TWI751103B - 培養哺乳動物細胞之方法 - Google Patents
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Abstract
本案提供在液體培養基中培養哺乳動物細胞的方法，所述液體培養基包含濃度為1.8g/L或濃度高於1.8g/L的poloxamer-188或者所述液體培養基中的包含的poloxamer-188濃度基於選自下組的一個或多個因素選擇：孔徑、孔類型、氣體流速、培養基中的活細胞密度和涉及細胞應激的標記物。
Description
此申請要求要求2014年12月22日提交的美國臨時專利申請序列號62/095,734的優先權，其全部內容併入本文。
此發明涉及生物技術和製造重組蛋白的方法。
含有編碼重組蛋白的核酸的哺乳動物細胞常常用於產生治療上或商業上重要的蛋白。在多樣化的產品管線的目前環境中，生物技術公司越來越多地被驅動以開發用於高度靈活且具有成本效益地生產治療性蛋白藥物質的創新解決方案。
本發明基於，至少部分基於，如下發現：包括編碼重組蛋白的核酸的哺乳動物細胞在包含濃度為1.8或濃度高於1.8g/L的poloxamer-188(例如，大於2.0g/L，大於2.5g/L，大於3.0g/L，大於3.5g/L，大於4.0g/L，大於4.5g/L，大於5.0g/L，大於5.5g/L，大於6.0g/L，大於6.5g/L，或大於7.0g/L poloxamer-188)的培養基中存活且增殖，從而以poloxamer-188與消泡劑的特定比例實現最佳細胞生長，從而通過增加細胞培養物中的poloxamer-188濃度作為活細胞密度的函數來實現高細胞密度，且從而將最佳的poloxamer-188濃度添加至細胞培養物以促進細胞增殖，這取決於來自下組的一個或多個因素：孔徑、孔類型、氣體流速、培養基中的活細胞密度、和涉及細胞應激(cell stress)的標記(markers)。
本案中提供的是培養哺乳動物細胞的方法，其包括：在足夠產生重組蛋白的條件下灌注培養包含編碼所述重組蛋白的核酸的哺乳動物細胞，其中灌注培養包括在包含濃度為1.8g/L或濃度高於1.8g/L的poloxamer-188的液體培養基中培養，且其中所述poloxamer-188在培養步驟前存在於所述培養基中和/或添加至所述培養基和/或在培養步驟過程中添加至所述培養基。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述培養基包含濃度為1.8g/L或濃度高於1.8g/L(例如，濃度為2.8g/L或濃度高於2.8g/L，濃度為4.0g/L或濃度高於4.0g/L，濃度為6.0g/L或濃度高於6.0g/L，濃度為8.0g/L或濃度高於8.0g/L，或者濃度為10.0g/L或濃度高於10.0g/L)的poloxamer-188。
在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述培養基還包含消泡劑且所述培養基中消泡劑(g/L)與poloxamer-188(g/L)的比例為所述液體培養基中約0.5%至約6.0%(例如，約1.0%至約5.5%，或約1.5%至約5.0%)。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述方法包括在培養步驟前將poloxamer-188添加至所述培養基和/或在培養步驟過程中將poloxamer-188添加至所述培養基以在所述培養基中提供濃度為1.8g/L或濃度高於1.8g/L的poloxamer-188。在本案提供的任何方法的一些實施方案中，poloxamer-188存在於所述培養基中。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述方法包括在培養步驟前將poloxamer-188添加至所述培養基和/或在培養步驟過程中將poloxamer-188添加至所述培養基以在所述培養基中提供濃度為2.8g/L或濃度高於2.8g/L(例如，濃度為4.0g/L或濃度為大於4.0g/L，濃度為6.0g/L或濃度高於6.0g/L，濃度為8.0g/L或濃度高於8.0g/L，或者濃度為10.0g/L或濃度高於10.0g/L)的poloxamer-188。
在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述方法包括將培養基中的poloxamer-188濃度隨時間增加。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，將培養基中的poloxamer-188濃度隨時間增加是基於所述培養基中的活細胞密度。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述方法包括當所述培養基中的活細胞密度為約35 x 106細胞/mL至約60 x 106細胞/mL時，將培養基中的poloxamer-188濃度增加到大於1.8g/L(例如，約1.8g/L至約3.0g/L，或約2.3g/L至約3.0g/L)。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述方法包括當所述培養基中的活細胞密度為約60 x 106細胞/mL至約90 x 106細胞/mL時，將培養基中的poloxamer-188濃度增加到大於3.0g/L(例如，約3.0g/L至約6.0g/L，或約3.6
g/L至約6.0g/L)。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述方法包括當所述培養基中的活細胞密度為大於90 x 106細胞/mL時，將培養基中的poloxamer-188濃度增加到大於6.0g/L(例如，大於7.0g/L，大於8.0g/L，或大於10.0g/L)。本案所述的任何方法的一些實施方案包括：當所述培養基中的活細胞密度為約35 x 106細胞/mL至約60 x 106細胞/mL時，將培養基中的poloxamer-188濃度增加到約1.8g/L至約3.0g/L；當所述培養基中的活細胞密度為約60 x 106細胞/mL至約90 x 106細胞/mL時，將培養基中的poloxamer-188濃度增加到約3.0g/L至約6.0g/L；並且當所述培養基中的活細胞密度為大於90 x 106細胞/mL時，將培養基中的poloxamer-188濃度增加到大於6.0g/L。本案所述的任何方法的一些實施方案還包括在培養過程中在一個或多個時間點確定所述培養基中的活細胞密度。
在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述灌注培養包括：提供包含配置於第一液體培養基中的哺乳動物細胞的容器；攪動溫育所述容器並在約32℃至約40℃的溫度進行至少約7天的培養期；和在培養期的首個48至96小時後連續地或周期地移出第一體積的第一液體培養基並向第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基，其中第一和第二體積是大約相等的。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，第二液體培養基以高於第一液體培養基中的濃度包含poloxamer-188。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，第一液體培養基包含濃度為1.8g/L或濃度低於1.8g/L的poloxamer-188，且第二液體培養基包含濃度高於1.8g/L(例如，濃度高於2.8g/L，濃度高於4.0g/L，濃度高於6.0g/L，濃度高於8.0g/L，或濃度高於10.0g/L)的poloxamer-188。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述方法包括在將第二體積的第二液體培養基添加至第一液體培養基之前或之後，將poloxamer-188添加至第二液體培養基以在所述第二培養基中提供濃度為1.8g/L或濃度高於1.8g/L(例如，濃度高於2.8g/L，濃度高於4.0g/L，濃度高於6.0g/L，濃度高於8.0g/L，或濃度高於10.0g/L)的poloxamer-188。
本案所述的任何方法的一些實施方案還包括：從哺乳動物細胞、從第一液體培養基或第二液體培養基，或其任何組合收集重組蛋白。本案所述的任何方法的一些實施方案還包括將收集的重組蛋白配製成藥物組合物。在本案所述的
任何方法的一些實施方案中，在培養實現大於30 x 106細胞/mL(例如，大於50 x 106細胞/mL，大於100 x 106細胞/mL，大於150 x 106細胞/mL，或大於200 x 106細胞/mL)的活細胞密度後進行收集。
本案中還提供的是培養哺乳動物細胞的方法，其包括：提供培養系統，其包含容器、配置於所述容器內的液體培養基和配置在所述容器內的噴霧器，所述噴霧器包含多個孔，所述孔經配置以將氣體通過所述噴霧器分配入所述液體培養基；和在所述培養系統中在足夠在該系統中產生重組蛋白的條件和氣體流速下灌注培養包含編碼所述重組蛋白的核酸的哺乳動物細胞，其中所述培養基包含的poloxamer-188濃度基於選自下組的一個或多個因素選擇：孔徑、孔類型、氣體流速、培養基中的活細胞密度和涉及細胞應激的標記物。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述選擇的poloxamer-188濃度通過如下實現：在培養步驟前將poloxamer-188添加至所述培養基和/或在所述培養步驟過程中將poloxamer-188添加至所述培養基。
在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述因素為孔類型且所述孔類型是燒結孔或鑽孔。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述方法包括當所述孔類型為鑽孔且所述孔徑為約750μm至約1.5mm時，基於孔類型和孔徑選擇濃度為約2.3g/L至約3.3g/L的poloxamer-188，或當所述孔類型為鑽孔且所述孔徑為約900μm至約1.1mm時，基於孔類型和孔徑選擇濃度為約2.5g/L至約3.1g/L的poloxamer-188。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述方法包括當所述孔類型為鑽孔且所述孔徑為約250μm至約750μm時，基於孔類型和孔徑選擇濃度為約3.3g/L至約4.3g/L的poloxamer-188，或當所述孔類型為鑽孔且所述孔徑為約400μm至約600μm時，基於孔類型和孔徑選擇濃度為約3.5g/L至約4.1g/L的poloxamer-188。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述方法包括當所述孔類型為鑽孔且所述孔徑為1μm至約250μm(例如，約1μm至約200μm，約160μm至約190μm，或約170μm至約180μm)時，基於孔類型和孔徑選擇濃度高於4.3g/L(例如，濃度高於5.0g/L，濃度高於6.0g/L，濃度高於8.0g/L，或濃度高於10.0g/L)的poloxamer-188。
在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述方法包括當所述孔類型為燒結孔且所述孔徑為大於150μm時，基於孔類型和孔徑選擇濃度為約1.8g/L至約3.3g/L的poloxamer-188。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述方
法包括當所述孔類型為燒結孔且所述孔徑為約80μm至約150μm時，基於孔類型和孔徑選擇濃度為約3.3g/L至約4.3g/L的poloxamer-188，或當所述孔類型為燒結孔且所述孔徑為約90μm至約110μm時，基於孔類型和孔徑選擇濃度為約3.5g/L至約4.1g/L的poloxamer-188。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述方法包括當所述孔類型為燒結孔且所述孔徑為約1μm至約80μm時，基於孔類型和孔徑選擇濃度高於4.5g/L(例如，濃度高於5.0g/L，濃度高於6.0g/L，濃度高於8.0g/L，或濃度高於10.0g/L)的poloxamer-188。
在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述灌注培養包括：在攪拌下溫育包含第一液體培養基的培養系統且在約32℃至約40℃的溫度進行至少約7天的培養期；並在培養期的首個48至96小時之後，連續地或周期地移出第一體積的第一液體培養基並向第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，第二液體培養基以高於第一液體培養基中poloxamer-188的濃度包含poloxamer-188。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述第二培養基包含選擇的poloxamer-188濃度。
本案所述的任何方法的一些實施方案還包括：從哺乳動物細胞的內部、從第一液體培養基或第二液體培養基，或其任何組合收集重組蛋白。本案所述的任何方法的一些實施方案還包括將所述收集的重組蛋白配製成藥物組合物。
在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述容器是灌注生物反應器。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述灌注生物反應器具有約1.5L至約25,000L的體積。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述培養期是大於10天。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，(c)中添加第二體積的第二液體培養基和移出第一體積的第一液體培養基是連續進行的。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，(c)中添加第二體積的第二液體培養基和移出第一體積的第一液體培養基是周期進行的。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，(c)中添加的第二體積的第二液體培養基和移出的第一體積的第一液體培養基隨時間增加。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，第一液體培養基和/或第二液體培養基選自下組：化學成分確定的液體培養基、無血清液體培養基、含有血清的液體培養基、無動物衍生組分的液體培養基、和無蛋白的培養基。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，在時間期的約首個48至96小時後，在每24-小時時間中，(c)中添加的第二體積的第二液體培養基和移出的第一體積的
第一液體培養基為第一液體培養基體積或容器體積的約0.3x至約10x。
在本案所述的任何方法的一些實施方案中，所述哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人胚胎腎(HEK)細胞、NSO細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、PerC6細胞、Vero細胞、或HT-1080細胞系。在本案所述的任何方法的一些實施方案中，重組蛋白為免疫球蛋白、酶、生長因子、蛋白片段、或工程改造的蛋白。
如本案中使用的，名詞之前的單字“a”代表一個或多個特定的名詞。例如，短語“哺乳動物細胞”代表“一個或多個哺乳動物細胞”。
術語“哺乳動物細胞”意指來自或源自任何哺乳動物(例如，人、倉鼠、小鼠、綠猴、大鼠、豬、牛、或兔)的任何細胞。例如，哺乳動物細胞可為無限增殖化細胞(immortalized cell)。在一些實施方案中，哺乳動物細胞是分化的或未分化的細胞。哺乳動物細胞的非限制性實例在本案中描述。哺乳動物細胞的其他實例是本領域已知的。
術語“培養”或“細胞培養”意指哺乳動物細胞在受控的物理條件組下的維持或增殖。
術語“哺乳動物細胞的培養物”、“培養物”或“細胞培養物”意指含有多種哺乳動物細胞的液體培養基，所述哺乳動物細胞在受控的物理條件組下維持或增殖。
術語“液體培養基(liquid culture medium)”或“液體培養基(liquid medium)”意指包含足夠營養物以允許細胞(例如，哺乳動物細胞)在體外生長或增殖的流體。例如，液體培養基可包含如下的一種或多種：胺基酸(例如，20種胺基酸)、嘌呤(例如，次黃嘌呤)、嘧啶(例如，胸苷)、膽堿、肌醇、硫胺素、葉酸、生物素、鈣、煙醯胺、吡哆素、核黃素、胸苷、氰鈷胺素、丙酮酸、硫辛酸、鎂、葡萄糖、鈉、鉀、鐵、銅、鋅和碳酸氫鈉。在一些實施方案中，液體培養基可包含來自哺乳動物的血清。在一些實施方案中，液體培養基不包含來自哺乳動物的血清或另外的提取物(成分確定的液體培養基)。在一些實施方案中，液體培養基可包含痕量金屬、哺乳動物生長激素、和/或哺乳動物生長因子。液體培養基的另外的實例是基本培養基(例如，僅含有無機鹽、碳源和水的培養基)。液體培養基的非限制性實例在本案中描述。液體培養基的其他實例是本領域已知的且為商業上可得到的。液體培養基可包含任何密度的哺乳動物細胞。例如，如本案中使用的，從生物反應器移出的一定體積的液體培養基可為基本上無哺乳動物細胞。
術語“無動物衍生組分的液體培養基”意指不含有任何源自哺乳動物的組分(例如，蛋白或血清)的液體培養基。
術語“無血清液體培養基”意指不含有哺乳動物血清的液體培養基。
術語“含血清液體培養基”意指含有哺乳動物血清的液體培養基。
術語“化學成分確定的液體培養基”是本領域的術語並意指液體培養基，其中所有化學組分都是已知的。例如，化學成分確定的液體培養基不含有胎牛血清、牛血清白蛋白、或人血清白蛋白，因為這些制備物通常含有白蛋白和脂質的複雜混合物。
術語“無蛋白液體培養基”已知不含有任何蛋白質(例如，任何可檢測的蛋白質)的液體培養基。
術語“攪拌”已知攪動或以其他方式移動容器中液體培養基的部分。進行此從而，例如，增加生物反應器中液體培養基中的溶解O2濃度。可使用任何本領域已知的方法，例如，工具或螺旋槳(propellor)來進行攪拌。可用於在生物反應器中進行液體培養基的部分的攪拌的例示性裝置和方法是本領域已知的。
術語“免疫球蛋白”意指多肽，其含有免疫球蛋白蛋白的至少15個胺基酸(例如，至少20、30、40、50、60、70、80、90、或100個胺基酸)的胺基酸序列(例如，可變域序列、框架序列、或恒定域序列)。免疫球蛋白可包含，例如，輕鏈免疫球蛋白的至少15個胺基酸，例如，重鏈免疫球蛋白的至少15個胺基酸。免疫球蛋白可為分離的抗體(例如，IgG、IgE、IgD、IgA、或IgM)。免疫球蛋白可為IgG的亞類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)。免疫球蛋白可為抗體片段，例如，Fab片段、F(ab')2片段、或scFv片段。免疫球蛋白亦可為雙特異性抗體或三特異性抗體，或二聚體、三聚體、或多聚體抗體，或者雙功能抗體(diabody)、Affibody®、或Nanobody®。免疫球蛋白還可為工程改造的蛋白，其含有至少一個免疫球蛋白域(例如，融合蛋白)。免疫球蛋白的非限制性實例在本案描述且免疫球蛋白的另外的實例是本領域已知的。可使用本案所述的任何方法產生重組免疫球蛋白。
術語“蛋白片段”或“多肽片段”意指多肽序列的部分，其長度為至少或約4胺基酸，至少或約5胺基酸，至少或約6胺基酸，至少或約7胺基酸，至少或約8胺基酸，至少或約9胺基酸，至少或約10胺基酸，至少或約11胺基酸，至少或約12
胺基酸，至少或約13胺基酸，至少或約14胺基酸，至少或約15胺基酸，至少或約16胺基酸，至少或約17胺基酸，至少或約18胺基酸，至少或約19胺基酸，或至少或約20胺基酸，或長度多於20個胺基酸。可使用本案所述的任何方法產生重組蛋白片段。
術語“工程改造的蛋白”意指多肽，其天然不由生物體(例如，哺乳動物)內存在的內源核酸編碼。工程改造的蛋白的實例包括酶(例如，具有一個或多個胺基酸取代、缺失、插入、或添加，其導致工程改造的酶的穩定性和/或催化活性增加)、融合蛋白、抗體(例如，二價抗體、三價抗體、或雙功能抗體)、和抗原結合蛋白，其含有至少一個重組的支架序列(scaffolding sequence)。可使用本案所述的任何方法產生重組的工程改造的蛋白。
術語“分泌的蛋白”或“分泌的重組蛋白”意指蛋白(例如，重組蛋白)，當其在哺乳動物細胞中被翻譯時原始含有至少一個分泌信號序列，並且通過(至少部分地通過)哺乳動物細胞中分泌信號序列的酶切被至少部分地分泌入細胞外空間(例如，液體培養基)。熟練專業人員會理解“分泌的”蛋白不需要完全與細胞分離才被認為是分泌的蛋白。
術語“灌注生物反應器”意指在第一液體培養基中含有多種細胞(例如，哺乳動物細胞)的生物反應器，其中培養生物反應器中存在的細胞包括周期地或連續地移出第一液體培養基並在同時或稍後向生物反應器添加基本上相同體積的第二液體培養基。在一些實例中，移出的第一液體培養基的體積和添加的體積在培養期過程中隨增加的時間(例如，約24-小時時間，約1分鐘-約24-小時的時間，或大於24小時的時間)存在增量變化(例如，增加或減少)(例如，以天為基礎的液體培養基再進料速率)。每天移出的和替代的培養基的部分可取決於被培養的特定細胞、初始的接種密度、和特定時間的細胞密度而變化。“RV”或“反應器體積”意指培養過程開始時存在的液體培養基的體積(例如，接種後存在的液體培養基的總體積)。
術語“進料分批生物反應器”是本領域的術語並意指在第一液體培養基中含有多種細胞(例如，哺乳動物細胞)的生物反應器，其中培養生物反應器中存在的細胞包括周期地或連續地將第二液體培養基添加至第一液體培養基而不大量或顯著地從細胞培養物移出第一液體培養基或第二液體培養基。第二液體培養基可與第一液體培養基相同。在進料分批培養的一些實例中，第二液體培養基是
第一液體培養基的濃縮形式。在進料分批培養的一些實例中，第二液體培養基作為幹粉添加。
術語“噴霧器”是本領域的術語並意指裝置，其具有入口、主體和具有一個或多個孔的表面，其中所述入口、主體和一個或多個孔經設計以允許氣體通過入口、通過主體流動，並流出一個或多個孔。當將噴霧器用於細胞培養時，一個或多個孔之一與細胞培養物接觸，使得氣體流出至少一個孔並流入細胞培養物。噴霧器常常通過它們的孔徑和孔類型來描述。具有孔徑和孔類型的不同組合的噴霧器的非限制性實例在本案描述。
術語“孔徑”是本領域的術語並指具有單孔的噴霧器中的單孔的直徑或具有兩個或多個孔的噴霧器中兩個或多個孔的平均直徑。
術語“涉及細胞應激的標記物”是本領域的術語並意指生物分子，其由細胞在生理應激下(例如，經受壞死性細胞死亡或凋亡性細胞死亡的細胞)釋放入液體培養基，或在受生理應激(例如，經受壞死性細胞死亡或凋亡性細胞死亡的細胞)下的細胞中產生或具有升高水平。由細胞在生理應激下釋放的涉及細胞應激的標記物的非限制性實例包括蛋白酶(例如，活化的半胱天冬酶(caspase))、乳酸脫氫酶、基因組DNA(例如，核小體DNA)、細胞色素c、和活化的PARP。在受生理應激下的細胞中產生或具有升高水平的涉及細胞應激的標記物的非限制性實例包括活化的半胱天冬酶、細胞色素c、活化的PARP、和外部化磷脂醯絲氨酸(externalized phosphatidylserine)。
“比生產速率(Specific productivity rate)”或“SPR”是本領域的術語並如在本案所使用的指每個哺乳動物細胞每天產生的重組蛋白的質量(mass)或酶活性。重組治療性抗體的SPR通常測量為質量/細胞/天。重組治療性酶的SPR通常測量為單位/細胞/天或(單位/質量)/細胞/天。
“體積生產速率(Volume productivity rate)”或“VPR”是本領域的術語並如在本案所使用的指每體積培養物(例如，每L的生物反應器、容器或管體積)每天產生的重組蛋白的質量(mass)或酶活性。重組治療性抗體的VPR通常測量為質量/L/天。重組治療性酶的VPR通常測量為單位/L/天或(單位/質量)/L/天。
短語“濃度為...的poloxamer-188”和“poloxamer-188濃度”在本案中可互換使用。短語“X g/L或更高的poloxamer-188”和“濃度為X g/L或濃度高於X g/L的poloxamer-188”在本案中可互換使用。
除非另外限定，本案中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員所通常理解的相同的含義。本案所述的方法和材料用於本發明；本領域已知的其他合適的方法和材料也可使用。所述材料、方法和實例僅僅是說明性的而非意欲為限制性的。本案提及的所有出版物、專利申請、專利、序列、數據庫條目和其他參考文件通過提述以它們的整體並入。在沖突的情況中，以包含定義的本說明書(specification)為准。
本發明的其他特征和優勢會由如下詳細的描述和附圖以及從請求項中顯而易見。
附圖簡述
圖1是在使用不含另外的poloxamer-188的液體培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(在培養期的長度中穩定濃度的1.8g/L poloxamer-188)(灰色數據)和使用含有增加量的poloxamer-188的液體培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(在培養期的長度中從1.8g/L增加至6.8g/L的poloxamer-188)(黑色數據)中活細胞密度隨時間的圖。
圖2是在使用含有增加量的poloxamer-188的液體培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(在培養期的長度中從1.8g/L增加至6.8g/L的poloxamer-188)中比生長速率隨時間的圖。
圖3是在使用不含另外的poloxamer-188的液體培養基在培養期長度中進行的兩個灌注細胞培養操作(在培養期的長度中穩定濃度的1.8g/L poloxamer-188)(灰色數據)和使用含有增加量的poloxamer-188的液體培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(在培養期的長度中從1.8g/L增加至6.8g/L的poloxamer-188)(黑色數據)中活細胞的百分數的圖。
圖4是在使用含有增加量的poloxamer-188的液體培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(在培養期的長度中從1.8g/L增加至6.8g/L的poloxamer-188)中體積生產率(volumetric productivity)隨時間的圖。
圖5是在使用含有增加量的poloxamer-188的液體培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(在培養期的長度中從1.8g/L增加至6.8g/L的poloxamer-188)中比生產率(specific productivity)隨時間的圖。
圖6是Bis-Tris凝膠，其顯示存在於如下的重組抗體的降解產物：收獲自含有6.8g/L poloxamer-188的灌注細胞培養物的澄清的液體培養基(泳道1)；收獲自含有6.8g/L poloxamer-188的灌注細胞培養物的澄清的液體培養基，其已在室溫溫育7天(泳道1a)；收獲自含有3.95g/L poloxamer-188的灌注細胞培養物的澄清的液體培養基(泳道2)；收獲自含有3.95g/L poloxamer-188的灌注細胞培養物並在室溫溫育7天的澄清的液體培養基(泳道2a)；收獲自含有3.95g/L poloxamer-188的灌注細胞培養物的澄清的液體培養基，其補充poloxmer-188以達到6.8g/L poloxamer-188的濃度並在室溫溫育9天(泳道2b)；收獲自含有3.0g/L poloxamer-188的灌注細胞培養物的澄清的液體培養基(泳道3)；收獲自含有3.0g/L poloxamer-188的灌注細胞培養物並在室溫溫育7天的澄清的液體培養基(泳道3a)；和收獲自含有3.0g/L poloxamer-188的灌注細胞培養物的澄清的液體培養基，其補充poloxmer-188以達到6.8g/L poloxamer-188的濃度並在室溫溫育9天(泳道3b)。
