JP2017520557A - ヒト化抗Tau(pS422)抗体脳シャトル及びその使用 - Google Patents
ヒト化抗Tau(pS422)抗体脳シャトル及びその使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
・タングルのみの型の疾患を含む、アルツハイマー病
・ダウン症候群、成人の症例
・グアム−パーキンソン痴呆複合
・パンチドランカー
・ピック病
・嗜銀顆粒性痴呆
・前頭側頭痴呆
・大脳皮質基底核変性症
・Pallido−ponto黒質変性症
・進行性核上性麻痺
・タングルを伴うゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病である。
a)ハプテン化抗体のハプテンに対する1つの結合部位と血液脳関門レセプターに対する1つの結合部位、又は
b)ハプテン化抗体のハプテンに対する2つの結合部位と血液脳関門レセプターに対する1つの結合部位、又は
c)ハプテン化抗体のハプテンに対する1つの結合部位と血液脳関門レセプターに対する2つの結合部位、又は
d)ハプテン化抗体のハプテンに対する2つの結合部位と血液脳関門レセプターに対する2つの結合部位
を含む。
a)ヒトTau(pS422)に特異的に結合するハプテン化抗体のハプテンに対する1つの結合部位と血液脳関門レセプターに対する1つの結合部位、又は
b)ヒトTau(pS422)に特異的に結合するハプテン化抗体のハプテンに対する2つの結合部位と血液脳関門レセプターに対する1つの結合部位、又は
c)ヒトTau(pS422)に特異的に結合するハプテン化抗体のハプテンに対する1つの結合部位と血液脳関門レセプターに対する2つの結合部位、又は
d)ヒトTau(pS422)に特異的に結合するハプテン化抗体のハプテンに対する2つの結合部位と血液脳関門レセプターに対する2つの結合部位
を含む。
a)血液脳関門レセプターに特異的に結合するハプテン化抗体のハプテンに対する1つの結合部位とヒトTau(pS422)に対する1つの結合部位、又は
b)血液脳関門レセプターに特異的に結合するハプテン化抗体のハプテンに対する2つの結合部位とヒトTau(pS422)に対する1つの結合部位、又は
c)血液脳関門レセプターに特異的に結合するハプテン化抗体のハプテンに対する1つの結合部位とヒトTau(pS422)に対する2つの結合部位、又は
d)血液脳関門レセプターに特異的に結合するハプテン化抗体のハプテンに対する2つの結合部位とヒトTau(pS422)に対する2つの結合部位
を含む。
i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauに特異的に結合する。
a)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、18、及び10のHVR、又は
b)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、09、及び10のHVR
を含む。
a)軽鎖可変ドメインに、配列番号:13、14、及び15のHVR、又は
b)軽鎖可変ドメインに、配列番号:12、05、及び15のHVR
を含む。
a)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、18、及び10のHVR、及び、軽鎖可変ドメインに、配列番号:13、14、及び15のHVR、又は
b)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、09、及び10のHVR、及び、軽鎖可変ドメインに、配列番号:12、05、及び15のHVR、又は
c)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、09、及び10のHVR、及び、軽鎖可変ドメインに、配列番号:13、14、及び15のHVR
を含む。
a)配列番号:20の重鎖可変ドメイン及び配列番号:17の軽鎖可変ドメイン、又は
b)配列番号:19の重鎖可変ドメイン及び配列番号:16の軽鎖可変ドメイン、又は
c)配列番号:19の重鎖可変ドメイン及び配列番号:17の軽鎖可変ドメイン、又は
d)配列番号:21の重鎖可変ドメイン及び配列番号:17の軽鎖可変ドメイン
を含む。
i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合する。
a)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下、及び/又は
b)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下、及び/又は
c)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下、及び/又は
d)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下
の、EC50値を有する。
i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する。
a)ヒトサブクラスIgG1の全長抗体、又は
b)ヒトサブクラスIgG4の全長抗体、又は
c)変異L234A、L235A、及びP329Gを有するヒトサブクラスIgG1の全長抗体、
d)変異S228P、L235E、及びP329Gを有するヒトサブクラスIgG4の全長抗体、
e)両重鎖に変異L234A、L235A、及びP329G、1つの重鎖に変異T366W及びS354C、ならびに、各他の重鎖に変異T366S、L368A、Y407V、及びY349Cを有するヒトサブクラスIgG1の全長抗体、又は
f)両重鎖に変異S228P及びP329G、1つの重鎖に変異T366W及びS354C、ならびに、各他の重鎖に変異T366S、L368A、Y407V、及びY349Cを有するヒトサブクラスIgG4の全長抗体
である。
a)2つの抗体重鎖を含み、それぞれ、重鎖可変ドメインと重鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:08、配列番号:18、及び配列番号:10のHVRを含み、
ii)該定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リシン残基が存在し、又は、存在しなくてもよく、
iii)該定常領域が、アミノ酸変異L234A、L235A、及びP329Gを含み、
b)2つの抗体軽鎖を含み、それぞれ、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:13、配列番号:14、及び配列番号:15のHVRを含み、
ii)該定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
c)i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する。
a)2つの抗体重鎖を含み、それぞれ、重鎖可変ドメインと重鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:08、配列番号:09、及び配列番号:10のHVRを含み、
ii)該定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リシン残基が存在し、又は、存在しなくてもよく、
iii)該定常領域が、アミノ酸変異L234A、L235A、及びP329Gを含み、
b)2つの抗体軽鎖を含み、それぞれ、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:12、配列番号:05、及び配列番号:15のHVRを含み、
ii)該定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
c)i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する。
a)2つの抗体重鎖を含み、それぞれ、重鎖可変ドメインと重鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:08、配列番号:09、及び配列番号:10のHVRを含み、
ii)該定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リシン残基が存在し、又は、存在しなくてもよく、
iii)該定常領域が、アミノ酸変異L234A、L235A、及びP329Gを含み、
b)2つの抗体軽鎖を含み、それぞれ、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:13、配列番号:14、及び配列番号:15のHVRを含み、
ii)該定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
c)i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する。
a)2つの抗体重鎖を含み、それぞれ、重鎖可変ドメインと重鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:20のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リシン残基が存在し、又は、存在しなくてもよく、
iii)該定常領域が、アミノ酸変異L234A、L235A、及びP329Gを含み、
b)2つの抗体軽鎖を含み、それぞれ、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:17のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
c)i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する。
a)2つの抗体重鎖を含み、それぞれ、重鎖可変ドメインと重鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:19のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リシン残基が存在し、又は、存在しなくてもよく、
iii)該定常領域が、アミノ酸変異L234A、L235A、及びP329Gを含み、
b)2つの抗体軽鎖を含み、それぞれ、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:16のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
c)i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する。
