JP2024050754A - 哺乳類細胞の培養方法 - Google Patents
哺乳類細胞の培養方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024050754A JP2024050754A JP2024014536A JP2024014536A JP2024050754A JP 2024050754 A JP2024050754 A JP 2024050754A JP 2024014536 A JP2024014536 A JP 2024014536A JP 2024014536 A JP2024014536 A JP 2024014536A JP 2024050754 A JP2024050754 A JP 2024050754A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- poloxamer
- medium
- concentration
- days
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 241
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title claims abstract description 82
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 71
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 1063
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 claims abstract description 341
- 229940044519 poloxamer 188 Drugs 0.000 claims abstract description 340
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 252
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 90
- CTKXFMQHOOWWEB-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide/propylene oxide copolymer Chemical compound CCCOC(C)COCCO CTKXFMQHOOWWEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 96
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 414
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 102
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 claims description 84
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 65
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 65
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 57
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 24
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 21
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 17
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 17
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 claims description 14
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 14
- 238000013019 agitation Methods 0.000 claims description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 10
- 230000004637 cellular stress Effects 0.000 claims description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 claims description 3
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 247
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 102
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 28
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 27
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- -1 hypoxanthine) Chemical class 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 7
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 7
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 7
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 6
- 230000009894 physiological stress Effects 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 230000004088 pulmonary circulation Effects 0.000 description 6
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 4
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 4
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 description 4
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 229920000776 Poly(Adenosine diphosphate-ribose) polymerase Polymers 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 101001018026 Homo sapiens Lysosomal alpha-glucosidase Proteins 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 102000045921 human GAA Human genes 0.000 description 3
- 108010039650 imiglucerase Proteins 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 3
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010005716 Interferon beta-1a Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 2
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 108010070626 acid beta-galactosidase Proteins 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 108010056760 agalsidase beta Proteins 0.000 description 2
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 229950001537 amatuximab Drugs 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000001465 calcium Nutrition 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229940049197 cerezyme Drugs 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 description 2
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 2
- RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M cyanocobalamin Chemical compound N#C[Co+]N([C@]1([H])[C@H](CC(N)=O)[C@]\2(CCC(=O)NC[C@H](C)OP(O)(=O)OC3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)C)C/2=C(C)\C([C@H](C/2(C)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010089296 galsulfase Proteins 0.000 description 2
- 229960005390 galsulfase Drugs 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229960004461 interferon beta-1a Drugs 0.000 description 2
- 229960002486 laronidase Drugs 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229940103023 myozyme Drugs 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 229960003347 obinutuzumab Drugs 0.000 description 2
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229960003989 tocilizumab Drugs 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- RTQWWZBSTRGEAV-PKHIMPSTSA-N 2-[[(2s)-2-[bis(carboxymethyl)amino]-3-[4-(methylcarbamoylamino)phenyl]propyl]-[2-[bis(carboxymethyl)amino]propyl]amino]acetic acid Chemical compound CNC(=O)NC1=CC=C(C[C@@H](CN(CC(C)N(CC(O)=O)CC(O)=O)CC(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)C=C1 RTQWWZBSTRGEAV-PKHIMPSTSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000006772 Acid Ceramidase Human genes 0.000 description 1
- 108020005296 Acid Ceramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- 206010001258 Adenoviral infections Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102100031317 Alpha-N-acetylgalactosaminidase Human genes 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- 102100022977 Antithrombin-III Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004201 Ceramidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000751 Ceramidases Proteins 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 241000867607 Chlorocebus sabaeus Species 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010019673 Darbepoetin alfa Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010074604 Epoetin Alfa Proteins 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102100028496 Galactocerebrosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010042681 Galactosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016871 Hexosaminidase A Human genes 0.000 description 1
- 108010053317 Hexosaminidase A Proteins 0.000 description 1
- 102000016870 Hexosaminidase B Human genes 0.000 description 1
- 108010053345 Hexosaminidase B Proteins 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 108010053927 Iduronate Sulfatase Proteins 0.000 description 1
- 102000004627 Iduronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010003381 Iduronidase Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 102000003815 Interleukin-11 Human genes 0.000 description 1
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108010059881 Lactase Proteins 0.000 description 1
- 102100033342 Lysosomal acid glucosylceramidase Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 description 1
- 108010061312 Sphingomyelin Phosphodiesterase Proteins 0.000 description 1
- 102000000019 Sterol Esterase Human genes 0.000 description 1
- 108010055297 Sterol Esterase Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010039185 Tenecteplase Proteins 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 1
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010066702 Thyrotropin Alfa Proteins 0.000 description 1
- 108010044965 UDP-N-acetylglucosamine-lysosomal-enzyme N-acetylglucosaminephosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950005186 abagovomab Drugs 0.000 description 1
- 229960003697 abatacept Drugs 0.000 description 1
- 229960000446 abciximab Drugs 0.000 description 1
- 102000010126 acid sphingomyelin phosphodiesterase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 229950004283 actoxumab Drugs 0.000 description 1
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229950009084 adecatumumab Drugs 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 229960003227 afelimomab Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960004470 agalsidase beta Drugs 0.000 description 1
- 229940022705 aldurazyme Drugs 0.000 description 1
- 229960000548 alemtuzumab Drugs 0.000 description 1
- 108010060162 alglucerase Proteins 0.000 description 1
- 229960004593 alglucosidase alfa Drugs 0.000 description 1
- 229960004539 alirocumab Drugs 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 102000016679 alpha-Glucosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 108010015684 alpha-N-Acetylgalactosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 229960003318 alteplase Drugs 0.000 description 1
- 229950009106 altumomab Drugs 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229950005794 anrukinzumab Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 229950003145 apolizumab Drugs 0.000 description 1
- 229950005725 arcitumomab Drugs 0.000 description 1
- 229950005122 atinumab Drugs 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229950003269 bectumomab Drugs 0.000 description 1
- 229960003270 belimumab Drugs 0.000 description 1
- 229950010559 besilesomab Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- 229950008086 bezlotoxumab Drugs 0.000 description 1
- 229950001303 biciromab Drugs 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 1
- 229960001838 canakinumab Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 229960003115 certolizumab pegol Drugs 0.000 description 1
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229940105774 coagulation factor ix Drugs 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 229940116318 copper carbonate Drugs 0.000 description 1
- 229960002104 cyanocobalamin Drugs 0.000 description 1
- 235000000639 cyanocobalamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011666 cyanocobalamin Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002806 daclizumab Drugs 0.000 description 1
- 229960005029 darbepoetin alfa Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 229960001251 denosumab Drugs 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000533 dornase alfa Drugs 0.000 description 1
- 108010067396 dornase alfa Proteins 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 229960002224 eculizumab Drugs 0.000 description 1
- 229960001776 edrecolomab Drugs 0.000 description 1
- 229960000284 efalizumab Drugs 0.000 description 1
- 229950002209 efungumab Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- KUBARPMUNHKBIQ-VTHUDJRQSA-N eliglustat tartrate Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O.C([C@@H](NC(=O)CCCCCCC)[C@H](O)C=1C=C2OCCOC2=CC=1)N1CCCC1.C([C@@H](NC(=O)CCCCCCC)[C@H](O)C=1C=C2OCCOC2=CC=1)N1CCCC1 KUBARPMUNHKBIQ-VTHUDJRQSA-N 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229960003388 epoetin alfa Drugs 0.000 description 1
- 229950009760 epratuzumab Drugs 0.000 description 1
- 229950008579 ertumaxomab Drugs 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 1
- 229950009569 etaracizumab Drugs 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 229940014516 fabrazyme Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 1
- 229950008085 figitumumab Drugs 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 229960001743 golimumab Drugs 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108010089932 heparan sulfate sulfatase Proteins 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 description 1
- 210000000688 human artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229940100689 human protein c Drugs 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229960001001 ibritumomab tiuxetan Drugs 0.000 description 1
- 229950002200 igovomab Drugs 0.000 description 1
- 229950005646 imgatuzumab Drugs 0.000 description 1
- 229960002127 imiglucerase Drugs 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229950007937 inolimomab Drugs 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940074383 interleukin-11 Drugs 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003284 iron Drugs 0.000 description 1
- 229950000518 labetuzumab Drugs 0.000 description 1
- 229940116108 lactase Drugs 0.000 description 1
- 229950002183 lebrikizumab Drugs 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M lipoate Chemical compound [O-]C(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 235000019136 lipoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940091827 lumizyme Drugs 0.000 description 1
- 229960002332 lutropin alfa Drugs 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229940091250 magnesium supplement Drugs 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000000723 mammalian artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 108010000594 mecasermin Proteins 0.000 description 1
- 229960001311 mecasermin Drugs 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229950005674 modotuximab Drugs 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960005027 natalizumab Drugs 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229960000470 omalizumab Drugs 0.000 description 1
- 229950007283 oregovomab Drugs 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000006353 oxyethylene group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000402 palivizumab Drugs 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 238000005325 percolation Methods 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002087 pertuzumab Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003975 potassium Drugs 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960003876 ranibizumab Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940083542 sodium Drugs 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001407 sodium bicarbonate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960000216 tenecteplase Drugs 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 229960002663 thioctic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960000874 thyrotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000001748 thyrotropin Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 229960005267 tositumomab Drugs 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 229950000835 tralokinumab Drugs 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229950000815 veltuzumab Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950008250 zalutumumab Drugs 0.000 description 1
- 229940043825 zinc carbonate Drugs 0.000 description 1
- 235000004416 zinc carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000010 zinc carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011667 zinc carbonate Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
- C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
- C12N5/0043—Medium free of human- or animal-derived components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
- C12N5/005—Protein-free medium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/50—Soluble polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01022—Alpha-galactosidase (3.2.1.22)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
【課題】哺乳類細胞を培養する方法を提供する。【解決手段】哺乳類細胞を、1.8g/Lの濃度、もしくは1.8g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を含む液体培地、または孔サイズ、孔タイプ、ガス流速、培地中の生細胞密度、および細胞ストレスに関連するマーカーの群から選択される1つまたはそれ以上の因子に基づき選択されるポロクサマー-188濃度を含む液体培地において、培養する方法が提供される。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれている、2014年12月22日に出願した、米国仮特許出願番号第62/095,734号の優先権を主張するものである。
本出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれている、2014年12月22日に出願した、米国仮特許出願番号第62/095,734号の優先権を主張するものである。
本発明は、バイオテクノロジー方法、および組み換えタンパク質の製造方法に関する。
組み換えタンパク質をコードする核酸を含有する哺乳類細胞は、治療上または商業上重要なタンパク質を産生するためにしばしば使用される。多様な製品パイプラインの現在の環境において、バイオテクノロジー企業は、治療用タンパク質薬物物質の高度に柔軟な費用効果の高い製造のための革新的な解決策を見出すことをますます活発にしている。
本発明は、組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞が、1.8g/Lの濃度または1.8g/Lより高い濃度のポロクサマー-188(例えば、2.0g/Lより高い、2.5g/Lより高い、3.0g/Lより高い、3.5g/Lより高い、4.0g/Lより高い、4.5g/Lより高い、5.0g/Lより高い、5.5g/Lより高い、6.0g/Lより高い、6.5g/Lより高い、もしくは7.0g/Lより高いポロクサマー-188)を含む培養培地において生存可能であり、増殖すること、最適な細胞成長が、特定の割合のポロクサマー-188と消泡剤にて達成されること、高い細胞密度が、生細胞密度に応じて細胞培養物中のポロクサマー-188濃度を増大させることにより達成されること、ならびに細胞増殖を促進するために細胞培養物に添加されるべき最適なポロクサマー-188濃度が、孔サイズ、孔タイプ、ガス流速、培地中の生細胞密度、および細胞ストレスに関連するマーカーの群からの1つまたはそれ以上の因子に依存することという知見に、少なくとも一部、基づく。
本明細書において、哺乳類細胞を培養する方法であって、該方法は、組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞を、組み換えタンパク質を産生するのに十分な条件下で灌流培養することを含み、灌流培養は、1.8g/Lの濃度または1.8g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を含む液体培地において培養することを含み、ポロクサマー-188は、培地に存在する、および/または培養工程の前に培地に添加される、および/または培養工程中に培地に添加される、前記方法が提供される。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、培地は、1.8g/Lの濃度または1.8g/Lより高い濃度(例えば、2.8g/Lの濃度もしくは2.8g/Lより高い濃度、4.0g/Lの濃度もしくは4.0g/Lより高い濃度、6.0g/Lの濃度もしくは6.0g/Lより高い濃度、8.0g/Lの濃度もしくは8.0g/Lより高い濃度、または10.0g/Lの濃度もしくは10.0g/Lより高い濃度)のポロクサマー-188を含む。
本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、培地は、消泡剤をさらに含み、培地中のポロクサマー-188(g/L)に対する消泡剤(g/L)の割合は、液体培地において約0.5%~約6.0%(例えば、約1.0%~約5.5%、または約1.5%~約5.0%)である。本明細書において記載される方法のいずれ
かのいくつかの実施形態において、方法は、培養工程の前にポロクサマー-188を培地に添加し、および/または培養工程中にポロクサマー-188を培地に添加して、培地中のポロクサマー-188を1.8g/Lの濃度または1.8g/Lより高い濃度にすることを含む。本明細書において提供される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ポロクサマー-188は培地に存在する。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、培養工程の前にポロクサマー-188を培地に添加し、および/または培養工程中にポロクサマー-188を培地に添加して、培地中のポロクサマー-188を2.8g/Lの濃度または2.8g/Lより高い濃度(例えば、4.0g/Lの濃度もしくは4.0g/Lより高い濃度、6.0g/Lの濃度もしくは6.0g/Lより高い濃度、8.0g/Lの濃度もしくは8.0g/Lより高い濃度、または10.0g/Lの濃度もしくは10.0g/Lより高い濃度)にすることを含む。
かのいくつかの実施形態において、方法は、培養工程の前にポロクサマー-188を培地に添加し、および/または培養工程中にポロクサマー-188を培地に添加して、培地中のポロクサマー-188を1.8g/Lの濃度または1.8g/Lより高い濃度にすることを含む。本明細書において提供される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ポロクサマー-188は培地に存在する。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、培養工程の前にポロクサマー-188を培地に添加し、および/または培養工程中にポロクサマー-188を培地に添加して、培地中のポロクサマー-188を2.8g/Lの濃度または2.8g/Lより高い濃度(例えば、4.0g/Lの濃度もしくは4.0g/Lより高い濃度、6.0g/Lの濃度もしくは6.0g/Lより高い濃度、8.0g/Lの濃度もしくは8.0g/Lより高い濃度、または10.0g/Lの濃度もしくは10.0g/Lより高い濃度)にすることを含む。
本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、培地中のポロクサマー-188濃度を経時的に増大させることを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、培地中のポロクサマー-188濃度を経時的に増大させることは、培地中の生細胞密度に基づく。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、培地中の生細胞密度が約35×106細胞/mL~約60×106細胞/mLである場合、培地中のポロクサマー-188濃度を1.8g/Lより高く(例えば、約1.8g/L~約3.0g/L、または約2.3g/L~約3.0g/L)まで増大させることを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、培地中の生細胞密度が約60×106細胞/mL~約90×106細胞/mLである場合、培地中のポロクサマー-188濃度を3.0g/Lより高く(例えば、約3.0g/L~約6.0g/L、または約3.6g/L~約6.0g/L)まで増大させることを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、培地中の生細胞密度が90×106細胞/mLより高い場合、培地中のポロクサマー-188濃度を6.0g/Lより高く(例えば、7.0g/Lより高く、8.0g/Lより高く、または10.0g/Lより高く)まで増大させることを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、培地中の生細胞密度が約35×106細胞/mL~約60×106細胞/mLである場合、培地中のポロクサマー-188濃度を約1.8g/L~約3.0g/Lまで増大させること;培地中の生細胞濃度密度が約60×106細胞/mL~約90×106細胞/mLである場合、培地中のポロクサマー-188濃度を約3.0g/L~約6.0g/Lまで増大させること;および培地中の生細胞密度濃度が90×106細胞/mLより高い場合、培地中のポロクサマー-188濃度を6.0g/Lより高くまで増大させることを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、培養中の1つまたはそれ以上の時点で培地中の生細胞密度を決定することをさらに含む。
本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、灌流培養は、第1の液体培地中に配置された哺乳類細胞を含む容器を用意すること;容器を撹拌しながら、少なくとも約7日の培養期間、温度約32℃~約40℃でインキュベートすること;および培養期間の最初の48~96時間後、連続的または定期的に、第1の体積の第1の液体培地を取り出し、第1の液体培地に第2の体積の第2の液体培地を添加することを含み、第1と第2の体積はほぼ等しい。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、第2の液体培地は、第1の液体培地中の濃度より高い濃度のポロクサマー-188を含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、第1の液体培地は、1.8g/Lの濃度または1.8g/L未満の濃度のポロクサマー-188を含み、第2の液体培地は、1.8g/Lより高い濃度(例えば、2.8g/Lより高い濃度、4.0g/Lより高い濃度、6.0g/Lより高い濃度、8.0g/Lより高い濃度、または10.0g/Lより高い濃度)のポロクサマー-
188を含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、第1の液体培地に第2の体積の第2の液体培地を添加する前または後に、ポロクサマー-188を第2の液体培地に添加して、第2の培地中のポロクサマー-188を1.8g/Lの濃度または1.8g/Lより高い濃度(例えば、2.8g/Lより高い濃度、4.0g/Lより高い濃度、6.0g/Lより高い濃度、8.0g/Lより高い濃度、または10.0g/Lより高い濃度)にすることを含む。
188を含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、第1の液体培地に第2の体積の第2の液体培地を添加する前または後に、ポロクサマー-188を第2の液体培地に添加して、第2の培地中のポロクサマー-188を1.8g/Lの濃度または1.8g/Lより高い濃度(例えば、2.8g/Lより高い濃度、4.0g/Lより高い濃度、6.0g/Lより高い濃度、8.0g/Lより高い濃度、または10.0g/Lより高い濃度)にすることを含む。
本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、組み換えタンパク質を哺乳類細胞から、第1の液体培地、もしくは第2の液体培地から、またはその任意の組み合わせから収集することをさらに含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、収集された組み換えタンパク質を医薬組成物に製剤化することをさらに含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、収集は、培養が、30×106細胞/mLより高い(例えば、50×106細胞/mLより高い、100×106細胞/mLより高い、150×106細胞/mLより高い、または200×106細胞/mLより高い)生細胞密度を達成した後、行われる。
哺乳類細胞を培養する方法であって、該方法は、容器と、該容器内に配置された液体培地と、および該容器内に配置されたスパージャであって、該スパージャを介して該液体培地中にガスを分配するように構成された複数の孔を含む該スパージャとを含む培養系を用意すること;ならびに培養系において組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞を、系において組み換えタンパク質を産生するのに十分な条件およびガス流速下で灌流培養することを含み、培地は、孔サイズ、孔タイプ、ガス流速、培地中の生細胞密度、および細胞ストレスに関連するマーカーの群から選択される1つまたはそれ以上の因子に基づき選択されるポロクサマー-188濃度を含む方法も、本明細書において提供される。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、選択されたポロクサマー-188濃度は、培養工程の前にポロクサマー-188を培地に添加すること、および/または培養工程中にポロクサマー-188を培地に添加することにより達成される。
本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、因子は孔タイプであり、孔タイプは焼結孔、またはドリル孔である。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約750μm~約1.5mmである場合は、約2.3g/L~約3.3g/Lの濃度のポロクサマー-188を、または孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約900μm~約1.1mmである場合は、約2.5g/L~約3.1g/Lの濃度のポロクサマー-188を選択することを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約250μm~約750μmである場合は、約3.3g/L~約4.3g/Lの濃度のポロクサマー-188、または孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約400μm~約600μmである場合は、約3.5g/L~約4.1g/Lの濃度のポロクサマー-188を選択することを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約1μm~約250μm(例えば、約1μm~約200μm、約160μm~約190μm、または約170μm~約180μm)である場合は、4.3g/Lより高い濃度(例えば、5.0g/Lより高い濃度、6.0g/Lより高い濃度、8.0g/Lより高い濃度、または10.0g/Lより高い濃度)のポロクサマー-188を選択することを含む。
本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが150μmより
大きい場合は、約1.8g/L~約3.3g/Lの濃度のポロクサマー-188を選択することを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが約80μm~約150μmである場合は、約3.3g/L~約4.3g/Lの濃度のポロクサマー-188を、または孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが約90μm~約110μmである場合は、約3.5g/L~約4.1g/Lの濃度のポロクサマー-188を選択することを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが約1μm~約80μmである場合は、4.5g/Lより高い濃度(例えば、5.0g/Lより高い濃度、6.0g/Lより高い濃度、8.0g/Lより高い濃度、または10.0g/Lより高い濃度)のポロクサマー-188を選択することを含む。
大きい場合は、約1.8g/L~約3.3g/Lの濃度のポロクサマー-188を選択することを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが約80μm~約150μmである場合は、約3.3g/L~約4.3g/Lの濃度のポロクサマー-188を、または孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが約90μm~約110μmである場合は、約3.5g/L~約4.1g/Lの濃度のポロクサマー-188を選択することを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが約1μm~約80μmである場合は、4.5g/Lより高い濃度(例えば、5.0g/Lより高い濃度、6.0g/Lより高い濃度、8.0g/Lより高い濃度、または10.0g/Lより高い濃度)のポロクサマー-188を選択することを含む。
本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、灌流培養は、第1の液体培地を含む培養系を撹拌しながら、少なくとも約7日の培養期間、温度約32℃~約40℃でインキュベートすること;および培養期間の最初の48~96時間後、連続的または定期的に、第1の体積の第1の液体培地を取り出し、第1の液体培地に第2の体積の第2の液体培地を添加することを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、第2の液体培地は、第1の液体培地中のポロクサマー-188の濃度より高い濃度のポロクサマー-188を含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、第2の培地は、選択されたポロクサマー-188濃度を含む。
本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、組み換えタンパク質を哺乳類細胞の内部から、第1の液体培地、もしくは第2の液体培地から、またはその任意の組み合わせから収集することをさらに含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、収集された組み換えタンパク質を医薬組成物に製剤化することをさらに含む。
本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、容器は灌流バイオリアクターである。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、灌流バイオリアクターは、約1.5L~約25,000Lの体積を有する。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、培養期間は10日より長い。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、(c)における、第1の体積の第1の液体培地を取り出し、第2の体積の第2の液体培地を添加することは、連続的に行われる。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、(c)における、第1の体積の第1の液体培地を取り出し、第2の体積の第2の液体培地を添加することは、定期的に行われる。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、(c)において、取り出される第1の液体培地の第1の体積、および添加される第2の液体培地の第2の体積は、経時的に増大される。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、第1の液体培地および/または第2の液体培地は、既知組成の液体培養培地、無血清の液体培養培地、血清を含有する液体培養培地、動物由来の成分を含まない液体培養培地、およびタンパク質を含まない培地の群から選択される。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、およそ最初の48~96時間の時間後、それぞれ24時間の期間において、(c)における、取り出された第1の液体培地の第1の体積、および添加された第2の液体培地の第2の体積は、第1の液体培地の体積、または容器の体積の約0.3×~約10×である。
本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞、
NSO細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、PerC6細胞、Vero細胞、またはHT-1080細胞株である。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、組み換えタンパク質は、免疫グロブリン、酵素、成長因子、タンパク質フラグメント、または操作されたタンパク質である。
NSO細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、PerC6細胞、Vero細胞、またはHT-1080細胞株である。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態において、組み換えタンパク質は、免疫グロブリン、酵素、成長因子、タンパク質フラグメント、または操作されたタンパク質である。
本明細書において使用される通り、名詞の前の単語「a」は、1つまたはそれ以上の特定の名詞を表す。例えば、語句「哺乳類細胞」は、「1つまたはそれ以上の哺乳類細胞」を表す。
用語「哺乳類細胞」は、任意の哺乳類(例えば、ヒト、ハムスター、マウス、ミドリザル、ラット、ブタ、ウシ、もしくはウサギ)由来の、またはそれからもたらされる任意の細胞を意味する。例えば、哺乳類細胞は不死化細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳類細胞は、分化した、または未分化の細胞である。哺乳類細胞の非限定的な例が、本明細書において記載される。哺乳類細胞のさらなる例は、当該技術分野において公知である。
用語「培養」、または「細胞培養」は、制御されたセットの物理的条件下での哺乳類細胞の維持または増殖を意味する。
用語「哺乳類細胞の培養物」、「培養物」、または「細胞培養物」は、制御されたセットの物理的条件下で維持されるか、または増殖する、複数の哺乳類細胞を含有する液体培地を意味する。
用語「液体培養培地」、または「液体培地」は、細胞(例えば、哺乳類細胞)がインビトロで成長または増殖することを可能にするのに十分な栄養分を含有する液体を意味する。例えば、液体培地は、アミノ酸(例えば、20種のアミノ酸)、プリン(例えば、ヒポキサンチン)、ピリミジン(例えば、チミジン)、コリン、イノシトール、チアミン、葉酸、ビオチン、カルシウム、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チミジン、シアノコバラミン、ピルビン酸、リポ酸、マグネシウム、グルコース、ナトリウム、カリウム、鉄、銅、亜鉛、および重炭酸ナトリウムの1つまたはそれ以上を含有する。いくつかの実施形態において、液体培地は、哺乳類由来の血清を含有する。いくつかの実施形態において、液体培地は、哺乳類由来の血清または別の抽出物を含有しない(既知組成の液体培地)。いくつかの実施形態において、液体培地は、微量金属、哺乳類成長ホルモン、および/または哺乳類成長因子を含有する。液体培地の別の例は、最小培地(例えば、無機塩、炭素源、および水のみを含有する培地)である。液体培地の非限定的な例が、本明細書において記載される。液体培地のさらなる例は、当該技術分野において公知であり、商業的に入手可能である。液体培地は、任意の密度の哺乳類細胞を含有する。例えば、本明細書において使用される通り、バイオリアクターから取り出されたある体積の液体培地は、哺乳類細胞を実質的に含まない。
用語「動物由来の成分を含まない液体培養培地」は、哺乳類に由来する成分(例えば、タンパク質、または血清)を全く含有しない液体培地を意味する。
用語「無血清の液体培養培地」は、哺乳類の血清を含有しない液体培地を意味する。
用語「血清を含有する液体培養培地」は、哺乳類の血清を含有する液体培地を意味する。
用語「既知組成の液体培養培地」は、当該技術分野の用語であり、化学的成分の全てが公知である、液体培地を意味する。例えば、既知組成の液体培地は、ウシ胎児血清、ウシ
血清アルブミン、またはヒト血清アルブミンを含有せず、なぜならこれらの調製物は、アルブミンと脂質の複雑な混合物を典型的に含有するからである。
血清アルブミン、またはヒト血清アルブミンを含有せず、なぜならこれらの調製物は、アルブミンと脂質の複雑な混合物を典型的に含有するからである。
用語「タンパク質を含まない液体培養培地」は、タンパク質(例えば、検出可能なタンパク質)を全く含有しない液体培地を意味する。
用語「撹拌」は、容器において液体培地の部分をかき混ぜること、またはそうでなければ動かすことを意味する。これは、例えば、バイオリアクターにおいて液体培地中の溶解したO2濃度を増大させるために行われる。撹拌は、任意の、当該技術分野で公知の方法、例えば、機器、またはプロペラを使用して行われる。バイオリアクターにおいて液体培地の部分の撹拌を行うために使用される、代表的な装置および方法は、当該技術分野において公知である。
用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリンタンパク質の少なくとも15個のアミノ酸(例えば、少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、または100個のアミノ酸)のアミノ酸配列(例えば、可変ドメイン配列、フレームワーク配列、または定常ドメイン配列)を含有するポリペプチドを意味する。免疫グロブリンは、例えば、軽鎖免疫グロブリンの少なくとも15個のアミノ酸、例えば、重鎖免疫グロブリンの少なくとも15個のアミノ酸を含む。免疫グロブリンは、単離抗体(例えば、IgG、IgE、IgD、IgA、またはIgM)であってもい。免疫グロブリンは、IgGのサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4)であってもよい。免疫グロブリンは、抗体フラグメント、例えば、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、またはscFvフラグメントであってもよい。免疫グロブリンはまた、二重特異性抗体もしくは三重特異性抗体、または2量体、3量体、もしくは多量体抗体、または二特異性抗体、Affibody(登録商標)、またはNanobody(登録商標)であってもよい。免疫グロブリンはまた、少なくとも1つの免疫グロブリンドメインを含有する操作されたタンパク質(例えば、融合タンパク質)でもあり得る。免疫グロブリンの非限定的な例が、本明細書において記載され、免疫グロブリンのさらなる例が、当該技術分野において公知である。組み換え免疫グロブリンは、本明細書において記載される方法のいずれかを使用して産生される。
用語「タンパク質フラグメント」、または「ポリペプチドフラグメント」は、少なくとももしくは約4個のアミノ酸長、少なくとももしくは約5個のアミノ酸長、少なくとももしくは約6個のアミノ酸長、少なくとももしくは約7個のアミノ酸長、少なくとももしくは約8個のアミノ酸長、少なくとももしくは約9個のアミノ酸長、少なくとももしくは約10個のアミノ酸長、少なくとももしくは約11個のアミノ酸長、少なくとももしくは約12個のアミノ酸長、少なくとももしくは約13個のアミノ酸長、少なくとももしくは約14個のアミノ酸長、少なくとももしくは約15個のアミノ酸長、少なくとももしくは約16個のアミノ酸長、少なくとももしくは約17個のアミノ酸長、少なくとももしくは約18個のアミノ酸長、少なくとももしくは約19個のアミノ酸長、もしくは少なくとももしくは約20個のアミノ酸長、または20個より長いアミノ酸長である、ポリペプチド配列の部分を意味する。組み換えタンパク質フラグメントは、本明細書において記載される方法のいずれかを使用して産生される。
用語「操作されたタンパク質」は、生物(例えば、哺乳類)内に存在する内在性核酸により天然でコードされないポリペプチドを意味する。操作されたタンパク質の例は、酵素(例えば、操作された酵素の安定性および/または触媒活性の増大をもたらす、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入、または付加を有する)、融合タンパク質、抗体(例えば、2価抗体、3価抗体、または二特異性抗体)、ならびに少なくとも1つの組み換えスキャフォールド配列を含有する抗原結合タンパク質を含む。組み換え操作されたタ
ンパク質は、本明細書において記載される方法のいずれかを使用して産生される。
ンパク質は、本明細書において記載される方法のいずれかを使用して産生される。
用語「分泌されたタンパク質」、または「分泌された組み換えタンパク質」は、哺乳類細胞内で翻訳され、哺乳類細胞における分泌シグナル配列の少なくとも一部での、酵素的切断を通じて、細胞外の空間(例えば、液体培地)に少なくとも部分的に分泌されたときの、少なくとも1つの分泌シグナル配列を本来含有するタンパク質(例えば、組み換えタンパク質)を意味する。当業者は、「分泌された」タンパク質が、分泌されたタンパク質とみなされるために、細胞から完全に分離している必要はないことを理解するだろう。
用語「灌流バイオリアクター」は、バイオリアクターに存在する細胞の培養が、定期的または連続的に第1の液体培地を取り出し、同時またはその直後に、バイオリアクターに実質的に同じ体積の第2の液体培地を添加することを含む、第1の液体培地中に複数の細胞(例えば、哺乳類細胞)を含有するバイオリアクターを意味する。いくつかの例では、培養期間(例えば、液体培地は、日常的に比率を再供給する)中の増加的期間(例えば、約24時間の期間、約1分~約24時間の期間、または24時間より長い期間)に渡り、取り出され、添加される第1の液体培地の体積の増加的変化(例えば、増大、または低減)が存在する。それぞれの日に取り出され、置き換えられる培地の分画は、培養される特定の細胞、開始播種密度、および特定の時間での細胞密度に依存して、変動する。「RV」、または「リアクター体積」は、培養プロセスの開始時に存在する液体培地の体積(例えば、播種後に存在する液体培地の総体積)を意味する。
用語「流加バイオリアクター(fed-batch bioreactor)」は、当該技術分野の用語であり、バイオリアクターに存在する細胞の培養が、細胞培養物から第1の液体培地または第2の液体培地を実質的にまたは有意に取り出すことなく、第2の液体培地の第1の液体培地に定期的または連続的に添加することを含む、第1の液体培地において複数の細胞(例えば、哺乳類細胞)を含有するバイオリアクターを意味する。第2の液体培地は、第1の液体培地と同じであり得る。流加培養(fed-batch culture)のいくつかの例では、第2
の液体培地は、第1の液体培地の濃縮された形態である。流加培養のいくつかの例では、第2の液体培地は、乾燥粉末として添加される。
の液体培地は、第1の液体培地の濃縮された形態である。流加培養のいくつかの例では、第2の液体培地は、乾燥粉末として添加される。
用語「スパージャ」は、当該技術分野の用語であり、入口、本体、ならびに1つまたはそれ以上の孔を有する表面を有する装置であって、ガスが入口を通り、本体を通り、1つまたはそれ以上の孔から外に流れ出ることを可能にするように入口、本体、および1つまたはそれ以上の孔が設計されている装置を意味する。スパージャを細胞培養物において使用する場合、1つまたはそれ以上の孔の1つは細胞培養物と接触しており、その結果、ガスが少なくとも1つの孔から外に出て細胞培養物中に流れる。スパージャは、その孔サイズおよび孔タイプによりしばしば記載される。異なる組み合わせの孔サイズおよび孔タイプを有するスパージャの非限定的な例が、本明細書において記載される。
用語「孔サイズ」は、当該技術分野の用語であり、単一の孔を有するスパージャにおける単一の孔の直径、または2つまたはそれ以上の孔を有するスパージャにおける2つまたはそれ以上の孔の平均直径を指す。
用語「細胞ストレスに関連するマーカー」は、当該技術分野の用語であり、生理学的ストレス下で細胞(例えば、ネクローシス細胞死もしくはアポトーシス細胞死を起こす細胞)により液体培地に放出される生物学的分子、または生理学的ストレス下で細胞(例えば、ネクローシス細胞死もしくはアポトーシス細胞死を起こす細胞)において産生されるか、もしくはレベルが上昇する生物学的分子を意味する。生理学的ストレス下で細胞により放出される、細胞ストレスに関連するマーカーの非限定的な例は、タンパク質分解酵素(例えば、活性化カスパーゼ)、乳酸脱水素酵素、ゲノムDNA(例えば、ヌクレオソーム
DNA)、チトクロムc、および活性化PARPを含む。生理学的ストレス下で細胞において産生されるか、またはレベルが上昇す、細胞ストレスに関連するマーカーの非限定的な例は、活性化カスパーゼ、チトクロムc、活性化PARP、および外在化ホスファチジルセリンを含む。
DNA)、チトクロムc、および活性化PARPを含む。生理学的ストレス下で細胞において産生されるか、またはレベルが上昇す、細胞ストレスに関連するマーカーの非限定的な例は、活性化カスパーゼ、チトクロムc、活性化PARP、および外在化ホスファチジルセリンを含む。
「比生産性」、または「SPR」は、当該技術分野の用語であり、本明細書において使用する場合、1日当たり1つの哺乳類細胞当たり生産される組み換えタンパク質の質量または酵素活性を指す。組み換え治療用抗体についてのSPRは、質量/細胞/日として通常測定される。組み換え治療用酵素についてのSPRは、ユニット/細胞/日、または(ユニット/質量)/細胞/日として通常測定される。
「体積生産性」、または「VPR」は、当該技術分野の用語であり、本明細書において使用する場合、1日当たりの培養物の体積当たり(例えば、バイオリアクター、容器、もしくはチューブ体積の1L当たり)の生産される組み換えタンパク質の質量、または酵素活性を指す。組み換え治療用抗体についてのVPRは、質量/L/日として通常測定される。組み換え治療用酵素についてのVPRは、ユニット/L/日、または質量/L/日として通常測定される。
語句「濃度のポロクサマー-1881」および「ポロクサマー-188濃度」は、本明細書において互換的に使用される。語句「Xg/Lまたはそれ以上のポロクサマー-188」、および「Xg/Lの濃度またはXg/Lより高い濃度のポロクサマー-188」は、本明細書において互換的に使用される。
別段定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術および化学用語は、本発明が属する当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のため本明細書において記載され;当該技術分野において公知の、他の、適当な方法および材料も使用される。材料、方法、および実施例は、説明のみであり、限定することを意図しない。本明細書において言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、および他の参考文献は、全体として参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む、本明細書が支配する。
本発明の他の特性ならびに利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに請求項から明らかであろう。
本明細書において、哺乳類細胞を培養する方法であって、該方法は、組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞を、組み換えタンパク質を産生するのに十分な条件下で培養すること含み、培養は、1.8g/Lの濃度または1.8g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を含む液体培地において培養することを含み、ポロクサマー-188は、培地に存在する、および/または培養工程の前に培地に添加される、および/または培養工程中に培地に添加される、方法が提供される。哺乳類細胞を培養する方法であって、該方法は、容器と、該容器内に配置された液体培地と、該容器内に配置されたスパージャであって、該スパージャを介して該液体培地中にガスを分配するように構成された複数の孔を含む該スパージャとを含む培養系を用意すること、ならびに培養系において組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞を、系において組み換えタンパク質を産生するのに十分な条件およびガス流速下で培養することを含み、培地が、孔サイズ、孔タイプ、ガス流速、培地中の生細胞密度、および細胞ストレスに関連するマーカーの群から選択される1つまたはそれ以上の因子に基づき選択されるポロクサマー-188濃度を含む方法も提供される。これらの方法の代表的な非限定的な態様が、以下で記載される。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、20×106細胞/mLより高い、25×106細胞/mLより高い、30×106細胞/mLより高い、35×106細胞/mLより高い、40×106細胞/mLより高い、45×106細胞/mLより高い、50×106細胞/mLより高い、55×106細胞/mLより高い、60×106細胞/mLより高い、65×106細胞/mLより高い、70×106細胞/mLより高い、75×106細胞/mLより高い、80×106細胞/mLより高い、85×106細胞/mLより高い、90×106細胞/mLより高い、95×106細胞/mLより高い、100×106細胞/mLより高い、105×106細胞/mLより高い、110×106細胞/mLより高い、115×106細胞/mLより高い、120×106細胞/mLより高い、125×106細胞/mLより高い、130×106細胞/mLより高い、135×106細胞/mLより高い、140×106細胞/mLより高い、145×106細胞/mLより高い、150×106細胞/mLより高い、155×106細胞/mLより高い、160×106細胞/mLより高い、165×106細胞/mLより高い、170×106細胞/mLより高い、175×106細胞/mLより高い、180×106細胞/mLより高い、185×106細胞/mLより高い、190×106細胞/mLより高い、195×106細胞/mLより高い、200×106細胞/mLより高い、205×106細胞/mLより高い、210×106細胞/mLより高い、215×106細胞/mLより高い、220×106細胞/mLより高い、225×106細胞/mLより高い、230×106細胞/mLより高い、235×106細胞/mLより高い、240×106細胞/mLより高い、245×106細胞/mLより高い、または250×106細胞/mLより高い生細胞密度を有する細胞培養物を達成する。細胞培養物の生細胞密度を決定する方法は、当該技術分野において周知である。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、少なくとも5日(例えば、少なくとも10日、少なくとも15日、少なくとも20日、少なくとも25日、少なくとも30日、少なくとも35日、少なくとも40日、少なくとも45日、少なくとも50日、少なくとも55日、少なくとも60日、少なくとも65日、または少なくとも70日)の培養期間に渡り、75%より高い(例えば、80%より高い、85%より高い、または90%より高い)パーセンテージ細胞生存率を有する細胞培養物をもたらす。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、培養期間中の任意の時間に開始する少なくとも5日(例えば、少なくとも10日、少なくとも15日、少なくとも20日、少なくとも25日、少なくとも30日、少なくとも35日、少なくとも40日、少なくとも45日、少なくとも50日、少なくとも55日、少なくとも60日、少なくとも65日、または少なくとも70日)に渡り、少なくとも1.5g/L/d(例えば、少なくとも1.6g/L/d、少なくとも1.7g/L/d、少なくとも1.8g/L/d、少なくとも1.9g/L/d、少なくとも2.0g/L/d、少なくとも2.1g/L/d、少なくとも2.2g/L/d、少なくとも2.3g/L/d、少なくとも2.4g/L/d、少なくとも2.5g/L/d、少なくとも2.6g/L/d、少なくとも2.7g/L/d、少なくとも2.8g/L/d、少なくとも2.9g/L/d、少なくとも3.0g/L/d、少なくとも3.1g/L/d、少なくとも3.2g/L/d、少なくとも3.3g/L/d、少なくとも3.4g/L/d、少なくとも3.5g/L/d、少なくとも3.6g/L/d、少なくとも3.7g/L/d、少なくとも3.8g/L/d、少なくとも3.9g/L/d、少なくとも4.0g/L/d、少なくとも4.1g/L/d、少なくとも4.2g/L/d、少なくとも4.3g/L/d、少なくとも4.4g/L/d、または少なくとも4.5g/L/d)の体積測定生産性(volumetric productivity rate)(VPR)を有する培養物に達する。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、収集されたとき、(1.8g/Lもしくはそれ以上のポロクサマー-188を含む液体培地における培養を含まない、類似の方法で産生された組み換えタンパク質と比較して)低減したレベル(例えば、約5%もしくはそれ未満の低減、約10%もしくはそれ未満の低減、約15%もしくはそれ未満の低減、約20%もしくはそれ未満の低減、約25%もしくはそれ未満の低減、約30%もしくはそれ未満の低減、約35%もしくはそれ未満の低減、約40%もしくはそれ未満の低減、約45%もしくはそれ未満の低減、約50%もしくはそれ未満の低減、約55%もしくはそれ未満の低減、約60%もしくはそれ未満の低減、約65%もしくはそれ未満の低減、約70%もしくはそれ未満の低減、約75%もしくはそれ未満の低減、約80%もしくはそれ未満の低減、約85%もしくはそれ未満の低減、または約90%もしくはそれ未満の低減)の分解を有する、組み換えタンパク質の産生をもたらす。細胞培養物から収集された組み換えタンパク質の分解のレベルは、例えば、ゲル電気泳動、および/または免疫ブロッティングを使用して、検出される。
いくつかの実施形態において、方法は、培養期間内の任意の時間にて開始する、少なくとも約5日(例えば、少なくとも10日、少なくとも15日、少なくとも20日、少なくとも25日、少なくとも30日、少なくとも35日、少なくとも40日、少なくとも45日、少なくとも50日、少なくとも55日、少なくとも60日、少なくとも65日、または少なくとも70日)の連続する日に渡り、60nU/細胞/日未満(例えば、55nU/細胞/日未満、50nU/細胞/日未満、45nU/細胞/日未満、40nU/細胞/日未満、35nU/細胞/日未満、30nU/細胞/日未満、25nU/細胞/日未満、または20nU/細胞/日未満)の比乳酸脱水素酵素生産を有する細胞培養物をもたらす。
いくつかの実施形態において、方法は、一定の状態(静止期)における、少なくとも5日(例えば、少なくとも10日、少なくとも15日、少なくとも20日、少なくとも25日、少なくとも30日、少なくとも35日、少なくとも40日、少なくとも45日、もしくは少なくとも50日)間の、例えば、約30×106細胞/mLもしくはそれより高い、約35×106細胞/mLもしくはそれより高い、約40×106細胞/mLもしくはそれより高い、約45×106細胞/mLもしくはそれより高い、約50×106細胞/mLもしくはそれより高い、約55×106細胞/mLもしくはそれより高い、約60×106細胞/mLもしくはそれより高い、約65×106細胞/mLもしくはそれより高い、約70×106細胞/mLもしくはそれより高い、約75×106細胞/mLもしくはそれより高い、約80×106細胞/mLもしくはそれより高い、約85×106細胞/mLもしくはそれより高い、約90×106細胞/mLもしくはそれより高い、約95×106細胞/mLもしくはそれより高い、約100×106細胞/mLもしくはそれより高い、約105×106細胞/mLもしくはそれより高い、約110×106細胞/mLもしくはそれより高い、約115×106細胞/mLもしくはそれより高い、約120×106細胞/mLもしくはそれより高い、約125×106細胞/mLもしくはそれより高い、約130×106細胞/mLもしくはそれより高い、約135×106細胞/mLもしくはそれより高い、約140×106細胞/mLもしくはそれより高い、約145×106細胞/mLもしくはそれより高い、約150×106細胞/mLもしくはそれより高い、約155×106細胞/mLもしくはそれより高い、約160×106細胞/mLもしくはそれより高い、約165×106細胞/mLもしくはそれより高い、約170×106細胞/mLもしくはそれより高い、約175×106細胞/mLもしくはそれより高い、約180×106細胞/mLもしくはそれより高い、約185×106細胞/mLもしくはそれより高い、約190×106細胞/mLもしくはそれより高い、約195×106細胞/mLもしくはそれより高い、または約200×106細胞/mLもしくはそれより高い生細胞密度での細胞の維持をもたらす。
培養物体積
記載される方法のいずれかにおける培養工程(例えば、灌流培養工程)は、培養物における細胞維持、および増殖を可能にする条件下で、20L~約8,000L(例えば、約20L~約7,000L、約20L~約6,000L、約20L~約5,000L、約20L~約4,000L、約20L~約3,000L、約20L~約2,500L、約20L~約2,000L、約20L~約1,500L、約20L~約1,000L、約20L~約500L、約20L~約200L、約20L~約100L、約100L~約8,000L、約100L~約7,000L、約100L~約6,000L、約100L~約5,000L、約100L~約4,000L、約100L~約3,000L、約100L~約2,000L、約100L~約1,500L、約100L~約1,000L、約100L~約800L、約100L~約700L、約100L~約600L、約100L~約500L、約100L~約400L、約100L~約300L、約100L~約200L、約500L~約8,000L、約500L~約7,000L、約500L~約6,000L、約500L~約5,000L、約500L~約4,000L、約500L~約3,000L、約500L~約2,000L、約500L~約1,500L、約500L~約1,000L、約500L~約750L、約1,000L~約8,000L、約1,000L~約7,000L、約1,000L~約6,000L、約1,000L~約5,000L、約1,000L~約4,000L、約1,000L~約3,000L、約1,000L~約2,000L、約1,000L~約1,500L、約2,000L~約8,000L、約2,000L~約7,000L、約2,000L~約6,000L、約2,000L~約5,000L、約2,000L~約4,000L、約2,000L~約3,000L、約3,000L~約8,000L、約3,000L~約7,000L、約3,000L~約6,000L、約3,000L~約5,000L、約3,000L~約4,000L、約4,000L~約8,000L、約4,000L~約7,000L、約4,000L
~約6,000L、約4,000L~約5,000L、約5,000L~約8,000L、約5,000L~約7,000L、約5,000L~約6,000L、約6,000L~約8,000L、約6,000L~約7,000L、または約7,000L~約8,000L)の体積を有する細胞培養物をインキュベートすることを含む。
記載される方法のいずれかにおける培養工程(例えば、灌流培養工程)は、培養物における細胞維持、および増殖を可能にする条件下で、20L~約8,000L(例えば、約20L~約7,000L、約20L~約6,000L、約20L~約5,000L、約20L~約4,000L、約20L~約3,000L、約20L~約2,500L、約20L~約2,000L、約20L~約1,500L、約20L~約1,000L、約20L~約500L、約20L~約200L、約20L~約100L、約100L~約8,000L、約100L~約7,000L、約100L~約6,000L、約100L~約5,000L、約100L~約4,000L、約100L~約3,000L、約100L~約2,000L、約100L~約1,500L、約100L~約1,000L、約100L~約800L、約100L~約700L、約100L~約600L、約100L~約500L、約100L~約400L、約100L~約300L、約100L~約200L、約500L~約8,000L、約500L~約7,000L、約500L~約6,000L、約500L~約5,000L、約500L~約4,000L、約500L~約3,000L、約500L~約2,000L、約500L~約1,500L、約500L~約1,000L、約500L~約750L、約1,000L~約8,000L、約1,000L~約7,000L、約1,000L~約6,000L、約1,000L~約5,000L、約1,000L~約4,000L、約1,000L~約3,000L、約1,000L~約2,000L、約1,000L~約1,500L、約2,000L~約8,000L、約2,000L~約7,000L、約2,000L~約6,000L、約2,000L~約5,000L、約2,000L~約4,000L、約2,000L~約3,000L、約3,000L~約8,000L、約3,000L~約7,000L、約3,000L~約6,000L、約3,000L~約5,000L、約3,000L~約4,000L、約4,000L~約8,000L、約4,000L~約7,000L、約4,000L
~約6,000L、約4,000L~約5,000L、約5,000L~約8,000L、約5,000L~約7,000L、約5,000L~約6,000L、約6,000L~約8,000L、約6,000L~約7,000L、または約7,000L~約8,000L)の体積を有する細胞培養物をインキュベートすることを含む。
当該技術分野において公知である通り、細胞培養物の体積は、培養期間(例えば、以下に記載される)中実質的に同じままであるか、または経時的に増大する。
培養期間
本明細書において記載される方法のいずれかにおける培養(例えば、灌流培養)は、約3日~約100日(例えば、約3日~約95日、約3日~約90日、約3日~約85日、約3日~約80日、約3日~約75日、約3日~約70日、約3日~約65日、約3日~約60日、約3日~約55日、約3日~約50日、約3日~約45日、約3日~約40日、約3日~約35日、約3日~約30日、約3日~約25日、約3日~約20日、約3日~約15日、約3日~約10日、約5日~約100日、約5日~約95日、約5日~約90日、約5日~約85日、約5日~約80日、約5日~約75日、約5日~約70日、約5日~約65日、約5日~約60日、約5日~約55日、約5日~約50日、約5日~約45日、約5日~約40日、約5日~約35日、約5日~約30日、約5日~約25日、約5日~約20日、約5日~約15日、約5日~約10日、約10日~約100日、約10日~約95日、約10日~約90日、約10日~約85日、約10日~約80日、約10日~約75日、約10日~約70日、約10日~約65日、約10日~約60日、約10日~約55日、約10日~約50日、約10日~約45日、約10日~約40日、約10日~約35日、約10日~約30日、約10日~約25日、約10日~約20日、約10日~約15日、約15日~約100日、約15日~約95日、約15日~約90日、約15日~約85日、約15日~約80日、約15日~約75日、約15日~約70日、約15日~約65日、約15日~約60日、約15日~約55日、約15日~約50日、約15日~約45日、約15日~約40日、約15日~約35日、約15日~約30日、約15日~約25日、約15日~約20日、約20日~約100日、約20日~約95日、約20日~約90日、約20日~約85日、約20日~約80日、約20日~約75日、約20日~約70日、約20日~約65日、約20日~約60日、約20日~約55日、約20日~約50日、約20日~約45日、約20日~約40日、約20日~約35日、約20日~約30日、約20日~約25日、約25日~約100日、約25日~約95日、約25日~約90日、約25日~約85日、約25日~約80日、約25日~約75日、約25日~約70日、約25日~約65日、約25日~約60日、約25日~約55日、約25日~約50日、約25日~約45日、約25日~約40日、約25日~約35日、約25日~約30日、約30日~約100日、約30日~約90日、約30日~約80日、約30日~約70日、約30日~約60日、約30日~約50日、約30日~約40日、約40日~約100日、約40日~約90日、約40日~約80日、約40日~約70日、約40日~約60日、約40日~約50日、約50日~約100日、約50日~約90日、約50日~約80日、約50日~約70日、約50日~約60日、約60日~約100日、約60日~約90日、約60日~約80日、約60日~約70日、約70日~約100日、約70日~約90日、約70日~約80日、約80日~約100日、約80日~約90日、または約90日~約100日)の期間に渡り行われる。