圖7是使用具有孔徑為20μm的燒結孔的噴霧器和含有增加量的poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(在培養期的長度中從1.8g/L增加至5.8g/L的poloxamer-188)(方形)；使用具有孔徑為200μm的鑽孔的噴霧器和含有增加量的poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(在培養期的長度中從1.8g/L增加至4.8g/L的poloxamer-188)(三角)；使用具有孔徑為500μm的鑽孔的噴霧器和含有增加量的poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(從1.8g/L增加至3.8g/L的poloxamer-188)(圓圈)的活細胞密度隨時間的圖。
圖8是使用具有孔徑為20μm的燒結孔的噴霧器和含有增加量的poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(在培養期的長度中從1.8g/L增加至5.8g/L的poloxamer-188)(方形)；使用具有孔徑為200μm的鑽孔的噴霧器和含有增加量的poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(在培養期的長度中從1.8g/L增加至4.8g/L的poloxamer-188)(三角)；使用具有孔徑為500μm的鑽孔的噴霧器和含有增加量的poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(從1.8g/L增加至3.8g/L的poloxamer-188)(圓圈)的比生長速率隨時間的圖。
圖9是使用具有孔徑為20μm的燒結孔的噴霧器和含有增加量的
poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(在培養期的長度中從1.8g/L增加至5.8g/L的poloxamer-188)(方形)；使用具有孔徑為200μm的鑽孔的噴霧器和含有增加量的poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(在培養期的長度中從1.8g/L增加至4.8g/L的poloxamer-188)(三角)；使用具有孔徑為500μm的鑽孔的噴霧器和含有增加量的poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(從1.8g/L增加至3.8g/L的poloxamer-188)(圓圈)的比乳糖脫氫酶產生隨時間的圖。
圖10是使用具有孔徑為20μm的燒結孔的噴霧器和含有增加量的poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(在培養期的長度中從1.8g/L增加至5.8g/L的poloxamer-188)(方形)；使用具有孔徑為200μm的鑽孔的噴霧器和含有增加量的poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(在培養期的長度中從1.8g/L增加至4.8g/L的poloxamer-188)(三角)；使用具有孔徑為500μm的鑽孔的噴霧器和含有增加量的poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(從1.8g/L增加至3.8g/L的poloxamer-188)(圓圈)的百分數活細胞隨時間的圖。
圖11是使用具有孔徑為20μm的燒結孔的噴霧器和含有1.8g/L poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(空心圓圈)；使用具有孔徑為20μm的燒結孔的噴霧器和含有增加量的poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(在培養期的長度中從1.8g/L增加至5.8g/L的poloxamer-188)(方形)；使用具有孔徑為200μm的鑽孔的噴霧器和含有增加量的poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(在培養期的長度中從1.8g/L增加至4.8g/L的poloxamer-188)(三角)；使用具有孔徑為500μm的鑽孔的噴霧器和含有增加量的poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(從1.8g/L增加至3.8g/L的poloxamer-188)(實心圓圈)的比乳糖脫氫酶產生隨時間的圖。
圖12是使用具有孔徑為20μm的燒結孔的噴霧器和含有增加量的poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(在培養期的長度中從1.8g/L增加至5.8g/L的poloxamer-188)(方形)；使用具有孔徑為200μm的鑽孔的噴霧器和含有增加量的poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(在培養期的長度中從1.8g/L增加至4.8g/L的poloxamer-188)
(三角)；使用具有孔徑為500μm的鑽孔的噴霧器和含有增加量的poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(從1.8g/L增加至3.8g/L的poloxamer-188)(圓圈)的體積生產率隨時間的圖。
圖13是使用具有孔徑為20μm的燒結孔的噴霧器和含有增加量的poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(在培養期的長度中從1.8g/L增加至5.8g/L的poloxamer-188)(方形)；使用具有孔徑為200μm的鑽孔的噴霧器和含有增加量的poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(在培養期的長度中從1.8g/L增加至4.8g/L的poloxamer-188)(三角)；使用具有孔徑為500μm的鑽孔的噴霧器和含有增加量的poloxamer-188的培養基在培養期長度中進行的灌注細胞培養操作(從1.8g/L增加至3.8g/L的poloxamer-188)(圓圈)的有氧葡萄糖消耗隨時間的圖。
圖14是使用含有0%消泡劑-c對poloxamer-188比例(實心圓圈)、5.6%消泡劑-c對poloxamer-188比例(空心圓圈)、11.1%消泡劑-c對poloxamer-188比例(實心方形)、27.8%消泡劑-c對poloxamer-188比例(空心方形)，或55.6%消泡劑-c對poloxamer-188比例(實心三角)的CD-CHO液體培養基進行的不同分批搖瓶細胞培養操作的活細胞密度隨時間的圖。
圖15是使用含有0%消泡劑-c對poloxamer-188比例(實心圓圈)、5.6%消泡劑-c對poloxamer-188比例(空心圓圈)、11.1%消泡劑-c對poloxamer-188比例(實心方形)、27.8%消泡劑-c對poloxamer-188比例(空心方形)，或a 55.6%消泡劑-c對poloxamer-188比例(實心三角)的CD-CHO液體培養基進行的不同分批搖瓶細胞培養操作的比乳糖脫氫酶產生速率隨時間的圖。
發明詳述
本案中提供的是培養哺乳動物細胞的方法，其包括：在足夠產生重組蛋白的條件下培養包含編碼所述重組蛋白的核酸的哺乳動物細胞，其中所述培養包括在包含濃度為1.8g/L或濃度高於1.8g/L的poloxamer-188的液體培養基中培養，且其中所述poloxamer-188在培養步驟前存在於所述培養基中和/或添加至所述培養基和/或在培養步驟過程中添加至所述培養基。還提供的是培養哺乳動物細胞的方法，其包括：提供培養系統，其包含容器、配置於所述容器內的液體培養
基和配置在所述容器內的噴霧器，所述噴霧器包含多個孔，所述孔經配置以將氣體通過所述噴霧器分配入所述液體培養基；和在所述培養系統中在足夠在該系統中產生重組蛋白的條件和氣體流速下培養包含編碼所述重組蛋白的核酸的哺乳動物細胞，其中所述培養基包含的poloxamer-188濃度基於選自下組的一個或多個因素選擇：孔徑、孔類型、氣體流速、培養基中的活細胞密度和涉及細胞應激的標記物。這些方法的例示性非限制性方面在下面描述。
在一些實施方案中，本案提供的方法能實現細胞培養物，其具有大於20 x 106細胞/mL，大於25 x 106細胞/mL，大於30 x 106細胞/mL，大於35 x 106細胞/mL，大於40 x 106細胞/mL，大於45 x 106細胞/mL，大於50 x 106細胞/mL，大於55 x 106細胞/mL，大於60 x 106細胞/mL，大於65 x 106細胞/mL，大於70 x 106細胞/mL，大於75 x 106細胞/mL，大於80 x 106細胞/mL，大於85 x 106細胞/mL，大於90 x 106細胞/mL，大於95 x 106細胞/mL，大於100 x 106細胞/mL，大於105 x 106細胞/mL，大於110 x 106細胞/mL，大於115 x 106細胞/mL，大於120 x 106細胞/mL，大於125 x 106細胞/mL，大於130 x 106細胞/mL，大於135 x 106細胞/mL，大於140 x 106細胞/mL，大於145 x 106細胞/mL，大於150 x 106細胞/mL，大於155 x 106細胞/mL，大於160 x 106細胞/mL，大於165 x 106細胞/mL，大於170 x 106細胞/mL，大於175 x 106細胞/mL，大於180 x 106細胞/mL，大於185 x 106細胞/mL，大於190 x 106細胞/mL，大於195 x 106細胞/mL，大於200 x 106細胞/mL，大於205 x 106細胞/mL，大於210 x 106細胞/mL，大於215 x 106細胞/mL，大於220 x 106細胞/mL，大於225 x 106細胞/mL，大於230 x 106細胞/mL，大於235 x 106細胞/mL，大於240 x 106細胞/mL，大於245 x 106細胞/mL，或大於250 x 106細胞/mL的活細胞密度。用於確定細胞培養物的活細胞密度的方法是本領域已知的。
在一些實施方案中，本案提供的方法提供細胞培養物，其在至少5天(例如，至少10天，至少15天，至少20天，至少25天，至少30天，至少35天，至少40天，至少45天，至少50天，至少55天，至少60天，至少65天，或至少70天)的培養期具有大於75%(例如，大於80%，大於85%，或大於90%)的百分數細胞存活率。
在一些實施方案中，本案提供的方法能實現培養，其在培養期過程中的任何時間開始的至少5天(例如，至少10天，至少15天，至少20天，至少25天，至少30天，至少35天，至少40天，至少45天，至少50天，至少55天，至少60天，至少65天，或至少70天)中具有至少1.5g/L/d(例如，至少1.6g/L/d，至少1.7g/L/d，至少1.8
g/L/d，至少1.9g/L/d，至少2.0g/L/d，至少2.1g/L/d，至少2.2g/L/天，至少2.3g/L/d，至少2.4g/L/d，至少2.5g/L/d，至少2.6g/L/d，至少2.7g/L/d，至少2.8g/L/d，至少2.9g/L/d至少3.0g/L/d至少3.1g/L/d至少3.2g/L/d至少3.3g/L/d至少3.4g/L/d，至少3.5g/L/d，至少3.6g/L/d，至少3.7g/L/d，至少3.8g/L/d，至少3.9g/L/d，至少4.0g/L/d，至少4.1g/L/d，至少4.2g/L/d，至少4.3g/L/d，至少4.4g/L/d，或至少4.5g/L/d)的體積生產率(VPR)。
在一些實施方案中，本案提供的方法得到重組蛋白的產生當收集時具有降低水平(例如，約或小於5%的降低，約或小於10%的降低，約或小於15%的降低，約或小於20%的降低，約或小於25%的降低，約或小於30%的降低，約或小於35%的降低，約或小於40%的降低，約或小於45%的降低，約或小於50%的降低，約或小於55%的降低，約或小於60%的降低，約或小於65%的降低，約或小於70%，約或小於75%的降低，約或小於80%的降低，約或小於80%的降低，約或小於85%的降低，或者約或小於90%的降低)的降解(相比於在不包括在包含1.8g/L或更高的poloxamer-188的液體培養基中培養)的相似方法中產生的重組蛋白)。從細胞培養物收集的重組蛋白的降解的水平可檢測，例如，使用凝膠電泳和/或免疫印跡檢測。
在一些實施方案中，所述方法得到細胞培養物，其在培養期內的任何時間開始的至少約5(例如，至少10，至少15，至少20，至少25，至少30，至少35，至少40，至少45，至少50，至少55，至少60，至少65，或至少70)連續天中具有小於60nU/細胞/天(例如，小於55nU/細胞/天，小於50nU/細胞/天，小於45nU/細胞/天，小於40nU/細胞/天，小於35nU/細胞/天，小於30nU/細胞/天，小於25nU/細胞/天，或小於20nU/細胞/天)的比乳酸脫氫酶生產。
在一些實施方案中，所述方法得到細胞在穩態(穩定期)中維持至少5天(例如，至少10天，至少15天，至少20天，至少25天，至少30天，至少35天，至少40天，至少45天，或至少50天)，例如，以約或大於30 x 106細胞/mL，約或大於35 x 106細胞/mL，約或大於40 x 106細胞/mL，約或大於45 x 106細胞/mL，約或大於50 x 106細胞/mL，約或大於55 x 106細胞/mL，約或大於60 x 106細胞/mL，約或大於65 x 106細胞/mL，約或大於70 x 106細胞/mL，約或大於75 x 106細胞/mL，約或大於80 x 106細胞/mL，約或大於85 x 106細胞/mL，約或大於90 x 106細胞/mL，約或大於95 x 106細胞/mL，約或大於100 x 106細胞/mL，約或大於105 x 106細胞
/mL，約或大於110 x 106細胞/mL，約或大於115 x 106細胞/mL，約或大於120 x 106細胞/mL，約或大於125 x 106細胞/mL，約或大於130 x 106細胞/mL，約或大於135 x 106細胞/mL，約或大於140 x 106細胞/mL，約或大於145 x 106細胞/mL，約或大於150 x 106細胞/mL，約或大於155 x 106細胞/mL，約或大於160 x 106細胞/mL，約或大於165 x 106細胞/mL，約或大於170 x 106細胞/mL，約或大於175 x 106細胞/mL，約或大於180 x 106細胞/mL，約或大於185 x 106細胞/mL，約或大於190 x 106細胞/mL，約或大於195 x 106細胞/mL，或者約或大於200 x 106細胞/mL的活細胞密度。
培養體積
所述任何方法中的培養步驟(例如，灌注培養步驟)可包括在允許細胞在培養中維持和增殖的條件下溫育具有20L-約8,000L(例如，約20L-約7,000L，約20L-約6,000L，約20L an約5,000L，約20L-約4,000L，約20L-約3,000L，約20L-約2,500L，約20L-約2,000L，約20L-約1,500L，約20L-約1,000L，約20L-約500L，約20L-約200L，約20L-約100L，約100L-約8,000L，約100L-約7,000L，約100L-約6,000L，約100L-約5,000L，約100L-約4,000L，約100L-約3,000L，約100L-約2,000L，約100L-約1,500L，約100L-約1,000L，約100L-約800L，約100L-約700L，約100L-約600L，約100L-約500L，約100L-約400L，約100L-約300L，約100L-約200L，約500L-約8,000L，約500L-約7,000L，約500L-約6,000L，約500L-約5,000L，約500L-約4,000L，約500L-約3,000L，約500L-約2,000L，約500L-約1,500L，約500L-約1,000L，約500L-約750L，約1,000L-約8,000L，約1,000L-約7,000L，約1,000L-約6,000L，約1,000L-約5,000L，約1,000L-約4,000L，約1,000L-約3,000L，約1,000L-約2,000L，約1,000L-約1,500L，約2,000L-約8,000L，約2,000L-約7,000L，約2,000L-約6,000L，約2,000L-約5,000L，約2,000L-約4,000L，約2,000L-約3,000L，約3,000L-約8,000L，約3,000L-約7,000L，約3,000L-約6,000L，約3,000L-約5,000L，約3,000L-約4,000L，約4,000L-約8,000L，約4,000L-約7,000L，約4,000L-約6,000L，約4,000L-約5,000L，約5,000L-約8,000L，約5,000L-約7,000L，約5,000L-約6,000L，約6,000L-約8,000L，約6,000L-約7,000L，或約7,000L或約8,000L)的體積的細胞培養物。
如本領域中已知的，細胞培養物的體積在培養期(例如，如下所述)過程中可
保持基本上相同或可隨時間增加。
培養期
本案所述任何方法中的培養(例如，灌注培養)可在約3天至約100天(例如，約3天-約95天，約3天-約90天，約3天-約85天，約3天-約80天，約3天-約75天，約3天-約70天，約3天-約65天，約3天-約60天，約3天-約55天，約3天-約50天，約3天-約45天，約3天-約40天，約3天-約35天，約3天-約30天，約3天-約25天，約3天-約20天，約3天-約15天，約3天-約10天，約5天-約100天，約5天-約95天，約5天-約90天，約5天-約85天，約5天-約80天，約5天-約75天，約5天-約70天，約5天-約65天，約5天-約60天，約5天-約55天，約5天-約50天，約5天-約45天，約5天-約40天，約5天-約35天，約5天-約30天，約5天-約25天，約5天-約20天，約5天-約15天，約5天-約10天，約10天-約100天，約10天-約95天，約10天-約90天，約10天-約85天，約10天-約80天，約10天-約75天，約10天-約70天，約10天-約65天，約10天-約60天，約10天-約55天，約10天-約50天，約10天-約45天，約10天-約40天，約10天-約35天，約10天-約30天，約10天-約25天，約10天-約20天，約10天-約15天，約15天-約100天，約15天-約95天，約15天-約90天，約15天-約85天，約15天-約80天，約15天-約75天，約15天-約70天，約15天-約65天，約15天-約60天，約15天-約55天，約15天-約50天，約15天-約45天，約15天-約40天，約15天-約35天，約15天-約30天，約15天-約25天，約15天-約20天，約20天-約100天，約20天-約95天，約20天-約90天，約20天-約85天，約20天-約80天，約20天-約75天，約20天-約70天，約20天-約65天，約20天-約60天，約20天-約55天，約20天-約50天，約20天-約45天，約20天-約40天，約20天-約35天，約20天-約30天，約20天-約25天，約25天-約100天，約25天-約95天，約25天-約90天，約25天-約85天，約25天-約80天，約25天-約75天，約25天-約70天，約25天-約65天，約25天-約60天，約25天-約55天，約25天-約50天，約25天-約45天，約25天-約40天，約25天-約35天，約25天-約30天，約30天-約100天，約30天-約90天，約30天-約80天，約30天-約70天，約30天-約60天，約30天-約50天，約30天-約40天，約40天-約100天，約40天-約90天，約40天-約80天，約40天-約70天，約40天-約60天，約40天-約50天，約50天-約100天，約50天-約90天，約50天-約80天，約50天-約70天，約50天-約60天，約60天-約100天，約60天-約90天，約60天-約80天，約60天-約70天，約70天-約100天，約70天-約90天，約70天-約80天，約80天-約100天，約80天-約90天，或約90天-約100天)的時間期中進行。
哺乳動物細胞
本案提供的方法中培養的(例如，灌注培養的)哺乳動物細胞可為在懸液中生長的細胞或粘附細胞。可在本案所述的任何方法中培養的哺乳動物細胞的非限制性實例包括：中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(例如，CHO DG44細胞或CHO-K1s細胞)、Sp2.0、骨髓瘤細胞(例如，NS/0)、B-細胞、雜交瘤細胞、T-細胞、人胚胎腎(HEK)細胞(例如，HEK 293E和HEK 293F)、非洲綠猴腎上皮細胞(Vero)細胞、NSO細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、PerC6細胞、Vero細胞、或HT-1080細胞和Madin-Darby Canine(Cocker Spaniel)腎上皮細胞(MDCK)細胞。在培養粘附細胞的一些實施例中，培養物還可包含多種微載體(例如，含有一個或多個孔的微載體)。可在本案所述的任何方法中培養的另外的哺乳動物細胞是本領域已知的。
所述哺乳動物細胞可含有編碼重組蛋白的重組核酸(例如，穩定整合在所述哺乳動物細胞的基因組中的核酸)。編碼例示性重組蛋白的重組核酸的非限制性實例在下面描述，作為可使用本案所述的方法產生的重組蛋白。在一些實例中，所述在生物反應器(例如，本案所述的任何生物反應器)中培養的哺乳動物細胞源自更大的培養(larger culture)。
可使用分子生物學和分子遺傳學中已知的多種方法將編碼重組蛋白的核酸導入哺乳動物細胞。非限制性實例包括轉染(例如，脂(質)轉染)、轉導(例如，慢病毒、腺病毒或反轉錄病毒感染)和電穿孔。在一些實例中，編碼重組蛋白的核酸未穩定地整合入哺乳動物細胞的染色體(瞬時轉染)，而在其他實例中將核酸整合。可替換地或此外，編碼重組蛋白的核酸可存在於質粒中和/或哺乳動物人工染色體(例如，人的人工染色體)中。可替換地或此外，可使用病毒載體(例如，慢病毒、反轉錄病毒或腺病毒載體)將核酸導入所述細胞。可將所述核酸可操作地連接於啟動子序列(例如，強啟動子，如β-肌動蛋白啟動子和CMV啟動子，或誘導型啟動子)。如果需要，含有核酸的載體可亦含有選擇標記(例如，賦予哺乳動物細胞潮黴素(hygromycin)、嘌呤黴素(puromycin)或新黴素(neomycin)抗性的基因。
在一些實例中，重組蛋白是分泌的蛋白並由哺乳動物細胞釋放入胞外培養基(例如，灌注培養中的第一和/或第二液體培養基或進料分批培養中的第一液體培養基和/或進料液體培養基)。例如，編碼可溶性重組蛋白的核酸序列可含有編碼在重組蛋白的N-或C-末端的分泌信號肽的序列，其由所述哺乳動物細胞中存
在的酶切割，並隨後釋放入胞外培養基(例如，第一和/或第二液體培養基)。
生物反應器
本案所述的任何方法中的培養步驟可使用生物反應器(例如，灌注生物反應器或進料分批生物反應器)進行。用於進行培養步驟的生物反應器(例如，灌注生物反應器或進料分批生物反應器)可具有約24L至約25,000L(例如，約24L-約20,000L，約24L-約15,000L，約24L-約10,000L，約24L-約9,500L，約24L-約9,000L，約24L-約8,500L，約24L-約8,000L，約24L-約7,500L，約24L-約7,000L，約24L-約6,500L，約24L-約6,000L，約24L-約5,500L，約24L-約5,000L，約24L-約4,500L，約24L-約4,000L，約24L-約3,500L，約24L-約3,000L，約24L-約2,500L，約24L-約2,000L，約24L-約1,500L，約24L-約1,000L，約24L-約900L，約24L-約800L，約24L-約700L，約24L-約600L，約24L-約500L，約24L-約400L，約24L-約300L，約24L-約200L，約24L-約100L，約100L-約25,000L，約100L-約20,000L，約100L-約15,000，約100L-約10,000L，約100L-約9,500L，約100L-約9,000L，約100L-約8,500L，約100L-約8,000L，約100L-約7,500L，約100L-約7,000L，約100L-約6,500L，約100L-約6,000L，約100L-約5,500L，約100L-約5,000L，約100L-約4,500L，約100L-約4,000L，約100L-約3,500L，約100L-約3,000L，約100L-約2,500L，約100L-約2,000L，約100L-約1,500L，約100L-約1,000L，約100L-約900L，約100L-約800L，約100L-約700L，約100L-約600L，約100L-約500L，約100L-約400L，約100L-約300L，約100L-約200L，約200L-約25,000L，約200L-約20,000L，約200L-約15,000L，約200L-約10,000L，約200L-約9,500L，約200L-約9,000L，約200L-約8,500L，約200L-約8,000L，約200L-約7,500L，約200L-約7,000L，約200L-約6,500L，約200L-約6,000L，約200L-約5,500L，約200L-約5,000L，約200L-約4,500L，約200L-約4,000L，約200L-約3,500L，約200L-約3,000L，約200L-約2,500L，約200L-約2,000L，約200L-約1,500L，約200L-約1,000L，約200L-約900L，約200L-約800L，約200L-約700L，約200L-約600L，約200L-約500L，約200L-約400L，約200L-約300L，約500L-約25,000L，約500L-約20,000L，約500L-約15,000L，約500L-約10,000L，約500L-約9,500L，約500L-約9,000L，約500L-約8,500L，約500L-約8,000L，約500L-約7,500L，約500L-約7,000L，約500L-約6,500L，約500L-約6,000L，約500L-約5,500L，約500L-約5,000L，約500L-約4,500L，約500L-約4,000L，約500L-約3,500L，
