JP2017525395A - 含酸素テルペンの産生方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年8月21日出願の米国特許仮出願第62/040,284号の利益、及びその優先権を主張し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
(1)疎水性:Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性の親水性:Cys、Ser、Thr;Asn、Gin;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響を与える残基:Gly、Pro;及び
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
上流MEP経路遺伝子のdxs、ispD、ispF、及びidiを過剰発現するE.coliを作製し、これはイソプレノイド前駆体のイソペンチルピロリン酸(IPP)へのフラックスを促進し、異種ジテルペノイド生成物の1g/L超の力価を支持する(3)。ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ(GGPS)及びジテルペンシンターゼを、ファルネシルピロリン酸シンターゼ(FPPS)及びセスキテルペンシンターゼまたはゲラニルピロリン酸シンターゼ(GPPS)及びモノテルペンシンターゼと置き換えることによりモノテルペン及びセスキテルペンを含む様々なテルペノイドを産生する株を構築した。新規含酸素テルペン用のCYP450を試験するためにセスキテルペン産生株を開発するには、バレンセンシンターゼ酵素をクローニングしてMEP経路過剰発現E.coli株中で発現させた。高基質フラックスは、CYP450の活性を同定するのに役立つ。これまで、含酸素タキサジエン産生株に関する研究は、CYP450経路をタキサジエン産生株に導入すると産生力の有意な減少を示した(300mg/L〜約10mg/L)。
バレンセンをモデル系として使用し、産生テルペン化学物質についてのCYP450に基づく酸素添加化学の能力を検証した。
一旦SrKOの特有の活性を同定したら、実験を実施してその多様なバレンセンの酸化を実施するその能力を改善した。SrKOの結晶構造は記載されてこなかった。RCSB Protein Data Bankに対するSrKOのBlast検索は、結晶構造によるSrKOとP450酵素との配列同一性が低いこと(約20%)を示す。その低い配列同一性にかかわらず、P450の保存的折り畳み構造を考慮し、最新のタンパク質モデリングツールを使用してSrKO上に構築した。ヒトにおいてアンドロゲンの生合成を触媒する膜結合シトクロムP450 17 A1の結晶構造(DeVore N.M.,Scott E.E.,Nature,482,116−119,2012を参照のこと)をモデル開発のための鋳型として選択した。BioLuminateタンパク質モデリングソフトウェアを使用して、主要な残基及び特徴的なモチーフの位置決め(Gotoh O.,J.Biol Chem,267,83−90,1992を参照のこと)が鋳型と十分に整列するようにして相同性モデルを開発した(図8A)。さらに、補欠分子ヘム鉄錯体を含んだSrKOの相同性モデルもまた構築した。次いで、AutoDock VINAを使用して、SrKO活性部位におけるバレンセンの可能な結合様式の全体を作製した(図8B)(29)。
シトクロムP450酵素SrKO(配列番号38)によるバレンセンの酸化から誘導した生成物をGC/MS(Agilent6800;カラム:Rtx−5、0.32mm×60m×1.0μm膜厚;GC温度プログラム:40℃で5分間、4℃/分ずつ300℃まで増加させて30分間保持した。)により分析し、表8A及び表8Bに提供したデータを得た。
最初のSrKOバリアント(これらの実施例においてバレンセンオキシダーゼ1、またはVO1と称される)の膜相互作用を最適化するために、細胞質C末端で内膜に固定されたE.coliタンパク質を同定した。E.coli yhcBのN末端配列を選択し、これは1回膜貫通ドメインを提供する。yhcBのN末端の20〜24アミノ酸を元の膜アンカー配列であるMALLLAVF(配列番号112)と交換し、SrKOのN末端切断サイズを28〜32で変えた。図9を参照のこと。VO1をp5プラスミド上のT7プロモーターの制御下で発現させた。SrCPRを染色体から独立して発現させた。株を96ディープウェルプレートにおいて、既に記載したようにグリセロール及びドデカン重層を添加したR培地中で30℃で48時間培養した。
VO1の変異分析を、含酸素力価を増加させるために実施した。株MB2509(MP6−MEP MP1−ScFPPS Fab46−VS2 MP6−ScCPR)をバックグラウンドとして使用し、これはp5−T7−yhcB−VO1プラスミドで形質転換した場合に約18%のヌートカトンを産生する。株をヌートカトンのより高い産生について評価した。
二次スクリーニング(実施例6)後に選択した7つの変異を、バリアントまたは野生型のいずれかを各部位に割り当てることにより、VO組換えライブラリー中にランダムに組み込んだ。バックグラウンド株は、MB2509(EGV G2 MP6−CPR)+pBAC−T7−BCD7−yhcB−VOであった。
