JP2017521414A - ロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物及びその使用 - Google Patents
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Abstract
下記の構造式で表されるロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ、それらの喘息及び／又はアレルギー性鼻炎−喘息症候群の治療及び／又は予防及び／又は緩和及び／又は補助治療用の医薬品を製造するための使用、及びそのシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグを含む医薬組成物を提供する。本発明に係る一連の化合物は、喘息及び／又はアレルギー性鼻炎−喘息症候群の治療及び／又は予防及び／又は緩和及び／又は補助治療用医薬品の製造において良好な見込みがある。【選択図】なし
Description
本発明は、ロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物及びその使用に関する。
喘息は、可逆性の気道閉塞及び非特異的気道過敏性を特徴とする慢性炎症性疾患であり、一連の炎症性細胞及び炎症性伝達物質の複雑な過程につながる。喘息患者の一般的な症状は、発作性息切れ、呼吸促迫、胸部圧迫感、又は咳であり、少数の患者に胸痛をもたらす可能性がある。現在、喘息はよく見られる多発性の疾患であり、人々の心身の健康に厳しい影響を与える。
気管支喘息（喘息）を発症するときに気道閉塞の機序は、気道平滑筋の収縮、血管漏出による粘膜の浮腫、粘液分泌の増加、及び好酸球支配の炎症性細胞浸潤などによる気管支痙攣に関連する。ヒスタミン、ロイコトリエン（ＬＴｓ）、トロンボキサン、プロスタグランジンのような様々な炎症性メディエーターは、上下気道の炎症反応に関与する。また、喘息は、一連の炎症性細胞及び炎症性メディエーターの複雑な過程（非特許文献１）に関連する。研究によると、ロイコトリエンは、喘息の発症に対して重要な役割を果たし（非特許文献２）、喘息の発生、進行に対しても主要な役割を果たすことが明らかになった。したがって、ロイコトリエン受容体拮抗薬は、喘息の臨床治療における最も効果的なメディエーター拮抗薬になっており、このような薬物の使用により、喘息の治療における重要な進展を実現できる。
２０世紀７０年代後半に、システイニルロイコトリエン（ＣｙｓＬＴ）が喘息の重要なメディエーターであることを発見した。肥満細胞や好酸球のような炎症性細胞によって生成されるロイコトリエンは、その受容体によって、喘息の発症において、血管透過性及び浮腫形成を促進する生物学的機能、粘液の生成を促進して粘液線毛輸送を弱める生物学的機能、炎症性細胞（例えば、好酸球）が血液から気道に移動して炎症性メディエーターを放出するように誘導し、気道上皮を損傷する生物学的機能、気管支痙攣を直接的に引き起こし、平滑筋細胞の増殖を刺激する生物学的機能などを発揮する。ロイコトリエン受容体は、平滑筋細胞、樹状細胞、好酸球、単球、マクロファージ、及びＢリンパ球に分布している。免疫蛍光検査によると、肺組織では、中枢気道の平滑筋及び末梢気道の平滑筋にＣｙｓＬＴ１受容体が分布していることを示す。ロイコトリエン受容体拮抗薬（ＬＴＲＡ）が喘息病人の呼吸を改善し症状を軽減できることによって、さらにロイコトリエンの喘息における効果をサポートすることができる。
ＬＴｓの喘息気道過敏性における効果が徐々に認識され、ＬＴｓ受容体部位が確認されることに伴って、ロイコトリエン受容体拮抗薬(ＬＴＲＡ)及びＬＴｓ合成阻害剤の喘息予防・治療における効果が注目されている。最初のロイコトリエンＤ４(ＬＴＤ４)受容体拮抗薬であるイブジラスト（ibudilast：ketas（登録商標））は、１９８９年以来臨床で使用されてきた。１９９６年、新世代のＬＴＲＡザフィルルカスト（商品名：アコレート）は、抗喘息、抗炎症、及び抗アレルギーの薬物として海外市場に登場し、一定の臨床上の使用実績がある。現在、このようなＬＴｓ拮抗作用を有する薬物は、喘息治療の新しい傾向になっている。
ロイコトリエン受容体拮抗薬（ＬＴＲＡｓ）の作用機序は、主として下記の（１）〜（４）である。（１）ＬＴＲＡｓは、粘膜炎症性細胞浸潤を予防、軽減する抗炎症作用があり、アレルギー性喘息患者にザフィルルカスト又はモンテルカストを投与する場合、肺機能の改善に伴って、患者の痰、末梢血、及び気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）におけるリンパ球、好塩基球、好酸球、マクロファージの数を顕著に減少させ、その減少度合いが肺活量及び昼間の徴候の改善度合いに関連する。（２）ＬＴＲＡｓは、気管支平滑筋を弛緩させる。（３）ＬＴＲＡｓは、運動誘発性気管支収縮を抑制する。ＬＴＲＡｓは、喘息患者において約７０％〜８０％を占める運動誘発性気管支収縮を顕著に抑制することができる。（４）ＬＴＲＡｓは、アスピリン喘息（ＡＩＡ）に効果がある。アスピリン喘息の患者は、慢性鼻炎、再発性鼻ポリープ、喘息、及びアスピリン不耐性などの特徴を有し、通常の治療でこのような喘息をコントロールすることが困難であり、このような患者にシステイニルロイコトリエンの過量生成及びＬＴＣ４合成酵素の上昇が伴う場合が多い。数多くの研究により、アスピリン耐性喘息患者及び正常人と比べて、ＡＩＡ患者は、気管支生検組織ＬＴＣ４合成酵素を過剰発現すると同時に、肺胞洗浄液におけるシステイニルロイコトリエンレベルの向上が伴うことを実証した。
近年、大規模臨床試験により、ＬＴＲＡｓはプラセボと比べて、顕著な臨床治療効果を有し、長期使用においても明らかな副作用が見られず、耐性がよく、小児に対しても非常に有効かつ安全であることを実証した。また、死亡や重篤な有害反応の発生に関する報告はない。
現在、市販及び臨床使用のＬＴＲＡｓは、主としてザフィルルカスト（Zafirlukast：アコレート（Acolate：登録商標））、プランルカスト（Pranukast）、及びモンテルカスト（Montelukast：シングレア（Singulair：登録商標））がある。そのうち、モンテルカストは、近年で開発された高選択性、良好な耐性を示す強力な新規システイニルロイコトリエン受容体１（ＣｙｓＬＴＲ）遮断薬類の薬物であり、ロイコトリエンＤ４（ＬＴＤ４）とＣｙｓ−ＬＴ１受容体との結合に競合的拮抗をすることにより、ロイコトリエンの活性を抑制し、血管内皮細胞成長因子の発現を減少して血管透過性を調整し、気道浮腫を改善することができ、ロイコトリエンによる血管透過性増加、気管支痙攣、気道粘液の高分泌を効果的に予防かつ抑制し、気道過敏性を低下することができ、重要な器官又は系統に対して顕著な有害反応がなく、コンプライアンスが良く、炎症メディエーター拮抗薬としての抗喘息効果が認められた（非特許文献３）。モンテルカストは、臨床で主として成人喘息及び小児喘息の予防及び長期治療に用いられる（非特許文献４）。二重盲検クロスオーバー無作為化比較試験の臨床研究により、モンテルカストは、ＬＴＤ４の吸入による気管支収縮を顕著に抑制できることを示した（非特許文献５）。また、Ｂｒｏｎｓｋｖ ＥＡら（非特許文献６）が喘息患者を対象としてモンテルカストの運動誘発性気管支収縮に対する抑制効果の試験を行った結果、モンテルカストは、運動による気管支収縮を抑制できることを示した。
モンテルカストナトリウム（シングレア）は、最初の経口ロイコトリエン受容体拮抗薬である。ロイコトリエンは、気管支喘息の発症における一連の炎症性細胞及び炎症性メディエーターのうちの重要なメディエーターの１つであり、喘息の病態生理学において気管支喘息の発生、進行に重要な役割を果たす。
モンテルカストナトリウム（シングレア）は、現在唯一の毎日１回投与の高選択性ロイコトリエン受容体拮抗薬であり、成人、小児喘息及びアレルギー性鼻炎−喘息症候群の治療に適用される。モンテルカストナトリウムは、適用範囲が広く、投与が便利であるため、製造及び臨床使用が比較的遅いにもかかわらず、現在、臨床医に広く認められ、臨床で使用されている。
最近、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）の有害事象報告システム（ＡＥＲＳ）は、モンテルカストナトリウム（シングレア）などの抗ロイコトリエン薬に関する多くの神経精神性副作用の報告を受け取った。それらの報告の多くは、モンテルカストナトリウム（シングレア）に誘発され得る自殺傾向に関する。現在、この薬物が最も一般的に使用される抗ロイコトリエン処方薬であり、一部の患者の自殺報告の臨床説明から見ると、自殺という有害事象は、確かに薬物に起因するものであることが分かった。２００８年３月２７日に、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）は、シングレアの使用が行為／情動の変更と自殺の傾向及び行動とを引き起こす可能性があるという通告（公告０３／２７／２００８）を医療従事者及び患者に出した。患者は一時休薬しなくてもよいが、臨床医は、これらの薬物を使用している患者に対して行為／情動変更の有無と、自殺傾向及び行為の有無とを密接に監視しなければならず、モンテルカストナトリウム（シングレア）を投与している小児に対して多動、注意欠陥の発生の有無と、攻撃行為、嗜眠、落ち込みなどの症状の有無とを注意しなければならない。
２００９年に、ＦＤＡは調査を行った後、モンテルカストナトリウム（シングレア）などの３種類の喘息薬が精神的問題を引き起こす可能性があり、抗ロイコトリエン薬物の製造業者が薬剤ラベルに薬物使用の危険性を明記する必要があることを正式に表明した。さらに、ＦＤＡのホームページで発表した声明において、モンテルカストナトリウム（シングレア）、アコレート、及びジレウトン（zileuton）を投与している一部の喘息患者に、
うつ、不安、及び自殺傾向などの副作用を生じることが指摘された。また、ＦＤＡの調査により、モンテルカストナトリウム（シングレア）などの３種類の抗ロイコトリエン類喘息薬が精神的問題を引き起こす可能性があることを実証した。さらに、ＦＤＡは、臨床医及び喘息患者がこれらの薬物の精神健康への潜在的危険性を理解すべきであることを指摘した。
うつ、不安、及び自殺傾向などの副作用を生じることが指摘された。また、ＦＤＡの調査により、モンテルカストナトリウム（シングレア）などの３種類の抗ロイコトリエン類喘息薬が精神的問題を引き起こす可能性があることを実証した。さらに、ＦＤＡは、臨床医及び喘息患者がこれらの薬物の精神健康への潜在的危険性を理解すべきであることを指摘した。
モンテルカストナトリウム（シングレア）の製造業者であるＭＳＤ株式会社のスポークスマンによると、上記した神経精神的副作用の危険性をモンテルカストナトリウム（シングレア）の取扱説明書における「有害反応」の欄に明記しており、今後はさらに薬品注意事項の欄に説明を追加する。
従来技術では、拮抗薬としてロイコトリエンに活性のあるキノリン含有化合物が開示されている。
例えば、特許文献１（Ｍｅｒｃｋ）及び特許文献２（ＭＥＲＣＫ ＦＲＯＳＳＴ ＣＡＮＡＤＡ ＩＮＣ）には、下記の構造式Ａで表される化合物が開示されている。特許文献３（Ｒｏｒｅｒ）及び特許文献４には、下記の構造式Ｂで表される化合物が開示されている。
British Medical Journal 1998,316(15):1257-1258
Sampson A, Holgate S.Leukotriencemodiilersin the treatment of asthma [J]. BMJ, 1998,316(5):1257-1258.
Markham A, Faulds D. Montelukast [J]. Drugs,1998, 56(2):251-7.
LEE KS, KIM SR, PARK HS, et a1. Cysteinylleukotriene receptor antagonist regulates vascular permeability by reducingvascularendothelial growth factor expression [J]. Allergy Clinlmmunol, 2004,114(5):1093-1099.
Lepeleive ID, Reiss TF, RocheHe F, et.Montelukastcausesprolonged, potent leukotriene D4-receptor antagonism intheairways of patients with asthma [J], cfinPharmacolTher, 1997, 61(1):83.
Bronsky EA, Kemp JP, Zhang J, et.Doserelated protection of execfise bronchoconstriction by montelukast, acysteinyl leukotriene-receptor antagonist, at the and of a once-daily dosing interval. Clin PharmacolTher, 1997, 62(5):556.