本明細書において記載される方法のいずれかにおける培養(例えば、灌流培養)は、約3日~約100日(例えば、約3日~約95日、約3日~約90日、約3日~約85日、約3日~約80日、約3日~約75日、約3日~約70日、約3日~約65日、約3日~約60日、約3日~約55日、約3日~約50日、約3日~約45日、約3日~約40日、約3日~約35日、約3日~約30日、約3日~約25日、約3日~約20日、約3日~約15日、約3日~約10日、約5日~約100日、約5日~約95日、約5日~約90日、約5日~約85日、約5日~約80日、約5日~約75日、約5日~約70日、約5日~約65日、約5日~約60日、約5日~約55日、約5日~約50日、約5日~約45日、約5日~約40日、約5日~約35日、約5日~約30日、約5日~約25日、約5日~約20日、約5日~約15日、約5日~約10日、約10日~約100日、約10日~約95日、約10日~約90日、約10日~約85日、約10日~約80日、約10日~約75日、約10日~約70日、約10日~約65日、約10日~約60日、約10日~約55日、約10日~約50日、約10日~約45日、約10日~約40日、約10日~約35日、約10日~約30日、約10日~約25日、約10日~約20日、約10日~約15日、約15日~約100日、約15日~約95日、約15日~約90日、約15日~約85日、約15日~約80日、約15日~約75日、約15日~約70日、約15日~約65日、約15日~約60日、約15日~約55日、約15日~約50日、約15日~約45日、約15日~約40日、約15日~約35日、約15日~約30日、約15日~約25日、約15日~約20日、約20日~約100日、約20日~約95日、約20日~約90日、約20日~約85日、約20日~約80日、約20日~約75日、約20日~約70日、約20日~約65日、約20日~約60日、約20日~約55日、約20日~約50日、約20日~約45日、約20日~約40日、約20日~約35日、約20日~約30日、約20日~約25日、約25日~約100日、約25日~約95日、約25日~約90日、約25日~約85日、約25日~約80日、約25日~約75日、約25日~約70日、約25日~約65日、約25日~約60日、約25日~約55日、約25日~約50日、約25日~約45日、約25日~約40日、約25日~約35日、約25日~約30日、約30日~約100日、約30日~約90日、約30日~約80日、約30日~約70日、約30日~約60日、約30日~約50日、約30日~約40日、約40日~約100日、約40日~約90日、約40日~約80日、約40日~約70日、約40日~約60日、約40日~約50日、約50日~約100日、約50日~約90日、約50日~約80日、約50日~約70日、約50日~約60日、約60日~約100日、約60日~約90日、約60日~約80日、約60日~約70日、約70日~約100日、約70日~約90日、約70日~約80日、約80日~約100日、約80日~約90日、または約90日~約100日)の期間に渡り行われる。
哺乳類細胞
本明細書において提供される方法において培養される(例えば、灌流培養される)哺乳類細胞は、懸濁液において成長する細胞、または接着細胞である。本明細書において記載される方法のいずれかにおいて培養される哺乳類細胞の非限定的な例は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(例えば、CHO DG44細胞、またはCHO-K1s細胞)、Sp2.0、ミエローマ細胞(例えば、NS/0)、B細胞、ハイブリドーマ細胞
、T細胞、ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞(例えば、HEK293E、およびHEK293F)、アフリカミドリザル腎臓上皮(Vero)細胞、NSO細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、PerC6細胞、Vero細胞、HT-1080細胞、ならびにメイディンダービーイヌ(コッカースパニエル)腎臓上皮(MDCK)細胞を含む。接着細胞が培養されるいくつかの例では、培養物はまた、複数のマイクロキャリア(例えば、1つまたはそれ以上の孔を含有するマイクロキャリア)も含有する。本明細書に記載される方法のいずれかにおいて培養されるさらなる哺乳類細胞は、当該技術分野において公知である。
本明細書において提供される方法において培養される(例えば、灌流培養される)哺乳類細胞は、懸濁液において成長する細胞、または接着細胞である。本明細書において記載される方法のいずれかにおいて培養される哺乳類細胞の非限定的な例は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(例えば、CHO DG44細胞、またはCHO-K1s細胞)、Sp2.0、ミエローマ細胞(例えば、NS/0)、B細胞、ハイブリドーマ細胞
、T細胞、ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞(例えば、HEK293E、およびHEK293F)、アフリカミドリザル腎臓上皮(Vero)細胞、NSO細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、PerC6細胞、Vero細胞、HT-1080細胞、ならびにメイディンダービーイヌ(コッカースパニエル)腎臓上皮(MDCK)細胞を含む。接着細胞が培養されるいくつかの例では、培養物はまた、複数のマイクロキャリア(例えば、1つまたはそれ以上の孔を含有するマイクロキャリア)も含有する。本明細書に記載される方法のいずれかにおいて培養されるさらなる哺乳類細胞は、当該技術分野において公知である。
哺乳類細胞は、組み換えタンパク質をコードする、組み換え核酸(例えば、哺乳類細胞のゲノムにおいて安定的に統合された核酸)を含有する。本明細書において記載される方法を使用して産生される組み換えタンパク質である、代表的な組み換えタンパク質をコードする組み換え核酸の非限定的な例が、以下に記載される。いくつかの場合に、バイオリアクター(例えば、本明細書において記載されるバイオリアクターのいずれか)において培養される哺乳類細胞は、より多くの培養物からもたらされた。
組み換えタンパク質をコードする核酸は、分子生物学および分子遺伝学において公知の多種多様な方法を使用して、哺乳類細胞に導入される。非限定的な例は、トランスフェクション(例えば、リポフェクション)、形質導入(例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、またはレトロウイルス感染)、およびエレクトロポレーションを含む。いくつかの場合に、組み換えタンパク質をコードする核酸は、哺乳類細胞の染色体に安定的に統合されない(一過性トランスフェクション)が、一方、他の場合で、核酸は統合される。あるいは、または加えて、組み換えタンパク質をコードする核酸は、プラスミド、および/または哺乳類人工染色体(例えば、ヒト人工染色体)に存在する。あるいは、または加えて、核酸は、ウイルスベクター(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルスベクター)を使用して細胞に導入される。核酸は、プロモーター配列(例えば、β-アクチンプロモーターおよびCMVプロモーターのような強力なプロモーター、または誘導可能なプロモーター)に作動可能に結合する。核酸を含有するベクターはまた、所望されるなら、選択可能なマーカー(例えば、哺乳類細胞にハイグロマイシン、ピューロマイシン、またはネオマイシン抵抗性を与える遺伝子)も含有する。
いくつかの場合に、組み換えタンパク質は、分泌されたタンパク質であり、哺乳類細胞により、細胞外培地(例えば、灌流培養における第1および/もしくは第2の液体培地、またはフィードバッチ培養(feed batch culturing)における第1の液体培地および/もしくはフィード液体培地(feed liquid medium))に放出される。例えば、溶解可能な組み換えタンパク質をコードする核酸配列は、哺乳類細胞に存在する酵素により切断され、細胞外培地(例えば、第1および/または第2の液体培地)にその後放出される、組み換えタンパク質のN-またはC-末端に分泌シグナルペプチドをコードする、配列を含有する。
バイオリアクター
本明細書において記載される方法のいずれかにおける培養工程は、バイオリアクター(例えば、灌流バイオリアクター、または流加バイオリアクター)を使用して行われる。培養工程を行うために使用されるバイオリアクター(例えば、灌流バイオリアクター、または流加バイオリアクター)は、約24L~約25,000L(例えば、約24L~約20,000L、約24L~約15,000L、約24L~約10,000L、約24L~約9,500L、約24L~約9,000L、約24L~約8,500L、約24L~約8,000L、約24L~約7,500L、約24L~約7,000L、約24L~約6,500L、約24L~約6,000L、約24L~約5,500L、約24L~約5,000L、約24L~約4,500L、約24L~約4,000L、約24L~約3,50
0L、約24L~約3,000L、約24L~約2,500L、約24L~約2,000L、約24L~約1,500L、約24L~約1,000L、約24L~約900L、約24L~約800L、約24L~約700L、約24L~約600L、約24L~約500L、約24L~約400L、約24L~約300L、約24L~約200L、約24L~約100L、約100L~約25,000L、約100L~約20,000L、約100L~約15,000L、約100L~約10,000L、約100L~約9,500L、約100L~約9,000L、約100L~約8,500L、約100L~約8,000L、約100L~約7,500L、約100L~約7,000L、約100L~約6,500L、約100L~約6,000L、約100L~約5,500L、約100L~約5,000L、約100L~約4,500L、約100L~約4,000L、約100L~約3,500L、約100L~約3,000L、約100L~約2,500L、約100L~約2,000L、約100L~約1,500L、約100L~約1,000L、約100L~約900L、約100L~約800L、約100L~約700L、約100L~約600L、約100L~約500L、約100L~約400L、約100L~約300L、約100L~約200L、約200L~約25,000L、約200L~約20,000L、約200L~約15,000L、約200L~約10,000L、約200L~約9,500L、約200L~約9,000L、約200L~約8,500L、約200L~約8,000L、約200L~約7,500L、約200L~約7,000L、約200L~約6,500L、約200L~約6,000L、約200L~約5,500L、約200L~約5,000L、約200L~約4,500L、約200L~約4,000L、約200L~約3,500L、約200L~約3,000L、約200L~約2,500L、約200L~約2,000L、約200L~約1,500L、約200L~約1,000L、約200L~約900L、約200L~約800L、約200L~約700L、約200L~約600L、約200L~約500L、約200L~約400L、約200L~約300L、約500L~約25,000L、約500L~約20,000L、約500L~約15,000L、約500L~約10,000L、約500L~約9,500L、約500L~約9,000L、約500L~約8,500L、約500L~約8,000L、約500L~約7,500L、約500L~約7,000L、約500L~約6,500L、約500L~約6,000L、約500L~約5,500L、約500L~約5,000L、約500L~約4,500L、約500L~約4,000L、約500L~約3,500L、約500L~約3,000L、約500L~約2,500L、約500L~約2,000L、約500L~約1,500L、約500L~約1,000L、約500L~約900L、約500L~約800L、約500L~約700L、約500L~約600L、約1,000L~約25,000L、約1,000L~約20,000L、約1,000L~約15,000L、約1,000L~約10,000L、約1,000L~約9,500L、約1,000L~約9,000L、約1,000L~約8,500L、約1,000L~約8,000L、約1,000L~約7,500L、約1,000L~約7,000L、約1,000L~約6,500L、約1,000L~約6,000L、約1,000L~約5,500L、約1,000L~約5,000L、約1,000L~約4,500L、約1,000L~約4,000L、約1,000L~約3,500L、約1,000L~約3,000L、約1,000L~約2,500L、約1,000L~約2,000L、約1,000L~約1,500L、約2,000L~約25,000L、約2,000L~約20,000L、約2,000L~約15,000L、約2,000L~約10,000L、約2,000L~約9,500L、約2,000L~約9,000L、約2,000L~約8,500L、約2,000L~約8,000L、約2,000L~約7,500L、約2,000L~約7,000L、約2,000L~約6,500L、約2,000L~約6,000L、約2,000L~約5,500L、約2,000L~約5,000L、約2,000L~約4,500L、約2,000L~約4,000L、約2,000L~約3,500L、約2,000L~約3,000L、約2,000L~約2,500L、約3,000L~約25,000L、約3,0
00L~約20,000L、約3,000L~約15,000L、約3,000L~約10,000L、約3,000L~約9,500L、約3,000L~約9,000L、約3,000L~約8,500L、約3,000L~約8,000L、約3,000L~約7,500L、約3,000L~約7,000L、約3,000L~約6,500L、約3,000L~約6,000L、約3,000L~約5,500L、約3,000L~約5,000L、約3,000L~約4,500L、約3,000L~約4,000L、約3,000L~約3,500L、約4,000L~約9,000L、約4,000L~約25,000L、約4,000L~約20,000L、約4,000L~約15,000L、約4,000L~約10,000L、約4,000L~約9,500L、約4,000L~約9,000L、約4,000L~約8,500L、約4,000L~約8,000L、約4,000L~約7,500L、約4,000L~約7,000L、約4,000L~約6,500L、約4,000L~約6,000L、約4,000L~約5,500L、約4,000L~約5,000L、約4,000L~約4,500L、約5,000L~約25,000L、約5,000L~約20,000L、約5,000L~約15,000L、約5,000L~約10,000L、約5,000L~約9,500L、約5,000L~約9,000L、約5,000L~約8,500L、約5,000L~約8,000L、約5,000L~約7,500L、約5,000L~約7,000L、約5,000L~約6,500L、約5,000L~約6,000L、約5,000L~約5,500L、約6,000L~約25,000L、約6,000L~約20,000L、約6,000L~約15,000L、約6.000L~約10,000L、約6,000L~約9,500L、約6,000L~約9,000L、約6,000L~約8,500L、約6,000L~約8,000L、約6,000L~約7,500L、約6,000L~約7,000L、約6,000L~約6,500L、7,000L~約25,000L、約7,000L~約20,000L、約7,000L~約15,000L、約7,000L~約10,000L、約7,000L~約9,500L、約7,000L~約9,000L、約7,000L~約8,500L、約7,000L~約8,000L、約7,000L~約7,500L、約8,000L~約25,000L、約8,000L~約20,000L、約8,000L~約15,000L、約8,000L~約10,000L、約8,000L~約9,500L、約8,000L~約9,000L、約8,000L~約8,500L、約9,000L~約25,000L、約9,000L~約20,000L、約9,000L~約15,000L、約9,000L~約10,000L、約9,000L~約9,500L、約10,000L~約25,000L、約10,000L~約20,000L、約10,000L~約15,000L、約15,000L~約25,000L、約15,000L~約20,000L、または約20,000L~約25,000L)の内部体積(収容能力)を有する。
本明細書において記載される方法のいずれかにおける培養工程は、バイオリアクター(例えば、灌流バイオリアクター、または流加バイオリアクター)を使用して行われる。培養工程を行うために使用されるバイオリアクター(例えば、灌流バイオリアクター、または流加バイオリアクター)は、約24L~約25,000L(例えば、約24L~約20,000L、約24L~約15,000L、約24L~約10,000L、約24L~約9,500L、約24L~約9,000L、約24L~約8,500L、約24L~約8,000L、約24L~約7,500L、約24L~約7,000L、約24L~約6,500L、約24L~約6,000L、約24L~約5,500L、約24L~約5,000L、約24L~約4,500L、約24L~約4,000L、約24L~約3,50
0L、約24L~約3,000L、約24L~約2,500L、約24L~約2,000L、約24L~約1,500L、約24L~約1,000L、約24L~約900L、約24L~約800L、約24L~約700L、約24L~約600L、約24L~約500L、約24L~約400L、約24L~約300L、約24L~約200L、約24L~約100L、約100L~約25,000L、約100L~約20,000L、約100L~約15,000L、約100L~約10,000L、約100L~約9,500L、約100L~約9,000L、約100L~約8,500L、約100L~約8,000L、約100L~約7,500L、約100L~約7,000L、約100L~約6,500L、約100L~約6,000L、約100L~約5,500L、約100L~約5,000L、約100L~約4,500L、約100L~約4,000L、約100L~約3,500L、約100L~約3,000L、約100L~約2,500L、約100L~約2,000L、約100L~約1,500L、約100L~約1,000L、約100L~約900L、約100L~約800L、約100L~約700L、約100L~約600L、約100L~約500L、約100L~約400L、約100L~約300L、約100L~約200L、約200L~約25,000L、約200L~約20,000L、約200L~約15,000L、約200L~約10,000L、約200L~約9,500L、約200L~約9,000L、約200L~約8,500L、約200L~約8,000L、約200L~約7,500L、約200L~約7,000L、約200L~約6,500L、約200L~約6,000L、約200L~約5,500L、約200L~約5,000L、約200L~約4,500L、約200L~約4,000L、約200L~約3,500L、約200L~約3,000L、約200L~約2,500L、約200L~約2,000L、約200L~約1,500L、約200L~約1,000L、約200L~約900L、約200L~約800L、約200L~約700L、約200L~約600L、約200L~約500L、約200L~約400L、約200L~約300L、約500L~約25,000L、約500L~約20,000L、約500L~約15,000L、約500L~約10,000L、約500L~約9,500L、約500L~約9,000L、約500L~約8,500L、約500L~約8,000L、約500L~約7,500L、約500L~約7,000L、約500L~約6,500L、約500L~約6,000L、約500L~約5,500L、約500L~約5,000L、約500L~約4,500L、約500L~約4,000L、約500L~約3,500L、約500L~約3,000L、約500L~約2,500L、約500L~約2,000L、約500L~約1,500L、約500L~約1,000L、約500L~約900L、約500L~約800L、約500L~約700L、約500L~約600L、約1,000L~約25,000L、約1,000L~約20,000L、約1,000L~約15,000L、約1,000L~約10,000L、約1,000L~約9,500L、約1,000L~約9,000L、約1,000L~約8,500L、約1,000L~約8,000L、約1,000L~約7,500L、約1,000L~約7,000L、約1,000L~約6,500L、約1,000L~約6,000L、約1,000L~約5,500L、約1,000L~約5,000L、約1,000L~約4,500L、約1,000L~約4,000L、約1,000L~約3,500L、約1,000L~約3,000L、約1,000L~約2,500L、約1,000L~約2,000L、約1,000L~約1,500L、約2,000L~約25,000L、約2,000L~約20,000L、約2,000L~約15,000L、約2,000L~約10,000L、約2,000L~約9,500L、約2,000L~約9,000L、約2,000L~約8,500L、約2,000L~約8,000L、約2,000L~約7,500L、約2,000L~約7,000L、約2,000L~約6,500L、約2,000L~約6,000L、約2,000L~約5,500L、約2,000L~約5,000L、約2,000L~約4,500L、約2,000L~約4,000L、約2,000L~約3,500L、約2,000L~約3,000L、約2,000L~約2,500L、約3,000L~約25,000L、約3,0
00L~約20,000L、約3,000L~約15,000L、約3,000L~約10,000L、約3,000L~約9,500L、約3,000L~約9,000L、約3,000L~約8,500L、約3,000L~約8,000L、約3,000L~約7,500L、約3,000L~約7,000L、約3,000L~約6,500L、約3,000L~約6,000L、約3,000L~約5,500L、約3,000L~約5,000L、約3,000L~約4,500L、約3,000L~約4,000L、約3,000L~約3,500L、約4,000L~約9,000L、約4,000L~約25,000L、約4,000L~約20,000L、約4,000L~約15,000L、約4,000L~約10,000L、約4,000L~約9,500L、約4,000L~約9,000L、約4,000L~約8,500L、約4,000L~約8,000L、約4,000L~約7,500L、約4,000L~約7,000L、約4,000L~約6,500L、約4,000L~約6,000L、約4,000L~約5,500L、約4,000L~約5,000L、約4,000L~約4,500L、約5,000L~約25,000L、約5,000L~約20,000L、約5,000L~約15,000L、約5,000L~約10,000L、約5,000L~約9,500L、約5,000L~約9,000L、約5,000L~約8,500L、約5,000L~約8,000L、約5,000L~約7,500L、約5,000L~約7,000L、約5,000L~約6,500L、約5,000L~約6,000L、約5,000L~約5,500L、約6,000L~約25,000L、約6,000L~約20,000L、約6,000L~約15,000L、約6.000L~約10,000L、約6,000L~約9,500L、約6,000L~約9,000L、約6,000L~約8,500L、約6,000L~約8,000L、約6,000L~約7,500L、約6,000L~約7,000L、約6,000L~約6,500L、7,000L~約25,000L、約7,000L~約20,000L、約7,000L~約15,000L、約7,000L~約10,000L、約7,000L~約9,500L、約7,000L~約9,000L、約7,000L~約8,500L、約7,000L~約8,000L、約7,000L~約7,500L、約8,000L~約25,000L、約8,000L~約20,000L、約8,000L~約15,000L、約8,000L~約10,000L、約8,000L~約9,500L、約8,000L~約9,000L、約8,000L~約8,500L、約9,000L~約25,000L、約9,000L~約20,000L、約9,000L~約15,000L、約9,000L~約10,000L、約9,000L~約9,500L、約10,000L~約25,000L、約10,000L~約20,000L、約10,000L~約15,000L、約15,000L~約25,000L、約15,000L~約20,000L、または約20,000L~約25,000L)の内部体積(収容能力)を有する。
培養系
本明細書において記載される方法のいくつかは、容器と、該容器内に配置された液体培地(例えば、本明細書において記載される培養培地のいずれか)と、該容器内に配置されたスパージャであって、該スパージャを介して該液体培地中にガスを分配するように構成された複数の孔を含む該スパージャとを含む培養系(例えば、灌流培養系)を使用する。容器は、約24L~約20,000L(例えば、約24L~約15,000L、約24L~約10,000L、約24L~約9,500L、約24L~約9,000L、約24L~約8,500L、約24L~約8,000L、約24L~約7,500L、約24L~約7,000L、約24L~約6,500L、約24L~約6,000L、約24L~約5,500L、約24L~約5,000L、約24L~約4,500L、約24L~約4,000L、約24L~約3,500L、約24L~約3,000L、約24L~約2,500L、約24L~約2,000L、約24L~約1,500L、約24L~約1,000L、約24L~約900L、約24L~約800L、約24L~約700L、約24L~約600L、約24L~約500L、約24L~約400L、約24L~約300L
、約24L~約200L、約24L~約100L、約100L~約20,000L、約100L~約15,000L、約100L~約10,000L、約100L~約9,500L、約100L~約9,000L、約100L~約8,500L、約100L~約8,000L、約100L~約7,500L、約100L~約7,000L、約100L~約6,500L、約100L~約6,000L、約100L~約5,500L、約100L~約5,000L、約100L~約4,500L、約100L~約4,000L、約100L~約3,500L、約100L~約3,000L、約100L~約2,500L、約100L~約2,000L、約100L~約1,500L、約100L~約1,000L、約100L~約900L、約100L~約800L、約100L~約700L、約100L~約600L、約100L~約500L、約100L~約400L、約100L~約300L、約100L~約200L、約200L~約20,000L、約200L~約15,000L、約200L~約10,000L、約200L~約9,500L、約200L~約9,000L、約200L~約8,500L、約200L~約8,000L、約200L~約7,500L、約200L~約7,000L、約200L~約6,500L、約200L~約6,000L、約200L~約5,500L、約200L~約5,000L、約200L~約4,500L、約200L~約4,000L、約200L~約3,500L、約200L~約3,000L、約200L~約2,500L、約200L~約2,000L、約200L~約1,500L、約200L~約1,000L、約200L~約900L、約200L~約800L、約200L~約700L、約200L~約600L、約200L~約500L、約200L~約400L、約200L~約300L、約500L~約20,000L、約500L~約15,000L、約500L~約10,000L、約500L~約9,500L、約500L~約9,000L、約500L~約8,500L、約500L~約8,000L、約500L~約7,500L、約500L~約7,000L、約500L~約6,500L、約500L~約6,000L、約500L~約5,500L、約500L~約5,000L、約500L~約4,500L、約500L~約4,000L、約500L~約3,500L、約500L~約3,000L、約500L~約2,500L、約500L~約2,000L、約500L~約1,500L、約500L~約1,000L、約500L~約900L、約500L~約800L、約500L~約700L、約500L~約600L、約1,000L~約25,000L、約1,000L~約20,000L、約1,000L~約15,000L、約1,000L~約10,000L、約1,000L~約9,500L、約1,000L~約9,000L、約1,000L~約8,500L、約1,000L~約8,000L、約1,000L~約7,500L、約1,000L~約7,000L、約1,000L~約6,500L、約1,000L~約6,000L、約1,000L~約5,500L、約1,000L~約5,000L、約1,000L~約4,500L、約1,000L~約4,000L、約1,000L~約3,500L、約1,000L~約3,000L、約1,000L~約2,500L、約1,000L~約2,000L、約1,000L~約1,500L、約2,000L~約20,000L、約2,000L~約15,000L、約2,000L~約10,000L、約2,000L~約9,500L、約2,000L~約9,000L、約2,000L~約8,500L、約2,000L~約8,000L、約2,000L~約7,500L、約2,000L~約7,000L、約2,000L~約6,500L、約2,000L~約6,000L、約2,000L~約5,500L、約2,000L~約5,000L、約2,000L~約4,500L、約2,000L~約4,000L、約2,000L~約3,500L、約2,000L~約3,000L、約2,000L~約2,500L、約3,000L~約20,000L、約3,000L~約15,000L、約3,000L~約10,000L、約3,000L~約9,500L、約3,000L~約9,000L、約3,000L~約8,500L、約3,000L~約8,000L、約3,000L~約7,500L、約3,000L~約7,000L、約3,000L~約6,500L、約3,000L~約6,000L、約3,000L~約5,500L、約3,000L~約5,000L、約3,000L~約4,500L、
約3,000L~約4,000L、約3,000L~約3,500L、約4,000L~約20,000L、約4,000L~約15,000L、約4,000L~約10,000L、約4,000L~約9,500L、約4,000L~約9,000L、約4,000L~約8,500L、約4,000L~約8,000L、約4,000L~約7,500L、約4,000L~約7,000L、約4,000L~約6,500L、約4,000L~約6,000L、約4,000L~約5,500L、約4,000L~約5,000L、約4,000L~約4,500L、約5,000L~約20,000L、約5,000L~約15,000L、約5,000L~約10,000L、約5,000L~約9,500L、約5,000L~約9,000L、約5,000L~約8,500L、約5,000L~約8,000L、約5,000L~約7,500L、約5,000L~約7,000L、約5,000L~約6,500L、約5,000L~約6,000L、約5,000L~約5,500L、約6,000L~約20,000L、約6,000L~約10,000L、約6,000L~約9,500L、約6,000L~約9,000L、約6,000L~約8,500L、約6,000L~約8,000L、約6,000L~約7,500L、約6,000L~約7,000L、約6,000L~約6,500L、約7,000L~約20,000L、約7,000L~約15,000L、約7,000L~約10,000L、約7,000L~約9,500L、約7,000L~約9,000L、約7,000L~約8,500L、約7,000L~約8,000L、約7,000L~約7,500L、約8,000L~約20,000L、約8,000L~約15,000L、約8,000L~約10,000L、約8,000L~約9,500L、約8,000L~約9,000L、約8,000L~約8,500L、約9,000L~約20,000L、約9,000L~約15,000L、約9,000L~約10,000L、約9,000L~約9,500L、約10,000L~約20,000L、約10,000L~約15,000L、または約15,000L~約20,000L)の内部体積(収容能力)を有する。容器は、金属(例えば、ステンレススチール)、プラスチック、もしくはガラス、またはその任意の組み合わせから作られる。
本明細書において記載される方法のいくつかは、容器と、該容器内に配置された液体培地(例えば、本明細書において記載される培養培地のいずれか)と、該容器内に配置されたスパージャであって、該スパージャを介して該液体培地中にガスを分配するように構成された複数の孔を含む該スパージャとを含む培養系(例えば、灌流培養系)を使用する。容器は、約24L~約20,000L(例えば、約24L~約15,000L、約24L~約10,000L、約24L~約9,500L、約24L~約9,000L、約24L~約8,500L、約24L~約8,000L、約24L~約7,500L、約24L~約7,000L、約24L~約6,500L、約24L~約6,000L、約24L~約5,500L、約24L~約5,000L、約24L~約4,500L、約24L~約4,000L、約24L~約3,500L、約24L~約3,000L、約24L~約2,500L、約24L~約2,000L、約24L~約1,500L、約24L~約1,000L、約24L~約900L、約24L~約800L、約24L~約700L、約24L~約600L、約24L~約500L、約24L~約400L、約24L~約300L
、約24L~約200L、約24L~約100L、約100L~約20,000L、約100L~約15,000L、約100L~約10,000L、約100L~約9,500L、約100L~約9,000L、約100L~約8,500L、約100L~約8,000L、約100L~約7,500L、約100L~約7,000L、約100L~約6,500L、約100L~約6,000L、約100L~約5,500L、約100L~約5,000L、約100L~約4,500L、約100L~約4,000L、約100L~約3,500L、約100L~約3,000L、約100L~約2,500L、約100L~約2,000L、約100L~約1,500L、約100L~約1,000L、約100L~約900L、約100L~約800L、約100L~約700L、約100L~約600L、約100L~約500L、約100L~約400L、約100L~約300L、約100L~約200L、約200L~約20,000L、約200L~約15,000L、約200L~約10,000L、約200L~約9,500L、約200L~約9,000L、約200L~約8,500L、約200L~約8,000L、約200L~約7,500L、約200L~約7,000L、約200L~約6,500L、約200L~約6,000L、約200L~約5,500L、約200L~約5,000L、約200L~約4,500L、約200L~約4,000L、約200L~約3,500L、約200L~約3,000L、約200L~約2,500L、約200L~約2,000L、約200L~約1,500L、約200L~約1,000L、約200L~約900L、約200L~約800L、約200L~約700L、約200L~約600L、約200L~約500L、約200L~約400L、約200L~約300L、約500L~約20,000L、約500L~約15,000L、約500L~約10,000L、約500L~約9,500L、約500L~約9,000L、約500L~約8,500L、約500L~約8,000L、約500L~約7,500L、約500L~約7,000L、約500L~約6,500L、約500L~約6,000L、約500L~約5,500L、約500L~約5,000L、約500L~約4,500L、約500L~約4,000L、約500L~約3,500L、約500L~約3,000L、約500L~約2,500L、約500L~約2,000L、約500L~約1,500L、約500L~約1,000L、約500L~約900L、約500L~約800L、約500L~約700L、約500L~約600L、約1,000L~約25,000L、約1,000L~約20,000L、約1,000L~約15,000L、約1,000L~約10,000L、約1,000L~約9,500L、約1,000L~約9,000L、約1,000L~約8,500L、約1,000L~約8,000L、約1,000L~約7,500L、約1,000L~約7,000L、約1,000L~約6,500L、約1,000L~約6,000L、約1,000L~約5,500L、約1,000L~約5,000L、約1,000L~約4,500L、約1,000L~約4,000L、約1,000L~約3,500L、約1,000L~約3,000L、約1,000L~約2,500L、約1,000L~約2,000L、約1,000L~約1,500L、約2,000L~約20,000L、約2,000L~約15,000L、約2,000L~約10,000L、約2,000L~約9,500L、約2,000L~約9,000L、約2,000L~約8,500L、約2,000L~約8,000L、約2,000L~約7,500L、約2,000L~約7,000L、約2,000L~約6,500L、約2,000L~約6,000L、約2,000L~約5,500L、約2,000L~約5,000L、約2,000L~約4,500L、約2,000L~約4,000L、約2,000L~約3,500L、約2,000L~約3,000L、約2,000L~約2,500L、約3,000L~約20,000L、約3,000L~約15,000L、約3,000L~約10,000L、約3,000L~約9,500L、約3,000L~約9,000L、約3,000L~約8,500L、約3,000L~約8,000L、約3,000L~約7,500L、約3,000L~約7,000L、約3,000L~約6,500L、約3,000L~約6,000L、約3,000L~約5,500L、約3,000L~約5,000L、約3,000L~約4,500L、
約3,000L~約4,000L、約3,000L~約3,500L、約4,000L~約20,000L、約4,000L~約15,000L、約4,000L~約10,000L、約4,000L~約9,500L、約4,000L~約9,000L、約4,000L~約8,500L、約4,000L~約8,000L、約4,000L~約7,500L、約4,000L~約7,000L、約4,000L~約6,500L、約4,000L~約6,000L、約4,000L~約5,500L、約4,000L~約5,000L、約4,000L~約4,500L、約5,000L~約20,000L、約5,000L~約15,000L、約5,000L~約10,000L、約5,000L~約9,500L、約5,000L~約9,000L、約5,000L~約8,500L、約5,000L~約8,000L、約5,000L~約7,500L、約5,000L~約7,000L、約5,000L~約6,500L、約5,000L~約6,000L、約5,000L~約5,500L、約6,000L~約20,000L、約6,000L~約10,000L、約6,000L~約9,500L、約6,000L~約9,000L、約6,000L~約8,500L、約6,000L~約8,000L、約6,000L~約7,500L、約6,000L~約7,000L、約6,000L~約6,500L、約7,000L~約20,000L、約7,000L~約15,000L、約7,000L~約10,000L、約7,000L~約9,500L、約7,000L~約9,000L、約7,000L~約8,500L、約7,000L~約8,000L、約7,000L~約7,500L、約8,000L~約20,000L、約8,000L~約15,000L、約8,000L~約10,000L、約8,000L~約9,500L、約8,000L~約9,000L、約8,000L~約8,500L、約9,000L~約20,000L、約9,000L~約15,000L、約9,000L~約10,000L、約9,000L~約9,500L、約10,000L~約20,000L、約10,000L~約15,000L、または約15,000L~約20,000L)の内部体積(収容能力)を有する。容器は、金属(例えば、ステンレススチール)、プラスチック、もしくはガラス、またはその任意の組み合わせから作られる。
いくつかの実施形態において、スパージャの1つまたはそれ以上の孔は、約750μm~約1.5mm(例えば、約750μm~約1.45mm、約750μm~約1.4mm、約750μm~約1.35mm、約750μm~約1.3mm、約750μm~約1.25mm、約750μm~約1.2mm、約750μm~約1.15mm、約750μm~約1.1mm、約750μm~約1.05mm、約750μm~約1.0mm、約750μm~約950μm、約750μm~約900μm、約750μm~約850μm、約750μm~約800μm、約800μm~約1.5mm、約800μm~約1.45mm、約800μm~約1.4mm、約800μm~約1.35mm、約800μm~約1.3mm、約800μm~約1.25mm、約800μm~約1.2mm、約800μm~約1.15mm、約800μm~約1.1mm、約800μm~約1.05mm、約800μm~約1.0mm、約800μm~約950μm、約800μm~約900μm、約800μm~約850μm、約850μm~約1.5mm、約850μm~約1.45mm、約850μm~約1.4mm、約850μm~約1.35mm、約850μm~約1.3mm、約850μm~約1.25mm、約850μm~約1.2mm、約850μm~約1.15mm、約850μm~約1.1mm、約850μm~約1.05mm、約850μm~約1.0mm、約850μm~約950μm、約850μm~約900μm、約900μm~約1.5mm、約900μm~約1.45mm、約900μm~約1.4mm、約900μm~約1.35mm、約900μm~約1.3mm、約900μm~約1.25mm、約900μm~約1.2mm、約900μm~約1.15mm、約900μm~約1.1mm、約900μm~約1.05mm、約900μm~約1.0mm、約900μm~約950μm、約950μm~約1.5mm、約950μm~約1.45mm、約950μm~約1.4mm、約950μm~約1.35mm、約950μm~約1.3mm、約950μm~約1.25mm、約950μm~約1.2mm、約950μ
m~約1.15mm、約950μm~約1.1mm、約950μm~約1.05mm、約950μm~約1.0mm、約1.0mm~約1.5mm、約1.0mm~約1.45mm、約1.0mm~約1.4mm、約1.0mm~約1.35mm、約1.0mm~約1.3mm、約1.0mm~約1.25mm、約1.0mm~約1.2mm、約1.0mm~約1.15mm、約1.0mm~約1.1mm、約1.0mm~約1.05mm、約1.05mm~約1.5mm、約1.05mm~約1.45mm、約1.05mm~約1.4mm、約1.05mm~約1.35mm、約1.05mm~約1.3mm、約1.05mm~約1.25mm、約1.05mm~約1.2mm、約1.05mm~約1.15mm、約1.05mm~約1.1mm、約1.1mm~約1.5mm、約1.1mm~約1.45mm、約1.1mm~約1.4mm、約1.1mm~約1.35mm、約1.1mm~約1.3mm、約1.1mm~約1.25mm、約1.1mm~約1.2mm、約1.1mm~約1.15mm、約1.15mm~約1.5mm、約1.15mm~約1.45mm、約1.15mm~約1.4mm、約1.15mm~約1.35mm、約1.15mm~約1.3mm、約1.15mm~約1.25mm、約1.15mm~約1.2mm、約1.2mm~約1.5mm、約1.2mm~約1.45mm、約1.2mm~約1.4mm、約1.2mm~約1.35mm、約1.2mm~約1.3mm、約1.2mm~約1.25mm、約1.25mm~約1.5mm、約1.25mm~約1.45mm、約1.25mm~約1.4mm、約1.25mm~約1.35mm、約1.25mm~約1.3mm、約1.3mm~約1.5mm、約1.3mm~約1.45mm、約1.3mm~約1.4mm、約1.3mm~約1.35mm、約1.35mm~約1.5mm、約1.35mm~約1.45mm、約1.35mm~約1.4mm、約1.4mm~約1.5mm、約1.4mm~約1.45mm、または約1.45mm~約1.5mm)の孔サイズを有する。
m~約1.15mm、約950μm~約1.1mm、約950μm~約1.05mm、約950μm~約1.0mm、約1.0mm~約1.5mm、約1.0mm~約1.45mm、約1.0mm~約1.4mm、約1.0mm~約1.35mm、約1.0mm~約1.3mm、約1.0mm~約1.25mm、約1.0mm~約1.2mm、約1.0mm~約1.15mm、約1.0mm~約1.1mm、約1.0mm~約1.05mm、約1.05mm~約1.5mm、約1.05mm~約1.45mm、約1.05mm~約1.4mm、約1.05mm~約1.35mm、約1.05mm~約1.3mm、約1.05mm~約1.25mm、約1.05mm~約1.2mm、約1.05mm~約1.15mm、約1.05mm~約1.1mm、約1.1mm~約1.5mm、約1.1mm~約1.45mm、約1.1mm~約1.4mm、約1.1mm~約1.35mm、約1.1mm~約1.3mm、約1.1mm~約1.25mm、約1.1mm~約1.2mm、約1.1mm~約1.15mm、約1.15mm~約1.5mm、約1.15mm~約1.45mm、約1.15mm~約1.4mm、約1.15mm~約1.35mm、約1.15mm~約1.3mm、約1.15mm~約1.25mm、約1.15mm~約1.2mm、約1.2mm~約1.5mm、約1.2mm~約1.45mm、約1.2mm~約1.4mm、約1.2mm~約1.35mm、約1.2mm~約1.3mm、約1.2mm~約1.25mm、約1.25mm~約1.5mm、約1.25mm~約1.45mm、約1.25mm~約1.4mm、約1.25mm~約1.35mm、約1.25mm~約1.3mm、約1.3mm~約1.5mm、約1.3mm~約1.45mm、約1.3mm~約1.4mm、約1.3mm~約1.35mm、約1.35mm~約1.5mm、約1.35mm~約1.45mm、約1.35mm~約1.4mm、約1.4mm~約1.5mm、約1.4mm~約1.45mm、または約1.45mm~約1.5mm)の孔サイズを有する。
いくつかの実施形態において、スパージャの1つまたはそれ以上の孔は、約250μm~約750μm(例えば、約250μm~約700μm、約250μm~約650μm、約250μm~約600μm、約250μm~約550μm、約250μm~約500μm、約250μm~約450μm、約250μm~約400μm、約250μm~約350μm、約250μm~約300μm、約300μm~約750μm、約300μm~約650μm、約300μm~約600μm、約300μm~約550μm、約300μm~約500μm、約300μm~約450μm、約300μm~約400μm、約300μm~約350μm、約350μm~約750μm、約350μm~約700μm、約350μm~約650μm、約350μm~約600μm、約350μm~約550μm、約350μm~約500μm、約350μm~約450μm、約350μm~約400μm、約400μm~約750μm、約400μm~約700μm、約400μm~約650μm、約400μm~約600μm、約400μm~約550μm、約400μm~約500μm、約400μm~約450μm、約450μm~約750μm、約450μm~約700μm、約450μm~約650μm、約450μm~約600μm、約450μm~約550μm、約450μm~約500μm、約500μm~約750μm、約500μm~約700μm、約500μm~約650μm、約500μm~約600μm、約500μm~約550μm、約550μm~約750μm、約550μm~約700μm、約550μm~約650μm、約550μm~約600μm、約600μm~約750μm、約600μm~約700μm、約600μm~約650μm、約650μm~約750μm、約650μm~約700μm、または約700μm~約750μm)の孔サイズを有する。
いくつかの実施形態において、スパージャの1つまたはそれ以上の孔は、約1μm~約250μm(例えば、約1μm~約240μm、約1μm~約230μm、約1μm~約220μm、約1μm~約210μm、約1μm~約200μm、約1μm~約190μm、約1μm~約180μm、約1μm~約170μm、約1μm~約160μm、約1
μm~約150μm、約1μm~約140μm、約1μm~約130μm、約1μm~約125μm、約1μm~約120μm、約1μm~約115μm、約1μm~約110μm、約1μm~約105μm、約1μm~約100μm、約1μm~約95μm、約1μm~約90μm、約1μm~約85μm、約1μm~約80μm、約1μm~約75μm、約1μm~約70μm、約1μm~約65μm、約1μm~約60μm、約1μm~約55μm、約1μm~約50μm、約1μm~約45μm、約1μm~約40μm、約1μm~約35μm、約1μm~約30μm、約1μm~約25μm、約1μm~約20μm、約1μm~約15μm、約1μm~約10μm、1μm~約5μm、10μm~約250μm、約10μm~約240μm、約10μm~約230μm、10μm~約220μm、約10μm~約210μm、約10μm~約200μm、約10μm~約190μm、10μm~約180μm、約10μm~約170μm、約10μm~約160μm、約10μm~約150μm、約10μm~約140μm、約10μm~約130μm、約10μm~約120μm、約10μm~約110μm、約10μm~約100μm、約10μm~約90μm、約10μm~約80μm、約10μm~約70μm、約10μm~約60μm、約10μm~約50μm、約10μm~約40μm、約10μm~約30μm、約10μm~約20μm、約20μm~約250μm、約20μm~約240μm、約20μm~約230μm、約20μm~約220μm、約20μm~約210μm、約20μm~約200μm、約20μm~約190μm、約20μm~約180μm、約20μm~約170μm、約20μm~約160μm、約20μm~約150μm、約20μm~約140μm、約20μm~約130μm、約20μm~約120μm、約20μm~約110μm、約20μm~約100μm、約20μm~約90μm、約20μm~約80μm、約20μm~約70μm、約20μm~約60μm、約20μm~約50μm、約20μm~約40μm、約20μm~約30μm、約30μm~約250μm、約30μm~約240μm、約30μm~約230μm、約30μm~約220μm、約30μm~約210μm、約30μm~約200μm、約30μm~約190μm、約30μm~約180μm、約30μm~約170μm、約30μm~約160μm、約30μm~約150μm、約30μm~約140μm、約30μm~約130μm、約30μm~約120μm、約30μm~約110μm、約30μm~約110μm、約30μm~約100μm、約30μm~約90μm、約30μm~約80μm、約30μm~約70μm、約30μm~約60μm、約30μm~約50μm、約30μm~約40μm、約40μm~約250μm、約40μm~約240μm、約40μm~約230μm、約40μm~約220μm、約40μm~約210μm、約40μm~約200μm、約40μm~約190μm、約40μm~約180μm、約40μm~約170μm、約40μm~約160μm、約40μm~約150μm、約40μm~約140μm、約40μm~約130μm、約40μm~約120μm、約40μm~約110μm、約40μm~約100μm、約40μm~約90μm、約40μm~約80μm、約40μm~約70μm、約40μm~約60μm、約40μm~約50μm、約50μm~約250μm、約50μm~約240μm、約50μm~約230μm、約50μm~約220μm、約50μm~約210μm、約50μm~約200μm、約50μm~約190μm、約50μm~約180μm、約50μm~約170μm、約50μm~約160μm、約50μm~約150μm、約50μm~約140μm、約50μm~約130μm、約50μm~約120μm、約50μm~約110μm、約50μm~約100μm、約50μm~約90μm、約50μm~約80μm、約50μm~約70μm、約50μm~約60μm、約60μm~約250μm、約60μm~約240μm、約60μm~約230μm、約60μm~約220μm、約60μm~約210μm、約60μm~約200μm、約60μm~約190μm、約60μm~約180μm、約60μm~約170μm、約60μm~約160μm、約60μm~約150μm、約60μm~約140μm、約60μm~約130μm、約60μm~約120μm、約60μm~約110μm、約60μm~約100μm、約60μm~約90μm、約60μm~約80μm、約60μm~約70μm、約70μm~約250μm、約70μm~約240μm、約70μm~約
230μm、約70μm~約220μm、約70μm~約210μm、約70μm~約200μm、約70μm~約190μm、約70μm~約180μm、約70μm~約170μm、約70μm~約160μm、約70μm~約150μm、約70μm~約140μm、約70μm~約130μm、約70μm~約120μm、約70μm~約110μm、約70μm~約100μm、約70μm~約90μm、約70μm~約80μm、約80μm~約250μm、約80μm~約240μm、約80μm~約230μm、約80μm~約220μm、約80μm~約210μm、約80μm~約200μm、約80μm~約190μm、約80μm~約180μm、約80μm~約170μm、約80μm~約160μm、約80μm~約150μm、約80μm~約140μm、約80μm~約130μm、約80μm~約120μm、約80μm~約110μm、約80μm~約100μm、約80μm~約90μm、約90μm~約250μm、約90μm~約240μm、約90μm~約230μm、約90μm~約220μm、約90μm~約210μm、約90μm~約200μm、約90μm~約190μm、約90μm~約180μm、約90μm~約170μm、約90μm~約160μm、約90μm~約150μm、約90μm~約140μm、約90μm~約130μm、約90μm~約120μm、約90μm~約110μm、約90μm~約100μm、約100μm~約250μm、約100μm~約240μm、約100μm~約230μm、約100μm~約220μm、約100μm~約210μm、約100μm~約200μm、約100μm~約190μm、約100μm~約180μm、約100μm~約170μm、約100μm~約160μm、約100μm~約150μm、約100μm~約140μm、約100μm~約130μm、約100μm~約120μm、約100μm~約110μm、約110μm~約250μm、約110μm~約240μm、約110μm~約230μm、約110μm~約220μm、約110μm~約210μm、約110μm~約200μm、約100μm~約190μm、約100μm~約180μm、約100μm~約170μm、約100μm~約160μm、約100μm~約150μm、約100μm~約140μm、約100μm~約130μm、約100μm~約120μm、約100μm~約110μm、約110μm~約250μm、約110μm~約240μm、約110μm~約230μm、約110μm~約220μm、約110μm~約210μm、約110μm~約200μm、約110μm~約190μm、約110μm~約180μm、約110μm~約170μm、約110μm~約160μm、約110μm~約150μm、約110μm~約140μm、約110μm~約130μm、約110μm~約120μm、約120μm~約250μm、約120μm~約240μm、約120μm~約230μm、約120μm~約220μm、約120μm~約210μm、約120μm~約200μm、約120μm~約190μm、約120μm~約180μm、約120μm~約170μm、約120μm~約160μm、約120μm~約150μm、約120μm~約140μm、約120μm~約130μm、約130μm~約250μm、約130μm~約240μm、約130μm~約230μm、約130μm~約220μm、約130μm~約210μm、約130μm~約200μm、約130μm~約190μm、約130μm~約180μm、約130μm~約170μm、約130μm~約160μm、約130μm~約150μm、約130μm~約140μm、約140μm~約250μm、約140μm~約240μm、約140μm~約230μm、約140μm~約220μm、約140μm~約210μm、約140μm~約200μm、約140μm~約190μm、約140μm~約180μm、約140μm~約170μm、約140μm~約160μm、約140μm~約150μm、約150μm~約250μm、約150μm~約240μm、約150μm~約230μm、約150μm~約220μm、約150μm~約210μm、約150μm~約200μm、約150μm~約190μm、約150μm~約180μm、約150μm~約170μm、約150μm~約160μm、約160μm~約250μm、約160μm~約240μm、約160μm~約230μm、約160μm~約220μm、約160μm~約210μm、約160μm~約200μm、約160μm~約190μm、約160μm~約180μm、約
160μm~約170μm、約170μm~約250μm、約170μm~約240μm、約170μm~約230μm、約170μm~約220μm、約170μm~約210μm、約170μm~約200μm、約170μm~約190μm、約170μm~約180μm、約180μm~約250μm、約180μm~約240μm、約180μm~約230μm、約180μm~約220μm、約180μm~約210μm、約180μm~約200μm、約180μm~約190μm、約190μm~約250μm、約190μm~約240μm、約190μm~約230μm、約190μm~約220μm、約190μm~約210μm、約190μm~約200μm、約200μm~約250μm、約200μm~約240μm、約200μm~約230μm、約200μm~約220μm、約200μm~約210μm、約210μm~約250μm、約210μm~約240μm、約210μm~約230μm、約210μm~約220μm、約220μm~約250μm、約220μm~約240μm、約220μm~約230μm、約230μm~約250μm、約230μm~約240μm、または約240μm~約250μm)の孔サイズを有する。
μm~約150μm、約1μm~約140μm、約1μm~約130μm、約1μm~約125μm、約1μm~約120μm、約1μm~約115μm、約1μm~約110μm、約1μm~約105μm、約1μm~約100μm、約1μm~約95μm、約1μm~約90μm、約1μm~約85μm、約1μm~約80μm、約1μm~約75μm、約1μm~約70μm、約1μm~約65μm、約1μm~約60μm、約1μm~約55μm、約1μm~約50μm、約1μm~約45μm、約1μm~約40μm、約1μm~約35μm、約1μm~約30μm、約1μm~約25μm、約1μm~約20μm、約1μm~約15μm、約1μm~約10μm、1μm~約5μm、10μm~約250μm、約10μm~約240μm、約10μm~約230μm、10μm~約220μm、約10μm~約210μm、約10μm~約200μm、約10μm~約190μm、10μm~約180μm、約10μm~約170μm、約10μm~約160μm、約10μm~約150μm、約10μm~約140μm、約10μm~約130μm、約10μm~約120μm、約10μm~約110μm、約10μm~約100μm、約10μm~約90μm、約10μm~約80μm、約10μm~約70μm、約10μm~約60μm、約10μm~約50μm、約10μm~約40μm、約10μm~約30μm、約10μm~約20μm、約20μm~約250μm、約20μm~約240μm、約20μm~約230μm、約20μm~約220μm、約20μm~約210μm、約20μm~約200μm、約20μm~約190μm、約20μm~約180μm、約20μm~約170μm、約20μm~約160μm、約20μm~約150μm、約20μm~約140μm、約20μm~約130μm、約20μm~約120μm、約20μm~約110μm、約20μm~約100μm、約20μm~約90μm、約20μm~約80μm、約20μm~約70μm、約20μm~約60μm、約20μm~約50μm、約20μm~約40μm、約20μm~約30μm、約30μm~約250μm、約30μm~約240μm、約30μm~約230μm、約30μm~約220μm、約30μm~約210μm、約30μm~約200μm、約30μm~約190μm、約30μm~約180μm、約30μm~約170μm、約30μm~約160μm、約30μm~約150μm、約30μm~約140μm、約30μm~約130μm、約30μm~約120μm、約30μm~約110μm、約30μm~約110μm、約30μm~約100μm、約30μm~約90μm、約30μm~約80μm、約30μm~約70μm、約30μm~約60μm、約30μm~約50μm、約30μm~約40μm、約40μm~約250μm、約40μm~約240μm、約40μm~約230μm、約40μm~約220μm、約40μm~約210μm、約40μm~約200μm、約40μm~約190μm、約40μm~約180μm、約40μm~約170μm、約40μm~約160μm、約40μm~約150μm、約40μm~約140μm、約40μm~約130μm、約40μm~約120μm、約40μm~約110μm、約40μm~約100μm、約40μm~約90μm、約40μm~約80μm、約40μm~約70μm、約40μm~約60μm、約40μm~約50μm、約50μm~約250μm、約50μm~約240μm、約50μm~約230μm、約50μm~約220μm、約50μm~約210μm、約50μm~約200μm、約50μm~約190μm、約50μm~約180μm、約50μm~約170μm、約50μm~約160μm、約50μm~約150μm、約50μm~約140μm、約50μm~約130μm、約50μm~約120μm、約50μm~約110μm、約50μm~約100μm、約50μm~約90μm、約50μm~約80μm、約50μm~約70μm、約50μm~約60μm、約60μm~約250μm、約60μm~約240μm、約60μm~約230μm、約60μm~約220μm、約60μm~約210μm、約60μm~約200μm、約60μm~約190μm、約60μm~約180μm、約60μm~約170μm、約60μm~約160μm、約60μm~約150μm、約60μm~約140μm、約60μm~約130μm、約60μm~約120μm、約60μm~約110μm、約60μm~約100μm、約60μm~約90μm、約60μm~約80μm、約60μm~約70μm、約70μm~約250μm、約70μm~約240μm、約70μm~約
230μm、約70μm~約220μm、約70μm~約210μm、約70μm~約200μm、約70μm~約190μm、約70μm~約180μm、約70μm~約170μm、約70μm~約160μm、約70μm~約150μm、約70μm~約140μm、約70μm~約130μm、約70μm~約120μm、約70μm~約110μm、約70μm~約100μm、約70μm~約90μm、約70μm~約80μm、約80μm~約250μm、約80μm~約240μm、約80μm~約230μm、約80μm~約220μm、約80μm~約210μm、約80μm~約200μm、約80μm~約190μm、約80μm~約180μm、約80μm~約170μm、約80μm~約160μm、約80μm~約150μm、約80μm~約140μm、約80μm~約130μm、約80μm~約120μm、約80μm~約110μm、約80μm~約100μm、約80μm~約90μm、約90μm~約250μm、約90μm~約240μm、約90μm~約230μm、約90μm~約220μm、約90μm~約210μm、約90μm~約200μm、約90μm~約190μm、約90μm~約180μm、約90μm~約170μm、約90μm~約160μm、約90μm~約150μm、約90μm~約140μm、約90μm~約130μm、約90μm~約120μm、約90μm~約110μm、約90μm~約100μm、約100μm~約250μm、約100μm~約240μm、約100μm~約230μm、約100μm~約220μm、約100μm~約210μm、約100μm~約200μm、約100μm~約190μm、約100μm~約180μm、約100μm~約170μm、約100μm~約160μm、約100μm~約150μm、約100μm~約140μm、約100μm~約130μm、約100μm~約120μm、約100μm~約110μm、約110μm~約250μm、約110μm~約240μm、約110μm~約230μm、約110μm~約220μm、約110μm~約210μm、約110μm~約200μm、約100μm~約190μm、約100μm~約180μm、約100μm~約170μm、約100μm~約160μm、約100μm~約150μm、約100μm~約140μm、約100μm~約130μm、約100μm~約120μm、約100μm~約110μm、約110μm~約250μm、約110μm~約240μm、約110μm~約230μm、約110μm~約220μm、約110μm~約210μm、約110μm~約200μm、約110μm~約190μm、約110μm~約180μm、約110μm~約170μm、約110μm~約160μm、約110μm~約150μm、約110μm~約140μm、約110μm~約130μm、約110μm~約120μm、約120μm~約250μm、約120μm~約240μm、約120μm~約230μm、約120μm~約220μm、約120μm~約210μm、約120μm~約200μm、約120μm~約190μm、約120μm~約180μm、約120μm~約170μm、約120μm~約160μm、約120μm~約150μm、約120μm~約140μm、約120μm~約130μm、約130μm~約250μm、約130μm~約240μm、約130μm~約230μm、約130μm~約220μm、約130μm~約210μm、約130μm~約200μm、約130μm~約190μm、約130μm~約180μm、約130μm~約170μm、約130μm~約160μm、約130μm~約150μm、約130μm~約140μm、約140μm~約250μm、約140μm~約240μm、約140μm~約230μm、約140μm~約220μm、約140μm~約210μm、約140μm~約200μm、約140μm~約190μm、約140μm~約180μm、約140μm~約170μm、約140μm~約160μm、約140μm~約150μm、約150μm~約250μm、約150μm~約240μm、約150μm~約230μm、約150μm~約220μm、約150μm~約210μm、約150μm~約200μm、約150μm~約190μm、約150μm~約180μm、約150μm~約170μm、約150μm~約160μm、約160μm~約250μm、約160μm~約240μm、約160μm~約230μm、約160μm~約220μm、約160μm~約210μm、約160μm~約200μm、約160μm~約190μm、約160μm~約180μm、約
160μm~約170μm、約170μm~約250μm、約170μm~約240μm、約170μm~約230μm、約170μm~約220μm、約170μm~約210μm、約170μm~約200μm、約170μm~約190μm、約170μm~約180μm、約180μm~約250μm、約180μm~約240μm、約180μm~約230μm、約180μm~約220μm、約180μm~約210μm、約180μm~約200μm、約180μm~約190μm、約190μm~約250μm、約190μm~約240μm、約190μm~約230μm、約190μm~約220μm、約190μm~約210μm、約190μm~約200μm、約200μm~約250μm、約200μm~約240μm、約200μm~約230μm、約200μm~約220μm、約200μm~約210μm、約210μm~約250μm、約210μm~約240μm、約210μm~約230μm、約210μm~約220μm、約220μm~約250μm、約220μm~約240μm、約220μm~約230μm、約230μm~約250μm、約230μm~約240μm、または約240μm~約250μm)の孔サイズを有する。
スパージャの1つまたはそれ以上の孔は、例えば、ドリル孔、または焼結孔の孔タイプを有する。培養系は、容器内に分配された液体培地を撹拌するための装置(例えば、インペラー、およびインペラーを回転させるモーター)を含む。容器は、容器に配置された液体培地への材料(例えば、液体培地、ポロクサマー-188、塩基もしくは酸(pHを調整するのに必要とされる)、および/もしくは消泡剤)を添加すること、ならびに/または液体培地(例えば、清澄化液体培地、もしくは細胞培養物のサンプル)を取り出すことを可能にする、1つまたはそれ以上の開口(および場合により、ポンプ)を含む。培養系はまた、培養期間中に液体培地中のpH、dO2、温度、およびdCO2をモニターするための1つまたはそれ以上のセンサーも含む。培養系は、細胞を実質的に含まない、清澄化液体培地をもたらすようにある体積の細胞培養物を処理する、濾過装置(例えば、交互接線濾過または接線流濾過を行う装置)を含む。培養系は、容器に配置された液体培地の温度の調整を可能にする過熱/冷却装置を含む。細胞培養系のさらなる特性は、当該技術分野において周知である。
灌流培養
本明細書において記載される方法のいずれかにおいて、培養工程は、灌流培養である。当該技術分野において公知である通り、灌流培養は、バイオリアクターから第1の体積の第1の液体培地を取り出すこと、およびバイオリアクターに第2の体積の第2の液体培地を添加することを含み、第1の体積と第2の体積はほぼ等しい。哺乳類細胞は、ある細胞保持装置により、またはコーン分級器における細胞沈殿のような、技術を介して、バイオリアクターにおいて保持される。
本明細書において記載される方法のいずれかにおいて、培養工程は、灌流培養である。当該技術分野において公知である通り、灌流培養は、バイオリアクターから第1の体積の第1の液体培地を取り出すこと、およびバイオリアクターに第2の体積の第2の液体培地を添加することを含み、第1の体積と第2の体積はほぼ等しい。哺乳類細胞は、ある細胞保持装置により、またはコーン分級器における細胞沈殿のような、技術を介して、バイオリアクターにおいて保持される。
当該技術分野において公知である通り、灌流培養は、フィードバッチ培養と異なり、灌流培養において使用される培養培地、および/または培養条件は、フィードバッチ培養において使用されるものとしばしば異なる。
灌流培養において培地を取り出すことおよび添加することは、同時もしくは連続的に、または2つのある組み合わせで行われる。さらに、取り出すことおよび添加することは、例えば、バイオリアクターの体積の0.1%~800%、1%~700%、1%~600%、1%~500%、1%~400%、1%~350%、1%~300%、1%~250%、1%~100%、100%~200%、5%~150%、10%~50%、15%~40%、8%~80%、または4%~30%の体積を取り出し、置き換える比率で、連続的に行われる。
取り出された第1の液体培地の第1の体積、および添加された第2の液体培地の第2の
体積は、いくつかの場合に、それぞれ24時間の期間に渡り、およそ同じに保たれる。当該技術分野において公知である通り、第1の体積の第1の液体培地が取り出される比率(体積/単位時間)、および第2の体積の第2の液体培地が添加される比率(体積/単位時間)は、変動し、特定の細胞培養系の条件に依存する。第1の体積の第1の液体培地が取り出される比率(体積/単位時間)、および第2の体積の第2の液体培地が添加される比率(体積/単位時間)は、ほぼ同じであるか、または異なる。
体積は、いくつかの場合に、それぞれ24時間の期間に渡り、およそ同じに保たれる。当該技術分野において公知である通り、第1の体積の第1の液体培地が取り出される比率(体積/単位時間)、および第2の体積の第2の液体培地が添加される比率(体積/単位時間)は、変動し、特定の細胞培養系の条件に依存する。第1の体積の第1の液体培地が取り出される比率(体積/単位時間)、および第2の体積の第2の液体培地が添加される比率(体積/単位時間)は、ほぼ同じであるか、または異なる。
あるいは、取り出され、添加された体積は、それぞれ24時間の期間に渡り、徐々に増大させることにより、変化する。例えば、それぞれ24時間の期間内に、取り出された第1の液体培地の体積、および添加された第2の液体培地の体積は、培養期間に渡り、増大される。体積は、培養期間に渡り、バイオリアクター体積の0.5%~約20%である体積から増大される。体積は、培養期間に渡り、バイオリアクター収容能力、または培養期間の開始時の細胞培養物の体積の約25%~約150%まで増大される。
本明細書において記載される方法のいくつかの例において、培養期間の最初の48~96時間後、それぞれ24時間の期間(培養期間内)において、取り出される第1の液体培地の第1の体積、および添加される第2の液体培地の第2の体積は、培養期間の開始時の細胞培養物の体積の約10%~約95%、約10%~約20%、約20%~約30%、約30%~約40%、約40%~約50%、約50%~約60%、約60%~約70%、約70%~約80%、約80%~約90%、約85%~約95%、約60%~約80%、または約70%である。
当業者は、第1の液体培地と第2の液体培地が、同じタイプの培地であり得ることを理解するだろう。他の場合に、第1の液体培地と第2の液体培地は異なり得る。第2の液体培地は、1種またはそれ以上の培地成分についてより濃縮されてもよい。
第1の体積の第1の液体培地は、任意の自動化システムを使用することにより、取り出され得る。例えば、交互接線流濾過が使用される。あるいは、第1の体積の第1の液体培地が、哺乳類細胞を除外する、分子量カットオフを有する滅菌したメンブレンを介して第1の体積の第1の液体培地を滲み出させることにより、またはその重力流出により、取り出される。あるいは、第1の体積の第1の液体培地は、少なくとも1分、少なくとも2分、3分、4分、5分、10分、15分、20分、25分、30分、40分、50分、もしくは1時間の期間、撹拌を停止するか、または撹拌の速度を有意に低減し、バイオリアクターの上部から第1の体積の第1の液体培地を取り出すか、または吸引することにより、取り出される。
第2の体積の第2の液体培地は、ポンプにより第1の液体培地に添加される。第2の液体培地は、例えば、第2の体積の第2の液体培地を、第1の液体培地に直接ピペッティングするか、もしくは注入することにより、第1の液体培地に手動で、または自動化様式で添加される。
本明細書において記載される方法のいくつかの実施形態において、(場合により、第1の液体培地に配置された哺乳類細胞を含有する容器を用意すること、および)容器を撹拌しながら、少なくとも約7日の培養期間、温度約32℃~約40℃でインキュベートすること;ならびに培養期間の最初の48~96時間後、連続的または定期的に、第1の体積の第1の液体培地を取り出し、第1の液体培地に第2の体積の第2の液体培地を添加することを含み、第1と第2の体積はほぼ等しい。いくつかの実施形態において、培養期間の最初の48~96時間後、それぞれ24時間の期間において、取り出される第1の液体培地の第1の体積、および添加される第2の液体培地の第2の体積は、第1の液体培地の体積、または容器の体積の約0.3×~約10×である。
灌流培養のいくつかの例は、第1の液体培地を含有する培養系を撹拌しながら、少なくとも約7日の培養期間、温度約32℃~約40℃でインキュベートすること;および培養期間の最初の48~96時間後、連続的または定期的に、第1の体積の第1の液体培地を取り出し、第1の液体培地に第2の体積の第2の液体培地を添加することを含む。
流加培養
本明細書において記載される方法における培養工程は、流加培養(fed-batch culturing)を含む。当該技術分野において公知である通り、流加培養は、細胞培養物から第1の
液体培地を実質的にまたは著しく取り出すことなく、フィード液体培地を開始細胞培養物に増加的または連続的に添加することを含む。いくつかの場合に、フィード液体培地は、第1の液体培地と同じである。フィード培地(feed medium)は、液体形態(フィード液
体培地)、または乾燥粉末のいずれかである。他の場合に、フィード液体培地は、第1の液体培地の濃縮された形態であるか、および/または乾燥粉末として添加される。
本明細書において記載される方法における培養工程は、流加培養(fed-batch culturing)を含む。当該技術分野において公知である通り、流加培養は、細胞培養物から第1の
液体培地を実質的にまたは著しく取り出すことなく、フィード液体培地を開始細胞培養物に増加的または連続的に添加することを含む。いくつかの場合に、フィード液体培地は、第1の液体培地と同じである。フィード培地(feed medium)は、液体形態(フィード液
体培地)、または乾燥粉末のいずれかである。他の場合に、フィード液体培地は、第1の液体培地の濃縮された形態であるか、および/または乾燥粉末として添加される。
フィード液体培地は、培養期間中に、特定の時点で、または複数の時点で開始細胞培養物に添加される。例えば、フィード液体培地は、培養期間の開始後、6時間~7日、約6時間~約6日、約6時間~約5日、約6時間~約4日、約6時間~約3日、約6時間~約2日、約6時間~約1日、約12時間~約7日、約12時間~約6日、約12時間~約5日、約12時間~約4日、約12時間~約3日、約12時間~約2日、約1日~約7日、約1日~約6日、約1日~約5日、約1日~約4日、約1日~約3日、約1日~約2日、約2日~約7日、約2日~約6日、約2日~約5日、約2日~約4日、約2日~約3日、約3日~約7日、約3日~約6日、約3日~約5日、約3日~約4日、約4日~約7日、約4日~約6日、約4日~約5日、約5日~約7日、または約5日~約6日である時点で、開始細胞培養物に添加される。
フィード液体培地は、開始細胞培養物に連続的に添加されるか、または培養期間中に開始細胞培養物に定期的に(例えば、毎日)添加される。フィード液体培地が、開始細胞培養物に定期的に添加される、いくつかの例では、フィード液体培地は、1回、2回、3回、4回、または5回添加される。開始細胞培養物に添加される、フィード液体培地の体積、またはフィード固体培地(feed solid medium)の量は、培養期間中に変化する(例え
ば、増大する)。培養期間中に任意の24時間の期間に渡り、開始細胞培養物に添加されるフィード液体培地の体積は、バイオリアクターの収容能力のある分画である。培養期間中に任意の24時間の期間に渡り、開始細胞培養物に添加されるフィード液体培地の体積は、培養物を含有するバイオリアクターの収容能力の0.01×~約0.3×(例えば、約0.01×~約0.28×、約0.01×~約0.26×、約0.01×~約0.24×、約0.01×~約0.22×、約0.01×~約0.20×、約0.01×~約0.18×、約0.01×~約0.16×、約0.01×~約0.14×、約0.01×~約0.12×、約0.01×~約0.10×、約0.01×~約0.08×、約0.01×~約0.06×、約0.01×~約0.04×、約0.025×~約0.3×、約0.025×~約0.28×、約0.025×~約0.26×、約0.025×~約0.24×、約0.025×~約0.22×、約0.025×~約0.20×、約0.025×~約0.18×、約0.025×~約0.16×、約0.025×~約0.14×、約0.025×~約0.12×、約0.025×~約0.10×、約0.025×~約0.08×、約0.025×~約0.06×、約0.025×~約0.04×、約0.05×~約0.3×、約0.05×~約0.28×、約0.05×~約0.26×、約0.05×~約0.24×、約0.05×~約0.22×、約0.05×~約0.20×、約0.05×~約0.18×、約0.05×~約0.16×、約0.05×~約0.14×、約0.05×~約0.12×、約0.05×~約0.10×、約0.1×~約0.3×、約0.1×~約0.28×、約0.1×~約0.26×、約0.1×~約0.24×、約0.1×
~約0.22×、約0.1×~約0.20×、約0.1×~約0.18×、約0.1×~約0.16X約0.1×~約0.14×、約0.1×、約0.15×~約0.3×、約0.15×~約0.2×、約0.2×~約0.3×、または約0.25×~約0.3×)である。
ば、増大する)。培養期間中に任意の24時間の期間に渡り、開始細胞培養物に添加されるフィード液体培地の体積は、バイオリアクターの収容能力のある分画である。培養期間中に任意の24時間の期間に渡り、開始細胞培養物に添加されるフィード液体培地の体積は、培養物を含有するバイオリアクターの収容能力の0.01×~約0.3×(例えば、約0.01×~約0.28×、約0.01×~約0.26×、約0.01×~約0.24×、約0.01×~約0.22×、約0.01×~約0.20×、約0.01×~約0.18×、約0.01×~約0.16×、約0.01×~約0.14×、約0.01×~約0.12×、約0.01×~約0.10×、約0.01×~約0.08×、約0.01×~約0.06×、約0.01×~約0.04×、約0.025×~約0.3×、約0.025×~約0.28×、約0.025×~約0.26×、約0.025×~約0.24×、約0.025×~約0.22×、約0.025×~約0.20×、約0.025×~約0.18×、約0.025×~約0.16×、約0.025×~約0.14×、約0.025×~約0.12×、約0.025×~約0.10×、約0.025×~約0.08×、約0.025×~約0.06×、約0.025×~約0.04×、約0.05×~約0.3×、約0.05×~約0.28×、約0.05×~約0.26×、約0.05×~約0.24×、約0.05×~約0.22×、約0.05×~約0.20×、約0.05×~約0.18×、約0.05×~約0.16×、約0.05×~約0.14×、約0.05×~約0.12×、約0.05×~約0.10×、約0.1×~約0.3×、約0.1×~約0.28×、約0.1×~約0.26×、約0.1×~約0.24×、約0.1×
~約0.22×、約0.1×~約0.20×、約0.1×~約0.18×、約0.1×~約0.16X約0.1×~約0.14×、約0.1×、約0.15×~約0.3×、約0.15×~約0.2×、約0.2×~約0.3×、または約0.25×~約0.3×)である。
他の実施形態において、培養期間において任意の24時間の期間に渡り、開始細胞培養物に添加されるフィード液体培地の体積は、培養期間の開始時の細胞培養物の体積の0.02×~約1.0×(例えば、約0.02×~約0.9×、約0.02×~約0.8×、約0.02×~約0.7×、約0.02×~約0.6×、約0.02×~約0.5×、約0.02×~約0.4×、約0.02×~約0.3×、約0.02×~約0.2×、約0.02×~約0.1×、約0.05×~約1.0×、約0.05×~約0.8×、約0.05×~約0.7×、約0.05×~約0.6×、約0.05×~約0.5×、約0.05×~約0.4×、約0.05×~約0.3×、約0.05×~約0.2×、約0.05×~約0.1×、約0.1×~約1.0×、約0.1×~約0.9×、約0.1×~約0.8×、約0.1×~約0.7×、約0.1×~約0.6×、約0.1×~約0.5×、約0.1×~約0.4×、約0.1×~約0.3×、約0.1×~約0.2×、約0.2×~約1.0×、約0.2×~約0.9×、約0.2×~約0.8×、約0.2×~約0.7×、約0.2×~約0.6×、約0.2×~約0.5×、または約0.2×~約0.4×)である。
ポロクサマー-188
ポロクサマー-188は、当該技術分野において公知の分子である。ポロクサマー-188は、エチレンオキシドとプロピレンオキシドの非イオン性合成ブロック共重合体である。ポロクサマー-188は、約7680~約9510の平均子量を有し、その組成の約81.8重量%±1.9重量%は、オキシエチレンにより表される。例えば、ポロクサマー-188は、以下の式I(式中、aは80であり、bは27である)において示される構造を有する。ポロクサマー-188は、9003-11-6のCAS番号を有する。
ポロクサマー-188は、当該技術分野において公知の分子である。ポロクサマー-188は、エチレンオキシドとプロピレンオキシドの非イオン性合成ブロック共重合体である。ポロクサマー-188は、約7680~約9510の平均子量を有し、その組成の約81.8重量%±1.9重量%は、オキシエチレンにより表される。例えば、ポロクサマー-188は、以下の式I(式中、aは80であり、bは27である)において示される構造を有する。ポロクサマー-188は、9003-11-6のCAS番号を有する。
ポロクサマー-188は、例えば、Sigma-Aldrich(St.Louis、MO)、Mediatech,Inc.(Manassas、VA)、MAST Therapeutics,Inc.(San Diego、CA)、EMD Millipore(Billerica、MA)、BASF(Ludwigshafen、Germany)、Pluronic(登録商標) F-68 Life Technologies(Carlsbad、CA)、およびPhytoTechnology Laboratories,LLC(Shawnee Mission、KS)を含む、多数の異なる供給元から商業的に入手可能である。
本明細書において提供される方法は、約1.8g/Lの濃度または1.8g/Lより高い濃度(例えば、約1.9g/Lの濃度もしくは1.9g/Lより高い濃度、約2.0g/Lの濃度もしくは2.0g/Lより高い濃度、約2.1g/Lの濃度もしくは2.1g/Lより高い濃度、約2.2g/Lの濃度もしくは2.2g/Lより高い濃度、約2.3g/Lの濃度もしくは2.3g/Lより高い濃度、約2.4g/Lの濃度もしくは2.4g/Lより高い濃度、約2.5g/Lの濃度もしくは2.5g/Lより高い濃度、約2.
