培地に添加して、培地中のポロクサマー−188を10.0g/Lの濃度または10.0g/Lより高い濃度にすることを含む、請求項16に記載の方法。
- 培地中のポロクサマー−188濃度を経時的に増大させることを含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 培地中のポロクサマー−188濃度を経時的に増大させることは、培地中の生細胞密度に基づく、請求項18に記載の方法。
- 培地中の生細胞密度が約35×106細胞/mL〜約60×106細胞/mLである場合、培地中のポロクサマー−188濃度を1.8g/Lより高くまで増大させることを含む、請求項19に記載の方法。
- 培地中の生細胞密度が約35×106細胞/mL〜約60×106細胞/mLである場合、培地中のポロクサマー−188濃度を約1.8g/L〜約3.0g/Lまで増大させることを含む、請求項20に記載の方法。
- 培地中の生細胞密度が約35×106〜約60×106細胞/mLである場合、該培地中のポロクサマー−188濃度を約2.3g/L〜約3.0g/Lまで増大させることを含む、請求項21に記載の方法。
- 培地中の生細胞密度が約60×106細胞/mL〜約90×106細胞/mLである場合、該培地中のポロクサマー−188濃度を3.0g/Lより高くまで増大させることを含む、請求項19〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 培地中の生細胞密度が約60×106細胞/mL〜約90×106細胞/mLである場合、該培地中のポロクサマー−188濃度を約3.0g/L〜約6.0g/Lまで増大させることを含む、請求項23に記載の方法。
- 培地中の生細胞密度が約60×106細胞/mL〜約90×106細胞/mLである場合、該培地中のポロクサマー−188濃度を約3.6g/L〜約6.0g/Lまで増大させることを含む、請求項24に記載の方法。
- 培地中の生細胞密度が90×106細胞/mLより高い場合、該培地中のポロクサマー−188濃度を6.0g/Lより高くまで増大させることを含む、請求項19〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 培地中の生細胞密度が90×106細胞/mLより高い場合、該培地中のポロクサマー−188濃度を7.0g/Lより高くまで増大させることを含む、請求項26に記載の方法。
- 培地中の生細胞密度が90×106細胞/mLより高い場合、該培地中のポロクサマー−188濃度を8.0g/Lより高くまで増大させることを含む、請求項27に記載の方法。
- 培地中の生細胞密度が90×106細胞/mLより高い場合、培地中のポロクサマー−188濃度を10.0g/Lより高くまで増大させることを含む、請求項28に記載の方法。
- 培地中の生細胞密度が約35×106細胞/mL〜約60×106細胞/mLである場合、培地中のポロクサマー−188濃度を約1.8g/L〜約3.0g/Lまで増大させること;
培地中の生細胞濃度密度が約60×106細胞/mL〜約90×106細胞/mLである場合、該培地中のポロクサマー−188濃度を約3.0g/L〜約6.0g/Lまで増大させること;および
培地中の生細胞密度濃度が90×106細胞/mLより高い場合、培地中のポロクサマー−188濃度を6.0g/Lより高くまで増大させること
を含む、請求項19に記載の方法。 - 培養中の1つまたはそれ以上の時点で培地中の生細胞密度を決定することをさらに含む、請求項19〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 灌流培養は、
第1の液体培地において配置された哺乳類細胞を含む容器を用意すること;
該容器を撹拌しながら、少なくとも約7日の培養期間、温度約32℃〜約40℃でインキュベートすること;および
培養期間の最初の48〜96時間後、連続的または定期的に、第1の体積の該第1の液体培地を取り出し、該第1の液体培地に第2の体積の第2の液体培地を添加することを含み、該第1および第2の体積がほぼ等しい、
請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法。 - 第2の液体培地は、第1の液体培地中の濃度より高い濃度のポロクサマー−188を含む、請求項32に記載の方法。
- 第1の液体培地は、1.8g/Lの濃度または1.8g/L未満の濃度のポロクサマー−188を含み、第2の液体培地は、1.8g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を含む、請求項32に記載の方法。
- 第2の液体培地は、2.8g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を含む、請求項34に記載の方法。
- 第2の液体培地は、4.0g/Lポロクサマー−188より高い濃度のポロクサマー−188を含む、請求項35に記載の方法。
- 第2の液体培地は、6.0g/Lポロクサマー−188より高い濃度のポロクサマー−188を含む、請求項36に記載の方法。
- 第2の液体培地は、8.0g/Lポロクサマー−188より高い濃度のポロクサマー−188を含む、請求項37に記載の方法。
- 第2の液体培地は、10.0g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を含む、請求項38に記載の方法。
- 第1の液体培地に第2の体積の第2の液体培地を添加する前または後に、該第2の液体培地にポロクサマー−188を添加して、第2の培地中のポロクサマー−188を1.8g/Lの濃度または1.8g/Lより高い濃度にすることを含む、請求項32に記載の方法。
- 第2の液体培地へのポロクサマー−188の添加は、第2の培地中のポロクサマー−188を2.8g/Lより高い濃度にする、請求項40に記載の方法。