本発明の目的は、ロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物及びその使用を提供することにある。
本発明は、下記の技術的手段を採用する。
本発明は、構造式：
（式中、
Ｒ１、Ｒ２は、Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＯ２、又はＮ３を示し、
Ｒ３は、低級アルキル基、低級アルケニル基、−ＣＦ３、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、ＣＨ２ＣＦ３、置換もしくは非置換のフェニル基、置換もしくは非置換のベンジル基、置換もしくは非置換の２−フェネチル基、又は２つのＲ２基が同一の炭素に結合してなるＯ、Ｓ、及びＮから選ばれる０〜２のヘテロ原子を有する８員以下の環を示し、
Ｒ４は、Ｈ、又はＲ３を示し、
Ｒ５は、Ｈ、又は薬学的に許容される塩に対応するカチオンを示し、
Ｒ６、Ｒ７は、Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＯ２、又はＮ３を示す。）
で表されるロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグを提供する。
Ｒ１、Ｒ２は、Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＯ２、又はＮ３を示し、
Ｒ３は、低級アルキル基、低級アルケニル基、−ＣＦ３、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、ＣＨ２ＣＦ３、置換もしくは非置換のフェニル基、置換もしくは非置換のベンジル基、置換もしくは非置換の２−フェネチル基、又は２つのＲ２基が同一の炭素に結合してなるＯ、Ｓ、及びＮから選ばれる０〜２のヘテロ原子を有する８員以下の環を示し、
Ｒ４は、Ｈ、又はＲ３を示し、
Ｒ５は、Ｈ、又は薬学的に許容される塩に対応するカチオンを示し、
Ｒ６、Ｒ７は、Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＯ２、又はＮ３を示す。）
で表されるロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグを提供する。
上記低級アルキル基は炭素数１〜８のアルキル基であり、上記低級アルケニル基は炭素数１〜８のアルケニル基である。
本発明は、構造式：
で表されるロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグを提供する。
本発明は、構造式：
で表されるロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグを提供する。
本発明は、構造式：
で表されるロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグを提供する。
本発明は、構造式：
で表されるロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグを提供する。
本発明は、構造式：
で表されるロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグを提供する。
本発明は、喘息及び／又はアレルギー性鼻炎喘息症候群の治療及び／又は予防及び／又は緩和及び／又は補助治療用の医薬品を製造するための、ロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグの使用を提供する。
本発明は、上記ロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグを含む医薬組成物を提供する。
上記医薬組成物は、薬学的に許容される補助剤をさらに含む。
本発明の有益な効果は、以下の通りである。
本発明に係る一連の化合物は、喘息及び／又はアレルギー性鼻炎喘息症候群の治療及び／又は予防及び／又は緩和及び／又は補助治療用医薬品の製造において良好な見込みがある。
具体的に、本発明に係る一連のシクロプロピル不飽和キノリン化合物は、ＫＭマウス急性毒性試験において、治療量範囲で相対的な安全性、信頼性、非毒性を示す。
イン・ビボ抗喘息薬効評価試験の結果によって、特に異性体化合物は、モルモット喘息モデルにおいて良好な抗喘息効果を有し、同じ用量のモンテルカスト対照群より顕著な効果を示し、高効率・低毒性の抗喘息医薬品の研究開発において見込みのある候補リード化合物であることが明らかになった。
本発明に係る一連の化合物は、喘息及び／又はアレルギー性鼻炎喘息症候群の治療及び／又は予防及び／又は緩和及び／又は補助治療用医薬品の製造において良好な見込みがある。
本発明に係るロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグは、構造式：
で表される。
好ましくは、式中、
Ｒ１、Ｒ２は、Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＯ２、又はＮ３を示し、
Ｒ３は、低級アルキル基、低級アルケニル基、−ＣＦ３、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、ＣＨ２ＣＦ３、置換もしくは非置換のフェニル基、置換もしくは非置換のベンジル基、置換もしくは非置換の２−フェネチル基、又は２つのＲ２基が同一の炭素に結合してなるＯ、Ｓ、及びＮから選ばれる０〜２のヘテロ原子を有する８員以下の環を示し、
Ｒ４は、Ｈ、又はＲ３を示し、
Ｒ５は、Ｈ、又は薬学的に許容される塩に対応するカチオンを示し、
Ｒ６、Ｒ７は、Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＯ２、又はＮ３を示す。
Ｒ１、Ｒ２は、Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＯ２、又はＮ３を示し、
Ｒ３は、低級アルキル基、低級アルケニル基、−ＣＦ３、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、ＣＨ２ＣＦ３、置換もしくは非置換のフェニル基、置換もしくは非置換のベンジル基、置換もしくは非置換の２−フェネチル基、又は２つのＲ２基が同一の炭素に結合してなるＯ、Ｓ、及びＮから選ばれる０〜２のヘテロ原子を有する８員以下の環を示し、
Ｒ４は、Ｈ、又はＲ３を示し、
Ｒ５は、Ｈ、又は薬学的に許容される塩に対応するカチオンを示し、
Ｒ６、Ｒ７は、Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＯ２、又はＮ３を示す。
さらに好ましくは、上記低級アルキル基は炭素数１〜８のアルキル基であり、上記低級アルケニル基は炭素数１〜８のアルケニル基である。
上記化合物における酸性基は、塩基と塩を形成可能であり、このような塩基と形成される塩の例として、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属炭酸水素塩、アルカリ土類金属水酸化物、アルカリ土類金属炭酸塩、アルカリ土類金属炭酸水素塩などの無機塩基と形成した塩と、プロカインなどの有機塩基と形成される塩と、リジンなどの塩基性アミノ酸と形成される塩とを含むが、これらに限定されない。
好ましくは、ロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグは、下記の化合物から選ばれる少なくとも１種である。
上記化合物における塩基性基は、酸と塩を形成可能であり、このような酸と形成される塩の例として、ハロゲン化水素酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸）、硝酸、硫酸、リン酸、炭酸などの無機酸と形成される塩と、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸などの低級アルキル基スルホン酸と形成される塩と、ベンゼンスルホン酸又はｐ−トルエンスルホン酸などのアリールスルホン酸と形成される塩と、酢酸、フマル酸、酒石酸、シュウ酸、クエン酸、マレイン酸、リンゴ酸、又はコハク酸などの有機酸と形成される塩と、アスパラギン酸又はグルタミン酸などのアミノ酸と形成される塩とを含む。
ロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグは、喘息及び／又はアレルギー性鼻炎喘息症候群の治療及び／又は予防及び／又は緩和及び／又は補助治療用の医薬品を製造するために使用される。
本発明に係る医薬組成物は、上記ロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグを含む。
上記医薬組成物は、薬学的に許容される補助剤をさらに含む。
好ましくは、上記補助剤は、溶媒、推進剤、可溶化剤、安定剤、流動促進剤、矯味剤、防腐剤、懸濁化剤、コーティング材、芳香剤、粘着防止剤、キレート剤、透過促進剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、可塑剤、溶解補助剤、乳化剤、着色剤、粘着剤、崩壊剤、充填剤、潤滑剤、湿潤剤、浸透圧調整剤、界面活性剤、発泡剤、消泡剤、増粘剤、包接剤、保湿剤、吸収剤、希釈剤、凝集剤及び凝集防止剤、ろ過助剤、放出阻害剤から選ばれる少なくとも１種を含む。
本発明に係る医薬組成物は、様々な剤形に調製可能であり、剤形の分散系によって分類する場合、具体的に、溶液型、コロイド溶液型、乳剤型、懸濁型、気体分散型、微粒子分散型、固体分散型に調製することができ、形態によって分類する場合、具体的に、液体剤形（例えば、芳香水剤、液剤、注射剤、混合剤、ローション、塗布剤など）、気体剤形（例えば、エアゾール、スプレー剤など）、固体剤形（例えば、散剤、ペレット剤、錠剤、フィルム剤など）、半固体剤形（例えば、軟膏剤、坐剤、ペースト剤など）に調製することができ、投与経路によって分類する場合、具体的に、経口投与剤、非経口投与剤に調製することができる。
本発明に係る化合物の合成経路は、以下の通りである。
以下、具体的な実施例を参照しながら本発明をさらに説明する。
［実施例］
＜実施例１：フラグメント化合物２の合成＞
合成経路：
＜実施例１：フラグメント化合物２の合成＞
合成経路：
（１）化合物２−２の合成
０℃〜５℃で、アセトニトリル（１５０ｍＬ）に溶解されたマロン酸ジエチル（８７ｍｍｏｌ）溶液に、トリエチルアミン（１０４ｍｍｏｌ）、及びアセトニトリル（１００ｍＬ）に溶解されたｐ−トルエンスルホニルアジド（２０．５ｇ、１０４ｍｍｏｌ）溶液をこの順に添加した。添加が完了した後、室温で一晩撹拌した。反応が終了した後、反応液を減圧濃縮し、ジエチルエーテル溶液１００ｍＬをさらに添加した。得られた有機層を１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で順に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧濃縮して化合物２−２（収率１００％）を１７ｇ得た。
1H NMR (CDCl3400 MHz): δ4.30-4.25 (q, J=6, 4H), δ 1.31-1.27 (t, J=6, 6H).
（２）化合物２−３の合成
1H NMR (CDCl3400 MHz): δ4.30-4.25 (q, J=6, 4H), δ 1.31-1.27 (t, J=6, 6H).
（２）化合物２−３の合成
−６０℃で、テトラキス（トリフェニルアセテート）ジロジウム（ＩＩ）（４８ｇ）及び粉末モレキュラーシーブ（７２０ｇ）のジクロルメタン（２０Ｌ）懸濁液に、１−クロロ−１−フルオロエチレン（１４．９ｍｏｌ）を添加した後、反応液を−３５℃〜−４０℃まで昇温させ、化合物２−２（１１．４７ｍｏｌ）のジクロルメタン（４Ｌ）溶液を添加した。添加が完了した後、室温で一晩撹拌した。得られた反応液をろ過し、ろ液を濃縮して黄色油状の粗化合物２−３を２．９Ｋｇ得て、精製せずに次の反応に直接使用した。
（３）化合物２−４の合成
８０℃で、粗化合物２−３（３．３５ｍｏｌ）のＮ−メチルピロリドン（４．５Ｌ）溶液に、ラネーニッケル（３８０ｇ）及びエチレンジアミン（６３２ｇ）を添加し、水素ガスを充填し、一晩反応させた。反応が終了した後、反応液を室温まで冷却し、酢酸エチル（１５Ｌ）を加え、ろ過した。得られたろ液を２Ｎ塩酸水溶液、飽和食塩水で順に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過した。得られたろ液を減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィーによって精製して化合物２−４（収率６５％）を５１８ｇ得た。
1HNMR (CDCl3400 MHz): δ 4.75-4.48 (m, 1H), δ 4.29-4.25(q, J=6, 4H), δ1.77-1.53 (m, 2H),δ 1.33-1.28(t, J=6, 6H).
1HNMR (CDCl3400 MHz): δ 4.75-4.48 (m, 1H), δ 4.29-4.25(q, J=6, 4H), δ1.77-1.53 (m, 2H),δ 1.33-1.28(t, J=6, 6H).
（４）化合物２−５の合成
０℃で、化合物２−４（１０．７ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１５ｍＬ）溶液を、ＬｉＡｌＨ４（３５．４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）懸濁液に徐々に滴下して加えた後、室温で１時間撹拌した。反応が終了した後、水を加えてクエンチした。得られた懸濁液をセライトろ過してろ液を減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィーによって精製して化合物２−５（収率７８％）を１ｇ得た。
1HNMR (CDCl3400 MHz): δ 4.70-4.54 (m, 1H), δ 4.09-2.98 (m, 6H), δ0.95-0.82 (m, 2H).
1HNMR (CDCl3400 MHz): δ 4.70-4.54 (m, 1H), δ 4.09-2.98 (m, 6H), δ0.95-0.82 (m, 2H).
（５）化合物２−６の合成
化合物２−５（２５０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２２５ｍＬ）溶液を１Ｌの反応フラスコに投入し、反応フラスコを減圧蒸留装置に取り付けた。反応温度が７５℃／５０ｔｏｒｒに達するときに、ＤＭＦを２５ｍＬ蒸留した。その後、反応液に亜硫酸ジイソプロピルのトルエン溶液（８１．６ｍＬ、３００ｍｍｏｌ）を加え、５２℃／５５ｔｏｒｒになるときに、トルエンを５０ｍＬ収集した。その後、反応液にナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２Ｍｉｎ ＴＨＦ、２．０ｍＬ）を加え、３５℃／５０ｔｏｒｒの条件で蒸留してフラクションを３０ｍＬ収集した。続いて昇温して７０℃／５０ｔｏｒｒで蒸留し、フラクションを６０ｍＬ収集した。その後、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２Ｍｉｎ ＴＨＦ、１．０ｍＬ）を加え、６０℃〜７５℃／５０ｔｏｒｒの条件で蒸留してフラクションを６０ｍＬ収集した。さらに、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２Ｍ ｉｎＴＨＦ、０．５ｍＬ）を加え、７０℃〜７５℃／５０ｔｏｒｒの条件で蒸留してフラクションを３０ｍＬ収集した後、蒸留を終了させ、反応液を７０℃で１時間撹拌した。その後、室温まで冷却し、後処理を行った後、化合物２−６溶液を得た。
（６）化合物２−７の合成
上記化合物２−６溶液に、シアン化ナトリウム（２７５ｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム（５０ｍｍｏｌ）を加え、７０℃まで昇温した後、１時間撹拌して反応させた。その後、４時間強く撹拌し、続いて７０℃でトルエン（４００ｍＬ）を徐々に添加した後、水（６ｍＬ）を３０分間で徐々に滴下して添加した。添加が完了した後、減圧蒸留し、トルエンを１００ｍＬ蒸留した後、反応液を１０℃まで冷却し、ろ過した。得られたろ過ケーキをトルエン（１００ｍＬ）で洗浄し、ろ液を合わせて濃縮し、カラムクロマトグラフィーによって精製して化合物２−７（２つのステップで収率７４％）を２４ｇ得た。
1H NMR (CDCl3400 MHz): δ 4.67-4.48(m, 1H), δ 3.88-3.33 (m, 2H),δ 2.76-2.34 (m, 2H),δ 1.11-0.91 (m, 2H).