6g/Lの濃度もしくは2.6g/Lより高い濃度、約2.7g/Lの濃度もしくは2.7g/Lより高い濃度、約2.8g/Lの濃度もしくは2.8g/Lより高い濃度、約2.9g/Lの濃度もしくは2.9g/Lより高い濃度、約3.0g/Lの濃度もしくは3.0g/Lより高い濃度、約3.1g/Lの濃度もしくは3.1g/Lより高い濃度、約3.2g/Lの濃度もしくは3.2g/Lより高い濃度、約3.3g/Lの濃度もしくは3.3g/Lより高い濃度、約3.4g/Lの濃度もしくは3.4g/Lより高い濃度、約3.5g/Lの濃度もしくは3.5g/Lより高い濃度、約3.6g/Lの濃度もしくは3.6g/Lより高い濃度、約3.7g/Lの濃度もしくは3.7g/Lより高い濃度、約3.8g/Lの濃度もしくは3.8g/Lより高い濃度、約3.9g/Lの濃度もしくは3.9g/Lより高い濃度、約4.0g/Lの濃度もしくは4.0g/Lより高い濃度、約4.1g/Lの濃度もしくは4.1g/Lより高い濃度、約4.2g/Lの濃度もしくは4.2g/Lより高い濃度、約4.3g/Lの濃度もしくは4.3g/Lより高い濃度、約4.4g/Lの濃度もしくは4.4g/Lより高い濃度、約4.5g/Lの濃度もしくは4.5g/Lより高い濃度、約4.6g/Lの濃度もしくは4.6g/Lより高い濃度、約4.7g/Lの濃度もしくは4.7g/Lより高い濃度、約4.8g/Lの濃度もしくは4.8g/Lより高い濃度、約4.9g/Lの濃度もしくは4.9g/Lより高い濃度、約5.0g/Lの濃度もしくは5.0g/Lより高い濃度、約5.1g/Lの濃度もしくは5.1g/Lより高い濃度、約5.2g/Lの濃度もしくは5.2g/Lより高い濃度、約5.3g/Lの濃度もしくは5.3g/Lより高い濃度、約5.4g/Lの濃度もしくは5.4g/Lより高い濃度、約5.5g/Lの濃度もしくは5.5g/Lより高い濃度、約5.6g/Lの濃度もしくは5.6g/Lより高い濃度、約5.7g/Lの濃度もしくは5.7g/Lより高い濃度、約5.8g/Lの濃度もしくは5.8g/Lより高い濃度、約5.9g/Lの濃度もしくは5.9g/Lより高い濃度、約6.0g/Lの濃度もしくは6.0g/Lより高い濃度、約6.1g/Lの濃度もしくは6.1g/Lより高い濃度、約6.2g/Lの濃度もしくは6.2g/Lより高い濃度、約6.3g/Lの濃度もしくは6.3g/Lより高い濃度、約6.4g/Lの濃度もしくは6.4g/Lより高い濃度、約6.5g/Lの濃度もしくは6.5g/Lより高い濃度、約6.6g/Lの濃度もしくは6.6g/Lより高い濃度、約6.7g/Lの濃度もしくは6.7g/Lより高い濃度、約6.8g/Lの濃度もしくは6.8g/Lより高い濃度、約6.9g/Lの濃度もしくは6.9g/Lより高い濃度、約7.0g/Lの濃度もしくは7.0g/Lより高い濃度、約7.1g/Lの濃度もしくは7.1g/Lより高い濃度、約7.2g/Lの濃度もしくは7.2g/Lより高い濃度、約7.3g/Lの濃度もしくは7.3g/Lより高い濃度、約7.4g/Lの濃度もしくは7.4g/Lより高い濃度、約7.5g/Lの濃度もしくは7.5g/Lより高い濃度、約7.6g/Lの濃度もしくは7.6g/Lより高い濃度、約7.7g/Lの濃度もしくは7.7g/Lより高い濃度、約7.8g/Lの濃度もしくは7.8g/Lより高い濃度、約7.9g/Lの濃度もしくは7.9g/Lより高い濃度、約8.0g/Lの濃度もしくは8.0g/Lより高い濃度、約8.1g/Lの濃度もしくは8.1g/Lより高い濃度、約8.2g/Lの濃度もしくは8.2g/Lより高い濃度、約8.3g/Lの濃度もしくは8.3g/Lより高い濃度、約8.4g/Lの濃度もしくは8.4g/Lより高い濃度、約8.5g/Lの濃度もしくは8.5g/Lより高い濃度、約8.6g/Lの濃度もしくは8.6g/Lより高い濃度、約8.7g/Lの濃度もしくは8.7g/Lより高い濃度、約8.8g/Lの濃度もしくは8.8g/Lより高い濃度、約8.9g/Lの濃度もしくは8.9g/Lより高い濃度、約9.0g/Lの濃度もしくは9.0g/Lより高い濃度、約9.1g/Lの濃度もしくは9.1g/Lより高い濃度、約9.2g/Lの濃度もしくは9.2g/Lより高い濃度、約9.3g/Lの濃度もしくは9.3g/Lより高い濃度、約9.4g/Lの濃度もしくは9.4g/Lより高い濃度、約9.5g/Lの濃度もしくは9.5g/Lより高い濃度、約9.6g/Lの濃度もしくは9.6g/Lより高い濃度、約9.7g/Lの濃度もしくは9.7g/Lより高い濃度、約9.8g/Lの濃度もしくは9.8g/Lより高い濃度、約9.9g/Lの濃度もしくは9.9g/Lより高い濃度、約10.0
g/Lの濃度もしくは10.0g/Lより高い濃度、約10.1g/Lの濃度もしくは10.1g/Lより高い濃度、約10.2g/Lの濃度もしくは10.2g/Lより高い濃度、約10.3g/Lの濃度もしくは10.3g/Lより高い濃度、約10.4g/Lの濃度もしくは10.4g/Lより高い濃度、約10.5g/Lの濃度もしくは10.5g/Lより高い濃度、約10.6g/Lの濃度もしくは10.6g/Lより高い濃度、約10.7g/Lの濃度もしくは10.7g/Lより高い濃度、約10.8g/Lの濃度もしくは10.8g/Lより高い濃度、約10.9g/Lの濃度もしくは10.9g/Lより高い濃度、約11.0g/Lの濃度もしくは11.0g/Lより高い濃度、約11.1g/Lの濃度もしくは11.1g/Lより高い濃度、約11.2g/Lの濃度もしくは11.2g/Lより高い濃度、約11.3g/Lの濃度もしくは11.3g/Lより高い濃度、約11.4g/Lの濃度もしくは11.4g/Lより高い濃度、約11.5g/Lの濃度もしくは11.5g/Lより高い濃度、約11.6g/Lの濃度もしくは11.6g/Lより高い濃度、約11.7g/Lの濃度もしくは11.7g/Lより高い濃度、約11.8g/Lの濃度もしくは11.8g/Lより高い濃度、約11.9g/Lの濃度もしくは11.9g/Lより高い濃度、約12.0g/Lの濃度もしくは12.0g/Lより高い濃度、約12.1g/Lの濃度もしくは12.1g/Lより高い濃度、約12.2g/Lの濃度もしくは12.2g/Lより高い濃度、約12.3g/Lの濃度もしくは12.3g/Lより高い濃度、約12.4g/Lの濃度もしくは12.4g/Lより高い濃度、約12.5g/Lの濃度もしくは12.5g/Lより高い濃度、約12.6g/Lの濃度もしくは12.6g/Lより高い濃度、約12.7g/Lの濃度もしくは12.7g/Lより高い濃度、約12.8g/Lの濃度もしくは12.8g/Lより高い濃度、約12.9g/Lの濃度もしくは12.9g/Lより高い濃度、約13.0g/Lの濃度もしくは13.0g/Lより高い濃度、約13.1g/Lの濃度もしくは13.1g/Lより高い濃度、約13.2g/Lの濃度もしくは13.2g/Lより高い濃度、約13.3g/Lの濃度もしくは13.3g/Lより高い濃度、約13.4g/Lの濃度もしくは13.4g/Lより高い濃度、約13.5g/Lの濃度もしくは13.5g/Lより高い濃度、約13.6g/Lの濃度もしくは13.6g/Lより高い濃度、約13.7g/Lの濃度もしくは13.7g/Lより高い濃度、約13.8g/Lの濃度もしくは13.8g/Lより高い濃度、約13.9g/Lの濃度もしくは13.9g/Lより高い濃度、約14.0g/Lの濃度もしくは14.0g/Lより高い濃度、約14.1g/Lの濃度もしくは14.1g/Lより高い濃度、約14,2g/Lの濃度もしくは14.2g/Lより高い濃度、約14.3g/Lの濃度もしくは14.3g/Lより高い濃度、約14.4g/Lの濃度もしくは14.4g/Lより高い濃度、約14.5g/Lの濃度もしくは14.5g/Lより高い濃度、約14.6g/Lの濃度もしくは14.6g/Lより高い濃度、約14.7g/Lの濃度もしくは14.7g/Lより高い濃度、約14.8g/Lの濃度もしくは14.8g/Lより高い濃度、約14.9g/Lの濃度もしくは14.9g/Lより高い濃度、または約15.0g/Lの濃度もしくは15.0g/Lより高い濃度)のポロクサマー-188を含む液体培地において、哺乳類細胞(例えば、組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞)を培養することを含む。
6g/Lの濃度もしくは2.6g/Lより高い濃度、約2.7g/Lの濃度もしくは2.7g/Lより高い濃度、約2.8g/Lの濃度もしくは2.8g/Lより高い濃度、約2.9g/Lの濃度もしくは2.9g/Lより高い濃度、約3.0g/Lの濃度もしくは3.0g/Lより高い濃度、約3.1g/Lの濃度もしくは3.1g/Lより高い濃度、約3.2g/Lの濃度もしくは3.2g/Lより高い濃度、約3.3g/Lの濃度もしくは3.3g/Lより高い濃度、約3.4g/Lの濃度もしくは3.4g/Lより高い濃度、約3.5g/Lの濃度もしくは3.5g/Lより高い濃度、約3.6g/Lの濃度もしくは3.6g/Lより高い濃度、約3.7g/Lの濃度もしくは3.7g/Lより高い濃度、約3.8g/Lの濃度もしくは3.8g/Lより高い濃度、約3.9g/Lの濃度もしくは3.9g/Lより高い濃度、約4.0g/Lの濃度もしくは4.0g/Lより高い濃度、約4.1g/Lの濃度もしくは4.1g/Lより高い濃度、約4.2g/Lの濃度もしくは4.2g/Lより高い濃度、約4.3g/Lの濃度もしくは4.3g/Lより高い濃度、約4.4g/Lの濃度もしくは4.4g/Lより高い濃度、約4.5g/Lの濃度もしくは4.5g/Lより高い濃度、約4.6g/Lの濃度もしくは4.6g/Lより高い濃度、約4.7g/Lの濃度もしくは4.7g/Lより高い濃度、約4.8g/Lの濃度もしくは4.8g/Lより高い濃度、約4.9g/Lの濃度もしくは4.9g/Lより高い濃度、約5.0g/Lの濃度もしくは5.0g/Lより高い濃度、約5.1g/Lの濃度もしくは5.1g/Lより高い濃度、約5.2g/Lの濃度もしくは5.2g/Lより高い濃度、約5.3g/Lの濃度もしくは5.3g/Lより高い濃度、約5.4g/Lの濃度もしくは5.4g/Lより高い濃度、約5.5g/Lの濃度もしくは5.5g/Lより高い濃度、約5.6g/Lの濃度もしくは5.6g/Lより高い濃度、約5.7g/Lの濃度もしくは5.7g/Lより高い濃度、約5.8g/Lの濃度もしくは5.8g/Lより高い濃度、約5.9g/Lの濃度もしくは5.9g/Lより高い濃度、約6.0g/Lの濃度もしくは6.0g/Lより高い濃度、約6.1g/Lの濃度もしくは6.1g/Lより高い濃度、約6.2g/Lの濃度もしくは6.2g/Lより高い濃度、約6.3g/Lの濃度もしくは6.3g/Lより高い濃度、約6.4g/Lの濃度もしくは6.4g/Lより高い濃度、約6.5g/Lの濃度もしくは6.5g/Lより高い濃度、約6.6g/Lの濃度もしくは6.6g/Lより高い濃度、約6.7g/Lの濃度もしくは6.7g/Lより高い濃度、約6.8g/Lの濃度もしくは6.8g/Lより高い濃度、約6.9g/Lの濃度もしくは6.9g/Lより高い濃度、約7.0g/Lの濃度もしくは7.0g/Lより高い濃度、約7.1g/Lの濃度もしくは7.1g/Lより高い濃度、約7.2g/Lの濃度もしくは7.2g/Lより高い濃度、約7.3g/Lの濃度もしくは7.3g/Lより高い濃度、約7.4g/Lの濃度もしくは7.4g/Lより高い濃度、約7.5g/Lの濃度もしくは7.5g/Lより高い濃度、約7.6g/Lの濃度もしくは7.6g/Lより高い濃度、約7.7g/Lの濃度もしくは7.7g/Lより高い濃度、約7.8g/Lの濃度もしくは7.8g/Lより高い濃度、約7.9g/Lの濃度もしくは7.9g/Lより高い濃度、約8.0g/Lの濃度もしくは8.0g/Lより高い濃度、約8.1g/Lの濃度もしくは8.1g/Lより高い濃度、約8.2g/Lの濃度もしくは8.2g/Lより高い濃度、約8.3g/Lの濃度もしくは8.3g/Lより高い濃度、約8.4g/Lの濃度もしくは8.4g/Lより高い濃度、約8.5g/Lの濃度もしくは8.5g/Lより高い濃度、約8.6g/Lの濃度もしくは8.6g/Lより高い濃度、約8.7g/Lの濃度もしくは8.7g/Lより高い濃度、約8.8g/Lの濃度もしくは8.8g/Lより高い濃度、約8.9g/Lの濃度もしくは8.9g/Lより高い濃度、約9.0g/Lの濃度もしくは9.0g/Lより高い濃度、約9.1g/Lの濃度もしくは9.1g/Lより高い濃度、約9.2g/Lの濃度もしくは9.2g/Lより高い濃度、約9.3g/Lの濃度もしくは9.3g/Lより高い濃度、約9.4g/Lの濃度もしくは9.4g/Lより高い濃度、約9.5g/Lの濃度もしくは9.5g/Lより高い濃度、約9.6g/Lの濃度もしくは9.6g/Lより高い濃度、約9.7g/Lの濃度もしくは9.7g/Lより高い濃度、約9.8g/Lの濃度もしくは9.8g/Lより高い濃度、約9.9g/Lの濃度もしくは9.9g/Lより高い濃度、約10.0
g/Lの濃度もしくは10.0g/Lより高い濃度、約10.1g/Lの濃度もしくは10.1g/Lより高い濃度、約10.2g/Lの濃度もしくは10.2g/Lより高い濃度、約10.3g/Lの濃度もしくは10.3g/Lより高い濃度、約10.4g/Lの濃度もしくは10.4g/Lより高い濃度、約10.5g/Lの濃度もしくは10.5g/Lより高い濃度、約10.6g/Lの濃度もしくは10.6g/Lより高い濃度、約10.7g/Lの濃度もしくは10.7g/Lより高い濃度、約10.8g/Lの濃度もしくは10.8g/Lより高い濃度、約10.9g/Lの濃度もしくは10.9g/Lより高い濃度、約11.0g/Lの濃度もしくは11.0g/Lより高い濃度、約11.1g/Lの濃度もしくは11.1g/Lより高い濃度、約11.2g/Lの濃度もしくは11.2g/Lより高い濃度、約11.3g/Lの濃度もしくは11.3g/Lより高い濃度、約11.4g/Lの濃度もしくは11.4g/Lより高い濃度、約11.5g/Lの濃度もしくは11.5g/Lより高い濃度、約11.6g/Lの濃度もしくは11.6g/Lより高い濃度、約11.7g/Lの濃度もしくは11.7g/Lより高い濃度、約11.8g/Lの濃度もしくは11.8g/Lより高い濃度、約11.9g/Lの濃度もしくは11.9g/Lより高い濃度、約12.0g/Lの濃度もしくは12.0g/Lより高い濃度、約12.1g/Lの濃度もしくは12.1g/Lより高い濃度、約12.2g/Lの濃度もしくは12.2g/Lより高い濃度、約12.3g/Lの濃度もしくは12.3g/Lより高い濃度、約12.4g/Lの濃度もしくは12.4g/Lより高い濃度、約12.5g/Lの濃度もしくは12.5g/Lより高い濃度、約12.6g/Lの濃度もしくは12.6g/Lより高い濃度、約12.7g/Lの濃度もしくは12.7g/Lより高い濃度、約12.8g/Lの濃度もしくは12.8g/Lより高い濃度、約12.9g/Lの濃度もしくは12.9g/Lより高い濃度、約13.0g/Lの濃度もしくは13.0g/Lより高い濃度、約13.1g/Lの濃度もしくは13.1g/Lより高い濃度、約13.2g/Lの濃度もしくは13.2g/Lより高い濃度、約13.3g/Lの濃度もしくは13.3g/Lより高い濃度、約13.4g/Lの濃度もしくは13.4g/Lより高い濃度、約13.5g/Lの濃度もしくは13.5g/Lより高い濃度、約13.6g/Lの濃度もしくは13.6g/Lより高い濃度、約13.7g/Lの濃度もしくは13.7g/Lより高い濃度、約13.8g/Lの濃度もしくは13.8g/Lより高い濃度、約13.9g/Lの濃度もしくは13.9g/Lより高い濃度、約14.0g/Lの濃度もしくは14.0g/Lより高い濃度、約14.1g/Lの濃度もしくは14.1g/Lより高い濃度、約14,2g/Lの濃度もしくは14.2g/Lより高い濃度、約14.3g/Lの濃度もしくは14.3g/Lより高い濃度、約14.4g/Lの濃度もしくは14.4g/Lより高い濃度、約14.5g/Lの濃度もしくは14.5g/Lより高い濃度、約14.6g/Lの濃度もしくは14.6g/Lより高い濃度、約14.7g/Lの濃度もしくは14.7g/Lより高い濃度、約14.8g/Lの濃度もしくは14.8g/Lより高い濃度、約14.9g/Lの濃度もしくは14.9g/Lより高い濃度、または約15.0g/Lの濃度もしくは15.0g/Lより高い濃度)のポロクサマー-188を含む液体培地において、哺乳類細胞(例えば、組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞)を培養することを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法は、約1.8g/L~約16.0g/L(例えば、約1.8g/L~約15.8g/L、約1.8g/L~約15.6g/L、約1.8g/L~約15.4g/L、約1.8g/L~約15.2g/L、約1.8g/L~約15.0g/L、約1.8g/L~約14.8g/L、約1.8g/L~約14.6g/L、約1.8g/L~約14.4g/L、約1.8g/L~約14.2g/L、約1.8g/L~約14.0g/L、約1.8g/L~約13.8g/L、約1.8g/L~約13.6g/L、約1.8g/L~約13.4g/L、約1.8g/L~約13.2g/L、約1.8g/L~約13.0g/L、約1.8g/L~約12.8g/L、約1.8g/L~約12.6g/L、約1.8g/L~約12.4g/L、約1.8g/L~約12.2g/L、約1.8g/L~約12.0g/L、約1.8g/L
~約11.8g/L、約1.8g/L~約11.6g/L、約1.8g/L~約11.4g/L、約1.8g/L~約11.2g/L、約1.8g/L~約11.0g/L、約1.8g/L~約10.8g/L、約1.8g/L~約10.6g/L、約1.8g/L~約10.4g/L、約1.8g/L~約10.2g/L、約1.8g/L~約10.0g/L、約1.8g/L~約9.8g/L、約1.8g/L~約9.6g/L、約1.8g/L~約9.4g/L、約1.8g/L~約9.2g/L、約1.8g/L~約9.0g/L、約1.8g/L~約8.8g/L、約1.8g/L~約8.6g/L、約1.8g/L~約8.4g/L、約1.8g/L~約8.2g/L、約1.8g/L~約8.0g/L、約1.8g/L~約7.8g/L、約1.8g/L~約7.6g/L、約1.8g/L~約7.4g/L、約1.8g/L~約7.2g/L、約1.8g/L~約7.0g/L、約1.8g/L~約6.8g/L、約1.8g/L~約6.6g/L、約1.8g/L~約6.4g/L、1.8g/L~約6.2g/L、約1.8g/L~約6.0g/L、約1.8g/L~約5.8g/L、約1.8g/L~約5.6g/L、約1.8g/L~約5.4g/L、約1.8g/L~約5.2g/L、約1.8g/L~約5.0g/L、約1.8g/L~約4.8g/L、約1.8g/L~約4.6g/L、約1.8g/L~約4.4g/L、約1.8g/L~約4.2g/L、約1.8g/L~約4.0g/L、約1.8g/L~約3.8g/L、約1.8g/L~約3.6g/L、約1.8g/L~約3.4g/L、約1.8g/L~約3.2g/L、約1.8g/L~約3.0g/L、約1.8g/L~約2.8g/L、約2.0g/L~約16.0g/L、約2.0g/L~約15.8g/L、約2.0g/L~約15.6g/L、約2.0g/L~約15.4g/L、約2.0g/L~約15.2g/L、約2.0g/L~約15.0g/L、約2.0g/L~約14.8g/L、約2.0g/L~約14.6g/L、約2.0g/L~約14.4g/L、約2.0g/L~約14.2g/L、約2.0g/L~約14.0g/L、約2.0g/L~約13.8g/L、約2.0g/L~約13.6g/L、約2.0g/L~約13.4g/L、約2.0g/L~約13.2g/L、約2.0g/L~約13.0g/L、約2.0g/L~約12.8g/L、約2.0g/L~約12.6g/L、約2.0g/L~約12.4g/L、約2.0g/L~約12.2g/L、約2.0g/L~約12.0g/L、約2.0g/L~約11.8g/L、約2.0g/L~約11.6g/L、約2.0g/L~約11.4g/L、約2.0g/L~約11.2g/L、約2.0g/L~約11.0g/L、約2.0g/L~約10.8g/L、約2.0g/L~約10.6g/L、約2.0g/L~約10.4g/L、約2.0g/L~約10.2g/L、約2.0g/L~約10.0g/L、約2.0g/L~約9.8g/L、約2.0g/L~約9.6g/L、約2.0g/L~約9.4g/L、約2.0g/L~約9.2g/L、約2.0g/L~約9.0g/L、約2.0g/L~約8.8g/L、約2.0g/L~約8.6g/L、約2.0g/L~約8.4g/L、約2.0g/L~約8.2g/L、約2.0g/L~約8.0g/L、約2.0g/L~約7.8g/L、約2.0g/L~約7.6g/L、約2.0g/L~約7.4g/L、約2.0g/L~約7.2g/L、約2.0g/L~約7.0g/L、約2.0g/L~約6.8g/L、約2.0g/L~約6.6g/L、約2.0g/L~約6.4g/L、約2.0g/L~約6.2g/L、約2.0g/L~約6.0g/L、約2.0g/L~約5.8g/L、約2.0g/L~約5.6g/L、約2.0g/L~約5.4g/L、約2.0g/L~約5.2g/L、約2.0g/L~約5.0g/L、約2.0g/L~約4.8g/L、約2.0g/L~約4.6g/L、約2.0g/L~約4.4g/L、約2.0g/L~約4.2g/L、約2.0g/L~約4.0g/L、約2.0g/L~約3.8g/L、約2.0g/L~約3.6g/L、約2.0g/L~約3.4g/L、約2.0g/L~約3.2g/L、約2.0g/L~約3.0g/L、約2.2g/L~約16.0g/L、約2.2g/L~約15.8g/L、約2.2g/L~約15.6g/L、約2.2g/L~約15.4g/L、約2.2g/L~約15.2g/L、約2.2g/L~約15.0g/L、約2.2g/L~約14.8g/L、約2.2g/L~約14.6g/L、約2.2g/L~約14.4g/L、約2.2g/L~約14.2g/L、約2.2g
/L~約14.0g/L、約2.2g/L~約13.8g/L、約2.2g/L~約13.6g/L、約2.2g/L~約13.4g/L、約2.2g/L~約13.2g/L、約2.2g/L~約13.0g/L、約2.2g/L~約12.8g/L、約2.2g/L~約12.6g/L、約2.2g/L~約12.4g/L、約2.2g/L~約12.2g/L、約2.2g/L~約12.0g/L、約2.2g/L~約11.8g/L、約2.2g/L~約11.6g/L、約2.2g/L~約11.4g/L、約2.2g/L~約11.2g/L、約2.2g/L~約11.0g/L、約2.2g/L~約10.8g/L、約2.2g/L~約10.6g/L.約2.2g/L~約10.4g/L、約2.2g/L~約10.2g/L、約2.2g/L~約10.0g/L、約2.2g/L~約9.8g/L、約2.2g/L~約9.6g/L、約2.2g/L~約9.4g/L、約2.2g/L~約9.2g/L、約2.2g/L~約9.0g/L、約2.2g/L~約8.8g/L、約2.2g/L~約8.6g/L、約2.2g/L~約8.4g/L、約2.2g/L~約8.2g/L、約2.2g/L~約8.0g/L、約2.2g/L~約7.8g/L、約2.2g/L~約7.6g/L、約2.2g/L~約7.4g/L、約2.2g/L~約7.2g/L、約2.2g/L~約7.0g/L、約2.2g/L~約6.9g/L、約2.2g/L~約6.8g/L、約2.2g/L~約6.6g/L、約2.2g/L~約6.4g/L、約2.2g/L~約6.2g/L、約2.2g/L~約6.0g/L、約2.2g/L~約5.8g/L、約2.2g/L~約5.6g/L、約2.2g/L~約5.4g/L、約2.2g/L~約5.2g/L、約2.2g/L~約5.0g/L、約2.2g/L~約4.8g/L、約2.2g/L~約4.6g/L、約2.2g/L~約4.4g/L、約2.2g/L~約4.2g/L、約2.2g/L~約4.0g/L、約2.2g/L~約3.8g/L、約2.2g/L~約3.6g/L、約2.2g/L~約3.4g/L、約2.2g/L~約3.2g/L、約2.4g/L~約16.0g/L、約2.4g/L~約15.8g/L、約2.4g/L~約15.6g/L、約2.4g/L~約15.4g/L、約2.4g/L~約15.2g/L、約2.4g/L~約15.0g/L、約2.4g/L~約14.8g/L、約2.4g/L~約14.6g/L、約2.4g/L~約14.4g/L、約2.4g/L~約14.2g/L、約2.4g/L~約14.0g/L、約2.4g/L~約13.8g/L、約2.4g/L~約13.6g/L、約2.4g/L~約13.4g/L、約2.4g/L~約13.2g/L、約2.4g/L~約13.0g/L、約2.4g/L~約12.8g/L、約2.4g/L~約12.6g/L、約2.4g/L~約12.4g/L、約2.4g/L~約12.2g/L、約2.4g/L~約12.0g/L、約2.4g/L~約11.8g/L、約2.4g/L~約11.6g/L、約2.4g/L~約11.4g/L、約2.4g/L~約11.2g/L、約2.4g/L~約11.0g/L、約2.4g/L~約10.8g/L、約2.4g/L~約10.6g/L、約2.4g/L~約10.4g/L、約2.4g/L~約10.2g/L、約2.4g/L~約10.0g/L、約2.4g/L~約9.8g/L、約2.4g/L~約9.6g/L、約2.4g/L~約9.4g/L、約2.4g/L~約9.2g/L、約2.4g/L~約9.0g/L、約2.4g/L~約8.8g/L、約2.4g/L~約8.6g/L、約2.4g/L~約8.4g/L、約2.4g/L~約8.2g/L、約2.4g/L~約8.0g/L、約2.4g/L~約7.8g/L、約2.4g/L~約7.6g/L、約2.4g/L~約7.4g/L、約2.4g/L~約7.2g/L、約2.4g/L~約7.0g/L、約2.4g/L~約6.9g/L、約2.4g/L~約6.8g/L、約2.4g/L~約6.6g/L、約2.4g/L~約6.4g/L、約2.4g/L~約6.2g/L、約2.4g/L~約6.0g/L、約2.4g/L~約5.8g/L、約2.4g/L~約5.6g/L、約2.4g/L~約5.4g/L、約2.4g/L~約5.2g/L、約2.4g/L~約5.0g/L、約2.4g/L~約4.8g/L、約2.4g/L~約4.6g/L、約2.4g/L~約4.4g/L、約2.4g/L~約4.2g/L、約2.4g/L~約4.0g/L、約2.4g/L~約3.8g/L、約2.4g/L~約3.6g/L、約2.4g/L~約3.4g/L、約2.6g/L~約16.0g/L、
約2.6g/L~約15.8g/L、約2.6g/L~約15.6g/L、約2.6g/L~約15.4g/L、約2.6g/L~約15.2g/L、約2.6g/L~約15.0g/L、約2.6g/L~約14.8g/L、約2.6g/L~約14.6g/L、約2.6g/L~約14.4g/L、約2.6g/L~約14.2g/L、約2.6g/L~約14.0g/L、約2.6g/L~約13.8g/L、約2.6g/L~約13.6g/L、約2.6g/L~約13.4g/L、約2.6g/L~約13.2g/L、約2.6g/L~約13.0g/L、約2.6g/L~約12.8g/L、約2.6g/L~約12.6g/L、約2.6g/L~約12.4g/L、約2.6g/L~約12.2g/L、約2.6g/L~約12.0g/L、約2.6g/L~約11.8g/L、約2.6g/L~約11.6g/L、約2.6g/L~約11.4g/L、約2.6g/L~約11.2g/L、約2.6g/L~約11.0g/L、約2.6g/L~約10.8g/L、約2.6g/L~約10.6g/L.約2.6g/L~約10.4g/L、約2.6g/L~約10.2g/L、約2.6g/L~約10.0g/L、約2.6g/L~約9.8g/L、約2.6g/L~約9.6g/L、約2.6g/L~約9.4g/L、約2.6g/L~約9.2g/L、約2.6g/L~約9.0g/L、約2.6g/L~約8.8g/L、約2.6g/L~約8.6g/L、約2.6g/L~約8.4g/L、約2.6g/L~約8.2g/L、約2.6g/L~約8.0g/L、約2.6g/L~約7.8g/L、約2.6g/L~約7.6g/L、約2.6g/L~約7.4g/L、
約2.6g/L~約7.2g/L、約2.6g/L~約7.0g/L、約2.6g/L~約6.9g/L、約2.6g/L~約6.8g/L、約2.6g/L~約6.6g/L、約2.6g/L~約6.4g/L、約2.6g/L~約6.2g/L、約2.6g/L~約6.0g/L、約2.6g/L~約5.8g/L、約2.6g/L~約5.6g/L、約2.6g/L~約5.4g/L、約2.6g/L~約5.2g/L、約2.6g/L~約5.0g/L、約2.6g/L~約4.8g/L、約2.6g/L~約4.6g/L、約2.6g/L~約4.4g/L、約2.6g/L~約4.2g/L、約2.6g/L~約4.0g/L、約2.6g/L~約3.8g/L、約2.6g/L~約3.6g/L、約2.8g/L~約16.0g/L、約2.8g/L~約15.8g/L、約2.8g/L~約15.6g/L、約2.8g/L~約15.4g/L、約2.8g/L~約15.2g/L、約2.8g/L~約15.0g/L、約2.8g/L~約14.8g/L、約2.8g/L~約14.6g/L、約2.8g/L~約14.4g/L、約2.8g/L~約14.2g/L、約2.8g/L~約14.0g/L、約2.8g/L~約13.8g/L、約2.8g/L~約13.6g/L、約2.8g/L~約13.4g/L、約2.8g/L~約13.2g/L、約2.8g/L~約13.0g/L、約2.8g/L~約12.8g/L、約2.8g/L~約12.6g/L、約2.8g/L~約12.4g/L、約2.8g/L~約12.2g/L、約2.8g/L~約12.0g/L、約2.8g/L~約11.8g/L、約2.8g/L~約11.6g/L、約2.8g/L~約11.4g/L、約2.8g/L~約11.2g/L、約2.8g/L~約11.0g/L、約2.8g/L~約10.8g/L、約2.8g/L~約10.6g/L、約2.8g/L~約10.4g/L、約2.8g/L~約10.2g/L、約2.8g/L~約10.0g/L、約2.8g/L~約9.8g/L、約2.8g/L~約9.6g/L、約2.8g/L~約9.4g/L、約2.8g/L~約9.2g/L、約2.8g/L~約9.0g/L、約2.8g/L~約8.8g/L、約2.8g/L~約8.6g/L、約2.8g/L~約8.4g/L、約2.8g/L~約8.2g/L、約2.8g/L~約8.0g/L、約2.8g/L~約7.8g/L、約2.8g/L~約7.6g/L、約2.8g/L~約7.4g/L、約2.8g/L~約7.2g/L、約2.8g/L~約7.0g/L、約2.8g/L~約6.9g/L、約2.8g/L~約6.8g/L、約2.8g/L~約6.6g/L、約2.8g/L~約6.4g/L、約2.8g/L~約6.2g/L、約2.8g/L~約6.0g/L、約2.8g/L~約5.8g/L、約2.8g/L~約5.6g/L、約2.8g/L~約5.4g/L、約2.8g/L~約5.2g/L、約2.8g/L~約5.0g/L、約2.8g/L~約4.8g/L、約
2.8g/L~約4.6g/L、約2.8g/L~約4.4g/L、約2.8g/L~約4.2g/L、約2.8g/L~約4.0g/L、約2.8g/L~約3.8g/L、約3.0g/L~約16.0g/L、約3.0g/L~約15.8g/L、約3.0g/L~約15.6g/L、約3.0g/L~約15.4g/L、約3.0g/L~約15.2g/L、約3.0g/L~約15.0g/L、約3.0g/L~約14.8g/L、約3.0g/L~約14.6g/L、約3.0g/L~約14.4g/L、約3.0g/L~約14.2g/L、約3.0g/L~約14.0g/L、約3.0g/L~約13.8g/L、約3.0g/L~約13.6g/L、約3.0g/L~約13.4g/L、約3.0g/L~約13.2g/L、約3.0g/L~約13.0g/L、約3.0g/L~約12.8g/L、約3.0g/L~約12.6g/L、約3.0g/L~約12.4g/L、約3.0g/L~約12.2g/L、約3.0g/L~約12.0g/L、約3.0g/L~約11.8g/L、約3.0g/L~約11.6g/L、約3.0g/L~約11.4g/L、約3.0g/L~約11.2g/L、約3.0g/L~約11.0g/L、約3.0g/L~約10.8g/L、約3.0g/L~約10.6g/L、約3.0g/L~約10.4g/L、約3.0g/L~約10.2g/L、約3.0g/L~約10.0g/L、約3.0g/L~約9.8g/L、約3.0g/L~約9.6g/L、約3.0g/L~約9.4g/L、約3.0g/L~約9.2g/L、約3.0g/L~約9.0g/L、約3.0g/L~約8.8g/L、約3.0g/L~約8.6g/L、約3.0g/L~約8.4g/L、約3.0g/L~約8.2g/L、約3.0g/L~約8.0g/L、約3.0g/L~約7.8g/L、約3.0g/L~約7.6g/L、約3.0g/L~約7.4g/L、約3.0g/L~約7.2g/L、約3.0g/L~約7.0g/L、約3.0g/L~約6.9g/L、約3.0g/L~約6.8g/L、約3.0g/L~約6.6g/L、約3.0g/L~約6.4g/L、約3.0g/L~約6.2g/L、約3.0g/L~約6.0g/L、約3.0g/L~約5.8g/L、約3.0g/L~約5.6g/L、約3.0g/L~約5.4g/L、約3.0g/L~約5.2g/L、約3.0g/L~約5.0g/L、約3.0g/L~約4.8g/L、約3.0g/L~約4.6g/L、約3.0g/L~約4.4g/L、約3.0g/L~約4.2g/L、約3.0g/L~約4.0g/L、約3.2g/L~約16.0g/L、約3.2g/L~約15.8g/L、約3.2g/L~約15.6g/L、約3.2g/L~約15.4g/L、約3.2g/L~約15.2g/L、約3.2g/L~約15.0g/L、約3.2g/L~約14.8g/L、約3.2g/L~約14.6g/L、約3.2g/L~約14.4g/L、約3.2g/L~約14.2g/L、約3.2g/L~約14.0g/L、約3.2g/L~約13.8g/L、約3.2g/L~約13.6g/L、約3.2g/L~約13.4g/L、約3.2g/L~約13.2g/L、約3.2g/L~約13.0g/L、約3.2g/L~約12.8g/L、約3.2g/L~約12.6g/L、約3.2g/L~約12.4g/L、約3.2g/L~約12.2g/L、約3.2g/L~約12.0g/L、約3.2g/L~約11.8g/L、約3.2g/L~約11.6g/L、約3.2g/L~約11.4g/L、約3.2g/L~約11.2g/L、約3.2g/L~約11.0g/L、約3.2g/L~約10.8g/L、約3.2g/L~約10.6g/L、約3.2g/L~約10.4g/L、約3.2g/L~約10.2g/L、約3.2g/L~約10.0g/L、約3.2g/L~約9.8g/L、約3.2g/L~約9.6g/L、約3.2g/L~約9.4g/L、約3.2g/L~約9.2g/L、約3.2g/L~約9.0g/L、約3.2g/L~約8.8g/L、約3.2g/L~約8.6g/L、約3.2g/L~約8.4g/L、約3.2g/L~約8.2g/L、約3.2g/L~約8.0g/L、約3.2g/L~約7.8g/L、約3.2g/L~約7.6g/L、約3.2g/L~約7.4g/L、約3.2g/L~約7.2g/L、約3.2g/L~約7.0g/L、約3.2g/L~約6.9g/L、約3.2g/L~約6.8g/L、約3.2g/L~約6.6g/L、約3.2g/L~約6.4g/L、約3.2g/L~約6.2g/L、約3.2g/L~約6.0g/L、約3.2g/L~約5.8g/L、約3.2g/L~約5.6g/L、約3.