a)2つの抗体重鎖を含み、それぞれ、重鎖可変ドメインと重鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:19のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リシン残基が存在し、又は、存在しなくてもよく、
iii)該定常領域が、アミノ酸変異L234A、L235A、及びP329Gを含み、
b)2つの抗体軽鎖を含み、それぞれ、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:17のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
c)i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する。
a)2つの抗体重鎖を含み、それぞれ、重鎖可変ドメインと重鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:21のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リシン残基が存在し、又は、存在しなくてもよく、
iii)該定常領域が、アミノ酸変異L234A、L235A、及びP329Gを含み、
b)2つの抗体軽鎖を含み、それぞれ、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:17のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
c)i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する。
医薬製剤である。
有効量の、本明細書で報告された非共有複合体を、個体に投与することを含む、
方法である。
Tau(pS422)誘引性神経変成を減少させるのに有効量の、本明細書で報告された非共有複合体を、個体に投与することを含む、
方法である。
認知及び機能を維持するのに有効量の、本明細書で報告された非共有複合体を、個体に投与することを含む、
方法。
認知及び機能が衰える速度を遅らせるのに有効量の、本明細書で報告された非共有複合体を、個体に投与することを含む、
方法である。
I.定義
本明細書で使用する場合、全ての定常領域ならびに重鎖及び軽鎖のドメインのアミノ酸位置は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載されたKabatナンバリングシステムに従って、ナンバリングされ、本明細書において、「Kabatに従ったナンバリング」と呼ばれる。具体的には、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のKabatナンバリングシステム(647〜660頁を参照のこと)は、カッパ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLに使用される。Kabat EUインデックスナンバリングシステム(661〜723頁を参照のこと)は、重鎖定常ドメイン(CH1、ヒンジ、CH2、及びCH3)に使用される。
(a)アミノ酸残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)、及び96〜101(H3)において生じる超可変ループ(Chothia、C. and Lesk、A.M.、J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917)と、
(b)アミノ酸残基24〜34(L1)、50〜56(L2)、89〜97(L3)、31〜35b(H1)、50〜65(H2)、及び95〜102(H3)において生じるCDR(Kabat、E.A. et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th ed. Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD (1991)、NIH Publication 91-3242)と、
(c)アミノ酸残基27c〜36(L1)、46〜55(L2)、89〜96(L3)、30〜35b(H1)、47〜58(H2)、及び93〜101(H3)において生じる抗原コンタクト(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))と、
(d)HVRアミノ酸残基46〜56(L2)、47〜56(L2)、48〜56(L2)、49〜56(L2)、26〜35(H1)、26〜35b(H1)、49〜65(H2)、93〜102(H3)、及び94〜102(H3)を含む、(a)、(b)、及び/又は(c)の組み合わせとを
含む。
100×分数X/Y
A.本明細書で報告された血液脳関門シャトル
本明細書で報告された非共有複合体の一部分は、ハプテンに対する第1の結合特異性と、血液脳関門レセプター(BBBR)に対する第2の結合特異性とを有する二重特異性抗体である血液脳関門−シャトルモジュール(BBBR−シャトルモジュール)である。このようなBBBR−シャトルモジュールは、血液脳関門上の経細胞輸送可能な細胞表面ターゲット(例えば、TfR、LRP、又は他のターゲット、BBBR)を認識し、同時に、ハプテン化ペイロードに結合する。
広い各種のリコンビナント抗体フォーマット、例えば、IgG抗体フォーマットと1つの鎖ドメインとの融合による三価の二重特異性抗体が、開発されてきた(例えば、Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15 (1997) 159-163;国際公開公報第2001/077342号;及びMorrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234を参照のこと)。
−一方の重鎖のCH3ドメイン及び他方の重鎖のCH3ドメインがそれぞれ、抗体CH3ドメイン間の元の界面を含む界面において一致し、
ここで、前記界面は、二重特異性抗体の形成を促進するように改変され、ここで、この改変は、
a)該一方の重鎖のCH3ドメインが改変され、
これにより、元の界面内で、該一方の重鎖のCH3ドメインが、二重特異性抗体内の他方の重鎖のCH3ドメインの元の界面に一致し、
アミノ酸残基が、より大きな側鎖の体積を有するアミノ酸残基で置き換えられることにより、該他方の重鎖のCH3ドメインの界面内のキャビティに位置することができる該一方の重鎖のCH3ドメインの界面内の隆起を生じさせ、
b)該他方の重鎖のCH3ドメインが改変され、
これにより、元の界面内で、第2のCH3ドメインが、二重特異性抗体内の第1のCH3ドメインの元の界面に一致し、
アミノ酸残基が、より小さい側鎖の体積を有するアミノ酸残基で置き換えられることにより、第1のCH3ドメインの界面内の隆起が位置することができる第2のCH3ドメインの界面内にキャビティを生じさせる、
ことを特徴とする。
−全長抗体の第1の重鎖のCH3ドメイン及び全長抗体の第2の重鎖のCH3ドメインが互いに、抗体CH3ドメイン間の元の界面に改変を含む界面において一致し、
ここで、i)第1の重鎖のCH3ドメインにおいて、
アミノ酸残基が、より大きな側鎖の体積を有するアミノ酸残基で置き換えられることにより、他方の重鎖のCH3ドメインの界面内のキャビティに位置することができる一方の重鎖のCH3ドメインの界面内の隆起を生じさせ、
かつ、ここで、ii)第2の重鎖のCH3ドメインにおいて、
アミノ酸残基が、より小さい側鎖の体積を有するアミノ酸残基で置き換えられることにより、第1のCH3ドメインの界面内の隆起が位置することができる第2のCH3ドメインの界面内にキャビティを生じさせる、
ことを特徴とする。
に記載された多重特異性抗体も含む。
に記載されている。
本明細書で報告された血液脳関門シャトルは、ヒトTau(pS422)に特異的に結合する抗体送達媒体として使用される。ヒトTau(pS422)に特異的に結合する抗体は、ハプテンとコンジュゲートするため、血液脳関門シャトルのハプテン結合部位により複合体化される。この複合体は、定義され、かつ、安定であり、ヒトTau(pS422)に特異的に結合するハプテン化抗体を、血液脳関門を通過して特異的に送達する。ヒトTau(pS422)に特異的に結合するハプテン化抗体は、血液脳関門シャトルにより非共有的方法で複合体化されているため、ヒトTau(pS422)に特異的に結合するハプテン化抗体は、その循環中には、その送達媒体(=血液脳関門シャトル=二重特異性抗体)に結合している一方、他方では、経細胞輸送後に効率的に放出されることもできる。ハプテンとのコンジュゲーションは、ヒトTau(pS422)に特異的に結合する抗体の活性に対する干渉なしに達成することができる。血液脳関門シャトルは、異常な共有付加を含まないため、免疫原性の任意のリスクを除去する。ヒトTau(pS422)に特異的に結合するハプテン化抗体と、ハプテン特異的結合部位を含む本明細書で報告された二重特異性抗体との複合体は、ヒトTau(pS422)に特異的に結合する抗体に対する、良性の生物物理学的な挙動を付与する。さらに、このような複合体は、二重特異性抗体の第2の結合特異性により認識される抗原を提示する細胞又は組織に対するロードをターゲット可能である。
i)重鎖可変ドメインの44位〜軽鎖可変ドメインの100位
ii)重鎖可変ドメインの105位〜軽鎖可変ドメインの43位、又は
iii)重鎖可変ドメインの101位〜軽鎖可変ドメインの100位
から選択される一本鎖抗体のためのものである。
本明細書で報告された非共有複合体のヒトTau(pS422)に特異的に結合するヒト化抗体は、標準的なヒト化法により得ることができなかった。親ウサギ抗体として特徴的な比較可能な結合性を有するヒト化抗体を得るために、アミノ酸配列中に標準的でない変異を導入する必要があった。このことは、本明細書で報告された抗体がヒト血液脳関門を通過し、ヒト脳内で有効であることを目的とするのに、特に重要である。このため、ヒト化抗体の選択に一般的に適用される基準は、本件に直接適用するには、十分説得力があるものではない。
i) (a)配列番号:08のアミノ酸配列を含むHVR−H1;
(b)配列番号:18のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び
(c)配列番号:10のアミノ酸配列を含むHVR−H3;又は
ii)(a)配列番号:08のアミノ酸配列を含むHVR−H1;
(b)配列番号:09のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び
(c)配列番号:10のアミノ酸配列を含むHVR−H3
から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は3つ全てのVH HVR配列を含む。
i) (a)配列番号:08のアミノ酸配列を含むHVR−H1;
(b)配列番号:18のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び