シトクロムP450レダクターゼのセットをVO1との活性の改善についてスクリーニングした。本実施例は、株MB2459をバックグラウンドとしてpBAC−T7−BCD7−VO1(I382L)−T7BCDx−CPRxと共に使用して行った。BCDは2シストロン設計を表し、これはMutalik et.al.Nature Methods 2013(10)4:354に記載されている。より低いBCD数は、より高い翻訳速度を指す。CPRは、SrCPR(配列番号62)、SrCPR3(配列番号80)、AaCPR(配列番号68)、PgCPR(配列番号82)、AtCPR2(配列番号72)、AtCPR1(配列番号70)、eSrCPR1(配列番号76)、及びeATR2(配列番号74)を含んだ。株を実施例5におけるように30℃で試験した。
ヌートカトールをヌートカトンに変換するアルコールデヒドロゲナーゼの能力を評価した。以下のADH酵素を評価した:
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Claims (94)
- セスキテルペンの含酸素生成物の作製方法であって、前記セスキテルペンを、セスキテルペン酸化活性を有するStevia rebaudianaカウレンオキシダーゼ(SrKO)またはその誘導体と接触させることと、前記含酸素生成物を回収することとを含む、前記方法。
- 前記SrKO誘導体が、SrKO(配列番号37、38、または55)と比較して置換、欠失、または挿入から独立して選択される1〜50の変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記SrKO誘導体が、SrKO(配列番号37、38、または55)と比較して1〜40の変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記SrKO誘導体が、SrKO(配列番号37、38、または55)と少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、バレンセンオキシダーゼ活性を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- SrKO(配列番号37、38、または55)と比較して1つ以上の変異が、表2または表6から選択される、請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも2つの変異が、表2及び/または表6から選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記SrKOが、そのN末端膜貫通領域の少なくとも一部分の欠失、及びE.coli yhcBまたはその誘導体に由来する内膜貫通ドメインの付加を有する誘導体である、請求項2に記載の方法。
- 前記SrKOが、そのN末端膜貫通ドメインの15〜35のアミノ酸欠失、及びE.coli yhcBまたはその誘導体に由来する前記膜貫通ドメインの15〜25のアミノ酸の付加を有する誘導体である、請求項7に記載の方法。
- yhcBに由来する前記N末端膜貫通ドメインが、配列番号118のアミノ酸配列、または配列番号118に対して1〜5つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記SrKOが、配列番号37と比較して46、76、94、131、231、284、383、390、400、444、468、488及び499から選択される位置に1つ以上の変異を有する誘導体である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記SrKOが、配列番号37と比較してR76K、M94V、T131Q、F231L、H284Q、R383K、I390L、T468I、及びT499Nから選択される1つ以上の変異を有する誘導体である、請求項10に記載の方法。
- 前記SrKOが、配列番号55〜61、104、及び105から選択されるアミノ酸配列または配列番号55〜61、104及び105から選択される配列と比較して1〜20の変異を有するアミノ酸配列を含む誘導体である、請求項1に記載の方法。
- 前記セスキテルペンが、バレンセン、ゲルマクレン(A、B、C、D、またはE)、ファルネセン、ファルネソール、ヌートカトール、パチュロール、カジネン、セドロール、フムレン、ロンギホレン、及び/またはベルガモテン、β−イランゲン、β−サンタロール、β−サンタレン、α−サンタレン、α−サンタロール、β−ベチボン、a−ベチボン、クシモール、ビサボレン、β−アリオフィレン(aryophyllene)、ロンギホレン;α−シネンサール;α−ビサボロール、(−)−β−コパエン、(−)−α−コパエン、4(Z),7(Z)−エカジエナール(ecadienal)、セドロール、セドレン、セドロール、グアイオール、(−)−6,9−グアイアジエン、ブルネソール、グアイオール、レデン、レドール、リンデストレン、ならびにアルファ−ベルガモテンである、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 主要なセスキテルペンが、バレンセン、ゲルマクレン(A、B、C、D、またはE)、ファルネセン、ファルネソール、ヌートカトール、パチュロール、カジネン、セドロール、フムレン、ロンギホレン、及び/またはベルガモテン、β−イランゲン、β−サンタロール、β−サンタレン、α−サンタレン、α−サンタロール、β−ベチボン、a−ベチボン、クシモール、ビサボレン、β−アリオフィレン(aryophyllene)、ロンギホレン;α−シネンサール;α−ビサボロール、(−)−β−コパエン、(−)−α−コパエン、4(Z),7(Z)−エカジエナール(ecadienal)、セドロール、セドレン、セドロール、グアイオール、(−)−6,9−グアイアジエン、ブルネソール、グアイオール、レデン、レドール、リンデストレン、ならびにアルファ−ベルガモテンである、請求項1〜13に記載の方法。
- 主要なセスキテルペンが、バレンセンである、請求項14に記載の方法。
- 主要な含酸素生成物が、ヌートカトン、及び場合によりヌートカトールである、請求項15に記載の方法。