2g/L~約5.4g/L、約3.2g/L~約5.2g/L、約3.2g/L~約5.0g/L、約3.2g/L~約4.8g/L、約3.2g/L~約4.6g/L、約3.2g/L~約4.4g/L、約3.2g/L~約4.2g/L、約3.4g/L~約16.0g/L、約3.4g/L~約15.8g/L、約3.4g/L~約15.6g/L、約3.4g/L~約15.4g/L、約3.4g/L~約15.2g/L、約3.4g/L~約15.0g/L、約3.4g/L~約14.8g/L、約3.4g/L~約14.6g/L、約3.4g/L~約14.4g/L、約3.4g/L~約14.2g/L、約3.4g/L~約14.0g/L、約3.4g/L~約13.8g/L、約3.4g/L~約13.6g/L、約3.4g/L~約13.4g/L、約3.4g/L~約13.2g/L、約3.4g/L~約13.0g/L、約3.4g/L~約12.8g/L、約3.4g/L~約12.6g/L、約3.4g/L~約12.4g/L、約3.4g/L~約12.2g/L、約3.4g/L~約12.0g/L、約3.4g/L~約11.8g/L、約3.4g/L~約11.6g/L、約3.4g/L~約11.4g/L、約3.4g/L~約11.2g/L、約3.4g/L~約11.0g/L、約3.4g/L~約10.8g/L、約3.4g/L~約10.6g/L、約3.4g/L~約10.4g/L、約3.4g/L~約10.2g/L、約3.4g/L~約10.0g/L、約3.4g/L~約9.8g/L、約3.4g/L~約9.6g/L、約3.4g/L~約9.4g/L、約3.4g/L~約9.2g/L、約3.4g/L~約9.0g/L、約3.4g/L~約8.8g/L、約3.4g/L~約8.6g/L、約3.4g/L~約8.4g/L、約3.4g/L~約8.2g/L、約3.4g/L~約8.0g/L、約3.4g/L~約7.8g/L、約3.4g/L~約7.6g/L、約3.4g/L~約7.4g/L、約3.4g/L~約7.2g/L、約3.4g/L~約7.0g/L、約3.4g/L~約6.9g/L、約3.4g/L~約6.8g/L、約3.4g/L~約6.6g/L、約3.4g/L~約6.4g/L、約3.4g/L~約6.2g/L、約3.4g/L~約6.0g/L、約3.4g/L~約5.8g/L、約3.4g/L~約5.6g/L、約3.4g/L~約5.4g/L、約3.4g/L~約5.2g/L、約3.4g/L~約5.0g/L、約3.4g/L~約4.8g/L、約3.4g/L~約4.6g/L、約3.4g/L~約4.4g/L、約3.6g/L~約16.0g/L、約3.6g/L~約15.8g/L、約3.6g/L~約15.6g/L、約3.6g/L~約15.4g/L、約3.6g/L~約15.2g/L、約3.6g/L~約15.0g/L、約3.6g/L~約14.8g/L、約3.6g/L~約14.6g/L、約3.6g/L~約14.4g/L、約3.6g/L~約14.2g/L、約3.6g/L~約14.0g/L、約3.6g/L~約13.8g/L、約3.6g/L~約13.6g/L、約3.6g/L~約13.4g/L、約3.6g/L~約13.2g/L、約3.6g/L~約13.0g/L、約3.6g/L~約12.8g/L、約3.6g/L~約12.6g/L、約3.6g/L~約12.4g/L、約3.6g/L~約12.2g/L、約3.6g/L~約12.0g/L、約3.6g/L~約11.8g/L、約3.6g/L~約11.6g/L、約3.6g/L~約11.4g/L、約3.6g/L~約11.2g/L、約3.6g/L~約11.0g/L、約3.6g/L~約10.8g/L、約3.6g/L~約10.6g/L、約3.6g/L~約10.4g/L、約3.6g/L~約10.2g/L、約3.6g/L~約10.0g/L、約3.6g/L~約9.8g/L、約3.6g/L~約9.6g/L、約3.6g/L~約9.4g/L、約3.6g/L~約9.2g/L、約3.6g/L~約9.0g/L、約3.6g/L~約8.8g/L、約3.6g/L~約8.6g/L、約3.6g/L~約8.4g/L、約3.6g/L~約8.2g/L、約3.6g/L~約8.0g/L、約3.6g/L~約7.8g/L、約3.6g/L~約7.6g/L、約3.6g/L~約7.4g/L、
約3.6g/L~約7.2g/L、約3.6g/L~約7.0g/L、約3.6g/L~約6.9g/L、約3.6g/L~約6.8g/L、約3.6g/L~約6.6g/L、約3.6g/L~約6.4g/L、約3.6g/L~約6.2g/L、約3.6g/L~約6.0g/L、約3.6g/L~約5.8g/L、約3.6g/L~約5.6g/L、
約3.6g/L~約5.4g/L、約3.6g/L~約5.2g/L、約3.6g/L~約5.0g/L、約3.6g/L~約4.8g/L、約3.6g/L~約4.6g/L、約3.8g/L~約16.0g/L、約3.8g/L~約15.8g/L、約3.8g/L~約15.6g/L、約3.8g/L~約15.4g/L、約3.8g/L~約15.2g/L、約3.8g/L~約15.0g/L、約3.8g/L~約14.8g/L、約3.8g/L~約14.6g/L、約3.8g/L~約14.4g/L、約3.8g/L~約14.2g/L、約3.8g/L~約14.0g/L、約3.8g/L~約13.8g/L、約3.8g/L~約13.6g/L、約3.8g/L~約13.4g/L、約3.8g/L~約13.2g/L、約3.8g/L~約13.0g/L、約3.8g/L~約12.8g/L、約3.8g/L~約12.6g/L、約3.8g/L~約12.4g/L、約3.8g/L~約12.2g/L、約3.8g/L~約12.0g/L、約3.8g/L~約11.8g/L、約3.8g/L~約11.6g/L、約3.8g/L~約11.4g/L、約3.8g/L~約11.2g/L、約3.8g/L~約11.0g/L、約3.8g/L~約10.8g/L、約3.8g/L~約10.6g/L、約3.8g/L~約10.4g/L、約3.8g/L~約10.2g/L、約3.8g/L~約10.0g/L、約3.8g/L~約9.8g/L、約3.8g/L~約9.6g/L、約3.8g/L~約9.4g/L、約3.8g/L~約9.2g/L、約3.8g/L~約9.0g/L、約3.8g/L~約8.8g/L、約3.8g/L~約8.6g/L、約3.8g/L~約8.4g/L、約3.8g/L~約8.2g/L、約3.8g/L~約8.0g/L、約3.8g/L~約7.8g/L、約3.8g/L~約7.6g/L、約3.8g/L~約7.4g/L、約3.8g/L~約7.2g/L、約3.8g/L~約7.0g/L、約3.8g/L~約6.9g/L、約3.8g/L~約6.8g/L、約3.8g/L~約6.6g/L、約3.8g/L~約6.4g/L、約3.8g/L~約6.2g/L、約3.8g/L~約6.0g/L、約3.8g/L~約5.8g/L、約3.8g/L~約5.6g/L、約3.8g/L~約5.4g/L、約3.8g/L~約5.2g/L、約3.8g/L~約5.0g/L、約3.8g/L~約4.8g/L、約4.0g/L~約16.0g/L、約4.0g/L~約15.8g/L、約4.0g/L~約15.6g/L、約4.0g/L~約15.4g/L、約4.0g/L~約15.2g/L、約4.0g/L~約15.0g/L、約4.0g/L~約14.8g/L、約4.0g/L~約14.6g/L、約4.0g/L~約14.4g/L、約4.0g/L~約14.2g/L、約4.0g/L~約14.0g/L、約4.0g/L~約13.8g/L、約4.0g/L~約13.6g/L、約4.0g/L~約13.4g/L、約4.0g/L~約13.2g/L、約4.0g/L~約13.0g/L、約4.0g/L~約12.8g/L、約4.0g/L~約12.6g/L、約4.0g/L~約12.4g/L、約4.0g/L~約12.2g/L、約4.0g/L~約12.0g/L、約4.0g/L~約11.8g/L、約4.0g/L~約11.6g/L、約4.0g/L~約11.4g/L、約4.0g/L~約11.2g/L、約4.0g/L~約11.0g/L、約4.0g/L~約10.8g/L、約4.0g/L~約10.6g/L、約4.0g/L~約10.4g/L、約4.0g/L~約10.2g/L、約4.0g/L~約10.0g/L、約4.0g/L~約9.8g/L、約4.0g/L~約9.6g/L、約4.0g/L~約9.4g/L、約4.0g/L~約9.2g/L、約4.0g/L~約9.0g/L、約4.0g/L~約8.8g/L、約4.0g/L~約8.6g/L、約4.0g/L~約8.4g/L、約4.0g/L~約8.2g/L、約4.0g/L~約8.0g/L、約4.0g/L~約7.8g/L、約4.0g/L~約7.6g/L、約4.0g/L~約7.4g/L、約4.0g/L~約7.2g/L、約4.0g/L~約7.0g/L、約4.0g/L~約6.9g/L、約4.0g/L~約6.8g/L、約4.0g/L~約6.6g/L、約4.0g/L~約6.4g/L、約4.0g/L~約6.2g/L、約4.0g/L~約6.0g/L、約4.0g/L~約5.8g/L、約4.0g/L~約5.6g/L、約4.0g/L~約5.4g/L、約4.0g/L~約5.2g/L、約4.0g/L~約5.0g/L、約4.2g/L~約16.0g/L、約
4.2g/L~約15.8g/L、約4.2g/L~約15.6g/L、約4.2g/L~約15.4g/L、約4.2g/L~約15.2g/L、約4.2g/L~約15.0g/L、約4.2g/L~約14.8g/L、約4.2g/L~約14.6g/L、約4.2g/L~約14.4g/L、約4.2g/L~約14.2g/L、約4.2g/L~約14.0g/L、約4.2g/L~約13.8g/L、約4.2g/L~約13.6g/L、約4.2g/L~約13.4g/L、約4.2g/L~約13.2g/L、約4.2g/L~約13.0g/L、約4.2g/L~約12.8g/L、約4.2g/L~約12.6g/L、約4.2g/L~約12.4g/L、約4.2g/L~約12.2g/L、約4.2g/L~約12.0g/L、約4.2g/L~約11.8g/L、約4.2g/L~約11.6g/L、約4.2g/L~約11.4g/L、約4.2g/L~約11.2g/L、約4.2g/L~約11.0g/L、約4.2g/L~約10.8g/L、約4.2g/L~約10.6g/L、約4.2g/L~約10.4g/L、約4.2g/L~約10.2g/L、約4.2g/L~約10.0g/L、約4.2g/L~約9.8g/L、約4.2g/L~約9.6g/L、約4.2g/L~約9.4g/L、約4.2g/L~約9.2g/L、約4.2g/L~約9.0g/L、約4.2g/L~約8.8g/L、約4.2g/L~約8.6g/L、約4.2g/L~約8.4g/L、約4.2g/L~約8.2g/L、約4.2g/L~約8.0g/L、約4.2g/L~約7.8g/L、約4.2g/L~約7.6g/L、約4.2g/L~約7.4g/L、約4.2g/L~約7.2g/L、約4.2g/L~約7.0g/L、約4.2g/L~約6.9g/L、約4.2g/L~約6.8g/L、約4.2g/L~約6.6g/L、約4.2g/L~約6.4g/L、約4.2g/L~約6.2g/L、約4.2g/L~約6.0g/L、約4.2g/L~約5.8g/L、約4.2g/L~約5.6g/L、約4.2g/L~約5.4g/L、約4.2g/L~約5.2g/L、約4.4g/L~約16.0g/L、約4.4g/L~約15.8g/L、約4.4g/L~約15.6g/L、約4.4g/L~約15.4g/L、約4.4g/L~約15.2g/L、約4.4g/L~約15.0g/L、約4.4g/L~約14.8g/L、約4.4g/L~約14.6g/L、約4.4g/L~約14.4g/L、約4.4g/L~約14.2g/L、約4.4g/L~約14.0g/L、約4.4g/L~約13.8g/L、約4.4g/L~約13.6g/L、約4.4g/L~約13.4g/L、約4.4g/L~約13.2g/L、約4.4g/L~約13.0g/L、約4.4g/L~約12.8g/L、約4.4g/L~約12.6g/L、約4.4g/L~約12.4g/L、約4.4g/L~約12.2g/L、約4.4g/L~約12.0g/L、約4.4g/L~約11.8g/L、約4.4g/L~約11.6g/L、約4.4g/L~約11.4g/L、約4.4g/L~約11.2g/L、約4.4g/L~約11.0g/L、約4.4g/L~約10.8g/L、約4.4g/L~約10.6g/L、約4.4g/L~約10.4g/L、約4.4g/L~約10.2g/L、約4.4g/L~約10.0g/L、約4.4g/L~約9.8g/L、約4.4g/L~約9.6g/L、約4.4g/L~約9.4g/L、約4.4g/L~約9.2g/L、約4.4g/L~約9.0g/L、約4.4g/L~約8.8g/L、約4.4g/L~約8.6g/L、約4.4g/L~約8.4g/L、約4.4g/L~約8.2g/L、約4.4g/L~約8.0g/L、約4.4g/L~約7.8g/L、約4.4g/L~約7.6g/L、約4.4g/L~約7.4g/L、約4.4g/L~約7.2g/L、約4.4g/L~約7.0g/L、約4.4g/L~約6.9g/L、約4.4g/L~約6.8g/L、約4.4g/L~約6.6g/L、約4.4g/L~約6.4g/L、約4.4g/L~約6.2g/L、約4.4g/L~約6.0g/L、約4.4g/L~約5.8g/L、約4.4g/L~約5.6g/L、約4.4g/L~約5.4g/L、約4.6g/L~約16.0g/L、約4.6g/L~約15.8g/L、約4.6g/L~約15.6g/L、約4.6g/L~約15.4g/L、約4.6g/L~約15.2g/L、約4.6g/L~約15.0g/L、約4.6g/L~約14.8g/L、約4.6g/L~約14.6g/L、約4.6g/L~約14.4g/L、約4.6g/L~約14.2g/L、約4.6g/L~約1
4.0g/L、約4.6g/L~約13.8g/L、約4.6g/L~約13.6g/L、約4.6g/L~約13.4g/L、約4.6g/L~約13.2g/L、約4.6g/L~約13.0g/L、約4.6g/L~約12.8g/L、約4.6g/L~約12.6g/L、約4.6g/L~約12.4g/L、約4.6g/L~約12.2g/L、約4.6g/L~約12.0g/L、約4.6g/L~約11.8g/L、約4.6g/L~約11.6g/L、約4.6g/L~約11.4g/L、約4.6g/L~約11.2g/L、約4.6g/L~約11.0g/L、約4.6g/L~約10.8g/L、約4.6g/L~約10.6g/L、約4.6g/L~約10.4g/L、約4.6g/L~約10.2g/L、約4.6g/L~約10.0g/L、約4.6g/L~約9.8g/L、約4.6g/L~約9.6g/L、約4.6g/L~約9.4g/L、約4.6g/L~約9.2g/L、約4.6g/L~約9.0g/L、約4.6g/L~約8.8g/L、約4.6g/L~約8.6g/L、約4.6g/L~約8.4g/L、約4.6g/L~約8.2g/L、約4.6g/L~約8.0g/L、約4.6g/L~約7.8g/L、約4.6g/L~約7.6g/L、約4.6g/L~約7.4g/L、約4.6g/L~約7.2g/L、約4.6g/L~約7.0g/L、約4.6g/L~約6.9g/L、約4.6g/L~約6.8g/L、約4.6g/L~約6.6g/L、約4.6g/L~約6.4g/L、約4.6g/L~約6.2g/L、約4.6g/L~約6.0g/L、約4.6g/L~約5.8g/L、約4.6g/L~約5.6g/L、約4.8g/L~約16.0g/L、約4.8g/L~約15.8g/L、約4.8g/L~約15.6g/L、約4.8g/L~約15.4g/L、約4.8g/L~約15.2g/L、約4.8g/L~約15.0g/L、約4.8g/L~約14.8g/L、約4.8g/L~約14.6g/L、約4.8g/L~約14.4g/L、約4.8g/L~約14.2g/L、約4.8g/L~約14.0g/L、約4.8g/L~約13.8g/L、約4.8g/L~約13.6g/L、約4.8g/L~約13.4g/L、
約4.8g/L~約13.2g/L、約4.8g/L~約13.0g/L、約4.8g/L~約12.8g/L、約4.8g/L~約12.6g/L、約4.8g/L~約12.4g/L、約4.8g/L~約12.2g/L、約4.8g/L~約12.0g/L、約4.8g/L~約11.8g/L、約4.8g/L~約11.6g/L、約4.8g/L~約11.4g/L、約4.8g/L~約11.2g/L、約4.8g/L~約11.0g/L、約4.8g/L~約10.8g/L、約4.8g/L~約10.6g/L、約4.8g/L~約10.4g/L、約4.8g/L~約10.2g/L、約4.8g/L~約10.0g/L、約4.8g/L~約9.8g/L、約4.8g/L~約9.6g/L、約4.8g/L~約9.4g/L、約4.8g/L~約9.2g/L、約4.8g/L~約9.0g/L、約4.8g/L~約8.8g/L、約4.8g/L~約8.6g/L、約4.8g/L~約8.4g/L、約4.8g/L~約8.2g/L、約4.8g/L~約8.0g/L、約4.8g/L~約7.8g/L、約4.8g/L~約7.6g/L、約4.8g/L~約7.4g/L、約4.8g/L~約7.2g/L、約4.8g/L~約7.0g/L、約4.8g/L~約6.9g/L、約4.8g/L~約6.8g/L、約4.8g/L~約6.6g/L、約4.8g/L~約6.4g/L、約4.8g/L~約6.2g/L、約4.8g/L~約6.0g/L、約4.8g/L~約5.8g/L、約5.0g/L~約16.0g/L、約5.0g/L~約15.8g/L、約5.0g/L~約15.6g/L、約5.0g/L~約15.4g/L、約5.0g/L~約15.2g/L、約5.0g/L~約15.0g/L、約5.0g/L~約14.8g/L、約5.0g/L~約14.6g/L、約5.0g/L~約14.4g/L、約5.0g/L~約14.2g/L、約5.0g/L~約14.0g/L、約5.0g/L~約13.8g/L、約5.0g/L~約13.6g/L、約5.0g/L~約13.4g/L、約5.0g/L~約13.2g/L、約5.0g/L~約13.0g/L、約5.0g/L~約12.8g/L、約5.0g/L~約12.6g/L、約5.0g/L~約12.4g/L、約5.0g/L~約12.2g/L、約5.0g/L~約12.0g/L、約5.0g/L~約11.8g/L、約5.0g/L~約11.6g/L、約5.0g/L~
約11.4g/L、約5.0g/L~約11.2g/L、約5.0g/L~約11.0g/L、約5.0g/L~約10.8g/L、約5.0g/L~約10.6g/L、約5.0g/L~約10.4g/L、約5.0g/L~約10.2g/L、約5.0g/L~約10.0g/L、約5.0g/L~約9.8g/L、約5.0g/L~約9.6g/L、約5.0g/L~約9.4g/L、約5.0g/L~約9.2g/L、約5.0g/L~約9.0g/L、約5.0g/L~約8.8g/L、約5.0g/L~約8.6g/L、約5.0g/L~約8.4g/L、約5.0g/L~約8.2g/L、約5.0g/L~約8.0g/L、約5.0g/L~約7.8g/L、約5.0g/L~約7.6g/L、約5.0g/L~約7.4g/L、約5.0g/L~約7.2g/L、約5.0g/L~約7.0g/L、約5.0g/L~約6.9g/L、約5.0g/L~約6.8g/L、約5.0g/L~約6.6g/L、約5.0g/L~約6.4g/L、約5.0g/L~約6.2g/L、約5.0g/L~約6.0g/L、約5.1g/L~約16.0g/L、約5.1g/L~約15.8g/L、約5.1g/L~約15.6g/L、約5.1g/L~約15.4g/L、約5.1g/L~約15.2g/L、約5.1g/L~約15.0g/L、約5.1g/L~約14.8g/L、約5.1g/L~約14.6g/L、約5.1g/L~約14.4g/L、約5.1g/L~約14.2g/L、約5.1g/L~約14.0g/L、約5.1g/L~約13.8g/L、約5.1g/L~約13.6g/L、約5.1g/L~約13.4g/L、約5.1g/L~約13.2g/L、約5.1g/L~約13.0g/L、約5.1g/L~約12.8g/L、約5.1g/L~約12.6g/L、約5.1g/L~約12.4g/L、約5.1g/L~約12.2g/L、約5.1g/L~約12.0g/L、約5.1g/L~約11.8g/L、約5.1g/L~約11.6g/L、約5.1g/L~約11.4g/L、約5.1g/L~約11.2g/L、約5.1g/L~約11.0g/L、約5.1g/L~約10.8g/L、約5.1g/L~約10.6g/L、約5.1g/L~約10.4g/L、約5.1g/L~約10.2g/L、約5.1g/L~約10.0g/L、約5.1g/L~約9.8g/L、約5.1g/L~約9.6g/L、約5.1g/L~約9.4g/L、約5.1g/L~約9.2g/L、約5.1g/L~約9.0g/L、約5.1g/L~約8.8g/L、約5.1g/L~約8.6g/L、約5.1g/L~約8.4g/L、約5.1g/L~約8.2g/L、約5.1g/L~約8.0g/L、約5.1g/L~約7.8g/L、約5.1g/L~約7.6g/L、約5.1g/L~約7.4g/L、約5.1g/L~約7.2g/L、約5.1g/L~約7.0g/L、約5.1g/L~約6.9g/L、約5.1g/L~約6.8g/L、約5.1g/L~約6.6g/L、約5.1g/L~約6.4g/L、約5.1g/L~約6.2g/L、約5.1g/L~約6.1g/L、約5.2g/L~約16.0g/L、約5.2g/L~約15.8g/L、約5.2g/L~約15.6g/L、約5.2g/L~約15.4g/L、約5.2g/L~約15.2g/L、約5.2g/L~約15.0g/L、約5.2g/L~約14.8g/L、約5.2g/L~約14.6g/L、約5.2g/L~約14.4g/L、約5.2g/L~約14.2g/L、約5.2g/L~約14.0g/L、約5.2g/L~約13.8g/L、約5.2g/L~約13.6g/L、約5.2g/L~約13.4g/L、約5.2g/L~約13.2g/L、約5.2g/L~約13.0g/L、約5.2g/L~約12.8g/L、約5.2g/L~約12.6g/L、約5.2g/L~約12.4g/L、約5.2g/L~約12.2g/L、約5.2g/L~約12.0g/L、約5.2g/L~約11.8g/L、約5.2g/L~約11.6g/L、約5.2g/L~約11.4g/L、約5.2g/L~約11.2g/L、約5.2g/L~約11.0g/L、約5.2g/L~約10.8g/L、約5.2g/L~約10.6g/L、約5.2g/L~約10.4g/L、約5.2g/L~約10.2g/L、約5.2g/L~約10.0g/L、約5.2g/L~約9.8g/L、約5.2g/L~約9.6g/L、約5.2g/L~約9.4g/L、約5.2g/L~約9.2g/L、約5.2g/L~約9.0g/L、約5.2g/L~約8.8g/L、約5.2g/L~約8.6g/L、約5.2g/L~約8.4g/L、約5.2g/L~約8.2g/L、約5
.2g/L~約8.0g/L、約5.2g/L~約7.8g/L、約5.2g/L~約7.6g/L、約5.2g/L~約7.4g/L、約5.2g/L~約7.2g/L、約5.2g/L~約7.0g/L、約5.2g/L~約6.9g/L、約5.2g/L~約6.8g/L、約5.2g/L~約6.6g/L、約5.2g/L~約6.4g/L、約5.2g/L~約6.2g/L、約5.4g/L~約16.0g/L、約5.4g/L~約15.8g/L、約5.4g/L~約15.6g/L、約5.4g/L~約15.4g/L、約5.4g/L~約15.2g/L、約5.4g/L~約15.0g/L、約5.4g/L~約14.8g/L、約5.4g/L~約14.6g/L、約5.4g/L~約14.4g/L、約5.4g/L~約14.2g/L、約5.4g/L~約14.0g/L、約5.4g/L~約13.8g/L、約5.4g/L~約13.6g/L、約5.4g/L~約13.4g/L、約5.4g/L~約13.2g/L、約5.4g/L~約13.0g/L、約5.4g/L~約12.8g/L、約5.4g/L~約12.6g/L、約5.4g/L~約12.4g/L、約5.4g/L~約12.2g/L、約5.4g/L~約12.0g/L、約5.4g/L~約11.8g/L、約5.4g/L~約11.6g/L、約5.4g/L~約11.4g/L、約5.4g/L~約11.2g/L、約5.4g/L~約11.0g/L、約5.4g/L~約10.8g/L、約5.4g/L~約10.6g/L、約5.4g/L~約10.4g/L、約5.4g/L~約10.2g/L、約5.4g/L~約10.0g/L、約5.4g/L~約9.8g/L、約5.4g/L~約9.6g/L、約5.4g/L~約9.4g/L、約5.4g/L~約9.2g/L、約5.4g/L~約9.0g/L、約5.4g/L~約8.8g/L、約5.4g/L~約8.6g/L、約5.4g/L~約8.4g/L、約5.4g/L~約8.2g/L、約5.4g/L~約8.0g/L、約5.4g/L~約7.8g/L、約5.4g/L~約7.6g/L、約5.4g/L~約7.4g/L、約5.4g/L~約7.2g/L、約5.4g/L~約7.0g/L、約5.4g/L~約6.9g/L、約5.4g/L~約6.8g/L、約5.4g/L~約6.6g/L、約5.4g/L~約6.4g/L、約5.6g/L~約16.0g/L、約5.6g/L~約15.8g/L、約5.6g/L~約15.6g/L、約5.6g/L~約15.4g/L、約5.6g/L~約15.2g/L、約5.6g/L~約15.0g/L、約5.6g/L~約14.8g/L、約5.6g/L~約14.6g/L、約5.6g/L~約14.4g/L、約5.6g/L~約14.2g/L、約5.6g/L~約14.0g/L、約5.6g/L~約13.8g/L、約5.6g/L~約13.6g/L、約5.6g/L~約13.4g/L、約5.6g/L~約13.2g/L、約5.6g/L~約13.0g/L、約5.6g/L~約12.8g/L、約5.6g/L~約12.6g/L、約5.6g/L~約12.4g/L、約5.6g/L~約12.2g/L、約5.6g/L~約12.0g/L、約5.6g/L~約11.8g/L、約5.6g/L~約11.6g/L、約5.6g/L~約11.4g/L、約5.6g/L~約11.2g/L、約5.6g/L~約11.0g/L、約5.6g/L~約10.8g/L、約5.6g/L~約10.6g/L、約5.6g/L~約10.4g/L、約5.6g/L~約10.2g/L、約5.6g/L~約10.0g/L、約5.6g/L~約9.8g/L、約5.6g/L~約9.6g/L、約5.6g/L~約9.4g/L、約5.6g/L~約9.2g/L、約5.6g/L~約9.0g/L、約5.6g/L~約8.8g/L、約5.6g/L~約8.6g/L、約5.6g/L~約8.4g/L、約5.6g/L~約8.2g/L、約5.6g/L~約8.0g/L、約5.6g/L~約7.8g/L、約5.6g/L~約7.6g/L、約5.6g/L~約7.4g/L、約5.6g/L~約7.2g/L、約5.6g/L~約7.0g/L、約5.6g/L~約6.9g/L、約5.6g/L~約6.8g/L、約5.6g/L~約6.6g/L、約5.8g/L~約16.0g/L、約5.8g/L~約15.8g/L、約5.8g/L~約15.6g/L、約5.8g/L~約15.4g/L、約5.8g/L~約15.2g/L、約5.8g/L~約15.0g/L、約5.8g/L~約14.8g/L、約5.8g/L~約14.6g/L、約5.8g/L~約14.4g/L、約5.8g/L~約14.2g/L、約5.8g/L~約1
4.0g/L、約5.8g/L~約13.8g/L、約5.8g/L~約13.6g/L、約5.8g/L~約13.4g/L、約5.8g/L~約13.2g/L、
約5.8g/L~約13.0g/L、約5.8g/L~約12.8g/L、約5.8g/L~約12.6g/L、約5.8g/L~約12.4g/L、約5.8g/L~約12.2g/L、約5.8g/L~約12.0g/L、約5.8g/L~約11.8g/L、約5.8g/L~約11.6g/L、約5.8g/L~約11.4g/L、約5.8g/L~約11.2g/L、約5.8g/L~約11.0g/L、約5.8g/L~約10.8g/L、約5.8g/L~約10.6g/L、約5.8g/L~約10.4g/L、約5.8g/L~約10.2g/L、約5.8g/L~約10.0g/L、約5.8g/L~約9.8g/L、約5.8g/L~約9.6g/L、約5.8g/L~約9.4g/L、約5.8g/L~約9.2g/L、約5.8g/L~約9.0g/L、約5.8g/L~約8.8g/L、約5.8g/L~約8.6g/L、約5.8g/L~約8.4g/L、約5.8g/L~約8.2g/L、約5.8g/L~約8.0g/L、約5.8g/L~約7.8g/L、約5.8g/L~約7.6g/L、約5.8g/L~約7.4g/L、約5.8g/L~約7.2g/L、約5.8g/L~約7.0g/L、約5.8g/L~約6.9g/L、約5.8g/L~約6.8g/L、約6.0g/L~約16.0g/L、約6.0g/L~約15.8g/L、約6.0g/L~約15.6g/L、約6.0g/L~約15.4g/L、約6.0g/L~約15.2g/L、約6.0g/L~約15.0g/L、約6.0g/L~約14.8g/L、約6.0g/L~約14.6g/L、約6.0g/L~約14.4g/L、約6.0g/L~約14.2g/L、約6.0g/L~約14.0g/L、約6.0g/L~約13.8g/L、約6.0g/L~約13.6g/L、約6.0g/L~約13.4g/L、約6.0g/L~約13.2g/L、約6.0g/L~約13.0g/L、約6.0g/L~約12.8g/L、約6.0g/L~約12.6g/L、約6.0g/L~約12.4g/L、約6.0g/L~約12.2g/L、約6.0g/L~約12.0g/L、約6.0g/L~約11.8g/L、約6.0g/L~約11.6g/L、約6.0g/L~約11.4g/L、約6.0g/L~約11.2g/L、約6.0g/L~約11.0g/L、約6.0g/L~約10.8g/L、約6.0g/L~約10.6g/L、約6.0g/L~約10.4g/L、約6.0g/L~約10.2g/L、約6.0g/L~約10.0g/L、約6.0g/L~約9.8g/L、約6.0g/L~約9.6g/L、約6.0g/L~約9.4g/L、約6.0g/L~約9.2g/L、約6.0g/L~約9.0g/L、約6.0g/L~約8.8g/L、約6.0g/L~約8.6g/L、約6.0g/L~約8.4g/L、約6.0g/L~約8.2g/L、約6.0g/L~約8.0g/L、約6.0g/L~約7.8g/L、約6.0g/L~約7.6g/L、約6.0g/L~約7.4g/L、約6.0g/L~約7.2g/L、約6.0g/L~約7.0g/L、約6.2g/L~約16.0g/L、約6.2g/L~約15.8g/L、約6.2g/L~約15.6g/L、約6.2g/L~約15.4g/L、約6.2g/L~約15.2g/L、約6.2g/L~約15.0g/L、約6.2g/L~約14.8g/L、約6.2g/L~約14.6g/L、約6.2g/L~約14.4g/L、約6.2g/L~約14.2g/L、約6.2g/L~約14.0g/L、約6.2g/L~約13.8g/L、約6.2g/L~約13.6g/L、約6.2g/L~約13.4g/L、約6.2g/L~約13.2g/L、約6.2g/L~約13.0g/L、約6.2g/L~約12.8g/L、約6.2g/L~約12.6g/L、約6.2g/L~約12.4g/L、約6.2g/L~約12.2g/L、約6.2g/L~約12.0g/L、約6.2g/L~約11.8g/L、約6.2g/L~約11.6g/L、約6.2g/L~約11.4g/L、約6.2g/L~約11.2g/L、約6.2g/L~約11.0g/L、約6.2g/L~約10.8g/L、約6.2g/L~約10.6g/L、約6.2g/L~約10.4g/L、約6.2g/L~約10.2g/L、約6.2g/L~約10.0g/L、約6.2g/L~約9.8g/L、約6.2g/L~約9.6g/L、約6.2g/L~約9.4g/L、約6.2g/L~約9.2g/L、
約6.2g/L~約9.0g/L、約6.2g/L~約8.8g/L、約6.2g/L~約8.6g/L、約6.2g/L~約8.4g/L、約6.2g/L~約8.2g/L、約6.2g/L~約8.0g/L、約6.2g/L~約7.8g/L、約6.2g/L~約7.6g/L、約6.2g/L~約7.4g/L、約6.2g/L~約7.2g/L、約6.4g/L~約16.0g/L、約6.4g/L~約15.8g/L、約6.4g/L~約15.6g/L、約6.4g/L~約15.4g/L、約6.4g/L~約15.2g/L、約6.4g/L~約15.0g/L、約6.4g/L~約14.8g/L、約6.4g/L~約14.6g/L、約6.4g/L~約14.4g/L、約6.4g/L~約14.2g/L、約6.4g/L~約14.0g/L、約6.4g/L~約13.8g/L、約6.4g/L~約13.6g/L、約6.4g/L~約13.4g/L、約6.4g/L~約13.2g/L、約6.4g/L~約13.0g/L、約6.4g/L~約12.8g/L、約6.4g/L~約12.6g/L、約6.4g/L~約12.4g/L、約6.4g/L~約12.2g/L、約6.4g/L~約12.0g/L、約6.4g/L~約11.8g/L、約6.4g/L~約11.6g/L、約6.4g/L~約11.4g/L、約6.4g/L~約11.2g/L、約6.4g/L~約11.0g/L、約6.4g/L~約10.8g/L、約6.4g/L~約10.6g/L、約6.4g/L~約10.4g/L、約6.4g/L~約10.2g/L、約6.4g/L~約10.0g/L、約6.4g/L~約9.8g/L、約6.4g/L~約9.6g/L、約6.4g/L~約9.4g/L、約6.4g/L~約9.2g/L、約6.4g/L~約9.0g/L、約6.4g/L~約8.8g/L、約6.4g/L~約8.6g/L、約6.4g/L~約8.4g/L、約6.4g/L~約8.2g/L、約6.4g/L~約8.0g/L、約6.4g/L~約7.8g/L、約6.4g/L~約7.6g/L、約6.4g/L~約7.4g/L、約6.6g/L~約16.0g/L、約6.6g/L~約15.8g/L、約6.6g/L~約15.6g/L、約6.6g/L~約15.4g/L、約6.6g/L~約15.2g/L、約6.6g/L~約15.0g/L、約6.6g/L~約14.8g/L、約6.6g/L~約14.6g/L、約6.6g/L~約14.4g/L、約6.6g/L~約14.2g/L、約6.6g/L~約14.0g/L、約6.6g/L~約13.8g/L、約6.6g/L~約13.6g/L、約6.6g/L~約13.4g/L、約6.6g/L~約13.2g/L、約6.6g/L~約13.0g/L、約6.6g/L~約12.8g/L、約6.6g/L~約12.6g/L、約6.6g/L~約12.4g/L、約6.6g/L~約12.2g/L、約6.6g/L~約12.0g/L、約6.6g/L~約11.8g/L、約6.6g/L~約11.6g/L、約6.6g/L~約11.4g/L、約6.6g/L~約11.2g/L、約6.6g/L~約11.0g/L、約6.6g/L~約10.8g/L、約6.6g/L~約10.6g/L、約6.6g/L~約10.4g/L、約6.6g/L~約10.2g/L、約6.6g/L~約10.0g/L、約6.6g/L~約9.8g/L、約6.6g/L~約9.6g/L、約6.6g/L~約9.4g/L、約6.6g/L~約9.2g/L、約6.6g/L~約9.0g/L、約6.6g/L~約8.8g/L、約6.6g/L~約8.6g/L、約6.6g/L~約8.4g/L、約6.6g/L~約8.2g/L、約6.6g/L~約8.0g/L、約6.6g/L~約7.8g/L、約6.6g/L~約7.6g/L、約6.8g/L~約16.0g/L、約6.8g/L~約15.8g/L、約6.8g/L~約15.6g/L、約6.8g/L~約15.4g/L、約6.8g/L~約15.2g/L、約6.8g/L~約15.0g/L、約6.8g/L~約14.8g/L、約6.8g/L~約14.6g/L、約6.8g/L~約14.4g/L、約6.8g/L~約14.2g/L、約6.8g/L~約14.0g/L、約6.8g/L~約13.8g/L、約6.8g/L~約13.6g/L、約6.8g/L~約13.4g/L、約6.8g/L~約13.2g/L、約6.8g/L~約13.0g/L、約6.8g/L~約12.8g/L、約6.8g/L~約12.6g/L、約6.8g/L~約12.4g/L、約6.8g/L~約12.2g/L、約6.8g/L~約12.0g/L、約6.8g/L~約11.8g/L、約6.8g/L~約11.
6g/L、約6.8g/L~約11.4g/L、約6.8g/L~約11.2g/L、約6.8g/L~約11.0g/L、約6.8g/L~約10.8g/L、約6.8g/L~約10.6g/L、約6.8g/L~約10.4g/L、約6.8g/L~約10.2g/L、約6.8g/L~約10.0g/L、約6.8g/L~約9.8g/L、約6.8g/L~約9.6g/L、約6.8g/L~約9.4g/L、約6.8g/L~約9.2g/L、約6.8g/L~約9.0g/L、約6.8g/L~約8.8g/L、約6.8g/L~約8.6g/L、約6.8g/L~約8.4g/L、約6.8g/L~約8.2g/L、約6.8g/L~約8.0g/L、約6.8g/L~約7.8g/L、約7.0g/L~約16.0g/L、約7.0g/L~約15.8g/L、約7.0g/L~約15.6g/L、約7.0g/L~約15.4g/L、約7.0g/L~約15.2g/L、約7.0g/L~約15.0g/L、約7.0g/L~約14.8g/L、約7.0g/L~約14.6g/L、約7.0g/L~約14.4g/L、約7.0g/L~約14.2g/L、約7.0g/L~約14.0g/L、約7.0g/L~約13.8g/L、約7.0g/L~約13.6g/L、約7.0g/L~約13.4g/L、約7.0g/L~約13.2g/L、約7.0g/L~約13.0g/L、約7.0g/L~約12.8g/L、約7.0g/L~約12.6g/L、約7.0g/L~約12.4g/L、約7.0g/L~約12.2g/L、約7.0g/L~約12.0g/L、約7.0g/L~約11.8g/L、約7.0g/L~約11.6g/L、約7.0g/L~約11.4g/L、約7.0g/L~約11.2g/L、約7.0g/L~約11.0g/L、約7.0g/L~約10.8g/L、約7.0g/L~約10.6g/L、約7.0g/L~約10.4g/L、約7.0g/L~約10.2g/L、約7.0g/L~約10.0g/L、約7.0g/L~約9.8g/L、約7.0g/L~約9.6g/L、約7.0g/L~約9.4g/L、約7.0g/L~約9.2g/L、約7.0g/L~約9.0g/L、約7.0g/L~約8.8g/L、約7.0g/L~約8.6g/L、約7.0g/L~約8.4g/L、約7.0g/L~約8.2g/L、約7.0g/L~約8.0g/L、約7.2g/L~約16.0g/L、約7.2g/L~約15.8g/L、約7.2g/L~約15.6g/L、約7.2g/L~約15.4g/L、約7.2g/L~約15.2g/L、約7.2g/L~約15.0g/L、約7.2g/L~約14.8g/L、約7.2g/L~約14.6g/L、約7.2g/L~約14.4g/L、約7.2g/L~約14.2g/L、約7.2g/L~約14.0g/L、約7.2g/L~約13.8g/L、約7.2g/L~約13.6g/L、約7.2g/L~約13.4g/L、約7.2g/L~約13.2g/L、約7.2g/L~約13.0g/L、約7.2g/L~約12.8g/L、約7.2g/L~約12.6g/L、約7.2g/L~約12.4g/L、約7.2g/L~約12.2g/L、約7.2g/L~約12.0g/L、約7.2g/L~約11.8g/L、約7.2g/L~約11.6g/L、約7.2g/L~約11.4g/L、約7.2g/L~約11.2g/L、約7.2g/L~約11.0g/L、約7.2g/L~約10.8g/L、約7.2g/L~約10.6g/L、約7.2g/L~約10.4g/L、約7.2g/L~約10.2g/L、約7.2g/L~約10.0g/L、約7.2g/L~約9.8g/L、約7.2g/L~約9.6g/L、約7.2g/L~約9.4g/L、約7.2g/L~約9.2g/L、約7.2g/L~約9.0g/L、約7.2g/L~約8.8g/L、約7.2g/L~約8.6g/L、約7.2g/L~約8.4g/L、約7.2g/L~約8.2g/L、約7.4g/L~約16.0g/L、約7.4g/L~約15.8g/L、約7.4g/L~約15.6g/L、約7.4g/L~約15.4g/L、約7.4g/L~約15.2g/L、約7.4g/L~約15.0g/L、約7.4g/L~約14.8g/L、約7.4g/L~約14.6g/L、約7.4g/L~約14.4g/L、約7.4g/L~約14.2g/L、約7.4g/L~約14.0g/L、約7.4g/L~約13.8g/L、約7.4g/L~約13.6g/L、約7.4g/L~約13.4g/L、約7.4g/L~約13.2g/L、約7.4g/L~約13.0g/L、約7.4g/L~約12.8g/L、約7.4g/L~約12.6g/L、約7.4g/L~約12.4g/L、約7
.4g/L~約12.2g/L、約7.4g/L~約12.0g/L、約7.4g/L~約11.8g/L、約7.4g/L~約11.6g/L、約7.4g/L~約11.4g/L、約7.4g/L~約11.2g/L、約7.4g/L~約11.0g/L、約7.4g/L~約10.8g/L、約7.4g/L~約10.6g/L、約7.4g/L~約10.4g/L、約7.4g/L~約10.2g/L、約7.4g/L~約10.0g/L、約7.4g/L~約9.8g/L、約7.4g/L~約9.6g/L、約7.4g/L~約9.4g/L、約7.4g/L~約9.2g/L、約7.4g/L~約9.0g/L、約7.4g/L~約8.8g/L、約7.4g/L~約8.6g/L、約7.4g/L~約8.4g/L、約7.6g/L~約16.0g/L、約7.6g/L~約15.8g/L、約7.6g/L~約15.6g/L、約7.6g/L~約15.4g/L、約7.6g/L~約15.2g/L、約7.6g/L~約15.0g/L、約7.6g/L~約14.8g/L、約7.6g/L~約14.6g/L、約7.6g/L~約14.4g/L、約7.6g/L~約14.2g/L、約7.6g/L~約14.0g/L、約7.6g/L~約13.8g/L、約7.6g/L~約13.6g/L、約7.6g/L~約13.4g/L、約7.6g/L~約13.2g/L、約7.6g/L~約13.0g/L、約7.6g/L~約12.8g/L、約7.6g/L~約12.6g/L、約7.6g/L~約12.4g/L、約7.6g/L~約12.2g/L、約7.6g/L~約12.0g/L、約7.6g/L~約11.8g/L、約7.6g/L~約11.6g/L、約7.6g/L~約11.4g/L、約7.6g/L~約11.2g/L、約7.6g/L~約11.0g/L、約7.6g/L~約10.8g/L、約7.6g/L~約10.6g/L、約7.6g/L~約10.4g/L、約7.6g/L~約10.2g/L、約7.6g/L~約10.0g/L、約7.6g/L~約9.8g/L、約7.6g/L~約9.6g/L、約7.6g/L~約9.4g/L、約7.6g/L~約9.2g/L、約7.6g/L~約9.0g/L、約7.6g/L~約8.8g/L、約7.6g/L~約8.6g/L、約7.8g/L~約16.0g/L、約7.8g/L~約15.8g/L、約7.8g/L~約15.6g/L、約7.8g/L~約15.4g/L、約7.8g/L~約15.2g/L、約7.8g/L~約15.0g/L、約7.8g/L~約14.8g/L、約7.8g/L~約14.6g/L、
約7.8g/L~約14.4g/L、約7.8g/L~約14.2g/L、約7.8g/L~約14.0g/L、約7.8g/L~約13.8g/L、約7.8g/L~約13.6g/L、約7.8g/L~約13.4g/L、約7.8g/L~約13.2g/L、約7.8g/L~約13.0g/L、約7.8g/L~約12.8g/L、約7.8g/L~約12.6g/L、約7.8g/L~約12.4g/L、約7.8g/L~約12.2g/L、約7.8g/L~約12.0g/L、約7.8g/L~約11.8g/L、約7.8g/L~約11.6g/L、約7.8g/L~約11.4g/L、約7.8g/L~約11.2g/L、約7.8g/L~約11.0g/L、約7.8g/L~約10.8g/L、約7.8g/L~約10.6g/L、約7.8g/L~約10.4g/L、約7.8g/L~約10.2g/L、約7.8g/L~約10.0g/L、約7.8g/L~約9.8g/L、約7.8g/L~約9.6g/L、約7.8g/L~約9.4g/L、約7.8g/L~約9.2g/L、約7.8g/L~約9.0g/L、約7.8g/L~約8.8g/L、約8.0g/L~約16.0g/L、約8.0g/L~約15.8g/L、約8.0g/L~約15.6g/L、約8.0g/L~約15.4g/L、約8.0g/L~約15.2g/L、約8.0g/L~約15.0g/L、約8.0g/L~約14.8g/L、約8.0g/L~約14.6g/L、約8.0g/L~約14.4g/L、約8.0g/L~約14.2g/L、約8.0g/L~約14.0g/L、約8.0g/L~約13.8g/L、約8.0g/L~約13.6g/L、約8.0g/L~約13.4g/L、約8.0g/L~約13.2g/L、約8.0g/L~約13.0g/L、約8.0g/L~約12.8g/L、約8.0g/L~約12.6g/L、約8.0g/L~約12.4g/L、約8.0g/L~約12.2g/L、約8.0g/L~約12.0g/L、約8.0g/L~約11.8g/L、約8.0g/L~約11.6g/L、約8
.0g/L~約11.4g/L、
約8.0g/L~約11.2g/L、約8.0g/L~約11.0g/L、約8.0g/L~約10.8g/L、約8.0g/L~約10.6g/L、約8.0g/L~約10.4g/L、約8.0g/L~約10.2g/L、約8.0g/L~約10.0g/L、約8.0g/L~約9.8g/L、約8.0g/L~約9.6g/L、約8.0g/L~約9.4g/L、約8.0g/L~約9.2g/L、約8.0g/L~約9.0g/L、約8.5g/L~約16.0g/L、約8.5g/L~約15.5g/L、約8.5g/L~約15.0g/L、約8.5g/L~約14.5g/L、約8.5g/L~約14.0g/L、約8.5g/L~約13.5g/L、約8.5g/L~約13.0g/L、約8.5g/L~約12.5g/L、約8.5g/L~約12.0g/L、約8.5g/L~約11.5g/L、約8.5g/L~約11.0g/L、約8.5g/L~約10.5g/L、約8.5g/L~約10.0g/L、約8.5g/L~約9.5g/L、約9.0g/L~約16.0g/L、約9.0g/L~約15.5g/L、約9.0g/L~約15.0g/L、約9.0g/L~約14.5g/L、約9.0g/L~約14.0g/L、約9.0g/L~約13.5g/L、約9.0g/L~約13.0g/L、約9.0g/L~約12.5g/L、約9.0g/L~約12.0g/L、約9.0g/L~約11.5g/L、約9.0g/L~約11.0g/L、約9.0g/L~約10.5g/L、約9.0g/L~約10.0g/L、約9.5g/L~約16.0g/L、約9.5g/L~約15.5g/L、約9.5g/L~約15.0g/L、約9.5g/L~約14.5g/L、約9.5g/L~約14.0g/L、約9.5g/L~約13.5g/L、約9.5g/L~約13.0g/L、約9.5g/L~約12.5g/L、約9.5g/L~約12.0g/L、約9.5g/L~約11.5g/L、約9.5g/L~約11.0g/L、約9.5g/L~約10.5g/L、約10.0g/L~約16.0g/L、約10.0g/L~約15.5g/L、約10.0g/L~約15.0g/L、約10.0g/L~約14.5g/L、約10.0g/L~約14.0g/L、約10.0g/L~約13.5g/L、約10.0g/L~約13.0g/L、約10.0g/L~約12.5g/L、約10.0g/L~約12.0g/L、約10.0g/L~約11.5g/L、約10.0g/L~約11.0g/L、約10.5g/L~約16.0g/L、約10.5g/L~約15.5g/L、約10.5g/L~約15.0g/L、約10.5g/L~約14.5g/L、約10.5g/L~約14.0g/L、約10.5g/L~約13.5g/L、約10.5g/L~約13.0g/L、約10.5g/L~約12.5g/L、約10.5g/L~約12.0g/L、約10.5g/L~約11.5g/L、約11.0g/L~約16.0g/L、約11.0g/L~約15.5g/L、約11.0g/L~約15.0g/L、約11.0g/L~約14.5g/L、約11.0g/L~約14.0g/L、約11.0g/L~約13.5g/L、約11.0g/L~約13.0g/L、約11.0g/L~約12.5g/L、約11.0g/L~約12.0g/L、約11.5g/L~約16.0g/L、約11.5g/L~約15.5g/L、約11.5g/L~約15.0g/L、約11.5g/L~約14.5g/L、約11.5g/L~約14.0g/L、約11.5g/L~約13.5g/L、約11.5g/L~約13.0g/L、約11.5g/L~約12.5g/L、約12.0g/L~約16.0g/L、約12.0g/L~約15.5g/L、約12.0g/L~約15.0g/L、約12.0g/L~約14.5g/L、約12.0g/L~約14.0g/L、約12.0g/L~約13.5g/L、約12.0g/L~約13.0g/L、約12.5g/L~約16.0g/L、約12.5g/L~約15.5g/L、約12.5g/L~約15.0g/L、約12.5g/L~約14.5g/L、約12.5g/L~約14.0g/L、約12.5g/L~約13.5g/L、約13.0g/L~約16.0g/L、約13.0g/L~約15.5g/L、約13.0g/L~約15.0g/L、約13.0g/L~約14.5g/L、約13.0g/L~約14.0g/L、約13.5g/L~約16.0g/L、約13.5g/L~約15.5g/L、約13.5g/L~約15.0g/L、約13.5g/L~約14.5g/L、約14.0g/L~約16.0g/L、約
14.0g/L~約15.5g/L、約14.0g/L~約15.0g/L、約14.5g/L~約16.0g/L、約14.5g/L~約15.5g/L、または約15.0g/L~約16.0g/L)の濃度のポロクサマー-188を含む液体培地において、哺乳類細胞(例えば、組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞)を培養することを含む。
~約11.8g/L、約1.8g/L~約11.6g/L、約1.8g/L~約11.4g/L、約1.8g/L~約11.2g/L、約1.8g/L~約11.0g/L、約1.8g/L~約10.8g/L、約1.8g/L~約10.6g/L、約1.8g/L~約10.4g/L、約1.8g/L~約10.2g/L、約1.8g/L~約10.0g/L、約1.8g/L~約9.8g/L、約1.8g/L~約9.6g/L、約1.8g/L~約9.4g/L、約1.8g/L~約9.2g/L、約1.8g/L~約9.0g/L、約1.8g/L~約8.8g/L、約1.8g/L~約8.6g/L、約1.8g/L~約8.4g/L、約1.8g/L~約8.2g/L、約1.8g/L~約8.0g/L、約1.8g/L~約7.8g/L、約1.8g/L~約7.6g/L、約1.8g/L~約7.4g/L、約1.8g/L~約7.2g/L、約1.8g/L~約7.0g/L、約1.8g/L~約6.8g/L、約1.8g/L~約6.6g/L、約1.8g/L~約6.4g/L、1.8g/L~約6.2g/L、約1.8g/L~約6.0g/L、約1.8g/L~約5.8g/L、約1.8g/L~約5.6g/L、約1.8g/L~約5.4g/L、約1.8g/L~約5.2g/L、約1.8g/L~約5.0g/L、約1.8g/L~約4.8g/L、約1.8g/L~約4.6g/L、約1.8g/L~約4.4g/L、約1.8g/L~約4.2g/L、約1.8g/L~約4.0g/L、約1.8g/L~約3.8g/L、約1.8g/L~約3.6g/L、約1.8g/L~約3.4g/L、約1.8g/L~約3.2g/L、約1.8g/L~約3.0g/L、約1.8g/L~約2.8g/L、約2.0g/L~約16.0g/L、約2.0g/L~約15.8g/L、約2.0g/L~約15.6g/L、約2.0g/L~約15.4g/L、約2.0g/L~約15.2g/L、約2.0g/L~約15.0g/L、約2.0g/L~約14.8g/L、約2.0g/L~約14.6g/L、約2.0g/L~約14.4g/L、約2.0g/L~約14.2g/L、約2.0g/L~約14.0g/L、約2.0g/L~約13.8g/L、約2.0g/L~約13.6g/L、約2.0g/L~約13.4g/L、約2.0g/L~約13.2g/L、約2.0g/L~約13.0g/L、約2.0g/L~約12.8g/L、約2.0g/L~約12.6g/L、約2.0g/L~約12.4g/L、約2.0g/L~約12.2g/L、約2.0g/L~約12.0g/L、約2.0g/L~約11.8g/L、約2.0g/L~約11.6g/L、約2.0g/L~約11.4g/L、約2.0g/L~約11.2g/L、約2.0g/L~約11.0g/L、約2.0g/L~約10.8g/L、約2.0g/L~約10.6g/L、約2.0g/L~約10.4g/L、約2.0g/L~約10.2g/L、約2.0g/L~約10.0g/L、約2.0g/L~約9.8g/L、約2.0g/L~約9.6g/L、約2.0g/L~約9.4g/L、約2.0g/L~約9.2g/L、約2.0g/L~約9.0g/L、約2.0g/L~約8.8g/L、約2.0g/L~約8.6g/L、約2.0g/L~約8.4g/L、約2.0g/L~約8.2g/L、約2.0g/L~約8.0g/L、約2.0g/L~約7.8g/L、約2.0g/L~約7.6g/L、約2.0g/L~約7.4g/L、約2.0g/L~約7.2g/L、約2.0g/L~約7.0g/L、約2.0g/L~約6.8g/L、約2.0g/L~約6.6g/L、約2.0g/L~約6.4g/L、約2.0g/L~約6.2g/L、約2.0g/L~約6.0g/L、約2.0g/L~約5.8g/L、約2.0g/L~約5.6g/L、約2.0g/L~約5.4g/L、約2.0g/L~約5.2g/L、約2.0g/L~約5.0g/L、約2.0g/L~約4.8g/L、約2.0g/L~約4.6g/L、約2.0g/L~約4.4g/L、約2.0g/L~約4.2g/L、約2.0g/L~約4.0g/L、約2.0g/L~約3.8g/L、約2.0g/L~約3.6g/L、約2.0g/L~約3.4g/L、約2.0g/L~約3.2g/L、約2.0g/L~約3.0g/L、約2.2g/L~約16.0g/L、約2.2g/L~約15.8g/L、約2.2g/L~約15.6g/L、約2.2g/L~約15.4g/L、約2.2g/L~約15.2g/L、約2.2g/L~約15.0g/L、約2.2g/L~約14.8g/L、約2.2g/L~約14.6g/L、約2.2g/L~約14.4g/L、約2.2g/L~約14.2g/L、約2.2g
/L~約14.0g/L、約2.2g/L~約13.8g/L、約2.2g/L~約13.6g/L、約2.2g/L~約13.4g/L、約2.2g/L~約13.2g/L、約2.2g/L~約13.0g/L、約2.2g/L~約12.8g/L、約2.2g/L~約12.6g/L、約2.2g/L~約12.4g/L、約2.2g/L~約12.2g/L、約2.2g/L~約12.0g/L、約2.2g/L~約11.8g/L、約2.2g/L~約11.6g/L、約2.2g/L~約11.4g/L、約2.2g/L~約11.2g/L、約2.2g/L~約11.0g/L、約2.2g/L~約10.8g/L、約2.2g/L~約10.6g/L.約2.2g/L~約10.4g/L、約2.2g/L~約10.2g/L、約2.2g/L~約10.0g/L、約2.2g/L~約9.8g/L、約2.2g/L~約9.6g/L、約2.2g/L~約9.4g/L、約2.2g/L~約9.2g/L、約2.2g/L~約9.0g/L、約2.2g/L~約8.8g/L、約2.2g/L~約8.6g/L、約2.2g/L~約8.4g/L、約2.2g/L~約8.2g/L、約2.2g/L~約8.0g/L、約2.2g/L~約7.8g/L、約2.2g/L~約7.6g/L、約2.2g/L~約7.4g/L、約2.2g/L~約7.2g/L、約2.2g/L~約7.0g/L、約2.2g/L~約6.9g/L、約2.2g/L~約6.8g/L、約2.2g/L~約6.6g/L、約2.2g/L~約6.4g/L、約2.2g/L~約6.2g/L、約2.2g/L~約6.0g/L、約2.2g/L~約5.8g/L、約2.2g/L~約5.6g/L、約2.2g/L~約5.4g/L、約2.2g/L~約5.2g/L、約2.2g/L~約5.0g/L、約2.2g/L~約4.8g/L、約2.2g/L~約4.6g/L、約2.2g/L~約4.4g/L、約2.2g/L~約4.2g/L、約2.2g/L~約4.0g/L、約2.2g/L~約3.8g/L、約2.2g/L~約3.6g/L、約2.2g/L~約3.4g/L、約2.2g/L~約3.2g/L、約2.4g/L~約16.0g/L、約2.4g/L~約15.8g/L、約2.4g/L~約15.6g/L、約2.4g/L~約15.4g/L、約2.4g/L~約15.2g/L、約2.4g/L~約15.0g/L、約2.4g/L~約14.8g/L、約2.4g/L~約14.6g/L、約2.4g/L~約14.4g/L、約2.4g/L~約14.2g/L、約2.4g/L~約14.0g/L、約2.4g/L~約13.8g/L、約2.4g/L~約13.6g/L、約2.4g/L~約13.4g/L、約2.4g/L~約13.2g/L、約2.4g/L~約13.0g/L、約2.4g/L~約12.8g/L、約2.4g/L~約12.6g/L、約2.4g/L~約12.4g/L、約2.4g/L~約12.2g/L、約2.4g/L~約12.0g/L、約2.4g/L~約11.8g/L、約2.4g/L~約11.6g/L、約2.4g/L~約11.4g/L、約2.4g/L~約11.2g/L、約2.4g/L~約11.0g/L、約2.4g/L~約10.8g/L、約2.4g/L~約10.6g/L、約2.4g/L~約10.4g/L、約2.4g/L~約10.2g/L、約2.4g/L~約10.0g/L、約2.4g/L~約9.8g/L、約2.4g/L~約9.6g/L、約2.4g/L~約9.4g/L、約2.4g/L~約9.2g/L、約2.4g/L~約9.0g/L、約2.4g/L~約8.8g/L、約2.4g/L~約8.6g/L、約2.4g/L~約8.4g/L、約2.4g/L~約8.2g/L、約2.4g/L~約8.0g/L、約2.4g/L~約7.8g/L、約2.4g/L~約7.6g/L、約2.4g/L~約7.4g/L、約2.4g/L~約7.2g/L、約2.4g/L~約7.0g/L、約2.4g/L~約6.9g/L、約2.4g/L~約6.8g/L、約2.4g/L~約6.6g/L、約2.4g/L~約6.4g/L、約2.4g/L~約6.2g/L、約2.4g/L~約6.0g/L、約2.4g/L~約5.8g/L、約2.4g/L~約5.6g/L、約2.4g/L~約5.4g/L、約2.4g/L~約5.2g/L、約2.4g/L~約5.0g/L、約2.4g/L~約4.8g/L、約2.4g/L~約4.6g/L、約2.4g/L~約4.4g/L、約2.4g/L~約4.2g/L、約2.4g/L~約4.0g/L、約2.4g/L~約3.8g/L、約2.4g/L~約3.6g/L、約2.4g/L~約3.4g/L、約2.6g/L~約16.0g/L、
約2.6g/L~約15.8g/L、約2.6g/L~約15.6g/L、約2.6g/L~約15.4g/L、約2.6g/L~約15.2g/L、約2.6g/L~約15.0g/L、約2.6g/L~約14.8g/L、約2.6g/L~約14.6g/L、約2.6g/L~約14.4g/L、約2.6g/L~約14.2g/L、約2.6g/L~約14.0g/L、約2.6g/L~約13.8g/L、約2.6g/L~約13.6g/L、約2.6g/L~約13.4g/L、約2.6g/L~約13.2g/L、約2.6g/L~約13.0g/L、約2.6g/L~約12.8g/L、約2.6g/L~約12.6g/L、約2.6g/L~約12.4g/L、約2.6g/L~約12.2g/L、約2.6g/L~約12.0g/L、約2.6g/L~約11.8g/L、約2.6g/L~約11.6g/L、約2.6g/L~約11.4g/L、約2.6g/L~約11.2g/L、約2.6g/L~約11.0g/L、約2.6g/L~約10.8g/L、約2.6g/L~約10.6g/L.約2.6g/L~約10.4g/L、約2.6g/L~約10.2g/L、約2.6g/L~約10.0g/L、約2.6g/L~約9.8g/L、約2.6g/L~約9.6g/L、約2.6g/L~約9.4g/L、約2.6g/L~約9.2g/L、約2.6g/L~約9.0g/L、約2.6g/L~約8.8g/L、約2.6g/L~約8.6g/L、約2.6g/L~約8.4g/L、約2.6g/L~約8.2g/L、約2.6g/L~約8.0g/L、約2.6g/L~約7.8g/L、約2.6g/L~約7.6g/L、約2.6g/L~約7.4g/L、
約2.6g/L~約7.2g/L、約2.6g/L~約7.0g/L、約2.6g/L~約6.9g/L、約2.6g/L~約6.8g/L、約2.6g/L~約6.6g/L、約2.6g/L~約6.4g/L、約2.6g/L~約6.2g/L、約2.6g/L~約6.0g/L、約2.6g/L~約5.8g/L、約2.6g/L~約5.6g/L、約2.6g/L~約5.4g/L、約2.6g/L~約5.2g/L、約2.6g/L~約5.0g/L、約2.6g/L~約4.8g/L、約2.6g/L~約4.6g/L、約2.6g/L~約4.4g/L、約2.6g/L~約4.2g/L、約2.6g/L~約4.0g/L、約2.6g/L~約3.8g/L、約2.6g/L~約3.6g/L、約2.8g/L~約16.0g/L、約2.8g/L~約15.8g/L、約2.8g/L~約15.6g/L、約2.8g/L~約15.4g/L、約2.8g/L~約15.2g/L、約2.8g/L~約15.0g/L、約2.8g/L~約14.8g/L、約2.8g/L~約14.6g/L、約2.8g/L~約14.4g/L、約2.8g/L~約14.2g/L、約2.8g/L~約14.0g/L、約2.8g/L~約13.8g/L、約2.8g/L~約13.6g/L、約2.8g/L~約13.4g/L、約2.8g/L~約13.2g/L、約2.8g/L~約13.0g/L、約2.8g/L~約12.8g/L、約2.8g/L~約12.6g/L、約2.8g/L~約12.4g/L、約2.8g/L~約12.2g/L、約2.8g/L~約12.0g/L、約2.8g/L~約11.8g/L、約2.8g/L~約11.6g/L、約2.8g/L~約11.4g/L、約2.8g/L~約11.2g/L、約2.8g/L~約11.0g/L、約2.8g/L~約10.8g/L、約2.8g/L~約10.6g/L、約2.8g/L~約10.4g/L、約2.8g/L~約10.2g/L、約2.8g/L~約10.0g/L、約2.8g/L~約9.8g/L、約2.8g/L~約9.6g/L、約2.8g/L~約9.4g/L、約2.8g/L~約9.2g/L、約2.8g/L~約9.0g/L、約2.8g/L~約8.8g/L、約2.8g/L~約8.6g/L、約2.8g/L~約8.4g/L、約2.8g/L~約8.2g/L、約2.8g/L~約8.0g/L、約2.8g/L~約7.8g/L、約2.8g/L~約7.6g/L、約2.8g/L~約7.4g/L、約2.8g/L~約7.2g/L、約2.8g/L~約7.0g/L、約2.8g/L~約6.9g/L、約2.8g/L~約6.8g/L、約2.8g/L~約6.6g/L、約2.8g/L~約6.4g/L、約2.8g/L~約6.2g/L、約2.8g/L~約6.0g/L、約2.8g/L~約5.8g/L、約2.8g/L~約5.6g/L、約2.8g/L~約5.4g/L、約2.8g/L~約5.2g/L、約2.8g/L~約5.0g/L、約2.8g/L~約4.8g/L、約
2.8g/L~約4.6g/L、約2.8g/L~約4.4g/L、約2.8g/L~約4.2g/L、約2.8g/L~約4.0g/L、約2.8g/L~約3.8g/L、約3.0g/L~約16.0g/L、約3.0g/L~約15.8g/L、約3.0g/L~約15.6g/L、約3.0g/L~約15.4g/L、約3.0g/L~約15.2g/L、約3.0g/L~約15.0g/L、約3.0g/L~約14.8g/L、約3.0g/L~約14.6g/L、約3.0g/L~約14.4g/L、約3.0g/L~約14.2g/L、約3.0g/L~約14.0g/L、約3.0g/L~約13.8g/L、約3.0g/L~約13.6g/L、約3.0g/L~約13.4g/L、約3.0g/L~約13.2g/L、約3.0g/L~約13.0g/L、約3.0g/L~約12.8g/L、約3.0g/L~約12.6g/L、約3.0g/L~約12.4g/L、約3.0g/L~約12.2g/L、約3.0g/L~約12.0g/L、約3.0g/L~約11.8g/L、約3.0g/L~約11.6g/L、約3.0g/L~約11.4g/L、約3.0g/L~約11.2g/L、約3.0g/L~約11.0g/L、約3.0g/L~約10.8g/L、約3.0g/L~約10.6g/L、約3.0g/L~約10.4g/L、約3.0g/L~約10.2g/L、約3.0g/L~約10.0g/L、約3.0g/L~約9.8g/L、約3.0g/L~約9.6g/L、約3.0g/L~約9.4g/L、約3.0g/L~約9.2g/L、約3.0g/L~約9.0g/L、約3.0g/L~約8.8g/L、約3.0g/L~約8.6g/L、約3.0g/L~約8.4g/L、約3.0g/L~約8.2g/L、約3.0g/L~約8.0g/L、約3.0g/L~約7.8g/L、約3.0g/L~約7.6g/L、約3.0g/L~約7.4g/L、約3.0g/L~約7.2g/L、約3.0g/L~約7.0g/L、約3.0g/L~約6.9g/L、約3.0g/L~約6.8g/L、約3.0g/L~約6.6g/L、約3.0g/L~約6.4g/L、約3.0g/L~約6.2g/L、約3.0g/L~約6.0g/L、約3.0g/L~約5.8g/L、約3.0g/L~約5.6g/L、約3.0g/L~約5.4g/L、約3.0g/L~約5.2g/L、約3.0g/L~約5.0g/L、約3.0g/L~約4.8g/L、約3.0g/L~約4.6g/L、約3.0g/L~約4.4g/L、約3.0g/L~約4.2g/L、約3.0g/L~約4.0g/L、約3.2g/L~約16.0g/L、約3.2g/L~約15.8g/L、約3.2g/L~約15.6g/L、約3.2g/L~約15.4g/L、約3.2g/L~約15.2g/L、約3.2g/L~約15.0g/L、約3.2g/L~約14.8g/L、約3.2g/L~約14.6g/L、約3.2g/L~約14.4g/L、約3.2g/L~約14.2g/L、約3.2g/L~約14.0g/L、約3.2g/L~約13.8g/L、約3.2g/L~約13.6g/L、約3.2g/L~約13.4g/L、約3.2g/L~約13.2g/L、約3.2g/L~約13.0g/L、約3.2g/L~約12.8g/L、約3.2g/L~約12.6g/L、約3.2g/L~約12.4g/L、約3.2g/L~約12.2g/L、約3.2g/L~約12.0g/L、約3.2g/L~約11.8g/L、約3.2g/L~約11.6g/L、約3.2g/L~約11.4g/L、約3.2g/L~約11.2g/L、約3.2g/L~約11.0g/L、約3.2g/L~約10.8g/L、約3.2g/L~約10.6g/L、約3.2g/L~約10.4g/L、約3.2g/L~約10.2g/L、約3.2g/L~約10.0g/L、約3.2g/L~約9.8g/L、約3.2g/L~約9.6g/L、約3.2g/L~約9.4g/L、約3.2g/L~約9.2g/L、約3.2g/L~約9.0g/L、約3.2g/L~約8.8g/L、約3.2g/L~約8.6g/L、約3.2g/L~約8.4g/L、約3.2g/L~約8.2g/L、約3.2g/L~約8.0g/L、約3.2g/L~約7.8g/L、約3.2g/L~約7.6g/L、約3.2g/L~約7.4g/L、約3.2g/L~約7.2g/L、約3.2g/L~約7.0g/L、約3.2g/L~約6.9g/L、約3.2g/L~約6.8g/L、約3.2g/L~約6.6g/L、約3.2g/L~約6.4g/L、約3.2g/L~約6.2g/L、約3.2g/L~約6.0g/L、約3.2g/L~約5.8g/L、約3.2g/L~約5.6g/L、約3.