(c)配列番号:10のアミノ酸配列を含むHVR−H3;又は
ii)(a)配列番号:08のアミノ酸配列を含むHVR−H1;
(b)配列番号:09のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び
(c)配列番号:10のアミノ酸配列を含むHVR−H3
を含む。
i) (a)配列番号:13のアミノ酸配列を含むHVR−L1;
(b)配列番号:14のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び
(c)配列番号:15のアミノ酸配列を含むHVR−L3;又は
ii)(a)配列番号:12のアミノ酸配列を含むHVR−L1;
(b)配列番号:05のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び
(c)配列番号:15のアミノ酸配列を含むHVR−L3
から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は3つ全てのVL HVR配列を含む。
i) (a)配列番号:13のアミノ酸配列を含むHVR−L1;
(b)配列番号:14のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び
(c)配列番号:15のアミノ酸配列を含むHVR−L3;又は
ii)(a)配列番号:12のアミノ酸配列を含むHVR−L1;
(b)配列番号:05のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び
(c)配列番号:15のアミノ酸配列を含むHVR−L3
を含む。
i) (a)配列番号:08のアミノ酸配列を含むHVR−H1;
(b)配列番号:18のアミノ酸配列を含むHVR−H2;
(c)配列番号:10のアミノ酸配列を含むHVR−H3;
(d)配列番号:13のアミノ酸配列を含むHVR−L1;
(e)配列番号:14のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び
(f)配列番号:15のアミノ酸配列を含むHVR−L3;又は
ii) (a)配列番号:08のアミノ酸配列を含むHVR−H1;
(b)配列番号:09のアミノ酸配列を含むHVR−H2;
(c)配列番号:10のアミノ酸配列を含むHVR−H3;
(d)配列番号:12のアミノ酸配列を含むHVR−L1;
(e)配列番号:05のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び
(f)配列番号:15のアミノ酸配列を含むHVR−L3;又は
iii)(a)配列番号:08のアミノ酸配列を含むHVR−H1;
(b)配列番号:09のアミノ酸配列を含むHVR−H2;
(c)配列番号:10のアミノ酸配列を含むHVR−H3;
(d)配列番号:13のアミノ酸配列を含むHVR−L1;
(e)配列番号:14のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び
(f)配列番号:15のアミノ酸配列を含むHVR−L3
を含む。
特定の実施態様では、本明細書で提供された抗体は、100nM以下、50nM以下、又は1nM〜100nM(例えば、10−7M以下、例えば、10−7M〜10−9M)の解離定数(KD)を有する。
特定の実施態様では、本明細書で提供された抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントは、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、CrossFab、scCrossFab、Fv、及びscFvフラグメントならびに以下に記載された他のフラグメントを含むがこれらに限定されない。特定の抗体フラグメントのレビューについて、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照のこと。scFvフラグメントのレビューについて、例えば、Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315を参照のこと。また、国際公開公報第93/16185号;米国特許第5,571,894号、及び同第5,587,458号も参照のこと。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含み、延長したin vivo半減期を有するFab及びF(ab’)2の検討については、米国特許第5,869,046号を参照のこと。
典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する抗原性を減少させるが、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持するようにヒト化される。一般的には、ヒト化抗体は、1つ以上の可変ドメインを含み、同ドメインにおいて、HVR、例えば、CDR(又はその一部)は、非ヒト抗体由来であり、FR(又はその一部)は、ヒト抗体配列由来である。ヒト化抗体は、場合により、少なくとも一部又は全長のヒト定常領域も含むであろう。一部の実施態様では、ヒト化抗体中の一部のFR残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体(例えば、HVR残基が得られる抗体)由来の対応する残基により置換されている。
特定の実施態様では、本明細書で提供された抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2種類の部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、結合特異性の一方は、ヒトTau(pS422)に対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、ヒトTau(pS422)の2種類のエピトープに結合することができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体フラグメントとして調製することができる。
特定の実施態様では、本明細書で提供された抗体のアミノ酸配列変異体が考慮される。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善するのが望ましい場合ある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列内に適切な改変を導入することにより、又は、ペプチド合成により調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び/又は、同配列内への挿入、及び/又は、同配列内の残基の置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終的な構築物に達するのに行うことができる。ただし、最終的な構築物は、所望の特徴、例えば、抗原結合性を有するという条件である。
特定の実施態様では、1つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換変異誘発の対象となる部位は、HVR及びFRを含む。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しで下記表に示されている。より実質的な変化は、「例示的な置換」の見出しで下記表に提供され、アミノ酸側鎖の分類を参照して、更に以下に記載されているように提供される。アミノ酸置換は、対象となる抗体内に導入することができ、生成物は、所望の活性、例えば、保持/活性化された抗原結合性、低下した免疫原性、又は改善したADCCもしくはCDCについてスクリーニングすることができる。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(6)芳香族性:Trp、Tyr、Phe
特定の実施態様では、本明細書で提供された抗体は、抗体がグリコシル化されている度合いを向上又は低下させるように変異させる。抗体に対するグリコシル化部位の付加又は欠失は、アミノ酸配列を変異させることにより、都合良く達成することができる。これにより、1つ以上のグリコシル化部位が形成又は除去される。
特定の実施態様では、1つ以上のアミノ酸改変を、本明細書で提供された抗体のFc領域に導入することにより、Fc領域変異体を生成することができる。Fc領域変異体は、1つ以上のアミノ酸位置において、アミノ酸改変(例えば、置換)を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4のFc領域)を含んでもよい。
特定の実施態様では、システイン操作抗体、例えば、「チオMAb」を形成するのが望ましい場合がある。同抗体において、抗体の1つ以上の残基は、システイン残基により置換されている。特定の実施態様では、置換された残基は、抗体のアクセッシブル部位において起こる。システインによりそれらの残基を置換することにより、反応性チオール基は、抗体のアクセッシブル部位に位置することで、抗体を他の部分、例えば、薬剤部分又はリンカー−薬剤部分にコンジュゲートして、本明細書で更に記載されているように、免疫コンジュゲートを形成するのに使用することができる。特定の実施態様では、任意の1つ以上の下記残基:軽鎖のV205(Kabatナンバリング);重鎖のA118(EUナンバリング);及び重鎖Fc領域のS400(EUナンバリング)は、システインにより置換することができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載されているように生成することができる。
特定の実施態様では、本明細書で提供された抗体は、当技術分野において公知であり、容易に利用できる、更なる非タンパク質性部分を含有するように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、水溶性ポリマーを含むがこれに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例は、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/マレイン酸無水物コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか)、及びデキストラン又はポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物を含むがこれらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために、製造中での利点を有する場合がある。このポリマーは、任意の分子量のものであることができ、分岐鎖又は非分岐鎖であることができる。抗体に付着するポリマー数は変化させることができ、2つ以上のポリマーが付着する場合、それらは、同じか又は異なる分子であることができる。一般的には、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又は種類は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が規定条件下での治療に使用されるであろうかどうか等を含むがこれらに限定されない考慮に基づいて決定することができる。
抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号に記載されているリコンビナント法及び組成物を使用して産生することができる。一実施態様において、本明細書で記載された抗ヒトTau(pS422)抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列及び/又はVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖及び/又は重鎖)をコードすることができる。更なる実施態様では、このような核酸を含む1つ以上のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。更なる実施態様では、このような核酸を含むホスト細胞が提供される。1つのこのような実施態様では、ホスト細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は、(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1ベクター及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2ベクターを含む(例えば、(1)又は(2)によりトランスフォーメーションされている)。一実施態様において、ホスト細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はリンパ球細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。一実施態様において、抗ヒトTau(pS422)抗体を製造する方法が提供される。ここで、同方法は、抗体の発現に適した条件下において、本明細書で提供された抗体をコードする核酸を含むホスト細胞を培養することと、場合により、ホスト細胞(又はホスト細胞培養培地)から、抗体を回収することとを含む。
本明細書で報告された非共有複合体の抗ヒトTau(pS422)抗体は、当技術分野において公知の種々のアッセイ法により、その物理的/化学的特性及び/又は生体活性を特定し、スクリーニングし、又は、特徴付けることができる。
ヒトTau(pS422)に特異的に結合する抗体を、その抗原結合活性について、例えば、公知の方法、例えば、ELISA、アルファLISA、ウェスタンブロット、抗体アレイ又は逆相アレイ等により試験する。
一態様において、生体活性を有するその抗ヒトTau(pS422)抗体を特定するためのアッセイ法が提供される。生体活性は、例えば、Tau(pS422)誘引性細胞傷害からの保護/同細胞傷害の減少/同細胞傷害の阻害、及び/又は、オリゴマーヒトTau(pS422)の細胞間伝達からの保護/同伝達の減少/同伝達の阻害、及び/又は、LUHMES細胞中でのTau(pS422)誘引性カスパーゼ活性の低下を含むことができる。また、in vivo及び/又はin vitroにおけるこのような生体活性を有する抗体も提供される。
本明細書で記載された非共有複合体の医薬製剤は、所望の度合いの純度を有するこのような非共有複合体を、1つ以上の任意の薬学的に許容し得る担体と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の状態で調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980))。薬学的に許容し得る担体は、一般的には、利用される用量及び濃度において、レシピエントに対して非毒性であり、バッファー、例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;保存剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド;ベンゼトニウムクロリド;フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリ(ビニルピロリドン);アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシン;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール;塩形成カウンターイオン、例えば、ナトリウム;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);ならびに/又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)を含むがこれらに限定されない。本明細書において、例示的な薬学的に許容し得る担体は、間質薬分散剤、例えば、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、ヒト可溶性PH−20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、rhuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International, Inc.)を更に含む。rhuPH20を含む特定の例示的なsHASEGP及び使用方法は、米国特許出願公開公報第2005/0260186号及び同第2006/0104968号に記載されている。一態様において、sHASEGPは、1つ以上の更なるグリコサミノグリカナーゼ、例えば、コンドロイチナーゼと組み合わせられる。
本明細書で報告された非共有複合体のいずれかを、治療法に使用することができる。
本発明の別の態様では、上記された障害の治療、予防、及び/又は診断に有用な材料を含有する製品が提供される。本製品は、容器と、該容器上又は該容器に関連するラベル又は添付文書を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグ等を含む。容器は、各種の材料、例えば、ガラス又はプラスチックから形成することができる。容器は、組成物自体、又は、症状を治療、予防、及び/又は診断するのに有効な別の組成物との組み合わせで、組成物を保持し、無菌アクセスポートを有してもよい(例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針により突き刺し可能なストッパーを有するバイアルでもよい)。組成物中の少なくとも1つの活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された症状を処置するのに使用されることを示す。さらに、本製品は、(a)本製品に含有される組成物を含む第1容器であって、同組成物が本発明の抗体を含む第1容器と、(b)本製品に含有される組成物を含む第2容器であって、同組成物が更なる細胞毒又はその他の方法での治療剤を含む第2容器とを含んでもよい。本発明のこの実施態様における製品は、組成物が特定の症状を処置するのに使用することができることを示す添付文書を更に含んでもよい。代替的に又は追加的に、本製品は、薬学的に許容し得るバッファー、例えば、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液を含む第2(又は第3)容器を更に含む。他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザ視点から望ましい他の材料を更に含んでもよい。
1.ヒトTau(pS422)に特異的に結合するハプテン化抗体と、抗血液脳関門レセプター/ハプテン二重特異性抗体との非共有複合体。
a)ヒトTau(pS422)に特異的に結合するハプテン化抗体のハプテンに対する1つの結合部位と血液脳関門レセプターに対する1つの結合部位、又は
b)ヒトTau(pS422)に特異的に結合するハプテン化抗体のハプテンに対する2つの結合部位と血液脳関門レセプターに対する1つの結合部位、又は
c)ヒトTau(pS422)に特異的に結合するハプテン化抗体のハプテンに対する1つの結合部位と血液脳関門レセプターに対する2つの結合部位、又は
d)ヒトTau(pS422)に特異的に結合するハプテン化抗体のハプテンに対する2つの結合部位と血液脳関門レセプターに対する2つの結合部位
を含み、
ここで、b)及びc)の場合には、二重特異性抗体の1つの重鎖が、ホールの変異を含み、各他の鎖が、ノブの変異を含む、実施態様1〜13のいずれか記載の非共有複合体。
i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauに特異的に結合する、実施態様1〜95のいずれか記載の非共有複合体。
a)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、18、及び10のHVR、又は
b)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、09、及び10のHVR
を含む、実施態様1〜96のいずれか記載の非共有複合体。
a)軽鎖可変ドメインに、配列番号:13、14、及び15のHVR、又は
b)軽鎖可変ドメインに、配列番号:12、05、及び15のHVR
を含む、実施態様1〜97のいずれか記載の非共有複合体。
a)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、18、及び10のHVR、及び、軽鎖可変ドメインに、配列番号:13、14、及び15のHVR、又は
b)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、09、及び10のHVR、及び、軽鎖可変ドメインに、配列番号:12、05、及び15のHVR、又は
c)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、09、及び10のHVR、及び、軽鎖可変ドメインに、配列番号:13、14、及び15のHVR
を含む、実施態様1〜98のいずれか記載の非共有複合体。
a)配列番号:20の重鎖可変ドメイン及び配列番号:17の軽鎖可変ドメイン、又は
b)配列番号:19の重鎖可変ドメイン及び配列番号:16の軽鎖可変ドメイン、又は
c)配列番号:19の重鎖可変ドメイン及び配列番号:17の軽鎖可変ドメイン、又は
d)配列番号:21の重鎖可変ドメイン及び配列番号:17の軽鎖可変ドメイン
を含む、実施態様1〜99のいずれか記載の非共有複合体。
i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合する、実施態様1〜103のいずれか記載の非共有複合体。