1H NMR (CDCl3400 MHz): δ 4.67-4.48(m, 1H), δ 3.88-3.33 (m, 2H),δ 2.76-2.34 (m, 2H),δ 1.11-0.91 (m, 2H).
（７）化合物２−８の合成
トリフェニルホスフィン（０．２８ｍｏｌ）をアセトニトリル３００ｍＬに溶解させ、−８℃まで冷却し、臭素（０．２７ｍｏｌ）を徐々に滴下して加え、０℃〜５℃で反応液を黄色がなくなるまで撹拌した。温度を１０℃以下に保持しながら化合物２−７（０．２７ｍｏｌ）のアセトニトリル溶液を滴下して添加した。添加が完了した後、反応液を６０℃に加熱して１５分間〜２０分間撹拌した。そして、反応液を−１０℃以下に冷却して１時間保持した後、ろ過した。得られたろ過ケーキを低温アセトニトリル（２×１００ｍＬ）で洗浄し、ろ液を合わせて減圧濃縮した。濃縮物をメチルターシャリーブチルエーテル（１００ｍＬ）に溶解し、−８℃〜−３℃の温度で１時間以上撹拌した後、ろ過した。得られたろ過ケーキを低温メチルターシャリーブチルエーテル（２×１００ｍＬ）で洗浄し、ろ液を合わせて濃縮し、化合物２−８（収率：８７％）を４５ｇ得た。
1H NMR (CDCl3400 MHz): δ 4.69-4.50(m, 1H), δ 3.51-3.24 (m, 2H),δ 2.56-2.37 (m, 2H), δ 1.18-1.01 (m, 2H).
1H NMR (CDCl3400 MHz): δ 4.69-4.50(m, 1H), δ 3.51-3.24 (m, 2H),δ 2.56-2.37 (m, 2H), δ 1.18-1.01 (m, 2H).
（８）化合物２−９の合成
化合物２−８（０．１８７ｍｏｌ）、アセトン（１６５ｍＬ）、及びチオウレア（０．１８９ｍｏｌ）を５００ｍＬの二口フラスコに投入し、反応液を１２時間加熱還流した。そして、反応液を−８℃〜−３℃まで冷却して１時間以上撹拌した後、ろ過した。得られたろ過ケーキを低温アセトン（２×２５ｍＬ）で洗浄した後、さらにアセトン８７ｍＬで５時間スラリー化し、ろ過した。得られたろ過ケーキをさらに低温アセトン（２×２５ｍＬ）で洗浄し、吸引ろ過し、真空乾燥して化合物２−９（収率９０％）を４４ｇ得た。
（９）フラグメント化合物２の合成
窒素ガス雰囲気で、化合物２−９（０．０４ｍｏｌ）及び２０％脱気水酸化ナトリウム溶液（３８．３ｍＬ）を１００ｍＬの三口フラスコに投入し、１４時間加熱還流した。その後、室温まで冷却し、脱気酢酸エチルを加え、続いて−５〜５℃に冷却した後、ｐＨ３．５〜４．０に調整するように８５％ギ酸を加えた。有機相を分離した後、水相を酢酸エチルで抽出し、有機相を合わせて水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮して粗生成物を得た。得られた粗生成物をさらにノルマルヘキサで結晶化させ、フラグメント化合物２（収率７６％）を５ｇ得た。
1H NMR (CDCl3400 MHz): δ 8.87 (br,1H),δ 4.61-4.43 (m, 1H), δ 2.91-2.66 (m, 2H),δ 2.56-2.22 (m, 2H),δ 1.49-1.45(m, 1H),δ 0.99-0.84 (m, 2H).
13CNMR(CDCl3500 MHz): δ 178, δ177;δ 77, δ76;δ 36, δ 33;δ 29, δ 26; δ24, δ23; δ 18, δ 16.
19FNMR(CDCl3470 MHz): δ -214;δ -219.
1H NMR (CDCl3400 MHz): δ 8.87 (br,1H),δ 4.61-4.43 (m, 1H), δ 2.91-2.66 (m, 2H),δ 2.56-2.22 (m, 2H),δ 1.49-1.45(m, 1H),δ 0.99-0.84 (m, 2H).
13CNMR(CDCl3500 MHz): δ 178, δ177;δ 77, δ76;δ 36, δ 33;δ 29, δ 26; δ24, δ23; δ 18, δ 16.
19FNMR(CDCl3470 MHz): δ -214;δ -219.
＜実施例２：化合物４の合成＞
合成経路：
合成経路：
（１）化合物３の合成
（２−フルオロ−シクロプロピル）−１−メルカプトメチル酢酸（３３ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（９８ｍｍｏｌ）、及びポリグリコール−４００（１０ｇ）をフラスコに投入し、ＤＭＦ（５０ｍＬ）を加えて室温で１時間撹拌した。反応液を−１５℃まで冷却し、化合物１（３３ｍｏｌ）のＴＨＦ（４５ｍＬ）溶液を滴下して添加した。添加が完了した後、反応液を室温まで昇温して８時間撹拌した。１Ｍ塩酸溶液（１００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。得られた有機相を合わせて飽和食塩水で洗浄し、乾燥、濃縮して粗生成物を得た。得られた粗生成物を酢酸エチル／石油エーテルで結晶化させ、黄色固体化合物３（収率８０％）を１６ｇ得た。
1H NMR (CDCl3400 MHz): δ 8.09-8.06(m,2H),δ 7.75-7.48 (m,4H),δ 7.45-7.31 (m,6H),δ 7.16-7.11 (m,3H),δ 5.20 (br,1H),δ 4.61-4.36 (m, 1H), δ 4.01-3.98 (m, 1H),δ 3.23-3.02 (m, 1H),δ 2.94-2.51(m, 4H),δ 2.35-2.08 (m, 4H),δ 1.62-1.61 (d, 6H),δ 0.93-0.86 (m, 2H).
MS: [M+H], 605.2.
（２−フルオロ−シクロプロピル）−１−メルカプトメチル酢酸（３３ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（９８ｍｍｏｌ）、及びポリグリコール−４００（１０ｇ）をフラスコに投入し、ＤＭＦ（５０ｍＬ）を加えて室温で１時間撹拌した。反応液を−１５℃まで冷却し、化合物１（３３ｍｏｌ）のＴＨＦ（４５ｍＬ）溶液を滴下して添加した。添加が完了した後、反応液を室温まで昇温して８時間撹拌した。１Ｍ塩酸溶液（１００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。得られた有機相を合わせて飽和食塩水で洗浄し、乾燥、濃縮して粗生成物を得た。得られた粗生成物を酢酸エチル／石油エーテルで結晶化させ、黄色固体化合物３（収率８０％）を１６ｇ得た。
1H NMR (CDCl3400 MHz): δ 8.09-8.06(m,2H),δ 7.75-7.48 (m,4H),δ 7.45-7.31 (m,6H),δ 7.16-7.11 (m,3H),δ 5.20 (br,1H),δ 4.61-4.36 (m, 1H), δ 4.01-3.98 (m, 1H),δ 3.23-3.02 (m, 1H),δ 2.94-2.51(m, 4H),δ 2.35-2.08 (m, 4H),δ 1.62-1.61 (d, 6H),δ 0.93-0.86 (m, 2H).
MS: [M+H], 605.2.
（２）化合物３のキラル分離
キラルカラム分離によって、化合物３−１（ｃｉｓ）及び化合物３−２（ｔｒａｎｓ）を得た。
化合物３−１（ｃｉｓ）:
1H NMR (CDCl3400 MHz): δ 8.08-8.04 (m,2H),δ 7.75-7.47 (m,4H),δ7.45-7.32 (m,6H),δ 7.17-7.11 (m,3H),δ 4.84 (br, 1H),δ 4.52-4.27 (m, 1H), δ 4.01-3.93(m, 1H),δ 3.19-3.14 (m, 1H),δ 2.93-2.52 (m, 4H),δ 2.38-2.18 (m, 4H),δ 1.61-1.60(d, 6H),δ 0.98-0.76 (m, 2H).
19F NMR(CDCl3470 MHz): δ -216.
1H NMR (CDCl3400 MHz): δ 8.08-8.04 (m,2H),δ 7.75-7.47 (m,4H),δ7.45-7.32 (m,6H),δ 7.17-7.11 (m,3H),δ 4.84 (br, 1H),δ 4.52-4.27 (m, 1H), δ 4.01-3.93(m, 1H),δ 3.19-3.14 (m, 1H),δ 2.93-2.52 (m, 4H),δ 2.38-2.18 (m, 4H),δ 1.61-1.60(d, 6H),δ 0.98-0.76 (m, 2H).
19F NMR(CDCl3470 MHz): δ -216.
化合物３−２（ｔｒａｎｓ）:
1H NMR (CDCl3400 MHz):1H NMR (CDCl3400 MHz): δ 8.07-8.04(m,2H),δ 7.76-7.47 (m,4H),δ 7.45-7.33 (m,6H),δ 7.17-7.10 (m,3H),δ 4.63 (br,1H),δ 4.74-4.36 (m, 1H), δ 4.07-3.99 (m, 1H),δ 3.24-3.13 (m, 1H),δ 2.94-2.53(m, 4H),δ 2.39-2.18 (m, 4H),δ 1.62-1.60 (d, 6H),δ 0.93-0.81 (m, 2H).
19FNMR(CDCl3470 MHz): δ -217.
1H NMR (CDCl3400 MHz):1H NMR (CDCl3400 MHz): δ 8.07-8.04(m,2H),δ 7.76-7.47 (m,4H),δ 7.45-7.33 (m,6H),δ 7.17-7.10 (m,3H),δ 4.63 (br,1H),δ 4.74-4.36 (m, 1H), δ 4.07-3.99 (m, 1H),δ 3.24-3.13 (m, 1H),δ 2.94-2.53(m, 4H),δ 2.39-2.18 (m, 4H),δ 1.62-1.60 (d, 6H),δ 0.93-0.81 (m, 2H).
19FNMR(CDCl3470 MHz): δ -217.
（３）化合物４の合成
室温でＮａＯＨ（８．７ｍｏｌ）をメタノール（３０ｍＬ）に溶解した後、得られた塩基性溶液を化合物３（８．５ｍｏｌ）のメタノール（３２ｍＬ）溶液に加え、３０分間撹拌した。その後、適量の活性炭を加え、３０分間撹拌した。セライトでろ過し、ろ液を回転蒸発させ、真空乾燥して化合物４（収率９０％）を得た。
1H NMR (CDCl3400 MHz): δ 8.03-8.00 (m,2H),δ 7.67-7.55 (m,4H),δ7.43-7.33 (m,6H),δ 7.09-7.02 (m,3H),δ 4.58-4.31 (m, 1H), δ 4.00-3.93 (m, 1H),δ3.28-3.16 (m, 1H),δ 2.86-2.53 (m, 4H),δ 2.23-2.09 (m, 4H),δ 1.59-1.55 (d, 6H),δ0.70-0.53 (m, 2H).
MS: [M+H], 605.2.
1H NMR (CDCl3400 MHz): δ 8.03-8.00 (m,2H),δ 7.67-7.55 (m,4H),δ7.43-7.33 (m,6H),δ 7.09-7.02 (m,3H),δ 4.58-4.31 (m, 1H), δ 4.00-3.93 (m, 1H),δ3.28-3.16 (m, 1H),δ 2.86-2.53 (m, 4H),δ 2.23-2.09 (m, 4H),δ 1.59-1.55 (d, 6H),δ0.70-0.53 (m, 2H).
MS: [M+H], 605.2.