2g/L~約5.4g/L、約3.2g/L~約5.2g/L、約3.2g/L~約5.0g/L、約3.2g/L~約4.8g/L、約3.2g/L~約4.6g/L、約3.2g/L~約4.4g/L、約3.2g/L~約4.2g/L、約3.4g/L~約16.0g/L、約3.4g/L~約15.8g/L、約3.4g/L~約15.6g/L、約3.4g/L~約15.4g/L、約3.4g/L~約15.2g/L、約3.4g/L~約15.0g/L、約3.4g/L~約14.8g/L、約3.4g/L~約14.6g/L、約3.4g/L~約14.4g/L、約3.4g/L~約14.2g/L、約3.4g/L~約14.0g/L、約3.4g/L~約13.8g/L、約3.4g/L~約13.6g/L、約3.4g/L~約13.4g/L、約3.4g/L~約13.2g/L、約3.4g/L~約13.0g/L、約3.4g/L~約12.8g/L、約3.4g/L~約12.6g/L、約3.4g/L~約12.4g/L、約3.4g/L~約12.2g/L、約3.4g/L~約12.0g/L、約3.4g/L~約11.8g/L、約3.4g/L~約11.6g/L、約3.4g/L~約11.4g/L、約3.4g/L~約11.2g/L、約3.4g/L~約11.0g/L、約3.4g/L~約10.8g/L、約3.4g/L~約10.6g/L、約3.4g/L~約10.4g/L、約3.4g/L~約10.2g/L、約3.4g/L~約10.0g/L、約3.4g/L~約9.8g/L、約3.4g/L~約9.6g/L、約3.4g/L~約9.4g/L、約3.4g/L~約9.2g/L、約3.4g/L~約9.0g/L、約3.4g/L~約8.8g/L、約3.4g/L~約8.6g/L、約3.4g/L~約8.4g/L、約3.4g/L~約8.2g/L、約3.4g/L~約8.0g/L、約3.4g/L~約7.8g/L、約3.4g/L~約7.6g/L、約3.4g/L~約7.4g/L、約3.4g/L~約7.2g/L、約3.4g/L~約7.0g/L、約3.4g/L~約6.9g/L、約3.4g/L~約6.8g/L、約3.4g/L~約6.6g/L、約3.4g/L~約6.4g/L、約3.4g/L~約6.2g/L、約3.4g/L~約6.0g/L、約3.4g/L~約5.8g/L、約3.4g/L~約5.6g/L、約3.4g/L~約5.4g/L、約3.4g/L~約5.2g/L、約3.4g/L~約5.0g/L、約3.4g/L~約4.8g/L、約3.4g/L~約4.6g/L、約3.4g/L~約4.4g/L、約3.6g/L~約16.0g/L、約3.6g/L~約15.8g/L、約3.6g/L~約15.6g/L、約3.6g/L~約15.4g/L、約3.6g/L~約15.2g/L、約3.6g/L~約15.0g/L、約3.6g/L~約14.8g/L、約3.6g/L~約14.6g/L、約3.6g/L~約14.4g/L、約3.6g/L~約14.2g/L、約3.6g/L~約14.0g/L、約3.6g/L~約13.8g/L、約3.6g/L~約13.6g/L、約3.6g/L~約13.4g/L、約3.6g/L~約13.2g/L、約3.6g/L~約13.0g/L、約3.6g/L~約12.8g/L、約3.6g/L~約12.6g/L、約3.6g/L~約12.4g/L、約3.6g/L~約12.2g/L、約3.6g/L~約12.0g/L、約3.6g/L~約11.8g/L、約3.6g/L~約11.6g/L、約3.6g/L~約11.4g/L、約3.6g/L~約11.2g/L、約3.6g/L~約11.0g/L、約3.6g/L~約10.8g/L、約3.6g/L~約10.6g/L、約3.6g/L~約10.4g/L、約3.6g/L~約10.2g/L、約3.6g/L~約10.0g/L、約3.6g/L~約9.8g/L、約3.6g/L~約9.6g/L、約3.6g/L~約9.4g/L、約3.6g/L~約9.2g/L、約3.6g/L~約9.0g/L、約3.6g/L~約8.8g/L、約3.6g/L~約8.6g/L、約3.6g/L~約8.4g/L、約3.6g/L~約8.2g/L、約3.6g/L~約8.0g/L、約3.6g/L~約7.8g/L、約3.6g/L~約7.6g/L、約3.6g/L~約7.4g/L、
約3.6g/L~約7.2g/L、約3.6g/L~約7.0g/L、約3.6g/L~約6.9g/L、約3.6g/L~約6.8g/L、約3.6g/L~約6.6g/L、約3.6g/L~約6.4g/L、約3.6g/L~約6.2g/L、約3.6g/L~約6.0g/L、約3.6g/L~約5.8g/L、約3.6g/L~約5.6g/L、
約3.6g/L~約5.4g/L、約3.6g/L~約5.2g/L、約3.6g/L~約5.0g/L、約3.6g/L~約4.8g/L、約3.6g/L~約4.6g/L、約3.8g/L~約16.0g/L、約3.8g/L~約15.8g/L、約3.8g/L~約15.6g/L、約3.8g/L~約15.4g/L、約3.8g/L~約15.2g/L、約3.8g/L~約15.0g/L、約3.8g/L~約14.8g/L、約3.8g/L~約14.6g/L、約3.8g/L~約14.4g/L、約3.8g/L~約14.2g/L、約3.8g/L~約14.0g/L、約3.8g/L~約13.8g/L、約3.8g/L~約13.6g/L、約3.8g/L~約13.4g/L、約3.8g/L~約13.2g/L、約3.8g/L~約13.0g/L、約3.8g/L~約12.8g/L、約3.8g/L~約12.6g/L、約3.8g/L~約12.4g/L、約3.8g/L~約12.2g/L、約3.8g/L~約12.0g/L、約3.8g/L~約11.8g/L、約3.8g/L~約11.6g/L、約3.8g/L~約11.4g/L、約3.8g/L~約11.2g/L、約3.8g/L~約11.0g/L、約3.8g/L~約10.8g/L、約3.8g/L~約10.6g/L、約3.8g/L~約10.4g/L、約3.8g/L~約10.2g/L、約3.8g/L~約10.0g/L、約3.8g/L~約9.8g/L、約3.8g/L~約9.6g/L、約3.8g/L~約9.4g/L、約3.8g/L~約9.2g/L、約3.8g/L~約9.0g/L、約3.8g/L~約8.8g/L、約3.8g/L~約8.6g/L、約3.8g/L~約8.4g/L、約3.8g/L~約8.2g/L、約3.8g/L~約8.0g/L、約3.8g/L~約7.8g/L、約3.8g/L~約7.6g/L、約3.8g/L~約7.4g/L、約3.8g/L~約7.2g/L、約3.8g/L~約7.0g/L、約3.8g/L~約6.9g/L、約3.8g/L~約6.8g/L、約3.8g/L~約6.6g/L、約3.8g/L~約6.4g/L、約3.8g/L~約6.2g/L、約3.8g/L~約6.0g/L、約3.8g/L~約5.8g/L、約3.8g/L~約5.6g/L、約3.8g/L~約5.4g/L、約3.8g/L~約5.2g/L、約3.8g/L~約5.0g/L、約3.8g/L~約4.8g/L、約4.0g/L~約16.0g/L、約4.0g/L~約15.8g/L、約4.0g/L~約15.6g/L、約4.0g/L~約15.4g/L、約4.0g/L~約15.2g/L、約4.0g/L~約15.0g/L、約4.0g/L~約14.8g/L、約4.0g/L~約14.6g/L、約4.0g/L~約14.4g/L、約4.0g/L~約14.2g/L、約4.0g/L~約14.0g/L、約4.0g/L~約13.8g/L、約4.0g/L~約13.6g/L、約4.0g/L~約13.4g/L、約4.0g/L~約13.2g/L、約4.0g/L~約13.0g/L、約4.0g/L~約12.8g/L、約4.0g/L~約12.6g/L、約4.0g/L~約12.4g/L、約4.0g/L~約12.2g/L、約4.0g/L~約12.0g/L、約4.0g/L~約11.8g/L、約4.0g/L~約11.6g/L、約4.0g/L~約11.4g/L、約4.0g/L~約11.2g/L、約4.0g/L~約11.0g/L、約4.0g/L~約10.8g/L、約4.0g/L~約10.6g/L、約4.0g/L~約10.4g/L、約4.0g/L~約10.2g/L、約4.0g/L~約10.0g/L、約4.0g/L~約9.8g/L、約4.0g/L~約9.6g/L、約4.0g/L~約9.4g/L、約4.0g/L~約9.2g/L、約4.0g/L~約9.0g/L、約4.0g/L~約8.8g/L、約4.0g/L~約8.6g/L、約4.0g/L~約8.4g/L、約4.0g/L~約8.2g/L、約4.0g/L~約8.0g/L、約4.0g/L~約7.8g/L、約4.0g/L~約7.6g/L、約4.0g/L~約7.4g/L、約4.0g/L~約7.2g/L、約4.0g/L~約7.0g/L、約4.0g/L~約6.9g/L、約4.0g/L~約6.8g/L、約4.0g/L~約6.6g/L、約4.0g/L~約6.4g/L、約4.0g/L~約6.2g/L、約4.0g/L~約6.0g/L、約4.0g/L~約5.8g/L、約4.0g/L~約5.6g/L、約4.0g/L~約5.4g/L、約4.0g/L~約5.2g/L、約4.0g/L~約5.0g/L、約4.2g/L~約16.0g/L、約
4.2g/L~約15.8g/L、約4.2g/L~約15.6g/L、約4.2g/L~約15.4g/L、約4.2g/L~約15.2g/L、約4.2g/L~約15.0g/L、約4.2g/L~約14.8g/L、約4.2g/L~約14.6g/L、約4.2g/L~約14.4g/L、約4.2g/L~約14.2g/L、約4.2g/L~約14.0g/L、約4.2g/L~約13.8g/L、約4.2g/L~約13.6g/L、約4.2g/L~約13.4g/L、約4.2g/L~約13.2g/L、約4.2g/L~約13.0g/L、約4.2g/L~約12.8g/L、約4.2g/L~約12.6g/L、約4.2g/L~約12.4g/L、約4.2g/L~約12.2g/L、約4.2g/L~約12.0g/L、約4.2g/L~約11.8g/L、約4.2g/L~約11.6g/L、約4.2g/L~約11.4g/L、約4.2g/L~約11.2g/L、約4.2g/L~約11.0g/L、約4.2g/L~約10.8g/L、約4.2g/L~約10.6g/L、約4.2g/L~約10.4g/L、約4.2g/L~約10.2g/L、約4.2g/L~約10.0g/L、約4.2g/L~約9.8g/L、約4.2g/L~約9.6g/L、約4.2g/L~約9.4g/L、約4.2g/L~約9.2g/L、約4.2g/L~約9.0g/L、約4.2g/L~約8.8g/L、約4.2g/L~約8.6g/L、約4.2g/L~約8.4g/L、約4.2g/L~約8.2g/L、約4.2g/L~約8.0g/L、約4.2g/L~約7.8g/L、約4.2g/L~約7.6g/L、約4.2g/L~約7.4g/L、約4.2g/L~約7.2g/L、約4.2g/L~約7.0g/L、約4.2g/L~約6.9g/L、約4.2g/L~約6.8g/L、約4.2g/L~約6.6g/L、約4.2g/L~約6.4g/L、約4.2g/L~約6.2g/L、約4.2g/L~約6.0g/L、約4.2g/L~約5.8g/L、約4.2g/L~約5.6g/L、約4.2g/L~約5.4g/L、約4.2g/L~約5.2g/L、約4.4g/L~約16.0g/L、約4.4g/L~約15.8g/L、約4.4g/L~約15.6g/L、約4.4g/L~約15.4g/L、約4.4g/L~約15.2g/L、約4.4g/L~約15.0g/L、約4.4g/L~約14.8g/L、約4.4g/L~約14.6g/L、約4.4g/L~約14.4g/L、約4.4g/L~約14.2g/L、約4.4g/L~約14.0g/L、約4.4g/L~約13.8g/L、約4.4g/L~約13.6g/L、約4.4g/L~約13.4g/L、約4.4g/L~約13.2g/L、約4.4g/L~約13.0g/L、約4.4g/L~約12.8g/L、約4.4g/L~約12.6g/L、約4.4g/L~約12.4g/L、約4.4g/L~約12.2g/L、約4.4g/L~約12.0g/L、約4.4g/L~約11.8g/L、約4.4g/L~約11.6g/L、約4.4g/L~約11.4g/L、約4.4g/L~約11.2g/L、約4.4g/L~約11.0g/L、約4.4g/L~約10.8g/L、約4.4g/L~約10.6g/L、約4.4g/L~約10.4g/L、約4.4g/L~約10.2g/L、約4.4g/L~約10.0g/L、約4.4g/L~約9.8g/L、約4.4g/L~約9.6g/L、約4.4g/L~約9.4g/L、約4.4g/L~約9.2g/L、約4.4g/L~約9.0g/L、約4.4g/L~約8.8g/L、約4.4g/L~約8.6g/L、約4.4g/L~約8.4g/L、約4.4g/L~約8.2g/L、約4.4g/L~約8.0g/L、約4.4g/L~約7.8g/L、約4.4g/L~約7.6g/L、約4.4g/L~約7.4g/L、約4.4g/L~約7.2g/L、約4.4g/L~約7.0g/L、約4.4g/L~約6.9g/L、約4.4g/L~約6.8g/L、約4.4g/L~約6.6g/L、約4.4g/L~約6.4g/L、約4.4g/L~約6.2g/L、約4.4g/L~約6.0g/L、約4.4g/L~約5.8g/L、約4.4g/L~約5.6g/L、約4.4g/L~約5.4g/L、約4.6g/L~約16.0g/L、約4.6g/L~約15.8g/L、約4.6g/L~約15.6g/L、約4.6g/L~約15.4g/L、約4.6g/L~約15.2g/L、約4.6g/L~約15.0g/L、約4.6g/L~約14.8g/L、約4.6g/L~約14.6g/L、約4.6g/L~約14.4g/L、約4.6g/L~約14.2g/L、約4.6g/L~約1
4.0g/L、約4.6g/L~約13.8g/L、約4.6g/L~約13.6g/L、約4.6g/L~約13.4g/L、約4.6g/L~約13.2g/L、約4.6g/L~約13.0g/L、約4.6g/L~約12.8g/L、約4.6g/L~約12.6g/L、約4.6g/L~約12.4g/L、約4.6g/L~約12.2g/L、約4.6g/L~約12.0g/L、約4.6g/L~約11.8g/L、約4.6g/L~約11.6g/L、約4.6g/L~約11.4g/L、約4.6g/L~約11.2g/L、約4.6g/L~約11.0g/L、約4.6g/L~約10.8g/L、約4.6g/L~約10.6g/L、約4.6g/L~約10.4g/L、約4.6g/L~約10.2g/L、約4.6g/L~約10.0g/L、約4.6g/L~約9.8g/L、約4.6g/L~約9.6g/L、約4.6g/L~約9.4g/L、約4.6g/L~約9.2g/L、約4.6g/L~約9.0g/L、約4.6g/L~約8.8g/L、約4.6g/L~約8.6g/L、約4.6g/L~約8.4g/L、約4.6g/L~約8.2g/L、約4.6g/L~約8.0g/L、約4.6g/L~約7.8g/L、約4.6g/L~約7.6g/L、約4.6g/L~約7.4g/L、約4.6g/L~約7.2g/L、約4.6g/L~約7.0g/L、約4.6g/L~約6.9g/L、約4.6g/L~約6.8g/L、約4.6g/L~約6.6g/L、約4.6g/L~約6.4g/L、約4.6g/L~約6.2g/L、約4.6g/L~約6.0g/L、約4.6g/L~約5.8g/L、約4.6g/L~約5.6g/L、約4.8g/L~約16.0g/L、約4.8g/L~約15.8g/L、約4.8g/L~約15.6g/L、約4.8g/L~約15.4g/L、約4.8g/L~約15.2g/L、約4.8g/L~約15.0g/L、約4.8g/L~約14.8g/L、約4.8g/L~約14.6g/L、約4.8g/L~約14.4g/L、約4.8g/L~約14.2g/L、約4.8g/L~約14.0g/L、約4.8g/L~約13.8g/L、約4.8g/L~約13.6g/L、約4.8g/L~約13.4g/L、
約4.8g/L~約13.2g/L、約4.8g/L~約13.0g/L、約4.8g/L~約12.8g/L、約4.8g/L~約12.6g/L、約4.8g/L~約12.4g/L、約4.8g/L~約12.2g/L、約4.8g/L~約12.0g/L、約4.8g/L~約11.8g/L、約4.8g/L~約11.6g/L、約4.8g/L~約11.4g/L、約4.8g/L~約11.2g/L、約4.8g/L~約11.0g/L、約4.8g/L~約10.8g/L、約4.8g/L~約10.6g/L、約4.8g/L~約10.4g/L、約4.8g/L~約10.2g/L、約4.8g/L~約10.0g/L、約4.8g/L~約9.8g/L、約4.8g/L~約9.6g/L、約4.8g/L~約9.4g/L、約4.8g/L~約9.2g/L、約4.8g/L~約9.0g/L、約4.8g/L~約8.8g/L、約4.8g/L~約8.6g/L、約4.8g/L~約8.4g/L、約4.8g/L~約8.2g/L、約4.8g/L~約8.0g/L、約4.8g/L~約7.8g/L、約4.8g/L~約7.6g/L、約4.8g/L~約7.4g/L、約4.8g/L~約7.2g/L、約4.8g/L~約7.0g/L、約4.8g/L~約6.9g/L、約4.8g/L~約6.8g/L、約4.8g/L~約6.6g/L、約4.8g/L~約6.4g/L、約4.8g/L~約6.2g/L、約4.8g/L~約6.0g/L、約4.8g/L~約5.8g/L、約5.0g/L~約16.0g/L、約5.0g/L~約15.8g/L、約5.0g/L~約15.6g/L、約5.0g/L~約15.4g/L、約5.0g/L~約15.2g/L、約5.0g/L~約15.0g/L、約5.0g/L~約14.8g/L、約5.0g/L~約14.6g/L、約5.0g/L~約14.4g/L、約5.0g/L~約14.2g/L、約5.0g/L~約14.0g/L、約5.0g/L~約13.8g/L、約5.0g/L~約13.6g/L、約5.0g/L~約13.4g/L、約5.0g/L~約13.2g/L、約5.0g/L~約13.0g/L、約5.0g/L~約12.8g/L、約5.0g/L~約12.6g/L、約5.0g/L~約12.4g/L、約5.0g/L~約12.2g/L、約5.0g/L~約12.0g/L、約5.0g/L~約11.8g/L、約5.0g/L~約11.6g/L、約5.0g/L~
約11.4g/L、約5.0g/L~約11.2g/L、約5.0g/L~約11.0g/L、約5.0g/L~約10.8g/L、約5.0g/L~約10.6g/L、約5.0g/L~約10.4g/L、約5.0g/L~約10.2g/L、約5.0g/L~約10.0g/L、約5.0g/L~約9.8g/L、約5.0g/L~約9.6g/L、約5.0g/L~約9.4g/L、約5.0g/L~約9.2g/L、約5.0g/L~約9.0g/L、約5.0g/L~約8.8g/L、約5.0g/L~約8.6g/L、約5.0g/L~約8.4g/L、約5.0g/L~約8.2g/L、約5.0g/L~約8.0g/L、約5.0g/L~約7.8g/L、約5.0g/L~約7.6g/L、約5.0g/L~約7.4g/L、約5.0g/L~約7.2g/L、約5.0g/L~約7.0g/L、約5.0g/L~約6.9g/L、約5.0g/L~約6.8g/L、約5.0g/L~約6.6g/L、約5.0g/L~約6.4g/L、約5.0g/L~約6.2g/L、約5.0g/L~約6.0g/L、約5.1g/L~約16.0g/L、約5.1g/L~約15.8g/L、約5.1g/L~約15.6g/L、約5.1g/L~約15.4g/L、約5.1g/L~約15.2g/L、約5.1g/L~約15.0g/L、約5.1g/L~約14.8g/L、約5.1g/L~約14.6g/L、約5.1g/L~約14.4g/L、約5.1g/L~約14.2g/L、約5.1g/L~約14.0g/L、約5.1g/L~約13.8g/L、約5.1g/L~約13.6g/L、約5.1g/L~約13.4g/L、約5.1g/L~約13.2g/L、約5.1g/L~約13.0g/L、約5.1g/L~約12.8g/L、約5.1g/L~約12.6g/L、約5.1g/L~約12.4g/L、約5.1g/L~約12.2g/L、約5.1g/L~約12.0g/L、約5.1g/L~約11.8g/L、約5.1g/L~約11.6g/L、約5.1g/L~約11.4g/L、約5.1g/L~約11.2g/L、約5.1g/L~約11.0g/L、約5.1g/L~約10.8g/L、約5.1g/L~約10.6g/L、約5.1g/L~約10.4g/L、約5.1g/L~約10.2g/L、約5.1g/L~約10.0g/L、約5.1g/L~約9.8g/L、約5.1g/L~約9.6g/L、約5.1g/L~約9.4g/L、約5.1g/L~約9.2g/L、約5.1g/L~約9.0g/L、約5.1g/L~約8.8g/L、約5.1g/L~約8.6g/L、約5.1g/L~約8.4g/L、約5.1g/L~約8.2g/L、約5.1g/L~約8.0g/L、約5.1g/L~約7.8g/L、約5.1g/L~約7.6g/L、約5.1g/L~約7.4g/L、約5.1g/L~約7.2g/L、約5.1g/L~約7.0g/L、約5.1g/L~約6.9g/L、約5.1g/L~約6.8g/L、約5.1g/L~約6.6g/L、約5.1g/L~約6.4g/L、約5.1g/L~約6.2g/L、約5.1g/L~約6.1g/L、約5.2g/L~約16.0g/L、約5.2g/L~約15.8g/L、約5.2g/L~約15.6g/L、約5.2g/L~約15.4g/L、約5.2g/L~約15.2g/L、約5.2g/L~約15.0g/L、約5.2g/L~約14.8g/L、約5.2g/L~約14.6g/L、約5.2g/L~約14.4g/L、約5.2g/L~約14.2g/L、約5.2g/L~約14.0g/L、約5.2g/L~約13.8g/L、約5.2g/L~約13.6g/L、約5.2g/L~約13.4g/L、約5.2g/L~約13.2g/L、約5.2g/L~約13.0g/L、約5.2g/L~約12.8g/L、約5.2g/L~約12.6g/L、約5.2g/L~約12.4g/L、約5.2g/L~約12.2g/L、約5.2g/L~約12.0g/L、約5.2g/L~約11.8g/L、約5.2g/L~約11.6g/L、約5.2g/L~約11.4g/L、約5.2g/L~約11.2g/L、約5.2g/L~約11.0g/L、約5.2g/L~約10.8g/L、約5.2g/L~約10.6g/L、約5.2g/L~約10.4g/L、約5.2g/L~約10.2g/L、約5.2g/L~約10.0g/L、約5.2g/L~約9.8g/L、約5.2g/L~約9.6g/L、約5.2g/L~約9.4g/L、約5.2g/L~約9.2g/L、約5.2g/L~約9.0g/L、約5.2g/L~約8.8g/L、約5.2g/L~約8.6g/L、約5.2g/L~約8.4g/L、約5.2g/L~約8.2g/L、約5
.2g/L~約8.0g/L、約5.2g/L~約7.8g/L、約5.2g/L~約7.6g/L、約5.2g/L~約7.4g/L、約5.2g/L~約7.2g/L、約5.2g/L~約7.0g/L、約5.2g/L~約6.9g/L、約5.2g/L~約6.8g/L、約5.2g/L~約6.6g/L、約5.2g/L~約6.4g/L、約5.2g/L~約6.2g/L、約5.4g/L~約16.0g/L、約5.4g/L~約15.8g/L、約5.4g/L~約15.6g/L、約5.4g/L~約15.4g/L、約5.4g/L~約15.2g/L、約5.4g/L~約15.0g/L、約5.4g/L~約14.8g/L、約5.4g/L~約14.6g/L、約5.4g/L~約14.4g/L、約5.4g/L~約14.2g/L、約5.4g/L~約14.0g/L、約5.4g/L~約13.8g/L、約5.4g/L~約13.6g/L、約5.4g/L~約13.4g/L、約5.4g/L~約13.2g/L、約5.4g/L~約13.0g/L、約5.4g/L~約12.8g/L、約5.4g/L~約12.6g/L、約5.4g/L~約12.4g/L、約5.4g/L~約12.2g/L、約5.4g/L~約12.0g/L、約5.4g/L~約11.8g/L、約5.4g/L~約11.6g/L、約5.4g/L~約11.4g/L、約5.4g/L~約11.2g/L、約5.4g/L~約11.0g/L、約5.4g/L~約10.8g/L、約5.4g/L~約10.6g/L、約5.4g/L~約10.4g/L、約5.4g/L~約10.2g/L、約5.4g/L~約10.0g/L、約5.4g/L~約9.8g/L、約5.4g/L~約9.6g/L、約5.4g/L~約9.4g/L、約5.4g/L~約9.2g/L、約5.4g/L~約9.0g/L、約5.4g/L~約8.8g/L、約5.4g/L~約8.6g/L、約5.4g/L~約8.4g/L、約5.4g/L~約8.2g/L、約5.4g/L~約8.0g/L、約5.4g/L~約7.8g/L、約5.4g/L~約7.6g/L、約5.4g/L~約7.4g/L、約5.4g/L~約7.2g/L、約5.4g/L~約7.0g/L、約5.4g/L~約6.9g/L、約5.4g/L~約6.8g/L、約5.4g/L~約6.6g/L、約5.4g/L~約6.4g/L、約5.6g/L~約16.0g/L、約5.6g/L~約15.8g/L、約5.6g/L~約15.6g/L、約5.6g/L~約15.4g/L、約5.6g/L~約15.2g/L、約5.6g/L~約15.0g/L、約5.6g/L~約14.8g/L、約5.6g/L~約14.6g/L、約5.6g/L~約14.4g/L、約5.6g/L~約14.2g/L、約5.6g/L~約14.0g/L、約5.6g/L~約13.8g/L、約5.6g/L~約13.6g/L、約5.6g/L~約13.4g/L、約5.6g/L~約13.2g/L、約5.6g/L~約13.0g/L、約5.6g/L~約12.8g/L、約5.6g/L~約12.6g/L、約5.6g/L~約12.4g/L、約5.6g/L~約12.2g/L、約5.6g/L~約12.0g/L、約5.6g/L~約11.8g/L、約5.6g/L~約11.6g/L、約5.6g/L~約11.4g/L、約5.6g/L~約11.2g/L、約5.6g/L~約11.0g/L、約5.6g/L~約10.8g/L、約5.6g/L~約10.6g/L、約5.6g/L~約10.4g/L、約5.6g/L~約10.2g/L、約5.6g/L~約10.0g/L、約5.6g/L~約9.8g/L、約5.6g/L~約9.6g/L、約5.6g/L~約9.4g/L、約5.6g/L~約9.2g/L、約5.6g/L~約9.0g/L、約5.6g/L~約8.8g/L、約5.6g/L~約8.6g/L、約5.6g/L~約8.4g/L、約5.6g/L~約8.2g/L、約5.6g/L~約8.0g/L、約5.6g/L~約7.8g/L、約5.6g/L~約7.6g/L、約5.6g/L~約7.4g/L、約5.6g/L~約7.2g/L、約5.6g/L~約7.0g/L、約5.6g/L~約6.9g/L、約5.6g/L~約6.8g/L、約5.6g/L~約6.6g/L、約5.8g/L~約16.0g/L、約5.8g/L~約15.8g/L、約5.8g/L~約15.6g/L、約5.8g/L~約15.4g/L、約5.8g/L~約15.2g/L、約5.8g/L~約15.0g/L、約5.8g/L~約14.8g/L、約5.8g/L~約14.6g/L、約5.8g/L~約14.4g/L、約5.8g/L~約14.2g/L、約5.8g/L~約1
4.0g/L、約5.8g/L~約13.8g/L、約5.8g/L~約13.6g/L、約5.8g/L~約13.4g/L、約5.8g/L~約13.2g/L、
約5.8g/L~約13.0g/L、約5.8g/L~約12.8g/L、約5.8g/L~約12.6g/L、約5.8g/L~約12.4g/L、約5.8g/L~約12.2g/L、約5.8g/L~約12.0g/L、約5.8g/L~約11.8g/L、約5.8g/L~約11.6g/L、約5.8g/L~約11.4g/L、約5.8g/L~約11.2g/L、約5.8g/L~約11.0g/L、約5.8g/L~約10.8g/L、約5.8g/L~約10.6g/L、約5.8g/L~約10.4g/L、約5.8g/L~約10.2g/L、約5.8g/L~約10.0g/L、約5.8g/L~約9.8g/L、約5.8g/L~約9.6g/L、約5.8g/L~約9.4g/L、約5.8g/L~約9.2g/L、約5.8g/L~約9.0g/L、約5.8g/L~約8.8g/L、約5.8g/L~約8.6g/L、約5.8g/L~約8.4g/L、約5.8g/L~約8.2g/L、約5.8g/L~約8.0g/L、約5.8g/L~約7.8g/L、約5.8g/L~約7.6g/L、約5.8g/L~約7.4g/L、約5.8g/L~約7.2g/L、約5.8g/L~約7.0g/L、約5.8g/L~約6.9g/L、約5.8g/L~約6.8g/L、約6.0g/L~約16.0g/L、約6.0g/L~約15.8g/L、約6.0g/L~約15.6g/L、約6.0g/L~約15.4g/L、約6.0g/L~約15.2g/L、約6.0g/L~約15.0g/L、約6.0g/L~約14.8g/L、約6.0g/L~約14.6g/L、約6.0g/L~約14.4g/L、約6.0g/L~約14.2g/L、約6.0g/L~約14.0g/L、約6.0g/L~約13.8g/L、約6.0g/L~約13.6g/L、約6.0g/L~約13.4g/L、約6.0g/L~約13.2g/L、約6.0g/L~約13.0g/L、約6.0g/L~約12.8g/L、約6.0g/L~約12.6g/L、約6.0g/L~約12.4g/L、約6.0g/L~約12.2g/L、約6.0g/L~約12.0g/L、約6.0g/L~約11.8g/L、約6.0g/L~約11.6g/L、約6.0g/L~約11.4g/L、約6.0g/L~約11.2g/L、約6.0g/L~約11.0g/L、約6.0g/L~約10.8g/L、約6.0g/L~約10.6g/L、約6.0g/L~約10.4g/L、約6.0g/L~約10.2g/L、約6.0g/L~約10.0g/L、約6.0g/L~約9.8g/L、約6.0g/L~約9.6g/L、約6.0g/L~約9.4g/L、約6.0g/L~約9.2g/L、約6.0g/L~約9.0g/L、約6.0g/L~約8.8g/L、約6.0g/L~約8.6g/L、約6.0g/L~約8.4g/L、約6.0g/L~約8.2g/L、約6.0g/L~約8.0g/L、約6.0g/L~約7.8g/L、約6.0g/L~約7.6g/L、約6.0g/L~約7.4g/L、約6.0g/L~約7.2g/L、約6.0g/L~約7.0g/L、約6.2g/L~約16.0g/L、約6.2g/L~約15.8g/L、約6.2g/L~約15.6g/L、約6.2g/L~約15.4g/L、約6.2g/L~約15.2g/L、約6.2g/L~約15.0g/L、約6.2g/L~約14.8g/L、約6.2g/L~約14.6g/L、約6.2g/L~約14.4g/L、約6.2g/L~約14.2g/L、約6.2g/L~約14.0g/L、約6.2g/L~約13.8g/L、約6.2g/L~約13.6g/L、約6.2g/L~約13.4g/L、約6.2g/L~約13.2g/L、約6.2g/L~約13.0g/L、約6.2g/L~約12.8g/L、約6.2g/L~約12.6g/L、約6.2g/L~約12.4g/L、約6.2g/L~約12.2g/L、約6.2g/L~約12.0g/L、約6.2g/L~約11.8g/L、約6.2g/L~約11.6g/L、約6.2g/L~約11.4g/L、約6.2g/L~約11.2g/L、約6.2g/L~約11.0g/L、約6.2g/L~約10.8g/L、約6.2g/L~約10.6g/L、約6.2g/L~約10.4g/L、約6.2g/L~約10.2g/L、約6.2g/L~約10.0g/L、約6.2g/L~約9.8g/L、約6.2g/L~約9.6g/L、約6.2g/L~約9.4g/L、約6.2g/L~約9.2g/L、
約6.2g/L~約9.0g/L、約6.2g/L~約8.8g/L、約6.2g/L~約8.6g/L、約6.2g/L~約8.4g/L、約6.2g/L~約8.2g/L、約6.2g/L~約8.0g/L、約6.2g/L~約7.8g/L、約6.2g/L~約7.6g/L、約6.2g/L~約7.4g/L、約6.2g/L~約7.2g/L、約6.4g/L~約16.0g/L、約6.4g/L~約15.8g/L、約6.4g/L~約15.6g/L、約6.4g/L~約15.4g/L、約6.4g/L~約15.2g/L、約6.4g/L~約15.0g/L、約6.4g/L~約14.8g/L、約6.4g/L~約14.6g/L、約6.4g/L~約14.4g/L、約6.4g/L~約14.2g/L、約6.4g/L~約14.0g/L、約6.4g/L~約13.8g/L、約6.4g/L~約13.6g/L、約6.4g/L~約13.4g/L、約6.4g/L~約13.2g/L、約6.4g/L~約13.0g/L、約6.4g/L~約12.8g/L、約6.4g/L~約12.6g/L、約6.4g/L~約12.4g/L、約6.4g/L~約12.2g/L、約6.4g/L~約12.0g/L、約6.4g/L~約11.8g/L、約6.4g/L~約11.6g/L、約6.4g/L~約11.4g/L、約6.4g/L~約11.2g/L、約6.4g/L~約11.0g/L、約6.4g/L~約10.8g/L、約6.4g/L~約10.6g/L、約6.4g/L~約10.4g/L、約6.4g/L~約10.2g/L、約6.4g/L~約10.0g/L、約6.4g/L~約9.8g/L、約6.4g/L~約9.6g/L、約6.4g/L~約9.4g/L、約6.4g/L~約9.2g/L、約6.4g/L~約9.0g/L、約6.4g/L~約8.8g/L、約6.4g/L~約8.6g/L、約6.4g/L~約8.4g/L、約6.4g/L~約8.2g/L、約6.4g/L~約8.0g/L、約6.4g/L~約7.8g/L、約6.4g/L~約7.6g/L、約6.4g/L~約7.4g/L、約6.6g/L~約16.0g/L、約6.6g/L~約15.8g/L、約6.6g/L~約15.6g/L、約6.6g/L~約15.4g/L、約6.6g/L~約15.2g/L、約6.6g/L~約15.0g/L、約6.6g/L~約14.8g/L、約6.6g/L~約14.6g/L、約6.6g/L~約14.4g/L、約6.6g/L~約14.2g/L、約6.6g/L~約14.0g/L、約6.6g/L~約13.8g/L、約6.6g/L~約13.6g/L、約6.6g/L~約13.4g/L、約6.6g/L~約13.2g/L、約6.6g/L~約13.0g/L、約6.6g/L~約12.8g/L、約6.6g/L~約12.6g/L、約6.6g/L~約12.4g/L、約6.6g/L~約12.2g/L、約6.6g/L~約12.0g/L、約6.6g/L~約11.8g/L、約6.6g/L~約11.6g/L、約6.6g/L~約11.4g/L、約6.6g/L~約11.2g/L、約6.6g/L~約11.0g/L、約6.6g/L~約10.8g/L、約6.6g/L~約10.6g/L、約6.6g/L~約10.4g/L、約6.6g/L~約10.2g/L、約6.6g/L~約10.0g/L、約6.6g/L~約9.8g/L、約6.6g/L~約9.6g/L、約6.6g/L~約9.4g/L、約6.6g/L~約9.2g/L、約6.6g/L~約9.0g/L、約6.6g/L~約8.8g/L、約6.6g/L~約8.6g/L、約6.6g/L~約8.4g/L、約6.6g/L~約8.2g/L、約6.6g/L~約8.0g/L、約6.6g/L~約7.8g/L、約6.6g/L~約7.6g/L、約6.8g/L~約16.0g/L、約6.8g/L~約15.8g/L、約6.8g/L~約15.6g/L、約6.8g/L~約15.4g/L、約6.8g/L~約15.2g/L、約6.8g/L~約15.0g/L、約6.8g/L~約14.8g/L、約6.8g/L~約14.6g/L、約6.8g/L~約14.4g/L、約6.8g/L~約14.2g/L、約6.8g/L~約14.0g/L、約6.8g/L~約13.8g/L、約6.8g/L~約13.6g/L、約6.8g/L~約13.4g/L、約6.8g/L~約13.2g/L、約6.8g/L~約13.0g/L、約6.8g/L~約12.8g/L、約6.8g/L~約12.6g/L、約6.8g/L~約12.4g/L、約6.8g/L~約12.2g/L、約6.8g/L~約12.0g/L、約6.8g/L~約11.8g/L、約6.8g/L~約11.
6g/L、約6.8g/L~約11.4g/L、約6.8g/L~約11.2g/L、約6.8g/L~約11.0g/L、約6.8g/L~約10.8g/L、約6.8g/L~約10.6g/L、約6.8g/L~約10.4g/L、約6.8g/L~約10.2g/L、約6.8g/L~約10.0g/L、約6.8g/L~約9.8g/L、約6.8g/L~約9.6g/L、約6.8g/L~約9.4g/L、約6.8g/L~約9.2g/L、約6.8g/L~約9.0g/L、約6.8g/L~約8.8g/L、約6.8g/L~約8.6g/L、約6.8g/L~約8.4g/L、約6.8g/L~約8.2g/L、約6.8g/L~約8.0g/L、約6.8g/L~約7.8g/L、約7.0g/L~約16.0g/L、約7.0g/L~約15.8g/L、約7.0g/L~約15.6g/L、約7.0g/L~約15.4g/L、約7.0g/L~約15.2g/L、約7.0g/L~約15.0g/L、約7.0g/L~約14.8g/L、約7.0g/L~約14.6g/L、約7.0g/L~約14.4g/L、約7.0g/L~約14.2g/L、約7.0g/L~約14.0g/L、約7.0g/L~約13.8g/L、約7.0g/L~約13.6g/L、約7.0g/L~約13.4g/L、約7.0g/L~約13.2g/L、約7.0g/L~約13.0g/L、約7.0g/L~約12.8g/L、約7.0g/L~約12.6g/L、約7.0g/L~約12.4g/L、約7.0g/L~約12.2g/L、約7.0g/L~約12.0g/L、約7.0g/L~約11.8g/L、約7.0g/L~約11.6g/L、約7.0g/L~約11.4g/L、約7.0g/L~約11.2g/L、約7.0g/L~約11.0g/L、約7.0g/L~約10.8g/L、約7.0g/L~約10.6g/L、約7.0g/L~約10.4g/L、約7.0g/L~約10.2g/L、約7.0g/L~約10.0g/L、約7.0g/L~約9.8g/L、約7.0g/L~約9.6g/L、約7.0g/L~約9.4g/L、約7.0g/L~約9.2g/L、約7.0g/L~約9.0g/L、約7.0g/L~約8.8g/L、約7.0g/L~約8.6g/L、約7.0g/L~約8.4g/L、約7.0g/L~約8.2g/L、約7.0g/L~約8.0g/L、約7.2g/L~約16.0g/L、約7.2g/L~約15.8g/L、約7.2g/L~約15.6g/L、約7.2g/L~約15.4g/L、約7.2g/L~約15.2g/L、約7.2g/L~約15.0g/L、約7.2g/L~約14.8g/L、約7.2g/L~約14.6g/L、約7.2g/L~約14.4g/L、約7.2g/L~約14.2g/L、約7.2g/L~約14.0g/L、約7.2g/L~約13.8g/L、約7.2g/L~約13.6g/L、約7.2g/L~約13.4g/L、約7.2g/L~約13.2g/L、約7.2g/L~約13.0g/L、約7.2g/L~約12.8g/L、約7.2g/L~約12.6g/L、約7.2g/L~約12.4g/L、約7.2g/L~約12.2g/L、約7.2g/L~約12.0g/L、約7.2g/L~約11.8g/L、約7.2g/L~約11.6g/L、約7.2g/L~約11.4g/L、約7.2g/L~約11.2g/L、約7.2g/L~約11.0g/L、約7.2g/L~約10.8g/L、約7.2g/L~約10.6g/L、約7.2g/L~約10.4g/L、約7.2g/L~約10.2g/L、約7.2g/L~約10.0g/L、約7.2g/L~約9.8g/L、約7.2g/L~約9.6g/L、約7.2g/L~約9.4g/L、約7.2g/L~約9.2g/L、約7.2g/L~約9.0g/L、約7.2g/L~約8.8g/L、約7.2g/L~約8.6g/L、約7.2g/L~約8.4g/L、約7.2g/L~約8.2g/L、約7.4g/L~約16.0g/L、約7.4g/L~約15.8g/L、約7.4g/L~約15.6g/L、約7.4g/L~約15.4g/L、約7.4g/L~約15.2g/L、約7.4g/L~約15.0g/L、約7.4g/L~約14.8g/L、約7.4g/L~約14.6g/L、約7.4g/L~約14.4g/L、約7.4g/L~約14.2g/L、約7.4g/L~約14.0g/L、約7.4g/L~約13.8g/L、約7.4g/L~約13.6g/L、約7.4g/L~約13.4g/L、約7.4g/L~約13.2g/L、約7.4g/L~約13.0g/L、約7.4g/L~約12.8g/L、約7.4g/L~約12.6g/L、約7.4g/L~約12.4g/L、約7
.4g/L~約12.2g/L、約7.4g/L~約12.0g/L、約7.4g/L~約11.8g/L、約7.4g/L~約11.6g/L、約7.4g/L~約11.4g/L、約7.4g/L~約11.2g/L、約7.4g/L~約11.0g/L、約7.4g/L~約10.8g/L、約7.4g/L~約10.6g/L、約7.4g/L~約10.4g/L、約7.4g/L~約10.2g/L、約7.4g/L~約10.0g/L、約7.4g/L~約9.8g/L、約7.4g/L~約9.6g/L、約7.4g/L~約9.4g/L、約7.4g/L~約9.2g/L、約7.4g/L~約9.0g/L、約7.4g/L~約8.8g/L、約7.4g/L~約8.6g/L、約7.4g/L~約8.4g/L、約7.6g/L~約16.0g/L、約7.6g/L~約15.8g/L、約7.6g/L~約15.6g/L、約7.6g/L~約15.4g/L、約7.6g/L~約15.2g/L、約7.6g/L~約15.0g/L、約7.6g/L~約14.8g/L、約7.6g/L~約14.6g/L、約7.6g/L~約14.4g/L、約7.6g/L~約14.2g/L、約7.6g/L~約14.0g/L、約7.6g/L~約13.8g/L、約7.6g/L~約13.6g/L、約7.6g/L~約13.4g/L、約7.6g/L~約13.2g/L、約7.6g/L~約13.0g/L、約7.6g/L~約12.8g/L、約7.6g/L~約12.6g/L、約7.6g/L~約12.4g/L、約7.6g/L~約12.2g/L、約7.6g/L~約12.0g/L、約7.6g/L~約11.8g/L、約7.6g/L~約11.6g/L、約7.6g/L~約11.4g/L、約7.6g/L~約11.2g/L、約7.6g/L~約11.0g/L、約7.6g/L~約10.8g/L、約7.6g/L~約10.6g/L、約7.6g/L~約10.4g/L、約7.6g/L~約10.2g/L、約7.6g/L~約10.0g/L、約7.6g/L~約9.8g/L、約7.6g/L~約9.6g/L、約7.6g/L~約9.4g/L、約7.6g/L~約9.2g/L、約7.6g/L~約9.0g/L、約7.6g/L~約8.8g/L、約7.6g/L~約8.6g/L、約7.8g/L~約16.0g/L、約7.8g/L~約15.8g/L、約7.8g/L~約15.6g/L、約7.8g/L~約15.4g/L、約7.8g/L~約15.2g/L、約7.8g/L~約15.0g/L、約7.8g/L~約14.8g/L、約7.8g/L~約14.6g/L、
約7.8g/L~約14.4g/L、約7.8g/L~約14.2g/L、約7.8g/L~約14.0g/L、約7.8g/L~約13.8g/L、約7.8g/L~約13.6g/L、約7.8g/L~約13.4g/L、約7.8g/L~約13.2g/L、約7.8g/L~約13.0g/L、約7.8g/L~約12.8g/L、約7.8g/L~約12.6g/L、約7.8g/L~約12.4g/L、約7.8g/L~約12.2g/L、約7.8g/L~約12.0g/L、約7.8g/L~約11.8g/L、約7.8g/L~約11.6g/L、約7.8g/L~約11.4g/L、約7.8g/L~約11.2g/L、約7.8g/L~約11.0g/L、約7.8g/L~約10.8g/L、約7.8g/L~約10.6g/L、約7.8g/L~約10.4g/L、約7.8g/L~約10.2g/L、約7.8g/L~約10.0g/L、約7.8g/L~約9.8g/L、約7.8g/L~約9.6g/L、約7.8g/L~約9.4g/L、約7.8g/L~約9.2g/L、約7.8g/L~約9.0g/L、約7.8g/L~約8.8g/L、約8.0g/L~約16.0g/L、約8.0g/L~約15.8g/L、約8.0g/L~約15.6g/L、約8.0g/L~約15.4g/L、約8.0g/L~約15.2g/L、約8.0g/L~約15.0g/L、約8.0g/L~約14.8g/L、約8.0g/L~約14.6g/L、約8.0g/L~約14.4g/L、約8.0g/L~約14.2g/L、約8.0g/L~約14.0g/L、約8.0g/L~約13.8g/L、約8.0g/L~約13.6g/L、約8.0g/L~約13.4g/L、約8.0g/L~約13.2g/L、約8.0g/L~約13.0g/L、約8.0g/L~約12.8g/L、約8.0g/L~約12.6g/L、約8.0g/L~約12.4g/L、約8.0g/L~約12.2g/L、約8.0g/L~約12.0g/L、約8.0g/L~約11.8g/L、約8.0g/L~約11.6g/L、約8
.0g/L~約11.4g/L、
約8.0g/L~約11.2g/L、約8.0g/L~約11.0g/L、約8.0g/L~約10.8g/L、約8.0g/L~約10.6g/L、約8.0g/L~約10.4g/L、約8.0g/L~約10.2g/L、約8.0g/L~約10.0g/L、約8.0g/L~約9.8g/L、約8.0g/L~約9.6g/L、約8.0g/L~約9.4g/L、約8.0g/L~約9.2g/L、約8.0g/L~約9.0g/L、約8.5g/L~約16.0g/L、約8.5g/L~約15.5g/L、約8.5g/L~約15.0g/L、約8.5g/L~約14.5g/L、約8.5g/L~約14.0g/L、約8.5g/L~約13.5g/L、約8.5g/L~約13.0g/L、約8.5g/L~約12.5g/L、約8.5g/L~約12.0g/L、約8.5g/L~約11.5g/L、約8.5g/L~約11.0g/L、約8.5g/L~約10.5g/L、約8.5g/L~約10.0g/L、約8.5g/L~約9.5g/L、約9.0g/L~約16.0g/L、約9.0g/L~約15.5g/L、約9.0g/L~約15.0g/L、約9.0g/L~約14.5g/L、約9.0g/L~約14.0g/L、約9.0g/L~約13.5g/L、約9.0g/L~約13.0g/L、約9.0g/L~約12.5g/L、約9.0g/L~約12.0g/L、約9.0g/L~約11.5g/L、約9.0g/L~約11.0g/L、約9.0g/L~約10.5g/L、約9.0g/L~約10.0g/L、約9.5g/L~約16.0g/L、約9.5g/L~約15.5g/L、約9.5g/L~約15.0g/L、約9.5g/L~約14.5g/L、約9.5g/L~約14.0g/L、約9.5g/L~約13.5g/L、約9.5g/L~約13.0g/L、約9.5g/L~約12.5g/L、約9.5g/L~約12.0g/L、約9.5g/L~約11.5g/L、約9.5g/L~約11.0g/L、約9.5g/L~約10.5g/L、約10.0g/L~約16.0g/L、約10.0g/L~約15.5g/L、約10.0g/L~約15.0g/L、約10.0g/L~約14.5g/L、約10.0g/L~約14.0g/L、約10.0g/L~約13.5g/L、約10.0g/L~約13.0g/L、約10.0g/L~約12.5g/L、約10.0g/L~約12.0g/L、約10.0g/L~約11.5g/L、約10.0g/L~約11.0g/L、約10.5g/L~約16.0g/L、約10.5g/L~約15.5g/L、約10.5g/L~約15.0g/L、約10.5g/L~約14.5g/L、約10.5g/L~約14.0g/L、約10.5g/L~約13.5g/L、約10.5g/L~約13.0g/L、約10.5g/L~約12.5g/L、約10.5g/L~約12.0g/L、約10.5g/L~約11.5g/L、約11.0g/L~約16.0g/L、約11.0g/L~約15.5g/L、約11.0g/L~約15.0g/L、約11.0g/L~約14.5g/L、約11.0g/L~約14.0g/L、約11.0g/L~約13.5g/L、約11.0g/L~約13.0g/L、約11.0g/L~約12.5g/L、約11.0g/L~約12.0g/L、約11.5g/L~約16.0g/L、約11.5g/L~約15.5g/L、約11.5g/L~約15.0g/L、約11.5g/L~約14.5g/L、約11.5g/L~約14.0g/L、約11.5g/L~約13.5g/L、約11.5g/L~約13.0g/L、約11.5g/L~約12.5g/L、約12.0g/L~約16.0g/L、約12.0g/L~約15.5g/L、約12.0g/L~約15.0g/L、約12.0g/L~約14.5g/L、約12.0g/L~約14.0g/L、約12.0g/L~約13.5g/L、約12.0g/L~約13.0g/L、約12.5g/L~約16.0g/L、約12.5g/L~約15.5g/L、約12.5g/L~約15.0g/L、約12.5g/L~約14.5g/L、約12.5g/L~約14.0g/L、約12.5g/L~約13.5g/L、約13.0g/L~約16.0g/L、約13.0g/L~約15.5g/L、約13.0g/L~約15.0g/L、約13.0g/L~約14.5g/L、約13.0g/L~約14.0g/L、約13.5g/L~約16.0g/L、約13.5g/L~約15.5g/L、約13.5g/L~約15.0g/L、約13.5g/L~約14.5g/L、約14.0g/L~約16.0g/L、約
14.0g/L~約15.5g/L、約14.0g/L~約15.0g/L、約14.5g/L~約16.0g/L、約14.5g/L~約15.5g/L、または約15.0g/L~約16.0g/L)の濃度のポロクサマー-188を含む液体培地において、哺乳類細胞(例えば、組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞)を培養することを含む。
いくつかの実施形態において、ポロクサマー-188は、培地に存在する、および/または培養工程の前に添加される、および/または培養工程中に培地に添加される。例えば、本明細書において提供される方法は、培養工程の前におよび/または培養工程中にポロクサマー-188を添加して、培地中1.8g/Lまたはそれ以上の濃度(例えば、ポロクサマー-188の代表的な濃度のいずれか、または本明細書において記載されるポロクサマー-188の範囲)にすることをさらに含む。いくつかの例では、ポロクサマー-188を1.8g/Lまたはそれ以上の濃度(例えば、ポロクサマー-188の代表的な濃度のいずれか、または本明細書において記載されるポロクサマー-188の範囲)にするために、あるポロクサマー-188を含む液体培地に追加のポロクサマー-188が添加される。例えば、ポロクサマー-188は、培養工程の前におよび/または培養工程中に、第1の液体培地、第2の液体培地、および/またはフィード液体培地に添加される。
いくつかの例では、ポロクサマー-188は、培養工程中に1つまたはそれ以上(例えば、2、3、4、または5つ)のアリコートで培地に添加される。ポロクサマー-188は、連続的方法で培地に添加される。いくつかの例では、第1の液体培地は、ポロクサマー-188を含有し、追加のポロクサマー-188が、培養期間中に培地に添加される。いくつかの実施形態において、ポロクサマー-188は、培地に存在する。
培養工程が灌流培養を含むとき、第2の液体培地は、第1の液体培地中の濃度より高い濃度のポロクサマー-188を含む。例えば、第1の液体培地は、1.8g/Lの濃度または1.8g/L以下の濃度のポロクサマー-188を含み、第2の液体培地は、1.8g/Lより高い濃度のポロクサマー-188(例えば、本明細書において記載されるポロクサマー-188の濃度または範囲のいずれか、例えば、1.9g/Lより高い濃度、2.0g/Lより高い濃度、2.1g/Lより高い濃度、2.2g/Lより高い濃度、2.3g/Lより高い濃度、2.4g/Lより高い濃度、2.5g/Lより高い濃度、2.6g/Lより高い濃度、2.7g/Lより高い濃度、2.8g/Lより高い濃度、2.9g/Lより高い濃度、3.0g/Lより高い濃度、3.1g/Lより高い濃度、3.2g/Lより高い濃度、3.3g/Lより高い濃度、3.4g/Lより高い濃度、3.5g/Lより高い濃度、3.6g/Lより高い濃度、3.7g/Lより高い濃度、3.8g/Lより高い濃度、3.9g/Lより高い濃度、4.0g/Lより高い濃度、4.1g/Lより高い濃度、4.2g/Lより高い濃度、4.3g/Lより高い濃度、4.4g/Lより高い濃度、4.5g/Lより高い濃度、4.6g/Lより高い濃度、4.7g/Lより高い濃度、4.8g/Lより高い濃度、4.9g/Lより高い濃度、5.0g/Lより高い濃度、5.1g/Lより高い濃度、5.2g/Lより高い濃度、5.3g/Lより高い濃度、5.4g/Lより高い濃度、5.5g/Lより高い濃度、5.6g/Lより高い濃度、5.7g/Lより高い濃度、5.8g/Lより高い濃度、5.9g/Lより高い濃度、6.0g/Lより高い濃度、6.1g/Lより高い濃度、6.2g/Lより高い濃度、6.3g/Lより高い濃度、6.4g/Lより高い濃度、6.5g/Lより高い濃度、6.6g/Lより高い濃度、6.7g/Lより高い濃度、6.8g/Lより高い濃度、6.9g/Lより高い濃度、7.0g/Lより高い濃度、7.1g/Lより高い濃度、7.2g/Lより高い濃度、7.3g/Lより高い濃度、7.4g/Lより高い濃度、7.5g/Lより高い濃度、7.6g/Lより高い濃度、7.7g/Lより高い濃度、7.8g/Lより高い濃度、7.9g/Lより高い濃度、8.0g/Lより高い濃度、8.1g/Lより高い濃度、8.2g/Lより高い濃度、8.3g/Lより高い濃度、8.4g/Lより高
い濃度、8.5g/Lより高い濃度、8.6g/Lより高い濃度、8.7g/Lより高い濃度、8.8g/Lより高い濃度、8.9g/Lより高い濃度、9.0g/Lより高い濃度、9.1g/Lより高い濃度、9.2g/Lより高い濃度、9.3g/Lより高い濃度、9.4g/Lより高い濃度、9.5g/Lより高い濃度、9.6g/Lより高い濃度、9.7g/Lより高い濃度、9.8g/Lより高い濃度、9.9g/Lより高い濃度、10.0g/Lより高い濃度、10.1g/Lより高い濃度、10.2g/Lより高い濃度、10.3g/Lより高い濃度、10.4g/Lより高い濃度、10.5g/Lより高い濃度、10.6g/Lより高い濃度、10.7g/Lより高い濃度、10.8g/Lより高い濃度、10.9g/Lより高い濃度、11.0g/Lより高い濃度、11.1g/Lより高い濃度、11.2g/Lより高い濃度、11.3g/Lより高い濃度、11.4g/Lより高い濃度、11.5g/Lより高い濃度、11.6g/Lより高い濃度、11.7g/Lより高い濃度、11.8g/Lより高い濃度、11.9g/Lより高い濃度、12.0g/Lより高い濃度、12.1g/Lより高い濃度、12.2g/Lより高い濃度、12.3g/Lより高い濃度、12.4g/Lより高い濃度、12.5g/Lより高い濃度、12.6g/Lより高い濃度、12.7g/Lより高い濃度、12.8g/Lより高い濃度、12.9g/Lより高い濃度、13.0g/Lより高い濃度、13.1g/Lより高い濃度、13.2g/Lより高い濃度、13.3g/Lより高い濃度、13.4g/Lより高い濃度、13.5g/Lより高い濃度、13.6g/Lより高い濃度、13.7g/Lより高い濃度、13.8g/Lより高い濃度、13.9g/Lより高い濃度、14.0g/Lより高い濃度、14.1g/Lより高い濃度、14.2g/Lより高い濃度、14.3g/Lより高い濃度、14.4g/Lより高い濃度、14.5g/Lより高い濃度、14.6g/Lより高い濃度、14.7g/Lより高い濃度、14.8g/Lより高い濃度、14.9g/Lより高い濃度、15.0g/Lより高い濃度、15.1g/Lより高い濃度、15.2g/Lより高い濃度、15.3g/Lより高い濃度、15.4g/Lより高い濃度、15.5g/Lより高い濃度、15.6g/Lより高い濃度、15.7g/Lより高い濃度、15.8g/Lより高い濃度、15.9より高い濃度、または16.0g/Lより高い濃度のポロクサマー-188)を含む。
い濃度、8.5g/Lより高い濃度、8.6g/Lより高い濃度、8.7g/Lより高い濃度、8.8g/Lより高い濃度、8.9g/Lより高い濃度、9.0g/Lより高い濃度、9.1g/Lより高い濃度、9.2g/Lより高い濃度、9.3g/Lより高い濃度、9.4g/Lより高い濃度、9.5g/Lより高い濃度、9.6g/Lより高い濃度、9.7g/Lより高い濃度、9.8g/Lより高い濃度、9.9g/Lより高い濃度、10.0g/Lより高い濃度、10.1g/Lより高い濃度、10.2g/Lより高い濃度、10.3g/Lより高い濃度、10.4g/Lより高い濃度、10.5g/Lより高い濃度、10.6g/Lより高い濃度、10.7g/Lより高い濃度、10.8g/Lより高い濃度、10.9g/Lより高い濃度、11.0g/Lより高い濃度、11.1g/Lより高い濃度、11.2g/Lより高い濃度、11.3g/Lより高い濃度、11.4g/Lより高い濃度、11.5g/Lより高い濃度、11.6g/Lより高い濃度、11.7g/Lより高い濃度、11.8g/Lより高い濃度、11.9g/Lより高い濃度、12.0g/Lより高い濃度、12.1g/Lより高い濃度、12.2g/Lより高い濃度、12.3g/Lより高い濃度、12.4g/Lより高い濃度、12.5g/Lより高い濃度、12.6g/Lより高い濃度、12.7g/Lより高い濃度、12.8g/Lより高い濃度、12.9g/Lより高い濃度、13.0g/Lより高い濃度、13.1g/Lより高い濃度、13.2g/Lより高い濃度、13.3g/Lより高い濃度、13.4g/Lより高い濃度、13.5g/Lより高い濃度、13.6g/Lより高い濃度、13.7g/Lより高い濃度、13.8g/Lより高い濃度、13.9g/Lより高い濃度、14.0g/Lより高い濃度、14.1g/Lより高い濃度、14.2g/Lより高い濃度、14.3g/Lより高い濃度、14.4g/Lより高い濃度、14.5g/Lより高い濃度、14.6g/Lより高い濃度、14.7g/Lより高い濃度、14.8g/Lより高い濃度、14.9g/Lより高い濃度、15.0g/Lより高い濃度、15.1g/Lより高い濃度、15.2g/Lより高い濃度、15.3g/Lより高い濃度、15.4g/Lより高い濃度、15.5g/Lより高い濃度、15.6g/Lより高い濃度、15.7g/Lより高い濃度、15.8g/Lより高い濃度、15.9より高い濃度、または16.0g/Lより高い濃度のポロクサマー-188)を含む。
培養工程がフィードバッチ培養を含むとき、フィード液体培地は、第1の液体培地中の濃度より高い濃度のポロクサマー-188を含む。例えば、第1の液体培地は、1.8g/Lの濃度または1.8g/L未満の濃度のポロクサマー-188を含み、フィード液体培地は、1.8g/Lより高い濃度の(例えば、2.0g/Lより高い濃度、2.5g/Lより高い濃度、3.0g/Lより高い濃度、3.5g/Lより高い濃度、4.0g/Lより高い濃度、4.5g/Lより高い濃度、5.0g/Lより高い濃度、5.5g/Lより高い濃度、6.0g/Lより高い濃度、6.5g/Lより高い濃度、7.0g/Lより高い濃度、7.5g/Lより高い濃度、8.0g/Lより高い濃度、8.5g/Lより高い濃度、9.0g/Lより高い濃度、9.5g/Lより高い濃度、10g/Lより高い濃度、10.5g/Lより高い濃度、11.0g/Lより高い濃度、11.5g/Lより高い濃度、12.0g/Lより高い濃度、12.5g/Lより高い濃度、13.0g/Lより高い濃度、13.5g/Lより高い濃度、14.0g/Lより高い濃度、14.5g/Lより高い濃度、15.0g/Lより高い濃度、15.5g/Lより高い濃度、16.0g/Lより高い濃度、16.5g/Lより高い濃度、17.0g/Lより高い濃度、17.5g/Lより高い濃度、18.0g/Lより高い濃度、18.5g/Lより高い濃度、19.0g/Lより高い濃度、19.5g/Lより高い濃度、20.0g/Lより高い濃度、20.5g/Lより高い濃度、21.0g/Lより高い濃度、21.5g/Lより高い濃度、22.0g/Lより高い濃度、22.5g/Lより高い濃度、23.0g/Lより高い濃度、23.5g/Lより高い濃度、24.0g/Lより高い濃度、24.5g/Lより高い濃度、25.0g/Lより高い濃度、25.5g/Lより高い濃度、26.0g/Lより高い濃度、26.5g/Lより高い濃度、27.0g/Lより高い濃度、28.0g/Lより高い濃度、28.5g/Lより高い濃度、29.0g/Lより高い濃度、
29.5g/Lより高い濃度、30.0g/Lより高い濃度、30.5g/Lより高い濃度、31.0g/Lより高い濃度、31.5g/Lより高い濃度、32.0g/Lより高い濃度、32.5g/Lより高い濃度、33.0g/Lより高い濃度、33.5g/Lより高い濃度、34.0g/Lより高い濃度、34.5g/Lより高い濃度、35.0g/Lより高い濃度、35.5g/Lより高い濃度、36.0g/Lより高い濃度、36.5g/Lより高い濃度、37.0g/Lより高い濃度、37.5g/Lより高い濃度、38.0g/Lより高い濃度、38.5g/Lより高い濃度、39.0g/Lより高い濃度、39.5g/Lより高い濃度、または40.0g/Lより高い濃度)ポロクサマー-188を含む。
29.5g/Lより高い濃度、30.0g/Lより高い濃度、30.5g/Lより高い濃度、31.0g/Lより高い濃度、31.5g/Lより高い濃度、32.0g/Lより高い濃度、32.5g/Lより高い濃度、33.0g/Lより高い濃度、33.5g/Lより高い濃度、34.0g/Lより高い濃度、34.5g/Lより高い濃度、35.0g/Lより高い濃度、35.5g/Lより高い濃度、36.0g/Lより高い濃度、36.5g/Lより高い濃度、37.0g/Lより高い濃度、37.5g/Lより高い濃度、38.0g/Lより高い濃度、38.5g/Lより高い濃度、39.0g/Lより高い濃度、39.5g/Lより高い濃度、または40.0g/Lより高い濃度)ポロクサマー-188を含む。
本明細書において提供される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、培養物中のポロクサマー-188濃度を経時的に増大させることを含む。いくつかの実施形態において、培地は、孔サイズ、孔タイプ、ガス流速、培地中の生細胞密度、および細胞ストレスに関連するマーカーの群から選択される1つまたはそれ以上の因子に基づき選択されるポロクサマー-188濃度を含む。これらの方法において、培地中の選択されたポロクサマー-188濃度は、培養工程の前にポロクサマー-188を培地に添加することにより、および/または培養工程中にポロクサマー-188を培地に添加することにより達成される。選択されたポロクサマー-188濃度は、本明細書において記載されるポロクサマー-188の代表的な濃度または範囲のいずれかである。
1つまたはそれ以上の因子に基づくポロクサマー-188の濃度の選択
本明細書において記載される方法のいくつかの実施形態は、孔サイズ、孔タイプ、ガス流速、培地中の生細胞密度、および細胞ストレスに関連するマーカーの群から選択される1つまたはそれ以上の因子に基づき選択されるポロクサマー-188濃度を含む液体培地において、哺乳類細胞を培養することを含む。
本明細書において記載される方法のいくつかの実施形態は、孔サイズ、孔タイプ、ガス流速、培地中の生細胞密度、および細胞ストレスに関連するマーカーの群から選択される1つまたはそれ以上の因子に基づき選択されるポロクサマー-188濃度を含む液体培地において、哺乳類細胞を培養することを含む。
孔タイプの異なる例は、当該技術分野において公知である。孔タイプの非限定的な例は、焼結孔、およびドリル孔である。
細胞培養に適当な様々なガス流速は、当該技術分野において公知である。一般に、ガス流速が速いほど、(より低いガス流速を使用した培養工程と比較して)高いポロクサマー-188濃度が選択されるべきであることを示し、ガス流速遅いほど、(より高いガス流速を使用した培養工程と比較して)低いポロクサマー-188濃度が選択されるべきであることを示す。
様々な非限定的な生細胞密度が、本明細書において記載される。一般に、生細胞密度が高いほど、(より低い生細胞密度を含有する培地と比較して)高いポロクサマー-188濃度が選択されるべきであることを示し、生細胞密度が低いほど、(より高い生細胞密度を含有する培地と比較して)低いポロクサマー-188濃度が選択されるべきであることを示す。
生理学的ストレス下で細胞により放出される、細胞ストレスの代表的なマーカーは、タンパク質分解酵素(例えば、活性化カスパーゼ)、乳酸脱水素酵素、ゲノムDNA(例えば、ヌクレオソームDNA)、チトクロムc、および活性化PARPを含む。生理学的ストレス下で細胞において産生されるか、または上昇したレベルを有する、細胞ストレスに関連するマーカーの非限定的な例は、活性化カスパーゼ、チトクロムc、活性化PARP、および外在化ホスファチジルセリンを含む。対照値と比較して、細胞ストレスのこれらのマーカーのいずれかの1つまたはそれ以上(例えば、2、3、4、5、6、または7つ)の上昇したレベルは、より高いポロクサマー-188濃度が選択されるべきであることを示す。対照値と同じであるか、もしくはそれ未満である、対照値と比較して、細胞スト
レスの1つまたはそれ以上のマーカーのレベルは、より低いポロクサマー-188濃度が選択されるべきであることを示す。本明細書において記載される例のいずれかにおいて、対照レベルは、アポトーシスを経験しないか、またはネクローシスを引き起こすであろう条件下で培養されない対照細胞におけるレベルである。細胞ストレスの1つまたはそれ以上のマーカーのレベルの検出方法は、当該技術分野において周知である。商業的に入手可能なキットは、細胞ストレスの1つまたはそれ以上のマーカーを測定するために入手可能である。
レスの1つまたはそれ以上のマーカーのレベルは、より低いポロクサマー-188濃度が選択されるべきであることを示す。本明細書において記載される例のいずれかにおいて、対照レベルは、アポトーシスを経験しないか、またはネクローシスを引き起こすであろう条件下で培養されない対照細胞におけるレベルである。細胞ストレスの1つまたはそれ以上のマーカーのレベルの検出方法は、当該技術分野において周知である。商業的に入手可能なキットは、細胞ストレスの1つまたはそれ以上のマーカーを測定するために入手可能である。
本明細書において記載される実施形態のいずれかにおいて、選択されるポロクサマー-188濃度は、培養工程の前にポロクサマー-188を培地に添加することにより、および/または培養工程中にポロクサマー-188を培地に添加することにより達成される。いくつかの実施形態において、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約750μm~約1.5mm(例えば、約750μm~約1.45mm、約750μm~約1.40mm、約750μm~約1.35mm、約750μm~約1.30mm、約750μm~約1.25mm、約750μm~約1.20mm、約750μm~約1.15mm、約750μm~約1.10mm、約750μm~約1.05mm、約750μm~約1.00mm、約750μm~約950μm、約750μm~約900μm、約750μm~約850μm、約750μm~約800μm、約800μm~約1.5mm、約800μm~約1.45mm、約800μm~約1.40mm、約800μm~約1.35mm、約800μm~約1.30mm、約800μm~約1.25mm、約800μm~約1.20mm、約800μm~約1.15mm、約800μm~約1.10mm、約800μm~約1.05mm、約800μm~約1.00mm、約800μm~約950μm、約800μm~約900μm、約800μm~約850μm、約850μm~約1.5mm、約850μm~約1.45mm、約850μm~約1.40mm、約850μm~約1.35mm、約850μm~約1.30mm、約850μm~約1.25mm、約850μm~約1.20mm、約850μm~約1.15mm、約850μm~約1.10mm、約850μm~約1.05mm、約850μm~約1.00mm、約850μm~約950μm、約850μm~約900μm、約900μm~約1.5mm、約900μm~約1.45mm、約900μm~約1.40mm、約900μm~約1.35mm、約900μm~約1.30mm、約900μm~約1.25mm、約900μm~約1.20mm、約900μm~約1.15mm、約900μm~約1.10mm、約900μm~約1.05mm、約900μm~約1.00mm、約900μm~約950μm、約950μm~約1.5mm、約950μm~約1.45mm、約950μm~約1.40mm、約950μm~約1.35mm、約950μm~約1.30mm、約950μm~約1.25mm、約950μm~約1.20mm、約950μm~約1.15mm、約950μm~約1.10mm、約950μm~約1.05mm、約950μm~約1.00mm、約1.0mm~約1.5mm、約1.0mm~約1.45mm、約1.0mm~約1.40mm、約1.0mm~約1.35mm、約1.0mm~約1.30mm、約1.0mm~約1.25mm、約1.0mm~約1.20mm、約1.0mm~約1.15mm、約1.0mm~約1.10mm、約1.0mm~約1.05mm、約1.05mm~約1.5mm、約1.05mm~約1.45mm、約1.05mm~約1.40mm、約1.05mm~約1.35mm、約1.05mm~約1.30mm、約1.05mm~約1.25mm、約1.05mm~約1.20mm、約1.05mm~約1.15mm、約1.05mm~約1.10mm、約1.10mm~約1.5mm、約1.10mm~約1.45mm、約1.10mm~約1.40mm、約1.10mm~約1.35mm、約1.10mm~約1.30mm、約1.10mm~約1.25mm、約1.10mm~約1.20mm、約1.10mm~約1.15mm、約1.15mm~約1.5mm、約1.15mm~約1.45mm、約1.15mm~約1.40mm、約1.15mm~約1.35mm、約1.15mm~約1.30mm、約1.15mm~約1.25mm、約1.15mm~約1.20mm、約1.20mm~約1.5mm
、約1.20mm~約1.45mm、約1.20mm~約1.40mm、約1.20mm~約1.35mm、約1.20mm~約1.30mm、約1.20mm~約1.25mm、約1.25mm~約1.5mm、約1.25mm~約1.45mm、約1.25mm~約1.40mm、約1.25mm~約1.35mm、約1.25mm~約1.30mm、約1.30mm~約1.5mm、約1.30mm~約1.45mm、約1.30mm~約1.40mm、約1.30mm~約1.35mm、約1.35mm~約1.5mm、約1.35mm~約1.45mm、約1.35mm~約1.40mm、約1.40mm~約1.5mm、約1.40mm~約1.45mm、または約1.45mm~約1.50)である場合は、約2.3g/L~約3.3g/L(例えば、約2.3g/L~約3.2g/L、約2.3g/L~約3.1g/L、約2.3g/L~約3.0g/L、約2.3g/L~約2.9g/L、約2.3g/L~約2.8g/L、約2.3g/L~約2.7g/L、約2.3g/L~約2.6g/L、約2.3g/L~約2.5g/L、約2.4g/L~約3.3g/L、約2.4g/L~約3.2g/L、約2.4g/L~約3.1g/L、約2.4g/L~約3.0g/L、約2.4g/L~約2.9g/L、約2.4g/L~約2.8g/L、約2.4g/L~約2.7g/L、約2.4g/L~約2.6g/L、約2.5g/L~約3.3g/L、約2.5g/L~約3.2g/L、約2.5g/L~約3.1g/L、約2.5g/L~約3.0g/L、約2.5g/L~約2.9g/L、約2.5g/L~約2.8g/L、約2.5g/L~約2.7g/L、約2.6g/L~約3.3g/L、約2.6g/L~約3.2g/L、約2.6g/L~約3.1g/L、約2.6g/L~約3.0g/L、約2.6g/L~約2.9g/L、約2.6g/L~約2.8g/L、約2.7g/L~約3.3g/L、約2.7g/L~約3.2g/L、約2.7g/L~約3.1g/L、約2.7g/L~約3.0g/L、約2.7g/L~約2.9g/L、約2.8g/L~約3.3g/L、約2.8g/L~約3.2g/L、約2.8g/L~約3.1g/L、約2.8g/L~約3.0g/L、約2.9g/L~約3.3g/L、約2.9g/L~約3.2g/L、約2.9g/L~約3.1g/L、約3.0g/L~約3.3g/L、約3.0g/L~約3.2g/L、または約3.1g/L~約3.3g/L)のポロクサマー-188濃度を選択することを含む。
、約1.20mm~約1.45mm、約1.20mm~約1.40mm、約1.20mm~約1.35mm、約1.20mm~約1.30mm、約1.20mm~約1.25mm、約1.25mm~約1.5mm、約1.25mm~約1.45mm、約1.25mm~約1.40mm、約1.25mm~約1.35mm、約1.25mm~約1.30mm、約1.30mm~約1.5mm、約1.30mm~約1.45mm、約1.30mm~約1.40mm、約1.30mm~約1.35mm、約1.35mm~約1.5mm、約1.35mm~約1.45mm、約1.35mm~約1.40mm、約1.40mm~約1.5mm、約1.40mm~約1.45mm、または約1.45mm~約1.50)である場合は、約2.3g/L~約3.3g/L(例えば、約2.3g/L~約3.2g/L、約2.3g/L~約3.1g/L、約2.3g/L~約3.0g/L、約2.3g/L~約2.9g/L、約2.3g/L~約2.8g/L、約2.3g/L~約2.7g/L、約2.3g/L~約2.6g/L、約2.3g/L~約2.5g/L、約2.4g/L~約3.3g/L、約2.4g/L~約3.2g/L、約2.4g/L~約3.1g/L、約2.4g/L~約3.0g/L、約2.4g/L~約2.9g/L、約2.4g/L~約2.8g/L、約2.4g/L~約2.7g/L、約2.4g/L~約2.6g/L、約2.5g/L~約3.3g/L、約2.5g/L~約3.2g/L、約2.5g/L~約3.1g/L、約2.5g/L~約3.0g/L、約2.5g/L~約2.9g/L、約2.5g/L~約2.8g/L、約2.5g/L~約2.7g/L、約2.6g/L~約3.3g/L、約2.6g/L~約3.2g/L、約2.6g/L~約3.1g/L、約2.6g/L~約3.0g/L、約2.6g/L~約2.9g/L、約2.6g/L~約2.8g/L、約2.7g/L~約3.3g/L、約2.7g/L~約3.2g/L、約2.7g/L~約3.1g/L、約2.7g/L~約3.0g/L、約2.7g/L~約2.9g/L、約2.8g/L~約3.3g/L、約2.8g/L~約3.2g/L、約2.8g/L~約3.1g/L、約2.8g/L~約3.0g/L、約2.9g/L~約3.3g/L、約2.9g/L~約3.2g/L、約2.9g/L~約3.1g/L、約3.0g/L~約3.3g/L、約3.0g/L~約3.2g/L、または約3.1g/L~約3.3g/L)のポロクサマー-188濃度を選択することを含む。
いくつかの実施形態において、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約250μm~約750μm(例えば、約250μm~約700μm、約250μm~約650μm、約250μm~約600μm、約250μm~約550μm、約250μm~約500μm、約250μm~約450μm、約250μm~約400μm、約250μm~約350μm、約250μm~約300μm、約300μm~約750μm、約300μm~約700μm、約300μm~約650μm、約300μm~約600μm、約300μm~約550μm、約300μm~約500μm、約300μm~約450μm、約300μm~約400μm、約300μm~約350μm、約350μm~約750μm、約350μm~約700μm、約350μm~約650μm、約350μm~約600μm、約350μm~約550μm、約350μm~約500μm、約350μm~約450μm、約350μm~約400μm、約400μm~約750μm、約400μm~約700μm、約400μm~約650μm、約400μm~約600μm、約400μm~約550μm、約400μm~約500μm、約400μm~約450μm、約450μm~約750μm、約450μm~約700μm、約450μm~約650μm、約450μm~約600μm、約450μm~約550μm、約450μm~約500μm、約500μm~約750μm、約500μm~約700μm、約500μm~約650μm、約500μm~約600μm、約500μm~約550μm、約550μm~約750μm、約550μm~約700μm、約550μm~約650μm、約550μm~約600μm、約600μm~約750μm、約600μm~約700μm、約600μm~約650μm、約650μm~約750μm、約650μm~約700μm、または約700μm~750μm)である場合は、約3.3g/L~約4.3g/L(例えば、約3.3g/L~約4.2g/L、約3.3g/L~