- 前記接触が宿主細胞中で行われ、この細胞が細菌である、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、E.coli、Bacillus subtillus、またはPseudomonas putidaである、請求項17に記載の方法。
- 前記接触が、酵母である宿主細胞中で行われる、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、及びYarrowia lipolyticaを含む、サッカロマイセス属、ピキア属、またはヤロウイア属の種である、請求項19に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、イソペンチルピロリン酸(IPP)を産生する、請求項17〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記IPPが、内因性または異種MEPまたはMVA経路による代謝フラックスによって産生される、請求項21に記載の方法。
- 前記セスキテルペンが、MEP経路による代謝フラックスによって少なくとも部分的に産生され、前記宿主細胞が、dxs、ispD、ispF、及び/またはidi遺伝子の少なくとも1つの追加コピーを有する、請求項22に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、ファルネシルピロリン酸シンターゼをさらに発現する、請求項17〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、異種セスキテルペンシンターゼをさらに発現する、請求項17〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記セスキテルペンシンターゼが、バレンセンシンターゼである、請求項25に記載の方法。
- 前記バレンセンシンターゼが、Citrus sinensisもしくはVitis vinferaバレンセンシンターゼまたはその誘導体である、請求項26に記載の方法。
- 前記VvVSが、VvVS(配列番号1)に対して置換、欠失、または挿入から独立して選択される1〜40の変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記CsVSが、CsVS(配列番号12)に対して置換、欠失、または挿入から独立して選択される1〜40の変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の方法。
- 1つ以上の変異が表3から選択される、請求項28に記載の方法。
- 前記SrKOが、シトクロムP450レダクターゼを共発現する宿主細胞中で発現される、請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記P450レダクターゼが、ステビア種に由来するCPRである、請求項31に記載の方法。
- 前記P450レダクターゼが、配列番号62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、及び82から選択されるアミノ酸配列、またはその誘導体を含む、請求項31に記載の方法。
- 前記SrKOが、シトクロムP450レダクターゼパートナーとの融合物として発現される、請求項1〜33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、ヌートカトールからヌートカトンを産生するアルコールデヒドロゲナーゼをさらに発現する、請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 酸化油が水性反応媒体から抽出され、続いて分留が行われる、請求項1〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記酸化油が、有機溶媒を使用して水性反応媒体から抽出される、請求項36に記載の方法。
- 画分のセスキテルペン及びセスキテルペノイド成分が、GC/MSにより定量的に測定され、続いて前記画分をブレンドし、所望のヌートカトン含有構成成分を生成する、請求項36に記載の方法。
- ヌートカトン成分が定量的に測定される、請求項38に記載の方法。
- ヌートカトン画分が回収される、請求項36または37に記載の方法。
- 含酸素セスキテルペンを含有する製品の作製方法であって、請求項1〜40のいずれか1項に記載の方法により調製される前記含酸素セスキテルペンを前記製品に組み込むことを含む、前記方法。
- 前記製品が、風味製品、芳香製品、化粧品、洗浄製品、洗剤もしくは石鹸、または有害生物防除製品である、請求項41に記載の方法。
- 前記製品が、飲料、チューインガム、キャンディ、または人工風味料から選択される風味製品である、請求項42に記載の方法。
- 前記製品が昆虫忌避剤である、請求項42に記載の方法。
- バレンセンオキシダーゼ活性を増加させる、配列番号37、38、または55に対して少なくとも1つの変異を含むSrKO誘導体。
- 前記SrKO誘導体が、そのN末端膜貫通領域の少なくとも一部分の欠失、及びE.coli yhcBまたはその誘導体に由来する内膜貫通ドメインの付加を有する、請求項45に記載のSrKO誘導体。
- 前記SrKO誘導体が、そのN末端膜貫通ドメインの15〜35のアミノ酸欠失、及びE.coli yhcBまたはその誘導体に由来する前記膜貫通ドメインの15〜25のアミノ酸の付加を有する、請求項46に記載のSrKO誘導体。