（２）化合物４のキラル分離
化合物４をキラルカラムによって分離させ、下記の４つの異なる絶対配置の化合物を得た。
化合物４をキラルカラムによって分離させ、下記の４つの異なる絶対配置の化合物を得た。
キラルカラム分離によって、ｃｉｓ化合物の１対のエナンチオマー、すなわち、２．４ｇの化合物４−１及び２．２ｇの化合物４−２をそれぞれ得た。
化合物４−１（ＣＳ−００９０−１）：
LC-MS:4.758 min, 96.7%; [M+H], 605.2.
SFC: 4.56 min, de value 97.79%.
化合物４−２（ＣＳ−００９０−２）：
LC-MS:4.758 min, 99.1%; [M+H], 605.2.
SFC: 6.36 min, de value 100%.
1HNMR (CDCl3400 MHz): δ 8.06-8.04 (m,2H),δ7.69-7.57 (m,4H),δ 7.46-7.33 (m,6H),δ 7.18-7.08 (m,3H),δ4.41-4.24 (m, 1H), δ 3.97-3.93 (m, 1H),δ3.23-3.16 (m, 1H),δ 2.90-2.45 (m, 4H),δ2.24-2.15 (m, 4H),δ 1.61-1.59 (d, 6H),δ0.93-0.68 (m, 2H).
13C NMR(CDCl3500 MHz):δ 176.3, δ 156.8, δ148.1, δ145.2,δ 143.4, δ143.2, δ140.1,δ136.5, δ136.4,δ135.7, δ 135.3, δ 131.5,δ129.1, δ128.7, δ128.5,δ127.6, δ127.2,δ127.1, δ126.7, δ126.4, δ 125.7,δ125.6, δ125.4, δ119.2, δ75.4, δ73.7,δ50.3, δ 39.8,δ 36.1, δ34.5, δ32.3,δ31.8, δ 31.7, δ21.4, δ 17.8.
19FNMR(CDCl3470 MHz): δ -215.
キラルカラム分離によって、ｔｒａｎｓ化合物のラセミ体（化合物４−３と化合物４−４（１：１）とはキラルカラムによって分離できない）を３０ｇ得た。
LC-MS:4.758 min, 96.7%; [M+H], 605.2.
SFC: 4.56 min, de value 97.79%.
化合物４−２（ＣＳ−００９０−２）：
LC-MS:4.758 min, 99.1%; [M+H], 605.2.
SFC: 6.36 min, de value 100%.
1HNMR (CDCl3400 MHz): δ 8.06-8.04 (m,2H),δ7.69-7.57 (m,4H),δ 7.46-7.33 (m,6H),δ 7.18-7.08 (m,3H),δ4.41-4.24 (m, 1H), δ 3.97-3.93 (m, 1H),δ3.23-3.16 (m, 1H),δ 2.90-2.45 (m, 4H),δ2.24-2.15 (m, 4H),δ 1.61-1.59 (d, 6H),δ0.93-0.68 (m, 2H).
13C NMR(CDCl3500 MHz):δ 176.3, δ 156.8, δ148.1, δ145.2,δ 143.4, δ143.2, δ140.1,δ136.5, δ136.4,δ135.7, δ 135.3, δ 131.5,δ129.1, δ128.7, δ128.5,δ127.6, δ127.2,δ127.1, δ126.7, δ126.4, δ 125.7,δ125.6, δ125.4, δ119.2, δ75.4, δ73.7,δ50.3, δ 39.8,δ 36.1, δ34.5, δ32.3,δ31.8, δ 31.7, δ21.4, δ 17.8.
19FNMR(CDCl3470 MHz): δ -215.
キラルカラム分離によって、ｔｒａｎｓ化合物のラセミ体（化合物４−３と化合物４−４（１：１）とはキラルカラムによって分離できない）を３０ｇ得た。
化合物４−４（ＣＳ−００９０−４）：
LC-MS:9.322 min, 99.1%; [M+H], 605.2.
HPLC: 8.689 min, 99.1%.
1H NMR (CDCl3400 MHz): δ 8.07-8.04(m,2H),δ 7.76-7.55 (m,4H),δ 7.47-7.33 (m,6H),δ 7.17-7.10 (m,3H),δ 4.63-4.36 (m,1H), δ 4.06-4.01 (m, 1H),δ 3.19-3.16 (m, 1H),δ 2.91-2.37 (m, 4H),δ 2.26-2.22(m, 4H),δ 1.62-1.57 (d, 6H),δ 0.93-0.81 (m, 2H).
13CNMR(CDCl3500 MHz): δ 174.7, δ 156.9, δ 147.8, δ 145.1, δ 143.6, δ143.4, δ 140.1, δ 136.5, δ 136.3, δ 135.8, δ 135.7, δ 131.5, δ 129.1, δ 128.7,δ 128.6, δ 127.4, δ 127.2, δ 127.1, δ 126.7, δ 126.4, δ 125.6, δ 125.5, δ125.4, δ 119.1,δ76.7, δ 73.8,δ50.5, δ 39.9,δ 38.1, δ32.8, δ32.2,δ31.8, δ31.6,δ21.9, δ 18.4.
19FNMR(CDCl3470 MHz): δ -216.
LC-MS:9.322 min, 99.1%; [M+H], 605.2.
HPLC: 8.689 min, 99.1%.
1H NMR (CDCl3400 MHz): δ 8.07-8.04(m,2H),δ 7.76-7.55 (m,4H),δ 7.47-7.33 (m,6H),δ 7.17-7.10 (m,3H),δ 4.63-4.36 (m,1H), δ 4.06-4.01 (m, 1H),δ 3.19-3.16 (m, 1H),δ 2.91-2.37 (m, 4H),δ 2.26-2.22(m, 4H),δ 1.62-1.57 (d, 6H),δ 0.93-0.81 (m, 2H).
13CNMR(CDCl3500 MHz): δ 174.7, δ 156.9, δ 147.8, δ 145.1, δ 143.6, δ143.4, δ 140.1, δ 136.5, δ 136.3, δ 135.8, δ 135.7, δ 131.5, δ 129.1, δ 128.7,δ 128.6, δ 127.4, δ 127.2, δ 127.1, δ 126.7, δ 126.4, δ 125.6, δ 125.5, δ125.4, δ 119.1,δ76.7, δ 73.8,δ50.5, δ 39.9,δ 38.1, δ32.8, δ32.2,δ31.8, δ31.6,δ21.9, δ 18.4.
19FNMR(CDCl3470 MHz): δ -216.
［試験部分］
＜ロイコトリエン受容体拮抗薬ＣＳ−００９０シリーズ化合物の抗喘息薬効学実験＞
−第一部分：マウス急性毒性試験−
（１）機器及び材料
（１．１）実験動物
（１．１．１）品種及びグレード
ＫＭマウス、通常グレード（conventional animal）。
（１．１．２）数量及び性別
４０匹、雌雄半々。
（１．１．３）体重
購入時にマウスの体重は１８〜２２ｇである。
（１．１．４）提供者
Guangzhou University of Chinese Medicine Laboratory Animal Center。
（１．１．５）識別方法
被毛染色法を利用する。飽和ピクリン酸を用いてマウスに番号を付け、異なる番号を示すようにマウス体表における異なる部位の被毛をスポットに染色した。マウス皮膚染色及びケージで二重番号を付けて標識した。
＜ロイコトリエン受容体拮抗薬ＣＳ−００９０シリーズ化合物の抗喘息薬効学実験＞
−第一部分：マウス急性毒性試験−
（１）機器及び材料
（１．１）実験動物
（１．１．１）品種及びグレード
ＫＭマウス、通常グレード（conventional animal）。
（１．１．２）数量及び性別
４０匹、雌雄半々。
（１．１．３）体重
購入時にマウスの体重は１８〜２２ｇである。
（１．１．４）提供者
Guangzhou University of Chinese Medicine Laboratory Animal Center。
（１．１．５）識別方法
被毛染色法を利用する。飽和ピクリン酸を用いてマウスに番号を付け、異なる番号を示すようにマウス体表における異なる部位の被毛をスポットに染色した。マウス皮膚染色及びケージで二重番号を付けて標識した。
（１．１．６）飼育管理
通常グレードの動物舎で動物を飼育する。
実験動物使用許可証番号：ＳＣＸＫ（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ）２０１３−００２０
動物飼育条件：１０匹／ケージ、群飼育、飼育温度２０℃〜２５℃、飼育湿度４０％〜７０％
１０時間：１４時間の昼夜間隔照明を利用し、試験期間において動物を自由に摂食・飲水させた。試験結果の信頼性を保証するために、飼育室の条件を安定に維持した。
通常グレードの動物舎で動物を飼育する。
実験動物使用許可証番号：ＳＣＸＫ（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ）２０１３−００２０
動物飼育条件：１０匹／ケージ、群飼育、飼育温度２０℃〜２５℃、飼育湿度４０％〜７０％
１０時間：１４時間の昼夜間隔照明を利用し、試験期間において動物を自由に摂食・飲水させた。試験結果の信頼性を保証するために、飼育室の条件を安定に維持した。
（１．１．７）検疫
購入したマウスに対して７日間の検疫を行った。検疫期間において動物を１日１回検査し、不健康な動物があれば即時に取り除き、健康な動物を選んで実験を行った。
購入したマウスに対して７日間の検疫を行った。検疫期間において動物を１日１回検査し、不健康な動物があれば即時に取り除き、健康な動物を選んで実験を行った。
（１．２）主要な試薬
無水エタノール（Tianjin Damao Chemical Reagent Factory）
ツイン−８０（Jiangsu Haian Petroleum Chemical Factory）
脱イオン水（Guangdong Pharmaceutical University, College ofPharmacy、実験室で調製）
ピクリン酸（Beijing Xinding Pengfei Technology Development Co.,Ltd.）
ホルマリン溶液（Tianjin Damao Chemical Reagent Factory）
生理食塩水（Guangdong Pharmaceutical University, College ofPharmacy、実験室で調製）
モンテルカスト（Chem-Stone Co., Ltd.）
ＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４（Chem-Stone Co., Ltd.製、Ｌｏｔ Ｎｏ：２０１４１０１２）。
無水エタノール（Tianjin Damao Chemical Reagent Factory）
ツイン−８０（Jiangsu Haian Petroleum Chemical Factory）
脱イオン水（Guangdong Pharmaceutical University, College ofPharmacy、実験室で調製）
ピクリン酸（Beijing Xinding Pengfei Technology Development Co.,Ltd.）
ホルマリン溶液（Tianjin Damao Chemical Reagent Factory）
生理食塩水（Guangdong Pharmaceutical University, College ofPharmacy、実験室で調製）
モンテルカスト（Chem-Stone Co., Ltd.）
ＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４（Chem-Stone Co., Ltd.製、Ｌｏｔ Ｎｏ：２０１４１０１２）。
（１．３）主要な機器及び材料
１０万分の１電子天びん（島津製作所、品番ＡＵＷ１２０Ｄ）
電子天びん（島津製作所、品番ＡＵＹ１２０）
Ｖ７ボルテックスミキサ（V7 Vortex Mixer、米国Essenscien社）
電熱恒温水槽（Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd.、品番ＤＫ−８Ｄ）
１ｍＬディスポーサブル無菌注射器（米国Becton,Dickinson and Company）。
１０万分の１電子天びん（島津製作所、品番ＡＵＷ１２０Ｄ）
電子天びん（島津製作所、品番ＡＵＹ１２０）
Ｖ７ボルテックスミキサ（V7 Vortex Mixer、米国Essenscien社）
電熱恒温水槽（Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd.、品番ＤＫ−８Ｄ）
１ｍＬディスポーサブル無菌注射器（米国Becton,Dickinson and Company）。
（２）実験方法
（２．１）用量設計及び群分け
（２．１．１）用量設計
（２．１．１．１）モンテルカスト
１０ｍｇ／日のモンテルカスト人体推薦量に基づいて、標準人６０ｋｇで換算すると、マウス等価用量は１．５２ｍｇ・ｋｇ−１・ｄ−１である。等価用量の１５００倍、すなわち２２８０ｍｇ・ｋｇ−１・ｄ−１を投与量とする。具体的な投与レジメンは、７６０ｍｇ・ｋｇ−１、０．０１ｍｌ／ｇ、３回／日である。