約4.1g/L、約3.3g/L~約4.0g/L、約3.3g/L~約3.9g/L、約3.3g/L~約3.8g/L、約3.3g/L~約3.7g/L、約3.3g/L~約3.6g/L、約3.3g/L~約3.5g/L、約3.4g/L~約4.3g/L、約3.4g/L~約4.2g/L、約3.4g/L~約4.1g/L、約3.4g/L~約4.0g/L、約3.4g/L~約3.9g/L、約3.4g/L~約3.8g/L、約3.4g/L~約3.7g/L、約3.4g/L~約3.6g/L、約3.5g/L~約4.3g/L、約3.5g/L~約4.2g/L、約3.5g/L~約4.1g/L、約3.5g/L~約4.0g/L、約3.5g/L~約3.9g/L、約3.5g/L~約3.8g/L、約3.5g/L~約3.7g/L、約3.6g/L~約4.3g/L、約3.6g/L~約4.2g/L、約3.6g/L~約4.1g/L、約3.6g/L~約4.0g/L、約3.6g/L~約3.9g/L、約3.6g/L~約3.8g/L、約3.7g/L~約4.3g/L、約3.7g/L~約4.2g/L、約3.7g/L~約4.1g/L、約3.7g/L~約4.0g/L、約3.7g/L~約3.9g/L、約3.8g/L~約4.3g/L、約3.8g/L~約4.2g/L、約3.8g/L~約4.1g/L、約3.8g/L~約4.0g/L、約3.9g/L~約4.3g/L、約3.9g/L~約4.2g/L、約3.9g/L~約4.1g/L、約4.0g/L~約4.3g/L、約4.0g/L~約4.2g/L、または約4.1g/L~約4.3g/L)のポロクサマー-188濃度を選択することを含む。
約4.1g/L、約3.3g/L~約4.0g/L、約3.3g/L~約3.9g/L、約3.3g/L~約3.8g/L、約3.3g/L~約3.7g/L、約3.3g/L~約3.6g/L、約3.3g/L~約3.5g/L、約3.4g/L~約4.3g/L、約3.4g/L~約4.2g/L、約3.4g/L~約4.1g/L、約3.4g/L~約4.0g/L、約3.4g/L~約3.9g/L、約3.4g/L~約3.8g/L、約3.4g/L~約3.7g/L、約3.4g/L~約3.6g/L、約3.5g/L~約4.3g/L、約3.5g/L~約4.2g/L、約3.5g/L~約4.1g/L、約3.5g/L~約4.0g/L、約3.5g/L~約3.9g/L、約3.5g/L~約3.8g/L、約3.5g/L~約3.7g/L、約3.6g/L~約4.3g/L、約3.6g/L~約4.2g/L、約3.6g/L~約4.1g/L、約3.6g/L~約4.0g/L、約3.6g/L~約3.9g/L、約3.6g/L~約3.8g/L、約3.7g/L~約4.3g/L、約3.7g/L~約4.2g/L、約3.7g/L~約4.1g/L、約3.7g/L~約4.0g/L、約3.7g/L~約3.9g/L、約3.8g/L~約4.3g/L、約3.8g/L~約4.2g/L、約3.8g/L~約4.1g/L、約3.8g/L~約4.0g/L、約3.9g/L~約4.3g/L、約3.9g/L~約4.2g/L、約3.9g/L~約4.1g/L、約4.0g/L~約4.3g/L、約4.0g/L~約4.2g/L、または約4.1g/L~約4.3g/L)のポロクサマー-188濃度を選択することを含む。
方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約1μm~約250μm(例えば、約1μm~約200μm、約1μm~約150μm、約1μm~約100μm、約1μm~約50μm、約1μm~約25μm、約10μm~約250μm、約10μm~約200μm、約10μm~約150μm、約10μm~約100μm、約10μm~約50μm、約10μm~約25μm、約25μm~約250μm、約25μm~約200μm、約25μm~約150μm、約25μm~約100μm、約25μm~約50μm、約50μm~約250μm、約50μm~約200μm、約50μm~約150μm、約50μm~約100μm、約100μm~約250μm、約100μm~約200μm、約100μm~約150μm、約150μm~約250μm、約150μm~約200μm、または約200μm~約250μm)である場合は、例えば、約4.3g/Lより高い濃度(例えば、約4.4g/Lより高い濃度、約4.5g/Lより高い濃度、約4.6g/Lより高い濃度、約4.7g/Lより高い濃度、約4.8g/Lより高い濃度、約4.9g/Lより高い濃度、約5.0g/Lより高い濃度、約5.1g/Lより高い濃度、約5.2g/Lより高い濃度、約5.3g/Lより高い濃度、約5.4g/Lより高い濃度、約5.5g/Lより高い濃度、約5.6g/Lより高い濃度、約5.7g/Lより高い濃度、約5.8g/Lより高い濃度、約5.9g/Lより高い濃度、約6.0g/Lより高い濃度、約6.1g/Lより高い濃度、約6.2g/Lより高い濃度、約6.3g/Lより高い濃度、約6.4g/Lより高い濃度、約6.5g/Lより高い濃度、約6.6g/Lより高い濃度、約6.7g/Lより高い濃度、約6.8g/Lより高い濃度、約6.9g/Lより高い濃度、約7.0g/Lより高い濃度、約7.1g/Lより高い濃度、約7.2g/Lより高い濃度、約7.3g/Lより高い濃度、約7.4g/Lより高い濃度、約7.5g/Lより高い濃度、約7.6g/Lより高い濃度、約7.7g/Lより高い濃度、約7.8g/Lより高い濃度、約7.9g/Lより高い濃度、約8.0g/Lより高い濃度、約8.1g/Lより高い濃度、約8.2g/Lより高い濃度、約8.2g/Lより高い濃度、約8.3g/Lより高い濃度、約8.4g/Lより高い濃度、約8.5g/Lより高い濃度、約8.6g/Lより高い濃度、約8.7g/Lより高い濃度、約8.8g/Lより高い濃度、約8.9g/Lより高い濃度、約9.0g/Lより高い濃度、約9.1g/Lより高い濃度、約9.2g/Lより高い濃度、約9.3g/Lより高い濃度、約9.4g/Lより高い濃度、約9.5g/Lより高い濃度、約9.6g/Lより高い濃度、約9.7g/Lより高い濃度、約9.8g/Lより高い濃度、約9.9g/Lより高い濃度、または約10.0g/Lより高い濃度)のポロ
クサマー-188を選択することを含む。
クサマー-188を選択することを含む。
いくつかの例では、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約160μm~約190μm(例えば、約160μm~約185μm、約160μm~約180μm、約160μm~約175μm、約160μm~約170μm、約160μm~約165μm、約165μm~約190μm、約165μm~約185μm、約165μm~約180μm、約165μm~約175μm、約165μm~約170μm、約170μm~約190μm、約170μm~約185μm、約170μm~約180μm、約170μm~約175μm、約175μm~約190μm、約175μm~約185μm、約175μm~約180μm、約180μm~約190μm、約180μm~約185μm、または約185μm~約190μm)である場合は、4.3g/Lより高い濃度(例えば、約4.4g/Lより高い濃度、約4.5g/Lより高い濃度、約4.6g/Lより高い濃度、約4.7g/Lより高い濃度、約4.8g/Lより高い濃度、約4.9g/Lより高い濃度、約5.0g/Lより高い濃度、約5.1g/Lより高い濃度、約5.2g/Lより高い濃度、約5.3g/Lより高い濃度、約5.4g/Lより高い濃度、約5.5g/Lより高い濃度、約5.6g/Lより高い濃度、約5.7g/Lより高い濃度、約5.8g/Lより高い濃度、約5.9g/Lより高い濃度、約6.0g/Lより高い濃度、約6.1g/Lより高い濃度、約6.2g/Lより高い濃度、約6.3g/Lより高い濃度、約6.4g/Lより高い濃度、約6.5g/Lより高い濃度、約6.6g/Lより高い濃度、約6.7g/Lより高い濃度、約6.8g/Lより高い濃度、約6.9g/Lより高い濃度、約7.0g/Lより高い濃度、約7.1g/Lより高い濃度、約7.2g/Lより高い濃度、約7.3g/Lより高い濃度、約7.4g/Lより高い濃度、約7.5g/Lより高い濃度、約7.6g/Lより高い濃度、約7.7g/Lより高い濃度、約7.8g/Lより高い濃度、約7.9g/Lより高い濃度、約8.0g/Lより高い濃度、約8.1g/Lより高い濃度、約8.2g/Lより高い濃度、約8.2g/Lより高い濃度、約8.3g/Lより高い濃度、約8.4g/Lより高い濃度、約8.5g/Lより高い濃度、約8.6g/Lより高い濃度、約8.7g/Lより高い濃度、約8.8g/Lより高い濃度、約8.9g/Lより高い濃度、約9.0g/Lより高い濃度、約9.1g/Lより高い濃度、約9.2g/Lより高い濃度、約9.3g/Lより高い濃度、約9.4g/Lより高い濃度、約9.5g/Lより高い濃度、約9.6g/Lより高い濃度、約9.7g/Lより高い濃度、約9.8g/Lより高い濃度、約9.9g/Lより高い濃度、または約10.0g/Lより高い濃度)のポロクサマー-188を選択することを含む。
いくつかの実施形態において、方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが150μmより大きい(例えば、155μmより大きい、160μmより大きい、165μmより大きい、170μmより大きい、175μmより大きい、約180μmより大きい、185μmより大きい、約190μmより大きい、約195μmより大きい、約200μmより大きい、約205μmより大きい、約210μmより大きい、約215μmより大きい、約220μmより大きい、約225μmより大きい、約230μmより大きい、約235μmより大きい、約240μmより大きい、約245μmより大きい、約250μmより大きい、約255μmより大きい、約260μmより大きい、約265μmより大きい、約270μmより大きい、約275μmより大きい、約280μmより大きい、約290μmより大きい、約300μmより大きい、約350μmより大きい、約400μmより大きい、約450μmより大きい、または約500μmより大きい)場合は、約1.8g/L~約3.3g/L(例えば、約1.8g/L~約3.2g/L、約1.8g/L~約3.1g/L、約1.8g/L~約3.0g/L、約1.8g/L~約2.9g/L、約1.8g/L~約2.8g/L、約1.8g/L~約2.7g/L、約1.8g/L~約2.6g/L、約1.8g/L~約2.5g/L、約1.8g/L~約2.4g/L、約1.8g/L~約2.3g/L、約1.8g/L~
約2.2g/L、約1.8g/L~約2.1g/L、約1.8g/L~約2.0g/L、約1.9g/L~約3.3g/L、約1.9g/L~約3.2g/L、約1.9g/L~約3.1g/L、約1.9g/L~約3.0g/L、約1.9g/L~約2.9g/L、約1.9g/L~約2.8g/L、約1.9g/L~約2.7g/L、約1.9g/L~約2.6g/L、約1.9g/L~約2.5g/L、約1.9g/L~約2.4g/L、約1.9g/L~約2.3g/L、約1.9g/L~約2.2g/L、約1.9g/L~約2.1g/L、約2.0g/L~約3.3g/L、約2.0g/L~約3.2g/L、約2.0g/L~約3.1g/L、約2.0g/L~約3.0g/L、約2.0g/L~約2.9g/L、約2.0g/L~約2.8g/L、約2.0g/L~約2.7g/L、約2.0g/L~約2.6g/L、約2.0g/L~約2.5g/L、約2.0g/L~約2.4g/L、約2.0g/L~約2.3g/L、約2.0g/L~約2.2g/L、約2.1g/L~約3.3g/L、約2.1g/L~約3.2g/L、約2.1g/L~約3.1g/L、約2.1g/L~約3.0g/L、約2.1g/L~約2.9g/L、約2.1g/L~約2.8g/L、約2.1g/L~約2.7g/L、約2.1g/L~約2.6g/L、約2.1g/L~約2.5g/L、約2.1g/L~約2.4g/L、約2.1g/L~約2.3g/L、約2.2g/L~約3.3g/L、約2.2g/L~約3.2g/L、約2.2g/L~約3.1g/L、約2.2g/L~約3.0g/L、約2.2g/L~約2.9g/L、約2.2g/L~約2.8g/L、約2.2g/L~約2.7g/L、約2.2g/L~約2.6g/L、約2.2g/L~約2.5g/L、約2.2g/L~約2.4g/L、約2.3g/L~約3.3g/L、約2.3g/L~約3.2g/L、約2.3g/L~約3.1g/L、約2.3g/L~約3.0g/L、約2.3g/L~約2.9g/L、約2.3g/L~約2.8g/L、約2.3g/L~約2.7g/L、約2.3g/L~約2.6g/L、約2.3g/L~約2.5g/L、約2.4g/L~約3.3g/L、約2.4g/L~約3.2g/L、約2.4g/L~約3.1g/L、約2.4g/L~約3.0g/L、約2.4g/L~約2.9g/L、約2.4g/L~約2.8g/L、約2.4g/L~約2.7g/L、約2.4g/L~約2.6g/L、約2.5g/L~約3.3g/L、約2.5g/L~約3.2g/L、約2.5g/L~約3.1g/L、約2.5g/L~約3.0g/L、約2.5g/L~約2.9g/L、約2.5g/L~約2.8g/L、約2.5g/L~約2.7g/L、約2.6g/L~約3.3g/L、約2.6g/L~約3.2g/L、約2.6g/L~約3.1g/L、約2.6g/L~約3.0g/L、約2.6g/L~約2.9g/L、約2.6g/L~約2.8g/L、約2.7g/L~約3.3g/L、約2.7g/L~約3.2g/L、約2.7g/L~約3.1g/L、約2.7g/L~約3.0g/L、約2.7g/L~約2.9g/L、約2.8g/L~約3.3g/L、約2.8g/L~約3.2g/L、約2.8g/L~約3.1g/L、約2.8g/L~約3.0g/L、約2.9g/L~約3.3g/L、約2.9g/L~約3.2g/L、約2.9g/L~約3.1g/L、約3.0g/L~約3.3g/L、約3.0g/L~約3.2g/L、または約3.1g/L~約3.3g/L)の濃度のポロクサマー-188を選択することを含む。
約2.2g/L、約1.8g/L~約2.1g/L、約1.8g/L~約2.0g/L、約1.9g/L~約3.3g/L、約1.9g/L~約3.2g/L、約1.9g/L~約3.1g/L、約1.9g/L~約3.0g/L、約1.9g/L~約2.9g/L、約1.9g/L~約2.8g/L、約1.9g/L~約2.7g/L、約1.9g/L~約2.6g/L、約1.9g/L~約2.5g/L、約1.9g/L~約2.4g/L、約1.9g/L~約2.3g/L、約1.9g/L~約2.2g/L、約1.9g/L~約2.1g/L、約2.0g/L~約3.3g/L、約2.0g/L~約3.2g/L、約2.0g/L~約3.1g/L、約2.0g/L~約3.0g/L、約2.0g/L~約2.9g/L、約2.0g/L~約2.8g/L、約2.0g/L~約2.7g/L、約2.0g/L~約2.6g/L、約2.0g/L~約2.5g/L、約2.0g/L~約2.4g/L、約2.0g/L~約2.3g/L、約2.0g/L~約2.2g/L、約2.1g/L~約3.3g/L、約2.1g/L~約3.2g/L、約2.1g/L~約3.1g/L、約2.1g/L~約3.0g/L、約2.1g/L~約2.9g/L、約2.1g/L~約2.8g/L、約2.1g/L~約2.7g/L、約2.1g/L~約2.6g/L、約2.1g/L~約2.5g/L、約2.1g/L~約2.4g/L、約2.1g/L~約2.3g/L、約2.2g/L~約3.3g/L、約2.2g/L~約3.2g/L、約2.2g/L~約3.1g/L、約2.2g/L~約3.0g/L、約2.2g/L~約2.9g/L、約2.2g/L~約2.8g/L、約2.2g/L~約2.7g/L、約2.2g/L~約2.6g/L、約2.2g/L~約2.5g/L、約2.2g/L~約2.4g/L、約2.3g/L~約3.3g/L、約2.3g/L~約3.2g/L、約2.3g/L~約3.1g/L、約2.3g/L~約3.0g/L、約2.3g/L~約2.9g/L、約2.3g/L~約2.8g/L、約2.3g/L~約2.7g/L、約2.3g/L~約2.6g/L、約2.3g/L~約2.5g/L、約2.4g/L~約3.3g/L、約2.4g/L~約3.2g/L、約2.4g/L~約3.1g/L、約2.4g/L~約3.0g/L、約2.4g/L~約2.9g/L、約2.4g/L~約2.8g/L、約2.4g/L~約2.7g/L、約2.4g/L~約2.6g/L、約2.5g/L~約3.3g/L、約2.5g/L~約3.2g/L、約2.5g/L~約3.1g/L、約2.5g/L~約3.0g/L、約2.5g/L~約2.9g/L、約2.5g/L~約2.8g/L、約2.5g/L~約2.7g/L、約2.6g/L~約3.3g/L、約2.6g/L~約3.2g/L、約2.6g/L~約3.1g/L、約2.6g/L~約3.0g/L、約2.6g/L~約2.9g/L、約2.6g/L~約2.8g/L、約2.7g/L~約3.3g/L、約2.7g/L~約3.2g/L、約2.7g/L~約3.1g/L、約2.7g/L~約3.0g/L、約2.7g/L~約2.9g/L、約2.8g/L~約3.3g/L、約2.8g/L~約3.2g/L、約2.8g/L~約3.1g/L、約2.8g/L~約3.0g/L、約2.9g/L~約3.3g/L、約2.9g/L~約3.2g/L、約2.9g/L~約3.1g/L、約3.0g/L~約3.3g/L、約3.0g/L~約3.2g/L、または約3.1g/L~約3.3g/L)の濃度のポロクサマー-188を選択することを含む。
方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが約80μm~約150μm(例えば、約80μm~約145μm、約80μm~約140μm、約80μm~約135μm、約80μm~約130μm、約80μm~約125μm、約80μm~約120μm、約80μm~約115μm、約80μm~約110μm、約80μm~約105μm、約80μm~約100μm、約80μm~約95μm、約80μm~約90μm、約80μm~約85μm、約85μm~約150μm、約85μm~約145μm、約85μm~約140μm、約85μm~約135μm、約85μm~約130μm、約85μm~約125μm、約85μm~約120μm、約85μm~約115μm、約85μm~約110μm、約85μm~約105μm、約85μm~約100μm、約85μm~約95μm、約85μm~約90μm、約90μm~約150μm
、約90μm~約145μm、約90μm~約140μm、約90μm~約135μm、約90μm~約130μm、約90μm~約125μm、約90μm~約120μm、約90μm~約115μm、約90μm~約110μm、約90μm~約105μm、約90μm~約100μm、約90μm~約95μm、約95μm~約150μm、約95μm~約145μm、約95μm~約140μm、約95μm~約135μm、約95μm~約130μm、約95μm~約125μm、約95μm~約120μm、約95μm~約115μm、約95μm~約110μm、約95μm~約105μm、約95μm~約100μm、約100μm~約150μm、約100μm~約145μm、約100μm~約140μm、約100μm~約135μm、約100μm~約130μm、約100μm~約125μm、約100μm~約120μm、約100μm~約115μm、約100μm~約110μm、約100μm~約105μm、約105μm~約150μm、約105μm~約145μm、約105μm~約140μm、約105μm~約135μm、約105μm~約130μm、約105μm~約125μm、約105μm~約120μm、約105μm~約115μm、約105μm~約110μm、約110μm~約150μm、約110μm~約145μm、約110μm~約140μm、約110μm~約135μm、約110μm~約130μm、約110μm~約125μm、約110μm~約120μm、約110μm~約115μm、約115μm~約150μm、約115μm~約145μm、約115μm~約140μm、約115μm~約135μm、約115μm~約130μm、約115μm~約125μm、約115μm~約120μm、約120μm~約150μm、約120μm~約145μm、約120μm~約140μm、約120μm~約135μm、約120μm~約130μm、約120μm~約125μm、約125μm~約150μm、約125μm~約145μm、約125μm~約140μm、約125μm~約135μm、約125μm~約130μm、約130μm~約150μm、約130μm~約145μm、約130μm~約140μm、約130μm~約135μm、約135μm~約150μm、約135μm~約145μm、約135μm~約140μm、約140μm~約150μm、約140μm~約145μm、または約145μm~約150μm)である場合は、例えば、約3.3g/L~約4.3g/L(例えば、約3.3g/L~約4.2g/L、約3.3g/L~約4.1g/L、約3.3g/L~約4.0g/L、約3.3g/L~約3.9g/L、約3.3g/L~約3.8g/L、約3.3g/L~約3.7g/L、約3.3g/L~約3.6g/L、約3.3g/L~約3.5g/L、約3.4g/L~約4.3g/L、約3.4g/L~約4.2g/L、約3.4g/L~約4.1g/L、約3.4g/L~約4.0g/L、約3.4g/L~約3.9g/L、約3.4g/L~約3.8g/L、約3.4g/L~約3.7g/L、約3.4g/L~約3.6g/L、約3.5g/L~約4.3g/L、約3.5g/L~約4.2g/L、約3.5g/L~約4.1g/L、約3.5g/L~約4.0g/L、約3.5g/L~約3.9g/L、約3.5g/L~約3.8g/L、約3.5g/L~約3.7g/L、約3.6g/L~約4.3g/L、約3.6g/L~約4.2g/L、約3.6g/L~約4.1g/L、約3.6g/L~約4.0g/L、約3.6g/L~約3.9g/L、約3.6g/L~約3.8g/L、約3.7g/L~約4.3g/L、約3.7g/L~約4.2g/L、約3.7g/L~約4.1g/L、約3.7g/L~約4.0g/L、約3.7g/L~約3.9g/L、約3.8g/L~約4.3g/L、約3.8g/L~約4.2g/L、約3.8g/L~約4.1g/L、約3.8g/L~約4.0g/L、約3.9g/L~約4.3g/L、約3.9g/L~約4.2g/L、約3.9g/L~約4.1g/L、約4.0g/L~約4.3g/L、約4.0g/L~約4.2g/L、または約4.1g/L~約4.3g/L)の濃度のポロクサマー-188を選択することを含む。
、約90μm~約145μm、約90μm~約140μm、約90μm~約135μm、約90μm~約130μm、約90μm~約125μm、約90μm~約120μm、約90μm~約115μm、約90μm~約110μm、約90μm~約105μm、約90μm~約100μm、約90μm~約95μm、約95μm~約150μm、約95μm~約145μm、約95μm~約140μm、約95μm~約135μm、約95μm~約130μm、約95μm~約125μm、約95μm~約120μm、約95μm~約115μm、約95μm~約110μm、約95μm~約105μm、約95μm~約100μm、約100μm~約150μm、約100μm~約145μm、約100μm~約140μm、約100μm~約135μm、約100μm~約130μm、約100μm~約125μm、約100μm~約120μm、約100μm~約115μm、約100μm~約110μm、約100μm~約105μm、約105μm~約150μm、約105μm~約145μm、約105μm~約140μm、約105μm~約135μm、約105μm~約130μm、約105μm~約125μm、約105μm~約120μm、約105μm~約115μm、約105μm~約110μm、約110μm~約150μm、約110μm~約145μm、約110μm~約140μm、約110μm~約135μm、約110μm~約130μm、約110μm~約125μm、約110μm~約120μm、約110μm~約115μm、約115μm~約150μm、約115μm~約145μm、約115μm~約140μm、約115μm~約135μm、約115μm~約130μm、約115μm~約125μm、約115μm~約120μm、約120μm~約150μm、約120μm~約145μm、約120μm~約140μm、約120μm~約135μm、約120μm~約130μm、約120μm~約125μm、約125μm~約150μm、約125μm~約145μm、約125μm~約140μm、約125μm~約135μm、約125μm~約130μm、約130μm~約150μm、約130μm~約145μm、約130μm~約140μm、約130μm~約135μm、約135μm~約150μm、約135μm~約145μm、約135μm~約140μm、約140μm~約150μm、約140μm~約145μm、または約145μm~約150μm)である場合は、例えば、約3.3g/L~約4.3g/L(例えば、約3.3g/L~約4.2g/L、約3.3g/L~約4.1g/L、約3.3g/L~約4.0g/L、約3.3g/L~約3.9g/L、約3.3g/L~約3.8g/L、約3.3g/L~約3.7g/L、約3.3g/L~約3.6g/L、約3.3g/L~約3.5g/L、約3.4g/L~約4.3g/L、約3.4g/L~約4.2g/L、約3.4g/L~約4.1g/L、約3.4g/L~約4.0g/L、約3.4g/L~約3.9g/L、約3.4g/L~約3.8g/L、約3.4g/L~約3.7g/L、約3.4g/L~約3.6g/L、約3.5g/L~約4.3g/L、約3.5g/L~約4.2g/L、約3.5g/L~約4.1g/L、約3.5g/L~約4.0g/L、約3.5g/L~約3.9g/L、約3.5g/L~約3.8g/L、約3.5g/L~約3.7g/L、約3.6g/L~約4.3g/L、約3.6g/L~約4.2g/L、約3.6g/L~約4.1g/L、約3.6g/L~約4.0g/L、約3.6g/L~約3.9g/L、約3.6g/L~約3.8g/L、約3.7g/L~約4.3g/L、約3.7g/L~約4.2g/L、約3.7g/L~約4.1g/L、約3.7g/L~約4.0g/L、約3.7g/L~約3.9g/L、約3.8g/L~約4.3g/L、約3.8g/L~約4.2g/L、約3.8g/L~約4.1g/L、約3.8g/L~約4.0g/L、約3.9g/L~約4.3g/L、約3.9g/L~約4.2g/L、約3.9g/L~約4.1g/L、約4.0g/L~約4.3g/L、約4.0g/L~約4.2g/L、または約4.1g/L~約4.3g/L)の濃度のポロクサマー-188を選択することを含む。
方法は、孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが約1μm~約80μm(例えば、約1μm~約50μm、約1μm~約25μm、約1μm~約10μm、約1μm~約5μm、約5μm~約80μm、約5μm~約50μm、約5
μm~約25μm、約5μm~約10μm、約10μm~約80μm、約10μm~約50μm、約10μm~約25μm、約25μm~約80μm、約25μm~約50μm、または約50μm~約80μm)である場合は、例えば、約4.5g/Lの濃度または約4.5g/Lより高い濃度(例えば、約4.6g/Lの濃度もしくは4.6g/Lより高い濃度、約4.7g/Lの濃度もしくは4.7g/Lより高い濃度、約4.8g/Lの濃度もしくは4.8g/Lより高い濃度、約4.9g/Lの濃度もしくは4.9g/Lより高い濃度、約5.0g/Lの濃度もしくは5.0g/Lより高い濃度、約5.1g/Lの濃度もしくは5.1g/Lより高い濃度、約5.2g/Lの濃度もしくは5.2g/Lより高い濃度、約5.3g/Lの濃度もしくは5.3g/Lより高い濃度、約5.4g/Lの濃度もしくは5.4g/Lより高い濃度、約5.5g/Lの濃度もしくは5.5g/Lより高い濃度、約5.6g/Lの濃度もしくは5.6g/Lより高い濃度、約5.7g/Lの濃度もしくは5.7g/Lより高い濃度、約5.8g/Lの濃度もしくは5.8g/Lより高い濃度、約6.0g/Lの濃度もしくは6.0g/Lより高い濃度、約6.1g/Lの濃度もしくは6.1g/Lより高い濃度、約6.2g/Lの濃度もしくは6.2g/Lより高い濃度、約6.3g/Lの濃度もしくは6.3g/Lより高い濃度、約6.4g/Lの濃度もしくは6.4g/Lより高い濃度、約6.5g/Lの濃度もしくは6.5g/Lより高い濃度、約6.6g/Lの濃度もしくは6.6g/Lより高い濃度、約6.7g/Lの濃度もしくは6.7g/Lより高い濃度、約6.8g/Lの濃度もしくは6.8g/Lより高い濃度、約6.9g/Lの濃度もしくは6.9g/Lより高い濃度、約7.0g/Lの濃度もしくは7.0g/Lより高い濃度、約7.1g/Lの濃度もしくは7.1g/Lより高い濃度、約7.2g/Lの濃度もしくは7.2g/Lより高い濃度、約7.3g/Lの濃度もしくは7.3g/Lより高い濃度、約7.4g/Lの濃度もしくは7.4g/Lより高い濃度、約7.5g/Lの濃度もしくは7.5g/Lより高い濃度、約7.6g/Lの濃度もしくは7.6g/Lより高い濃度、約7.7g/Lの濃度もしくは7.7g/Lより高い濃度、約7.8g/Lの濃度もしくは7.8g/Lより高い濃度、約7.9g/Lの濃度もしくは7.9g/Lより高い濃度、約8.0g/Lの濃度もしくは8.0g/Lより高い濃度、約8.1g/Lの濃度もしくは8.1g/Lより高い濃度、約8.2g/Lの濃度もしくは8.2g/Lより高い濃度、約8.3g/Lの濃度もしくは8.3g/Lより高い濃度、約8.4g/Lの濃度もしくは8.4g/Lより高い濃度、約8.5g/Lの濃度もしくは8.5g/Lより高い濃度、約8.6g/Lの濃度もしくは8.6g/Lより高い濃度、約8.7g/Lの濃度もしくは8.7g/Lより高い濃度、約8.8g/Lの濃度もしくは8.8g/Lより高い濃度、約8.9g/Lの濃度もしくは8.9g/Lより高い濃度、約9.0g/Lの濃度もしくは9.0g/Lより高い濃度、約9.1g/Lの濃度もしくは9.1g/Lより高い濃度、約9.2g/Lの濃度もしくは9.2g/Lより高い濃度、約9.3g/Lの濃度もしくは9.3g/Lより高い濃度、約9.4g/Lの濃度もしくは9.4g/Lより高い濃度、約9.5g/Lの濃度もしくは9.5g/Lより高い濃度、約9.6g/Lの濃度もしくは9.6g/Lより高い濃度、約9.7g/Lの濃度もしくは9.7g/Lより高い濃度、約9.8g/Lの濃度もしくは9.8g/Lより高い濃度、約9.9g/Lの濃度もしくは9.9g/Lより高い濃度、または約10.0g/Lの濃度もしくは10.0g/Lより高い濃度)のポロクサマー-188を選択することを含む。
μm~約25μm、約5μm~約10μm、約10μm~約80μm、約10μm~約50μm、約10μm~約25μm、約25μm~約80μm、約25μm~約50μm、または約50μm~約80μm)である場合は、例えば、約4.5g/Lの濃度または約4.5g/Lより高い濃度(例えば、約4.6g/Lの濃度もしくは4.6g/Lより高い濃度、約4.7g/Lの濃度もしくは4.7g/Lより高い濃度、約4.8g/Lの濃度もしくは4.8g/Lより高い濃度、約4.9g/Lの濃度もしくは4.9g/Lより高い濃度、約5.0g/Lの濃度もしくは5.0g/Lより高い濃度、約5.1g/Lの濃度もしくは5.1g/Lより高い濃度、約5.2g/Lの濃度もしくは5.2g/Lより高い濃度、約5.3g/Lの濃度もしくは5.3g/Lより高い濃度、約5.4g/Lの濃度もしくは5.4g/Lより高い濃度、約5.5g/Lの濃度もしくは5.5g/Lより高い濃度、約5.6g/Lの濃度もしくは5.6g/Lより高い濃度、約5.7g/Lの濃度もしくは5.7g/Lより高い濃度、約5.8g/Lの濃度もしくは5.8g/Lより高い濃度、約6.0g/Lの濃度もしくは6.0g/Lより高い濃度、約6.1g/Lの濃度もしくは6.1g/Lより高い濃度、約6.2g/Lの濃度もしくは6.2g/Lより高い濃度、約6.3g/Lの濃度もしくは6.3g/Lより高い濃度、約6.4g/Lの濃度もしくは6.4g/Lより高い濃度、約6.5g/Lの濃度もしくは6.5g/Lより高い濃度、約6.6g/Lの濃度もしくは6.6g/Lより高い濃度、約6.7g/Lの濃度もしくは6.7g/Lより高い濃度、約6.8g/Lの濃度もしくは6.8g/Lより高い濃度、約6.9g/Lの濃度もしくは6.9g/Lより高い濃度、約7.0g/Lの濃度もしくは7.0g/Lより高い濃度、約7.1g/Lの濃度もしくは7.1g/Lより高い濃度、約7.2g/Lの濃度もしくは7.2g/Lより高い濃度、約7.3g/Lの濃度もしくは7.3g/Lより高い濃度、約7.4g/Lの濃度もしくは7.4g/Lより高い濃度、約7.5g/Lの濃度もしくは7.5g/Lより高い濃度、約7.6g/Lの濃度もしくは7.6g/Lより高い濃度、約7.7g/Lの濃度もしくは7.7g/Lより高い濃度、約7.8g/Lの濃度もしくは7.8g/Lより高い濃度、約7.9g/Lの濃度もしくは7.9g/Lより高い濃度、約8.0g/Lの濃度もしくは8.0g/Lより高い濃度、約8.1g/Lの濃度もしくは8.1g/Lより高い濃度、約8.2g/Lの濃度もしくは8.2g/Lより高い濃度、約8.3g/Lの濃度もしくは8.3g/Lより高い濃度、約8.4g/Lの濃度もしくは8.4g/Lより高い濃度、約8.5g/Lの濃度もしくは8.5g/Lより高い濃度、約8.6g/Lの濃度もしくは8.6g/Lより高い濃度、約8.7g/Lの濃度もしくは8.7g/Lより高い濃度、約8.8g/Lの濃度もしくは8.8g/Lより高い濃度、約8.9g/Lの濃度もしくは8.9g/Lより高い濃度、約9.0g/Lの濃度もしくは9.0g/Lより高い濃度、約9.1g/Lの濃度もしくは9.1g/Lより高い濃度、約9.2g/Lの濃度もしくは9.2g/Lより高い濃度、約9.3g/Lの濃度もしくは9.3g/Lより高い濃度、約9.4g/Lの濃度もしくは9.4g/Lより高い濃度、約9.5g/Lの濃度もしくは9.5g/Lより高い濃度、約9.6g/Lの濃度もしくは9.6g/Lより高い濃度、約9.7g/Lの濃度もしくは9.7g/Lより高い濃度、約9.8g/Lの濃度もしくは9.8g/Lより高い濃度、約9.9g/Lの濃度もしくは9.9g/Lより高い濃度、または約10.0g/Lの濃度もしくは10.0g/Lより高い濃度)のポロクサマー-188を選択することを含む。
培養が灌流培養である場合、第2の液体培地は、選択されたポロクサマー-188濃度を含む。
生細胞密度に基づくポロクサマー-188濃度の増大
本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、培地中の生細胞密度に基づき、培地中のポロクサマー-188濃度を経時的に増大させることを含む。例えば、本明細書において記載される方法のいずれかは、培地中の生細胞密度が約20×106細胞/mL~約60×106細胞/mL(例えば、約20×106細胞/mL~約5
8×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約40×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約38×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約36×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約34×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約32×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約30×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約28×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約26×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約24×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約22×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約40×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約38×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約36×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約34×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約32×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約30×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約28×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約26×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約24×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約40×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約38×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約36×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約34×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約32×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約30×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約28×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約26×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約40×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約38×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約36×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約34×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約32×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約30×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約28×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~
約52×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約40×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約38×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約36×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約34×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約32×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約30×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約40×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約38×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約36×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約34×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約32×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約40×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約38×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約36×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約34×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約40×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約38×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約36×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、
約36×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約40×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約38×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約40×106細胞/mL、
約40×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約40×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約40×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約40×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約40×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約40×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約40×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約40×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約40×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約40×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約42×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約42×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約42×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約42×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約42×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約42×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約42×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約42×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約42×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約44×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約44×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約44×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約44×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約44×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約44×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約44×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約44×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約46×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約46×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約46×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約46×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約46×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約46×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約46×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約48×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約48×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約48×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約48×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約48×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約48×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約50×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約50×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約50×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約50×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約50×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約52×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約52×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約52×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約52×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約54×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約54×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約54×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約56×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約56×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、または約58×106細胞/mL~約60×106細胞/mL)である場合、培地中のポロクサマー-188濃度を1.8g/Lより高く(例えば、約1.8g/L~約3.0g/L、約1.8g/L~約2.9g/L、約1.8g/L~約2.8g/L、約1.8g/L~約2.7g/L、約1.8g/L~約2.5g/L、約1.8g/L~約2.4g/L、約1.8g/L~約2.3g/L、約1.8g/L~約2.2g/L、約1.8g/L~約2.1g/L、約1.8g/L~約2.0g/L、約1.9g/L~約3.0g/L、約1.9g/L~約2.9g/L、約1.9g/L~約2.8g/L、約1.9g/L~約2.7g/L、約1.9g/L~約2.6g/L、約1.9g/L~約2.5g/L、約1.9g/L~約2.4g/L、約1.9g/L~約2.3g/L、約1.9g/L~約2.2g/L、約1.9g/L~約2.1g/L、約2.0g/L~約3.0g/L、約2.0g/L~約2.9g/L、約2.0g/L~約2.8g/L、約2.0g/L~約2.7g/L、約2.0g/L~約2.6g/L、約2.0g/L~約2.5g/L、約2.0g/L~約2.4g/L、約2.0g/L~約2.3g/L、約2.0g/L~約2.2g/L、約2.1g/L~約3.0g/L、約2.1g/L~約2.9g/L、約2.1g/L~約2.8g/L、約2.1g/L~約2.7g/L、約
2.1g/L~約2.6g/L、約2.1g/L~約2.5g/L、約2.1g/L~約2.4g/L、約2.1g/L~約2.3g/L、約2.2g/L~約3.0g/L、約2.2g/L~約2.9g/L、約2.2g/L~約2.8g/L、約2.2g/L~約2.7g/L、約2.2g/L~約2.6g/L、約2.2g/L~約2.5g/L、約2.2g/L~約2.4g/L、約2.3g/L~約3.0g/L、約2.3g/L~約2.9g/L、約2.3g/L~約2.8g/L、約2.3g/L~約2.7g/L、約2.3g/L~約2.6g/L、約2.3g/L~約2.5g/L、約2.4g/L~約3.0g/L、約2.4g/L~約2.9g/L、約2.4g/L~約2.8g/L、約2.4g/L~約2.7g/L、約2.4g/L~約2.6g/L、約2.5g/L~約3.0g/L、約2.5g/L~約2.9g/L、約2.5g/L~約2.8g/L、約2.5g/L~約2.7g/L、約2.6g/L~約3.0g/L、約2.6g/L~約2.9g/L、約2.6g/L~約2.8g/L、約2.7g/L~約3.0g/L、約2.7g/L~約2.9g/L、または約2.8g/L~約3.0g/L)まで増大させることを含む。
本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、培地中の生細胞密度に基づき、培地中のポロクサマー-188濃度を経時的に増大させることを含む。例えば、本明細書において記載される方法のいずれかは、培地中の生細胞密度が約20×106細胞/mL~約60×106細胞/mL(例えば、約20×106細胞/mL~約5
8×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約40×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約38×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約36×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約34×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約32×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約30×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約28×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約26×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約24×106細胞/mL、約20×106細胞/mL~約22×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約40×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約38×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約36×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約34×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約32×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約30×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約28×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約26×106細胞/mL、約22×106細胞/mL~約24×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約40×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約38×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約36×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約34×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約32×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約30×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約28×106細胞/mL、約24×106細胞/mL~約26×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約40×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約38×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約36×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約34×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約32×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約30×106細胞/mL、約26×106細胞/mL~約28×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~
約52×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約40×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約38×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約36×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約34×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約32×106細胞/mL、約28×106細胞/mL~約30×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約40×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約38×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約36×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約34×106細胞/mL、約30×106細胞/mL~約32×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約40×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約38×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約36×106細胞/mL、約32×106細胞/mL~約34×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約40×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約38×106細胞/mL、約34×106細胞/mL~約36×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、
約36×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約40×106細胞/mL、約36×106細胞/mL~約38×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約38×106細胞/mL~約40×106細胞/mL、
約40×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約40×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約40×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約40×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約40×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約40×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約40×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約40×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約40×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約40×106細胞/mL~約42×106細胞/mL、約42×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約42×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約42×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約42×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約42×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約42×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約42×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約42×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約42×106細胞/mL~約44×106細胞/mL、約44×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約44×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約44×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約44×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約44×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約44×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約44×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約44×106細胞/mL~約46×106細胞/mL、約46×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約46×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約46×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約46×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約46×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約46×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約46×106細胞/mL~約48×106細胞/mL、約48×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約48×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約48×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約48×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約48×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約48×106細胞/mL~約50×106細胞/mL、約50×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約50×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約50×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約50×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約50×106細胞/mL~約52×106細胞/mL、約52×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約52×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約52×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約52×106細胞/mL~約54×106細胞/mL、約54×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約54×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、約54×106細胞/mL~約56×106細胞/mL、約56×106細胞/mL~約60×106細胞/mL、約56×106細胞/mL~約58×106細胞/mL、または約58×106細胞/mL~約60×106細胞/mL)である場合、培地中のポロクサマー-188濃度を1.8g/Lより高く(例えば、約1.8g/L~約3.0g/L、約1.8g/L~約2.9g/L、約1.8g/L~約2.8g/L、約1.8g/L~約2.7g/L、約1.8g/L~約2.5g/L、約1.8g/L~約2.4g/L、約1.8g/L~約2.3g/L、約1.8g/L~約2.2g/L、約1.8g/L~約2.1g/L、約1.8g/L~約2.0g/L、約1.9g/L~約3.0g/L、約1.9g/L~約2.9g/L、約1.9g/L~約2.8g/L、約1.9g/L~約2.7g/L、約1.9g/L~約2.6g/L、約1.9g/L~約2.5g/L、約1.9g/L~約2.4g/L、約1.9g/L~約2.3g/L、約1.9g/L~約2.2g/L、約1.9g/L~約2.1g/L、約2.0g/L~約3.0g/L、約2.0g/L~約2.9g/L、約2.0g/L~約2.8g/L、約2.0g/L~約2.7g/L、約2.0g/L~約2.6g/L、約2.0g/L~約2.5g/L、約2.0g/L~約2.4g/L、約2.0g/L~約2.3g/L、約2.0g/L~約2.2g/L、約2.1g/L~約3.0g/L、約2.1g/L~約2.9g/L、約2.1g/L~約2.8g/L、約2.1g/L~約2.7g/L、約
2.1g/L~約2.6g/L、約2.1g/L~約2.5g/L、約2.1g/L~約2.4g/L、約2.1g/L~約2.3g/L、約2.2g/L~約3.0g/L、約2.2g/L~約2.9g/L、約2.2g/L~約2.8g/L、約2.2g/L~約2.7g/L、約2.2g/L~約2.6g/L、約2.2g/L~約2.5g/L、約2.2g/L~約2.4g/L、約2.3g/L~約3.0g/L、約2.3g/L~約2.9g/L、約2.3g/L~約2.8g/L、約2.3g/L~約2.7g/L、約2.3g/L~約2.6g/L、約2.3g/L~約2.5g/L、約2.4g/L~約3.0g/L、約2.4g/L~約2.9g/L、約2.4g/L~約2.8g/L、約2.4g/L~約2.7g/L、約2.4g/L~約2.6g/L、約2.5g/L~約3.0g/L、約2.5g/L~約2.9g/L、約2.5g/L~約2.8g/L、約2.5g/L~約2.7g/L、約2.6g/L~約3.0g/L、約2.6g/L~約2.9g/L、約2.6g/L~約2.8g/L、約2.7g/L~約3.0g/L、約2.7g/L~約2.9g/L、または約2.8g/L~約3.0g/L)まで増大させることを含む。
本明細書において記載される方法のいずれかは、培地中の生細胞密度が約60×106細胞/mL~約90×106細胞/mL(例えば、約60×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約60×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約60×106細胞/mL~約84×106細胞/mL、約60×106細胞/mL~約82×106細胞/mL、約60×106細胞/mL~約80×106細胞/mL、約60×106細胞/mL~約78×106細胞/mL、約60×106細胞/mL~約76×106細胞/mL、約60×106細胞/mL~約74×106細胞/mL、約60×106細胞/mL~約72×106細胞/mL、約60×106細胞/mL~約70×106細胞/mL、約60×106細胞/mL~約68×106細胞/mL、約60×106細胞/mL~約66×106細胞/mL、約60×106細胞/mL~約64×106細胞/mL、約60×106細胞/mL~約62×106細胞/mL、約62×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約62×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約62×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約62×106細胞/mL~約84×106細胞/mL、約62×106細胞/mL~約82×106細胞/mL、約62×106細胞/mL~約80×106細胞/mL、約62×106細胞/mL~約78×106細胞/mL、約62×106細胞/mL~約76×106細胞/mL、約62×106細胞/mL~約74×106細胞/mL、約62×106細胞/mL~約72×106細胞/mL、約62×106細胞/mL~約70×106細胞/mL、約62×106細胞/mL~約68×106細胞/mL、約62×106細胞/mL~約66×106細胞/mL、約62×106細胞/mL~約64×106細胞/mL、約64×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約64×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約64×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約64×106細胞/mL~約84×106細胞/mL、約64×106細胞/mL~約82×106細胞/mL、約64×106細胞/mL~約80×106細胞/mL、約64×106細胞/mL~約78×106細胞/mL、約64×106細胞/mL~約76×106細胞/mL、約64×106細胞/mL~約74×106細胞/mL、約64×106細胞/mL~約72×106細胞/mL、約64×106細胞/mL~約70×106細胞/mL、約64×106細胞/mL~約68×106細胞/mL、約64×106細胞/mL~約66×106細胞/mL、約66×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約66×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約66×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約66×106細胞/mL~約84×106細胞/mL、約66×106細胞/mL~約82×106細胞/mL、約66×106細胞/mL~約80×106細胞/mL、約66×106細胞/mL~約78×106細胞/mL、約66×106細胞/mL~約76×106細胞/mL、約66×106細胞/mL~約74×106細胞/mL、約66×106細胞/mL~約72×106細胞/mL、約66×106細胞/m
L~約70×106細胞/mL、約66×106細胞/mL~約68×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約84×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約82×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約80×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約78×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約76×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約74×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約72×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約70×106細胞/mL、約70×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約70×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約70×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約70×106細胞/mL~約84×106細胞/mL、約70×106細胞/mL~約82×106細胞/mL、約70×106細胞/mL~約80×106細胞/mL、約70×106細胞/mL~約78×106細胞/mL、約70×106細胞/mL~約76×106細胞/mL、約70×106細胞/mL~約74×106細胞/mL、約70×106細胞/mL~約72×106細胞/mL、約72×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約72×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約72×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約72×106細胞/mL~約84×106細胞/mL、約72×106細胞/mL~約82×106細胞/mL、約72×106細胞/mL~約80×106細胞/mL、約72×106細胞/mL~約78×106細胞/mL、約72×106細胞/mL~約76×106細胞/mL、約72×106細胞/mL~約74×106細胞/mL、約74×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約74×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約74×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約74×106細胞/mL~約84×106細胞/mL、約74×106細胞/mL~約82×106細胞/mL、約74×106細胞/mL~約80×106細胞/mL、約74×106細胞/mL~約78×106細胞/mL、約74×106細胞/mL~約76×106細胞/mL、約76×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約76×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約76×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約76×106細胞/mL~約84×106細胞/mL、約76×106細胞/mL~約82×106細胞/mL、約76×106細胞/mL~約80×106細胞/mL、約76×106細胞/mL~約78×106細胞/mL、約78×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約78×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約78×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約78×106細胞/mL~約84×106細胞/mL、約78×106細胞/mL~約82×106細胞/mL、約78×106細胞/mL~約80×106細胞/mL、約80×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約80×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約80×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約80×106細胞/mL~約84×106細胞/mL、約80×106細胞/mL~約82×106細胞/mL、約82×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約82×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約82×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約82×106細胞/mL~約84×106細胞/mL、約84×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約84×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約84×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約86×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約86×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、または約88×106細胞/mL~約90×106細胞/mL)である場合、
培地中のポロクサマー-188濃度を約3.0g/L~約6.0g/L(例えば、約3.0g/L~約5.9g/L、約3.0g/L~約5.8g/L、約3.0g/L~約5.7g/L、約3.0g/L~約5.6g/L、約3.0g/L~約5.5g/L、約3.0g/L~約5.4g/L、約3.0g/L~約5.3g/L、約3.0g/L~約5.2g/L、約3.0g/L~約5.1g/L、約3.0g/L~約5.0g/L、約3.