約500L-約3,000L，約500L-約2,500L，約500L-約2,000L，約500L-約1,500L，約500L-約1,000L，約500L-約900L，約500L-約800L，約500L-約700L，約500L-約600L，約1,000L-約25,000L，約1,000L-約20,000L，約1,000L-約15,000L，約1,000L-約10,000L，約1,000L-約9,500L，約1,000L-約9,000L，約1,000L-約8,500L，約1,000L-約8,000L，約1,000L-約7,500L，約1,000L-約7,000L，約1,000L-約6,500L，約1,000L-約6,000L，約1,000L-約5,500L，約1,000L-約5,000L，約1,000L-約4,500L，約1,000L-約4,000L，約1,000L-約3,500L，約1,000L-約3,000L，約1,000L-約2,500L，約1,000L-約2,000L，約1,000L-約1,500L，約2,000L-約25,000L，約2,000L-約20,000L，約2,000L-約15,000L，約2,000L-約10,000L，約2,000L-約9,500L，約2,000L-約9,000L，約2,000L-約8,500L，約2,000L-約8,000L，約2,000L-約7,500L，約2,000L-約7,000L，約2,000L-約6,500L，約2,000L-約6,000L，約2,000L-約5,500L，約2,000L-約5,000L，約2,000L-約4,500L，約2,000L-約4,000L，約2,000L-約3,500L，約2,000L-約3,000L，約2,000L-約2,500L，約3,000L-約25,000L，約3,000L-約20,000L，約3,000L-約15,000L，約3,000L-約10,000L，約3,000L-約9,500L，約3,000L-約9,000L，約3,000L-約8,500L，約3,000L-約8,000L，約3,000L-約7,500L，約3,000L-約7,000L，約3,000L-約6,500L，約3,000L-約6,000L，約3,000L-約5,500L，約3,000L-約5,000L，約3,000L-約4,500L，約3,000L-約4,000L，約3,000L-約3,500L，約4,000L-約9,000L，約4,000L-約25,000L，約4,000L-約20,000L，約4,000L-約15,000L，約4,000L-約10,000L，約4,000L-約9,500L，約4,000L-約9,000L，約4,000L-約8,500L，約4,000L-約8,000L，約4,000L-約7,500L，約4,000L-約7,000L，約4,000L-約6,500L，約4,000L-約6,000L，約4,000L-約5,500L，約4,000L-約5,000L，約4,000L-約4,500L，約5,000L-約25,000L，約5,000L-約20,000L，約5,000L-約15,000L，約5,000L-約10,000L，約5,000L-約9,500L，約5,000L-約9,000L，約5,000L-約8,500L，約5,000L-約8,000L，約5,000L-約7,500L，約5,000L-約7,000L，約5,000L-約6,500L，約5,000L-約6,000L，約5,000L-約5,500L，約6,000L-約25,000L，約6,000L-約20,000L，約6,000L-約15,000L，約6.000L-約10,000L，約6,000L-約9,500L，約6,000L-約9,000L，約6,000L-約8,500L，約6,000L-約8,000L，約6,000L-約7,500L，約6,000L-約7,000L，約6,000L-約6,500L,7,000L-約25,000L，約7,000L-約20,000L，約7,000L-約15,000L，約7,000L-約10,000L，約7,000L-約9,500L，約7,000L-約9,000L，約7,000L-約8,500
L，約7,000L-約8,000L，約7,000L-約7,500L，約8,000L-約25,000L，約8,000L-約20,000L，約8,000L-約15,000L，約8,000L-約10,000L，約8,000L-約9,500L，約8,000L-約9,000L，約8,000L-約8,500L，約9,000L-約25,000L，約9,000L-約20,000L，約9,000L-約15,000L，約9,000L-約10,000L，約9,000L-約9,500L，約10,000L-約25,000L，約10,000L-約20,000L，約10,000L-約15,000L，約15,000L-約25,000L，約15,000L-約20,000L，或約20,000L-約25,000L)的內部體積(容積)。
培養系統
本案所述的一些方法使用培養系統(例如，灌注培養系統)，其包含容器、配置於所述容器內的液體培養基(例如，本案所述的任何培養基)和配置在所述容器內的噴霧器，所述噴霧器包含多個孔，所述孔經配置以將氣體通過所述噴霧器分配入所述液體培養基。容器可具有約24L至約20,000L(例如，約24L-約15,000L，約24L-約10,000L，約24L-約9,500L，約24L-約9,000L，約24L-約8,500L，約24L-約8,000L，約24L-約7,500L，約24L-約7,000L，約24L-約6,500L，約24L-約6,000L，約24L-約5,500L，約24L-約5,000L，約24L-約4,500L，約24L-約4,000L，約24L-約3,500L，約24L-約3,000L，約24L-約2,500L，約24L-約2,000L，約24L-約1,500L，約24L-約1,000L，約24L-約900L，約24L-約800L，約24L-約700L，約24L-約600L，約24L-約500L，約24L-約400L，約24L-約300L，約24L-約200L，約24L-約100L，約100L-約20,000L，約100L-約15,000L，約100L-約10,000L，約100L-約9,500L，約100L-約9,000L，約100L-約8,500L，約100L-約8,000L，約100L-約7,500L，約100L-約7,000L，約100L-約6,500L，約100L-約6,000L，約100L-約5,500L，約100L-約5,000L，約100L-約4,500L，約100L-約4,000L，約100L-約3,500L，約100L-約3,000L，約100L-約2,500L，約100L-約2,000L，約100L-約1,500L，約100L-約1,000L，約100L-約900L，約100L-約800L，約100L-約700L，約100L-約600L，約100L-約500L，約100L-約400L，約100L-約300L，約100L-約200L，約200L-約20,000L，約200L-約15,000L，約200L-約10,000L，約200L-約9,500L，約200L-約9,000L，約200L-約8,500L，約200L-約8,000L，約200L-約7,500L，約200L-約7,000L，約200L-約6,500L，約200L-約6,000L，約200L-約5,500L，約200L-約5,000L，約200L-約4,500L，約200L-約4,000L，約200L-約3,500L，約200L-約3,000L，約200L-約2,500L，約200L-約2,000L，約200L-約1,500L，約200L-約1,000L，約200
L-約900L，約200L-約800L，約200L-約700L，約200L-約600L，約200L-約500L，約200L-約400L，約200L-約300L，約500L-約20,000L，約500L-約15,000L，約500L-約10,000L，約500L-約9,500L，約500L-約9,000L，約500L-約8,500L，約500L-約8,000L，約500L-約7,500L，約500L-約7,000L，約500L-約6,500L，約500L-約6,000L，約500L-約5,500L，約500L-約5,000L，約500L-約4,500L，約500L-約4,000L，約500L-約3,500L，約500L-約3,000L，約500L-約2,500L，約500L-約2,000L，約500L-約1,500L，約500L-約1,000L，約500L-約900L，約500L-約800L，約500L-約700L，約500L-約600L，約1,000L-約25,000L，約1,000L-約20,000L，約1,000L-約15,000L，約1,000L-約10,000L，約1,000L-約9,500L，約1,000L-約9,000L，約1,000L-約8,500L，約1,000L-約8,000L，約1,000L-約7,500L，約1,000L-約7,000L，約1,000L-約6,500L，約1,000L-約6,000L，約1,000L-約5,500L，約1,000L-約5,000L，約1,000L-約4,500L，約1,000L-約4,000L，約1,000L-約3,500L，約1,000L-約3,000L，約1,000L-約2,500L，約1,000L-約2,000L，約1,000L-約1,500L，約2,000L-約20,000L，約2,000L-約15,000L，約2,000L-約10,000L，約2,000L-約9,500L，約2,000L-約9,000L，約2,000L-約8,500L，約2,000L-約8,000L，約2,000L-約7,500L，約2,000L-約7,000L，約2,000L-約6,500L，約2,000L-約6,000L，約2,000L-約5,500L，約2,000L-約5,000L，約2,000L-約4,500L，約2,000L-約4,000L，約2,000L-約3,500L，約2,000L-約3,000L，約2,000L-約2,500L，約3,000L-約20,000L，約3,000L-約15,000L，約3,000L-約10,000L，約3,000L-約9,500L，約3,000L-約9,000L，約3,000L-約8,500L，約3,000L-約8,000L，約3,000L-約7,500L，約3,000L-約7,000L，約3,000L-約6,500L，約3,000L-約6,000L，約3,000L-約5,500L，約3,000L-約5,000L，約3,000L-約4,500L，約3,000L-約4,000L，約3,000L-約3,500L，約4,000L-約20,000L，約4,000L-約15,000L，約4,000L-約10,000L，約4,000L-約9,500L，約4,000L-約9,000L，約4,000L-約8,500L，約4,000L-約8,000L，約4,000L-約7,500L，約4,000L-約7,000L，約4,000L-約6,500L，約4,000L-約6,000L，約4,000L-約5,500L，約4,000L-約5,000L，約4,000L-約4,500L，約5,000L-約20,000L，約5,000L-約15,000L，約5,000L-約10,000L，約5,000L-約9,500L，約5,000L-約9,000L，約5,000L-約8,500L，約5,000L-約8,000L，約5,000L-約7,500L，約5,000L-約7,000L，約5,000L-約6,500L，約5,000L-約6,000L，約5,000
L-約5,500L，約6,000L-約20,000L，約6,000L-約10,000L，約6,000L-約9,500L，約6,000L-約9,000L，約6,000L-約8,500L，約6,000L-約8,000L，約6,000L-約7,500L，約6,000L-約7,000L，約6,000L-約6,500L，約7,000L-約20,000L，約7,000L-約15,000L，約7,000L-約10,000L，約7,000L-約9,500L，約7,000L-約9,000L，約7,000L-約8,500L，約7,000L-約8,000L，約7,000L-約7,500L，約8,000L-約20,000L，約8,000L-約15,000L，約8,000L-約10,000L，約8,000L-約9,500L，約8,000L-約9,000L，約8,000L-約8,500L，約9,000L-約20,000L，約9,000L-約15,000L，約9,000L-約10,000L，約9,000L-約9,500L，約10,000L-約20,000L，約10,000L-約15,000L，或者約15,000L-約20,000L)的內部體積(容積)。容器可由金屬(例如，不鏽鋼)、塑料、或玻璃，或其任何組合制成。
在一些實施方案中，噴霧器的一個或多個孔可具有約750μm-約1.5mm(例如，約750μm-約1.45mm，約750μm-約1.4mm，約750μm-約1.35mm，約750μm-約1.3mm，約750μm-約1.25mm，約750μm-約1.2mm，約750μm-約1.15mm，約750μm-約1.1mm，約750μm-約1.05mm，約750μm-約1.0mm，約750μm-約950μm，約750μm-約900μm，約750μm-約850μm，約750μm-約800μm，約800μm-約1.5mm，約800μm-約1.45mm，約800μm-約1.4mm，約800μm-約1.35mm，約800μm-約1.3mm，約800μm-約1.25mm，約800μm-約1.2mm，約800μm-約1.15mm，約800μm-約1.1mm，約800μm-約1.05mm，約800μm-約1.0mm，約800μm-約950μm，約800μm-約900μm，約800μm-約850μm，約850μm-約1.5mm，約850μm-約1.45mm，約850μm-約1.4mm，約850μm-約1.35mm，約850μm-約1.3mm，約850μm-約1.25mm，約850μm-約1.2mm，約850μm-約1.15mm，約850μm-約1.1mm，約850μm-約1.05mm，約850μm-約1.0mm，約850μm-約950μmm，約850μm-約900μm，約900μm-約1.5mm，約900μm-約1.45mm，約900μm-約1.4mm，約900μm-約1.35mm，約900μm-約1.3mm，約900μm-約1.25mm，約900μm-約1.2mm，約900μm-約1.15mm，約900μm-約1.1mm，約900μm-約1.05mm，約900μm-約1.0mm，約900μm-約950μm，約950μm-約1.5mm，約950μm-約1.45mm，約950μm-約1.4mm，約950μm-約1.35mm，約950μm-約1.3mm，約950μm-約1.25mm，約950μm-約1.2mm，約950μm-約1.15mm，約950μm-約1.1mm，約950μm-約1.05mm，約950μm-約1.0mm，約1.0mm-約1.5mm，約1.0mm-約1.45mm，約1.0mm-約1.4mm，約1.0mm-約1.35mm，約
1.0mm-約1.3mm，約1.0mm-約1.25mm，約1.0mm-約1.2mm，約1.0mm-約1.15mm，約1.0mm-約1.1mm，約1.0mm-約1.05mm，約1.05mm-約1.5mm，約1.05mm-約1.45mm，約1.05mm-約1.4mm，約1.05mm-約1.35mm，約1.05mm-約1.3mm，約1.05mm-約1.25mm，約1.05mm-約1.2mm，約1.05mm-約1.15mm，約1.05mm-約1.1mm，約1.1mm-約1.5mm，約1.1mm-約1.45mm，約1.1mm-約1.4mm，約1.1mm-約1.35mm，約1.1mm-約1.3mm，約1.1mm-約1.25mm，約1.1mm-約1.2mm，約1.1mm-約1.15mm，約1.15mm-約1.5mm，約1.15mm-約1.45mm，約1.15mm-約1.4mm，約1.15mm-約1.35mm，約1.15mm-約1.3mm，約1.15mm-約1.25mm，約1.15mm-約1.2mm，約1.2mm-約1.5mm，約1.2mm-約1.45mm，約1.2mm-約1.4mm，約1.2mm-約1.35mm，約1.2mm-約1.3mm，約1.2mm-約1.25mm，約1.25mm-約1.5mm，約1.25mm-約1.45mm，約1.25mm-約1.4mm，約1.25mm-約1.35mm，約1.25mm-約1.3mm，約1.3mm-約1.5mm，約1.3mm-約1.45mm，約1.3mm-約1.4mm，約1.3mm-約1.35mm，約1.35mm-約1.5mm，約1.35mm-約1.45mm，約1.35mm-約1.4mm，約1.4mm-約1.5mm，約1.4mm-約1.45mm，或約1.45mm-約1.5mm)的孔徑。
在一些實施方案中，噴霧器的一個或多個孔可具有約250μm-約750μm(例如，約250μm-約700μm，約250μm-約650μm，約250μm-約600μm，約250μm-約550μm，約250μm-約500μm，約250μm-約450μm，約250μm-約400μm，約250μm-約350μm，約250μm-約300μm，約300μm-約750μm，約300μm-約650μm，約300μm-約600μm，約300μm-約550μm，約300μm-約500μm，約300μm-約450μm，約300μm-約400μm，約300μm-約350μm，約350μm-約750μm，約350μm-約700μm，約350μm-約650μm，約350μm-約600μm，約350μm-約550μm，約350μm-約500μm，約350μm-約450μm，約350μm-約400μm，約400μm-約750μm，約400μm-約700μm，約400μm-約650μm，約400μm-約600μm，約400μm-約550μm，約400μm-約500μm，約400μm-約450μm，約450μm-約750μm，約450μm-約700μm，約450μm-約650μm，約450μm-約600μm，約450μm-約550μm，約450μm-約500μm，約500μm-約750μm，約500μm-約700μm，約500μm-約650μm，約500μm-約600μm，約500μm-約550μm，約550μm-約750μm，約550μm-約700μm，約550μm-約650μm，約550μm-約600μm，約600μm-約750μm，約600μm-約700μm，約600μm-約650μm，約650μm-約750μm，約650μm-約700μm，或
約700μm-約750μm)的孔徑。
在一些實施方案中，噴霧器的一個或多個孔可具有約1μm-約250μm(例如，約1μm-約240μm，約1μm-約230μm，約1μm-約220μm，約1μm-約210μm，約1μm-約200μm，約1μm-約190μm，約1μm-約180μm，約1μm-約170μm，約1μm-約160μm，約1μm-約150μm，約1μm-約140μm，約1μm-約130μm，約1μm-約125μm，約1μm-約120μm，約1μm-約115μm，約1μm-約110μm，約1μm-約105μm，約1μm-約100μm，約1μm-約95μm，約1μm-約90μm，約1μm-約85μm，約1μm-約80μm，約1μm-約75μm，約1μm-約70μm，約1μm-約65μm，約1μm-約60μm，約1μm-約55μm，約1μm-約50μm，約1μm-約45μm，約1μm-約40μm，約1μm-約35μm，約1μm-約30μm，約1μm-約25μm，約1μm-約20μm，約1μm-約15μm，約1μm-約10μm，1μm-約5μm，10μm-約250μm，約10μm-約240μm，約10μm-約230μm，10μm-約220μm，約10μm-約210μm，約10μm-約200μm，約10μm-約190μm，10μm-約180μm，約10μm-約170μm，約10μm-約160μm，約10μm-約150μm，約10μm-約140μm，約10μm-約130μm，約10μm-約120μm，約10μm-約110μm，約10μm-約100μm，約10μm-約90μm，約10μm-約80μm，約10μm-約70μm，約10μm-約60μm，約10μm-約50μm，約10μm-約40μm，約10μm-約30μm，約10μm-約20μm，約20μm-約250μm，約20μm-約240μm，約20μm-約230μm，約20μm-約220μm，約20μm-約210μm，約20μm-約200μm，約20μm-約190μm，約20μm-約180μm，約20μm-約170μm，約20μm-約160μm，約20μm-約150μm，約20μm-約140μm，約20μm-約130μm，約20μm-約120μm，約20μm-約110μm，約20μm-約100μm，約20μm-約90μm，約20μm-約80μm，約20μm-約70μm，約20μm-約60μm，約20μm-約50μm，約20μm-約40μm，約20μm-約30μm，約30μm-約250μm，約30μm-約240μm，約30μm-約230μm，約30μm-約220μm，約30μm-約210μm，約30μm-約200μm，約30μm-約190μm，約30μm-約180μm，約30μm-約170μm，約30μm-約160μm，約30μm-約150μm，約30μm-約140μm，約30μm-約130μm，約30μm-約120μm，約30μm-約110μm，約30μm-約110μm，約30μm-約100μm，約30μm-約90μm，約30μm-約80μm，約30μm-約70μm，約30μm-約60μm，約30μm-約50μm，約30μm-約40μm，約40μm-約250μm，約40μ-約240μm，約40μm-約230μm，約40μm-約220μm，約40μm-約210μm，約40μm-約200μm，約40μm-約190μm，約40μm-約180μm，
約40μm-約170μm，約40μm-約160μm，約40μm-約150μm，約40μm-約140μm，約40μm-約130μm，約40μm-約120μm，約40μm-約110μm，約40μm-約100μm，約40μm-約90μm，約40μm-約80μm，約40μm-約70μm，約40μm-約60μm，約40μm-約50μm，約50μm-約250μm，約50μm-約240μm，約50μm-約230μm，約50μm-約220μm，約50μm-約210μm，約50μm-約200μm，約50μm-約190μm，約50μm-約180μm，約50μm-約170μm，約50μm-約160μm，約50μm-約150μm，約50μm-約140μm，約50μm-約130μm，約50μm-約120μm，約50μm-約110μm，約50μm-約100μm，約50μm-約90μm，約50μm-約80μm，約50μm-約70μm，約50μm-約60μm，約60μm-約250μm，約60μm-約240μm，約60μm-約230μm，約60μm-約220μm，約60μm-約210μm，約60μm-約200μm，約60μm-約190μm，約60μm-約180μm，約60μm-約170μm，約60μm-約160μm，約60μm-約150μm，約60μm-約140μm，約60μm-約130μm，約60μm-約120μm，約60μm-約110μm，約60μm-約100μm，約60μm-約90μm，約60μm-約80μm，約60μm-約70μm，約70μm-約250μm，約70μm-約240μm，約70μm-約230μm，約70μm-約220μm，約70μm-約210μm，約70μm-約200μm，約70μm-約190μm，約70μm-約180μm，約70μm-約170μm，約70μm-約160μm，約70μm-約150μm，約70μm-約140μm，約70μm-約130μm，約70μm-約120μm，約70μm-約110μm，約70μm-約100μm，約70μm-約90μm，約70μm-約80μm，約80μm-約250μm，約80μm-約240μm，約80μm-約230μm，約80μm-約220μm，約80μm-約210μm，約80μm-約200μm，約80μm-約190μm，約80μm-約180μm，約80μm-約170μm，約80μm-約160μm，約80μm-約150μm，約80μm-約140μm，約80μm-約130μm，約80μm-約120μm，約80μm-約110μm，約80μm-約100μm，約80μm-約90μm，約90μm-約250μm，約90μm-約240μm，約90μm-約230μm，約90μm-約220μm，約90μm-約210μm，約90μm-約200μm，約90μm-約190μm，約90μm-約180μm，約90μm-約170μm，約90μm-約160μm，約90μm-約150μm，約90μm-約140μm，約90μm-約130μm，約90μm-約120μm，約90μm-約110μm，約90μm-約100μm，約100μm-約250μm，約100μm-約240μm，約100μm-約230μm，約100μm-約220μm，約100μm-約210μm，約100μm-約200μm，約100μm-約190μm，約100μm-約180μm，約100μm-約170μm，約100μm-約160μm，約100μm-約150μm，約100μm-約140μm，約100μm-約130μm，約100μm-約120μm，約100μm-約110μm，約110μm-約250μm，
約110μm-約240μm，約110μm-約230μm，約110μm-約220μm，約110μm-約210μm，約110μm-約200μm，約100μm-約190μm，約100μm-約180μm，約100μm-約170μm，約100μm-約160μm，約100μm-約150μm，約100μm-約140μm，約100μm-約130μm，約100μm-約120μm，約100μm-約110μm，約110μm-約250μm，約110μm-約240μm，約110μm-約230μm，約110μm-約220μm，約110μm-約210μm，約110μm-約200μm，約110μm-約190μm，約110μm-約180μm，約110μm-約170μm，約110μm-約160μm，約110μm-約150μm，約110μm-約140μm，約110μm-約130μm，約110μm-約120μm，約120μm-約250μm，約120μm-約240μm，約120μm-約230μm，約120μm-約220μm，約120μm-約210μm，約120μm-約200μm，約120μm-約190μm，約120μm-約180μm，約120μm-約170μm，約120μm-約160μm，約120μm-約150μm，約120μm-約140μm，約120μm-約130μm，約130μm-約250μm，約130μm-約240μm，約130μm-約230μm，約130μm-約220μm，約130μm-約210μm，約130μm-約200μm，約130μm-約190μm，約130μm-約180μm，約130μm-約170μm，約130μm-約160μm，約130μm-約150μm，約130μm-約140μm，約140μm-約250μm，約140μm-約240μm，約140μm-約230μm，約140μm-約220μm，約140μm-約210μm，約140μm-約200μm，約140μm-約190μm，約140μm-約180μm，約140μm-約170μm，約140μm-約160μm，約140μm-約150μm，約150μm-約250μm，約150μm-約240μm，約150μm-約230μm，約150μm-約220μm，約150μm-約210μm，約150μm-約200μm，約150μm-約190μm，約150μm-約180μm，約150μm-約170μm，約150μm-約160μm，約160μm-約250μm，約160μm-約240μm，約160μm-約230μm，約160μm-約220μm，約160μm-約210μm，約160μm-約200μm，約160μm-約190μm，約160μm-約180μm，約160μm-約170μm，約170μm-約250μm，約170μm-約240μm，約170μm-約230μm，約170μm-約220μm，約170μm-約210μm，約170μm-約200μm，約170μm-約190μm，約170μm-約180μm，約180μm-約250μm，約180μm-約240μm，約180μm-約230μm，約180μm-約220μm，約180μm-約210μm，約180μm-約200μm，約180μm-約190μm，約190μm-約250μm，約190μm-約240μm，約190μm-約230μm，約190μm-約220μm，約190μm-約210μm，約190μm-約200μm，約200μm-約250μm，約200μm-約240μm，約200μm-約230μm，約200μm-約220μm，約200μm-約210μm，約210μm-約250μm，約210μm-約240μm，約210μm-約230μm，約210μm-
約220μm，約220μm-約250μm，約220μm-約240μm，約220μm-約230μm，約230μm-約250μm，約230μm-約240μm，或約240μm-約250μm)的孔徑。
噴霧器的一個或多個孔可具有例如，鑽孔或燒結孔的孔類型。所述培養系統可包括用於攪動配置在所述容器內的液體培養基的裝置(例如，葉輪(impellor)和旋轉所述葉輪的馬達)。所述容器可包括一個或多個端口(和任選的泵)，其允許添加材料(例如，液體培養基、poloxamer-188、堿或酸(根據需要調節pH)、和/或消泡劑)至配置於所述容器中的液體培養基和/或移出液體培養基(例如，澄清的液體培養基或細胞培養的樣品)。培養系統還可包括一個或多個傳感器，用於在培養期過程中監測液體培養基中的pH、dO2、溫度和dCO2。培養系統可包括過濾裝置(例如，進行交替切向過濾或切向流過濾的裝置)，其處理一定體積的細胞培養物以提供基本上無細胞的澄清的液體培養基。培養系統可包括加熱/冷卻裝置，其允許調節配置於所述容器中的液體培養基的溫度。細胞培養系統的另外的特征是本領域中已知的。