- 前記N末端膜貫通ドメインが、配列番号118のアミノ酸配列、または配列番号118に対して1〜5つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項46に記載のSrKO誘導体。
- 前記SrKO誘導体が、配列番号37と比較して46、76、94、131、231、284、383、390、400、444、468、488及び499から選択される位置に1つ以上の変異を有する、請求項45〜48に記載のSrKO誘導体。
- 前記SrKO誘導体が、配列番号37と比較してR76K、M94V、L107M、T131Q、F231L、H284Q、R383K、I390L、T468I、及びT499Nから選択される1つ以上の変異を有する、請求項49に記載のSrKO誘導体。
- 前記SrKO誘導体が、配列番号55〜61、104、及び105から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項50に記載のSrKO誘導体。
- 前記SrKO誘導体が、配列番号55〜61、104または105から選択されるアミノ酸配列に対して1〜20の変異を有するアミノ酸配列を含み、ただし、前記アミノ酸配列が、配列番号37と比較して46、76、94、131、231、284、383、390、400、444、468、488及び499から選択される位置に1つ以上の変異を有することを条件とする、またはただし、前記アミノ酸配列が、配列番号37と比較してR76K、M94V、T131Q、F231L、H284Q、R383K、I390L、T468I、及びT499Nから選択される前記変異のうち1つ以上を有することを条件とする、請求項50に記載のSrKO誘導体。
- 前記誘導体が単離される、もしくは部分的に精製される、または宿主細胞中で異種発現される、請求項45〜52のいずれか1項に記載のSrKO誘導体。
- 含酸素セスキテルペンを産生する宿主細胞であって、前記宿主細胞がイソペンチルピロリン酸(IPP)を産生し;前記宿主細胞が、ファルネシルピロリン酸シンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、及びバレンセンオキシダーゼ活性を有するSrKOまたはその誘導体を発現する、前記宿主細胞。
- 前記SrKO誘導体が、バレンセンオキシダーゼ活性を増加させる、配列番号37、38、または55に対して少なくとも1つの変異を含む、請求項54に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、MVAまたはMEP経路を発現する、請求項54または55に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、細菌または酵母である、請求項56に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、E.coli、Bacillus subtillus、またはPseudomonas putidaである、請求項57に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、及びYarrowia lipolyticaを含む、サッカロマイセス属、ピキア属、またはヤロウイア属の種である、請求項57に記載の宿主細胞。
- 前記SrKO誘導体が、SrKO(配列番号37、38、または55)と比較して置換、欠失、または挿入から独立して選択される1〜50の変異を有する、請求項54〜59のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記SrKO誘導体が、SrKO(配列番号37、38、または55)と比較して1〜40の変異を有する、請求項60に記載の宿主細胞。
- 前記SrKO誘導体が、SrKO(配列番号37、38、または55)と少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、バレンセンオキシダーゼ活性を有する、請求項60または61に記載の宿主細胞。
- SrKO(配列番号37または38)と比較して1つ以上の変異が、表2または表6から選択される、請求項54〜62のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 少なくとも2つの変異が、表2及び/または表6から選択される、請求項63に記載の宿主細胞。
- 前記SrKO誘導体が、そのN末端膜貫通領域の少なくとも一部分の欠失、及びE.coli yhcBまたはその誘導体に由来する内膜貫通ドメインの付加を有する、請求項54に記載の宿主細胞。
- 前記SrKO誘導体が、そのN末端膜貫通ドメインの15〜35のアミノ酸欠失、及びE.coli yhcBまたはその誘導体に由来する前記膜貫通ドメインの15〜25のアミノ酸の付加を有する、請求項65に記載の宿主細胞。
- 前記N末端膜貫通ドメインが、配列番号118のアミノ酸配列、または配列番号118に対して1〜5つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項66に記載の宿主細胞。
- 前記SrKO誘導体が、配列番号37と比較して46、76、94、131、231、284、383、390、400、444、468、488及び499から選択される位置に1つ以上の変異を有する、請求項54〜67のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記SrKO誘導体が、配列番号37と比較してR76K、M94V、L107M、T131Q、F231L、H284Q、R383K、I390L、T468I、及びT499Nから選択される1つ以上の変異を有する、請求項68に記載の宿主細胞。