0g/L~約4.9g/L、約3.0g/L~約4.8g/L、約3.0g/L~約4.7g/L、約3.0g/L~約4.6g/L、約3.0g/L~約4.5g/L、約3.0g/L~約4.4g/L、約3.0g/L~約4.3g/L、約3.0g/L~約4.2g/L、約3.0g/L~約4.1g/L、約3.0g/L~約4.0g/L、約3.0g/L~約3.9g/L、約3.0g/L~約3.8g/L、約3.0g/L~約3.7g/L、約3.0g/L~約3.6g/L、約3.0g/L~約3.5g/L、約3.0g/L~約3.4g/L、約3.0g/L~約3.3g/L、約3.0g/L~約3.2g/L、約3.1g/L~約6.0g/L、約3.1g/L~約5.9g/L、約3.1g/L~約5.8g/L、約3.1g/L~約5.7g/L、約3.1g/L~約5.6g/L、約3.1g/L~約5.5g/L、約3.1g/L~約5.4g/L、約3.1g/L~約5.3g/L、約3.1g/L~約5.2g/L、約3.1g/L~約5.1g/L、約3.1g/L~約5.0g/L、約3.1g/L~約4.9g/L、約3.1g/L~約4.8g/L、約3.1g/L~約4.7g/L、約3.1g/L~約4.6g/L、約3.1g/L~約4.5g/L、約3.1g/L~約4.4g/L、約3.1g/L~約4.3g/L、約3.1g/L~約4.2g/L、約3.1g/L~約4.1g/L、約3.1g/L~約4.0g/L、約3.1g/L~約3.9g/L、約3.1g/L~約3.8g/L、約3.1g/L~約3.7g/L、約3.1g/L~約3.6g/L、約3.1g/L~約3.5g/L、約3.1g/L~約3.4g/L、約3.1g/L~約3.3g/L、約3.2g/L~約6.0g/L、約3.2g/L~約5.9g/L、約3.2g/L~約5.8g/L、約3.2g/L~約5.7g/L、約3.2g/L~約5.6g/L、約3.2g/L~約5.5g/L、約3.2g/L~約5.4g/L、約3.2g/L~約5.3g/L、約3.2g/L~約5.2g/L、約3.2g/L~約5.1g/L、約3.2g/L~約5.0g/L、約3.2g/L~約4.9g/L、約3.2g/L~約4.8g/L、約3.2g/L~約4.7g/L、約3.2g/L~約4.6g/L、約3.2g/L~約4.5g/L、約3.2g/L~約4.4g/L、約3.2g/L~約4.3g/L、約3.2g/L~約4.2g/L、約3.2g/L~約4.1g/L、約3.2g/L~約4.0g/L、約3.2g/L~約3.9g/L、約3.2g/L~約3.8g/L、約3.2g/L~約3.7g/L、約3.2g/L~約3.6g/L、約3.2g/L~約3.5g/L、約3.2g/L~約3.4g/L、約3.3g/L~約6.0g/L、約3.3g/L~約5.9g/L、約3.3g/L~約5.8g/L、約3.3g/L~約5.7g/L、約3.3g/L~約5.6g/L、約3.3g/L~約5.5g/L、約3.3g/L~約5.4g/L、約3.3g/L~約5.3g/L、約3.3g/L~約5.2g/L、約3.3g/L~約5.1g/L、約3.3g/L~約5.0g/L、約3.3g/L~約4.9g/L、約3.3g/L~約4.8g/L、約3.3g/L~約4.7g/L、約3.3g/L~約4.6g/L、約3.3g/L~約4.5g/L、約3.3g/L~約4.4g/L、約3.3g/L~約4.3g/L、約3.3g/L~約4.2g/L、約3.3g/L~約4.1g/L、約3.3g/L~約4.0g/L、約3.3g/L~約3.9g/L、約3.3g/L~約3.8g/L、約3.3g/L~約3.7g/L、約3.3g/L~約3.6g/L、約3.3g/L~約3.5g/L、約3.4g/L~約6.0g/L、約3.4g/L~約5.9g/L、約3.4g/L~約5.8g/L、約3.4g/L~約5.7g/L、約3.4g/L~約5.6g/L、約3.4g/L~約5.5g/L、約3.4g/L~約5.4g/L、約3.4g/L~約5.3g/L、約3.4g/L~約5.2g/L、約3.4g/L~約5.1g/L、約3.4g/L~約5.0g/L、約3.4g/L~約4.9g/L、約3.4g/L~約4.8g/L、約3.4g/L~約4.7g/L、約3.4g/L~約4.6g/L、約3.4g/L~約4.5g/L、約3.4g/L~約4.4g/L、約3.4g/L~約4.3g/L、約3.4g/L~約4.2g/L、約3.4g/L~約4.1g/L、約3.4g/L~約4.0g/L、約3.4g/L~約3.9g/L、約3.4g/L~約3.8g/L、約3.4g/L~約3.7g/L、約3.4g/L~約3.6g/L、約3.5g/L~約6.0g/L、約3.
5g/L~約5.9g/L、約3.5g/L~約5.8g/L、約3.5g/L~約5.7g/L、約3.5g/L~約5.6g/L、約3.5g/L~約5.5g/L、約3.5g/L~約5.4g/L、約3.5g/L~約5.3g/L、約3.5g/L~約5.2g/L、約3.5g/L~約5.1g/L、約3.5g/L~約5.0g/L、約3.5g/L~約4.9g/L、約3.5g/L~約4.8g/L、約3.5g/L~約4.7g/L、約3.5g/L~約4.6g/L、約3.5g/L~約4.5g/L、約3.5g/L~約4.4g/L、約3.5g/L~約4.3g/L、約3.5g/L~約4.2g/L、約3.5g/L~約4.1g/L、約3.5g/L~約4.0g/L、約3.5g/L~約3.9g/L、約3.5g/L~約3.8g/L、約3.5g/L~約3.7g/L、約3.6g/L~約6.0g/L、約3.6g/L~約5.9g/L、約3.6g/L~約5.8g/L、約3.6g/L~約5.7g/L、約3.6g/L~約5.6g/L、約3.6g/L~約5.5g/L、約3.6g/L~約5.4g/L、約3.6g/L~約5.3g/L、約3.6g/L~約5.2g/L、約3.6g/L~約5.1g/L、約3.6g/L~約5.0g/L、約3.6g/L~約4.9g/L、約3.6g/L~約4.8g/L、約3.6g/L~約4.7g/L、約3.6g/L~約4.6g/L、約3.6g/L~約4.5g/L、約3.6g/L~約4.4g/L、約3.6g/L~約4.3g/L、約3.6g/L~約4.2g/L、約3.6g/L~約4.1g/L、約3.6g/L~約4.0g/L、約3.6g/L~約3.9g/L、約3.6g/L~約3.8g/L、約3.7g/L~約6.0g/L、約3.7g/L~約5.9g/L、約3.7g/L~約5.8g/L、約3.7g/L~約5.7g/L、約3.7g/L~約5.6g/L、約3.7g/L~約5.5g/L、約3.7g/L~約5.4g/L、約3.7g/L~約5.3g/L、約3.7g/L~約5.2g/L、約3.7g/L~約5.1g/L、約3.7g/L~約5.0g/L、約3.7g/L~約4.9g/L、約3.7g/L~約4.8g/L、約3.7g/L~約4.7g/L、約3.7g/L~約4.6g/L、約3.7g/L~約4.5g/L、約3.7g/L~約4.4g/L、約3.7g/L~約4.3g/L、約3.7g/L~約4.2g/L、約3.7g/L~約4.1g/L、約3.7g/L~約4.0g/L、約3.7g/L~約3.9g/L、約3.8g/L~約6.0g/L、約3.8g/L~約5.9g/L、約3.8g/L~約5.8g/L、約3.8g/L~約5.7g/L、約3.8g/L~約5.6g/L、約3.8g/L~約5.5g/L、約3.8g/L~約5.4g/L、約3.8g/L~約5.3g/L、約3.8g/L~約5.2g/L、約3.8g/L~約5.1g/L、約3.8g/L~約5.0g/L、約3.8g/L~約4.9g/L、約3.8g/L~約4.8g/L、約3.8g/L~約4.7g/L、約3.8g/L~約4.6g/L、約3.8g/L~約4.5g/L、約3.8g/L~約4.4g/L、約3.8g/L~約4.3g/L、約3.8g/L~約4.2g/L、約3.8g/L~約4.1g/L、約3.8g/L~約4.0g/L、約3.9g/L~約6.0g/L、約3.9g/L~約5.9g/L、約3.9g/L~約5.8g/L、約3.9g/L~約5.7g/L、約3.9g/L~約5.6g/L、約3.9g/L~約5.5g/L、約3.9g/L~約5.4g/L、約3.9g/L~約5.3g/L、約3.9g/L~約5.2g/L、約3.9g/L~約5.1g/L、約3.9g/L~約5.0g/L、約3.9g/L~約4.9g/L、約3.9g/L~約4.8g/L、約3.9g/L~約4.7g/L、約3.9g/L~約4.6g/L、約3.9g/L~約4.5g/L、約3.9g/L~約4.4g/L、約3.9g/L~約4.3g/L、約3.9g/L~約4.2g/L、約3.9g/L~約4.1g/L、約4.0g/L~約6.0g/L、約4.0g/L~約5.9g/L、約4.0g/L~約5.8g/L、約4.0g/L~約5.7g/L、約4.0g/L~約5.6g/L、約4.0g/L~約5.5g/L、約4.0g/L~約5.4g/L、約4.0g/L~約5.3g/L、約4.0g/L~約5.2g/L、約4.0g/L~約5.1g/L、約4.0g/L~約5.0g/L、約4.0g/L~約4.9g/L、約4.0g/L~約4.8g/L、約4.0g/L~約4.7g/L、約4.0g/L~約4.6g/L、約4.0g/L~約4.5g/L、約4.
0g/L~約4.4g/L、約4.0g/L~約4.3g/L、約4.0g/L~約4.2g/L、約4.1g/L~約6.0g/L、約4.1g/L~約5.9g/L、約4.1g/L~約5.8g/L、約4.1g/L~約5.7g/L、約4.1g/L~約5.6g/L、約4.1g/L~約5.5g/L、約4.1g/L~約5.4g/L、約4.1g/L~約5.3g/L、約4.1g/L~約5.2g/L、約4.1g/L~約5.1g/L、約4.1g/L~約5.0g/L、約4.1g/L~約4.9g/L、約4.1g/L~約4.8g/L、約4.1g/L~約4.7g/L、約4.1g/L~約4.6g/L、約4.1g/L~約4.5g/L、約4.1g/L~約4.4g/L、約4.1g/L~約4.3g/L、約4.2g/L~約6.0g/L、約4.2g/L~約5.9g/L、約4.2g/L~約5.8g/L、約4.2g/L~約5.7g/L、約4.2g/L~約5.6g/L、約4.2g/L~約5.5g/L、約4.2g/L~約5.4g/L、約4.2g/L~約5.3g/L、約4.2g/L~約5.2g/L、約4.2g/L~約5.1g/L、約4.2g/L~約5.0g/L、約4.2g/L~約4.9g/L、約4.2g/L~約4.8g/L、約4.2g/L~約4.7g/L、約4.2g/L~約4.6g/L、約4.2g/L~約4.5g/L、約4.2g/L~約4.4g/L、約4.3g/L~約6.0g/L、約4.3g/L~約5.9g/L、約4.3g/L~約5.8g/L、約4.3g/L~約5.7g/L、約4.3g/L~約5.6g/L、約4.3g/L~約5.5g/L、約4.3g/L~約5.4g/L、約4.3g/L~約5.3g/L、約4.3g/L~約5.2g/L、約4.3g/L~約5.1g/L、約4.3g/L~約5.0g/L、約4.3g/L~約4.9g/L、約4.3g/L~約4.8g/L、約4.3g/L~約4.7g/L、約4.3g/L~約4.6g/L、約4.3g/L~約4.5g/L、約4.4g/L~約6.0g/L、約4.4g/L~約5.9g/L、約4.4g/L~約5.8g/L、
約4.4g/L~約5.7g/L、約4.4g/L~約5.6g/L、約4.4g/L~約5.5g/L、約4.4g/L~約5.4g/L、約4.4g/L~約5.3g/L、約4.4g/L~約5.2g/L、約4.4g/L~約5.1g/L、約4.4g/L~約5.0g/L、約4.4g/L~約4.9g/L、約4.4g/L~約4.8g/L、約4.4g/L~約4.7g/L、約4.4g/L~約4.6g/L、約4.5g/L~約6.0g/L、約4.5g/L~約5.9g/L、約4.5g/L~約5.8g/L、約4.5g/L~約5.7g/L、約4.5g/L~約5.6g/L、約4.5g/L~約5.5g/L、約4.5g/L~約5.4g/L、約4.5g/L~約5.3g/L、約4.5g/L~約5.2g/L、約4.5g/L~約5.1g/L、約4.5g/L~約5.0g/L、約4.5g/L~約4.9g/L、約4.5g/L~約4.8g/L、約4.5g/L~約4.7g/L、約4.6g/L~約6.0g/L、約4.6g/L~約5.9g/L、約4.6g/L~約5.8g/L、約4.6g/L~約5.7g/L、約4.6g/L~約5.6g/L、約4.6g/L~約5.5g/L、約4.6g/L~約5.4g/L、約4.6g/L~約5.3g/L、約4.6g/L~約5.2g/L、約4.6g/L~約5.1g/L、約4.6g/L~約5.0g/L、約4.6g/L~約4.9g/L、約4.6g/L~約4.8g/L、約4.7g/L~約6.0g/L、約4.7g/L~約5.9g/L、約4.7g/L~約5.8g/L、約4.7g/L~約5.7g/L、約4.7g/L~約5.6g/L、約4.7g/L~約5.5g/L、約4.7g/L~約5.4g/L、約4.7g/L~約5.3g/L、約4.7g/L~約5.2g/L、約4.7g/L~約5.1g/L、約4.7g/L~約5.0g/L、約4.7g/L~約4.9g/L、約4.8g/L~約6.0g/L、約4.8g/L~約5.9g/L、約4.8g/L~約5.8g/L、約4.8g/L~約5.7g/L、約4.8g/L~約5.6g/L、約4.8g/L~約5.5g/L、約4.8g/L~約5.4g/L、約4.8g/L~約5.3g/L、約4.8g/L~約5.2g/L、約4.8g/L~約5.1g/L、約4.8g/L~約5.0g/L、約4.9g/L~約6.0g/L、約4.9g/L~約5.9g/L、約4.9g/L~約5.8g/L、約4.9g/L~約5.7g/L、約4.9g/L~約5.6g/L、約4.9g/L~
約5.5g/L、約4.9g/L~約5.4g/L、約4.9g/L~約5.3g/L、約4.9g/L~約5.2g/L、約4.9g/L~約5.1g/L、約5.0g/L~約6.0g/L、約5.0g/L~約5.9g/L、約5.0g/L~約5.8g/L、約5.0g/L~約5.7g/L、約5.0g/L~約5.6g/L、約5.0g/L~約5.5g/L、約5.0g/L~約5.4g/L、約5.0g/L~約5.3g/L、約5.0g/L~約5.2g/L、約5.1g/L~約6.0g/L、約5.1g/L~約5.9g/L、約5.1g/L~約5.8g/L、約5.1g/L~約5.7g/L、約5.1g/L~約5.6g/L、約5.1g/L~約5.5g/L、約5.1g/L~約5.4g/L、約5.1g/L~約5.3g/L、約5.2g/L~約6.0g/L、約5.2g/L~約5.9g/L、約5.2g/L~約5.8g/L、約5.2g/L~約5.7g/L、約5.2g/L~約5.6g/L、約5.2g/L~約5.5g/L、約5.2g/L~約5.4g/L、約5.3g/L~約6.0g/L、約5.3g/L~約5.9g/L、約5.3g/L~約5.8g/L、約5.3g/L~約5.7g/L、約5.3g/L~約5.6g/L、約5.3g/L~約5.5g/L、約5.4g/L~約6.0g/L、約5.4g/L~約5.9g/L、約5.4g/L~約5.8g/L、約5.4g/L~約5.7g/L、約5.4g/L~約5.6g/L、約5.5g/L~約6.0g/L、約5.5g/L~約5.9g/L、約5.5g/L~約5.8g/L、約5.5g/L~約5.7g/L、約5.6g/L~約6.0g/L、約5.6g/L~約5.9g/L、約5.6g/L~約5.8g/L、約5.7g/L~約6.0g/L、約5.7g/L~約5.9g/L、または約5.8g/L~約6.0g/L)まで増大させることを含む。
L~約70×106細胞/mL、約66×106細胞/mL~約68×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約84×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約82×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約80×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約78×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約76×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約74×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約72×106細胞/mL、約68×106細胞/mL~約70×106細胞/mL、約70×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約70×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約70×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約70×106細胞/mL~約84×106細胞/mL、約70×106細胞/mL~約82×106細胞/mL、約70×106細胞/mL~約80×106細胞/mL、約70×106細胞/mL~約78×106細胞/mL、約70×106細胞/mL~約76×106細胞/mL、約70×106細胞/mL~約74×106細胞/mL、約70×106細胞/mL~約72×106細胞/mL、約72×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約72×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約72×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約72×106細胞/mL~約84×106細胞/mL、約72×106細胞/mL~約82×106細胞/mL、約72×106細胞/mL~約80×106細胞/mL、約72×106細胞/mL~約78×106細胞/mL、約72×106細胞/mL~約76×106細胞/mL、約72×106細胞/mL~約74×106細胞/mL、約74×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約74×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約74×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約74×106細胞/mL~約84×106細胞/mL、約74×106細胞/mL~約82×106細胞/mL、約74×106細胞/mL~約80×106細胞/mL、約74×106細胞/mL~約78×106細胞/mL、約74×106細胞/mL~約76×106細胞/mL、約76×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約76×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約76×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約76×106細胞/mL~約84×106細胞/mL、約76×106細胞/mL~約82×106細胞/mL、約76×106細胞/mL~約80×106細胞/mL、約76×106細胞/mL~約78×106細胞/mL、約78×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約78×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約78×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約78×106細胞/mL~約84×106細胞/mL、約78×106細胞/mL~約82×106細胞/mL、約78×106細胞/mL~約80×106細胞/mL、約80×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約80×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約80×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約80×106細胞/mL~約84×106細胞/mL、約80×106細胞/mL~約82×106細胞/mL、約82×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約82×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約82×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約82×106細胞/mL~約84×106細胞/mL、約84×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約84×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、約84×106細胞/mL~約86×106細胞/mL、約86×106細胞/mL~約90×106細胞/mL、約86×106細胞/mL~約88×106細胞/mL、または約88×106細胞/mL~約90×106細胞/mL)である場合、
培地中のポロクサマー-188濃度を約3.0g/L~約6.0g/L(例えば、約3.0g/L~約5.9g/L、約3.0g/L~約5.8g/L、約3.0g/L~約5.7g/L、約3.0g/L~約5.6g/L、約3.0g/L~約5.5g/L、約3.0g/L~約5.4g/L、約3.0g/L~約5.3g/L、約3.0g/L~約5.2g/L、約3.0g/L~約5.1g/L、約3.0g/L~約5.0g/L、約3.
0g/L~約4.9g/L、約3.0g/L~約4.8g/L、約3.0g/L~約4.7g/L、約3.0g/L~約4.6g/L、約3.0g/L~約4.5g/L、約3.0g/L~約4.4g/L、約3.0g/L~約4.3g/L、約3.0g/L~約4.2g/L、約3.0g/L~約4.1g/L、約3.0g/L~約4.0g/L、約3.0g/L~約3.9g/L、約3.0g/L~約3.8g/L、約3.0g/L~約3.7g/L、約3.0g/L~約3.6g/L、約3.0g/L~約3.5g/L、約3.0g/L~約3.4g/L、約3.0g/L~約3.3g/L、約3.0g/L~約3.2g/L、約3.1g/L~約6.0g/L、約3.1g/L~約5.9g/L、約3.1g/L~約5.8g/L、約3.1g/L~約5.7g/L、約3.1g/L~約5.6g/L、約3.1g/L~約5.5g/L、約3.1g/L~約5.4g/L、約3.1g/L~約5.3g/L、約3.1g/L~約5.2g/L、約3.1g/L~約5.1g/L、約3.1g/L~約5.0g/L、約3.1g/L~約4.9g/L、約3.1g/L~約4.8g/L、約3.1g/L~約4.7g/L、約3.1g/L~約4.6g/L、約3.1g/L~約4.5g/L、約3.1g/L~約4.4g/L、約3.1g/L~約4.3g/L、約3.1g/L~約4.2g/L、約3.1g/L~約4.1g/L、約3.1g/L~約4.0g/L、約3.1g/L~約3.9g/L、約3.1g/L~約3.8g/L、約3.1g/L~約3.7g/L、約3.1g/L~約3.6g/L、約3.1g/L~約3.5g/L、約3.1g/L~約3.4g/L、約3.1g/L~約3.3g/L、約3.2g/L~約6.0g/L、約3.2g/L~約5.9g/L、約3.2g/L~約5.8g/L、約3.2g/L~約5.7g/L、約3.2g/L~約5.6g/L、約3.2g/L~約5.5g/L、約3.2g/L~約5.4g/L、約3.2g/L~約5.3g/L、約3.2g/L~約5.2g/L、約3.2g/L~約5.1g/L、約3.2g/L~約5.0g/L、約3.2g/L~約4.9g/L、約3.2g/L~約4.8g/L、約3.2g/L~約4.7g/L、約3.2g/L~約4.6g/L、約3.2g/L~約4.5g/L、約3.2g/L~約4.4g/L、約3.2g/L~約4.3g/L、約3.2g/L~約4.2g/L、約3.2g/L~約4.1g/L、約3.2g/L~約4.0g/L、約3.2g/L~約3.9g/L、約3.2g/L~約3.8g/L、約3.2g/L~約3.7g/L、約3.2g/L~約3.6g/L、約3.2g/L~約3.5g/L、約3.2g/L~約3.4g/L、約3.3g/L~約6.0g/L、約3.3g/L~約5.9g/L、約3.3g/L~約5.8g/L、約3.3g/L~約5.7g/L、約3.3g/L~約5.6g/L、約3.3g/L~約5.5g/L、約3.3g/L~約5.4g/L、約3.3g/L~約5.3g/L、約3.3g/L~約5.2g/L、約3.3g/L~約5.1g/L、約3.3g/L~約5.0g/L、約3.3g/L~約4.9g/L、約3.3g/L~約4.8g/L、約3.3g/L~約4.7g/L、約3.3g/L~約4.6g/L、約3.3g/L~約4.5g/L、約3.3g/L~約4.4g/L、約3.3g/L~約4.3g/L、約3.3g/L~約4.2g/L、約3.3g/L~約4.1g/L、約3.3g/L~約4.0g/L、約3.3g/L~約3.9g/L、約3.3g/L~約3.8g/L、約3.3g/L~約3.7g/L、約3.3g/L~約3.6g/L、約3.3g/L~約3.5g/L、約3.4g/L~約6.0g/L、約3.4g/L~約5.9g/L、約3.4g/L~約5.8g/L、約3.4g/L~約5.7g/L、約3.4g/L~約5.6g/L、約3.4g/L~約5.5g/L、約3.4g/L~約5.4g/L、約3.4g/L~約5.3g/L、約3.4g/L~約5.2g/L、約3.4g/L~約5.1g/L、約3.4g/L~約5.0g/L、約3.4g/L~約4.9g/L、約3.4g/L~約4.8g/L、約3.4g/L~約4.7g/L、約3.4g/L~約4.6g/L、約3.4g/L~約4.5g/L、約3.4g/L~約4.4g/L、約3.4g/L~約4.3g/L、約3.4g/L~約4.2g/L、約3.4g/L~約4.1g/L、約3.4g/L~約4.0g/L、約3.4g/L~約3.9g/L、約3.4g/L~約3.8g/L、約3.4g/L~約3.7g/L、約3.4g/L~約3.6g/L、約3.5g/L~約6.0g/L、約3.
5g/L~約5.9g/L、約3.5g/L~約5.8g/L、約3.5g/L~約5.7g/L、約3.5g/L~約5.6g/L、約3.5g/L~約5.5g/L、約3.5g/L~約5.4g/L、約3.5g/L~約5.3g/L、約3.5g/L~約5.2g/L、約3.5g/L~約5.1g/L、約3.5g/L~約5.0g/L、約3.5g/L~約4.9g/L、約3.5g/L~約4.8g/L、約3.5g/L~約4.7g/L、約3.5g/L~約4.6g/L、約3.5g/L~約4.5g/L、約3.5g/L~約4.4g/L、約3.5g/L~約4.3g/L、約3.5g/L~約4.2g/L、約3.5g/L~約4.1g/L、約3.5g/L~約4.0g/L、約3.5g/L~約3.9g/L、約3.5g/L~約3.8g/L、約3.5g/L~約3.7g/L、約3.6g/L~約6.0g/L、約3.6g/L~約5.9g/L、約3.6g/L~約5.8g/L、約3.6g/L~約5.7g/L、約3.6g/L~約5.6g/L、約3.6g/L~約5.5g/L、約3.6g/L~約5.4g/L、約3.6g/L~約5.3g/L、約3.6g/L~約5.2g/L、約3.6g/L~約5.1g/L、約3.6g/L~約5.0g/L、約3.6g/L~約4.9g/L、約3.6g/L~約4.8g/L、約3.6g/L~約4.7g/L、約3.6g/L~約4.6g/L、約3.6g/L~約4.5g/L、約3.6g/L~約4.4g/L、約3.6g/L~約4.3g/L、約3.6g/L~約4.2g/L、約3.6g/L~約4.1g/L、約3.6g/L~約4.0g/L、約3.6g/L~約3.9g/L、約3.6g/L~約3.8g/L、約3.7g/L~約6.0g/L、約3.7g/L~約5.9g/L、約3.7g/L~約5.8g/L、約3.7g/L~約5.7g/L、約3.7g/L~約5.6g/L、約3.7g/L~約5.5g/L、約3.7g/L~約5.4g/L、約3.7g/L~約5.3g/L、約3.7g/L~約5.2g/L、約3.7g/L~約5.1g/L、約3.7g/L~約5.0g/L、約3.7g/L~約4.9g/L、約3.7g/L~約4.8g/L、約3.7g/L~約4.7g/L、約3.7g/L~約4.6g/L、約3.7g/L~約4.5g/L、約3.7g/L~約4.4g/L、約3.7g/L~約4.3g/L、約3.7g/L~約4.2g/L、約3.7g/L~約4.1g/L、約3.7g/L~約4.0g/L、約3.7g/L~約3.9g/L、約3.8g/L~約6.0g/L、約3.8g/L~約5.9g/L、約3.8g/L~約5.8g/L、約3.8g/L~約5.7g/L、約3.8g/L~約5.6g/L、約3.8g/L~約5.5g/L、約3.8g/L~約5.4g/L、約3.8g/L~約5.3g/L、約3.8g/L~約5.2g/L、約3.8g/L~約5.1g/L、約3.8g/L~約5.0g/L、約3.8g/L~約4.9g/L、約3.8g/L~約4.8g/L、約3.8g/L~約4.7g/L、約3.8g/L~約4.6g/L、約3.8g/L~約4.5g/L、約3.8g/L~約4.4g/L、約3.8g/L~約4.3g/L、約3.8g/L~約4.2g/L、約3.8g/L~約4.1g/L、約3.8g/L~約4.0g/L、約3.9g/L~約6.0g/L、約3.9g/L~約5.9g/L、約3.9g/L~約5.8g/L、約3.9g/L~約5.7g/L、約3.9g/L~約5.6g/L、約3.9g/L~約5.5g/L、約3.9g/L~約5.4g/L、約3.9g/L~約5.3g/L、約3.9g/L~約5.2g/L、約3.9g/L~約5.1g/L、約3.9g/L~約5.0g/L、約3.9g/L~約4.9g/L、約3.9g/L~約4.8g/L、約3.9g/L~約4.7g/L、約3.9g/L~約4.6g/L、約3.9g/L~約4.5g/L、約3.9g/L~約4.4g/L、約3.9g/L~約4.3g/L、約3.9g/L~約4.2g/L、約3.9g/L~約4.1g/L、約4.0g/L~約6.0g/L、約4.0g/L~約5.9g/L、約4.0g/L~約5.8g/L、約4.0g/L~約5.7g/L、約4.0g/L~約5.6g/L、約4.0g/L~約5.5g/L、約4.0g/L~約5.4g/L、約4.0g/L~約5.3g/L、約4.0g/L~約5.2g/L、約4.0g/L~約5.1g/L、約4.0g/L~約5.0g/L、約4.0g/L~約4.9g/L、約4.0g/L~約4.8g/L、約4.0g/L~約4.7g/L、約4.0g/L~約4.6g/L、約4.0g/L~約4.5g/L、約4.
0g/L~約4.4g/L、約4.0g/L~約4.3g/L、約4.0g/L~約4.2g/L、約4.1g/L~約6.0g/L、約4.1g/L~約5.9g/L、約4.1g/L~約5.8g/L、約4.1g/L~約5.7g/L、約4.1g/L~約5.6g/L、約4.1g/L~約5.5g/L、約4.1g/L~約5.4g/L、約4.1g/L~約5.3g/L、約4.1g/L~約5.2g/L、約4.1g/L~約5.1g/L、約4.1g/L~約5.0g/L、約4.1g/L~約4.9g/L、約4.1g/L~約4.8g/L、約4.1g/L~約4.7g/L、約4.1g/L~約4.6g/L、約4.1g/L~約4.5g/L、約4.1g/L~約4.4g/L、約4.1g/L~約4.3g/L、約4.2g/L~約6.0g/L、約4.2g/L~約5.9g/L、約4.2g/L~約5.8g/L、約4.2g/L~約5.7g/L、約4.2g/L~約5.6g/L、約4.2g/L~約5.5g/L、約4.2g/L~約5.4g/L、約4.2g/L~約5.3g/L、約4.2g/L~約5.2g/L、約4.2g/L~約5.1g/L、約4.2g/L~約5.0g/L、約4.2g/L~約4.9g/L、約4.2g/L~約4.8g/L、約4.2g/L~約4.7g/L、約4.2g/L~約4.6g/L、約4.2g/L~約4.5g/L、約4.2g/L~約4.4g/L、約4.3g/L~約6.0g/L、約4.3g/L~約5.9g/L、約4.3g/L~約5.8g/L、約4.3g/L~約5.7g/L、約4.3g/L~約5.6g/L、約4.3g/L~約5.5g/L、約4.3g/L~約5.4g/L、約4.3g/L~約5.3g/L、約4.3g/L~約5.2g/L、約4.3g/L~約5.1g/L、約4.3g/L~約5.0g/L、約4.3g/L~約4.9g/L、約4.3g/L~約4.8g/L、約4.3g/L~約4.7g/L、約4.3g/L~約4.6g/L、約4.3g/L~約4.5g/L、約4.4g/L~約6.0g/L、約4.4g/L~約5.9g/L、約4.4g/L~約5.8g/L、
約4.4g/L~約5.7g/L、約4.4g/L~約5.6g/L、約4.4g/L~約5.5g/L、約4.4g/L~約5.4g/L、約4.4g/L~約5.3g/L、約4.4g/L~約5.2g/L、約4.4g/L~約5.1g/L、約4.4g/L~約5.0g/L、約4.4g/L~約4.9g/L、約4.4g/L~約4.8g/L、約4.4g/L~約4.7g/L、約4.4g/L~約4.6g/L、約4.5g/L~約6.0g/L、約4.5g/L~約5.9g/L、約4.5g/L~約5.8g/L、約4.5g/L~約5.7g/L、約4.5g/L~約5.6g/L、約4.5g/L~約5.5g/L、約4.5g/L~約5.4g/L、約4.5g/L~約5.3g/L、約4.5g/L~約5.2g/L、約4.5g/L~約5.1g/L、約4.5g/L~約5.0g/L、約4.5g/L~約4.9g/L、約4.5g/L~約4.8g/L、約4.5g/L~約4.7g/L、約4.6g/L~約6.0g/L、約4.6g/L~約5.9g/L、約4.6g/L~約5.8g/L、約4.6g/L~約5.7g/L、約4.6g/L~約5.6g/L、約4.6g/L~約5.5g/L、約4.6g/L~約5.4g/L、約4.6g/L~約5.3g/L、約4.6g/L~約5.2g/L、約4.6g/L~約5.1g/L、約4.6g/L~約5.0g/L、約4.6g/L~約4.9g/L、約4.6g/L~約4.8g/L、約4.7g/L~約6.0g/L、約4.7g/L~約5.9g/L、約4.7g/L~約5.8g/L、約4.7g/L~約5.7g/L、約4.7g/L~約5.6g/L、約4.7g/L~約5.5g/L、約4.7g/L~約5.4g/L、約4.7g/L~約5.3g/L、約4.7g/L~約5.2g/L、約4.7g/L~約5.1g/L、約4.7g/L~約5.0g/L、約4.7g/L~約4.9g/L、約4.8g/L~約6.0g/L、約4.8g/L~約5.9g/L、約4.8g/L~約5.8g/L、約4.8g/L~約5.7g/L、約4.8g/L~約5.6g/L、約4.8g/L~約5.5g/L、約4.8g/L~約5.4g/L、約4.8g/L~約5.3g/L、約4.8g/L~約5.2g/L、約4.8g/L~約5.1g/L、約4.8g/L~約5.0g/L、約4.9g/L~約6.0g/L、約4.9g/L~約5.9g/L、約4.9g/L~約5.8g/L、約4.9g/L~約5.7g/L、約4.9g/L~約5.6g/L、約4.9g/L~
約5.5g/L、約4.9g/L~約5.4g/L、約4.9g/L~約5.3g/L、約4.9g/L~約5.2g/L、約4.9g/L~約5.1g/L、約5.0g/L~約6.0g/L、約5.0g/L~約5.9g/L、約5.0g/L~約5.8g/L、約5.0g/L~約5.7g/L、約5.0g/L~約5.6g/L、約5.0g/L~約5.5g/L、約5.0g/L~約5.4g/L、約5.0g/L~約5.3g/L、約5.0g/L~約5.2g/L、約5.1g/L~約6.0g/L、約5.1g/L~約5.9g/L、約5.1g/L~約5.8g/L、約5.1g/L~約5.7g/L、約5.1g/L~約5.6g/L、約5.1g/L~約5.5g/L、約5.1g/L~約5.4g/L、約5.1g/L~約5.3g/L、約5.2g/L~約6.0g/L、約5.2g/L~約5.9g/L、約5.2g/L~約5.8g/L、約5.2g/L~約5.7g/L、約5.2g/L~約5.6g/L、約5.2g/L~約5.5g/L、約5.2g/L~約5.4g/L、約5.3g/L~約6.0g/L、約5.3g/L~約5.9g/L、約5.3g/L~約5.8g/L、約5.3g/L~約5.7g/L、約5.3g/L~約5.6g/L、約5.3g/L~約5.5g/L、約5.4g/L~約6.0g/L、約5.4g/L~約5.9g/L、約5.4g/L~約5.8g/L、約5.4g/L~約5.7g/L、約5.4g/L~約5.6g/L、約5.5g/L~約6.0g/L、約5.5g/L~約5.9g/L、約5.5g/L~約5.8g/L、約5.5g/L~約5.7g/L、約5.6g/L~約6.0g/L、約5.6g/L~約5.9g/L、約5.6g/L~約5.8g/L、約5.7g/L~約6.0g/L、約5.7g/L~約5.9g/L、または約5.8g/L~約6.0g/L)まで増大させることを含む。
本明細書において記載される方法のいずれかは、培地中の生細胞密度が、約90×106細胞/mLより高い(例えば、約91×106細胞/mLより高い、約92×106細胞/mLより高い、約93×106細胞/mLより高い、約94×106細胞/mLより高い、約95×106細胞/mLより高い、約96×106細胞/mLより高い、約97×106細胞/mLより高い、約98×106細胞/mLより高い、約99×106細胞/mLより高い、約100×106細胞/mLより高い、約101×106細胞/mLより高い、約102×106細胞/mLより高い、約103×106細胞/mLより高い、約104×106細胞/mLより高い、約105×106細胞/mLより高い、約106×106細胞/mLより高い、約107×106細胞/mLより高い、約108×106細胞/mLより高い、約109×106細胞/mLより高い、約110×106細胞/mLより高い、約111×106細胞/mLより高い、約112×106細胞/mLより高い、約113×106細胞/mLより高い、約114×106細胞/mLより高い、約115×106細胞/mLより高い、約116×106細胞/mLより高い、約117×106細胞/mLより高い、約118×106細胞/mLより高い、約119×106細胞/mLより高い、または約120×106細胞/mLより高い)とき、培地中のポロクサマー-188濃度を、6.0g/Lより高い(例えば、6.1g/Lより高い、6.2g/Lより高い、6.3g/Lより高い、6.4g/Lより高い、6.5g/Lより高い、6.6g/Lより高い、6.7g/Lより高い、6.8g/Lより高い、6.9g/Lより高い、7.0g/Lより高い、7.1g/Lより高い、7.2g/Lより高い、7.3g/Lより高い、7.4g/Lより高い、7.5g/Lより高い、7.6g/Lより高い、7.7g/Lより高い、7.8g/Lより高い、7.9g/Lより高い、8.0g/Lより高い、8.1g/Lより高い、8.2g/Lより高い、8.3g/Lより高い、8.4g/Lより高い、8.5g/Lより高い、8.6g/Lより高い、8.7g/Lより高い、8.8g/Lより高い、8.9g/Lより高い、9.0g/Lより高い、9.1g/Lより高い、9.2g/Lより高い、9.3g/Lより高い、9.4g/Lより高い、9.5g/Lより高い、9.6g/Lより高い、9.7g/Lより高い、9.8g/Lより高い、9.9g/Lより高い、10.0g/Lより高い、約10.1g/Lより高い、約10.2g/Lより高い、約10.3g/Lより高い、約10.4g/Lより高い、約1
0.5g/Lより高い、約10.6g/Lより高い、約10.7g/Lより高い、約10.8g/Lより高い、約10.9g/Lより高い、または約11.0g/Lより高い)ポロクサマー-188まで増大させることを含む。
0.5g/Lより高い、約10.6g/Lより高い、約10.7g/Lより高い、約10.8g/Lより高い、約10.9g/Lより高い、または約11.0g/Lより高い)ポロクサマー-188まで増大させることを含む。
いくつかの実施形態において、方法は、培地中の生細胞密度が約35×106細胞/mL~約60×106細胞/mL(例えば、または本明細書において記載されるそれらの間の範囲のいずれか)である場合、培地中のポロクサマー-188濃度を約1.8g/L~約3.0g/L(例えば、本明細書において記載されるそれらの間の範囲のいずれか)まで増大させること;培地中の生細胞濃度密度が約60×106細胞/mL~約90×106細胞/mL(例えば、本明細書において記載されるそれらの間の範囲のいずれか)である場合、培地中のポロクサマー-188濃度を約3.0g/L~約6.0g/L(例えば、本明細書において記載されるそれらの間の範囲のいずれか)まで増大させること;および培地中の生細胞密度濃度が90×106細胞/mL(例えば、本明細書において記載される、90×106細胞/mLより高い生細胞密度のいずれか)より高い場合、培地中のポロクサマー-188濃度を6.0g/Lより高く(例えば、本明細書において記載される、6.0g/Lより高い濃度のいずれか)まで増大させることを含む。本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、培養中の1つまたはそれ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20)の時点で培地中の生細胞密度を決定することをさらに含む。
消泡剤に対するポロクサマー-188の割合
本明細書において記載される実施形態のいずれかにおいて、液体培地は、消泡剤(例えば、消泡剤-c)を含み、培地中のポロクサマー-188(g/L)に対する消泡剤(g/L)の割合は、約0.5%~約6.0%(例えば、約0.5%~約5.5%、約0.5%~約5.0%、約0.5%~約4.5%、約0.5%~約4.0%、約0.5%~約3.5%、約0.5%~約3.0%、約0.5%~約2.5%、約0.5%~約2.0%、約0.5%~約1.5%、約0.5%~約1.0%、約1.0%~約6.0%、約1.0%~約5.5%、約1.0%~約5.0%、約1.0%~約4.5%、約1.0%~約4.0%、約1.0%~約3.5%、約1.0%~約3.0%、約1.0%~約2.5%、約1.0%~約2.0%、約1.0%~約1.5%、約2.0%~約6.0%、約2.0%~約5.5%、約2.0%~約5.0%、約2.0%~約4.5%、約2.0%~約4.0%、約2.0%~約3.5%、約2.0%~約3.0%、約2.0%~約2.5%、約2.5%~約6.0%、約2.5%~約5.5%、約2.5%~約5.0%、約2.5%~約4.5%、約2.5%~約4.0%、約2.5%~約3.5%、約2.5%~約3.0%、約3.0%~約6.0%、約3.0%~約5.5%、約3.0%~約5.0%、約3.0%~約4.5%、約3.0%~約4.0%、約3.0%~約3.5%、約3.5%~約6.0%、約3.5%~約5.5%、約3.5%~約5.0%、約3.5%~約4.5%、約3.5%~約4.0%、約4.0%~約6.0%、約4.0%~約5.5%、約4.0%~約5.0%、約4.0%~約4.5%、約4.5%~約6.0%、約4.5%~約5.5%、約4.5%~約5.0%、約5.0%~約6.0%、約5.0%~約5.5%、または約5.5%~約6.0%)である。
本明細書において記載される実施形態のいずれかにおいて、液体培地は、消泡剤(例えば、消泡剤-c)を含み、培地中のポロクサマー-188(g/L)に対する消泡剤(g/L)の割合は、約0.5%~約6.0%(例えば、約0.5%~約5.5%、約0.5%~約5.0%、約0.5%~約4.5%、約0.5%~約4.0%、約0.5%~約3.5%、約0.5%~約3.0%、約0.5%~約2.5%、約0.5%~約2.0%、約0.5%~約1.5%、約0.5%~約1.0%、約1.0%~約6.0%、約1.0%~約5.5%、約1.0%~約5.0%、約1.0%~約4.5%、約1.0%~約4.0%、約1.0%~約3.5%、約1.0%~約3.0%、約1.0%~約2.5%、約1.0%~約2.0%、約1.0%~約1.5%、約2.0%~約6.0%、約2.0%~約5.5%、約2.0%~約5.0%、約2.0%~約4.5%、約2.0%~約4.0%、約2.0%~約3.5%、約2.0%~約3.0%、約2.0%~約2.5%、約2.5%~約6.0%、約2.5%~約5.5%、約2.5%~約5.0%、約2.5%~約4.5%、約2.5%~約4.0%、約2.5%~約3.5%、約2.5%~約3.0%、約3.0%~約6.0%、約3.0%~約5.5%、約3.0%~約5.0%、約3.0%~約4.5%、約3.0%~約4.0%、約3.0%~約3.5%、約3.5%~約6.0%、約3.5%~約5.5%、約3.5%~約5.0%、約3.5%~約4.5%、約3.5%~約4.0%、約4.0%~約6.0%、約4.0%~約5.5%、約4.0%~約5.0%、約4.0%~約4.5%、約4.5%~約6.0%、約4.5%~約5.5%、約4.5%~約5.0%、約5.0%~約6.0%、約5.0%~約5.5%、または約5.5%~約6.0%)である。
培養培地
液体培養培地は、当該技術分野において公知である。液体培養培地(例えば、第1および/もしくは第2の液体培地)は、哺乳類血清(例えば、ウシ胎児血清およびウシ血清)、ならびに/または成長ホルモンもしくは成長因子(例えば、インスリン、トランスフェリン、および上皮成長因子)を付加され得る。あるいは、または加えて、液体培養培地(例えば、第1および/もしくは第2の液体培地)は、既知組成の液体培養培地、動物由来の成分を含まない液体培養培地、無血清の液体培養培地、または血清を含有する液体培養
培地であり得る。既知組成の液体培養培地、動物由来の成分を含まない液体培養培地、無血清の液体培養培地、および血清を含有する液体培養培地の非限定的な例が、商業的に入手可能である。
液体培養培地は、当該技術分野において公知である。液体培養培地(例えば、第1および/もしくは第2の液体培地)は、哺乳類血清(例えば、ウシ胎児血清およびウシ血清)、ならびに/または成長ホルモンもしくは成長因子(例えば、インスリン、トランスフェリン、および上皮成長因子)を付加され得る。あるいは、または加えて、液体培養培地(例えば、第1および/もしくは第2の液体培地)は、既知組成の液体培養培地、動物由来の成分を含まない液体培養培地、無血清の液体培養培地、または血清を含有する液体培養
培地であり得る。既知組成の液体培養培地、動物由来の成分を含まない液体培養培地、無血清の液体培養培地、および血清を含有する液体培養培地の非限定的な例が、商業的に入手可能である。
液体培地は、エネルギー源(例えば、グルコースのような炭水化物)、必須アミノ酸(例えば、20種のアミノ酸とシステインの基本的セット)、低い濃度の必要とされるビタミンおよび/もしくは他の有機化合物、遊離脂肪酸、ならびに/または微量元素を典型的に含有する。液体培養培地(例えば、第1および/または第2の液体培地)は、所望されるなら、例えば、哺乳類ホルモンもしくは成長因子(例えば、インスリン、トランスフェリン、もしくは上皮成長因子)、塩ならびに緩衝液(例えば、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩)、ヌクレオシドならびに塩基(例えば、アデノシン、チミジン、およびヒポキサンチン)、タンパク質ならびに組織加水分解産物、ならびに/またはこれらの添加剤の任意の組み合わせを付加される。
本明細書において記載される方法のいずれかにおいて細胞(例えば、哺乳類細胞)を培養するために使用される、多種多様な異なる液体培養培地は、当該技術分野において公知である。本プロセスにおいて有用でもある培地成分は、既知組成(CD)の加水分解産物、例えば、CDペプトン、CDポリペプチド(2個またはそれ以上のアミノ酸)、およびCD成長因子を含むが、これらに限定されない。液体培地および培地成分のさらなる例が、当該技術分野において公知である。
当業者は、本明細書において記載される、第1の液体培地、および第2またはフィード液体培地が、同じタイプの培地、もしくは異なる培地であることを理解するだろう。
細胞培養物から得た液体培地を濾過、または清澄化して、細胞および/もしくはウイルスを実質的に含まない、液体培地を得る。細胞を取り出すために液体培地を濾過するか、または清澄化する方法は、当該技術分野において公知である(例えば、0.2μmの濾過および交互接線流(ATFTM)システムを使用した濾過)。哺乳類細胞はまた、遠心分離を使用し、細胞を実質的に含まない液体培地である上清を取り出して、または細胞を、液体培地を含有する容器もしくはバイオリアクターの重力的下部に定着させ、定着した組み換え細胞から離れた液体培地(細胞を実質的に含まない液体培地)を取り出すことにより、液体培地から取り出される。
温度
哺乳類細胞の培養の工程は、約31℃~約40℃の温度にて行われる。当業者は、温度が、例えば、毎時または毎日を基準に、培養工程中の特定の時点で変化されることを理解するだろう。例えば、温度は、細胞(例えば、哺乳類細胞)を有するバイオリアクターの開始播種後、約1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、もしくは約20日もしくはそれ以上にて、変化されるか、またはシフトされる(例えば、増大させる、または低減させる)。例えば、温度は、上向きにシフトされる(例えば、最大もしくは約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または最大もしくは約20℃の変化)。例えば、温度は、下向きにシフトされる(例えば、最大もしくは約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または最大もしくは約20℃)。
哺乳類細胞の培養の工程は、約31℃~約40℃の温度にて行われる。当業者は、温度が、例えば、毎時または毎日を基準に、培養工程中の特定の時点で変化されることを理解するだろう。例えば、温度は、細胞(例えば、哺乳類細胞)を有するバイオリアクターの開始播種後、約1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、もしくは約20日もしくはそれ以上にて、変化されるか、またはシフトされる(例えば、増大させる、または低減させる)。例えば、温度は、上向きにシフトされる(例えば、最大もしくは約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または最大もしくは約20℃の変化)。例えば、温度は、下向きにシフトされる(例えば、最大もしくは約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または最大もしくは約20℃)。
CO2
本明細書において記載される培養工程は、バイオリアクター中の液体培地を、最大または約15%CO2(例えば、最大もしくは約14%CO2、12%CO2、10%CO2、8%CO2、6%CO2、5%CO2、4%CO2、3%CO2、2%CO2、もしくは最大もしくは約1%CO2)を含有する雰囲気に曝露させることをさらに含む。
本明細書において記載される培養工程は、バイオリアクター中の液体培地を、最大または約15%CO2(例えば、最大もしくは約14%CO2、12%CO2、10%CO2、8%CO2、6%CO2、5%CO2、4%CO2、3%CO2、2%CO2、もしくは最大もしくは約1%CO2)を含有する雰囲気に曝露させることをさらに含む。
組み換えタンパク質
本明細書において提供される方法により産生される組み換えタンパク質の非限定的な例は、免疫グロブリン(軽および重鎖免疫グロブリン、抗体、もしくは抗体フラグメント(例えば、本明細書において記載される抗体フラグメントのいずれか)、酵素(例えば、ガラクトシダーゼ(例えば、アルファ-ガラクトシダーゼ)、ミオザイム、もしくはセレザイム)、タンパク質(例えば、ヒトエリスロポエチン、腫瘍壊死因子(TNF)、もしくはインターフェロンアルファもしくはベータ)、または免疫原性もしくは抗原性タンパク質もしくはタンパク質フラグメント(例えば、ワクチンにおいて使用するためのタンパク質)を含む。組み換えタンパク質は、少なくとも1つの多機能組み換えタンパク質スキャフォールドを含有する操作された抗原結合ポリペプチド(例えば、Gebauerら、Current Opin.Chem.Biol.13巻:245~255頁、2009年;および米国特許出願公開第2012/0164066号(参照により全体として本明細書に組み込まれる)において記載される、組み換え抗原結合タンパク質)である。抗体である組み換えタンパク質の非限定的な例は、パニツムマブ、オマリズマブ、アバゴボマム(abagovomab)、アブシキシマブ、アクトクマブ(actoxumab)、アダリムマブ、アデカ
ツムマブ(adecatumumab)、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ(alacizumab)、アラシズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモバム(altumomab)、アマ
ツキシマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ(anatumomab)、アヌルキンズマブ(anrukinzumab)、アポリズマブ、アルシツモマブ、アチヌマブ(atinumab)、トシリズマブ、バシリジマブ(basilizimab)、ベクツモブ(bectumomab)、ベリムマブ、ベバシズマブ、
ベシレソマブ、ベズロトクスマブ(bezlotoxumab)、ビシロマブ(biciromab)、カナキ
ヌマブ、セルトリズマブ、セツキシマブ、シズツムマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、デンスマブ(densumab)、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ(efungumab)、エプラツズマブ、エルツマクソマブ(ertumaxomab)、エタラシズマブ(etaracizumab)、フィギツムマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、イゴボマブ(igovomab)、イマガツズマブ(imgatuzumab)、インフリキシマブ、イノリモマブ、
イノツズマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ、モキセツモマブ(moxetumomab)、ナタ
リズマブ、オビヌツズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ(tralokinumab)、ツコツズマブ(tucotuzumab)、トラスツズマブ、ベルツズマブ、ザルツムマ
ブ、およびザツキシマブ(zatuximab)を含む。本明細書において記載される方法により
産生される組み換え抗体のさらなる例は、当該技術分野において公知である。本方法により産生される組み換えタンパク質のさらなる非限定的な例は、アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、アバタセプト、ガルスルファーゼ、ルトロピンアルファ、抗血友病因子、アガルシダーゼベータ、インターフェロンベータ-1a、ダルベポエチンアルファ、テネクテプラーゼ、エタネルセプト、第IX凝固因子、卵胞刺激ホルモン、インターフェロンベータ-1a、イミグルセラーゼ、ドルナーゼアルファ、エポエチンアルファ、インスリンまたはインスリン類似体、メカセルミン、第VIII因子、第VIIa因子、抗トロンビンIII、タンパク質C、ヒトアルブミン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン-11、ラロニダーゼ、イデュルスファーゼ(idursuphase)、ガルスルファーゼ、α-1-プロテアーゼ阻
害剤、ラクターゼ、アデノシンデアミナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、サイロトロピンアルファ(例えば、Thyrogen(登録商標))、およびアルテプラー
ゼを含む。本方法により産生される組み換えタンパク質のさらなる例は、酸性α-グルコシダーゼ、アルグルコシダーゼアルファ(例えば、Myozyme(登録商標)、およびLumizyme(登録商標))、α-L-イズロニダーゼ(例えば、Aldurazyme(登録商標))、イズロン酸スルファターゼ、ヘパランN-スルファターゼ、ガラクトース-6-スルファターゼ、酸性β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、N-アセチルグルコサミン-1-ホスホトランスフェラーゼ、α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、リソソーム酸性セラミダーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、β-グルコシダーゼ(例えば、Cerezyme(登録商標)、およびCeredase(登録商標))、ガラクトシルセラミダーゼ、α-ガラクトシダーゼ-A(例えば、Fabrazyme(登録商標))、酸性β-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ノイラミニダーゼ、ヘキソサミニダーゼA、ならびにヘキソサミニダーゼBを含む。
本明細書において提供される方法により産生される組み換えタンパク質の非限定的な例は、免疫グロブリン(軽および重鎖免疫グロブリン、抗体、もしくは抗体フラグメント(例えば、本明細書において記載される抗体フラグメントのいずれか)、酵素(例えば、ガラクトシダーゼ(例えば、アルファ-ガラクトシダーゼ)、ミオザイム、もしくはセレザイム)、タンパク質(例えば、ヒトエリスロポエチン、腫瘍壊死因子(TNF)、もしくはインターフェロンアルファもしくはベータ)、または免疫原性もしくは抗原性タンパク質もしくはタンパク質フラグメント(例えば、ワクチンにおいて使用するためのタンパク質)を含む。組み換えタンパク質は、少なくとも1つの多機能組み換えタンパク質スキャフォールドを含有する操作された抗原結合ポリペプチド(例えば、Gebauerら、Current Opin.Chem.Biol.13巻:245~255頁、2009年;および米国特許出願公開第2012/0164066号(参照により全体として本明細書に組み込まれる)において記載される、組み換え抗原結合タンパク質)である。抗体である組み換えタンパク質の非限定的な例は、パニツムマブ、オマリズマブ、アバゴボマム(abagovomab)、アブシキシマブ、アクトクマブ(actoxumab)、アダリムマブ、アデカ
ツムマブ(adecatumumab)、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ(alacizumab)、アラシズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモバム(altumomab)、アマ
ツキシマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ(anatumomab)、アヌルキンズマブ(anrukinzumab)、アポリズマブ、アルシツモマブ、アチヌマブ(atinumab)、トシリズマブ、バシリジマブ(basilizimab)、ベクツモブ(bectumomab)、ベリムマブ、ベバシズマブ、
ベシレソマブ、ベズロトクスマブ(bezlotoxumab)、ビシロマブ(biciromab)、カナキ
ヌマブ、セルトリズマブ、セツキシマブ、シズツムマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、デンスマブ(densumab)、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ(efungumab)、エプラツズマブ、エルツマクソマブ(ertumaxomab)、エタラシズマブ(etaracizumab)、フィギツムマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、イゴボマブ(igovomab)、イマガツズマブ(imgatuzumab)、インフリキシマブ、イノリモマブ、
イノツズマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ、モキセツモマブ(moxetumomab)、ナタ
リズマブ、オビヌツズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ(tralokinumab)、ツコツズマブ(tucotuzumab)、トラスツズマブ、ベルツズマブ、ザルツムマ
ブ、およびザツキシマブ(zatuximab)を含む。本明細書において記載される方法により
産生される組み換え抗体のさらなる例は、当該技術分野において公知である。本方法により産生される組み換えタンパク質のさらなる非限定的な例は、アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、アバタセプト、ガルスルファーゼ、ルトロピンアルファ、抗血友病因子、アガルシダーゼベータ、インターフェロンベータ-1a、ダルベポエチンアルファ、テネクテプラーゼ、エタネルセプト、第IX凝固因子、卵胞刺激ホルモン、インターフェロンベータ-1a、イミグルセラーゼ、ドルナーゼアルファ、エポエチンアルファ、インスリンまたはインスリン類似体、メカセルミン、第VIII因子、第VIIa因子、抗トロンビンIII、タンパク質C、ヒトアルブミン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン-11、ラロニダーゼ、イデュルスファーゼ(idursuphase)、ガルスルファーゼ、α-1-プロテアーゼ阻
害剤、ラクターゼ、アデノシンデアミナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、サイロトロピンアルファ(例えば、Thyrogen(登録商標))、およびアルテプラー
ゼを含む。本方法により産生される組み換えタンパク質のさらなる例は、酸性α-グルコシダーゼ、アルグルコシダーゼアルファ(例えば、Myozyme(登録商標)、およびLumizyme(登録商標))、α-L-イズロニダーゼ(例えば、Aldurazyme(登録商標))、イズロン酸スルファターゼ、ヘパランN-スルファターゼ、ガラクトース-6-スルファターゼ、酸性β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、N-アセチルグルコサミン-1-ホスホトランスフェラーゼ、α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、リソソーム酸性セラミダーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、β-グルコシダーゼ(例えば、Cerezyme(登録商標)、およびCeredase(登録商標))、ガラクトシルセラミダーゼ、α-ガラクトシダーゼ-A(例えば、Fabrazyme(登録商標))、酸性β-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ノイラミニダーゼ、ヘキソサミニダーゼA、ならびにヘキソサミニダーゼBを含む。
分泌された、溶解性組み換えタンパク質は、細胞(例えば、哺乳類細胞)から液体培地を取り出すか、またはそうでなければ物理的に分けることにより、液体培地(例えば、第1および/もしくは第2の液体培地)から回収される。例えば、遠心分離、濾過、ピペッティング、および/または吸引を含む、細胞(例えば、哺乳類細胞)から液体培地を取り出す、様々な異なる方法が、当該技術分野において公知である。次に、分泌された組み換えタンパク質は、種々のタイプのクロマトグラフィー(例えば、アフィニティークロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、もしくは陰イオン交換クロマトグラフィー)、および/または濾過(例えば、分子量カットオフ濾過)を含む、様々な生化学的技術を使用して、液体培地から回収され、さらに精製される。
組み換えタンパク質の収集
いくつかの実施形態は、組み換えタンパク質(例えば、本明細書において記載される組み換えタンパク質のいずれか)を収集することをさらに含む。いくつかの例では、収集は、哺乳類細胞を溶解することを含む。他の例では、収集は、組み換えタンパク質を培地(例えば、灌流培養が行われるとき、第1および第2の液体培地の1つもしくは両方、またはバッチ培養が行われるとき、第1の液体培地およびフィード液体培地の1つもしくは両方)から収集することを含む。
いくつかの実施形態は、組み換えタンパク質(例えば、本明細書において記載される組み換えタンパク質のいずれか)を収集することをさらに含む。いくつかの例では、収集は、哺乳類細胞を溶解することを含む。他の例では、収集は、組み換えタンパク質を培地(例えば、灌流培養が行われるとき、第1および第2の液体培地の1つもしくは両方、またはバッチ培養が行われるとき、第1の液体培地およびフィード液体培地の1つもしくは両方)から収集することを含む。