灌注培養
在本案所述的任何方法中，培養步驟可為灌注培養。如本領域中已知的，灌注培養包括從生物反應器移出第一體積的第一液體培養基，並向所述生物反應器添加第二體積的第二液體培養基，其中第一體積和第二體積是大約相等的。通過一些細胞保留裝置或通過一些技術如沉降錐中的細胞沉降將哺乳動物細胞保留在生物反應器中。
如本領域中已知的，灌注培養不同於進料分批培養，且灌注培養中使用的培養基和/或培養條件常常不同於進料分批培養中使用的那些。
灌注培養中培養基的移出和添加可同時或順序，或兩者的一些組合來進行。此外，移出和添加可連續地，如以移出並替代生物反應器體積的0.1%至800%，1%-700%，1%-600%，1%-500%，1%-400%，1%-350%，1%-300%，1%-250%，1%-100%，100%-200%，5%-150%，10%-50%，15%-40%，8%-80%，或4%-30%的體積的速率進行。
移出的第一體積的第一液體培養基和添加的第二體積的第二液體培養基在一些實例中可在各24-小時時間中被保持大約相同。如本領域中已知的，移出第一體積的第一液體培養基的速率(體積/時間單位)和添加第二體積的第二液體培養基的速率(體積/時間單位)可變化並取決於特定細胞培養系統的條件。移出第
一體積的第一液體培養基的速率(體積/時間單位)和添加第二體積的第二液體培養基的速率(體積/時間單位)可為大約相同或可不同。
可替換地，移出和添加的體積可通過在各24-小時時間中逐漸增加而變化。例如，各24-小時時間內移出的第一體積的第一液體培養基的體積和添加的第二體積的第二液體培養基的體積可在培養期中增加。所述體積可在培養期中從生物反應器體積的0.5%至約20%的體積增加。所述體積可在培養期中增加至生物反應器容積或培養期開始時細胞培養物體積的約25%至約150%。
在本案所述的方法的一些實例中，在培養期的首個48至96小時後，在(培養期內)各24-小時時間中，移出的第一體積的第一液體培養基和添加的第二體積的第二液體培養基為培養期開始時細胞培養物體積的約10%至約95%，約10%至約20%，約20%至約30%，約30%至約40%，約40%至約50%，約50%至約60%，約60%至約70%，約70%至約80%，約80%至約90%，約85%至約95%，約60%至約80%，或約70%。
熟練專業人員會理解的是，第一液體培養基和第二液體培養基可為相同類型的培養基。在其他實例中，第一液體培養基和第二液體培養基可不同。就一種或多種培養基組分而言，第二液體培養基可為更濃縮的。
可通過使用任何自動系統來移出第一體積的第一液體培養基。例如，可使用交替切向流過濾。可替換地，可通過使第一體積的第一液體培養基滲過或重力流過具有排除哺乳動物細胞的截留分子量的無菌膜來移出第一體積的第一液體培養基。可替換地，可通過使攪拌速率停止或顯著降低至少1分鐘，至少2分鐘，3分鐘，4分鐘，5分鐘，10分鐘，15分鐘，20分鐘，25分鐘，30分鐘，40分鐘，50分鐘，或1小時的時間，並從生物反應器的頂部移出或抽吸第一體積的第一液體培養基來移出第一體積的第一液體培養基。
可通過泵將第二體積的第二液體培養基添加至第一液體培養基。可人工地，如通過將第二體積的第二液體培養基直接移液或注射入第一液體培養基或以自動的方式來將第二液體培養基添加至第一液體培養基。
在本案所述的方法的一些實施方案中，包括(任選地提供含有配置於第一液體培養基中的哺乳動物細胞的容器和)攪拌溫育所述容器並在約32℃至約40℃的溫度進行至少約7天的培養期；和在培養期的首個48至96小時後連續地或周期地移出第一體積的第一液體培養基和向第一液體培養基添加第二體積的第二液
體培養基，其中第一和第二體積是大約相等的。在一些實施方案中，在培養期的約首個48至96小時後在各24-小時時間中，移出的第一體積的第一液體培養基和添加的第二體積的第二液體培養基為第一液體培養基體積或所述容器體積的約0.3x至約10x。
灌注培養的一些實例包括攪拌溫育含有第一液體培養基的培養系統並在約32℃至約40℃的溫度進行至少約7天的培養期；和在培養期的首個48至96小時後連續地或周期地移出第一體積的第一液體培養基和向第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基。
進料分批培養
本案所述的方法中培養步驟可包括進料分批培養。如本領域中已知的，進料分批培養包括增量的或連續的將進料液體培養基添加至初始細胞培養物，而不大量地或顯著地從所述細胞培養物中移出第一液體培養基。在一些實例中，進料液體培養基與第一液體培養基相同。進料培養基可為液體形式(進料液體培養基)或幹粉。在其他實例中，進料液體培養基是第一液體培養基的濃縮形式和/或作為幹粉添加。
可在培養期過程中的特定時間點或多個時間點將進料液體培養基添加至初始細胞培養物。例如，可在培養期開始後其為6小時-7天，約6小時-約6天，約6小時-約5天，約6小時-約4天，約6小時-約3天，約6小時-約2天，約6小時-約1天，約12小時-約7天，約12小時-約6天，約12小時-約5天，約12小時-約4天，約12小時-約3天，約12小時-約2天，約1天-約7天，約1天-約6天，約1天-約5天，約1天-約4天，約1天-約3天，約1天-約2天，約2天-約7天，約2天-約6天，約2天-約5天，約2天-約4天，約2天-約3天，約3天-約7天，約3天-約6天，約3天-約5天，約3天-約4天，約4天-約7天，約4天-約6天，約4天-約5天，約5天-約7天，或者約5天-約6天的時間點將進料液體培養基添加至初始細胞培養物。
在培養基過程中，可將進料液體培養基連續地添加至初始細胞培養物，或可周期地(例如，每天)添加至初始細胞培養物。在一些實例中，將進料液體培養基周期地添加至初始細胞培養物時，可添加進料液體培養基一次、兩次、三次、四次或五次。添加至初始細胞培養物的進料液體培養基的體積或進料固體培養基的量在培養期過程中可變化(例如，增加)。在培養期過程中在任何24小時時間中添加至初始細胞培養物的進料液體培養基的體積可為生物反應器的容積的一些部
分。在培養期過程中在任何24小時時間中添加至初始細胞培養物的進料液體培養基的體積可為含有培養物的生物反應器容積的0.01X-約0.3X(例如，約0.01X-約0.28X，約0.01X-約0.26X，約0.01X-約0.24X，約0.01X-約0.22X，約0.01X-約0.20X，約0.01X-約0.18X，約0.01X-約0.16X，約0.01X-約0.14X，約0.01X-約0.12X，約0.01X-約0.10X，約0.01X-約0.08X，約0.01X-約0.06X，約0.01X-約0.04X，約0.025X-約0.3X，約0.025X-約0.28X，約0.025X-約0.26X，約0.025X-約0.24X，約0.025X-約0.22X，約0.025X-約0.20X，約0.025X-約0.18X，約0.025X-約0.16X，約0.025X-約0.14X，約0.025X-約0.12X，約0.025X-約0.10X，約0.025X-約0.08X，約0.025X-約0.06X，約0.025X-約0.04X，約0.05X-約0.3X，約0.05X-約0.28X，約0.05X-約0.26X，約0.05X-約0.24X，約0.05X-約0.22X，約0.05X-約0.20X，約0.05X-約0.18X，約0.05X-約0.16X，約0.05X-約0.14X，約0.05X-約0.12X，約0.05X-約0.10X，約0.1X-約0.3X，約0.1X-約0.28X，約0.1X-約0.26X，約0.1X-約0.24X，約0.1X-約0.22X，約0.1X-約0.20X，約0.1X-約0.18X，約0.1X-約0.16X約0.1X-約0.14X，約0.1X，約0.15X-約0.3X，約0.15X-約0.2X，約0.2X-約0.3X，或約0.25X-約0.3X)。
在其他實施方案中，在培養期中在任何24小時時間中添加至初始細胞培養物的進料液體培養基的體積可為培養期開始時細胞培養物體積的0.02X-約1.0X(例如，約0.02X-約0.9X，約0.02X-約0.8X，約0.02X-約0.7X，約0.02X-約0.6X，約0.02X-約0.5X，約0.02X-約0.4X，約0.02X-約0.3X，約0.02X-約0.2X，約0.02X-約0.1X，約0.05X-約1.0X，約0.05X-約0.8X，約0.05X-約0.7X，約0.05X-約0.6X，約0.05X-約0.5X，約0.05X-約0.4X，約0.05X-約0.3X，約0.05X-約0.2X，約0.05X-約0.1X，約0.1X-約1.0X，約0.1X-約0.9X，約0.1X-約0.8X，約0.1X-約0.7X，約0.1X-約0.6X，約0.1X-約0.5X，約0.1X-約0.4X，約0.1X-約0.3X，約0.1X-約0.2X，約0.2X-約1.0X，約0.2X-約0.9X，約0.2X-約0.8X，約0.2X-約0.7X，約0.2X-約0.6X，約0.2X-約0.5X，或約0.2X-約0.4X)。
Poloxamer-188
Poloxamer-188是本領域中已知的分子。Poloxamer-188是非離子合成的環氧乙烷(ethylene oxide)和環氧丙烷(propylene oxide)的嵌段共聚物。Poloxamer-188具有約7680至約9510的平均分子量，且按重量計-約81.8%±1.9%的其組成由氧乙烯(oxyethylene)代表。例如，poloxamer-188具有下式I中所示的結構，其中a為80和b為27。Poloxamer-188具有9003-11-6的CAS編號。
Poloxamer-188在商業上可從多個不同的銷售商得到，所述銷售商包括，例如，Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)、Mediatech,Inc.(Manassas,VA)、MAST Therapeutics,Inc.(San Diego,CA)、EMD Millipore(Billerica,MA)、BASF(Ludwigshafen,Germany)、Pluronic® F-68 Life Technologies(Carlsbad,CA)和PhytoTechnology Laboratories,LLC(Shawnee Mission,KS)。
本案提供的方法包括在液體培養基中培養哺乳動物細胞(例如，包含編碼重組蛋白的核酸的哺乳動物細胞)，所述液體培養基包含濃度為約1.8g/L或濃度高於1.8g/L(例如，濃度為約1.9g/L或濃度高於1.9g/L，濃度為約2.0g/L或濃度高於2.0g/L，濃度為約2.1g/L或濃度高於2.1g/L，濃度為約2.2g/L或濃度高於2.2g/L，濃度為約2.3g/L或濃度高於2.3g/L，濃度為約2.4g/L或濃度高於2.4g/L，濃度為約2.5g/L或濃度高於2.5g/L，濃度為約2.6g/L或濃度高於2.6g/L，濃度為約2.7g/L或濃度高於2.7g/L，濃度為約2.8g/L或濃度高於2.8g/L，濃度為約2.9g/L或濃度高於2.9g/L，濃度為約3.0g/L或濃度高於3.0g/L，濃度為約3.1g/L或濃度高於3.1g/L，濃度為約3.2g/L或濃度高於3.2g/L，濃度為約3.3g/L或濃度高於3.3g/L，濃度為約3.4g/L或濃度高於3.4g/L，濃度為約3.5g/L或濃度高於3.5g/L，濃度為約3.6g/L或濃度高於3.6g/L，濃度為約3.7g/L或濃度高於3.7g/L，濃度為約3.8g/L或濃度高於3.8g/L，濃度為約3.9g/L或濃度高於3.9g/L，濃度為約4.0g/L或濃度高於4.0g/L，濃度為約4.1g/L或濃度高於4.1g/L，濃度為約4.2g/L或濃度高於4.2g/L，濃度為約4.3g/L或濃度高於4.3g/L，濃度為約4.4g/L或濃度高於4.4g/L，濃度為約4.5g/L或濃度高於4.5g/L，濃度為約4.6g/L或濃度高於4.6g/L，濃度為約4.7g/L或濃度高於4.7g/L，濃度為約4.8g/L或濃度高於4.8g/L，濃度為約4.9g/L或濃度高於4.9g/L，濃度為約5.0g/L或濃度高於5.0g/L，濃度為約5.1g/L或濃度高於5.1g/L，濃度為約5.2g/L或濃度高於5.2g/L，濃度為約5.3g/L或濃度高於5.3g/L，濃度為約5.4g/L或濃度高於5.4g/L，濃度為約5.5g/L或濃度高於5.5g/L，濃度為約5.6g/L或濃度高於5.6g/L，濃度為約5.7g/L或濃度高於5.7g/L，濃度為約5.8g/L或濃度高於5.8g/L，濃度為約5.9g/L或濃度高
於5.9g/L，濃度為約6.0g/L或濃度高於6.0g/L，濃度為約6.1g/L或濃度高於6.1g/L，濃度為約6.2g/L或濃度高於6.2g/L，濃度為約6.3g/L或濃度高於6.3g/L，濃度為約6.4g/L或濃度高於6.4g/L，濃度為約6.5g/L或濃度高於6.5g/L，濃度為約6.6g/L或濃度高於6.6g/L，濃度為約6.7g/L或濃度高於6.7g/L，濃度為約6.8g/L或濃度高於6.8g/L，濃度為約6.9g/L或濃度高於6.9g/L，濃度為約7.0g/L或濃度高於7.0g/L，濃度為約7.1g/L或濃度高於7.1g/L，濃度為約7.2g/L或濃度高於7.2g/L，濃度為約7.3g/L或濃度高於7.3g/L，濃度為約7.4g/L或濃度高於7.4g/L，濃度為約7.5g/L或濃度高於7.5g/L，濃度為約7.6g/L或濃度高於7.6g/L，濃度為約7.7g/L或濃度高於7.7g/L，濃度為約7.8g/L或濃度高於7.8g/L，濃度為約7.9g/L或濃度高於7.9g/L，濃度為約8.0g/L或濃度高於8.0g/L，濃度為約8.1g/L或濃度高於8.1g/L，濃度為約8.2g/L或濃度高於8.2g/L，濃度為約8.3g/L或濃度高於8.3g/L，濃度為約8.4g/L或濃度高於8.4g/L，濃度為約8.5g/L或濃度高於8.5g/L，濃度為約8.6g/L或濃度高於8.6g/L，濃度為約8.7g/L或濃度高於8.7g/L，濃度為約8.8g/L或濃度高於8.8g/L，濃度為約8.9g/L或濃度高於8.9g/L，濃度為約9.0g/L或濃度高於9.0g/L，濃度為約9.1g/L或濃度高於9.1g/L，濃度為約9.2g/L或濃度高於9.2g/L，濃度為約9.3g/L或濃度高於9.3g/L，濃度為約9.4g/L或濃度高於9.4g/L，濃度為約9.5g/L或濃度高於9.5g/L，濃度為約9.6g/L或濃度高於9.6g/L，濃度為約9.7g/L或濃度高於9.7g/L，濃度為約9.8g/L或濃度高於9.8g/L，濃度為約9.9g/L或濃度高於9.9g/L，濃度為約10.0g/L或濃度高於10.0g/L，濃度為約10.1g/L或濃度高於10.1g/L，濃度為約10.2g/L或濃度高於10.2g/L，濃度為約10.3g/L或濃度高於10.3g/L，濃度為約10.4g/L或濃度高於10.4g/L，濃度為約10.5g/L或濃度高於10.5g/L，濃度為約10.6g/L或濃度高於10.6g/L，濃度為約10.7g/L或濃度高於10.7g/L，濃度為約10.8g/L或濃度高於10.8g/L，濃度為約10.9g/L或濃度高於10.9g/L，濃度為約11.0g/L或濃度高於11.0g/L，濃度為約11.1g/L或濃度高於11.1g/L，濃度為約11.2g/L或濃度高於11.2g/L，濃度為約11.3g/L或濃度高於11.3g/L，濃度為約11.4g/L或濃度高於11.4g/L，濃度為約11.5g/L或濃度高於11.5g/L，濃度為約11.6g/L或濃度高於11.6g/L，濃度為約11.7g/L或濃度高於11.7g/L，濃度為約11.8g/L或濃度高於11.8g/L，濃度為約11.9g/L或濃度高於11.9g/L，濃度為約12.0g/L或濃度高於12.0g/L，濃度為約12.1g/L或濃度高於12.1g/L，濃度為約12.2g/L或濃度高於12.2g/L，濃度為約12.3g/L或濃度高
於12.3g/L，濃度為約12.4g/L或濃度高於12.4g/L，濃度為約12.5g/L或濃度高於12.5g/L，濃度為約12.6g/L或濃度高於12.6g/L，濃度為約12.7g/L或濃度高於12.7g/L，濃度為約12.8g/L或濃度高於12.8g/L，濃度為約12.9g/L或濃度高於12.9g/L，濃度為約13.0g/L或濃度高於13.0g/L，濃度為約13.1g/L或濃度高於13.1g/L，濃度為約13.2g/L或濃度高於13.2g/L，濃度為約13.3g/L或濃度高於13.3g/L，濃度為約13.4g/L或濃度高於13.4g/L，濃度為約13.5g/L或濃度高於13.5g/L，濃度為約13.6g/L或濃度高於13.6g/L，濃度為約13.7g/L或濃度高於13.7g/L，濃度為約13.8g/L或濃度高於13.8g/L，濃度為約13.9g/L或濃度高於13.9g/L，濃度為約14.0g/L或濃度高於14.0g/L，濃度為約14.1g/L或濃度高於14.1g/L，濃度為約14,2g/L或濃度高於14.2g/L，濃度為約14.3g/L或濃度高於14.3g/L，濃度為約14.4g/L或濃度高於14.4g/L，濃度為約14.5g/L或濃度高於14.5g/L，濃度為約14.6g/L或濃度高於14.6g/L，濃度為約14.7g/L或濃度高於14.7g/L，濃度為約14.8g/L或濃度高於14.8g/L，濃度為約14.9g/L或濃度高於14.9g/L，或濃度為約15.0g/L或濃度高於15.0g/L)的poloxamer-188。
在一些實施方案中，本案提供的方法包括在液體培養基中培養哺乳動物細胞(例如，包含編碼重組蛋白的核酸的哺乳動物細胞)，所述液體培養基包含濃度為約1.8g/L-約16.0g/L(例如，約1.8g/L-約15.8g/L，約1.8g/L-約15.6g/L，約1.8g/L-約15.4g/L，約1.8g/L-約15.2g/L，約1.8g/L-約15.0g/L，約1.8g/L-約14.8g/L，約1.8g/L-約14.6g/L，約1.8g/L-約14.4g/L，約1.8g/L-約14.2g/L，約1.8g/L-約14.0g/L，約1.8g/L-約13.8g/L，約1.8g/L-約13.6g/L，約1.8g/L-約13.4g/L，約1.8g/L-約13.2g/L，約1.8g/L-約13.0g/L，約1.8g/L-約12.8g/L，約1.8g/L-約12.6g/L，約1.8g/L-約12.4g/L，約1.8g/L-約12.2g/L，約1.8g/L-約12.0g/L，約1.8g/L-約11.8g/L，約1.8g/L-約11.6g/L，約1.8g/L-約11.4g/L，約1.8g/L-約11.2g/L，約1.8g/L-約11.0g/L，約1.8g/L-約10.8g/L，約1.8g/L-約10.6g/L，約1.8g/L-約10.4g/L，約1.8g/L-約10.2g/L，約1.8g/L-約10.0g/L，約1.8g/L-約9.8g/L，約1.8g/L-約9.6g/L，約1.8g/L-約9.4g/L，約1.8g/L-約9.2g/L，約1.8g/L-約9.0g/L，約1.8g/L-約8.8g/L，約1.8g/L-約8.6g/L，約1.8g/L-約8.4g/L，約1.8g/L-約8.2g/L，約1.8g/L-約8.0g/L，約1.8g/L-約7.8g/L，約1.8g/L-約7.6g/L，約1.8g/L-約7.4g/L，約1.8g/L-約7.2g/L，約1.8g/L-約7.0g/L，約1.8g/L-約6.8g/L，約1.8g/L-約6.6g/L，約1.8g/L-約6.4g/L，1.8g/L-約6.2g/L，約1.8g/L-約6.0g/L，約1.8g/L-約5.8g/L，
約1.8g/L-約5.6g/L，約1.8g/L-約5.4g/L，約1.8g/L-約5.2g/L，約1.8g/L-約5.0g/L，約1.8g/L-約4.8g/L，約1.8g/L-約4.6g/L，約1.8g/L-約4.4g/L，約1.8g/L-約4.2g/L，約1.8g/L-約4.0g/L，約1.8g/L-約3.8g/L，約1.8g/L-約3.6g/L，約1.8g/L-約3.4g/L，約1.8g/L-約3.2g/L，約1.8g/L-約3.0g/L，約1.8g/L-約2.8g/L，約2.0g/L-約16.0g/L，約2.0g/L-約15.8g/L，約2.0g/L-約15.6g/L，約2.0g/L-約15.4g/L，約2.0g/L-約15.2g/L，約2.0g/L-約15.0g/L，約2.0g/L-約14.8g/L，約2.0g/L-約14.6g/L，約2.0g/L-約14.4g/L，約2.0g/L-約14.2g/L，約2.0g/L-約14.0g/L，約2.0g/L-約13.8g/L，約2.0g/L-約13.6g/L，約2.0g/L-約13.4g/L，約2.0g/L-約13.2g/L，約2.0g/L-約13.0g/L，約2.0g/L-約12.8g/L，約2.0g/L-約12.6g/L，約2.0g/L-約12.4g/L，約2.0g/L-約12.2g/L，約2.0g/L-約12.0g/L，約2.0g/L-約11.8g/L，約2.0g/L-約11.6g/L，約2.0g/L-約11.4g/L，約2.0g/L-約11.2g/L，約2.0g/L-約11.0g/L，約2.0g/L-約10.8g/L，約2.0g/L-約10.6g/L，約2.0g/L-約10.4g/L，約2.0g/L-約10.2g/L，約2.0g/L-約10.0g/L，約2.0g/L-約9.8g/L，約2.0g/L-約9.6g/L，約2.0g/L-約9.4g/L，約2.0g/L-約9.2g/L，約2.0g/L-約9.0g/L，約2.0g/L-約8.8g/L，約2.0g/L-約8.6g/L，約2.0g/L-約8.4g/L，約2.0g/L-約8.2g/L，約2.0g/L-約8.0g/L，約2.0g/L-約7.8g/L，約2.0g/L-約7.6g/L，約2.0g/L-約7.4g/L，約2.0g/L-約7.2g/L，約2.0g/L-約7.0g/L，約2.0g/L-約6.8g/L，約2.0g/L-約6.6g/L，約2.0g/L-約6.4g/L，約2.0g/L-約6.2g/L，約2.0g/L-約6.0g/L，約2.0g/L-約5.8g/L，約2.0g/L-約5.6g/L，約2.0g/L-約5.4g/L，約2.0g/L-約5.2g/L，約2.0g/L-約5.0g/L，約2.0g/L-約4.8g/L，約2.0g/L-約4.6g/L，約2.0g/L-約4.4g/L，約2.0g/L-約4.2g/L，約2.0g/L-約4.0g/L，約2.0g/L-約3.8g/L，約2.0g/L-約3.6g/L，約2.0g/L-約3.4g/L，約2.0g/L-約3.2g/L，約2.0g/L-約3.0g/L，約2.2g/L-約16.0g/L，約2.2g/L-約15.8g/L，約2.2g/L-約15.6g/L，約2.2g/L-約15.4g/L，約2.2g/L-約15.2g/L，約2.2g/L-約15.0g/L，約2.2g/L-約14.8g/L，約2.2g/L-約14.6g/L，約2.2g/L-約14.4g/L，約2.2g/L-約14.2g/L，約2.2g/L-約14.0g/L，約2.2g/L-約13.8g/L，約2.2g/L-約13.6g/L，約2.2g/L-約13.4g/L，約2.2g/L-約13.2g/L，約2.2g/L-約13.0g/L，約2.2g/L-約12.8g/L，約2.2g/L-約12.6g/L，約2.2g/L-約12.4g/L，約2.2g/L-約12.2g/L，約2.2g/L-約12.0g/L，約2.2g/L-約11.8g/L，約2.2g/L-約11.6g/L，約2.2g/L-約11.4g/L，約2.2g/L-約11.2g/L，約2.2g/L-約11.0g/L，約2.2g/L-約10.8g/L，約2.2g/L-約10.6g/L.約2.2g/L-約10.4g/L，約2.2g/L-約10.2g/L，約2.2g/L-約10.0g/L，約2.2g/L-約9.8
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g/L，約8.5g/L-約12.5g/L，約8.5g/L-約12.0g/L，約8.5g/L-約11.5g/L，約8.5g/L-約11.0g/L，約8.5g/L-約10.5g/L，約8.5g/L-約10.0g/L，約8.5g/L-約9.5g/L，約9.0g/L-約16.0g/L，約9.0g/L-約15.5g/L，約9.0g/L-約15.0g/L，約9.0g/L-約14.5g/L，約9.0g/L-約14.0g/L，約9.0g/L-約13.5g/L，約9.0g/L-約13.0g/L，約9.0g/L-約12.5g/L，約9.0g/L-約12.0g/L，約9.0g/L-約11.5g/L，約9.0g/L-約11.0g/L，約9.0g/L-約10.5g/L，約9.0g/L-約10.0g/L，約9.5g/L-約16.0g/L，約9.5g/L-約15.5g/L，約9.5g/L-約15.0g/L，約9.5g/L-約14.5g/L，約9.5g/L-約14.0g/L，約9.5g/L-約13.5g/L，約9.5g/L-約13.0g/L，約9.5g/L-約12.5g/L，約9.5g/L-約12.0g/L，約9.5g/L-約11.5g/L，約9.5g/L-約11.0g/L，約9.5g/L-約10.5g/L，約10.0g/L-約16.0g/L，約10.0g/L-約15.5g/L，約10.0g/L-約15.0g/L，約10.0g/L-約14.5g/L，約10.0g/L-約14.0g/L，約10.0g/L-約13.5g/L，約10.0g/L-約13.0g/L，約10.0g/L-約12.5g/L，約10.0g/L-約12.0g/L，約10.0g/L-約11.5g/L，約10.0g/L-約11.0g/L，約10.5g/L-約16.0g/L，約10.5g/L-約15.5g/L，約10.5g/L-約15.0g/L，約10.5g/L-約14.5g/L，約10.5g/L-約14.0g/L，約10.5g/L-約13.5g/L，約10.5g/L-約13.0g/L，約10.5g/L-約12.5g/L，約10.5g/L-約12.0g/L，約10.5g/L-約11.5g/L，約11.0g/L-約16.0g/L，約11.0g/L-約15.5g/L，約11.0g/L-約15.0g/L，約11.0g/L-約14.5g/L，約11.0g/L-約14.0g/L，約11.0g/L-約13.5g/L，約11.0g/L-約13.0g/L，約11.0g/L-約12.5g/L，約11.0g/L-約12.0g/L，約11.5g/L-約16.0g/L，約11.5g/L-約15.5g/L，約11.5g/L-約15.0g/L，約11.5g/L-約14.5g/L，約11.5g/L-約14.0g/L，約11.5g/L-約13.5g/L，約11.5g/L-約13.0g/L，約11.5g/L-約12.5g/L，約12.0g/L-約16.0g/L，約12.0g/L-約15.5g/L，約12.0g/L-約15.0g/L，約12.0g/L-約14.5g/L，約12.0g/L-約14.0g/L，約12.0g/L-約13.5g/L，約12.0g/L-約13.0g/L，約12.5g/L-約16.0g/L，約12.5g/L-約15.5g/L，約12.5g/L-約15.0g/L，約12.5g/L-約14.5g/L，約12.5g/L-約14.0g/L，約12.5g/L-約13.5g/L，約13.0g/L-約16.0g/L，約13.0g/L-約15.5g/L，約13.0g/L-約15.0g/L，約13.0g/L-約14.5g/L，約13.0g/L-約14.0g/L，約13.5g/L-約16.0g/L，約13.5g/L-約15.5g/L，約13.5g/L-約15.0g/L，約13.5g/L-約14.5g/L，約14.0g/L-約16.0g/L，約14.0g/L-約15.5g/L，約14.0g/L-約15.0g/L，約14.5g/L-約16.0g/L，約14.5g/L-約15.5g/L，或約15.0g/L-約16.0g/L)的poloxamer-188。
在一些實施方案中，在培養步驟前使poloxamer-188存在於培養基中和/或將poloxamer-188添加至所述培養基和/或在培養步驟過程中將poloxamer-188添加