a)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下、及び/又は
b)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下、及び/又は
c)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下、及び/又は
d)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下
の、EC50値を有する、実施態様1〜104のいずれか記載の非共有複合体。
i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する、実施態様1〜107のいずれか記載の非共有複合体。
a)ヒトサブクラスIgG1の全長抗体、又は
b)ヒトサブクラスIgG4の全長抗体、又は
c)変異L234A、L235A、及びP329Gを有するヒトサブクラスIgG1の全長抗体、
d)変異S228P、L235E、及びP329Gを有するヒトサブクラスIgG4の全長抗体、
e)両重鎖に変異L234A、L235A、及びP329G、1つの重鎖に変異T366W及びS354C、ならびに、各他の重鎖に変異T366S、L368A、Y407V、及びY349Cを有するヒトサブクラスIgG1の全長抗体、又は
f)両重鎖に変異S228P及びP329G、1つの重鎖に変異T366W及びS354C、ならびに、各他の重鎖に変異T366S、L368A、Y407V、及びY349Cを有するヒトサブクラスIgG4の全長抗体
である、実施態様1〜108のいずれか記載の非共有複合体。
a)2つの抗体重鎖を含み、それぞれ、重鎖可変ドメインと重鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:08、配列番号:18、及び配列番号:10のHVRを含み、
ii)該定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リシン残基が存在し、又は、存在しなくてもよく、
iii)該定常領域が、アミノ酸変異L234A、L235A、及びP329Gを含み、
b)2つの抗体軽鎖を含み、それぞれ、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:13、配列番号:14、及び配列番号:15のHVRを含み、
ii)該定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
c)i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する、実施態様1〜109のいずれか記載の非共有複合体。
a)2つの抗体重鎖を含み、それぞれ、重鎖可変ドメインと重鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:08、配列番号:09、及び配列番号:10のHVRを含み、
ii)該定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リシン残基が存在し、又は、存在しなくてもよく、
iii)該定常領域が、アミノ酸変異L234A、L235A、及びP329Gを含み、
b)2つの抗体軽鎖を含み、それぞれ、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:12、配列番号:05、及び配列番号:15のHVRを含み、
ii)該定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
c)i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する、実施態様1〜110のいずれか記載の非共有複合体。
a)2つの抗体重鎖を含み、それぞれ、重鎖可変ドメインと重鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:08、配列番号:09、及び配列番号:10のHVRを含み、
ii)該定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リシン残基が存在し、又は、存在しなくてもよく、
iii)該定常領域が、アミノ酸変異L234A、L235A、及びP329Gを含み、
b)2つの抗体軽鎖を含み、それぞれ、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:13、配列番号:14、及び配列番号:15のHVRを含み、
ii)該定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
c)i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する、実施態様1〜111のいずれか記載の非共有複合体。
a)2つの抗体重鎖を含み、それぞれ、重鎖可変ドメインと重鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:20のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リシン残基が存在し、又は、存在しなくてもよく、
iii)該定常領域が、アミノ酸変異L234A、L235A、及びP329Gを含み、
b)2つの抗体軽鎖を含み、それぞれ、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:17のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
c)i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する、実施態様1〜112のいずれか記載の非共有複合体。
a)2つの抗体重鎖を含み、それぞれ、重鎖可変ドメインと重鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:19のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リシン残基が存在し、又は、存在しなくてもよく、
iii)該定常領域が、アミノ酸変異L234A、L235A、及びP329Gを含み、
b)2つの抗体軽鎖を含み、それぞれ、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:16のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
c)i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する、実施態様1〜113のいずれか記載の非共有複合体。
a)2つの抗体重鎖を含み、それぞれ、重鎖可変ドメインと重鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:19のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リシン残基が存在し、又は、存在しなくてもよく、
iii)該定常領域が、アミノ酸変異L234A、L235A、及びP329Gを含み、
b)2つの抗体軽鎖を含み、それぞれ、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:17のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
c)i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する、実施態様1〜114のいずれか記載の非共有複合体。
a)2つの抗体重鎖を含み、それぞれ、重鎖可変ドメインと重鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:21のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リシン残基が存在し、又は、存在しなくてもよく、
iii)該定常領域が、アミノ酸変異L234A、L235A、及びP329Gを含み、
b)2つの抗体軽鎖を含み、それぞれ、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:17のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
c)i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する、実施態様1〜115のいずれか記載の非共有複合体。
a)血液脳関門レセプターに特異的に結合するハプテン化抗体のハプテンに対する1つの結合部位とヒトTau(pS422)に対する1つの結合部位、又は
b)血液脳関門レセプターに特異的に結合するハプテン化抗体のハプテンに対する2つの結合部位とヒトTau(pS422)に対する1つの結合部位、又は
c)血液脳関門レセプターに特異的に結合するハプテン化抗体のハプテンに対する1つの結合部位とヒトTau(pS422)に対する2つの結合部位、又は
d)血液脳関門レセプターに特異的に結合するハプテン化抗体のハプテンに対する2つの結合部位とヒトTau(pS422)に対する2つの結合部位
を含み、
ここで、b)及びc)の場合には、二重特異性抗体の1つの重鎖が、ホールの変異を含み、各他の鎖が、ノブの変異を含む、実施態様119〜131のいずれか記載の非共有複合体。
i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauに特異的に結合する、実施態様119〜213のいずれか記載の非共有複合体。
a)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、18、及び10のHVR、又は
b)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、09、及び10のHVR
を含む、実施態様119〜214のいずれか記載の非共有複合体。
a)軽鎖可変ドメインに、配列番号:13、14、及び15のHVR、又は
b)軽鎖可変ドメインに、配列番号:12、05、及び15のHVR
を含む、実施態様119〜215のいずれか記載の非共有複合体。
a)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、18、及び10のHVR、及び、軽鎖可変ドメインに、配列番号:13、14、及び15のHVR、又は
b)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、09、及び10のHVR、及び、軽鎖可変ドメインに、配列番号:12、05、及び15のHVR、又は
c)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、09、及び10のHVR、及び、軽鎖可変ドメインに、配列番号:13、14、及び15のHVR