- 第2の液体培地へのポロクサマー−188の添加は、第2の培地中のポロクサマー−188を4.0g/Lより高い濃度にする、請求項41に記載の方法。
- 第2の液体培地へのポロクサマー−188の添加は、第2の培地中のポロクサマー−188を6.0g/Lより高い濃度にする、請求項42に記載の方法。
- 第2の液体培地へのポロクサマー−188の添加は、第2の培地中のポロクサマー−188を8.0g/Lより高い濃度にする、請求項43に記載の方法。
- 第2の液体培地へのポロクサマー−188の添加は、第2の培地中のポロクサマー−188を10.0g/Lより高い濃度にする、請求項44に記載の方法。
- 組み換えタンパク質を哺乳類細胞から、第1の液体培地、もしくは第2の液体培地、またはその任意の組み合わせから収集すること
をさらに含む、請求項32〜45のいずれか1項に記載の方法。 - 収集された組み換えタンパク質を医薬組成物に製剤化することをさらに含む、請求項46に記載の方法。
- 収集は、培養が30×106細胞/mLより高い生細胞密度を達成した後、行われる、請求項46に記載の方法。
- 収集は、培養が50×106細胞/mLより高い生細胞密度を達成した後、行われる、請求項48に記載の方法。
- 収集は、培養が100×106細胞/mLより高い生細胞密度を達成した後、行われる、請求項49に記載の方法。
- 収集は、培養が150×106細胞/mLより高い生細胞密度を達成した後、行われる、請求項50に記載の方法。
- 収集は、培養が200×106細胞/mLより高い生細胞密度を達成した後、行われる、請求項51に記載の方法。
- 哺乳類細胞を培養する方法であって、該方法は、
容器と、該容器内に配置された液体培地と、該容器内に配置されたスパージャであって、該スパージャを介して該液体培地中にガスを分配するように構成された複数の孔を含む該スパージャとを含む培養系を用意すること;ならびに
培養系において組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞を、系において組み換えタンパク質を産生するのに十分な条件およびガス流速下で灌流培養すること
を含み、培地は、孔サイズ、孔タイプ、ガス流速、培地中の生細胞密度、および細胞ストレスに関連するマーカーからなる群から選択される1つまたはそれ以上の因子に基づき選択されるポロクサマー−188濃度を含む、前記方法。 - 選択されたポロクサマー−188濃度は、培養工程の前にポロクサマー−188を培地に添加すること、および/または培養工程中にポロクサマー−188を培地に添加することにより達成される、請求項53に記載の方法。
- 因子は孔タイプであり、孔タイプは、焼結孔またはドリル孔である、請求項53または54に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約750μm〜約1.5mmである場合は、約2.3g/L〜約3.3g/Lの濃度のポロクサマー−188を選択することを含む、請求項53に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約900μm〜約1.1mmである場合は、約2.5g/L〜約3.1g/Lの濃度のポロクサマー−188を選択することを含む、請求項56に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約250μm〜約750μmである場合は、約3.3g/L〜約4.3g/Lの濃度のポロクサマー−188を選択することを含む、請求項53に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約400μm〜約600μmである場合は、約3.5g/L〜約4.1g/Lの濃度のポロクサマー−188を選択することを含む、請求項58に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約1μm〜約250μmである場合は、4.3g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を選択することを含む、請求項53に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約1μm〜約200μmである場合は、4.3g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を選択することを含む、請求項60に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約160μm〜約190μmである場合は、4.3g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を選択することを含む、請求項61に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約170μm〜約180μmである場合は、4.3g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を選択することを含む、請求項62に記載の方法。
- 5.0g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を選択することを含む、請求項60〜63のいずれか1項に記載の方法。
- 6.0g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を選択することを含む、請求項64に記載の方法。
- 8.0g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を選択することを含む、請求項65に記載の方法。