至所述培養基。例如，本案提供的方法可進一步包括在培養步驟前和/或在培養步驟過程中添加poloxamer-188以在所述培養基中提供1.8g/L或更高的濃度(例如，本案所述的任何例示的poloxamer-188濃度或poloxamer-188的範圍)。在一些實例中，將另外的poloxamer-188添加至包含一些poloxamer-188的液體培養基以提供1.8g/L或更高poloxamer-188的濃度(例如，本案所述的任何例示的poloxamer-188濃度或poloxamer-188的範圍)。例如，在培養步驟前和/或在培養步驟過程中可將poloxamer-188添加至第一液體培養基、第二液體培養基、和/或進料液體培養基。
在一些實例中，在培養步驟過程中將poloxamer-188以一個或多個(例如，兩個、三個、四個或五個)等分試樣添加至培養基。可以連續的方式將poloxamer-188添加至培養基。在一些實例中，第一液體培養基可含有poloxamer-188，並且在培養期過程中將另外的poloxamer-188添加至培養基。在一些實施方案中，poloxamer-188存在於培養基中。
當培養步驟包括灌注培養時，第二液體培養基可以高於第一液體培養基中的濃度包含poloxamer-188。例如，第一液體培養基可包含濃度為1.8g/L或濃度小於1.8g/L的poloxamer-188，而第二液體培養基包含濃度高於1.8g/L的poloxamer-188(例如，本案所述的任何poloxamer-188的濃度或範圍，例如，濃度高於1.9g/L，濃度高於2.0g/L，濃度高於2.1g/L，濃度高於2.2g/L，濃度高於2.3g/L，濃度高於2.4g/L，濃度高於2.5g/L，濃度高於2.6g/L，濃度高於2.7g/L，濃度高於2.8g/L，濃度高於2.9g/L，濃度高於3.0g/L，濃度高於3.1g/L，濃度高於3.2g/L，濃度高於3.3g/L，濃度高於3.4g/L，濃度高於3.5g/L，濃度高於3.6g/L，濃度高於3.7g/L，濃度高於3.8g/L，濃度高於3.9g/L，濃度高於4.0g/L，濃度高於4.1g/L，濃度高於4.2g/L，濃度高於4.3g/L，濃度高於4.4g/L，濃度高於4.5g/L，濃度高於4.6g/L，濃度高於4.7g/L，濃度高於4.8g/L，濃度高於4.9g/L，濃度高於5.0g/L，濃度高於5.1g/L，濃度高於5.2g/L，濃度高於5.3g/L，濃度高於5.4g/L，濃度高於5.5g/L，濃度高於5.6g/L，濃度高於5.7g/L，濃度高於5.8g/L，濃度高於5.9g/L，濃度高於6.0g/L，濃度高於6.1g/L，濃度高於6.2g/L，濃度高於6.3g/L，濃度高於6.4g/L，濃度高於6.5g/L，濃度高於6.6g/L，濃度高於6.7g/L，濃度高於6.8g/L，濃度高於6.9g/L，濃度高於7.0g/L，濃度高於7.1g/L，濃度高於7.2g/L，濃度高於7.3g/L，濃度高於7.4g/L，濃度高於7.5g/L，濃度高於7.6g/L，濃度高於7.7g/L，濃度高於7.8g/L，濃度高於7.9g/L，濃度高於8.0g/L，濃度高於8.1g/L，
濃度高於8.2g/L，濃度高於8.3g/L，濃度高於8.4g/L，濃度高於8.5g/L，濃度高於8.6g/L，濃度高於8.7g/L，濃度高於8.8g/L，濃度高於8.9g/L，濃度高於9.0g/L，濃度高於9.1g/L，濃度高於9.2g/L，濃度高於9.3g/L，濃度高於9.4g/L，濃度高於9.5g/L，濃度高於9.6g/L，濃度高於9.7g/L，濃度高於9.8g/L，濃度高於9.9g/L，濃度高於10.0g/L，濃度高於10.1g/L，濃度高於10.2g/L，濃度高於10.3g/L，濃度高於10.4g/L，濃度高於10.5g/L，濃度高於10.6g/L，濃度高於10.7g/L，濃度高於10.8g/L，濃度高於10.9g/L，濃度高於11.0g/L，濃度高於11.1g/L濃度高於11.2g/L，濃度高於11.3g/L，濃度高於11.4g/L，濃度高於11.5g/L，濃度高於11.6g/L，濃度高於11.7g/L，濃度高於11.8g/L，濃度高於11.9g/L，濃度高於12.0g/L，濃度高於12.1g/L，濃度高於12.2g/L，濃度高於12.3g/L，濃度高於12.4g/L，濃度高於12.5g/L，濃度高於12.6g/L，濃度高於12.7g/L，濃度高於12.8g/L，濃度高於12.9g/L，濃度高於13.0g/L，濃度高於13.1g/L，濃度高於13.2g/L，濃度高於13.3g/L，濃度高於13.4g/L，濃度高於13.5g/L，濃度高於13.6g/L，濃度高於13.7g/L，濃度高於13.8g/L，濃度高於13.9g/L，濃度高於14.0g/L，濃度高於14.1g/L，濃度高於14.2g/L，濃度高於14.3g/L，濃度高於14.4g/L，濃度高於14.5g/L，濃度高於14.6g/L，濃度高於14.7g/L，濃度高於14.8g/L，濃度高於14.9g/L，濃度高於15.0g/L，濃度高於15.1g/L，濃度高於15.2g/L，濃度高於15.3g/L，濃度高於15.4g/L，濃度高於15.5g/L，濃度高於15.6g/L，濃度高於15.7g/L，濃度高於15.8g/L，濃度高於15.9g/L，或濃度高於16.0g/L poloxamer-188)。
當培養步驟包括進料分批培養時，進料液體培養基可以高於第一液體培養基中的濃度包含poloxamer-188。例如，第一液體培養基可包括濃度為1.8g/L或濃度小於1.8g/L的poloxamer-188，而進料液體培養基包含濃度高於1.8g/L(例如，濃度高於2.0g/L，濃度高於2.5g/L，濃度高於3.0g/L，濃度高於3.5g/L，濃度高於4.0g/L，濃度高於4.5g/L，濃度高於5.0g/L，濃度高於5.5g/L，濃度高於6.0g/L，濃度高於6.5g/L，濃度高於7.0g/L，濃度高於7.5g/L，濃度高於8.0g/L，濃度高於8.5g/L，濃度高於9.0g/L，濃度高於9.5g/L，濃度高於10g/L，濃度高於10.5g/L，濃度高於11.0g/L，濃度高於11.5g/L，濃度高於12.0g/L，濃度高於12.5g/L，濃度高於13.0g/L，濃度高於13.5g/L，濃度高於14.0g/L，濃度高於14.5g/L，濃度高於15.0g/L，濃度高於15.5g/L，濃度高於16.0g/L，濃度高於16.5g/L，濃度高於17.0g/L，濃度高於17.5g/L，濃度高於18.0g/L，濃度高於18.5g/L，濃度高於
19.0g/L，濃度高於19.5g/L，濃度高於20.0g/L，濃度高於20.5g/L，濃度高於21.0g/L，濃度高於21.5g/L，濃度高於22.0g/L，濃度高於22.5g/L，濃度高於23.0g/L，濃度高於23.5g/L，濃度高於24.0g/L，濃度高於24.5g/L，濃度高於25.0g/L，濃度高於25.5g/L，濃度高於26.0g/L，濃度高於26.5g/L，濃度高於27.0g/L，濃度高於28.0g/L，濃度高於28.5g/L，濃度高於29.0g/L，濃度高於29.5g/L，濃度高於30.0g/L，濃度高於30.5g/L，濃度高於31.0g/L，濃度高於31.5g/L，濃度高於32.0g/L，濃度高於32.5g/L，濃度高於33.0g/L，濃度高於33.5g/L，濃度高於34.0g/L，濃度高於34.5g/L，濃度高於35.0g/L，濃度高於35.5g/L，濃度高於36.0g/L，濃度高於36.5g/L，濃度高於37.0g/L，濃度高於37.5g/L，濃度高於38.0g/L，濃度高於38.5g/L，濃度高於39.0g/L，濃度高於39.5g/L.或濃度高於40.0g/L)的poloxamer-188。
本案提供的任何方法的一些實施方案包括隨時間增加培養物中的poloxamer-188濃度。在一些實施方案中，培養基包含poloxamer-188濃度，其基於選自下組的一個或多個因素選擇：孔徑、孔類型、氣體流速、培養基中的活細胞密度和涉及細胞應激的標記物。在這些方法中，培養基中選擇的poloxamer-188濃度可通過如下實現：在培養步驟之前將poloxamer-188添加至所述培養基和/或在培養步驟過程中將poloxamer-188添加至所述培養基。選擇的poloxamer-188濃度可為本案所述的任何例示的poloxamer-188的濃度或範圍。
基於一個或多個因素選擇Poloxamer-188的濃度
本案所述方法的一些實施方案包括在包含poloxamer-188濃度的液體培養基中培養哺乳動物細胞，所述poloxamer-188濃度基於選自下組的一個或多個因素選擇：孔徑、孔類型、氣體流速、培養基中的活細胞密度和涉及細胞應激的標記物。
孔類型的不同實例是本領域中已知的。孔類型的非限制性實例是燒結孔和鑽孔。
適於細胞培養的多種氣體流速是本領域中已知的。通常，較高的氣體流速指示應選擇(相比於使用較低氣體流速的培養步驟)更高的poloxamer-188濃度，而較低的氣體流速指示應選擇(相比於使用較高氣體流速的培養步驟)更低的poloxamer-188濃度。
多種非限制性活細胞密度在本案描述。通常，較高的活細胞密度指示應選
擇(相比於包含較低活細胞密度的培養基)更高的poloxamer-188濃度，而較低的活細胞密度指示應選擇(相比於包含較高活細胞密度的培養基)更低的poloxamer-188濃度。
由細胞在生理應激下釋放的例示性細胞應激的標記物包括蛋白酶(例如，活化的半胱天冬酶(caspase))、乳酸脫氫酶、基因組DNA(例如，核小體DNA)、細胞色素c、和活化的PARP。在受生理應激下的細胞中產生或具有升高水平的涉及細胞應激的標記物的非限制性實例包括活化的半胱天冬酶、細胞色素c、活化的PARP、和外部化磷脂醯絲氨酸(externalized phosphatidylserine)。任何這些細胞應激的標記物中的一種或多種(例如，兩種、三種、四種、五種、六種或七種)相比於對照值的水平升高指示應選擇更高的poloxamer-188濃度。一種或多種細胞應激的標記物的水平相比於對照值與對照值大約相同或低於對照值指示應選擇更低的poloxamer-188濃度。在本案所述的任何實例中，對照水平可為不經曆凋亡或不在會觸發壞死的條件下培養的對照細胞中的水平。檢測一種或多種細胞應激的標記物的水平的方法是本領域已知的。商業上可得到的套盒可用於測量所述一種或多種細胞應激的標記物。
在本案所述的任何實施方案中，選擇的poloxamer-188濃度是通過如下實現的：在培養步驟之前將poloxamer-188添加至所述培養基和/或在培養步驟過程中將poloxamer-188添加至所述培養基。在一些實施方案中，所述方法包括當孔類型為鑽孔且孔徑為約750μm-約1.5mm(例如，約750μm至約1.45mm，約750μm-約1.40mm，約750μm-約1.35mm，約750μm-約1.30mm，約750μm-約1.25mm，約750μm-約1.20mm，約750μm-約1.15mm，約750μm-約1.10mm，約750μm-約1.05mm，約750μm-約1.00mm，約750μm-約950μm，約750μm-約900μm，約750μm-約850μm，約750μm-約800μm，約800μm-約1.5mm，約800μm-約1.45mm，約800μm-約1.40mm，約800μm-約1.35mm，約800μm-約1.30mm，約800μm-約1.25mm，約800μm-約1.20mm，約800μm-約1.15mm，約800μm-約1.10mm，約800μm-約1.05mm，約800μm-約1.00mm，約800μm-約950μm，約800μm-約900μm，約800μm-約850μm，約850μm-約1.5mm，約850μm-約1.45mm，約850μm-約1.40mm，約850μm-約1.35mm，約850μm-約1.30mm，約850μm-約1.25mm，約850μm-約1.20mm，約850μm-約1.15mm，約850μm-約1.10mm，約850μm-約1.05mm，約850μm-約1.00mm，約850μm-約950μm，約850μm-
約900μm，約900μm-約1.5mm，約900μm-約1.45mm，約900μm-約1.40mm，約900μm-約1.35mm，約900μm-約1.30mm，約900μm-約1.25mm，約900μm-約1.20mm，約900μm-約1.15mm，約900μm-約1.10mm，約900μm-約1.05mm，約900μm-約1.00mm，約900μm-約950μm，約950μm-約1.5mm，約950μm-約1.45mm，約950μm-約1.40mm，約950μm-約1.35mm，約950μm-約1.30mm，約950μm-約1.25mm，約950μm-約1.20mm，約950μm-約1.15mm，約950μm-約1.10mm，約950μm-約1.05mm，約950μm-約1.00mm，約1.0mm-約1.5mm，約1.0mm-約1.45mm，約1.0mm-約1.40mm，約1.0mm-約1.35mm，約1.0mm-約1.30mm，約1.0mm-約1.25mm，約1.0mm-約1.20mm，約1.0mm-約1.15mm，約1.0mm-約1.10mm，約1.0mm-約1.05mm，約1.05mm-約1.5mm，約1.05mm-約1.45mm，約1.05mm-約1.40mm，約1.05mm-約1.35mm，約1.05mm-約1.30mm，約1.05mm-約1.25mm，約1.05mm-約1.20mm，約1.05mm-約1.15mm，約1.05mm-約1.10mm，約1.10mm-約1.5mm，約1.10mm-約1.45mm，約1.10mm-約1.40mm，約1.10mm-約1.35mm，約1.10mm-約1.30mm，約1.10mm-約1.25mm，約1.10mm-約1.20mm，約1.10mm-約1.15mm，約1.15mm-約1.5mm，約1.15mm-約1.45mm，約1.15mm-約1.40mm，約1.15mm-約1.35mm，約1.15mm-約1.30mm，約1.15mm-約1.25mm，約1.15mm-約1.20mm，約1.20mm-約1.5mm，約1.20mm-約1.45mm，約1.20mm-約1.40mm，約1.20mm-約1.35mm，約1.20mm-約1.30mm，約1.20mm-約1.25mm，約1.25mm-約1.5mm，約1.25mm-約1.45mm，約1.25mm-約1.40mm，約1.25mm-約1.35mm，約1.25mm-約1.30mm，約1.30mm-約1.5mm，約1.30mm-約1.45mm，約1.30mm-約1.40mm，約1.30mm-約1.35mm，約1.35mm-約1.5mm，約1.35mm-約1.45mm，約1.35mm-約1.40mm，約1.40mm-約1.5mm，約1.40mm-約1.45mm，或約1.45mm-約1.50)時，基於孔類型和孔徑選擇約2.3g/L-約3.3g/L(例如，約2.3g/L-約3.2g/L，約2.3g/L-約3.1g/L，約2.3g/L-約3.0g/L，約2.3g/L-約2.9g/L，約2.3g/L-約2.8g/L，約2.3g/L-約2.7g/L，約2.3g/L-約2.6g/L，約2.3g/L-約2.5g/L，約2.4g/L-約3.3g/L，約2.4g/L-約3.2g/L，約2.4g/L-約3.1g/L，約2.4g/L-約3.0g/L，約2.4g/L-約2.9g/L，約2.4g/L-約2.8g/L，約2.4g/L-約2.7g/L，約2.4g/L-約2.6g/L，約2.5g/L-約3.3g/L，約2.5g/L-約3.2g/L，約2.5g/L-約3.1g/L，約2.5g/L-約3.0g/L，約2.5g/L-約2.9g/L，約2.5g/L-約2.8g/L，約2.5g/L-約2.7g/L，約2.6g/L-約3.3g/L，約2.6g/L-約3.2g/L，約2.6g/L-約3.1g/L，
約2.6g/L-約3.0g/L，約2.6g/L-約2.9g/L，約2.6g/L-約2.8g/L，約2.7g/L-約3.3g/L，約2.7g/L-約3.2g/L，約2.7g/L-約3.1g/L，約2.7g/L-約3.0g/L，約2.7g/L-約2.9g/L，約2.8g/L-約3.3g/L，約2.8g/L-約3.2g/L，約2.8g/L-約3.1g/L，約2.8g/L-約3.0g/L，約2.9g/L-約3.3g/L，約2.9g/L-約3.2g/L，約2.9g/L-約3.1g/L，約3.0g/L-約3.3g/L，約3.0g/L-約3.2g/L，或約3.1g/L-約3.3g/L)的poloxamer-188濃度，。
在一些實施方案中，所述方法包括當孔類型是鑽孔且孔徑為約250μm-約750μm(例如，約250μm-約700μm，約250μm-約650μm，約250μm-約600μm，約250μm-約550μm，約250μm-約500μm，約250μm-約450μm，約250μm-約400μm，約250μm-約350μm，約250μm-約300μm，約300μm-約750μm，約300μm-約700μm，約300μm-約650μm，約300μm-約600μm，約300μm-約550μm，約300μm-約500μm，約300μm-約450μm，約300μm-約400μm，約300μm-約350μm，約350μm-約750μm，約350μm-約700μm，約350μm-約650μm，約350μm-約600μm，約350μm-約550μm，約350μm-約500μm，約350μm-約450μm，約350μm-約400μm，約400μm-約750μm，約400μm-約700μm，約400μm-約650μm，約400μm-約600μm，約400μm-約550μm，約400μm-約500μm，約400μm-約450μm，約450μm-約750μm，約450μm-約700μm，約450μm-約650μm，約450μm-約600μm，約450μm-約550μm，約450μm-約500μm，約500μm-約750μm，約500μm-約700μm，約500μm-約650μm，約500μm-約600μm，約500μm-約550μm，約550μm-約750μm，約550μm-約700μm，約550μm-約650μm，約550μm-約600μm，約600μm-約750μm，約600μm-約700μm，約600μm-約650μm，約650μm-約750μm，約650μm-約700μm，或約700μm和750μm)時，基於孔類型和孔徑選擇約3.3g/L-約4.3g/L(例如，約3.3g/L-約4.2g/L，約3.3g/L-約4.1g/L，約3.3g/L-約4.0g/L，約3.3g/L-約3.9g/L，約3.3g/L-約3.8g/L，約3.3g/L-約3.7g/L，約3.3g/L-約3.6g/L，約3.3g/L-約3.5g/L，約3.4g/L-約4.3g/L，約3.4g/L-約4.2g/L，約3.4g/L-約4.1g/L，約3.4g/L-約4.0g/L，約3.4g/L-約3.9g/L，約3.4g/L-約3.8g/L，約3.4g/L-約3.7g/L，約3.4g/L-約3.6g/L，約3.5g/L-約4.3g/L，約3.5g/L-約4.2g/L，約3.5g/L-約4.1g/L，約3.5g/L-約4.0g/L，約3.5g/L-約3.9g/L，約3.5g/L-約3.8g/L，約3.5g/L-約3.7g/L，約3.6g/L-約4.3g/L，約3.6g/L-約4.2g/L，約3.6g/L-約4.1g/L，約3.6g/L-約4.0g/L，約3.6g/L-約3.9g/L，約3.6g/L-約3.8g/L，約3.7g/L-約4.3g/L，約3.7g/L-約4.2g/L，約3.7g/L-約4.1g/L，約3.7g/L-約4.0g/L，約3.7g/L-約3.9g/L，約3.8g/L-約4.3g/L，
約3.8g/L-約4.2g/L，約3.8g/L-約4.1g/L，約3.8g/L-約4.0g/L，約3.9g/L-約4.3g/L，約3.9g/L-約4.2g/L，約3.9g/L-約4.1g/L，約4.0g/L-約4.3g/L，約4.0g/L-約4.2g/L，或約4.1g/L-約4.3g/L)的poloxamer-188濃度。
所述方法可包括，例如，當孔類型是鑽孔且孔徑為約1μm-約250μm(例如，約1μm-約200μm，約1μm-約150μm，約1μm-約100μm，約1μm-約50μm，約1μm-約25μm，約10μm-約250μm，約10μm-約200μm，約10μm-約150μm，約10μm-約100μm，約10μm-約50μm，約10μm-約25μm，約25μm-約250μm，約25μm-約200μm，約25μm-約150μm，約25μm-約100μm，約25μm-約50μm，約50μm-約250μm，約50μm-約200μm，約50μm-約150μm，約50μm-約100μm，約100μm-約250μm，約100μm-約200μm，約100μm-約150μm，約150μm-約250μm，約150μm-約200μm，或者約200μm-約250μm)時，基於孔類型和孔徑選擇濃度高於約4.3g/L(例如，濃度高於約4.4g/L，濃度高於約4.5g/L，濃度高於約4.6g/L，濃度高於約4.7g/L，濃度高於約4.8g/L，濃度高於約4.9g/L，濃度高於約5.0g/L，濃度高於約5.1g/L，濃度高於約5.2g/L，濃度高於約5.3g/L，濃度高於約5.4g/L，濃度高於約5.5g/L，濃度高於約5.6g/L，濃度高於約5.7g/L，濃度高於約5.8g/L，濃度高於約5.9g/L，濃度高於約6.0g/L，濃度高於約6.1g/L，濃度高於約6.2g/L，濃度高於約6.3g/L，濃度高於約6.4g/L，濃度高於約6.5g/L，濃度高於約6.6g/L，濃度高於約6.7g/L，濃度高於約6.8g/L，濃度高於約6.9g/L，濃度高於約7.0g/L，濃度高於約7.1g/L，濃度高於約7.2g/L，濃度高於約7.3g/L，濃度高於約7.4g/L，濃度高於約7.5g/L，濃度高於約7.6g/L，濃度高於約7.7g/L，濃度高於約7.8g/L，濃度高於約7.9g/L，濃度高於約8.0g/L，濃度高於約8.1g/L，濃度高於約8.2g/L，濃度高於約8.2g/L，濃度高於約8.3g/L，濃度高於約8.4g/L，濃度高於約8.5g/L，濃度高於約8.6g/L，濃度高於約8.7g/L，濃度高於約8.8g/L，濃度高於約8.9g/L，濃度高於約9.0g/L，濃度高於約9.1g/L，濃度高於約9.2g/L，濃度高於約9.3g/L，濃度高於約9.4g/L，濃度高於約9.5g/L，濃度高於約9.6g/L，濃度高於約9.7g/L，濃度高於約9.8g/L，濃度高於約9.9g/L，或濃度高於約10.0g/L)的poloxamer-188。
在一些實例中，所述方法包括當孔類型是鑽孔且孔徑為約160μm-約190μm(例如，約160μm-約185μm，約160μm-約180μm，約160μm-約175μm，約160μm-約170μm，約160μm-約165μm，約165μm-約190μm，約165μm-約185μm，約
165μm-約180μm，約165μm-約175μm，約165μm-約170μm，約170μm-約190μm，約170μm-約185μm，約170μm-約180μm，約170μm-約175μm，約175μm-約190μm，約175μm-約185μm，約175μm-約180μm，約180μm-約190μm，約180μm-約185μm，或約185μm-約190μm)時，基於孔類型和孔徑選擇濃度高於4.3g/L(例如，濃度高於約4.4g/L，濃度高於約4.5g/L，濃度高於約4.6g/L，濃度高於約4.7g/L，濃度高於約4.8g/L，濃度高於約4.9g/L，濃度高於約5.0g/L，濃度高於約5.1g/L，濃度高於約5.2g/L，濃度高於約5.3g/L，濃度高於約5.4g/L，濃度高於約5.5g/L，濃度高於約5.6g/L，濃度高於約5.7g/L，濃度高於約5.8g/L，濃度高於約5.9g/L，濃度高於約6.0g/L，濃度高於約6.1g/L，濃度高於約6.2g/L，濃度高於約6.3g/L，濃度高於約6.4g/L，濃度高於約6.5g/L，濃度高於約6.6g/L，濃度高於約6.7g/L，濃度高於約6.8g/L，濃度高於約6.9g/L，濃度高於約7.0g/L，濃度高於約7.1g/L，濃度高於約7.2g/L，濃度高於約7.3g/L，濃度高於約7.4g/L，濃度高於約7.5g/L，濃度高於約7.6g/L，濃度高於約7.7g/L，濃度高於約7.8g/L，濃度高於約7.9g/L，濃度高於約8.0g/L，濃度高於約8.1g/L，濃度高於約8.2g/L，濃度高於約8.2g/L，濃度高於約8.3g/L，濃度高於約8.4g/L，濃度高於約8.5g/L，濃度高於約8.6g/L，濃度高於約8.7g/L，濃度高於約8.8g/L，濃度高於約8.9g/L，濃度高於約9.0g/L，濃度高於約9.1g/L，濃度高於約9.2g/L，濃度高於約9.3g/L，濃度高於約9.4g/L，濃度高於約9.5g/L，濃度高於約9.6g/L，濃度高於約9.7g/L，濃度高於約9.8g/L，濃度高於約9.9g/L，或濃度高於約10.0g/L)的poloxamer-188。
在一些實施方案中，所述方法包括當孔類型是燒結孔且孔徑為大於150μm(例如，大於155μm，大於160μm，大於165μm，大於170μm，大於175μm，大於約180μm，大於185μm，大於約190μm，大於約195μm，大於約200μm，大於約205μm，大於約210μm，大於約215μm，大於約220μm，大於約225μm，大於約230μm，大於約235μm，大於約240μm，大於約245μm，大於約250μm，大於約255μm，大於約260μm，大於約265μm，大於約270μm，大於約275μm，大於約280μm，大於約290μm，大於約300μm，大於約350μm，大於約400μm，大於約450μm，或大於約500μm)時，基於孔類型和孔徑選擇濃度為約1.8g/L-約3.3g/L(例如，約1.8g/L-約3.2g/L，約1.8g/L-約3.1g/L，約1.8g/L-約3.0g/L，約1.8g/L-約2.9g/L，約1.8g/L-約2.8g/L，約1.8g/L-約2.7g/L，約1.8g/L-約2.6g/L，
約1.8g/L-約2.5g/L，約1.8g/L-約2.4g/L，約1.8g/L-約2.3g/L，約1.8g/L-約2.2g/L，約1.8g/L-約2.1g/L，約1.8g/L-約2.0g/L，約1.9g/L-約3.3g/L，約1.9g/L-約3.2g/L，約1.9g/L-約3.1g/L，約1.9g/L-約3.0g/L，約1.9g/L-約2.9g/L，約1.9g/L-約2.8g/L，約1.9g/L-約2.7g/L，約1.9g/L-約2.6g/L，約1.9g/L-約2.5g/L，約1.9g/L-約2.4g/L，約1.9g/L-約2.3g/L，約1.9g/L-約2.2g/L，約1.9g/L-約2.1g/L，約2.0g/L-約3.3g/L，約2.0g/L-約3.2g/L，約2.0g/L-約3.1g/L，約2.0g/L-約3.0g/L，約2.0g/L-約2.9g/L，約2.0g/L-約2.8g/L，約2.0g/L-約2.7g/L，約2.0g/L-約2.6g/L，約2.0g/L-約2.5g/L，約2.0g/L-約2.4g/L，約2.0g/L-約2.3g/L，約2.0g/L-約2.2g/L，約2.1g/L-約3.3g/L，約2.1g/L-約3.2g/L，約2.1g/L-約3.1g/L，約2.1g/L-約3.0g/L，約2.1g/L-約2.9g/L，約2.1g/L-約2.8g/L，約2.1g/L-約2.7g/L，約2.1g/L-約2.6g/L，約2.1g/L-約2.5g/L，約2.1g/L-約2.4g/L，約2.1g/L-約2.3g/L，約2.2g/L-約3.3g/L，約2.2g/L-約3.2g/L，約2.2g/L-約3.1g/L，約2.2g/L-約3.0g/L，約2.2g/L-約2.9g/L，約2.2g/L-約2.8g/L，約2.2g/L-約2.7g/L，約2.2g/L-約2.6g/L，約2.2g/L-約2.5g/L，約2.2g/L-約2.4g/L，約2.3g/L-約3.3g/L，約2.3g/L-約3.2g/L，約2.3g/L-約3.1g/L，約2.3g/L-約3.0g/L，約2.3g/L-約2.9g/L，約2.3g/L-約2.8g/L，約2.3g/L-約2.7g/L，約2.3g/L-約2.6g/L，約2.3g/L-約2.5g/L，約2.4g/L-約3.3g/L，約2.4g/L-約3.2g/L，約2.4g/L-約3.1g/L，約2.4g/L-約3.0g/L，約2.4g/L-約2.9g/L，約2.4g/L-約2.8g/L，約2.4g/L-約2.7g/L，約2.4g/L-約2.6g/L，約2.5g/L-約3.3g/L，約2.5g/L-約3.2g/L，約2.5g/L-約3.1g/L，約2.5g/L-約3.0g/L，約2.5g/L-約2.9g/L，約2.5g/L-約2.8g/L，約2.5g/L-約2.7g/L，約2.6g/L-約3.3g/L，約2.6g/L-約3.2g/L，約2.6g/L-約3.1g/L，約2.6g/L-約3.0g/L，約2.6g/L-約2.9g/L，約2.6g/L-約2.8g/L，約2.7g/L-約3.3g/L，約2.7g/L-約3.2g/L，約2.7g/L-約3.1g/L，約2.7g/L-約3.0g/L，約2.7g/L-約2.9g/L，約2.8g/L-約3.3g/L，約2.8g/L-約3.2g/L，約2.8g/L-約3.1g/L，約2.8g/L-約3.0g/L，約2.9g/L-約3.3g/L，約2.9g/L-約3.2g/L，約2.9g/L-約3.1g/L，約3.0g/L-約3.3g/L，約3.0g/L-約3.2g/L，或約3.1g/L-約3.3g/L)的poloxamer-188。