（２．１．１．２）ＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４
結果を対照するために、ＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４の投与レジメンは、モンテルカストと同様に設定される。
（２．１．２）動物の群分け
適応期間が終了した後、動物を体重によって１０匹／群で無作為に、陽性薬雄性対照群、陽性薬雌性対照群、ＣＳ−００９０−１雄実験群、及びＣＳ−００９０−１雌性実験群の４群に分けた。
（２．１）用量設計及び群分け
（２．１．１）用量設計
（２．１．１．１）モンテルカスト
１０ｍｇ／日のモンテルカスト人体推薦量に基づいて、標準人６０ｋｇで換算すると、マウス等価用量は１．５２ｍｇ・ｋｇ−１・ｄ−１である。等価用量の１５００倍、すなわち２２８０ｍｇ・ｋｇ−１・ｄ−１を投与量とする。具体的な投与レジメンは、７６０ｍｇ・ｋｇ−１、０．０１ｍｌ／ｇ、３回／日である。
（２．１．１．２）ＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４
結果を対照するために、ＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４の投与レジメンは、モンテルカストと同様に設定される。
（２．１．２）動物の群分け
適応期間が終了した後、動物を体重によって１０匹／群で無作為に、陽性薬雄性対照群、陽性薬雌性対照群、ＣＳ−００９０−１雄実験群、及びＣＳ−００９０−１雌性実験群の４群に分けた。
（２．２）ＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４のＫＭマウスに対する急性毒性作用
（２．２．１）薬剤の調製方法
（２．２．１．１）モンテルカスト
一定量のモンテルカストに、濃度０．２％になるように適量のツイン−８０を、濃度１０％になるように適量の無水エタノールを加え、ボルテックスミキサで完全に溶解させた後、適量の脱イオン水を加え、濃度７６ｍｇ／ｍＬの薬液に調製して即時に使用する。
（２．２．１．２）ＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４
一定量のＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４に、濃度０．２％になるように適量ツイン−８０を、濃度１０％になるように適量の無水エタノールを加え、ボルテックスミキサで完全に溶解させた後、適量の脱イオン水を加え、濃度７６ｍｇ／ｍＬの薬液に調製して即時に使用する。
（２．２．１）薬剤の調製方法
（２．２．１．１）モンテルカスト
一定量のモンテルカストに、濃度０．２％になるように適量のツイン−８０を、濃度１０％になるように適量の無水エタノールを加え、ボルテックスミキサで完全に溶解させた後、適量の脱イオン水を加え、濃度７６ｍｇ／ｍＬの薬液に調製して即時に使用する。
（２．２．１．２）ＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４
一定量のＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４に、濃度０．２％になるように適量ツイン−８０を、濃度１０％になるように適量の無水エタノールを加え、ボルテックスミキサで完全に溶解させた後、適量の脱イオン水を加え、濃度７６ｍｇ／ｍＬの薬液に調製して即時に使用する。
（２．２．２）試験方法
適応期間が終了した後、動物を体重によって１０匹／群で無作為に、陽性薬雄性対照群、陽性薬雌性対照群、被験薬雄性実験群、被験薬雌性実験群の４群に分けた。投与前に各群のマウスを絶水させずに１２時間絶食させ、各群の動物に０．０１ｍｌ／ｇ体重で対応する治療薬物を３回／日で１日間経胃投与した。８日目で解剖して肺臓及び気管支を摘出し、ホルマリン溶液により安定化して保存した。
適応期間が終了した後、動物を体重によって１０匹／群で無作為に、陽性薬雄性対照群、陽性薬雌性対照群、被験薬雄性実験群、被験薬雌性実験群の４群に分けた。投与前に各群のマウスを絶水させずに１２時間絶食させ、各群の動物に０．０１ｍｌ／ｇ体重で対応する治療薬物を３回／日で１日間経胃投与した。８日目で解剖して肺臓及び気管支を摘出し、ホルマリン溶液により安定化して保存した。
（２．２．３）測定指標
（２．２．３．１）日常観察
投与後最初の３０分間以内に、少なくとも各動物を１回観察し、投与後２４時間以内に定時に観察し（観察の時間間隔は中毒反応、発症時間及び回復周期の長さに依存し、投与後４時間以内に特に注意すべきである）、その後、毎日１回、合計７日間観察した。投与過程及び観察期間における動物の中毒及び死亡状況を観察して記録した。
（２．２．３．２）中毒継続症状の観察
動物に中毒兆候の発生が続いた場合、追加の観察を行う必要がある。観察対象は、皮膚及び毛皮、眼及び粘膜、呼吸、循環、自律神経核中枢神経系、肢体活動、及び行動パターンの変更を含む。振戦、痙攣、流涎、下痢、嗜眠、及び意識不明の観察に注目すべきである。げっ歯類動物の中毒症状の観察項目は表１に示される。
（２．２．３．１）日常観察
投与後最初の３０分間以内に、少なくとも各動物を１回観察し、投与後２４時間以内に定時に観察し（観察の時間間隔は中毒反応、発症時間及び回復周期の長さに依存し、投与後４時間以内に特に注意すべきである）、その後、毎日１回、合計７日間観察した。投与過程及び観察期間における動物の中毒及び死亡状況を観察して記録した。
（２．２．３．２）中毒継続症状の観察
動物に中毒兆候の発生が続いた場合、追加の観察を行う必要がある。観察対象は、皮膚及び毛皮、眼及び粘膜、呼吸、循環、自律神経核中枢神経系、肢体活動、及び行動パターンの変更を含む。振戦、痙攣、流涎、下痢、嗜眠、及び意識不明の観察に注目すべきである。げっ歯類動物の中毒症状の観察項目は表１に示される。
（２．２．３．３）解剖
観察期間における死亡動物の死体を解剖した。観察期間が終了した後、生存マウスを頸椎脱臼により殺処分し、死体を解剖した。各動物の肺臓及び気管支の病理学的変化を記録し、観察された病変臓器に対して組織病理学的検査を行った。
観察期間における死亡動物の死体を解剖した。観察期間が終了した後、生存マウスを頸椎脱臼により殺処分し、死体を解剖した。各動物の肺臓及び気管支の病理学的変化を記録し、観察された病変臓器に対して組織病理学的検査を行った。
（３）結果
陽性薬であるモンテルカストの人体推薦投与量１０ｍｇ／日に基づいてマウス投与量を換算して被験薬物ＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４の初期投与量（１．５２ｍｇ・ｋｇ−１）とする。予備実験によって、５００倍の初期投与量（７６０ｍｇ・ｋｇ−１）でこれらの被験薬物をマウスに経胃投与しても、実験群マウスを１００％死亡（ＬＤ１００）させないことが分かった。ＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４の水に対する溶解度が低いので、投与剤形が懸濁剤に限定される一方、投与濃度をさらに増加すれば薬物が溶媒と比較的安定なシステムを形成することがいっそう難しくなり、経胃投与の投与量が不正確になり、ひいては実験でＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４のＬＤ５０を測定できないため、ＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４のマウスに対する最大投与量の測定に限定される。
陽性薬であるモンテルカストの人体推薦投与量１０ｍｇ／日に基づいてマウス投与量を換算して被験薬物ＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４の初期投与量（１．５２ｍｇ・ｋｇ−１）とする。予備実験によって、５００倍の初期投与量（７６０ｍｇ・ｋｇ−１）でこれらの被験薬物をマウスに経胃投与しても、実験群マウスを１００％死亡（ＬＤ１００）させないことが分かった。ＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４の水に対する溶解度が低いので、投与剤形が懸濁剤に限定される一方、投与濃度をさらに増加すれば薬物が溶媒と比較的安定なシステムを形成することがいっそう難しくなり、経胃投与の投与量が不正確になり、ひいては実験でＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４のＬＤ５０を測定できないため、ＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４のマウスに対する最大投与量の測定に限定される。
Chem-Stone Co., Ltd.が提供したモンテルカストのＫＭマウスに対する急性毒性作用試験において、陽性薬雌性群において２日目に死亡した１匹のマウス以外に、残りのマウスは生存し、摂食、活動・行動、排尿・排便が正常であり、特別な分泌物がなく、例えば活動減少、静止無動、驚かせた後の酔いのような挙動などの神経系毒性反応の症状がなく、８日目で解剖した後の観察により各マウスの肺臓及び気管支が正常であることを示した。個体差現象の存在を考慮して、モンテルカストの最大投与量は７６０ｍｇ・ｋｇ−１*３＝２２８０ｍｇ・ｋｇ−１であることが認められる。
Chem-Stone Co., Ltd.が提供したＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４のＫＭマウスに対する急性毒性作用試験において、すべてのマウスは生存し、摂食、活動・行動、排尿・排便が正常であり、特別な分泌物がなく、例えば活動減少、静止無動、驚かせた後の酔いのような挙動などの神経系毒性反応の症状がなく、８日目で解剖した後の観察により各マウスの肺臓及び気管支が正常であることを示した。ＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−３の最大投与量は、同様にそれぞれ７６０ｍｇ・ｋｇ−１*３＝２２８０ｍｇ・ｋｇ−１、７６３ｍｇ・ｋｇ−１*３＝２２８９ｍｇ・ｋｇ−１、７５４ｍｇ・ｋｇ−１*３＝２２６２ｍｇ・ｋｇ−１であることが認められる。これにより、ＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４は、治療量範囲で相対的な安全性、信頼性、非毒性を示すことが分かった。
−第二部分：化合物ＣＳ−００９０−１のイン・ビボ抗喘息薬効評価試験−
（１）機器及び材料
（１．１）実験動物
（１．１．１）品種及びグレード
モルモット、通常グレード。
（１．１．２）数量及び性別
２４匹、雄性。
（１．１．３）体重
購入時にモルモットの体重は１８０ｇ〜２２０ｇである。
（１．１．４）提供者
Guangzhou University of Chinese MedicineLaboratory Animal Center。
（１．１．５）識別方法
被毛染色法を利用する。飽和ピクリン酸を用いてモルモットに番号を付け、異なる番号を示すようにモルモット体表における異なる部位の被毛をスポットに染色した。モルモット皮膚染色及びケージで二重番号を付けて標識した。
（１．１．６）飼育管理：
通常グレードの動物舎で動物を飼育する。
実験動物使用許可証番号：ＳＣＸＫ（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ）２０１３−００２０
動物飼育条件：６匹／ケージ、群飼育、飼育温度２０〜２５℃、飼育湿度４０〜７０％
１０時間：１４時間の昼夜間隔照明を利用し、試験期間において動物を自由に摂食・飲水させた。試験結果の信頼性を保証するために、飼育室の条件を安定に維持した。
（１．１．７）検疫
購入したモルモットに対して３日間の検疫を行った。検疫期間において動物を１日１回検査し、不健康な動物がいれば即時に取り除き、健康な動物を選んで実験を行った。
（１）機器及び材料
（１．１）実験動物
（１．１．１）品種及びグレード
モルモット、通常グレード。
（１．１．２）数量及び性別
２４匹、雄性。
（１．１．３）体重
購入時にモルモットの体重は１８０ｇ〜２２０ｇである。
（１．１．４）提供者
Guangzhou University of Chinese MedicineLaboratory Animal Center。
（１．１．５）識別方法
被毛染色法を利用する。飽和ピクリン酸を用いてモルモットに番号を付け、異なる番号を示すようにモルモット体表における異なる部位の被毛をスポットに染色した。モルモット皮膚染色及びケージで二重番号を付けて標識した。
（１．１．６）飼育管理：
通常グレードの動物舎で動物を飼育する。
実験動物使用許可証番号：ＳＣＸＫ（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ）２０１３−００２０
動物飼育条件：６匹／ケージ、群飼育、飼育温度２０〜２５℃、飼育湿度４０〜７０％
１０時間：１４時間の昼夜間隔照明を利用し、試験期間において動物を自由に摂食・飲水させた。試験結果の信頼性を保証するために、飼育室の条件を安定に維持した。
（１．１．７）検疫
購入したモルモットに対して３日間の検疫を行った。検疫期間において動物を１日１回検査し、不健康な動物がいれば即時に取り除き、健康な動物を選んで実験を行った。
（１．２）主要な試薬
塩化アセチルコリン（Shanghai SSS Reagent Co.,Ltd.）
ヒスタミン（Beijing Bode Luyuan Biotech Co.,Ltd.）
無水エタノール（Tianjin Damao Chemical Reagent Factory）