を含む、実施態様119〜216のいずれか記載の非共有複合体。
a)配列番号:20の重鎖可変ドメイン及び配列番号:17の軽鎖可変ドメイン、又は
b)配列番号:19の重鎖可変ドメイン及び配列番号:16の軽鎖可変ドメイン、又は
c)配列番号:19の重鎖可変ドメイン及び配列番号:17の軽鎖可変ドメイン、又は
d)配列番号:21の重鎖可変ドメイン及び配列番号:17の軽鎖可変ドメイン
を含む、実施態様119〜217のいずれか記載の非共有複合体。
i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合する、実施態様119〜221のいずれか記載の非共有複合体。
a)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下、及び/又は
b)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下、及び/又は
c)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下、及び/又は
d)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下
の、EC50値を有する、実施態様119〜222のいずれか記載の非共有複合体。
i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する、実施態様119〜225のいずれか記載の非共有複合体。
a)ヒトサブクラスIgG1の全長抗体、又は
b)ヒトサブクラスIgG4の全長抗体、又は
c)変異L234A、L235A、及びP329Gを有するヒトサブクラスIgG1の全長抗体、
d)変異S228P、L235E、及びP329Gを有するヒトサブクラスIgG4の全長抗体、
e)両重鎖に変異L234A、L235A、及びP329G、1つの重鎖に変異T366W及びS354C、ならびに、各他の重鎖に変異T366S、L368A、Y407V、及びY349Cを有するヒトサブクラスIgG1の全長抗体、又は
f)両重鎖に変異S228P、L235E、及びP329G、1つの重鎖に変異T366W及びS354C、ならびに、各他の重鎖に変異T366S、L368A、Y407V、及びY349Cを有するヒトサブクラスIgG4の全長抗体、又は
g)両重鎖に変異L234A、L235A、及びP329G、1つの重鎖に変異T366W及びY349C、ならびに、各他の重鎖に変異T366S、L368A、Y407V、及びS354Cを有するヒトサブクラスIgG1の全長抗体、又は
h)両重鎖に変異S228P、L235E、及びP329G、1つの重鎖に変異T366W及びY349C、ならびに、各他の重鎖に変異T366S、L368A、Y407V、及びS354Cを有するヒトサブクラスIgG4の全長抗体
である、実施態様119〜226のいずれか記載の非共有複合体。
a)2つの抗体重鎖を含み、それぞれ、重鎖可変ドメインと重鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:08、配列番号:18、及び配列番号:10のHVRを含み、
ii)該定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リシン残基が存在し、又は、存在しなくてもよく、
iii)該定常領域が、アミノ酸変異L234A、L235A、及びP329Gを含み、
b)2つの抗体軽鎖を含み、それぞれ、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:13、配列番号:14、及び配列番号:15のHVRを含み、
ii)該定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
c)i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する、実施態様119〜227のいずれか記載の非共有複合体。
a)2つの抗体重鎖を含み、それぞれ、重鎖可変ドメインと重鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:08、配列番号:09、及び配列番号:10のHVRを含み、
ii)該定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リシン残基が存在し、又は、存在しなくてもよく、
iii)該定常領域が、アミノ酸変異L234A、L235A、及びP329Gを含み、
b)2つの抗体軽鎖を含み、それぞれ、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:12、配列番号:05、及び配列番号:15のHVRを含み、
ii)該定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
c)i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する、実施態様119〜228のいずれか記載の非共有複合体。
a)2つの抗体重鎖を含み、それぞれ、重鎖可変ドメインと重鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:08、配列番号:09、及び配列番号:10のHVRを含み、
ii)該定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リシン残基が存在し、又は、存在しなくてもよく、
iii)該定常領域が、アミノ酸変異L234A、L235A、及びP329Gを含み、
b)2つの抗体軽鎖を含み、それぞれ、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:13、配列番号:14、及び配列番号:15のHVRを含み、
ii)該定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
c)i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する、実施態様119〜229のいずれか記載の非共有複合体。
a)2つの抗体重鎖を含み、それぞれ、重鎖可変ドメインと重鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:20のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リシン残基が存在し、又は、存在しなくてもよく、
iii)該定常領域が、アミノ酸変異L234A、L235A、及びP329Gを含み、
b)2つの抗体軽鎖を含み、それぞれ、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:17のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
c)i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する、実施態様119〜230のいずれか記載の非共有複合体。
a)2つの抗体重鎖を含み、それぞれ、重鎖可変ドメインと重鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:19のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リシン残基が存在し、又は、存在しなくてもよく、
iii)該定常領域が、アミノ酸変異L234A、L235A、及びP329Gを含み、
b)2つの抗体軽鎖を含み、それぞれ、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:16のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
c)i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する、実施態様119〜231のいずれか記載の非共有複合体。
a)2つの抗体重鎖を含み、それぞれ、重鎖可変ドメインと重鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:19のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リシン残基が存在し、又は、存在しなくてもよく、
iii)該定常領域が、アミノ酸変異L234A、L235A、及びP329Gを含み、
b)2つの抗体軽鎖を含み、それぞれ、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:17のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
c)i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する、実施態様119〜232のいずれか記載の非共有複合体。
a)2つの抗体重鎖を含み、それぞれ、重鎖可変ドメインと重鎖定常領域とを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:21のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リシン残基が存在し、又は、存在しなくてもよく、
iii)該定常領域が、アミノ酸変異L234A、L235A、及びP329Gを含み、
b)2つの抗体軽鎖を含み、それぞれ、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含み、ここで、
i)該可変ドメインが、配列番号:17のアミノ酸配列を有し、
ii)該定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
c)i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有する全長ヒトTauに特異的に結合し、及び/又は
vi)配列番号:03のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)フラグメントについて、6ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
vii)配列番号:02のアミノ酸配列を有する全長ヒトTau(pS422)について、4.5ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
viii)配列番号:02のアミノ酸配列を有するヒトTau(pS422)の凝集体について、30ng/mL以下のEC50値を有し、及び/又は
ix)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauについて、125ng/mL以下のEC50値を有する、実施態様119〜233のいずれか記載の非共有複合体。