所述方法可包括，例如，當孔類型是燒結孔且孔徑為約80μm-約150μm(例如，約80μm-約145μm，約80μm-約140μm，約80μm-約135μm，約80μm-約130μm，約80μm-約125μm，約80μm-約120μm，約80μm-約115μm，約80μm-約110μm，約80μm-約105μm，約80μm-約100μm，約80μm-約95μm，約80μm-約90μm，約80μm-約85μm，約85μm-約150μm，約85μm-約145μm，約85μm-
約140μm，約85μm-約135μm，約85μm-約130μm，約85μm-約125μm，約85μm-約120μm，約85μm-約115μm，約85μm-約110μm，約85μm-約105μm，約85μm-約100μm，約85μm-約95μm，約85μm-約90μm，約90μm-約150μm，約90μm-約145μm，約90μm-約140μm，約90μm-約135μm，約90μm-約130μm，約90μm-約125μm，約90μm-約120μm，約90μm-約115μm，約90μm-約110μm，約90μm-約105μm，約90μm-約100μm，約90μm-約95μm，約95μm-約150μm，約95μm-約145μm，約95μm-約140μm，約95μm-約135μm，約95μm-約130μm，約95μm-約125μm，約95μm-約120μm，約95μm-約115μm，約95μm-約110μm，約95μm-約105μm，約95μm-約100μm，約100μm-約150μm，約100μm-約145μm，約100μm-約140μm，約100μm-約135μm，約100μm-約130μm，約100μm-約125μm，約100μm-約120μm，約100μm-約115μm，約100μm-約110μm，約100μm-約105μm，約105μm-約150μm，約105μm-約145μm，約105μm-約140μm，約105μm-約135μm，約105μm-約130μm，約105μm-約125μm，約105μm-約120μm，約105μm-約115μm，約105μm-約110μm，約110μm-約150μm，約110μm-約145μm，約110μm-約140μm，約110μm-約135μm，約110μm-約130μm，約110μm-約125μm，約110μm-約120μm，約110μm-約115μm，約115μm-約150μm，約115μm-約145μm，約115μm-約140μm，約115μm-約135μm，約115μm-約130μm，約115μm-約125μm，約115μm-約120μm，約120μm-約150μm，約120μm-約145μm，約120μm-約140μm，約120μm-約135μm，約120μm-約130μm，約120μm-約125μm，約125μm-約150μm，約125μm-約145μm，約125μm-約140μm，約125μm-約135μm，約125μm-約130μm，約130μm-約150μm，約130μm-約145μm，約130μm-約140μm，約130μm-約135μm，約135μm-約150μm，約135μm-約145μm，約135μm-約140μm，約140μm-約150μm，約140μm-約145μm，或約145μm-約150μm)時，基於孔類型和孔徑選擇濃度為約3.3g/L-約4.3g/L(例如，約3.3g/L-約4.2g/L，約3.3g/L-約4.1g/L，約3.3g/L-約4.0g/L，約3.3g/L-約3.9g/L，約3.3g/L-約3.8g/L，約3.3g/L-約3.7g/L，約3.3g/L-約3.6g/L，約3.3g/L-約3.5g/L，約3.4g/L-約4.3g/L，約3.4g/L-約4.2g/L，約3.4g/L-約4.1g/L，約3.4g/L-約4.0g/L，約3.4g/L-約3.9g/L，約3.4g/L-約3.8g/L，約3.4g/L-約3.7g/L，約3.4g/L-約3.6g/L，約3.5g/L-約4.3g/L，約3.5g/L-約4.2g/L，約3.5g/L-約4.1g/L，約3.5g/L-約4.0g/L，約3.5g/L-約3.9g/L，約3.5g/L-約3.8g/L，約3.5g/L-約3.7g/L，約3.6g/L-約4.3g/L，
約3.6g/L-約4.2g/L，約3.6g/L-約4.1g/L，約3.6g/L-約4.0g/L，約3.6g/L-約3.9g/L，約3.6g/L-約3.8g/L，約3.7g/L-約4.3g/L，約3.7g/L-約4.2g/L，約3.7g/L-約4.1g/L，約3.7g/L-約4.0g/L，約3.7g/L-約3.9g/L，約3.8g/L-約4.3g/L，約3.8g/L-約4.2g/L，約3.8g/L-約4.1g/L，約3.8g/L-約4.0g/L，約3.9g/L-約4.3g/L，約3.9g/L-約4.2g/L，約3.9g/L-約4.1g/L，約4.0g/L-約4.3g/L，約4.0g/L-約4.2g/L，或約4.1g/L-約4.3g/L)的poloxamer-188。
所述方法可包括，例如，當孔類型是燒結孔且孔徑為約1μm-約80μm(例如，約1μm-約50μm，約1μm-約25μm，約1μm-約10μm，約1μm-約5μm，約5μm-約80μm，約5μm-約50μm，約5μm-約25μm，約5μm-約10μm，約10μm-約80μm，約10μm-約50μm，約10μm-約25μm，約25μm-約80μm，約25μm-約50μm，或者約50μm-約80μm)時，基於孔類型和孔徑選擇濃度為約4.5g/L或濃度高於約4.5g/L(例如，濃度為約4.6g/L或濃度為大於4.6g/L，濃度為約4.7g/L或濃度為大於4.7g/L，濃度為約4.8g/L或濃度為大於4.8g/L，濃度為約4.9g/L或濃度為大於4.9g/L，濃度為約5.0g/L或濃度為大於5.0g/L，濃度為約5.1g/L或濃度為大於5.1g/L，濃度為約5.2g/L或濃度為大於5.2g/L，濃度為約5.3g/L或濃度為大於5.3g/L，濃度為約5.4g/L或濃度為大於5.4g/L，濃度為約5.5g/L或濃度為大於5.5g/L，濃度為約5.6g/L或濃度為大於5.6g/L，濃度為約5.7g/L或濃度為大於5.7g/L，濃度為約5.8g/L或濃度為大於5.8g/L，濃度為約6.0g/L或濃度為大於6.0g/L，濃度為約6.1g/L或濃度為大於6.1g/L，濃度為約6.2g/L或濃度為大於6.2g/L，濃度為約6.3g/L或濃度為大於6.3g/L，濃度為約6.4g/L或濃度為大於6.4g/L，濃度為約6.5g/L或濃度為大於6.5g/L，濃度為約6.6g/L或濃度為大於6.6g/L，濃度為約6.7g/L或濃度為大於6.7g/L，濃度為約6.8g/L或濃度為大於6.8g/L，濃度為約6.9g/L或濃度為大於6.9g/L，濃度為約7.0g/L或濃度為大於7.0g/L，濃度為約7.1g/L或濃度為大於7.1g/L，濃度為約7.2g/L或濃度為大於7.2g/L，濃度為約7.3g/L或濃度為大於7.3g/L，濃度為約7.4g/L或濃度為大於7.4g/L，濃度為約7.5g/L或濃度為大於7.5g/L，濃度為約7.6g/L或濃度為大於7.6g/L，濃度為約7.7g/L或濃度為大於7.7g/L，濃度為約7.8g/L或濃度為大於7.8g/L，濃度為約7.9g/L或濃度為大於7.9g/L，濃度為約8.0g/L或濃度為大於8.0g/L，濃度為約8.1g/L或濃度為大於8.1g/L，濃度為約8.2g/L或濃度為大於8.2g/L，濃度為約8.3g/L或濃度為大於8.3g/L，濃度為約8.4g/L或濃度為大於8.4g/L，濃度為約8.5g/L或濃度為大於8.5g/L，
濃度為約8.6g/L或濃度為大於8.6g/L，濃度為約8.7g/L或濃度為大於8.7g/L，濃度為約8.8g/L或濃度為大於8.8g/L，濃度為約8.9g/L或濃度為大於8.9g/L，濃度為約9.0g/L或濃度為大於9.0g/L，濃度為約9.1g/L或濃度為大於9.1g/L，濃度為約9.2g/L或濃度為大於9.2g/L，濃度為約9.3g/L或濃度為大於9.3g/L，濃度為約9.4g/L或濃度為大於9.4g/L，濃度為約9.5g/L或濃度為大於9.5g/L，濃度為約9.6g/L或濃度為大於9.6g/L，濃度為約9.7g/L或濃度為大於9.7g/L，濃度為約9.8g/L或濃度為大於9.8g/L，濃度為約9.9g/L或濃度為大於9.9g/L，或濃度為約10.0g/L或濃度為大於10.0g/L)的poloxamer-188。
當所述培養為灌注培養時，第二液體培養基可包括選擇的poloxamer-188濃度。
基於活細胞密度增加Poloxamer-188濃度
本案所述的任何方法的一些實施方案包括基於培養基中的活細胞密度隨時間增加培養基中的poloxamer-188濃度。例如，本案所述的任何方法可包括當培養基中的活細胞密度為約20 x 106細胞/mL至約60 x 106細胞/mL(例如，約20 x 106細胞/mL-約58 x 106細胞/mL，約20 x 106細胞/mL至約56 x 106細胞/mL，約20 x 106細胞/mL-約54 x 106細胞/mL，約20 x 106細胞/mL-約52 x 106細胞/mL，約20 x 106細胞/mL-約50 x 106細胞/mL，約20 x 106細胞/mL-約48 x 106細胞/mL，約20 x 106細胞/mL-約46 x 106細胞/mL，約20 x 106細胞/mL-約44 x 106細胞/mL，約20 x 106細胞/mL-約42 x 106細胞/mL，約20 x 106細胞/mL至約40 x 106細胞/mL，約20 x 106細胞/mL-約38 x 106細胞/mL，約20 x 106細胞/mL-約36 x 106細胞/mL，約20 x 106細胞/mL-約34 x 106細胞/mL，約20 x 106細胞/mL-約32 x 106細胞/mL，約20 x 106細胞/mL-約30 x 106細胞/mL，約20 x 106細胞/mL至約28 x 106細胞/mL，約20 x 106細胞/mL-約26 x 106細胞/mL，約20 x 106細胞/mL-約24 x 106細胞/mL，約20 x 106細胞/mL-約22 x 106細胞/mL，約22 x 106細胞/mL-約60 x 106細胞/mL，約22 x 106細胞/mL-約58 x 106細胞/mL，約22 x 106細胞/mL至約56 x 106細胞/mL，約22 x 106細胞/mL-約54 x 106細胞/mL，約22 x 106細胞/mL-約52 x 106細胞/mL，約22 x 106細胞/mL-約50 x 106細胞/mL，約22 x 106細胞/mL-約48 x 106細胞/mL，約22 x 106細胞/mL-約46 x 106細胞/mL，約22 x 106細胞/mL-約44 x 106細胞/mL，約22 x 106細胞/mL-約42 x 106細胞/mL，約22 x 106細胞/mL至約40 x 106細胞/mL，約22 x 106細胞/mL-約38 x 106細胞/mL，約22 x 106細胞/mL-約36 x 106細胞/mL，約22 x 106
細胞/mL-約34 x 106細胞/mL，約22 x 106細胞/mL-約32 x 106細胞/mL，約22 x 106細胞/mL-約30 x 106細胞/mL，約22 x 106細胞/mL至約28 x 106細胞/mL，約22 x 106細胞/mL-約26 x 106細胞/mL，約22 x 106細胞/mL-約24 x 106細胞/mL，約24 x 106細胞/mL-約60 x 106細胞/mL，約24 x 106細胞/mL-約58 x 106細胞/mL，約24 x 106細胞/mL至約56 x 106細胞/mL，約24 x 106細胞/mL-約54 x 106細胞/mL，約24 x 106細胞/mL-約52 x 106細胞/mL，約24 x 106細胞/mL-約50 x 106細胞/mL，約24 x 106細胞/mL-約48 x 106細胞/mL，約24 x 106細胞/mL-約46 x 106細胞/mL，約24 x 106細胞/mL-約44 x 106細胞/mL，約24 x 106細胞/mL-約42 x 106細胞/mL，約24 x 106細胞/mL至約40 x 106細胞/mL，約24 x 106細胞/mL-約38 x 106細胞/mL，約24 x 106細胞/mL-約36 x 106細胞/mL，約24 x 106細胞/mL-約34 x 106細胞/mL，約24 x 106細胞/mL-約32 x 106細胞/mL，約24 x 106細胞/mL-約30 x 106細胞/mL，約24 x 106細胞/mL至約28 x 106細胞/mL，約24 x 106細胞/mL-約26 x 106細胞/mL，約26 x 106細胞/mL-約60 x 106細胞/mL，約26 x 106細胞/mL-約58 x 106細胞/mL，約26 x 106細胞/mL至約56 x 106細胞/mL，約26 x 106細胞/mL-約54 x 106細胞/mL，約26 x 106細胞/mL-約52 x 106細胞/mL，約26 x 106細胞/mL-約50 x 106細胞/mL，約26 x 106細胞/mL-約48 x 106細胞/mL，約26 x 106細胞/mL-約46 x 106細胞/mL，約26 x 106細胞/mL-約44 x 106細胞/mL，約26 x 106細胞/mL-約42 x 106細胞/mL，約26 x 106細胞/mL至約40 x 106細胞/mL，約26 x 106細胞/mL-約38 x 106細胞/mL，約26 x 106細胞/mL-約36 x 106細胞/mL，約26 x 106細胞/mL-約34 x 106細胞/mL，約26 x 106細胞/mL-約32 x 106細胞/mL，約26 x 106細胞/mL-約30 x 106細胞/mL，約26 x 106細胞/mL至約28 x 106細胞/mL，約28 x 106細胞/mL-約60 x 106細胞/mL，約28 x 106細胞/mL-約58 x 106細胞/mL，約28 x 106細胞/mL至約56 x 106細胞/mL，約28 x 106細胞/mL-約54 x 106細胞/mL，約28 x 106細胞/mL-約52 x 106細胞/mL，約28 x 106細胞/mL-約50 x 106細胞/mL，約28 x 106細胞/mL-約48 x 106細胞/mL，約28 x 106細胞/mL-約46 x 106細胞/mL，約28 x 106細胞/mL-約44 x 106細胞/mL，約28 x 106細胞/mL-約42 x 106細胞/mL，約28 x 106細胞/mL至約40 x 106細胞/mL，約28 x 106細胞/mL-約38 x 106細胞/mL，約28 x 106細胞/mL-約36 x 106細胞/mL，約28 x 106細胞/mL-約34 x 106細胞/mL，約28 x 106細胞/mL-約32 x 106細胞/mL，約28 x 106細胞/mL-約30 x 106細胞/mL，約30 x 106細胞/mL-約60 x 106細胞/mL，約30 x 106細胞/mL-約58 x 106細胞/mL，約30 x 106細胞/mL至約56 x 106細胞/mL，約30 x 106
細胞/mL-約54 x 106細胞/mL，約30 x 106細胞/mL-約52 x 106細胞/mL，約30 x 106細胞/mL-約50 x 106細胞/mL，約30 x 106細胞/mL-約48 x 106細胞/mL，約30 x 106細胞/mL-約46 x 106細胞/mL，約30 x 106細胞/mL-約44 x 106細胞/mL，約30 x 106細胞/mL-約42 x 106細胞/mL，約30 x 106細胞/mL至約40 x 106細胞/mL，約30 x 106細胞/mL-約38 x 106細胞/mL，約30 x 106細胞/mL-約36 x 106細胞/mL，約30 x 106細胞/mL-約34 x 106細胞/mL，約30 x 106細胞/mL-約32 x 106細胞/mL，約32 x 106細胞/mL-約60 x 106細胞/mL，約32 x 106細胞/mL-約58 x 106細胞/mL，約32 x 106細胞/mL至約56 x 106細胞/mL，約32 x 106細胞/mL-約54 x 106細胞/mL，約32 x 106細胞/mL-約52 x 106細胞/mL，約32 x 106細胞/mL-約50 x 106細胞/mL，約32 x 106細胞/mL-約48 x 106細胞/mL，約32 x 106細胞/mL-約46 x 106細胞/mL，約32 x 106細胞/mL-約44 x 106細胞/mL，約32 x 106細胞/mL-約42 x 106細胞/mL，約32 x 106細胞/mL至約40 x 106細胞/mL，約32 x 106細胞/mL-約38 x 106細胞/mL，約32 x 106細胞/mL-約36 x 106細胞/mL，約32 x 106細胞/mL-約34 x 106細胞/mL，約34 x 106細胞/mL-約60 x 106細胞/mL，約34 x 106細胞/mL-約58 x 106細胞/mL，約34 x 106細胞/mL至約56 x 106細胞/mL，約34 x 106細胞/mL-約54 x 106細胞/mL，約34 x 106細胞/mL-約52 x 106細胞/mL，約34 x 106細胞/mL-約50 x 106細胞/mL，約34 x 106細胞/mL-約48 x 106細胞/mL，約34 x 106細胞/mL-約46 x 106細胞/mL，約34 x 106細胞/mL-約44 x 106細胞/mL，約34 x 106細胞/mL-約42 x 106細胞/mL，約34 x 106細胞/mL至約40 x 106細胞/mL，約34 x 106細胞/mL-約38 x 106細胞/mL，約34 x 106細胞/mL-約36 x 106細胞/mL，約36 x 106細胞/mL-約60 x 106細胞/mL，約36 x 106細胞/mL-約58 x 106細胞/mL，約36 x 106細胞/mL至約56 x 106細胞/mL，約36 x 106細胞/mL-約54 x 106細胞/mL，約36 x 106細胞/mL-約52 x 106細胞/mL，約36 x 106細胞/mL-約50 x 106細胞/mL，約36 x 106細胞/mL-約48 x 106細胞/mL，約36 x 106細胞/mL-約46 x 106細胞/mL，約36 x 106細胞/mL-約44 x 106細胞/mL，約36 x 106細胞/mL-約42 x 106細胞/mL，約36 x 106細胞/mL至約40 x 106細胞/mL，約36 x 106細胞/mL-約38 x 106細胞/mL，約38 x 106細胞/mL-約60 x 106細胞/mL，約38 x 106細胞/mL-約58 x 106細胞/mL，約38 x 106細胞/mL至約56 x 106細胞/mL，約38 x 106細胞/mL-約54 x 106細胞/mL，約38 x 106細胞/mL-約52 x 106細胞/mL，約38 x 106細胞/mL-約50 x 106細胞/mL，約38 x 106細胞/mL-約48 x 106細胞/mL，約38 x 106細胞/mL-約46 x 106細胞/mL，約38 x 106細胞/mL-約44 x 106細胞/mL，約38 x 106
細胞/mL-約42 x 106細胞/mL，約38 x 106細胞/mL至約40 x 106細胞/mL，約40 x 106細胞/mL-約60 x 106細胞/mL，約40 x 106細胞/mL-約58 x 106細胞/mL，約40 x 106細胞/mL至約56 x 106細胞/mL，約40 x 106細胞/mL-約54 x 106細胞/mL，約40 x 106細胞/mL-約52 x 106細胞/mL，約40 x 106細胞/mL-約50 x 106細胞/mL，約40 x 106細胞/mL-約48 x 106細胞/mL，約40 x 106細胞/mL-約46 x 106細胞/mL，約40 x 106細胞/mL-約44 x 106細胞/mL，約40 x 106細胞/mL-約42 x 106細胞/mL，約42 x 106細胞/mL-約60 x 106細胞/mL，約42 x 106細胞/mL-約58 x 106細胞/mL，約42 x 106細胞/mL至約56 x 106細胞/mL，約42 x 106細胞/mL-約54 x 106細胞/mL，約42 x 106細胞/mL-約52 x 106細胞/mL，約42 x 106細胞/mL-約50 x 106細胞/mL，約42 x 106細胞/mL-約48 x 106細胞/mL，約42 x 106細胞/mL-約46 x 106細胞/mL，約42 x 106細胞/mL-約44 x 106細胞/mL，約44 x 106細胞/mL-約60 x 106細胞/mL，約44 x 106細胞/mL-約58 x 106細胞/mL，約44 x 106細胞/mL至約56 x 106細胞/mL，約44 x 106細胞/mL-約54 x 106細胞/mL，約44 x 106細胞/mL-約52 x 106細胞/mL，約44 x 106細胞/mL-約50 x 106細胞/mL，約44 x 106細胞/mL-約48 x 106細胞/mL，約44 x 106細胞/mL-約46 x 106細胞/mL，約46 x 106細胞/mL-約60 x 106細胞/mL，約46 x 106細胞/mL-約58 x 106細胞/mL，約46 x 106細胞/mL至約56 x 106細胞/mL，約46 x 106細胞/mL-約54 x 106細胞/mL，約46 x 106細胞/mL-約52 x 106細胞/mL，約46 x 106細胞/mL-約50 x 106細胞/mL，約46 x 106細胞/mL-約48 x 106細胞/mL，約48 x 106細胞/mL-約60 x 106細胞/mL，約48 x 106細胞/mL-約58 x 106細胞/mL，約48 x 106細胞/mL至約56 x 106細胞/mL，約48 x 106細胞/mL-約54 x 106細胞/mL，約48 x 106細胞/mL-約52 x 106細胞/mL，約48 x 106細胞/mL-約50 x 106細胞/mL，約50 x 106細胞/mL-約60 x 106細胞/mL，約50 x 106細胞/mL-約58 x 106細胞/mL，約50 x 106細胞/mL至約56 x 106細胞/mL，約50 x 106細胞/mL-約54 x 106細胞/mL，約50 x 106細胞/mL-約52 x 106細胞/mL，約52 x 106細胞/mL-約60 x 106細胞/mL，約52 x 106細胞/mL-約58 x 106細胞/mL，約52 x 106細胞/mL至約56 x 106細胞/mL，約52 x 106細胞/mL-約54 x 106細胞/mL，約54 x 106細胞/mL-約60 x 106細胞/mL，約54 x 106細胞/mL-約58 x 106細胞/mL，約54 x 106細胞/mL至約56 x 106細胞/mL，約56 x 106細胞/mL-約60 x 106細胞/mL，約56 x 106細胞/mL-約58 x 106細胞/mL，或約58 x 106細胞/mL-約60 x 106細胞/mL)時，將培養基中的poloxamer-188濃度增加到大於1.8g/L(例如，約1.8g/L-約3.0g/L，約1.8g/L-約2.9g/L，約1.8g/L-約2.8g/L，約
1.8g/L-約2.7g/L，約1.8g/L-約2.5g/L，約1.8g/L-約2.4g/L，約1.8g/L-約2.3g/L，約1.8g/L-約2.2g/L，約1.8g/L-約2.1g/L，約1.8g/L-約2.0g/L，約1.9g/L-約3.0g/L，約1.9g/L-約2.9g/L，約1.9g/L-約2.8g/L，約1.9g/L-約2.7g/L，約1.9g/L-約2.6g/L，約1.9g/L-約2.5g/L，約1.9g/L-約2.4g/L，約1.9g/L-約2.3g/L，約1.9g/L-約2.2g/L，約1.9g/L-約2.1g/L，約2.0g/L-約3.0g/L，約2.0g/L-約2.9g/L，約2.0g/L-約2.8g/L，約2.0g/L-約2.7g/L，約2.0g/L-約2.6g/L，約2.0g/L-約2.5g/L，約2.0g/L-約2.4g/L，約2.0g/L-約2.3g/L，約2.0g/L-約2.2g/L，約2.1g/L-約3.0g/L，約2.1g/L-約2.9g/L，約2.1g/L-約2.8g/L，約2.1g/L-約2.7g/L，約2.1g/L-約2.6g/L，約2.1g/L-約2.5g/L，約2.1g/L-約2.4g/L，約2.1g/L-約2.3g/L，約2.2g/L-約3.0g/L，約2.2g/L-約2.9g/L，約2.2g/L-約2.8g/L，約2.2g/L-約2.7g/L，約2.2g/L-約2.6g/L，約2.2g/L-約2.5g/L，約2.2g/L-約2.4g/L，約2.3g/L-約3.0g/L，約2.3g/L-約2.9g/L，約2.3g/L-約2.8g/L，約2.3g/L-約2.7g/L，約2.3g/L-約2.6g/L，約2.3g/L-約2.5g/L，約2.4g/L-約3.0g/L，約2.4g/L-約2.9g/L，約2.4g/L-約2.8g/L，約2.4g/L-約2.7g/L，約2.4g/L-約2.6g/L，約2.5g/L-約3.0g/L，約2.5g/L-約2.9g/L，約2.5g/L-約2.8g/L，約2.5g/L-約2.7g/L，約2.6g/L-約3.0g/L，約2.6g/L-約2.9g/L，約2.6g/L-約2.8g/L，約2.7g/L-約3.0g/L，約2.7g/L-約2.9g/L，或者約2.8g/L-約3.0g/L)。
本案所述的任何方法可包括當培養基中的活細胞密度為約60 x 106細胞/mL至約90 x 106細胞/mL(例如，約60 x 106細胞/mL-約88 x 106細胞/mL，約60 x 106細胞/mL至約86 x 106細胞/mL，約60 x 106細胞/mL-約84 x 106細胞/mL，約60 x 106細胞/mL-約82 x 106細胞/mL，約60 x 106細胞/mL-約80 x 106細胞/mL，約60 x 106細胞/mL-約78 x 106細胞/mL，約60 x 106細胞/mL-約76 x 106細胞/mL，約60 x 106細胞/mL-約74 x 106細胞/mL，約60 x 106細胞/mL-約72 x 106細胞/mL，約60 x 106細胞/mL至約70 x 106細胞/mL，約60 x 106細胞/mL-約68 x 106細胞/mL，約60 x 106細胞/mL-約66 x 106細胞/mL，約60 x 106細胞/mL-約64 x 106細胞/mL，約60 x 106細胞/mL-約62 x 106細胞/mL，約62 x 106細胞/mL-約90 x 106細胞/mL，約62 x 106細胞/mL-約88 x 106細胞/mL，約62 x 106細胞/mL至約86 x 106細胞/mL，約62 x 106細胞/mL-約84 x 106細胞/mL，約62 x 106細胞/mL-約82 x 106細胞/mL，約62 x 106細胞/mL-約80 x 106細胞/mL，約62 x 106細胞/mL-約78 x 106細胞/mL，約62 x 106細胞/mL-約76 x 106細胞/mL，約62 x 106細胞/mL-約74 x 106細胞/mL，約62 x 106細胞/mL-約72 x 106細胞/mL，約62 x 106細胞/mL至約70 x 106細胞/mL，約62 x 106