収集は、培養が、例えば、約30×106細胞/mLより高い、約32×106細胞/mLより高い、約34×106細胞/mLより高い、約36×106細胞/mLより高い、約38×106細胞/mLより高い、約40×106細胞/mLより高い、約42×106細胞/mLより高い、約44×106細胞/mLより高い、約46×106細胞/mLより高い、約48×106細胞/mLより高い、約50×106細胞/mLより高い、約52×106細胞/mLより高い、約54×106細胞/mLより高い、約56×106細胞/mLより高い、約58×106細胞/mLより高い、約60×106細胞/mLより高い、約62×106細胞/mLより高い、約64×106細胞/mLより高い、約66×106細胞/mLより高い、約68×106細胞/mLより高い、約70×106細胞/mLより高い、約72×106細胞/mLより高い、約74×106細胞/mLより高い、約76×106細胞/mLより高い、約78×106細胞/mLより高い、約80×106細胞/mLより高い、約82×106細胞/mLより高い、約84×106細胞/mLより高い、約86×106細胞/mLより高い、約88×106細胞/mLより高い、約90×106細胞/mLより高い、約92×106細胞/mLより高い、約94×106細胞/mLより高い、約96×106細胞/mLより高い、約98×106細胞/mLより高い、約100×106細胞/mLより高い、約102×106細胞/mLより高い、約104×106細胞/mLより高い、約106×106細胞/mLより高い、約108×106細胞/mLより高い、約110×106細胞/mLより高い、約112×106細胞/mLより高い、約114×106細胞/mLより高い、約116×106
細胞/mLより高い、約118×106細胞/mLより高い、約120×106細胞/mLより高い、約122×106細胞/mLより高い、約124×106細胞/mLより高い、約126×106細胞/mLより高い、約128×106細胞/mLより高い、約130×106細胞/mLより高い、約132×106細胞/mLより高い、約134×106細胞/mLより高い、約136×106細胞/mLより高い、約138×106細胞/mLより高い、約140×106細胞/mLより高い、約142×106細胞/mLより高い、約144×106細胞/mLより高い、約146×106細胞/mLより高い、約148×106細胞/mLより高い、約150×106細胞/mLより高い、約152×106細胞/mLより高い、約154×106細胞/mLより高い、約156×106細胞/mLより高い、約158×106細胞/mLより高い、約160×106細胞/mLより高い、約162×106細胞/mLより高い、約164×106細胞/mLより高い、約166×106細胞/mLより高い、約168×106細胞/mLより高い、約170×106細胞/mLより高い、約172×106細胞/mLより高い、約174×106細胞/mLより高い、約176×106細胞/mLより高い、約178×106細胞/mLより高い、約180×106細胞/mLより高い、約182×106細胞/mLより高い、約184×106細胞/mLより高い、約186×106細胞/mLより高い、約188×106細胞/mLより高い、約190×106細胞/mLより高い、約192×106細胞/mLより高い、約194×106細胞/mLより高い、約196×106細胞/mLより高い、約198×106細胞/mLより高い、または約200×106細胞/mLより高い)生細胞密度を達成した後、行われる。
細胞/mLより高い、約118×106細胞/mLより高い、約120×106細胞/mLより高い、約122×106細胞/mLより高い、約124×106細胞/mLより高い、約126×106細胞/mLより高い、約128×106細胞/mLより高い、約130×106細胞/mLより高い、約132×106細胞/mLより高い、約134×106細胞/mLより高い、約136×106細胞/mLより高い、約138×106細胞/mLより高い、約140×106細胞/mLより高い、約142×106細胞/mLより高い、約144×106細胞/mLより高い、約146×106細胞/mLより高い、約148×106細胞/mLより高い、約150×106細胞/mLより高い、約152×106細胞/mLより高い、約154×106細胞/mLより高い、約156×106細胞/mLより高い、約158×106細胞/mLより高い、約160×106細胞/mLより高い、約162×106細胞/mLより高い、約164×106細胞/mLより高い、約166×106細胞/mLより高い、約168×106細胞/mLより高い、約170×106細胞/mLより高い、約172×106細胞/mLより高い、約174×106細胞/mLより高い、約176×106細胞/mLより高い、約178×106細胞/mLより高い、約180×106細胞/mLより高い、約182×106細胞/mLより高い、約184×106細胞/mLより高い、約186×106細胞/mLより高い、約188×106細胞/mLより高い、約190×106細胞/mLより高い、約192×106細胞/mLより高い、約194×106細胞/mLより高い、約196×106細胞/mLより高い、約198×106細胞/mLより高い、または約200×106細胞/mLより高い)生細胞密度を達成した後、行われる。
組み換えタンパク質の製剤化
本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、組み換えタンパク質(例えば、収集された組み換えタンパク質)を医薬組成物に製剤化する工程をさらに含む。例えば、製剤化は、薬学的に許容し得る賦形剤を組み換えタンパク質(例えば、収集された組み換えタンパク質)に添加することを含む。製剤化は、薬学的に許容し得る賦形剤を組み換えタンパク質(例えば、収集された組み換えタンパク質)と混合することを含む。薬学的に許容し得る賦形剤(例えば、天然に存在しない薬学的に許容し得る賦形剤)の例は、当該技術分野において周知である。いくつかの実施形態において、組み換えタンパク質(例えば、収集された組み換えタンパク質)は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内投与のため製剤化される。
本明細書において記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態は、組み換えタンパク質(例えば、収集された組み換えタンパク質)を医薬組成物に製剤化する工程をさらに含む。例えば、製剤化は、薬学的に許容し得る賦形剤を組み換えタンパク質(例えば、収集された組み換えタンパク質)に添加することを含む。製剤化は、薬学的に許容し得る賦形剤を組み換えタンパク質(例えば、収集された組み換えタンパク質)と混合することを含む。薬学的に許容し得る賦形剤(例えば、天然に存在しない薬学的に許容し得る賦形剤)の例は、当該技術分野において周知である。いくつかの実施形態において、組み換えタンパク質(例えば、収集された組み換えタンパク質)は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内投与のため製剤化される。
分泌された組み換え抗体を産生する灌流細胞培養に対するポロクサマー-188の濃度の増大の効果
このセットの実験を行い、組み換え抗体をコードする核酸を含有する哺乳類細胞を含む灌流細胞培養物における、細胞成長および組み換え抗体産生に対するポロクサマー-188の増加濃度の効果を試験した。これらの実験において、全培養期間に渡り、1.8g/Lを含有するCD-CHO培地を使用する、第1の灌流細胞培養ラン、および培養期間に渡り、ポロクサマー-188の増加濃度(培養期間に渡り、1.8g/Lから6.8g/Lポロクサマー-188に増大する)を含有するCD-CHO培地を使用した、第2の灌流細胞培養ランを行った。それぞれの細胞培養ランについて、培養の12日~33日において4リアクター体積(RV)/日の速度で、灌流を行い、培養の33日~63日において6RV/日の速度にスイッチし、培養の63日~72日において7RV/日の速度にスイッチした。培養の0日~14日において1.8g/Lポロクサマー-188を含有するCD-CHO培地、培養の15日~34日において2.8g/Lポロクサマー-188を含有するCD-CHO培地、培養の35日~39日において3.8g/Lポロクサマー-188を含有するCD-CHO培地、培養の40日~56日において4.8g/Lポロクサマー-188を含有するCD-CHO培地、および培養の57日~72日において5.8g/Lポロクサマー-188を含有するCD-CHO培地を使用して、第2の細胞培養
ランを行った。
このセットの実験を行い、組み換え抗体をコードする核酸を含有する哺乳類細胞を含む灌流細胞培養物における、細胞成長および組み換え抗体産生に対するポロクサマー-188の増加濃度の効果を試験した。これらの実験において、全培養期間に渡り、1.8g/Lを含有するCD-CHO培地を使用する、第1の灌流細胞培養ラン、および培養期間に渡り、ポロクサマー-188の増加濃度(培養期間に渡り、1.8g/Lから6.8g/Lポロクサマー-188に増大する)を含有するCD-CHO培地を使用した、第2の灌流細胞培養ランを行った。それぞれの細胞培養ランについて、培養の12日~33日において4リアクター体積(RV)/日の速度で、灌流を行い、培養の33日~63日において6RV/日の速度にスイッチし、培養の63日~72日において7RV/日の速度にスイッチした。培養の0日~14日において1.8g/Lポロクサマー-188を含有するCD-CHO培地、培養の15日~34日において2.8g/Lポロクサマー-188を含有するCD-CHO培地、培養の35日~39日において3.8g/Lポロクサマー-188を含有するCD-CHO培地、培養の40日~56日において4.8g/Lポロクサマー-188を含有するCD-CHO培地、および培養の57日~72日において5.8g/Lポロクサマー-188を含有するCD-CHO培地を使用して、第2の細胞培養
ランを行った。
周知の方法を使用して、第1および第2の灌流培養の両方について、それぞれの日に、生細胞密度、比成長速度、生細胞のパーセンテージ、体積測定生産性、および比生産性を決定した。
データは、培養物中1.8g/Lより高いポロクサマー-188濃度を確立することにより、100×106細胞/mLを超える生細胞密度を達成することを示した(図1)。対照的に、培養物中1.8g/Lポロクサマー-188のみを使用した第1の細胞培養ランのみが、50×106細胞/mLの生細胞密度を達成した(図1)。第2の細胞培養ランについてのデータはまた、細胞培養物が100×106細胞/mLより高い生細胞密度を有するときでさえ、培地中の1.8g/Lより高いポロクサマー-188濃度の確立が、着実な比成長速度をもたらすことも示した(図2)。図3におけるデータはまた、培地中の1.8g/Lより高いポロクサマー-188濃度の確立が、培養期間を通じて1.8g/Lポロクサマー-188を含有する培養培地を使用した灌流細胞培養ランと比較して、高いおよび定常パーセンテージの生細胞(培養期間を通じて80%より上)をもたらすことも示した(図3)。
図4および5におけるデータはまた、培養期間に渡り、増加濃度のポロクサマー-188(1.8g/Lから6.8g/Lポロクサマー-188に増大する)を含有する培養培地で行った第2の灌流細胞培養ランは、それぞれ、高い体積測定生産性(3g/L/dより高い)、および高い比生産性(15pg/細胞/日~42pg/細胞/日)を有することも示した。
液体培地中の組み換え抗体の安定性に対するポロクサマー-188の増加濃度の効果
セットの実験を行い、増加濃度のポロクサマー-188が、細胞培養物からの回収後、清澄化液体培地に存在する組み換えタンパク質の分解を阻害するかどうかを決定した。これらの実験において、培養物が6.8g/Lポロクサマー-188の濃度を達成した後、培養物中のポロクサマー-188濃度を3.95g/Lポロクサマー-188まで低減し、次に、3.0g/Lポロクサマー-188まで再度低減したことを除き、実施例1において記載した第2の灌流細胞培養ランと類似する灌流細胞培養ランを行った。これらの実験において、次の時点:培養物が6.8g/Lポロクサマー-188を含有したときの第1の時点、培養物が3.95g/Lポロクサマー-188の濃度を含有したときの第2の時点、および培養物が3.0g/Lポロクサマー-188の濃度を含有したときの第3の時点で培養物から、液体培地の2または3つのサンプルを取り出した。時点のそれぞれから収集した1つのサンプルを4℃で保存し、時点のそれぞれから収集した1つのサンプルを、4℃での保存の前に室温にて7日間インキュベートし、第2および第3の時点のそれぞれについて、サンプルにポロクサマー-188を付加して、それぞれのサンプルにおける6.8g/Lポロクサマー-188の濃度を達成し、次に、それぞれのサンプルを、4℃での保存の前に室温にて9日間インキュベートした。得られた無処理および処理したサンプルを、4~20%ビス-トリスゲルに泳動し、クーマシーブルーで染色した。
セットの実験を行い、増加濃度のポロクサマー-188が、細胞培養物からの回収後、清澄化液体培地に存在する組み換えタンパク質の分解を阻害するかどうかを決定した。これらの実験において、培養物が6.8g/Lポロクサマー-188の濃度を達成した後、培養物中のポロクサマー-188濃度を3.95g/Lポロクサマー-188まで低減し、次に、3.0g/Lポロクサマー-188まで再度低減したことを除き、実施例1において記載した第2の灌流細胞培養ランと類似する灌流細胞培養ランを行った。これらの実験において、次の時点:培養物が6.8g/Lポロクサマー-188を含有したときの第1の時点、培養物が3.95g/Lポロクサマー-188の濃度を含有したときの第2の時点、および培養物が3.0g/Lポロクサマー-188の濃度を含有したときの第3の時点で培養物から、液体培地の2または3つのサンプルを取り出した。時点のそれぞれから収集した1つのサンプルを4℃で保存し、時点のそれぞれから収集した1つのサンプルを、4℃での保存の前に室温にて7日間インキュベートし、第2および第3の時点のそれぞれについて、サンプルにポロクサマー-188を付加して、それぞれのサンプルにおける6.8g/Lポロクサマー-188の濃度を達成し、次に、それぞれのサンプルを、4℃での保存の前に室温にて9日間インキュベートした。得られた無処理および処理したサンプルを、4~20%ビス-トリスゲルに泳動し、クーマシーブルーで染色した。
図6におけるデータは、6.8g/L、3.95g/L、または3.0g/Lポロクサマー-188を含有する無処理サンプルが全て、類似の生産安定性を示したことを示す(レーン1、2、および3)。データはまた、6.8g/Lポロクサマー-188を含有するサンプルが、室温にて7日間のインキュベーション後に実質的な分解を示さず、一方、3.0g/Lまたは3.95g/Lポロクサマー-188を含有するサンプルの両方が、同じインキュベーション後に検出可能な分解を示したことも、驚くべきことに示した(図6;レーン1a、2a、および3a)。データはまた、少ないポロクサマー-188を含
有するサンプルへのポロクサマー-188への添加が、生産安定性を改善しないことも示した(図6;レーン2bおよび3b)。これらのデータは、培地中の1.8g/Lより高い、ポロクサマー-188の濃度の使用が、培養物における組み換えタンパク質の分解を低減するか、または阻害することを示し、ポロクサマー-188が、健全な細胞培養物をもたらすことにより、この効果を達成することを示した。
有するサンプルへのポロクサマー-188への添加が、生産安定性を改善しないことも示した(図6;レーン2bおよび3b)。これらのデータは、培地中の1.8g/Lより高い、ポロクサマー-188の濃度の使用が、培養物における組み換えタンパク質の分解を低減するか、または阻害することを示し、ポロクサマー-188が、健全な細胞培養物をもたらすことにより、この効果を達成することを示した。
細胞培養成長および生産性に対して有益な効果を達成するのに必要なポロクサマー-188の量に対するスパージャ孔タイプならびにサイズの効果
セットの実験を行い、灌流細胞培養物において有益な成長および生産性特性を達成するのに必要なポロクサマー-188の量に対するスパージャ孔タイプおよびサイズの効果を試験した。これらの実験において、異なるスパージャ:20μmのサイズを有する焼結孔を有するスパージャ(1つのリアクター);200μmのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ(2つのリアクター);または500μmのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ(1つのリアクター)を使用した、異なる灌流細胞培養ランを行った。それぞれの灌流培養は、1.8g/Lポロクサマー-188を含有するCD CHO培地を最初使用し、必要に応じて、細胞生存率を維持し、細胞溶解を最小にするために、漸増量で培養物にポロクサマー-188を添加した。周知の方法を使用して、培養期間中の異なる時点で、それぞれの細胞培養物について、生細胞密度、比成長速度、比乳酸脱水素酵素生産性、生細胞のパーセンテージ、体積測定生産性、および好気性グルコース消費を行った。
セットの実験を行い、灌流細胞培養物において有益な成長および生産性特性を達成するのに必要なポロクサマー-188の量に対するスパージャ孔タイプおよびサイズの効果を試験した。これらの実験において、異なるスパージャ:20μmのサイズを有する焼結孔を有するスパージャ(1つのリアクター);200μmのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ(2つのリアクター);または500μmのサイズを有するドリル孔を有するスパージャ(1つのリアクター)を使用した、異なる灌流細胞培養ランを行った。それぞれの灌流培養は、1.8g/Lポロクサマー-188を含有するCD CHO培地を最初使用し、必要に応じて、細胞生存率を維持し、細胞溶解を最小にするために、漸増量で培養物にポロクサマー-188を添加した。周知の方法を使用して、培養期間中の異なる時点で、それぞれの細胞培養物について、生細胞密度、比成長速度、比乳酸脱水素酵素生産性、生細胞のパーセンテージ、体積測定生産性、および好気性グルコース消費を行った。
データは、500μmのサイズを有するドリル孔を有するスパージャを使用して行った灌流細胞培養ランにおいて、培養物中の3.8g/Lポロクサマー-188の濃度が、生細胞密度を維持することができ、200μmのサイズを有するドリル孔を有するスパージャを使用して行った灌流細胞培養ランにおいて、4.8g/Lポロクサマー-188の濃度が、生細胞密度を維持することができ、20μmのサイズを有する焼結孔を有するスパージャを使用して行った灌流細胞培養ランにおいて、5.8g/Lポロクサマー-188の濃度が、生細胞密度を維持することができたことを示す(図7)。
データはまた、3.8g/Lポロクサマー-188、および500μmのサイズを有するドリル孔を有するスパージャを使用して行った灌流細胞培養ラン、4.8g/Lポロクサマー-188、および200μmのサイズを有する焼結孔を有するスパージャを使用して行った灌流細胞培養ラン、ならびに5.8g/Lポロクサマー-188、および20μmのサイズを有する焼結孔を有するスパージャを使用して行った灌流細胞培養ランについて、類似の比成長速度(図8)、比ラクトース脱水素酵素生産性(図9および11)、生細胞のパーセンテージ(図10)、体積測定生産性(図12)、ならびに好気性グルコース消費率(図13)を達成したことも示す。
データは、ポロクサマー-188が、培養物中1.8g/Lより高い濃度で存在するとき、全ての試験したスパージャを使用して、60×106細胞/mLの生細胞密度を達成したことを示す。例えば、60×106細胞/mLより高い生細胞密度を、培地中2.8g/Lポロクサマー-188を使用することによる、1mmのサイズを有するドリル孔を有するスパージャを使用した灌流細胞培養ラン、培地中3.8g/Lポロクサマー-188を使用することによる、500μmのサイズを有するドリル孔を有するスパージャを使用した灌流細胞培養ラン、培地中4.8g/Lポロクサマー-188を使用することによる、200μmのサイズを有するドリル孔を有するスパージャを使用した灌流細胞培養ラン、培地中3.8g/Lポロクサマー-188を使用することによる、100μmのサイズを有する焼結孔を有するスパージャを使用した灌流細胞培養ラン、および培地中5.8g/Lポロクサマー-188を使用することによる、20μmのサイズを有する焼結孔を
有するスパージャを使用した灌流培養において達成した。データは、孔サイズが小さいほど、健常な培養を維持するのによりポロクサマー-188を必要としたことを示す。
有するスパージャを使用した灌流培養において達成した。データは、孔サイズが小さいほど、健常な培養を維持するのによりポロクサマー-188を必要としたことを示す。
灌流培養細胞成長に対するスパージャ孔タイプ、孔サイズ、およびポロクサマー-188に対する消泡剤の割合の効果
さらなるセットの実験を行い、異なる孔タイプおよびサイズを有するスパージャ、ならびに培養物中のポロクサマー-188に対する消泡剤の異なる割合を使用した灌流培養において、一定の状態の細胞成長を決定した(以下の表1において示す)。
さらなるセットの実験を行い、異なる孔タイプおよびサイズを有するスパージャ、ならびに培養物中のポロクサマー-188に対する消泡剤の異なる割合を使用した灌流培養において、一定の状態の細胞成長を決定した(以下の表1において示す)。
表1におけるデータは、孔サイズが小さいほど、より多くの消泡剤-cを、泡沫の生成を緩和するために培地に添加する必要があること、拡散速度が増大するにつれ、追加の消泡剤-cを必要とすること、およびポロクサマー-188に対する消泡剤-cの最適な割合が0~<5%(例えば、約1%~約3%)であることを必要とすることを示す。
バッチ細胞培養ランにおける細胞成長に対するポロクサマー-188に対する消泡剤-Cの割合の効果
セットの実験を行い、ポロクサマー-188に対する消泡剤-cの割合0%、ポロクサマー-188に対する消泡剤-cの割合5.6%、ポロクサマー-188に対する消泡剤-cの割合11.1%、ポロクサマー-188に対する消泡剤-cの割合27.8%、またはポロクサマー-188に対する消泡剤-cの割合55.6%を含有するCD-CHO培地を使用したバッチ振盪フラスコ細胞培養ランにおいて、細胞成長に対するポロクサマー-188に対する消泡剤-cの割合の効果を試験した。振盪フラスコ細胞培養を調節し、泡を受動的に生成させて、バイオリアクターを刺激した。周知の方法を使用して、培養期間に渡るそれぞれの日で、それぞれの細胞培養ランにおける生細胞密度および比乳酸脱水素酵素生産性を決定した。
セットの実験を行い、ポロクサマー-188に対する消泡剤-cの割合0%、ポロクサマー-188に対する消泡剤-cの割合5.6%、ポロクサマー-188に対する消泡剤-cの割合11.1%、ポロクサマー-188に対する消泡剤-cの割合27.8%、またはポロクサマー-188に対する消泡剤-cの割合55.6%を含有するCD-CHO培地を使用したバッチ振盪フラスコ細胞培養ランにおいて、細胞成長に対するポロクサマー-188に対する消泡剤-cの割合の効果を試験した。振盪フラスコ細胞培養を調節し、泡を受動的に生成させて、バイオリアクターを刺激した。周知の方法を使用して、培養期間に渡るそれぞれの日で、それぞれの細胞培養ランにおける生細胞密度および比乳酸脱水素酵素生産性を決定した。
データは、ポロクサマー-188に対するより消泡剤-cの割合が少ないほど、改善した生細胞密度(図14)、およびより遅い比乳酸脱水素酵素生産性(図15)を示したことを示す。これらのデータは、培養物中のポロクサマー-188に対する消泡剤-cの最適な割合が0~約5%未満(例えば、約1%~約3%)であることをさらに示唆する。
他の実施形態
本発明が、その詳細な説明と結び付けて記載される一方、前述の説明が、添付の請求の範囲により定義される、本発明の範囲を説明し、制限しないことを意図することは、理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の請求項の範囲内である。
本発明が、その詳細な説明と結び付けて記載される一方、前述の説明が、添付の請求の範囲により定義される、本発明の範囲を説明し、制限しないことを意図することは、理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の請求項の範囲内である。
Claims (90)
- 哺乳類細胞を培養する方法であって、該方法は、
組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞を、組み換えタンパク質を産生するのに十分な条件下で灌流培養すること
を含み、灌流培養は、1.8g/Lの濃度または1.8g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を含む液体培地において培養することを含み、ポロクサマー-188は、培地に存在する、および/または培養工程の前に培地に添加される、および/または培養工程中に培地に添加される、前記方法。 - 培地は、1.8g/Lの濃度または1.8g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を含む、請求項1に記載の方法。
- 培地は、2.8g/Lの濃度または2.8g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を含む、請求項2に記載の方法。
- 培地は、4.0g/Lの濃度または4.0g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を含む、請求項3に記載の方法。
- 培地は、6.0g/Lの濃度または6.0g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を含む、請求項4に記載の方法。
- 培地は、8.0g/Lの濃度または8.0g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を含む、請求項5に記載の方法。
- 培地は、10.0g/Lの濃度または10.0g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を含む、請求項6に記載の方法。
- 培地は消泡剤をさらに含み、培地中のポロクサマー-188(g/L)に対する消泡剤(g/L)の割合は、液体培地中約0.5%~約6.0%である、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 培地中のポロクサマー-188(g/L)に対する消泡剤(g/L)の割合は、約1.0%~約5.5%である、請求項8に記載の方法。
- 培地中のポロクサマー-188(g/L)に対する消泡剤(g/L)の割合は、約1.5%~約5.0%である、請求項9に記載の方法。
- 培養工程の前にポロクサマー-188を培地に添加し、および/または培養工程中にポロクサマー-188を培地に添加して、培地中のポロクサマー-188を1.8g/Lの濃度または1.8g/Lより高い濃度にすることを含む、請求項1に記載の方法。
- ポロクサマー-188は培地に存在する、請求項1または11に記載の方法。
- 培養工程の前にポロクサマー-188を培地に添加し、および/または培養工程中にポロクサマー-188を培地に添加して、培地中のポロクサマー-188を2.8g/Lの濃度または2.8g/Lより高い濃度にすることを含む、請求項11または12に記載の方法。
- 培養工程の前にポロクサマー-188を培地に添加し、および/または培養工程中にポ
ロクサマー-188を培地に添加して、培地中のポロクサマー-188を4.0g/Lの濃度または4.0g/Lより高い濃度にすることを含む、請求項13に記載の方法。 - 培養工程の前にポロクサマー-188を培地に添加し、および/または培養工程中にポロクサマー-188を培地に添加して、培地中のポロクサマー-188を6.0g/Lの濃度または6.0g/Lより高い濃度にすることを含む、請求項14に記載の方法。
- 培養工程の前にポロクサマー-188を培地に添加し、および/または培養工程中にポロクサマー-188を培地に添加して、培地中のポロクサマー-188を8.0g/Lの濃度または8.0g/Lより高い濃度にすることを含む、請求項15に記載の方法。
- 培養工程の前にポロクサマー-188を培地に添加し、および/または培養工程中にポロクサマー-188を培地に添加して、培地中のポロクサマー-188を10.0g/Lの濃度または10.0g/Lより高い濃度にすることを含む、請求項16に記載の方法。
- 培地中のポロクサマー-188濃度を経時的に増大させることを含む、請求項1~17のいずれか1項に記載の方法。
- 培地中のポロクサマー-188濃度を経時的に増大させることは、培地中の生細胞密度に基づく、請求項18に記載の方法。
- 培地中の生細胞密度が約35×106細胞/mL~約60×106細胞/mLである場合、培地中のポロクサマー-188濃度を1.8g/Lより高くまで増大させることを含む、請求項19に記載の方法。
- 培地中の生細胞密度が約35×106細胞/mL~約60×106細胞/mLである場合、培地中のポロクサマー-188濃度を約1.8g/L~約3.0g/Lまで増大させることを含む、請求項20に記載の方法。
- 培地中の生細胞密度が約35×106~約60×106細胞/mLである場合、該培地中のポロクサマー-188濃度を約2.3g/L~約3.0g/Lまで増大させることを含む、請求項21に記載の方法。
- 培地中の生細胞密度が約60×106細胞/mL~約90×106細胞/mLである場合、該培地中のポロクサマー-188濃度を3.0g/Lより高くまで増大させることを含む、請求項19~22のいずれか1項に記載の方法。
- 培地中の生細胞密度が約60×106細胞/mL~約90×106細胞/mLである場合、該培地中のポロクサマー-188濃度を約3.0g/L~約6.0g/Lまで増大させることを含む、請求項23に記載の方法。
- 培地中の生細胞密度が約60×106細胞/mL~約90×106細胞/mLである場合、該培地中のポロクサマー-188濃度を約3.6g/L~約6.0g/Lまで増大させることを含む、請求項24に記載の方法。
- 培地中の生細胞密度が90×106細胞/mLより高い場合、該培地中のポロクサマー-188濃度を6.0g/Lより高くまで増大させることを含む、請求項19~25のいずれか1項に記載の方法。
- 培地中の生細胞密度が90×106細胞/mLより高い場合、該培地中のポロクサマー
-188濃度を7.0g/Lより高くまで増大させることを含む、請求項26に記載の方法。 - 培地中の生細胞密度が90×106細胞/mLより高い場合、該培地中のポロクサマー-188濃度を8.0g/Lより高くまで増大させることを含む、請求項27に記載の方法。
- 培地中の生細胞密度が90×106細胞/mLより高い場合、培地中のポロクサマー-188濃度を10.0g/Lより高くまで増大させることを含む、請求項28に記載の方法。
- 培地中の生細胞密度が約35×106細胞/mL~約60×106細胞/mLである場合、培地中のポロクサマー-188濃度を約1.8g/L~約3.0g/Lまで増大させること;
培地中の生細胞濃度密度が約60×106細胞/mL~約90×106細胞/mLである場合、該培地中のポロクサマー-188濃度を約3.0g/L~約6.0g/Lまで増大させること;および
培地中の生細胞密度濃度が90×106細胞/mLより高い場合、培地中のポロクサマー-188濃度を6.0g/Lより高くまで増大させること
を含む、請求項19に記載の方法。 - 培養中の1つまたはそれ以上の時点で培地中の生細胞密度を決定することをさらに含む、請求項19~30のいずれか1項に記載の方法。
- 灌流培養は、
第1の液体培地において配置された哺乳類細胞を含む容器を用意すること;
該容器を撹拌しながら、少なくとも約7日の培養期間、温度約32℃~約40℃でインキュベートすること;および
培養期間の最初の48~96時間後、連続的または定期的に、第1の体積の該第1の液体培地を取り出し、該第1の液体培地に第2の体積の第2の液体培地を添加することを含み、該第1および第2の体積がほぼ等しい、
請求項1~31のいずれか1項に記載の方法。 - 第2の液体培地は、第1の液体培地中の濃度より高い濃度のポロクサマー-188を含む、請求項32に記載の方法。
- 第1の液体培地は、1.8g/Lの濃度または1.8g/L未満の濃度のポロクサマー-188を含み、第2の液体培地は、1.8g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を含む、請求項32に記載の方法。
- 第2の液体培地は、2.8g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を含む、請求項34に記載の方法。
- 第2の液体培地は、4.0g/Lポロクサマー-188より高い濃度のポロクサマー-188を含む、請求項35に記載の方法。
- 第2の液体培地は、6.0g/Lポロクサマー-188より高い濃度のポロクサマー-188を含む、請求項36に記載の方法。
- 第2の液体培地は、8.0g/Lポロクサマー-188より高い濃度のポロクサマー-
188を含む、請求項37に記載の方法。 - 第2の液体培地は、10.0g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を含む、請求項38に記載の方法。
- 第1の液体培地に第2の体積の第2の液体培地を添加する前または後に、該第2の液体培地にポロクサマー-188を添加して、第2の培地中のポロクサマー-188を1.8g/Lの濃度または1.8g/Lより高い濃度にすることを含む、請求項32に記載の方法。
- 第2の液体培地へのポロクサマー-188の添加は、第2の培地中のポロクサマー-188を2.8g/Lより高い濃度にする、請求項40に記載の方法。
- 第2の液体培地へのポロクサマー-188の添加は、第2の培地中のポロクサマー-188を4.0g/Lより高い濃度にする、請求項41に記載の方法。
- 第2の液体培地へのポロクサマー-188の添加は、第2の培地中のポロクサマー-188を6.0g/Lより高い濃度にする、請求項42に記載の方法。
- 第2の液体培地へのポロクサマー-188の添加は、第2の培地中のポロクサマー-188を8.0g/Lより高い濃度にする、請求項43に記載の方法。
- 第2の液体培地へのポロクサマー-188の添加は、第2の培地中のポロクサマー-188を10.0g/Lより高い濃度にする、請求項44に記載の方法。
- 組み換えタンパク質を哺乳類細胞から、第1の液体培地、もしくは第2の液体培地、またはその任意の組み合わせから収集すること
をさらに含む、請求項32~45のいずれか1項に記載の方法。 - 収集された組み換えタンパク質を医薬組成物に製剤化することをさらに含む、請求項46に記載の方法。
- 収集は、培養が30×106細胞/mLより高い生細胞密度を達成した後、行われる、請求項46に記載の方法。
- 収集は、培養が50×106細胞/mLより高い生細胞密度を達成した後、行われる、請求項48に記載の方法。
- 収集は、培養が100×106細胞/mLより高い生細胞密度を達成した後、行われる、請求項49に記載の方法。
- 収集は、培養が150×106細胞/mLより高い生細胞密度を達成した後、行われる、請求項50に記載の方法。
- 収集は、培養が200×106細胞/mLより高い生細胞密度を達成した後、行われる、請求項51に記載の方法。
- 哺乳類細胞を培養する方法であって、該方法は、
容器と、該容器内に配置された液体培地と、該容器内に配置されたスパージャであって、該スパージャを介して該液体培地中にガスを分配するように構成された複数の孔を含む
該スパージャとを含む培養系を用意すること;ならびに
培養系において組み換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞を、系において組み換えタンパク質を産生するのに十分な条件およびガス流速下で灌流培養すること
を含み、培地は、孔サイズ、孔タイプ、ガス流速、培地中の生細胞密度、および細胞ストレスに関連するマーカーからなる群から選択される1つまたはそれ以上の因子に基づき選択されるポロクサマー-188濃度を含む、前記方法。 - 選択されたポロクサマー-188濃度は、培養工程の前にポロクサマー-188を培地に添加すること、および/または培養工程中にポロクサマー-188を培地に添加することにより達成される、請求項53に記載の方法。
- 因子は孔タイプであり、孔タイプは、焼結孔またはドリル孔である、請求項53または54に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約750μm~約1.5mmである場合は、約2.3g/L~約3.3g/Lの濃度のポロクサマー-188を選択することを含む、請求項53に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約900μm~約1.1mmである場合は、約2.5g/L~約3.1g/Lの濃度のポロクサマー-188を選択することを含む、請求項56に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約250μm~約750μmである場合は、約3.3g/L~約4.3g/Lの濃度のポロクサマー-188を選択することを含む、請求項53に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約400μm~約600μmである場合は、約3.5g/L~約4.1g/Lの濃度のポロクサマー-188を選択することを含む、請求項58に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約1μm~約250μmである場合は、4.3g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を選択することを含む、請求項53に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約1μm~約200μmである場合は、4.3g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を選択することを含む、請求項60に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約160μm~約190μmである場合は、4.3g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を選択することを含む、請求項61に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプがドリル孔であり、孔サイズが約170μm~約180μmである場合は、4.3g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を選択することを含む、請求項62に記載の方法。
- 5.0g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を選択することを含む、請求項60~63のいずれか1項に記載の方法。
- 6.0g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を選択することを含む、請求項64
に記載の方法。 - 8.0g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を選択することを含む、請求項65に記載の方法。
- 10.0g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を選択することを含む、請求項66に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが150μmより大きい場合は、約1.8g/L~約3.3g/Lの濃度のポロクサマー-188を選択することを含む、請求項53に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが約80μm~約150μmである場合は、約3.3g/L~約4.3g/Lの濃度のポロクサマー-188を選択することを含む、請求項68に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが約90μm~約110μmである場合は、約3.5g/L~約4.1g/Lの濃度のポロクサマー-188を選択することを含む、請求項69に記載の方法。
- 孔タイプおよび孔サイズに基づき、孔タイプが焼結孔であり、孔サイズが約1μm~約80μmである場合は、4.5g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を選択することを含む、請求項53に記載の方法。
- 5.0g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を選択することを含む、請求項71に記載の方法。
- 6.0g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を選択することを含む、請求項72に記載の方法。
- 8.0g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を選択することを含む、請求項73に記載の方法。
- 10.0g/Lより高い濃度のポロクサマー-188を選択することを含む、請求項74に記載の方法。
- 灌流培養は、
第1の液体培地を含む培養系を撹拌しながら、少なくとも約7日の培養期間、温度約32℃~約40℃でインキュベートすること;および
培養期間の最初の48~96時間後、連続的または定期的に、第1の体積の第1の液体培地を取り出し、第1の液体培地に第2の体積の第2の液体培地を添加すること
を含む、請求項53~75のいずれか1項に記載の方法。 - 第2の液体培地は、第1の液体培地中のポロクサマー-188の濃度より高い濃度のポロクサマー-188を含む、請求項76に記載の方法。
- 第2の培地は、選択されたポロクサマー-188濃度を含む、請求項76または77に記載の方法。
- 組み換えタンパク質を哺乳類細胞の内部から、第1の液体培地、もしくは第2の液体培
地、またはその任意の組み合わせから収集すること
をさらに含む、請求項76~78のいずれか1項に記載の方法。 - 収集された組み換えタンパク質を医薬組成物に製剤化することをさらに含む、請求項79に記載の方法。
- 容器は灌流バイオリアクターである、請求項32または53に記載の方法。
- 灌流バイオリアクターは、約1.5L~約25,000Lの体積を有する、請求項81に記載の方法。
- 培養期間は10日より長い、請求項32または53に記載の方法。
- (c)における、第1の体積の第1の液体培地を取り出し、第2の体積の第2の液体培地を添加することは、連続的に行われる、請求項32または53に記載の方法。
- (c)における、第1の体積の第1の液体培地を取り出し、第2の体積の第2の液体培地を添加することは、定期的に行われる、請求項32または53に記載の方法。
- (c)における、取り出された第1の液体培地の第1の体積、および添加された第2の液体培地の第2の体積は、経時的に増大される、請求項32または53に記載の方法。
- 第1の液体培地および/または第2の液体培地は、既知組成の液体培養培地、無血清の液体培養培地、血清を含有する液体培養培地、動物由来の成分を含まない液体培養培地、およびタンパク質を含まない培地からなる群から選択される、請求項32または53に記載の方法。
- およそ最初の48~96時間の時間後、それぞれ24時間の期間において、(c)における、取り出された第1の液体培地の第1の体積、および添加された第2の液体培地の第2の体積は、該第1の液体培地の体積、または容器の体積の約0.3×~約10×である、請求項32または53に記載の方法。
- 哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞、NSO細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、PerC6細胞、Vero細胞、またはHT-1080細胞株である、請求項1~88のいずれか1項に記載の方法。
- 組み換えタンパク質は、免疫グロブリン、酵素、成長因子、タンパク質フラグメント、または操作されたタンパク質である、請求項1~89のいずれか1項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201462095734P | 2014-12-22 | 2014-12-22 | |
US62/095,734 | 2014-12-22 | ||
JP2020177700A JP7075463B2 (ja) | 2014-12-22 | 2020-10-23 | 哺乳類細胞の培養方法 |
JP2022079207A JP2022107000A (ja) | 2014-12-22 | 2022-05-13 | 哺乳類細胞の培養方法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022079207A Division JP2022107000A (ja) | 2014-12-22 | 2022-05-13 | 哺乳類細胞の培養方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2024050754A true JP2024050754A (ja) | 2024-04-10 |
Family
ID=55527619
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017533539A Active JP6843750B2 (ja) | 2014-12-22 | 2015-12-21 | 哺乳類細胞の培養方法 |
JP2020177700A Active JP7075463B2 (ja) | 2014-12-22 | 2020-10-23 | 哺乳類細胞の培養方法 |
JP2022079207A Pending JP2022107000A (ja) | 2014-12-22 | 2022-05-13 | 哺乳類細胞の培養方法 |
JP2024014536A Pending JP2024050754A (ja) | 2014-12-22 | 2024-02-02 | 哺乳類細胞の培養方法 |
Family Applications Before (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017533539A Active JP6843750B2 (ja) | 2014-12-22 | 2015-12-21 | 哺乳類細胞の培養方法 |
JP2020177700A Active JP7075463B2 (ja) | 2014-12-22 | 2020-10-23 | 哺乳類細胞の培養方法 |
JP2022079207A Pending JP2022107000A (ja) | 2014-12-22 | 2022-05-13 | 哺乳類細胞の培養方法 |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11306341B2 (ja) |
EP (1) | EP3237604A2 (ja) |
JP (4) | JP6843750B2 (ja) |
KR (2) | KR102568951B1 (ja) |
CN (1) | CN107567495A (ja) |
AU (2) | AU2015369809B2 (ja) |
BR (1) | BR112017013423B1 (ja) |
CA (2) | CA2971861C (ja) |
HK (1) | HK1246345A1 (ja) |
IL (2) | IL308064A (ja) |
MX (2) | MX2017008338A (ja) |
RU (1) | RU2712746C2 (ja) |
SG (2) | SG11201705103WA (ja) |
TW (2) | TWI751103B (ja) |
WO (1) | WO2016106192A2 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2901950A1 (en) | 2013-02-22 | 2014-08-28 | Genzyme Corporation | Microcarrier perfusion culturing methods and uses thereof |
US10421949B2 (en) | 2013-02-22 | 2019-09-24 | Genzyme Corporation | Microcarrier perfusion culturing methods and uses thereof |
TWI743024B (zh) | 2014-06-06 | 2021-10-21 | 美商健臻公司 | 灌注培養方法及其用途 |
TWI776235B (zh) | 2014-06-09 | 2022-09-01 | 美商健臻公司 | 種子罐培養法(seed train processes)及其用途 |
RU2712746C2 (ru) | 2014-12-22 | 2020-01-30 | Джензим Корпорейшн | Способы культивирования клетки млекопитающего |
WO2019178508A1 (en) * | 2018-03-16 | 2019-09-19 | Genzyme Corporation | Methods for improving cell viability in a production bioreactor |
US20230266221A1 (en) * | 2020-08-12 | 2023-08-24 | Allen Institute | Systems, devices, and methods for quality control of cell production using predictive tagging |
CN112795531B (zh) * | 2021-04-11 | 2021-08-06 | 依科赛生物科技(太仓)有限公司 | 一种cho细胞无血清无蛋白培养基及其用途 |
Family Cites Families (37)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4522811A (en) | 1982-07-08 | 1985-06-11 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides |
US6458574B1 (en) * | 1996-09-12 | 2002-10-01 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Treatment of a α-galactosidase a deficiency |
EP1395647B1 (en) | 2000-12-20 | 2006-11-22 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | A device and method for seed-train expansion of mammalian cells |
AU2002348151A1 (en) | 2001-11-05 | 2003-05-19 | Genvec, Inc. | Viral vector production methods and compositions |
US6953692B2 (en) | 2001-12-18 | 2005-10-11 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Device and method for seed-train expansion of mammalian cells |
US7067279B1 (en) * | 2002-08-23 | 2006-06-27 | Immunex Corporation | Cell culture performance with betaine |
US6974681B1 (en) | 2002-08-23 | 2005-12-13 | Immunex Corporation | Cell culture performance with vanadate |
GB2411178B8 (en) | 2004-02-20 | 2008-07-11 | Cesco Bioengineering Co Ltd | Apparatus and method for preparing and culturing cells |
WO2006033935A2 (en) | 2004-09-16 | 2006-03-30 | Becton, Dickinson And Company | Perfusion bioreactor for culturing cells |
JP2008543307A (ja) | 2005-06-15 | 2008-12-04 | アンプロテイン コーポレイション | 懸濁培養用容器 |
WO2006138143A1 (en) | 2005-06-15 | 2006-12-28 | Amprotein Corporation | Suspension culture vessels |
US20080206819A1 (en) * | 2006-08-21 | 2008-08-28 | Mary Tsao | Intensified Perfusion Production Method |
US8501462B2 (en) | 2007-02-27 | 2013-08-06 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Insert device for multiwell plate |
WO2009034186A2 (en) | 2007-09-13 | 2009-03-19 | Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH | Process for cell cultivation |
US7968543B2 (en) | 2007-11-08 | 2011-06-28 | Ambit Biosciences Corporation | Methods of administering N-(5-tert-butyl-isoxazol-3-yl)-N′-{4-[7-(2-morpholin-4-yl-ethoxy)imidazo[2,1-b][1,3]benzothiazol-2-yl]phenyl}urea to treat proliferative disease |
BRPI0821467B8 (pt) | 2007-12-31 | 2021-05-25 | Baxalta GmbH | composição de furina recombinante, método para produzir a composição de furina recombinante, e, método para produzir uma proteína madura utilizando a composição de furina recombinante |
US20090233334A1 (en) * | 2008-03-11 | 2009-09-17 | Excellgene Sa | Cell cultivation and production of recombinant proteins by means of an orbital shake bioreactor system with disposable bags at the 1,500 liter scale |
DE102008019691A1 (de) | 2008-04-15 | 2009-10-29 | Technische Universität Ilmenau | Teilaktives mikrofluidisches System für die 3D-Zellkultivierung sowie Verfahren zu dessen Perfusion |
US8728479B2 (en) | 2009-03-31 | 2014-05-20 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Antigen-binding proteins comprising recombinant protein scaffolds |
PL2501822T3 (pl) * | 2009-11-17 | 2017-12-29 | E. R. Squibb & Sons, L.L.C. | Sposoby zwiększenia produkcji białek |
EP2707488B1 (en) | 2011-05-12 | 2017-11-15 | ProBioGen AG | Enhancement of protein production yield mediated by a fast shuttling cdc42 gtpase |
US20150004686A1 (en) | 2012-02-02 | 2015-01-01 | Corning Incorporated | Automatic continuous perfusion cell culture microplate consumables |
JP2015517804A (ja) | 2012-04-01 | 2015-06-25 | イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン | 細胞培養及び傾斜移動アッセイ方法及び装置 |
CN104903436B (zh) | 2012-10-23 | 2018-03-30 | 建新公司 | 灌注培养方法及其用途 |
US10421949B2 (en) | 2013-02-22 | 2019-09-24 | Genzyme Corporation | Microcarrier perfusion culturing methods and uses thereof |
CA2901950A1 (en) | 2013-02-22 | 2014-08-28 | Genzyme Corporation | Microcarrier perfusion culturing methods and uses thereof |
SG10201709131UA (en) | 2013-03-08 | 2017-12-28 | Genzyme Corp | Continuous purification of therapeutic proteins |
US20140271633A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Abbvie Inc. | Mammalian cell culture performance through surfactant supplementation of feed media |
JP6742902B2 (ja) | 2013-03-15 | 2020-08-19 | ジェンザイム・コーポレーション | 高密度細胞バンキングの方法 |
WO2014194137A1 (en) | 2013-05-29 | 2014-12-04 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods of evaluating cell culture additives |
KR102369211B1 (ko) | 2013-09-16 | 2022-03-03 | 젠자임 코포레이션 | 세포 배양물을 가공하는 방법 및 시스템 |
TWI709569B (zh) | 2014-01-17 | 2020-11-11 | 美商健臻公司 | 無菌層析樹脂及其用於製造方法的用途 |
TWI709570B (zh) | 2014-01-17 | 2020-11-11 | 美商健臻公司 | 無菌層析法及製法 |
MX2016015944A (es) | 2014-06-04 | 2017-08-15 | Amgen Inc | Metodos para cosechar cultivos de celulas de mamifero. |
TWI743024B (zh) | 2014-06-06 | 2021-10-21 | 美商健臻公司 | 灌注培養方法及其用途 |
TWI776235B (zh) | 2014-06-09 | 2022-09-01 | 美商健臻公司 | 種子罐培養法(seed train processes)及其用途 |
RU2712746C2 (ru) | 2014-12-22 | 2020-01-30 | Джензим Корпорейшн | Способы культивирования клетки млекопитающего |
-
2015
- 2015-12-21 RU RU2017126045A patent/RU2712746C2/ru active
- 2015-12-21 CA CA2971861A patent/CA2971861C/en active Active
- 2015-12-21 AU AU2015369809A patent/AU2015369809B2/en active Active
- 2015-12-21 KR KR1020177020466A patent/KR102568951B1/ko active IP Right Grant
- 2015-12-21 CN CN201580076640.3A patent/CN107567495A/zh active Pending
- 2015-12-21 CA CA3225136A patent/CA3225136A1/en active Pending
- 2015-12-21 IL IL308064A patent/IL308064A/en unknown
- 2015-12-21 BR BR112017013423-3A patent/BR112017013423B1/pt active IP Right Grant
- 2015-12-21 SG SG11201705103WA patent/SG11201705103WA/en unknown
- 2015-12-21 MX MX2017008338A patent/MX2017008338A/es unknown
- 2015-12-21 IL IL253071A patent/IL253071B2/en unknown
- 2015-12-21 EP EP15843061.1A patent/EP3237604A2/en active Pending
- 2015-12-21 US US14/976,486 patent/US11306341B2/en active Active
- 2015-12-21 SG SG10202001034PA patent/SG10202001034PA/en unknown
- 2015-12-21 WO PCT/US2015/067040 patent/WO2016106192A2/en active Application Filing
- 2015-12-21 JP JP2017533539A patent/JP6843750B2/ja active Active
- 2015-12-21 KR KR1020237027804A patent/KR20230125102A/ko not_active Application Discontinuation
- 2015-12-22 TW TW104143177A patent/TWI751103B/zh active
- 2015-12-22 TW TW109136823A patent/TWI741851B/zh active
-
2017
- 2017-06-21 MX MX2021007433A patent/MX2021007433A/es unknown
-
2018
- 2018-04-30 HK HK18105611.8A patent/HK1246345A1/zh unknown
-
2020
- 2020-10-23 JP JP2020177700A patent/JP7075463B2/ja active Active
-
2022
- 2022-01-11 US US17/572,978 patent/US20220145348A1/en active Pending
- 2022-05-13 JP JP2022079207A patent/JP2022107000A/ja active Pending
- 2022-06-14 AU AU2022204152A patent/AU2022204152A1/en active Pending
-
2024
- 2024-02-02 JP JP2024014536A patent/JP2024050754A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2024050754A (ja) | 哺乳類細胞の培養方法 | |
JP7360504B2 (ja) | シードトレイン法およびその使用 | |
KR102369211B1 (ko) | 세포 배양물을 가공하는 방법 및 시스템 | |
TWI843012B (zh) | 培養哺乳動物細胞之方法 | |
RU2811104C2 (ru) | Способы культивирования клетки млекопитающего | |
US20220333054A1 (en) | Methods of perfusion culturing a mammalian cell |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240229 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20240229 |