- 前記SrKO誘導体が、配列番号55〜61、104、もしくは105から選択されるアミノ酸配列;または配列番号55〜61、104、もしくは105から選択される配列と比較して1〜20の変異を有するアミノ酸配列を含み、ただし、前記アミノ酸配列が、配列番号37と比較して46、76、94、131、231、284、383、390、400、444、468、488及び499から選択される位置に1つ以上の変異を有することを条件とする、またはただし、前記アミノ酸配列が、配列番号37と比較してR76K、M94V、T131Q、F231L、H284Q、R383K、I390L、T468I、及びT499Nから選択される前記変異のうち1つ以上を有することを条件とする、請求項68または69に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞がヌートカトンを産生する、請求項54〜70のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、dxs、ispD、ispF、及び/またはidi遺伝子の少なくとも1つの追加コピーを有するE.coliである、請求項71に記載の宿主細胞。
- 前記セスキテルペンシンターゼが、バレンセンシンターゼである、請求項54〜72のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記バレンセンシンターゼが、Citrus sinensisもしくはVitis vinferaバレンセンシンターゼ、またはE.coliにおいて増加した発現及び/または活性を有するその誘導体である、請求項73に記載の宿主細胞。
- 前記VvVS誘導体が、VvVS(配列番号1)に対して置換、欠失、または挿入から独立して選択される1〜40の変異を有する、請求項74に記載の宿主細胞。
- 前記CsVSが、CsVS(配列番号12)に対して置換、欠失、または挿入から独立して選択される1〜40の変異を有する、請求項74に記載の宿主細胞。
- 1つ以上の変異が表3から選択される、請求項75に記載の宿主細胞。
- 前記SrKOまたはその誘導体が、シトクロムP450レダクターゼを共発現する宿主細胞中で発現される、請求項54〜77のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記SrKOが、シトクロムP450レダクターゼパートナーとの融合物として発現される、請求項78に記載の宿主細胞。
- 前記P450レダクターゼが、ステビア種に由来するCPRである、請求項54〜79のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記P450レダクターゼが、配列番号62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、及び82から選択されるアミノ酸配列、またはその誘導体を含む、請求項54〜79のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、ヌートカトールをヌートカトンに変換するアルコールデヒドロゲナーゼ酵素をさらに発現する、請求項54〜79のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 請求項1〜40のいずれか1項に記載の方法により得ることができる含酸素セスキテルペン生成物。
- 請求項83に記載の含酸素セスキテルペン生成物を含む、風味製品または芳香製品。
- 請求項83に記載の含酸素セスキテルペン生成物を含む、昆虫忌避製品。
- 配列番号3(Vv1MI)、配列番号5(Vv2MI)、配列番号7(Vv1M5)、配列番号9(Vv2M5)、及び配列番号11(VS2)から選択されるアミノ酸配列、またはE.coliにおいて増加した活性を有するその誘導体を含む、バレンセンシンターゼ酵素。
- バレンセンオキシダーゼ活性を増加させる少なくとも1つの変異を有するSrKO誘導体をコードするヌクレオチド配列と、E.coliにおける発現及び活性を支持するリーダー配列と、リンカー配列と、前記SrKO誘導体を再生するのに十分なSrCPRまたはその誘導体とを含む、組換え核酸分子。
- 請求項45〜52のいずれか1項に記載のSrKO誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む、組換え核酸分子。
- 請求項88に記載の改変SrKOポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたヌクレオチド配列、組換えベクター、または宿主細胞。
- 前記ヌクレオチド配列が宿主細胞中で発現され、前記宿主細胞がE.coli細胞である、請求項88に記載の単離されたヌクレオチド配列。
- 請求項45〜52に記載の改変SrKOポリペプチドの調製方法であって、前記方法が、(i)前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記改変されたポリペプチドを発現する宿主細胞を培養するステップと;(ii)場合により前記ポリペプチドを回収するステップとを含む、前記方法。
- 含酸素セスキテルペンの産生方法であって、
(i)請求項45または52に記載の改変SrKOポリペプチドを提供するステップと、
(ii)シトクロムP450レダクターゼの存在下でセスキテルペンを前記改変SrKOポリペプチドと接触させるステップと、
(iii)前記産生された含酸素セスキテルペンを回収するステップと
を含む、前記方法。 - 前記含酸素セスキテルペンが、油として回収される、請求項92に記載の方法。
- 前記セスキテルペンがバレンセンである、請求項91〜93に記載の方法。
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