細胞/mL-約68 x 106細胞/mL，約62 x 106細胞/mL-約66 x 106細胞/mL，約62 x 106細胞/mL-約64 x 106細胞/mL，約64 x 106細胞/mL-約90 x 106細胞/mL，約64 x 106細胞/mL-約88 x 106細胞/mL，約64 x 106細胞/mL至約86 x 106細胞/mL，約64 x 106細胞/mL-約84 x 106細胞/mL，約64 x 106細胞/mL-約82 x 106細胞/mL，約64 x 106細胞/mL-約80 x 106細胞/mL，約64 x 106細胞/mL-約78 x 106細胞/mL，約64 x 106細胞/mL-約76 x 106細胞/mL，約64 x 106細胞/mL-約74 x 106細胞/mL，約64 x 106細胞/mL-約72 x 106細胞/mL，約64 x 106細胞/mL至約70 x 106細胞/mL，約64 x 106細胞/mL-約68 x 106細胞/mL，約64 x 106細胞/mL-約66 x 106細胞/mL，約66 x 106細胞/mL-約90 x 106細胞/mL，約66 x 106細胞/mL-約88 x 106細胞/mL，約66 x 106細胞/mL至約86 x 106細胞/mL，約66 x 106細胞/mL-約84 x 106細胞/mL，約66 x 106細胞/mL-約82 x 106細胞/mL，約66 x 106細胞/mL-約80 x 106細胞/mL，約66 x 106細胞/mL-約78 x 106細胞/mL，約66 x 106細胞/mL-約76 x 106細胞/mL，約66 x 106細胞/mL-約74 x 106細胞/mL，約66 x 106細胞/mL-約72 x 106細胞/mL，約66 x 106細胞/mL至約70 x 106細胞/mL，約66 x 106細胞/mL-約68 x 106細胞/mL，約68 x 106細胞/mL-約90 x 106細胞/mL，約68 x 106細胞/mL-約88 x 106細胞/mL，約68 x 106細胞/mL至約86 x 106細胞/mL，約68 x 106細胞/mL-約84 x 106細胞/mL，約68 x 106細胞/mL-約82 x 106細胞/mL，約68 x 106細胞/mL-約80 x 106細胞/mL，約68 x 106細胞/mL-約78 x 106細胞/mL，約68 x 106細胞/mL-約76 x 106細胞/mL，約68 x 106細胞/mL-約74 x 106細胞/mL，約68 x 106細胞/mL-約72 x 106細胞/mL，約68 x 106細胞/mL至約70 x 106細胞/mL，約70 x 106細胞/mL-約90 x 106細胞/mL，約70 x 106細胞/mL-約88 x 106細胞/mL，約70 x 106細胞/mL至約86 x 106細胞/mL，約70 x 106細胞/mL-約84 x 106細胞/mL，約70 x 106細胞/mL-約82 x 106細胞/mL，約70 x 106細胞/mL-約80 x 106細胞/mL，約70 x 106細胞/mL-約78 x 106細胞/mL，約70 x 106細胞/mL-約76 x 106細胞/mL，約70 x 106細胞/mL-約74 x 106細胞/mL，約70 x 106細胞/mL-約72 x 106細胞/mL，約72 x 106細胞/mL-約90 x 106細胞/mL，約72 x 106細胞/mL-約88 x 106細胞/mL，約72 x 106細胞/mL至約86 x 106細胞/mL，約72 x 106細胞/mL-約84 x 106細胞/mL，約72 x 106細胞/mL-約82 x 106細胞/mL，約72 x 106細胞/mL-約80 x 106細胞/mL，約72 x 106細胞/mL-約78 x 106細胞/mL，約72 x 106細胞/mL-約76 x 106細胞/mL，約72 x 106細胞/mL-約74 x 106細胞/mL，約74 x 106細胞/mL-約90 x 106細胞/mL，約74 x 106細胞/mL-約88 x 106細胞/mL，約74 x 106
細胞/mL至約86 x 106細胞/mL，約74 x 106細胞/mL-約84 x 106細胞/mL，約74 x 106細胞/mL-約82 x 106細胞/mL，約74 x 106細胞/mL-約80 x 106細胞/mL，約74 x 106細胞/mL-約78 x 106細胞/mL，約74 x 106細胞/mL-約76 x 106細胞/mL，約76 x 106細胞/mL-約90 x 106細胞/mL，約76 x 106細胞/mL-約88 x 106細胞/mL，約76 x 106細胞/mL至約86 x 106細胞/mL，約76 x 106細胞/mL-約84 x 106細胞/mL，約76 x 106細胞/mL-約82 x 106細胞/mL，約76 x 106細胞/mL-約80 x 106細胞/mL，約76 x 106細胞/mL-約78 x 106細胞/mL，約78 x 106細胞/mL-約90 x 106細胞/mL，約78 x 106細胞/mL-約88 x 106細胞/mL，約78 x 106細胞/mL至約86 x 106細胞/mL，約78 x 106細胞/mL-約84 x 106細胞/mL，約78 x 106細胞/mL-約82 x 106細胞/mL，約78 x 106細胞/mL-約80 x 106細胞/mL，約80 x 106細胞/mL-約90 x 106細胞/mL，約80 x 106細胞/mL-約88 x 106細胞/mL，約80 x 106細胞/mL至約86 x 106細胞/mL，約80 x 106細胞/mL-約84 x 106細胞/mL，約80 x 106細胞/mL-約82 x 106細胞/mL，約82 x 106細胞/mL-約90 x 106細胞/mL，約82 x 106細胞/mL-約88 x 106細胞/mL，約82 x 106細胞/mL至約86 x 106細胞/mL，約82 x 106細胞/mL-約84 x 106細胞/mL，約84 x 106細胞/mL-約90 x 106細胞/mL，約84 x 106細胞/mL-約88 x 106細胞/mL，約84 x 106細胞/mL至約86 x 106細胞/mL，約86 x 106細胞/mL-約90 x 106細胞/mL，約86 x 106細胞/mL-約88 x 106細胞/mL，或約88 x 106細胞/mL-約90 x 106細胞/mL)時，將培養基中的poloxamer-188濃度增加到約3.0g/L-約6.0g/L(例如，約3.0g/L-約5.9g/L，約3.0g/L-約5.8g/L，約3.0g/L-約5.7g/L，約3.0g/L-約5.6g/L，約3.0g/L-約5.5g/L，約3.0g/L-約5.4g/L，約3.0g/L-約5.3g/L，約3.0g/L-約5.2g/L，約3.0g/L-約5.1g/L，約3.0g/L-約5.0g/L，約3.0g/L-約4.9g/L，約3.0g/L-約4.8g/L，約3.0g/L-約4.7g/L，約3.0g/L-約4.6g/L，約3.0g/L-約4.5g/L，約3.0g/L-約4.4g/L，約3.0g/L-約4.3g/L，約3.0g/L-約4.2g/L，約3.0g/L-約4.1g/L，約3.0g/L-約4.0g/L，約3.0g/L-約3.9g/L，約3.0g/L-約3.8g/L，約3.0g/L-約3.7g/L，約3.0g/L-約3.6g/L，約3.0g/L-約3.5g/L，約3.0g/L-約3.4g/L，約3.0g/L-約3.3g/L，約3.0g/L-約3.2g/L，約3.1g/L-約6.0g/L，約3.1g/L-約5.9g/L，約3.1g/L-約5.8g/L，約3.1g/L-約5.7g/L，約3.1g/L-約5.6g/L，約3.1g/L-約5.5g/L，約3.1g/L-約5.4g/L，約3.1g/L-約5.3g/L，約3.1g/L-約5.2g/L，約3.1g/L-約5.1g/L，約3.1g/L-約5.0g/L，約3.1g/L-約4.9g/L，約3.1g/L-約4.8g/L，約3.1g/L-約4.7g/L，約3.1g/L-約4.6g/L，約3.1g/L-約4.5g/L，約3.1g/L-約4.4g/L，約3.1g/L-約4.3g/L，約3.1g/L-約4.2g/L，約3.1g/L-約4.1g/L，約3.1g/L-約4.0g/L，
約3.1g/L-約3.9g/L，約3.1g/L-約3.8g/L，約3.1g/L-約3.7g/L，約3.1g/L-約3.6g/L，約3.1g/L-約3.5g/L，約3.1g/L-約3.4g/L，約3.1g/L-約3.3g/L，約3.2g/L-約6.0g/L，約3.2g/L-約5.9g/L，約3.2g/L-約5.8g/L，約3.2g/L-約5.7g/L，約3.2g/L-約5.6g/L，約3.2g/L-約5.5g/L，約3.2g/L-約5.4g/L，約3.2g/L-約5.3g/L，約3.2g/L-約5.2g/L，約3.2g/L-約5.1g/L，約3.2g/L-約5.0g/L，約3.2g/L-約4.9g/L，約3.2g/L-約4.8g/L，約3.2g/L-約4.7g/L，約3.2g/L-約4.6g/L，約3.2g/L-約4.5g/L，約3.2g/L-約4.4g/L，約3.2g/L-約4.3g/L，約3.2g/L-約4.2g/L，約3.2g/L-約4.1g/L，約3.2g/L-約4.0g/L，約3.2g/L-約3.9g/L，約3.2g/L-約3.8g/L，約3.2g/L-約3.7g/L，約3.2g/L-約3.6g/L，約3.2g/L-約3.5g/L，約3.2g/L-約3.4g/L，約3.3g/L-約6.0g/L，約3.3g/L-約5.9g/L，約3.3g/L-約5.8g/L，約3.3g/L-約5.7g/L，約3.3g/L-約5.6g/L，約3.3g/L-約5.5g/L，約3.3g/L-約5.4g/L，約3.3g/L-約5.3g/L，約3.3g/L-約5.2g/L，約3.3g/L-約5.1g/L，約3.3g/L-約5.0g/L，約3.3g/L-約4.9g/L，約3.3g/L-約4.8g/L，約3.3g/L-約4.7g/L，約3.3g/L-約4.6g/L，約3.3g/L-約4.5g/L，約3.3g/L-約4.4g/L，約3.3g/L-約4.3g/L，約3.3g/L-約4.2g/L，約3.3g/L-約4.1g/L，約3.3g/L-約4.0g/L，約3.3g/L-約3.9g/L，約3.3g/L-約3.8g/L，約3.3g/L-約3.7g/L，約3.3g/L-約3.6g/L，約3.3g/L-約3.5g/L，約3.4g/L-約6.0g/L，約3.4g/L-約5.9g/L，約3.4g/L-約5.8g/L，約3.4g/L-約5.7g/L，約3.4g/L-約5.6g/L，約3.4g/L-約5.5g/L，約3.4g/L-約5.4g/L，約3.4g/L-約5.3g/L，約3.4g/L-約5.2g/L，約3.4g/L-約5.1g/L，約3.4g/L-約5.0g/L，約3.4g/L-約4.9g/L，約3.4g/L-約4.8g/L，約3.4g/L-約4.7g/L，約3.4g/L-約4.6g/L，約3.4g/L-約4.5g/L，約3.4g/L-約4.4g/L，約3.4g/L-約4.3g/L，約3.4g/L-約4.2g/L，約3.4g/L-約4.1g/L，約3.4g/L-約4.0g/L，約3.4g/L-約3.9g/L，約3.4g/L-約3.8g/L，約3.4g/L-約3.7g/L，約3.4g/L-約3.6g/L，約3.5g/L-約6.0g/L，約3.5g/L-約5.9g/L，約3.5g/L-約5.8g/L，約3.5g/L-約5.7g/L，約3.5g/L-約5.6g/L，約3.5g/L-約5.5g/L，約3.5g/L-約5.4g/L，約3.5g/L-約5.3g/L，約3.5g/L-約5.2g/L，約3.5g/L-約5.1g/L，約3.5g/L-約5.0g/L，約3.5g/L-約4.9g/L，約3.5g/L-約4.8g/L，約3.5g/L-約4.7g/L，約3.5g/L-約4.6g/L，約3.5g/L-約4.5g/L，約3.5g/L-約4.4g/L，約3.5g/L-約4.3g/L，約3.5g/L-約4.2g/L，約3.5g/L-約4.1g/L，約3.5g/L-約4.0g/L，約3.5g/L-約3.9g/L，約3.5g/L-約3.8g/L，約3.5g/L-約3.7g/L，約3.6g/L-約6.0g/L，約3.6g/L-約5.9g/L，約3.6g/L-約5.8g/L，約3.6g/L-約5.7g/L，約3.6g/L-約5.6g/L，約3.6g/L-約5.5g/L，約3.6g/L-約5.4g/L，約3.6g/L-約5.3g/L，約3.6g/L-約5.2g/L，約3.6g/L-約5.1g/L，約3.6g/L-約5.0g/L，
約3.6g/L-約4.9g/L，約3.6g/L-約4.8g/L，約3.6g/L-約4.7g/L，約3.6g/L-約4.6g/L，約3.6g/L-約4.5g/L，約3.6g/L-約4.4g/L，約3.6g/L-約4.3g/L，約3.6g/L-約4.2g/L，約3.6g/L-約4.1g/L，約3.6g/L-約4.0g/L，約3.6g/L-約3.9g/L，約3.6g/L-約3.8g/L，約3.7g/L-約6.0g/L，約3.7g/L-約5.9g/L，約3.7g/L-約5.8g/L，約3.7g/L-約5.7g/L，約3.7g/L-約5.6g/L，約3.7g/L-約5.5g/L，約3.7g/L-約5.4g/L，約3.7g/L-約5.3g/L，約3.7g/L-約5.2g/L，約3.7g/L-約5.1g/L，約3.7g/L-約5.0g/L，約3.7g/L-約4.9g/L，約3.7g/L-約4.8g/L，約3.7g/L-約4.7g/L，約3.7g/L-約4.6g/L，約3.7g/L-約4.5g/L，約3.7g/L-約4.4g/L，約3.7g/L-約4.3g/L，約3.7g/L-約4.2g/L，約3.7g/L-約4.1g/L，約3.7g/L-約4.0g/L，約3.7g/L-約3.9g/L，約3.8g/L-約6.0g/L，約3.8g/L-約5.9g/L，約3.8g/L-約5.8g/L，約3.8g/L-約5.7g/L，約3.8g/L-約5.6g/L，約3.8g/L-約5.5g/L，約3.8g/L-約5.4g/L，約3.8g/L-約5.3g/L，約3.8g/L-約5.2g/L，約3.8g/L-約5.1g/L，約3.8g/L-約5.0g/L，約3.8g/L-約4.9g/L，約3.8g/L-約4.8g/L，約3.8g/L-約4.7g/L，約3.8g/L-約4.6g/L，約3.8g/L-約4.5g/L，約3.8g/L-約4.4g/L，約3.8g/L-約4.3g/L，約3.8g/L-約4.2g/L，約3.8g/L-約4.1g/L，約3.8g/L-約4.0g/L，約3.9g/L-約6.0g/L，約3.9g/L-約5.9g/L，約3.9g/L-約5.8g/L，約3.9g/L-約5.7g/L，約3.9g/L-約5.6g/L，約3.9g/L-約5.5g/L，約3.9g/L-約5.4g/L，約3.9g/L-約5.3g/L，約3.9g/L-約5.2g/L，約3.9g/L-約5.1g/L，約3.9g/L-約5.0g/L，約3.9g/L-約4.9g/L，約3.9g/L-約4.8g/L，約3.9g/L-約4.7g/L，約3.9g/L-約4.6g/L，約3.9g/L-約4.5g/L，約3.9g/L-約4.4g/L，約3.9g/L-約4.3g/L，約3.9g/L-約4.2g/L，約3.9g/L-約4.1g/L，約4.0g/L-約6.0g/L，約4.0g/L-約5.9g/L，約4.0g/L-約5.8g/L，約4.0g/L-約5.7g/L，約4.0g/L-約5.6g/L，約4.0g/L-約5.5g/L，約4.0g/L-約5.4g/L，約4.0g/L-約5.3g/L，約4.0g/L-約5.2g/L，約4.0g/L-約5.1g/L，約4.0g/L-約5.0g/L，約4.0g/L-約4.9g/L，約4.0g/L-約4.8g/L，約4.0g/L-約4.7g/L，約4.0g/L-約4.6g/L，約4.0g/L-約4.5g/L，約4.0g/L-約4.4g/L，約4.0g/L-約4.3g/L，約4.0g/L-約4.2g/L，約4.1g/L-約6.0g/L，約4.1g/L-約5.9g/L，約4.1g/L-約5.8g/L，約4.1g/L-約5.7g/L，約4.1g/L-約5.6g/L，約4.1g/L-約5.5g/L，約4.1g/L-約5.4g/L，約4.1g/L-約5.3g/L，約4.1g/L-約5.2g/L，約4.1g/L-約5.1g/L，約4.1g/L-約5.0g/L，約4.1g/L-約4.9g/L，約4.1g/L-約4.8g/L，約4.1g/L-約4.7g/L，約4.1g/L-約4.6g/L，約4.1g/L-約4.5g/L，約4.1g/L-約4.4g/L，約4.1g/L-約4.3g/L，約4.2g/L-約6.0g/L，約4.2g/L-約5.9g/L，約4.2g/L-約5.8g/L，約4.2g/L-約5.7g/L，約4.2g/L-約5.6g/L，約4.2g/L-約5.5g/L，約4.2g/L-約5.4g/L，約4.2g/L-約5.3g/L，
約4.2g/L-約5.2g/L，約4.2g/L-約5.1g/L，約4.2g/L-約5.0g/L，約4.2g/L-約4.9g/L，約4.2g/L-約4.8g/L，約4.2g/L-約4.7g/L，約4.2g/L-約4.6g/L，約4.2g/L-約4.5g/L，約4.2g/L-約4.4g/L，約4.3g/L-約6.0g/L，約4.3g/L-約5.9g/L，約4.3g/L-約5.8g/L，約4.3g/L-約5.7g/L，約4.3g/L-約5.6g/L，約4.3g/L-約5.5g/L，約4.3g/L-約5.4g/L，約4.3g/L-約5.3g/L，約4.3g/L-約5.2g/L，約4.3g/L-約5.1g/L，約4.3g/L-約5.0g/L，約4.3g/L-約4.9g/L，約4.3g/L-約4.8g/L，約4.3g/L-約4.7g/L，約4.3g/L-約4.6g/L，約4.3g/L-約4.5g/L，約4.4g/L-約6.0g/L，約4.4g/L-約5.9g/L，約4.4g/L-約5.8g/L，約4.4g/L-約5.7g/L，約4.4g/L-約5.6g/L，約4.4g/L-約5.5g/L，約4.4g/L-約5.4g/L，約4.4g/L-約5.3g/L，約4.4g/L-約5.2g/L，約4.4g/L-約5.1g/L，約4.4g/L-約5.0g/L，約4.4g/L-約4.9g/L，約4.4g/L-約4.8g/L，約4.4g/L-約4.7g/L，約4.4g/L-約4.6g/L，約4.5g/L-約6.0g/L，約4.5g/L-約5.9g/L，約4.5g/L-約5.8g/L，約4.5g/L-約5.7g/L，約4.5g/L-約5.6g/L，約4.5g/L-約5.5g/L，約4.5g/L-約5.4g/L，約4.5g/L-約5.3g/L，約4.5g/L-約5.2g/L，約4.5g/L-約5.1g/L，約4.5g/L-約5.0g/L，約4.5g/L-約4.9g/L，約4.5g/L-約4.8g/L，約4.5g/L-約4.7g/L，約4.6g/L-約6.0g/L，約4.6g/L-約5.9g/L，約4.6g/L-約5.8g/L，約4.6g/L-約5.7g/L，約4.6g/L-約5.6g/L，約4.6g/L-約5.5g/L，約4.6g/L-約5.4g/L，約4.6g/L-約5.3g/L，約4.6g/L-約5.2g/L，約4.6g/L-約5.1g/L，約4.6g/L-約5.0g/L，約4.6g/L-約4.9g/L，約4.6g/L-約4.8g/L，約4.7g/L-約6.0g/L，約4.7g/L-約5.9g/L，約4.7g/L-約5.8g/L，約4.7g/L-約5.7g/L，約4.7g/L-約5.6g/L，約4.7g/L-約5.5g/L，約4.7g/L-約5.4g/L，約4.7g/L-約5.3g/L，約4.7g/L-約5.2g/L，約4.7g/L-約5.1g/L，約4.7g/L-約5.0g/L，約4.7g/L-約4.9g/L，約4.8g/L-約6.0g/L，約4.8g/L-約5.9g/L，約4.8g/L-約5.8g/L，約4.8g/L-約5.7g/L，約4.8g/L-約5.6g/L，約4.8g/L-約5.5g/L，約4.8g/L-約5.4g/L，約4.8g/L-約5.3g/L，約4.8g/L-約5.2g/L，約4.8g/L-約5.1g/L，約4.8g/L-約5.0g/L，約4.9g/L-約6.0g/L，約4.9g/L-約5.9g/L，約4.9g/L-約5.8g/L，約4.9g/L-約5.7g/L，約4.9g/L-約5.6g/L，約4.9g/L-約5.5g/L，約4.9g/L-約5.4g/L，約4.9g/L-約5.3g/L，約4.9g/L-約5.2g/L，約4.9g/L-約5.1g/L，約5.0g/L-約6.0g/L，約5.0g/L-約5.9g/L，約5.0g/L-約5.8g/L，約5.0g/L-約5.7g/L，約5.0g/L-約5.6g/L，約5.0g/L-約5.5g/L，約5.0g/L-約5.4g/L，約5.0g/L-約5.3g/L，約5.0g/L-約5.2g/L，約5.1g/L-約6.0g/L，約5.1g/L-約5.9g/L，約5.1g/L-約5.8g/L，約5.1g/L-約5.7g/L，約5.1g/L-約5.6g/L，約5.1g/L-約5.5g/L，約5.1g/L-約5.4g/L，約5.1g/L-約5.3g/L，約5.2g/L-約6.0g/L，約5.2g/L-約5.9g/L，約5.2g/L-約5.8g/L，
約5.2g/L-約5.7g/L，約5.2g/L-約5.6g/L，約5.2g/L-約5.5g/L，約5.2g/L-約5.4g/L，約5.3g/L-約6.0g/L，約5.3g/L-約5.9g/L，約5.3g/L-約5.8g/L，約5.3g/L-約5.7g/L，約5.3g/L-約5.6g/L，約5.3g/L-約5.5g/L，約5.4g/L-約6.0g/L，約5.4g/L-約5.9g/L，約5.4g/L-約5.8g/L，約5.4g/L-約5.7g/L，約5.4g/L-約5.6g/L，約5.5g/L-約6.0g/L，約5.5g/L-約5.9g/L，約5.5g/L-約5.8g/L，約5.5g/L-約5.7g/L，約5.6g/L-約6.0g/L，約5.6g/L-約5.9g/L，約5.6g/L-約5.8g/L，約5.7g/L-約6.0g/L，約5.7g/L-約5.9g/L，或約5.8g/L-約6.0g/L)。
本案所述的任何方法可包括當培養基中的活細胞密度為大於約90 x 106細胞/mL(例如，大於約91 x 106細胞/mL，大於約92 x 106細胞/mL，大於約93 x 106細胞/mL，大於約94 x 106細胞/mL，大於約95 x 106細胞/mL，大於約96 x 106細胞/mL，大於約97 x 106細胞/mL，大於約98 x 106細胞/mL，大於約99 x 106細胞/mL，大於約100 x 106細胞/mL，大於約101 x 106細胞/mL，大於約102 x 106細胞/mL，大於約103 x 106細胞/mL，大於約104 x 106細胞/mL，大於約105 x 106細胞/mL，大於約106 x 106細胞/mL，大於約107 x 106細胞/mL，大於約108 x 106細胞/mL，大於約109 x 106細胞/mL，大於約110 x 106細胞/mL，大於約111 x 106細胞/mL，大於約112 x 106細胞/mL，大於約113 x 106細胞/mL，大於約114 x 106細胞/mL，大於約115 x 106細胞/mL，大於約116 x 106細胞/mL，大於約117 x 106細胞/mL，大於約118 x 106細胞/mL，大於約119 x 106細胞/mL，或大於約120 x 106細胞/mL)時，將培養基中的poloxamer-188濃度增加到大於6.0g/L(例如，大於6.1g/L，大於6.2g/L，大於6.3g/L，大於6.4g/L，大於6.5g/L，大於6.6g/L，大於6.7g/L，大於6.8g/L，大於6.9g/L，大於7.0g/L，大於7.1g/L，大於7.2g/L，大於7.3g/L，大於7.4g/L，大於7.5g/L，大於7.6g/L，大於7.7g/L，大於7.8g/L，大於7.9g/L，大於8.0g/L，大於8.1g/L，大於8.2g/L，大於8.3g/L，大於8.4g/L，大於8.5g/L，大於8.6g/L，大於8.7g/L，大於8.8g/L，大於8.9g/L，大於9.0g/L，大於9.1g/L，大於9.2g/L，大於9.3g/L，大於9.4g/L，大於9.5g/L，大於9.6g/L，大於9.7g/L，大於9.8g/L，大於9.9g/L，大於10.0g/L，大於約10.1g/L，大於約10.2g/L，大於約10.3g/L，大於約10.4g/L，大於約10.5g/L，大於約10.6g/L，大於約10.7g/L，大於約10.8g/L，大於約10.9g/L，或大於約11.0g/L)poloxamer-188。
在一些實施方案中，所述方法包括：當培養基中的活細胞密度為約35 x 106細胞/mL至約60 x 106細胞/mL(例如，或本案所述的其間任何範圍)時，將培養基
中的poloxamer-188濃度增加到約1.8g/L至約3.0g/L(例如，本案所述的其間任何範圍)；當培養基中的活細胞濃度密度為約60 x 106細胞/mL至約90 x 106細胞/mL(例如，本案所述的其間任何範圍)時，將培養基中的poloxamer-188濃度增加到約3.0g/L至約6.0g/L(例如，本案所述的其間任何範圍)；和當培養基中的活細胞密度濃度為大於90 x 106細胞/mL(例如，本案所述的大於90 x 106細胞/mL的任何活細胞密度)時，將培養基中的poloxamer-188濃度增加到大於6.0g/L(例如，本案所述的大於6.0g/L的任何濃度)。本案所述的任何方法的一些實施方案還包括在培養過程中在一個或多個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、十五個、十六個、十七個、十八個、十九個或二十個)時間點確定培養基中的活細胞密度。
Poloxamer-188對消泡劑比例
在本案所述的任何實施方案中，液體培養基包含消泡劑(例如，消泡劑-c)且所述培養基中消泡劑(g/L)與poloxamer-188(g/L)的比例為約0.5%至約6.0%(例如，約0.5%-約5.5%，約0.5%-約5.0%，約0.5%-約4.5%，約0.5%-約4.0%，約0.5%-約3.5%，約0.5%-約3.0%，約0.5%-約2.5%，約0.5%-約2.0%，約0.5%-約1.5%，約0.5%-約1.0%，約1.0%-約6.0%，約1.0%-約5.5%，約1.0%-約5.0%，約1.0%-約4.5%，約1.0%-約4.0%，約1.0%-約3.5%，約1.0%-約3.0%，約1.0%-約2.5%，約1.0%-約2.0%，約1.0%-約1.5%，約2.0%-約6.0%，約2.0%-約5.5%，約2.0%-約5.0%，約2.0%-約4.5%，約2.0%-約4.0%，約2.0%-約3.5%，約2.0%-約3.0%，約2.0%-約2.5%，約2.5%-約6.0%，約2.5%-約5.5%，約2.5%-約5.0%，約2.5%-約4.5%，約2.5%-約4.0%，約2.5%-約3.5%，約2.5%-約3.0%，約3.0%-約6.0%，約3.0%-約5.5%，約3.0%-約5.0%，約3.0%-約4.5%，約3.0%-約4.0%，約3.0%-約3.5%，約3.5%-約6.0%，約3.5%-約5.5%，約3.5%-約5.0%，約3.5%-約4.5%，約3.5%-約4.0%，約4.0%-約6.0%，約4.0%-約5.5%，約4.0%-約5.0%，約4.0%-約4.5%，約4.5%-約6.0%，約4.5%-約5.5%，約4.5%-約5.0%，約5.0%-約6.0%，約5.0%-約5.5%，或約5.5%-約6.0%)。
培養基