医薬製剤。
有効量の、実施態様1〜236のいずれか記載の非共有複合体を、個体に投与することを含む、
方法。
Tau(pS422)誘引性神経変成を減少させるのに有効量の、実施態様1〜236のいずれか記載の非共有複合体を、個体に投与することを含む、
方法。
認知及び機能を維持するのに有効量の、実施態様1〜236のいずれか記載の非共有複合体を、個体に投与することを含む、
方法。
認知及び機能が衰える速度を遅らせるのに有効量の、実施態様1〜236のいずれか記載の非共有複合体を、個体に投与することを含む、
方法。
下記は、本発明の方法及び組成物の例示である。種々の他の実施態様を実施でき、上記で提供された一般記載を提供すると理解される。
リコンビナントDNA技術
標準的な方法を使用して、Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているように、DNAを操作した。分子生物学的試薬を、製造メーカーの説明書に従って使用した。
所望の遺伝子セグメントを、Geneart GmbH(Regensburg, Germany)での化学合成により調製した。合成した遺伝子フラグメントを、増殖/増幅用のE. coliプラスミド内にクローニングした。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのDNA配列を、DNAシークエンシングにより確かめた。あるいは、短い合成DNAフラグメントを、化学的に合成したオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることにより、又は、PCRによりアッセンブリした。各オリゴヌクレオチドを、metabion GmbH(Planegg-Martinsried, Germany)により調製した。
特に断りない限り、全ての市販の化学薬品、抗体、及びキットを、製造メーカーのプロトコールに従って提供されたまま使用した。
ウサギ抗体の調製及び精製
免疫化
Charles River Laboratories International, IncからのNZWウサギを、免疫化に使用した。KLHに連結したホスホペプチドTau(416〜430)[pS422]を、K3PO4バッファー pH7.0に、濃度1mg/mLで溶解させ、安定したエマルジョンが生成されるまで、完全フロイントアジュバントと混合した(1:1)。3匹のウサギに、エマルジョン 2mLの皮内(i.d.)注入を受けさせ、続けて、2回目に筋肉内(i.m.)注入、及び3回目に皮下(s.c.)注入を、それぞれ1mLにおいて、1週間間隔で受けさせた。4回目のi.m.注入 1mLを、2週間後に行い、続けて更に、2回s.c.注入 1mLを4週間間隔で行った。各動物の末梢全血サンプル 10mLを、3回目、4回目、5回目、及び6回目の注入後4〜6日で収集し、FACSでの単一細胞ソーティングに使用した。さらに、各動物の血清 0.5mLを、同時に収集し、Tau(416〜430)[pS422]特異的抗体応答の決定に使用した。
免疫化に対する抗体応答を、血清の系列希釈により、ELISAを使用して決定した。同ELISAにおいて、ウェル当たりに、30ng ビオチン化Tau(416〜430)[pS422]を、1×PBS中において、ストレプトアビジンプレコート96ウェルマイクロタイタープレート(MC1347, Micro Coat Biotechnologie GmbH, Bernried, Germany)上で、4℃で一晩インキュベーションした。検出のために、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたヤギ抗ウサギIgG(The Jackson laboratory)を、1:16,000希釈で使用した。BM Blue POD基質である沈殿性テトラメチルベンジジン(TMB)(Roche Diagnostics GmbHからのすぐ使用できる溶液)を、可視化に使用した。反応を、1N HClにより停止させ、Tecan Inginiteで450/690nmにより測定した。
プレートのコーティング
無菌のストレプトアビジンコート6ウェルプレート(細胞培養グレード)を、3つのビオチン化対照ペプチド(非リン酸化Tau(416〜430)、MCAK_ヒト(88〜102)[95−pSer]、及びMAP2_ヒト(1802〜1816)[pSer−1802])の混合物、又は、ビオチン化ホスホペプチドTau(416〜430)[pS422]のいずれかと、PBS中でそれぞれ濃度0.5〜1μg/mLで、室温において1時間インキュベーションした。プレートを、使用前に3回、無菌のPBSで洗浄した。細胞培養6ウェルプレートを、炭酸バッファー(0.1M 炭酸ナトリウム、34mM 炭酸水素二ナトリウム、pH9.55)中の2μg/mL KLH(キーホールリンペットヘモシアニン)で、4℃で一晩コートした。プレートを、使用前に3回、無菌のPBSで洗浄した。
EDTA含有全血を、lympholyte mammal(Cedarlane Laboratories)での密度遠心前に、1×PBSで2倍希釈した。lympholyte mammalを、ウサギPBMCを単離するのに行った。PBMCを、抗体による染色前に2回洗浄した。
RPMI1640(Pan Biotech, Aidenbach, Germany)に、10% FCS(Hyclone, Logan, UT, USA)、2mM グルタミン、1% ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(PAA, Pasching, Austria)、2mM ピルビン酸ナトリウム、10mM HEPES(PAN Biotech, Aidenbach, Germany)、及び0.05mM ベータ−メルカプトエタノール(Gibco, Paisley, Scotland)を添加した。
無菌の6ウェルプレート(細胞培養グレード)を、非特異的付着により、マクロファージ及び単球を枯渇させるのに使用した。ウェルを、KLH(キーホールリンペットヘモシアニン)又はストレプトアビジンのいずれか及び対照ペプチドでコートした。各ウェルを、培地 最大4mL及び最大6×106個 免疫化ウサギからの末梢血単核細胞で満たし、インキュベーター中において、37℃で1時間結合させた。上清中の50% 細胞を、パニング工程に使用し、残り50% 細胞を、免疫蛍光染色及び単一細胞ソーティングに直接供した。
6ウェル組織培養プレートを、ストレプトアビジンでコートし、ビオチン化ペプチドTau(416〜430)[pS422]を、培地 4mL当たりに、最大6×106個 細胞と共に播種し、インキュベーター中において、37℃で1時間結合させた。付着しなかった細胞を、1×PBSで1〜2回、ウェルを注意深く洗浄することにより除去した。残りの付着した細胞を、トリプシンにより、インキュベーター中において37℃で10分間引き剥がし、ついで、培地中で2回洗浄した。細胞を、免疫蛍光染色まで、氷上で維持した。
単一細胞ソーティングに使用した抗ウサギIgG FITCを、AbD Serotec(STAR121F, Dusseldorf, Germany)から得た。表面染色のために、枯渇及びパニング工程からの細胞を、PBS中の抗ウサギIgG FITC抗体と共に、暗所での4℃の低温室において回転させながら、30分間インキュベーションさせた。遠心分離後、上清を、吸引により除去した。PBMCを、遠心分離及び氷冷PBSでの洗浄の2サイクルに供した。最終的に、PBMCを、氷冷PBS中に再懸濁させ、FACS分析に直ちに供した。ヨウ化プロピジウム(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)を、FACS分析前に濃度5μg/mLで加えて、死んだ細胞と生きた細胞とを識別した。FACSを、FACSDivaソフトウェア(BD Biosciences, USA)を備えたBecton Dickinson FACSAriaを使用して行った。単一のFITCラベル生細胞を、96ウェルプレート中に堆積させた。
B細胞の培養を、Zubler, R.H. et al., J. Immunol. 134 (1985) 3662-3668に記載されている方法と同様の方法により準備した。簡潔に、単一ソーティングしたB細胞を、210μL/ウェル Pansorbin Cells(1:20000)(Calbiochem (Merck), Darmstadt, Deutschland)、5% ウサギ胸腺細胞上清、及びガンマ線照射EL−4−B5マウス胸腺細胞(2×104個/ウェル)を含む、EL−4 B5培地を含む96ウェルプレート中で、インキュベーター中において、5% CO2の雰囲気下での37℃で7日間培養した。B細胞培養上清を、スクリーニングのために除去し、細胞を、可変領域遺伝子クローニングのために直ちに収集し、又は、RLTバッファー(Qiagen, Hilden, Germany) 100μL中において、−80℃で凍結させた。
B細胞培養上清を、ビオチン化Tau(416〜430)[pS422]に対する結合性について、ELISAによりスクリーニングした。非リン酸化Tau(416〜430)、KLH(キーホールリンペットヘモシアニン)、及び非関連ホスホペプチドMCAK_ヒト(88〜102)[95−pSer]を、対照抗原として使用した。ELISAプレートの準備に関して、ストレプトアビジンプレコートマイクロタイタープレートを、ビオチン化Tau(416〜430)[pS422]と、50ng/mLで、室温において1時間インキュベーションした。KLH又は対照ペプチドでのコーティングを、1μg/mLで行った。B細胞上清を、1:5〜1:10で希釈し、抗原コートマイクロタイタープレートにおいて、60分間インキュベーションした。徹底的な洗浄後に、ウサギ抗体の結合性を、ヒツジ抗ウサギIgGジゴキシゲニンコンジュゲート検出抗体(Chemicon AQ301D)を使用して検出した。TMBとの室温でのインキュベーション後、370nm〜492nmでの吸光度を測定した。ビオチン化Tau(416〜430)[pS422]により、バックグラウンドを上回るシグナルを生じるが、KLH及びMCAK_ヒト(88〜102)[95−pSer]によってはシグナルを生じないB細胞クローンを、更に検討し、可変領域遺伝子クローニングに供した。