ツイン−８０（Jiangsu Haian Petroleum Chemical Factory）
ピクリン酸（Beijing Xinding Pengfei Technology Development Co.,Ltd.）
脱イオン水（Guangdong Pharmaceutical University, College ofPharmacy、実験室で調製）
モンテルカスト（Chem-Stone Co., Ltd.）
ＣＳ−００９０−１（Chem-Stone Co., Ltd.）。
塩化アセチルコリン（Shanghai SSS Reagent Co.,Ltd.）
ヒスタミン（Beijing Bode Luyuan Biotech Co.,Ltd.）
無水エタノール（Tianjin Damao Chemical Reagent Factory）
ツイン−８０（Jiangsu Haian Petroleum Chemical Factory）
ピクリン酸（Beijing Xinding Pengfei Technology Development Co.,Ltd.）
脱イオン水（Guangdong Pharmaceutical University, College ofPharmacy、実験室で調製）
モンテルカスト（Chem-Stone Co., Ltd.）
ＣＳ−００９０−１（Chem-Stone Co., Ltd.）。
（１．３）主要機器及び材料
Ｖ７ボルテックスミキサ（米国Essenscien社）
電熱恒温水槽（Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd.、品番ＤＫ−８Ｄ）
ＹＵＹＵＥ４０２ＡＩ超音波噴霧器（Jiangsu Yuyue Medical Equipment &Supply Co. Ltd.）
電子天びん（島津製作所、品番ＡＵＹ１２０）
１０万分の１電子天びん（島津製作所、品番ＡＵＷ１２０Ｄ）
１ｍＬディスポーサブル無菌注射器（米国Becton,Dickinson and Company）。
Ｖ７ボルテックスミキサ（米国Essenscien社）
電熱恒温水槽（Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd.、品番ＤＫ−８Ｄ）
ＹＵＹＵＥ４０２ＡＩ超音波噴霧器（Jiangsu Yuyue Medical Equipment &Supply Co. Ltd.）
電子天びん（島津製作所、品番ＡＵＹ１２０）
１０万分の１電子天びん（島津製作所、品番ＡＵＷ１２０Ｄ）
１ｍＬディスポーサブル無菌注射器（米国Becton,Dickinson and Company）。
（２）実験方法
（２．１）モルモット喘息モデルの製作
０．１％ヒスタミンと２％アセチルコリンとの混合溶液の噴霧による喘息誘発法を使用する。１８０ｇ〜２２０ｇの健康な雄性モルモットを、実験の前日に自製の密封容器（２Ｌ）内に置き、超音波噴霧で０．１％ヒスタミンと２％アセチルコリンとの混合溶液を吸入させた。最大噴霧量に調節し、モルモットに咳症状が出るまで噴霧を継続し、モルモットの噴霧吸入開始から痙攣、転倒発生までの時間（すなわち、喘息誘発潜伏期）を観察した。喘息誘発潜伏期が１２０秒以内のモルモットを合格した敏感な動物として選別し、群分け及び投与用の動物とする。
（２．１）モルモット喘息モデルの製作
０．１％ヒスタミンと２％アセチルコリンとの混合溶液の噴霧による喘息誘発法を使用する。１８０ｇ〜２２０ｇの健康な雄性モルモットを、実験の前日に自製の密封容器（２Ｌ）内に置き、超音波噴霧で０．１％ヒスタミンと２％アセチルコリンとの混合溶液を吸入させた。最大噴霧量に調節し、モルモットに咳症状が出るまで噴霧を継続し、モルモットの噴霧吸入開始から痙攣、転倒発生までの時間（すなわち、喘息誘発潜伏期）を観察した。喘息誘発潜伏期が１２０秒以内のモルモットを合格した敏感な動物として選別し、群分け及び投与用の動物とする。
（２．２）用量設計及び群分け
（２．２．１）用量設計
（２．２．１．１）モンテルカスト
１０ｍｇ／日のモンテルカスト人体推薦量に基づいて、標準人６０ｋｇで換算すると、モルモット等価用量は１ｍｇ・ｋｇ−１・ｄ−１である。等価用量の３倍、すなわち３ｍｇ・ｋｇ−１・ｄ−１を投与量とする。
（２．２．１．２）ＣＳ−００９０−１
モンテルカスト等価用量の１倍、すなわち１ｍｇ・ｋｇ−１・ｄ−１をＣＳ−００９０−１の低用量とし、モンテルカスト等価用量の３倍、すなわち３ｍｇ・ｋｇ−１・ｄ−１をＣＳ−００９０−１の中用量とし、モンテルカスト等価用量の９倍、すなわち９ｍｇ・ｋｇ−１・ｄ−１をＣＳ−００９０−１の高用量とする。
（２．２．１）用量設計
（２．２．１．１）モンテルカスト
１０ｍｇ／日のモンテルカスト人体推薦量に基づいて、標準人６０ｋｇで換算すると、モルモット等価用量は１ｍｇ・ｋｇ−１・ｄ−１である。等価用量の３倍、すなわち３ｍｇ・ｋｇ−１・ｄ−１を投与量とする。
（２．２．１．２）ＣＳ−００９０−１
モンテルカスト等価用量の１倍、すなわち１ｍｇ・ｋｇ−１・ｄ−１をＣＳ−００９０−１の低用量とし、モンテルカスト等価用量の３倍、すなわち３ｍｇ・ｋｇ−１・ｄ−１をＣＳ−００９０−１の中用量とし、モンテルカスト等価用量の９倍、すなわち９ｍｇ・ｋｇ−１・ｄ−１をＣＳ−００９０−１の高用量とする。
（２．２．２）動物の群分け
喘息誘発潜伏期が合格したモルモットを体重によって６匹／群で無作為に、モンテルカスト対照群、ＣＳ−００９０−１低用量実験群、ＣＳ−００９０−１中用量実験群、ＣＳ−００９０−１高用量実験群の４群に分けた。
喘息誘発潜伏期が合格したモルモットを体重によって６匹／群で無作為に、モンテルカスト対照群、ＣＳ−００９０−１低用量実験群、ＣＳ−００９０−１中用量実験群、ＣＳ−００９０−１高用量実験群の４群に分けた。
（２．３）ＣＳ−００９０−１のモルモット喘息モデルに対する抗喘息作用
（２．３．１）薬剤の調製方法
（２．３．１．１）モンテルカスト
一定量のモンテルカストに、濃度０．２％になるように適量のツイン−８０を、濃度１０％になるように適量の無水エタノールを加え、ボルテックスミキサで完全に溶解させた後、適量の脱イオン水を加え、濃度０．６ｍｇ／ｍＬの薬液に調製して即時に使用する。
（２．３．１．２）ＣＳ−００９０−１
一定量のＣＳ−００９０−１に、濃度０．２％になるように適量ツイン−８０を、濃度１０％になるように適量の無水エタノールを加え、ボルテックスミキサで完全に溶解させた後、適量の脱イオン水を加え、濃度０．２ｍｇ／ｍＬの高用量溶液に調製した。同じ方法で濃度０．６ｍｇ／ｍＬの中用量溶液、及び濃度１．８ｍｇ／ｍＬの低用量溶液をそれぞれ調製して即時に使用する。
（２．３．１．３）０．１％ヒスタミンと２％アセチルコリンとの混合溶液
一定量のヒスタミンに適量の脱イオン水を加えて濃度０．１％のヒスタミン溶液に調製し、一定量のアセチルコリンに適量の脱イオン水を加えて濃度２％のアセチルコリン溶液に調製した。その後、ヒスタミン溶液とアセチルコリン溶液とを体積で混合して即時に使用する。
（２．３．１）薬剤の調製方法
（２．３．１．１）モンテルカスト
一定量のモンテルカストに、濃度０．２％になるように適量のツイン−８０を、濃度１０％になるように適量の無水エタノールを加え、ボルテックスミキサで完全に溶解させた後、適量の脱イオン水を加え、濃度０．６ｍｇ／ｍＬの薬液に調製して即時に使用する。
（２．３．１．２）ＣＳ−００９０−１
一定量のＣＳ−００９０−１に、濃度０．２％になるように適量ツイン−８０を、濃度１０％になるように適量の無水エタノールを加え、ボルテックスミキサで完全に溶解させた後、適量の脱イオン水を加え、濃度０．２ｍｇ／ｍＬの高用量溶液に調製した。同じ方法で濃度０．６ｍｇ／ｍＬの中用量溶液、及び濃度１．８ｍｇ／ｍＬの低用量溶液をそれぞれ調製して即時に使用する。
（２．３．１．３）０．１％ヒスタミンと２％アセチルコリンとの混合溶液
一定量のヒスタミンに適量の脱イオン水を加えて濃度０．１％のヒスタミン溶液に調製し、一定量のアセチルコリンに適量の脱イオン水を加えて濃度２％のアセチルコリン溶液に調製した。その後、ヒスタミン溶液とアセチルコリン溶液とを体積で混合して即時に使用する。
（２．３．２）試験方法
喘息誘発潜伏期が合格した２４匹のモルモットを体重によって６匹／群で無作為に、モンテルカスト対照群、ＣＳ−００９０−１低用量実験群、ＣＳ−００９０−１中用量実験群、ＣＳ−００９０−１高用量実験群の４群に分けた。投与前に各群のモルモットを絶水させずに１２時間絶食させ、各群のモルモットに毎日１ｍＬ／１００ｇ体重で対応する治療薬物を１回／日、７日間連続して経胃投与した。７日目に最後の投与１時間後、モルモットを自製の密封容器（２Ｌ）内に置き、喘息モデルの製作と同様の条件で喘息誘発を行い、モルモット投与後の喘息誘発潜伏期を観察して記録した。潜伏期が６分間を超えたものを６分間として記録する。
喘息誘発潜伏期が合格した２４匹のモルモットを体重によって６匹／群で無作為に、モンテルカスト対照群、ＣＳ−００９０−１低用量実験群、ＣＳ−００９０−１中用量実験群、ＣＳ−００９０−１高用量実験群の４群に分けた。投与前に各群のモルモットを絶水させずに１２時間絶食させ、各群のモルモットに毎日１ｍＬ／１００ｇ体重で対応する治療薬物を１回／日、７日間連続して経胃投与した。７日目に最後の投与１時間後、モルモットを自製の密封容器（２Ｌ）内に置き、喘息モデルの製作と同様の条件で喘息誘発を行い、モルモット投与後の喘息誘発潜伏期を観察して記録した。潜伏期が６分間を超えたものを６分間として記録する。
（２．３．３）統計的分析
Ｅｘｃｅｌで統計的分析を行う。すべての実験結果データを平均数±標準偏差(ｘ±ｓ)で表され、ｔ−検定によって、Ｐ≦０．０５であるときに両群のデータに有意差があり、Ｐ＞０．０５であるときに両群のデータに有意差はない。
Ｅｘｃｅｌで統計的分析を行う。すべての実験結果データを平均数±標準偏差(ｘ±ｓ)で表され、ｔ−検定によって、Ｐ≦０．０５であるときに両群のデータに有意差があり、Ｐ＞０．０５であるときに両群のデータに有意差はない。
（３）結果
本実験において、ブランク対照群を設定せずに投与前後の自己対照法を使用し、動物の数が統計学の要求を満たし、各群にモデル製作済みのモルモット６匹を含む。以下の表に示すように、ＣＳ−００９０−１中用量群では、投与後の喘息誘発潜伏期が投与前の喘息誘発潜伏期と比べてＰ＜０．０５で有意差があると認められ、モルモットの喘息誘発潜伏期を明らかに延長させ、同じ用量のモンテルカスト対照群より明確な効果を示す一方、ＣＳ−００９０−１低用量群及びＣＳ−００９０−１高用量群では、投与後の喘息誘発潜伏期が投与前の喘息誘発潜伏期と比べてＰ＞０．０５で有意差がないと示され、すなわち、モルモット喘息モデルに対する抗喘息作用は明らかではないことが分かった。その理由は、低用量のＣＳ−００９０−１が抗喘息の最小有効量に到達できず、モルモット喘息モデルに対する抗喘息作用が明らかではない一方、中用量のＣＳ−００９０−１が最大治療量に到達するため、用量を高用量まで増大させてもモルモット喘息モデルに対する抗喘息作用がいっそう明らかにならないためであると考えられ得る。
本実験において、ブランク対照群を設定せずに投与前後の自己対照法を使用し、動物の数が統計学の要求を満たし、各群にモデル製作済みのモルモット６匹を含む。以下の表に示すように、ＣＳ−００９０−１中用量群では、投与後の喘息誘発潜伏期が投与前の喘息誘発潜伏期と比べてＰ＜０．０５で有意差があると認められ、モルモットの喘息誘発潜伏期を明らかに延長させ、同じ用量のモンテルカスト対照群より明確な効果を示す一方、ＣＳ−００９０−１低用量群及びＣＳ−００９０−１高用量群では、投与後の喘息誘発潜伏期が投与前の喘息誘発潜伏期と比べてＰ＞０．０５で有意差がないと示され、すなわち、モルモット喘息モデルに対する抗喘息作用は明らかではないことが分かった。その理由は、低用量のＣＳ−００９０−１が抗喘息の最小有効量に到達できず、モルモット喘息モデルに対する抗喘息作用が明らかではない一方、中用量のＣＳ−００９０−１が最大治療量に到達するため、用量を高用量まで増大させてもモルモット喘息モデルに対する抗喘息作用がいっそう明らかにならないためであると考えられ得る。
（４）結び
イン・ビボ薬効評価試験において、陽性対照薬モンテルカストと比べて、ＣＳ−００９０−１は、中用量、高用量でモルモット喘息誘発潜伏期を延長できる（Ｐ＜０．０５）ことから、モルモット喘息モデルに対する良好な抗喘息作用を有し、ドラッガビリティへの見込みのある候補リード化合物であることを示した。薬剤学的研究でＣＳ−００９０−１のバイオアベイラビリティを向上させることにより、さらなるドラッガビリティ評価にもっと多くの実験的根拠を提供することができる。
イン・ビボ薬効評価試験において、陽性対照薬モンテルカストと比べて、ＣＳ−００９０−１は、中用量、高用量でモルモット喘息誘発潜伏期を延長できる（Ｐ＜０．０５）ことから、モルモット喘息モデルに対する良好な抗喘息作用を有し、ドラッガビリティへの見込みのある候補リード化合物であることを示した。薬剤学的研究でＣＳ−００９０−１のバイオアベイラビリティを向上させることにより、さらなるドラッガビリティ評価にもっと多くの実験的根拠を提供することができる。
−第三部分：化合物ＣＳ−００９０−２のイン・ビボ抗喘息薬効学的研究−
（１）機器及び材料
（１．１）薬品及び試薬
モンテルカスト及び被験薬物ＣＳ−００９０−２（Chem-Stone Co., Ltd.）
塩化アセチルコリン（アセチルコリン、Shanghai SSS Reagent Co.,Ltd.）
リン酸ヒスタミン（ヒスタミン、Beijing Bode Luyuan Biotech Co.,Ltd.）