液體培養基是本領域中已知的。所述液體培養基(例如，第一和/或第二液體培養基)可補充哺乳動物血清(例如，胎牛血清(fetal calf serum)和牛血清(bovine serum))，和/或生長激素或生長因子(例如，胰島素、運鐵蛋白和表皮生長因子)。
可替換地或此外，所述液體培養基(例如，第一和/或第二液體培養基)可為化學成分確定的液體培養基、無動物衍生組分的液體培養基、無血清液體培養基或含血清液體培養基。化學成分確定的液體培養基、無動物衍生組分的液體培養基、無血清液體培養基或含血清液體培養基的非限制性實例是商業上可得到的。
液體培養基通常含有能量源(例如，碳水化合物，如葡萄糖)、必需胺基酸(例如，二十個胺基酸加半胱氨酸的基本組)、維生素和/或以低濃度需要的其他有機化合物、遊離脂肪酸和/或痕量元素。如果需要，所述液體培養基(例如，第一和/或第二液體培養基)可補充，例如，哺乳動物激素或生長因子(例如，胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽和緩沖劑(例如，鈣、鎂和磷酸鹽)、核苷和堿基(例如，腺苷、胸苷和次黃嘌呤)、蛋白質和組織水解物，和/或這些添加劑的任何組合。
可用於在本案所述的任何方法中培養細胞(例如，哺乳動物細胞)的多種不同的液體培養基是本領域中已知的。可用於本方法中的培養基組分包括但不限於化學成分確定的(CD)水解物，例如，CD腖、CD多肽(兩種或更多胺基酸)，和CD生長因子。液體培養基和培養基組分的另外的實例是本領域中已知的。
熟練專業人員會理解的是本案所述的第一液體培養基和第二或進料液體培養基可為相同類型的培養基或不同的培養基。
可將從細胞培養物獲得的液體培養基過濾或澄清以獲得基本上無細胞和/或病毒的液體培養基。用於過濾或澄清液體培養基以移出細胞的方法是本領域中已知的(例如，0.2-μm過濾和使用交替的切線流(ATFTM)系統的過濾)。也可使用離心並移出其為基本上無細胞的液體培養基的上清，或通過允許細胞沉降至含有液體培養基的容器或生物反應器的重力底部並移出遠離沉降的重組細胞的液體培養基(所述液體培養基基本上無細胞)而從液體培養基移出哺乳動物細胞。
溫度
可在約31℃至約40℃的溫度進行培養哺乳動物細胞的步驟。熟練專業人員會理解的是可在培養步驟過程中在特定的時間點改變溫度，例如，以每小時或每天為基礎。例如，可在用細胞(例如，哺乳動物細胞)初始接種生物反應器後約一天、兩天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十四天、十五天、十六天、十七天、十八天、十九天，或約二十天或
更多天改變或變化(例如，增加或降低)溫度。例如，可將溫度上調(例如，多至或約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19，或多至或約20攝氏度的變化)。例如，可將溫度下調(例如，多至或約約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19，或多至或約20℃的變化)。
CO
2
本案所述的培養步驟可進一步包括將生物反應器中的液體培養基暴露於含有至多或約15% CO2(例如，至多或約14% CO2、12% CO2、10% CO2、8% CO2、6% CO2、5% CO2、4% CO2、3% CO2、2% CO2，或至多或約1% CO2)的氣氛。
重組蛋白
可通過本案提供的方法產生的重組蛋白的非限制性實例包括免疫球蛋白(包括輕鏈和重鏈免疫球蛋白、抗體、或抗體片段(例如，本案所述的任何抗體片段)、酶(例如，半乳糖苷酶(例如，α-半乳糖苷酶)、Myozyme或Cerezyme)、蛋白質(例如，人促紅細胞生成素(erythropoietin)、腫瘤壞死因子(TNF)、或幹擾素α或β)、或免疫原性或抗原性蛋白或蛋白片段(例如，用於疫苗的蛋白)。重組蛋白可為工程改造的抗原結合多肽，其含有至少一個多功能重組蛋白支架(參見，例如，Gebauer等，Current Opin.Chem.Biol.13：245-255,2009；和，美國專利申請公開號2012/0164066(通過提述以其整體並入本案)中描述的重組抗原結合蛋白)。作為抗體的重組蛋白的非限制性實例包括：帕尼單抗(panitumumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、阿巴伏單抗(abagovomab)、阿昔單抗(abciximab)、actoxumab、阿達木單抗(adalimumab)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿非莫單抗(afelimomab)、afutuzumab、alacizumab、alacizumab、阿侖單抗(alemtuzumab)、alirocumab、阿妥莫單抗(altumomab)、amatuximab、amatuximab、anatumomab、安蘆珠單抗(anrukinzumab)、阿泊珠單抗(apolizumab)、阿西莫單抗(arcitumomab)、atinumab、托珠單抗(tocilizumab)、basilizimab、貝妥莫單抗(bectumomab)、貝利單抗(belimumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、貝西索單抗(besilesomab)、bezlotoxumab、比西單抗(biciromab)、卡那奴單抗(canakinumab)、賽妥珠單抗(certolizumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、西妥木單抗(cixutumumab)、達利珠單抗(daclizumab)、地諾單抗(denosumab)、densumab、
依庫珠單抗(eculizumab)、依決洛單抗(edrecolomab)、依法利珠單抗(efalizumab)、依芬古單抗(efungumab)、依帕珠單抗(epratuzumab)、厄妥索單抗(ertumaxomab)、伊瑞西珠單抗(etaracizumab)、figitumumab、戈利木單抗(golimumab)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、伊戈伏單抗(igovomab)、imgatuzumab、英利昔單抗(infliximab)、伊諾莫單抗(inolimomab)、伊珠單抗(inotuzumab)、拉貝珠單抗(labetuzumab)、來金珠單抗(lebrikizumab)、moxetumomab、那他珠單抗(natalizumab)、奧濱尤妥珠單抗(obinutuzumab)、奧戈伏單抗(oregovomab)、帕利珠單抗(palivizumab)、帕尼單抗(panitumumab)、培妥珠單抗(pertuzumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、托珠單抗(tocilizumab)、托西莫單抗(tositumomab)、tralokinumab、tucotuzumab、曲妥單抗(trastuzumab)、維妥珠單抗(veltuzumab)、紮妥木單抗(zalutumumab)和zatuximab。可通過本案所述的方法產生的重組抗體的另外的實例是本領域中已知的。可通過本方法產生的重組蛋白的另外的非限制性實例包括：阿葡糖苷酶α(alglucosidase alfa)、拉羅尼酶(laronidase)、阿巴西普(abatacept)、加硫酶(galsulfase)、促黃體激素α(lutropin alfa)、抗血友病因子(antihemophilic factor)、阿加糖苷酶β(agalsidase beta)、幹擾素β-1A(interferon beta-1a)、達貝泊汀α(darbepoetin alfa)、替奈普酶(tenecteplase)、依那西普(etanercept)、凝血因子IX、促卵泡激素、幹擾素β-1a、伊米苷酶(imiglucerase)、Domase α、依伯汀α(epoetin alfa)、胰島素或胰島素類似物、美卡舍明(mecasermin)、因子VIII、因子VIIa、抗凝血酶III、蛋白C、人白蛋白、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素-11、拉羅尼酶、idursuphase、galsulphase、α-1-蛋白酶抑制劑、乳糖酶、腺苷脫氨酶、組織纖維蛋白溶酶原活化劑、促甲狀腺素α(例如、Thyrogen®)和阿替普酶。可通過本方法產生的重組蛋白的另外的實例包括酸性α葡糖苷酶、阿葡糖苷酶α、阿葡糖苷酶α(例如、Myozyme®和Lumizyme®)、α-L-艾杜糖苷酶(例如、Aldurazyme®)、艾杜糖醛酸硫酸酯酶(iduronate sulfatase)、乙醯肝素N-硫酸酯酶(heparan N-sulfatase)、半乳糖6-硫酸酯酶、酸性β半乳糖苷酶、β葡糖醛酸酶、N-乙醯葡糖胺-1-磷酸轉移酶、α-N-乙醯半乳糖氨酶(α-N-acetylgalactosaminidase)、酸性脂肪酶、溶酶體酸性神經醯胺酶(lysosomal acid ceramidase)、酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase)、β葡糖苷酶(例如、Cerezyme®和Ceredase®)、半乳糖神經醯胺酶(galactosylceramidase)、α-半乳糖苷酶-A(例如、Fabrazyme®)、酸β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、神經氨酸酶、氨基己糖苷酶A和
氨基己糖苷酶B。
可通過從細胞(例如，哺乳動物細胞)移出或以其他方式物理地分離液體培養基而從液體培養基(例如，第一和/或第二液體培養基)回收分泌的、可溶的重組蛋白。用於從細胞(例如，哺乳動物細胞)移出液體培養基的多種不同的方法是本領域中已知的，包括，例如，離心、過濾、移液和/或抽吸。然後可使用多種生物化學技術包括多種層析術(例如，親和層析、分子篩層析、陽離子交換層析或陰離子交換層析)和/或過濾(例如，分子量截留過濾)而從液體培養基回收和進一步純化分泌的重組蛋白。
收集重組蛋白
一些實施方案還包括收集重組蛋白(例如，本案所述的任何重組蛋白)。在一些實例中，收集包括裂解哺乳動物細胞。在其他實例中，收集可包括從培養基中收集重組蛋白(例如，當進行灌注培養時，第一和第二液體培養基之一或兩者，或者當進行分批培養時第一液體培養基和進料液體培養基之一或兩者)。
在培養實現，例如，大於約30 x 106細胞/mL，大於約32 x 106細胞/mL，大於約34 x 106細胞/mL，大於約36 x 106細胞/mL，大於約38 x 106細胞/mL，大於約40 x 106細胞/mL，大於約42 x 106細胞/mL，大於約44 x 106細胞/mL，大於約46 x 106細胞/mL，大於約48 x 106細胞/mL，大於約50 x 106細胞/mL，大於約52 x 106細胞/mL，大於約54 x 106細胞/mL，大於約56 x 106細胞/mL，大於約58 x 106細胞/mL，大於約60 x 106細胞/mL，大於約62 x 106細胞/mL，大於約64 x 106細胞/mL，大於約66 x 106細胞/mL，大於約68 x 106細胞/mL，大於約70 x 106細胞/mL，大於約72 x 106細胞/mL，大於約74 x 106細胞/mL，大於約76 x 106細胞/mL，大於約78 x 106細胞/mL，大於約80 x 106細胞/mL，大於約82 x 106細胞/mL，大於約84 x 106細胞/mL，大於約86 x 106細胞/mL，大於約88 x 106細胞/mL，大於約90 x 106細胞/mL，大於約92 x 106細胞/mL，大於約94 x 106細胞/mL，大於約96 x 106細胞/mL，大於約98 x 106細胞/mL，大於約100 x 106細胞/mL，大於約102 x 106細胞/mL，大於約104 x 106細胞/mL，大於約106 x 106細胞/mL，大於約108 x 106細胞/mL，大於約110 x 106細胞/mL，大於約112 x 106細胞/mL，大於約114 x 106細胞/mL，大於約116 x 106細胞/mL，大於約118 x 106細胞/mL，大於約120 x 106細胞/mL，大於約122 x 106細胞/mL，大於約124 x 106細胞/mL，大於約126 x 106細胞/mL，大於約128 x 106細胞/mL，大於約130 x 106細胞/mL，大於約132 x 106
細胞/mL，大於約134 x 106細胞/mL，大於約136 x 106細胞/mL，大於約138 x 106細胞/mL，大於約140 x 106細胞/mL，大於約142 x 106細胞/mL，大於約144 x 106細胞/mL，大於約146 x 106細胞/mL，大於約148 x 106細胞/mL，大於約150 x 106細胞/mL，大於約152 x 106細胞/mL，大於約154 x 106細胞/mL，大於約156 x 106細胞/mL，大於約158 x 106細胞/mL，大於約160 x 106細胞/mL，大於約162 x 106細胞/mL，大於約164 x 106細胞/mL，大於約166 x 106細胞/mL，大於約168 x 106細胞/mL，大於約170 x 106細胞/mL，大於約172 x 106細胞/mL，大於約174 x 106細胞/mL，大於約176 x 106細胞/mL，大於約178 x 106細胞/mL，大於約180 x 106細胞/mL，大於約182 x 106細胞/mL，大於約184 x 106細胞/mL，大於約186 x 106細胞/mL，大於約188 x 106細胞/mL，大於約190 x 106細胞/mL，大於約192 x 106細胞/mL，大於約194 x 106細胞/mL，大於約196 x 106細胞/mL，大於約198 x 106細胞/mL，或者大於約200 x 106細胞/mL)的活細胞密度後可進行收集。
配製重組蛋白
本案所述的任何方法的一些實施方案還包括將重組蛋白(例如，收集的重組蛋白)配製成藥物組合物的步驟。例如，配製可包括將藥學上可接受的賦形劑添加至重組蛋白(例如，收集的重組蛋白)。配製可包括將藥學上可接受的賦形劑與重組蛋白(例如，收集的重組蛋白)混合。藥物可接受的賦形劑(例如，非天然存在的藥物可接受的賦形劑)的實例是本領域已知的。在一些實施方案中，重組蛋白(例如，收集的重組蛋白)經配製用於靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內、或肌內施用。
實施例
實施例1. 增加的Poloxamer-188濃度對於產生分泌的重組抗體的灌注細胞培養的作用
進行這組實驗以測試增加的Poloxamer-188濃度對於包含含有編碼重組抗體的核酸的哺乳動物細胞的灌注細胞培養中的細胞生長和重組抗體產生的作用。在這些實驗中，進行第一灌注細胞培養操作，其使用在整個培養期中含有1.8g/L的CD-CHO培養基，並進行第二灌注細胞培養操作，其使用在培養期中含有增加的poloxamer-188濃度的CD-CHO培養基(在培養期中從1.8g/L增加至6.8g/L poloxamer-188)。對於每個細胞培養操作，在培養的12天到33天以4反應器體積
(RV)/天的速率進行灌注，在培養的33天到63天轉換至6 RV/天的速率，並在培養的63天到72天轉換至7 RV/天的速率。使用CD-CHO培養基進行第二細胞培養操作，所述CD-CHO培養基在培養的0天到14天含有1.8g/L poloxamer-188，在培養的15天到34天含有2.8g/L poloxamer-188，在培養的35天到39天含有3.8g/L poloxamer-188，在培養的40天到56天含有4.8g/L poloxamer-188，且在培養的57天到72天含有5.8g/L poloxamer-188。
對於第一和第二灌注培養兩者使用已知方法每天確定活細胞密度、比生長速率、活細胞的百分數、體積生產率和比生產速率。
數據顯示通過在培養中建立大於1.8g/L的Poloxamer-188濃度實現了超過100 x 106細胞/mL的活細胞密度(圖1)。相反，在培養基中僅使用1.8g/L poloxamer-188的第一細胞培養操作僅實現了50 x 106細胞/mL的活細胞密度(圖1)。第二細胞培養操作的數據還顯示：甚至當細胞培養物具有大於100 x 106細胞/mL的活細胞密度時，在培養中建立大於1.8g/L的Poloxamer-188濃度導致穩固的比生長速率(圖2)。圖3中的數據還顯示：與在整個培養期中使用含有1.8g/L poloxamer-188的培養基的灌注細胞培養操作相比，在培養中建立大於1.8g/L的Poloxamer-188濃度導致高而且穩定的活細胞百分數(在整個培養期中高於80%)(圖3)。
圖4和5中的數據還顯示：以在培養期中含有增加的poloxamer-188濃度(從1.8g/L增加至6.8g/L poloxamer-188)的培養基進行的第二灌注細胞培養操作分別具有高的體積生產速率(大於3g/L/d)和高的比生產速率(15pg/細胞/天至42pg/細胞/天)。
實施例2. 增加的Poloxamer-188濃度對於液體培養基中重組抗體的穩定性的作用
進行一組實驗以確定增加的Poloxamer-188濃度是否會抑制在從細胞培養物收獲後的澄清的液體培養基中存在的重組蛋白的降解。在這些實驗中，進行與實施例1中所述的第二灌注細胞培養操作相似的灌注細胞培養操作，只是在培養實現6.8g/L的poloxamer-188濃度後，將培養中的Poloxamer-188濃度降低至3.95g/L poloxamer-188，然後再次降低至3.0g/L poloxamer-188。在這些實驗中，在如下時間點從培養物移出液體培養基的兩個或三個樣品：當培養物含有6.8g/L
poloxamer-188時的第一時間點，當培養物含有3.95g/L poloxamer-188時的第二時間點，和當培養物含有3.0g/L poloxamer-188時的第三時間點。從每個時間點收集的一個樣品存儲在4℃，從每個時間點收集的一個樣品在存儲於4℃之前在室溫溫育7天，且對於第二和第三時間點中的每個，對樣品補充poloxamer-188以在各樣品中實現6.8g/L的polaxmer-188濃度，然後將各樣品在存儲於4℃之前在室溫溫育9天。所得的未處理的和處理的樣品在4-20% Bis-Tris凝膠上跑膠並用考馬斯藍(Coomassie Blue)染色。
圖6中的數據顯示：含有6.8g/L、3.95g/L或3.0g/L poloxamer-188的未處理的樣品都顯示相似的產物穩定性(泳道1、2和3)。數據還令人驚訝地顯示：含有6.8g/L poloxamer-188的樣品在於室溫溫育7天後不顯示大量的降解，而含有3.0g/L或3.95g/L poloxamer-188的樣品兩者在相同的溫育後顯示可檢測的降解(圖6；泳道1a、2a和3a)。數據還證明：將poloxamer-188添加至含有低poloxamer-188的樣品不改進產物穩定性(圖6；泳道2b和3b)。這些數據顯示：在培養中使用大於1.8g/L的poloxamer-188濃度可減少或抑制培養物中重組蛋白的降解，並指示：poloxamer-188可通過提供更健康的細胞培養而實現此效果。
實施例3. 噴霧器孔類型和孔徑對於實現對於細胞培養物生長和產率(Productivity)的有益作用所需的Poloxamer-188量的作用
進行一組實驗以測試噴霧器孔類型和孔徑對於在灌注細胞培養中實現有益的生長和產率性質所需的Poloxamer-188量的作用。在這些實驗中，使用不同的噴霧器進行不同的灌注細胞培養操作：具有20μm的孔徑的燒結孔的噴霧器(1反應器)；具有200μm的孔徑的鑽孔的噴霧器(2反應器)；或具有500μm的孔徑的鑽孔的噴霧器(1反應器)。各灌注培養初始使用含有1.8g/L poloxamer-188的CD CHO培養基，並以漸增的增量將poloxamer-188添加至培養物以維持細胞存活率並使細胞裂解根據需要最小化。使用已知方法在培養期過程中的不同時間點進行各細胞培養的活細胞密度、比生長速率、比乳酸脫氫酶產生速率、活細胞百分數、體積生產速率和有氧葡萄糖消耗(的測定)。
數據顯示：培養物中3.8g/L的poloxamer-188濃度能夠在使用具有500μm的孔徑的鑽孔的噴霧器進行的灌注細胞培養操作中維持活細胞密度，培養物中4.8g/L的poloxamer-188濃度能夠在使用具有200μm的孔徑的鑽孔的噴霧器進行的
灌注細胞培養操作中維持活細胞密度，且培養物中5.8g/L的poloxamer-188濃度能夠在使用具有20μm的孔徑的燒結孔的噴霧器進行的灌注細胞培養操作中維持活細胞密度(圖7)。
數據還顯示：對於使用3.8g/L poloxamer-188和具有500μm的孔徑的鑽孔的噴霧器進行的灌注細胞培養操作，使用4.8g/L poloxamer-188和具有200μm的孔徑的燒結孔的噴霧器進行的灌注細胞培養操作，和使用5.8g/L poloxamer-188和具有20μm的孔徑的燒結孔的噴霧器進行的灌注細胞培養操作實現了相似的比生長速率(圖8)、比乳糖脫氫酶生產速率(圖9和11)、活細胞百分數(圖10)、體積生產速率(圖12)和有氧葡萄糖消耗速率(圖13)。
數據顯示：當poloxamer-188以大於1.8g/L的濃度存在於培養物中時，所有測試的噴霧器可用於實現60 x 106細胞/mL的活細胞密度。例如，在如下中實現了大於60 x 106細胞/mL的活細胞密度：通過在培養物中使用2.8g/L poloxamer-188使用具有1mm的孔徑的鑽孔的噴霧器的灌注細胞培養操作，通過在培養物中使用3.8g/L poloxamer-188使用具有500μm的孔徑的鑽孔的噴霧器的灌注細胞培養操作，通過在培養物中使用4.8g/L poloxamer-188使用具有200μm的孔徑的鑽孔的噴霧器的灌注細胞培養操作，通過在培養物中使用3.8g/L poloxamer-188使用具有100μm的孔徑的燒結孔的噴霧器的灌注細胞培養操作，和通過在培養物中使用5.8g/L poloxamer-188使用具有20μm的孔徑的燒結孔的噴霧器的灌注細胞培養操作。數據指示孔徑越小，需要越多的poloxamer-188以維持健康的培養。
實施例4. 噴霧器孔類型、孔徑和消泡劑對Poloxamer-188比例對於灌注培養細胞生長的作用
進行另外的一組實驗以確定在培養中使用具有不同孔類型和孔徑的噴霧器和不同的消泡劑對poloxamer-188比例的灌注培養中的穩態細胞生長(下表1中所示)。
表1中的數據顯示：較小的孔徑要求：需要將較多的消泡劑-c添加至培養物以減輕泡沫的生成，隨著噴霧速率增加需要另外的消泡劑-c，且消泡劑-c對poloxamer-188的最佳比例可為0-<5%(例如，約1%至約3%)。
實施例5. 消泡劑-C對Poloxamer-188比例對於分批細胞培養操作中的細胞生長的作用
進行了一組實驗以測試消泡劑-c對poloxamer-188比例對於使用CD-CHO培養基的分批搖瓶細胞培養操作中的細胞生長的作用，所述CD-CHO培養基含有0%消泡劑-c對poloxamer-188比例、5.6%消泡劑-c對poloxamer-188比例、11.1%消泡劑-c對poloxamer-188比例、27.8%消泡劑-c對poloxamer-188比例或55.6%消泡劑-c對poloxamer-188比例。對搖瓶細胞培養物加擋板以被動地生成氣泡以刺激生物反應器。使用已知方法在培養期中每天確定每個細胞培養操作中的活細胞密度和比乳酸脫氫酶生產速率。
數據顯示：較低的消泡劑-c對poloxamer-188比例顯示改進的活細胞密度(圖14)和較低的比乳酸脫氫酶生產速率(圖15)。這些數據進一步表明培養中消泡劑-c對poloxamer-188的最佳比例為0-小於約5%(例如，約1%-約3%)。
其他實施方案
可理解的是雖然以結合其詳細描述描述了本發明，但上述描述意欲說明而不是限制本發明的範圍，所述範圍由所附請求項的範圍限定。其他的方面、優勢和修飾均在所附請求項的範圍之內。
Claims (17)
- 一種在該液體培養基中培養哺乳動物細胞以達到活細胞密度大於90 x 106細胞/mL的方法，其係藉由作為活細胞密度函數而增加液體培養基中的poloxamer-188濃度，該方法包括：在足夠產生重組蛋白的條件下灌注培養包含編碼該重組蛋白的核酸之哺乳動物細胞，其中：灌注培養包括在包含濃度為1.8g/L或濃度大於1.8g/L的poloxamer-188及消泡劑的液體培養基中培養，消泡劑(g/L)與poloxamer-188(g/L)的比例在該液體培養基中係介於1.0%至3.0%；且其中該灌注培養包括：(a)測定該液體培養基中的活細胞密度為35 x 106細胞/mL至60 x 106細胞/mL時，則將該液體培養基中的poloxamer-188濃度增加到介於1.8g/L與2.9g/L之間；(b)在步驟(a)之後測定該液體培養基中的活細胞密度為60 x 106細胞/mL至90 x 106細胞/mL時，則將該液體培養基中的poloxamer-188濃度增加到介於3.0g/L與5.9g/L之間；及(c)在步驟(b)之後測定該液體培養基中的活細胞密度為大於90 x 106細胞/mL時，則將該液體培養基中的poloxamer-188濃度增加到介於6.0g/L與8.0g/L之間；其中：該poloxamer-188在該灌注培養步驟前存在於該液體培養基中和/或添加至該液體培養基和/或在該灌注培養步驟過程中添加至該液體培養基；且該方法使得在該液體培養基中達到超過90×106細胞/mL之活細胞密度。
- 如請求項1的方法，其中該方法包括以下一或二者：在該灌注培養步驟前將poloxamer-188添加至該液體培養基；及在該灌注培養步驟過程中將poloxamer-188添加至該液體培養基，以在該液體培養基中提供濃度為1.8g/L或濃度大於1.8g/L的poloxamer-188。
- 如請求項1的方法，其中poloxamer-188存在於該液體培養基中。
- 如請求項1-3中任一項的方法，其中灌注培養包括：提供包含配置於第一液體培養基中的哺乳動物細胞的容器；攪動培育容器並在32℃至40℃之間的溫度進行至少7天的培養期；和在培養期的首個48至96小時後連續地或周期地移出第一體積的第一液體培養基，並向第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基，其中第一體積和第二體積是相等的。
- 如請求項4的方法，其中第二液體培養基係包含濃度高於第一液體培養基中的濃度之poloxamer-188。
- 如請求項5的方法，其中第一液體培養基包含濃度為1.8g/L或濃度低於1.8g/L的poloxamer-188，且第二液體培養基包含濃度高於1.8g/L的poloxamer-188。
- 如請求項4的方法，其進一步包括：從該哺乳動物細胞、從第一液體培養基或第二液體培養基，或其任何組合收集重組蛋白。
- 如請求項7的方法，其進一步包括將收集的重組蛋白調配為醫藥組成物。
- 如請求項8的方法，其中收集係在培養達到超過100×106細胞/mL之活細胞密度之後進行。
- 如請求項9的方法，其中收集係在培養達到超過150×106細胞/mL之活細胞密度之後進行。
- 如請求項4的方法，其中第一液體培養基和/或第二液體培養基係選自由下列組成之群組：化學成分確定的液體培養基、無血清液體培養基、含有血清的液體培養基、無動物衍生組分的液體培養基、和無蛋白的培養基。
- 如請求項1-3中任一項的方法，其中該哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人胚胎腎(HEK)細胞、NSO細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、PerC6細胞、Vero細胞、或HT-1080細胞系。
- 如請求項12的方法，其中該哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
- 如請求項1-3中任一項的方法，其中該重組蛋白為免疫球蛋白、酶、生長因子、蛋白片段、或工程改造的蛋白。
- 如請求項14的方法，其中該酶為半乳糖苷酶。
- 如請求項15的方法，其中該半乳糖苷酶為α-半乳糖苷酶。
- 如請求項16的方法，其中該α-半乳糖苷酶為α-半乳糖苷酶-A。
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