- 10.0g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を選択することを含む、請求項66に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが150μmより大きい場合は、約1.8g/L〜約3.3g/Lの濃度のポロクサマー−188を選択することを含む、請求項53に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが約80μm〜約150μmである場合は、約3.3g/L〜約4.3g/Lの濃度のポロクサマー−188を選択することを含む、請求項68に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが約90μm〜約110μmである場合は、約3.5g/L〜約4.1g/Lの濃度のポロクサマー−188を選択することを含む、請求項69に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが約1μm〜約80μmである場合は、4.5g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を選択することを含む、請求項53に記載の方法。
- 5.0g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を選択することを含む、請求項71に記載の方法。
- 6.0g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を選択することを含む、請求項72に記載の方法。
- 8.0g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を選択することを含む、請求項73に記載の方法。
- 10.0g/Lより高い濃度のポロクサマー−188を選択することを含む、請求項74に記載の方法。
- 灌流培養は、
第1の液体培地を含む培養系を撹拌しながら、少なくとも約7日の培養期間、温度約32℃〜約40℃でインキュベートすること;および
培養期間の最初の48〜96時間後、連続的または定期的に、第1の体積の第1の液体培地を取り出し、第1の液体培地に第2の体積の第2の液体培地を添加すること
を含む、請求項53〜75のいずれか1項に記載の方法。 - 第2の液体培地は、第1の液体培地中のポロクサマー−188の濃度より高い濃度のポロクサマー−188を含む、請求項76に記載の方法。
- 第2の培地は、選択されたポロクサマー−188濃度を含む、請求項76または77に記載の方法。
- 組み換えタンパク質を哺乳類細胞の内部から、第1の液体培地、もしくは第2の液体培地、またはその任意の組み合わせから収集すること
をさらに含む、請求項76〜78のいずれか1項に記載の方法。 - 収集された組み換えタンパク質を医薬組成物に製剤化することをさらに含む、請求項79に記載の方法。
- 容器は灌流バイオリアクターである、請求項32または53に記載の方法。
- 灌流バイオリアクターは、約1.5L〜約25,000Lの体積を有する、請求項81に記載の方法。
- 培養期間は10日より長い、請求項32または53に記載の方法。
- (c)における、第1の体積の第1の液体培地を取り出し、第2の体積の第2の液体培地を添加することは、連続的に行われる、請求項32または53に記載の方法。
- (c)における、第1の体積の第1の液体培地を取り出し、第2の体積の第2の液体培地を添加することは、定期的に行われる、請求項32または53に記載の方法。
- (c)における、取り出された第1の液体培地の第1の体積、および添加された第2の液体培地の第2の体積は、経時的に増大される、請求項32または53に記載の方法。
- 第1の液体培地および/または第2の液体培地は、既知組成の液体培養培地、無血清の液体培養培地、血清を含有する液体培養培地、動物由来の成分を含まない液体培養培地、およびタンパク質を含まない培地からなる群から選択される、請求項32または53に記載の方法。
- およそ最初の48〜96時間の時間後、それぞれ24時間の期間において、(c)における、取り出された第1の液体培地の第1の体積、および添加された第2の液体培地の第2の体積は、該第1の液体培地の体積、または容器の体積の約0.3×〜約10×である、請求項32または53に記載の方法。
- 哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞、NSO細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、PerC6細胞、Vero細胞、またはHT−1080細胞株である、請求項1〜88のいずれか1項に記載の方法。
- 組み換えタンパク質は、免疫グロブリン、酵素、成長因子、タンパク質フラグメント、または操作されたタンパク質である、請求項1〜89のいずれか1項に記載の方法。
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TORDAHL, K. ET AL: "Study of a perfusion process of Chinese Hamster Ovary cells by ATF filtration in bioreactor", KTH VETENSKAP OCH KONST, JPN6019045920, 2009, ISSN: 0004291607 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2021515584A (ja) * | 2018-03-16 | 2021-06-24 | ジェンザイム・コーポレーション | 産生バイオリアクターにおける細胞生存度を改善するための方法 |
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