無水エタノール（Tianjin Damao Chemical Reagent Factory）
ツイン８０（Jiangsu Haian Petroleum Chemical Factory）
塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、Guangdong Guanghua Sci-Tech Co., Ltd.）
塩化カリウム（ＫＣｌ、Tianjin Baishi Chemical Co., Ltd.）
塩化カルシウム（ＣａＣｌ２、Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co. Ltd.）
炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３、Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co. Ltd.）
リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４、Tianjin Fuchen Chemical Reagent Factory）
硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４、Tianjin Damao Chemical Reagent Factory）
ブドウ糖（Ｇｌｕｃｏｓｅ、Tianjin Baishi Chemical Co., Ltd.）
ホルマリン（Tianjin Damao Chemical Reagent Factory）
生理食塩水（Guangdong Pharmaceutical University, College ofPharmacy、実験室で調製）
ピクリン酸（Beijing Xinding Pengfei Technology Development Co.,Ltd.）
（１）機器及び材料
（１．１）薬品及び試薬
モンテルカスト及び被験薬物ＣＳ−００９０−２（Chem-Stone Co., Ltd.）
塩化アセチルコリン（アセチルコリン、Shanghai SSS Reagent Co.,Ltd.）
リン酸ヒスタミン（ヒスタミン、Beijing Bode Luyuan Biotech Co.,Ltd.）
無水エタノール（Tianjin Damao Chemical Reagent Factory）
ツイン８０（Jiangsu Haian Petroleum Chemical Factory）
塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、Guangdong Guanghua Sci-Tech Co., Ltd.）
塩化カリウム（ＫＣｌ、Tianjin Baishi Chemical Co., Ltd.）
塩化カルシウム（ＣａＣｌ２、Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co. Ltd.）
炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３、Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co. Ltd.）
リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４、Tianjin Fuchen Chemical Reagent Factory）
硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４、Tianjin Damao Chemical Reagent Factory）
ブドウ糖（Ｇｌｕｃｏｓｅ、Tianjin Baishi Chemical Co., Ltd.）
ホルマリン（Tianjin Damao Chemical Reagent Factory）
生理食塩水（Guangdong Pharmaceutical University, College ofPharmacy、実験室で調製）
ピクリン酸（Beijing Xinding Pengfei Technology Development Co.,Ltd.）
（１．２）実験動物
モルモット：体重１８０〜２２０ｇ（喘息誘発）、健康雄性。
マウス：ＫＭマウス、体重２０〜２５ｇ、雌雄半々。
提供者：Guangzhou University of Chinese MedicineLaboratory Animal Center、マウス合格証号：ＳＣＸＫ（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ）２０１３−００２０、モルモット使用許可証番号：ＳＣＸＫ（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ）２０１３−００２０
モルモット：体重１８０〜２２０ｇ（喘息誘発）、健康雄性。
マウス：ＫＭマウス、体重２０〜２５ｇ、雌雄半々。
提供者：Guangzhou University of Chinese MedicineLaboratory Animal Center、マウス合格証号：ＳＣＸＫ（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ）２０１３−００２０、モルモット使用許可証番号：ＳＣＸＫ（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ）２０１３−００２０
（１．３）実験機器
ＹＵＹＵＥ４０２ＡＩ超音波噴霧器（Jiangsu Yuyue Medical Equipment &Supply Co. Ltd.）
ＺＣ−１０インテリジェントスーパー恒温水槽（Ningbo Tianheng Instrument Factory）
ＸＩＮＨＡＮＧ ＪＺ１００テンショントランスデューサ（Beijing Xinhang Xingye Technology &Trade Co. , Ltd.）
ＭｅｄＬａｂ生体信号取得処理システム（Nanjing Medease Technology Co., Ltd.）
１万分の１電子天びん（島津製作所、品番ＡＵＹ１２０）
１０万分の１電子天びん（島津製作所、品番ＡＵＷ１２０Ｄ）
電熱恒温水槽（Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd.、品番ＤＫ−８Ｄ）
ＢＩＯＬＡＢボルテクスミキサーＭＢ（Shanghai Biolab Equipment Co., Ltd.）
超音波洗浄装置（Dongguan Keqiao Ultrasonic Equipment Co., Ltd.）
ＹＵＹＵＥ４０２ＡＩ超音波噴霧器（Jiangsu Yuyue Medical Equipment &Supply Co. Ltd.）
ＺＣ−１０インテリジェントスーパー恒温水槽（Ningbo Tianheng Instrument Factory）
ＸＩＮＨＡＮＧ ＪＺ１００テンショントランスデューサ（Beijing Xinhang Xingye Technology &Trade Co. , Ltd.）
ＭｅｄＬａｂ生体信号取得処理システム（Nanjing Medease Technology Co., Ltd.）
１万分の１電子天びん（島津製作所、品番ＡＵＹ１２０）
１０万分の１電子天びん（島津製作所、品番ＡＵＷ１２０Ｄ）
電熱恒温水槽（Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd.、品番ＤＫ−８Ｄ）
ＢＩＯＬＡＢボルテクスミキサーＭＢ（Shanghai Biolab Equipment Co., Ltd.）
超音波洗浄装置（Dongguan Keqiao Ultrasonic Equipment Co., Ltd.）
（２）実験方法
（２．１）ヒスタミン及びアセチルコリンによって喘息が誘発されたモルモット動物モデルの製作
（２．１．１）用量設計
１０ｍｇ／日、１日１回投与のモンテルカスト臨床用量に基づいて、人体標準体重６０Ｋｇで換算すると、人体臨床用量は０．１７ｍｇ・ｋｇ−１である。体表面積で換算する人とモルモットとの等価用量比に基づいて、モルモット投与量は３ｍｇ・ｋｇ−１に設定される。前述のように、薬効を対照するために、被験薬ＣＳ−００９０−２の高、中、低用量は、それぞれ９ｍｇ・ｋｇ−１、３ｍｇ・ｋｇ−１、１ｍｇ・ｋｇ−１に設定される。
（２．１）ヒスタミン及びアセチルコリンによって喘息が誘発されたモルモット動物モデルの製作
（２．１．１）用量設計
１０ｍｇ／日、１日１回投与のモンテルカスト臨床用量に基づいて、人体標準体重６０Ｋｇで換算すると、人体臨床用量は０．１７ｍｇ・ｋｇ−１である。体表面積で換算する人とモルモットとの等価用量比に基づいて、モルモット投与量は３ｍｇ・ｋｇ−１に設定される。前述のように、薬効を対照するために、被験薬ＣＳ−００９０−２の高、中、低用量は、それぞれ９ｍｇ・ｋｇ−１、３ｍｇ・ｋｇ−１、１ｍｇ・ｋｇ−１に設定される。
（２．１．２）モデル製作及び投与方法
体重１８０ｇ〜２２０ｇの健康モルモットを密封ガラスベルジャー内に置き、安静になった後、噴霧装置を起動して喘息誘発薬液（２％塩化アセチルコリンと０．１％リン酸ヒスタミンとの等体積混合液）を１５秒間噴霧した。噴霧が終了した後、喘息潜伏期（噴霧開始から喘息発症、すなわち呼吸困難、痙攣転倒までの時間）を観察し、喘息潜伏期≦１２０秒の合格動物を選別した。選別された合格モルモットを無作為に高、中、低用量群、及び陽性対照群の４群に分けた。
体重１８０ｇ〜２２０ｇの健康モルモットを密封ガラスベルジャー内に置き、安静になった後、噴霧装置を起動して喘息誘発薬液（２％塩化アセチルコリンと０．１％リン酸ヒスタミンとの等体積混合液）を１５秒間噴霧した。噴霧が終了した後、喘息潜伏期（噴霧開始から喘息発症、すなわち呼吸困難、痙攣転倒までの時間）を観察し、喘息潜伏期≦１２０秒の合格動物を選別した。選別された合格モルモットを無作為に高、中、低用量群、及び陽性対照群の４群に分けた。
翌日に、合格したモルモット４２匹を選出して６匹／群で無作為に、モンテルカスト３ｍｇ・ｋｇ−１群、ＣＳ−００９０−２被験薬１ｍｇ・ｋｇ−１群、３ｍｇ・ｋｇ−１群、９ｍｇ・ｋｇ−１群の４群に分けた。各群のモルモットに１ｍＬ／１００ｇで７日間連続して経胃投与した。７日目に最後の投与１時間後、モルモットを密封ガラスベルジャー内に置き、同様の選別実験条件で噴霧して喘息を誘発した。モルモットの喘息潜伏期及び痙攣動物の数を記録した。３６０秒を超えても転倒しなかったものを３６０秒として記録する。
（２．２）統計的検定
実験データを±ｓで示し、統計データをＳＰＳＳ１１．０ソフトウェアにより処理する。
実験データを±ｓで示し、統計データをＳＰＳＳ１１．０ソフトウェアにより処理する。
喘潜伏期は明らかに延長する（Ｐ＜０．０５）。ＣＳ−００９０−２（１ｍｇ・ｋｇ−１、３ｍｇ・ｋｇ−１、９ｍｇ・ｋｇ−１）投与７日間後、投与前後の自己対照によって、モルモットの喘息潜伏期は明らかな変化がないことを示した。
（３）結び
モルモット喘息誘発実験において、新規化合物ＣＳ−００９０−２は、モルモット喘息に対して拮抗作用を有しない。
モルモット喘息誘発実験において、新規化合物ＣＳ−００９０−２は、モルモット喘息に対して拮抗作用を有しない。
−第四部分：化合物ＣＳ−００９０−４のイン・ビボ抗喘息薬効学研究−
（１）機器及び材料
（１．１）実験動物
健康モルモット、雄性、体重１８０−２２０ｇ
提供者：Guangzhou University of Chinese Medicine LaboratoryAnimal Center、合格証番号：ＳＣＸＫ(Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ)２０１３−００２０
（１．２）主要な機器
１０万分の１電子天びん（島津製作所、品番ＡＵＹ１２０）
電子天びん（島津製作所、品番ＡＵＹ１２０）
Ｖ７ボルテックスミキサ（米国Essenscien社）
ＹＵＹＵＥ４０２ＡＩ超音波噴霧器（Jiangsu Yuyue Medical Equipment &Supply Co. Ltd.）
電子天びん（島津製作所、品番：ＡＵＷ１２０Ｄ）
（１．３）主要な試薬及び材料
塩化アセチルコリン（Shanghai SSS Reagent Co.,Ltd.、バッチ番号２００２１０１８）
リン酸ヒスタミン（Shanghai Lizhu Dongfang Biotech Co.,Ltd.、バッチ番号０１０３１０）
モンテルカスト（Chem-Stone Co., Ltd.）
ＣＳ−００９−０４（Chem-Stone Co., Ltd.）
（１）機器及び材料
（１．１）実験動物
健康モルモット、雄性、体重１８０−２２０ｇ
提供者：Guangzhou University of Chinese Medicine LaboratoryAnimal Center、合格証番号：ＳＣＸＫ(Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ)２０１３−００２０
（１．２）主要な機器
１０万分の１電子天びん（島津製作所、品番ＡＵＹ１２０）
電子天びん（島津製作所、品番ＡＵＹ１２０）
Ｖ７ボルテックスミキサ（米国Essenscien社）
ＹＵＹＵＥ４０２ＡＩ超音波噴霧器（Jiangsu Yuyue Medical Equipment &Supply Co. Ltd.）
電子天びん（島津製作所、品番：ＡＵＷ１２０Ｄ）
（１．３）主要な試薬及び材料
塩化アセチルコリン（Shanghai SSS Reagent Co.,Ltd.、バッチ番号２００２１０１８）
リン酸ヒスタミン（Shanghai Lizhu Dongfang Biotech Co.,Ltd.、バッチ番号０１０３１０）
モンテルカスト（Chem-Stone Co., Ltd.）
ＣＳ−００９−０４（Chem-Stone Co., Ltd.）
（２）実験方法
（２．１）喘息誘発溶液の調製
０．２ｇコリン及び０．０１ｇヒスタミンを秤量してそれぞれビーカーに投入し、各ビーカーに蒸留水１０ｍｌをそれぞれ添加して均一に混合した。
（２．２）ＣＳ−００９−０４によるモルモット喘息潜伏期への影響
（２．２．１）モルモット喘息が誘発された動物モデルの製作
購入したモルモットに対して３日間の検疫を行った。検疫期間において動物を１日１回検査し、不健康な動物があれば即時に取り除き、健康な動物を選んで実験を行った。体重１８０ｇ〜２２０ｇの健康モルモットを密封ガラスベルジャー内に置き、安静になった後、噴霧装置を起動して、モルモットが転倒するまで喘息誘発薬液（２％塩化アセチルコリンと０．１％リン酸ヒスタミンとの等体積混合液）を噴霧した。喘息潜伏期（噴霧開始から喘息発症、すなわち呼吸困難、痙攣転倒までの時間）を観察し、喘息潜伏期≦１２０秒の合格動物を選別した。
（２．１）喘息誘発溶液の調製
０．２ｇコリン及び０．０１ｇヒスタミンを秤量してそれぞれビーカーに投入し、各ビーカーに蒸留水１０ｍｌをそれぞれ添加して均一に混合した。
（２．２）ＣＳ−００９−０４によるモルモット喘息潜伏期への影響
（２．２．１）モルモット喘息が誘発された動物モデルの製作
購入したモルモットに対して３日間の検疫を行った。検疫期間において動物を１日１回検査し、不健康な動物があれば即時に取り除き、健康な動物を選んで実験を行った。体重１８０ｇ〜２２０ｇの健康モルモットを密封ガラスベルジャー内に置き、安静になった後、噴霧装置を起動して、モルモットが転倒するまで喘息誘発薬液（２％塩化アセチルコリンと０．１％リン酸ヒスタミンとの等体積混合液）を噴霧した。喘息潜伏期（噴霧開始から喘息発症、すなわち呼吸困難、痙攣転倒までの時間）を観察し、喘息潜伏期≦１２０秒の合格動物を選別した。
（２．２．２）用量設計
文献に記載されている１０ｍｇ／日のモンテルカスト人体推薦量に基づいて、標準人６０Ｋｇで換算すると、毎日の用量は０．１７ｍｇ・ｋｇ−１である。成人用量に応じて換算した動物用量の倍数簡易表により、モルモットのＣＳ−００９−０４投与量は、低用量（１ｍｇ・ｋｇ−１）、中用量（３ｍｇ・ｋｇ−１）、高用量（９ｍｇ・ｋｇ−１）であり、陽性対照群のモンテルカスト投与量は中用量（３ｍｇ・ｋｇ−１）であることが分かった。
文献に記載されている１０ｍｇ／日のモンテルカスト人体推薦量に基づいて、標準人６０Ｋｇで換算すると、毎日の用量は０．１７ｍｇ・ｋｇ−１である。成人用量に応じて換算した動物用量の倍数簡易表により、モルモットのＣＳ−００９−０４投与量は、低用量（１ｍｇ・ｋｇ−１）、中用量（３ｍｇ・ｋｇ−１）、高用量（９ｍｇ・ｋｇ−１）であり、陽性対照群のモンテルカスト投与量は中用量（３ｍｇ・ｋｇ−１）であることが分かった。
（２．２．３）投与方法
選別された合格モルモットを無作為に高、中、低用量群、及び陽性対照群の４群に分けた。各群のモルモットに１ｍＬ／１００ｇ、１日１回で７日間連続して経胃投与した。７日目に最後の投与１時間後、喘息誘発潜伏期を測定した。
選別された合格モルモットを無作為に高、中、低用量群、及び陽性対照群の４群に分けた。各群のモルモットに１ｍＬ／１００ｇ、１日１回で７日間連続して経胃投与した。７日目に最後の投与１時間後、喘息誘発潜伏期を測定した。
（３）結果
（３．１）ＣＳ−００９−０４によるモルモット喘息潜伏期への影響
モルモットが吸入したヒスタミン、アセチルコリンは、モルモットの気道上皮細胞のＨ１、Ｍ受容体に作用することにより、気道平滑筋を収縮させ、モルモットの呼吸を困難にする。このモデルは、喘息発症時の気道閉塞症状を模擬することができる。表４に示すように、ＣＳ−００９−０４用量群における９ｍｇ・ｋｇ−１群は、投与前後の潜伏期に有意差（Ｐ＜０．０５）があり、ＣＳ−００９−０４用量群における１ｍｇ・ｋｇ−１群及び３ｍｇ・ｋｇ−１群は、投与前後の潜伏期に有意差（Ｐ＞０．０５）がないことが分かった。このことから、ＣＳ−００９−０４は、９ｍｇ・ｋｇ−１用量で喘息潜伏期を明らかに延長できるが、１ｍｇ・ｋｇ−１及び３ｍｇ・ｋｇ−１の用量で喘息潜伏期を明らかに延長できないことが分かった。
（３．１）ＣＳ−００９−０４によるモルモット喘息潜伏期への影響
モルモットが吸入したヒスタミン、アセチルコリンは、モルモットの気道上皮細胞のＨ１、Ｍ受容体に作用することにより、気道平滑筋を収縮させ、モルモットの呼吸を困難にする。このモデルは、喘息発症時の気道閉塞症状を模擬することができる。表４に示すように、ＣＳ−００９−０４用量群における９ｍｇ・ｋｇ−１群は、投与前後の潜伏期に有意差（Ｐ＜０．０５）があり、ＣＳ−００９−０４用量群における１ｍｇ・ｋｇ−１群及び３ｍｇ・ｋｇ−１群は、投与前後の潜伏期に有意差（Ｐ＞０．０５）がないことが分かった。このことから、ＣＳ−００９−０４は、９ｍｇ・ｋｇ−１用量で喘息潜伏期を明らかに延長できるが、１ｍｇ・ｋｇ−１及び３ｍｇ・ｋｇ−１の用量で喘息潜伏期を明らかに延長できないことが分かった。
（３．２）モンテルカストによるモルモット喘息潜伏期への影響
表３に示すように、モンテルカストの３ｍｇ・ｋｇ−１用量群では、投与前後の喘息潜伏期に有意差（Ｐ＜０．０５）があることを示し、モンテルカストは３ｍｇ・ｋｇ−１の用量で喘息潜伏期を明らかに延長できることが分かった。
表３に示すように、モンテルカストの３ｍｇ・ｋｇ−１用量群では、投与前後の喘息潜伏期に有意差（Ｐ＜０．０５）があることを示し、モンテルカストは３ｍｇ・ｋｇ−１の用量で喘息潜伏期を明らかに延長できることが分かった。
（４）結び
モルモットのイン・ビボ抗喘息実験において、ＣＳ−００９−０４は、９ｍｇ・ｋｇ−１の投与量で、アセチルコリン−ヒスタミンによるモルモット喘息に対して明らかな抗喘息作用を有し、モルモットの喘息潜伏期を明らかに延長することができる。一方、モンテルカストは、３ｍｇ・ｋｇ−１の僅かな投与量で、アセチルコリン−ヒスタミンによるモルモット喘息に対して明らかな抗喘息作用（Ｐ＜０．０５）を有する。このことから、ＣＳ−００９−０４の抗喘息作用はモンテルカストに及ばないことが分かった。
モルモットのイン・ビボ抗喘息実験において、ＣＳ−００９−０４は、９ｍｇ・ｋｇ−１の投与量で、アセチルコリン−ヒスタミンによるモルモット喘息に対して明らかな抗喘息作用を有し、モルモットの喘息潜伏期を明らかに延長することができる。一方、モンテルカストは、３ｍｇ・ｋｇ−１の僅かな投与量で、アセチルコリン−ヒスタミンによるモルモット喘息に対して明らかな抗喘息作用（Ｐ＜０．０５）を有する。このことから、ＣＳ−００９−０４の抗喘息作用はモンテルカストに及ばないことが分かった。
［結論部］
（１）急性毒性実験の結果により、Chem-Stone Co., Ltd.が提供したＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４のＫＭマウス急性毒性作用試験において、すべてのマウスは生存し、摂食、活動・行動、排尿・排便が正常であり、特別な分泌物がなく、例えば活動減少、静止無動、驚かせた後の酔いのような挙動などの神経系毒性反応の症状がなく、８日目で解剖した後の観察により各マウスの肺臓及び気管支が正常であることを示した。そのため、ＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４の最大投与量は、それぞれ２２８０ｍｇ・ｋｇ−１、２２８９ｍｇ・ｋｇ−１、２２６２ｍｇ・ｋｇ−１であると考えられ得る。このことから、ＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４は、治療量範囲で相対的な安全性、信頼性、非毒性を示すことが分かった。
（１）急性毒性実験の結果により、Chem-Stone Co., Ltd.が提供したＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４のＫＭマウス急性毒性作用試験において、すべてのマウスは生存し、摂食、活動・行動、排尿・排便が正常であり、特別な分泌物がなく、例えば活動減少、静止無動、驚かせた後の酔いのような挙動などの神経系毒性反応の症状がなく、８日目で解剖した後の観察により各マウスの肺臓及び気管支が正常であることを示した。そのため、ＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４の最大投与量は、それぞれ２２８０ｍｇ・ｋｇ−１、２２８９ｍｇ・ｋｇ−１、２２６２ｍｇ・ｋｇ−１であると考えられ得る。このことから、ＣＳ−００９０−１、ＣＳ−００９０−２、ＣＳ−００９０−４は、治療量範囲で相対的な安全性、信頼性、非毒性を示すことが分かった。
（２）ＣＳ−００９０−１のイン・ビボ抗喘息薬効評価試験の結果により、中、高用量のＣＳ−００９０−１は、モルモット喘息誘発潜伏期を明らかに延長させ、モルモット喘息モデルに対して良好な抗喘息作用を有し、同じ用量のモンテルカスト対照群より明らかな効果（Ｐ＜０．０５）を有し、高効率、低毒性抗喘息薬物の研究開発において見込みのある候補リード化合物であることを示した。これを基に、ＣＳ−００９０−１の薬剤学的研究でＣＳ−００９０−１のバイオアベイラビリティを向上させることにより、さらなるドラッガビリティ評価にもっと多くの実験的根拠を提供することができる。
（３）ＣＳ−００９０−２のイン・ビボ抗喘息薬効評価試験の結果により、化合物ＣＳ−００９０−２は、モルモット喘息に対して拮抗作用を有しないことを示した。
（４）ＣＳ−００９０−４のイン・ビボ抗喘息薬効評価試験の結果により、モルモットのイン・ビボ抗喘息実験において、ＣＳ−００９−０４は、高用量（９ｍｇ・ｋｇ−１）投与の条件でアセチルコリン−ヒスタミンによるモルモット喘息に対して明らかな抗喘息作用を有し、モルモットの喘息潜伏期を明らかに延長できることを示した。一方、モンテルカストは、３ｍｇ・ｋｇ−１の僅かな投与量で、アセチルコリン−ヒスタミンによるモルモット喘息に対して明らかな抗喘息作用を有し、モルモットの喘息潜伏期を極めて顕著に延長することができる。このことから、ＣＳ−００９−０４は、陽性対照薬モンテルカストと比べて、喘息に対する治療効果が陽性対照薬より低いことが分かった。
Claims (10)
- 構造式：
（式中、
Ｒ１、Ｒ２は、Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＯ２、又はＮ３を示し、
Ｒ３は、低級アルキル基、低級アルケニル基、−ＣＦ３、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、ＣＨ２ＣＦ３、置換もしくは非置換のフェニル基、置換もしくは非置換のベンジル基、置換もしくは非置換の２−フェネチル基、又は２つのＲ２基が同一の炭素に結合してなるＯ、Ｓ、及びＮから選ばれる０〜２のヘテロ原子を有する８員以下の環を示し、
Ｒ４は、Ｈ、又はＲ３を示し、
Ｒ５は、Ｈ、又は薬学的に許容される塩に対応するカチオンを示し、
Ｒ６、Ｒ７は、Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＯ２、又はＮ３を示す。）
で表されることを特徴とする、ロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ。 - 前記低級アルキル基は炭素数１〜８のアルキル基であり、前記低級アルケニル基は炭素数１〜８のアルケニル基であることを特徴とする、請求項１に記載のロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ。
- 構造式：
で表されることを特徴とする、請求項１に記載のロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ。 - 構造式：
で表されることを特徴とする、請求項３に記載のロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ。 - 構造式：
で表されることを特徴とする、請求項３に記載のロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ。 - 構造式：
で表されることを特徴とする、請求項３に記載のロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ。 - 構造式：
で表されることを特徴とする、請求項３に記載のロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグ。 - 喘息及び／又はアレルギー性鼻炎−喘息症候群の治療及び／又は予防及び／又は緩和及び／又は補助治療用の医薬品を製造するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグの使用。
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載のロイコトリエン受容体拮抗薬として用いるシクロプロピル不飽和キノリン化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくはプロドラッグを含む、
ことを特徴とする医薬組成物。 - 薬学的に許容される補助剤をさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物。
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