トータルRNAを、NucleoSpin(登録商標)8/96 RNAキット(Macherey&Nagel; 740709.4, 740698)を使用し、製造メーカーのプロトコールに従って調製した。全ての工程を、epMotion 5075 liquid handling system(Eppendorf)において行った。RNAを、RNAseフリー水 60μLにより溶出した。RNA 6μLを使用し、製造メーカーの説明書に従って、Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen 18080-400)及びオリゴ−dT−プライマーを使用するリバーストランスクリプターゼ反応によりcDNAを生成した。cDNA 4μLを使用して、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域(VH及びVL)を、最終容量 50μLにおいて、重鎖についてのプライマーであるrbHCfinal.up及びrbHCfinal.do、ならびに、軽鎖についてのプライマーであるrbLCfinal.up及びrbLCfinal.do(以下の表を参照のこと)を使用する、AccuPrime SuperMix(Invitrogen 12344-040)により増幅させた。PCR条件は、下記の通りとした。94℃で5分の高温開始;94℃で20秒 35サイクル、70℃で20秒、68℃で45秒、及び68℃で7分での最後の伸長。
ウサギモノクローナル抗体のリコンビナント発現のために、VH又はVLをコードするPCR産物を、オーバーハングクローニング法(Haun, R.S. et al., BioTechniques 13 (1992) 515-518;Li, M.Z., et al., Nature Methods 4 (2007) 251-256)により、発現ベクター内にcDNAとしてクローニングした。ウサギカッパ又はガンマ定常領域及びVL又はHLインサートをコードする線状発現プラスミドを、オーバーラッププライマーを使用するPCRにより増幅した。精製したPCR産物を、T4 DNAポリメラーゼと共にインキュベーションし、一本鎖オーバーハングを生成した。この反応を、dCTPを加えることにより停止させた。次の工程において、プラスミド及びインサートを組み合わせ、recAと共にインキュベーションして、部位特異的組換えを誘引した。組換えプラスミドを、E. coli内にトランスフォーメーションした。翌日、増殖したコロニーを選択し、プラスミド調製、切断解析、及びDNAシークエンシングにより、正しく組み換えられたプラスミドについて試験した。抗体発現について、単離したHC及びLCプラスミドを、HEK293細胞内に一過性共トランスフェクションした。上清を、1週間後に収集した。ウサギマウスキメラ抗体のクローニング及び発現について、VH及びVL領域を、PCRにより増幅し、マウス定常カッパ及びマウス定常ガンマ1領域を含有する発現ベクター内にサブクローニングした。ウサギ/マウスキメラHC及びLCプラスミドを単離し、正しい挿入について、切断解析及びDNAシークエンシングにより試験し、HEK293細胞内に一過性に共トランスフェクションした。上清を、トランスフェクション後1週間で収集した。
リコンビナントに発現させたウサギ抗体を、MabSelectSuRe(商標)カラム(GE Healthcare)において、細胞培養上清から精製した。サンプルをロードする前に、該カラムを、25mmol/L Tris−HCl、25mmol/L NaCl、pH7.4で平衡化した。抗体の溶出を、50mmol/L 酢酸 pH3.14で達成した。溶出したサンプルを、脱塩カラム(Sephadex G25, GE Healthcare)上に直ちにロードし、20mmol/L His−HCl、140mmol/L NaCl pH6.0中に溶出した。また、このバッファーを、精製した抗体の保存にも使用した。全体的な保存温度を4℃とし、精製プロセス中は室温とし、分注後は−80℃とした。細胞培養上清からリコンビナントに発現させたウサギ/マウスキメラ抗体を、MabSelectSuRe(商標)カラム(GE Healthcare)において精製した。サンプルをロードする前に、該カラムを、1×PBS、pH7.4で平衡化させた。抗体の溶出を、100mmol/L クエン酸 pH3.0で達成した。溶出したサンプルを、2mol/L Tris/HCl pH9.0で直ちに中和した。その後、抗体を、サイズ排除カラム(Superdex 200, GE Healthcare)上にロードし、20mmol/L His−HCl、140mmol/L NaCl pH6.0中に溶出した。また、このバッファーを、精製した抗体の保存にも使用した。全体的な保存温度を4℃とし、精製プロセス中は室温とし、分注後は−80℃とした。
抗Tau pS422モノクローナルウサギ抗体は、pS422でリン酸化されたTauに非常に選択的であり、Tau pS422の原線維凝集体に結合する。
ウサギモノクローナル抗体を、HEK293細胞中で、リコンビナントに発現させた。細胞培養上清又は精製したウサギ抗体を、ビオチン化Tau(416〜430)[pS422]、非リン酸化Tau(416〜430)、KLH(キーホールリンペットヘモシアニン)、及び非関連ホスホペプチドMCAK_ヒト(88〜102)[95−pSer]に対する結合性を、ELISAにより試験した。ELISAプレートの準備に関して、ストレプトアビジンプレコートマイクロタイタープレートを、ビオチン化Tau(415〜430)[pS422]と、50ng/mLで、室温において1時間インキュベーションした。KLH又は対照ペプチドでのコーティングを、1μg/mLで行った。ウサギ抗Tau pS422抗体(Abcam AB51071)又はウサギ抗体含有上清を、種々の濃度で、抗原ラベルマイクロタイタープレートにおいて、60分間インキュベーションした。徹底的な洗浄後に、ウサギ抗体の結合性を、ヒツジ抗ウサギIgGジゴキシゲニンコンジュゲート検出抗体(Chemicon AQ301D)を使用して検出した。TMBとの室温でのインキュベーション後、370nm〜492nmでの吸光度を測定した。抗体結合性を、そのEC50値により特徴付けた。ビオチン化Tau(416〜430)[pS422]及び非リン酸化Tau(416〜430)のペプチドに対する抗体結合性を、そのEC50値により特徴付けた。KLH又はMCAKホスホペプチドによる交叉反応性を、高濃度、すなわち、細胞培養上清の1:5希釈での一点測定により推測した。結果を、以下の表に示す。Tauホスホペプチドに対する結合性のEC50値は、Tauペプチドに対する結合性のEC50値より、100倍超低いことが見出された。このことは、非リン酸化Tauペプチドと比較して、リン酸化Tauフラグメントに対する少なくとも100倍の選択性を示す。KLH及びMCAKの対照ホスホペプチドに対する結合性は、全ての抗体に関して、バックグラウンドレベルであり、Tauホスホペプチドに関する最大側定値の約1<3%であった。
原線維Tau pS422の凝集体に対する結合性を、BIAcore(商標)分析により更に調査し、確認した。測定を、BIAcore 3000機器を使用して、37℃で行った。このシステム及びサンプルのバッファーを、HBS−EP(10mM HEPES、150mM NaCl、3.4mM EDTA、0.005% ポリソルベート20(v/v))とした。BIAcore(商標)CM5センサチップを、前処理手順に供した。0.1% SDS、50mM NaOH、10mM HCl、及び100mM H3PO4を続けて、フローセルFC1、FC2、FC3、及びFC4に、30秒間注入した。アミンカップリング手順を、製造メーカーの説明書に従って、BIAcore(商標) 3000 wizard v. 4.1を使用して行った。センサ表面のEDC/NHS活性化後に、非ホスホ選択性抗Tau抗体mAb<TAU>M−4/53−IgGを、センサのフローセルFC2、FC3、及びFC4に固定した。対照として、無関係な抗原を認識する、CK−MM(クレアチンキナーゼアイソタイプ)に対する抗体を、CF1において捕捉した。mAb<TAU>M−4/53−IgG及びCK−MMに対する抗体を、10mM NaAc pH5.0中において、30μg/mLに希釈し、10μL/分で、接触時間7分間注入して、10,000RU 抗体捕捉系を固定した。この表面を、1M エタノールアミンによる飽和により不活性化した。センサを、10μL/分で2分間、溶液中の検体として、リン酸化線維状Tauタンパク質(0.3mg/mL ストックをHBS−EP中に1:100希釈)による5サイクルで順化させた。再生を、10mM グリシン pH2.5により、30μL/分で3分間行った。mAb4/53に結合する検体は、線維状pTauを解離しないと推測される。mAb4/53からの線維状pTauの解離を観察することができなかったためである。全ての更なる測定サイクルについて、0.3mg/mL 線維状pTauを、HBS−EPバッファー中で1:100希釈し、pTauを異種サンドイッチ方式で各抗体の検体に提示するために、10μL/分で1分間注入した。抗体の検体を、HBS−EPバッファー中に、濃度100nMに希釈し、この系内に、20μL/分で3分間注入した。解離の3分後、センサ表面を、10mM グリシン pH2.5、100μL/分で1分間、続けて、HBS洗浄、100μL/分で15秒間の、2回の注入により再生した。相互作用の会合及び解離期をモニターした。溶液中における抗体の検体は二価であるため、結合活性負荷抗体−pTau動力学を、二相性解離モデルにより特徴付けた。同モデルは、速い親和性系初期解離工程、続けて、後期の複合体解離における結合活性が安定化されているが、速度制限した動力学工程からなる。検体注入終了後10秒(初期)及び50秒(後期)に、kd及びt/2 dissをできる限り定量した。動力学測定を、二重参照法を使用して評価した。まず、FC1参照からのシグナルを差し引いて、バッファーバルク効果及び非特異的結合を補正した。第二に、0nM 検体注入を差し引いて、各捕捉系からの一次抗体の解離を補正した。動力学的速度を、ラングミュア1.1解離当嵌めモデルを使用して、BIAcore(商標)evaluation software v.4.1により評価した。抗原/抗体複合体安定性半減期(分)を、式ln(2)/60*kdにより算出した。
抗Tau pS422モノクローナルウサギ抗体の、アルツハイマー病患者の脳切片における細胞内pTauに対する結合性
アルツハイマー病の脳組織におけるpTau病理のモノクローナルウサギ抗Tau pS422抗体により特異的で、高感度の免疫組織化学検出を、AD患者からのヒト脳組織の凍結切片を使用して、免疫蛍光染色実験により調査した。方法は、基本的に、例X(マウス抗体)に記載されているのと同じとした。ウサギIgGを、ヤギ抗ウサギAlexa Fluor488(登録商標)コンジュゲート二次抗体(Invitrogen/Molecular Probes A11034)により検出した。pTau堆積及び線維の特異的で、高感度の染色が、クローンMab005、Mab019、Mab020、Mab085、Mab086、及びMab097について明らかとなる。細胞内pTau堆積が、大きな神経線維もつれ及び伸長した好中球閾値と同様に、顕著である。0.08〜0.016μg/mLの範囲の最少有効濃度を、調査した全てのクローンについて決定した。このことは、本物のヒトpTau堆積に対する非常に高感度の結合性を示す。
ウサギ抗ヒトTau(pS422)抗体のヒト化
本明細書で使用する場合、「可変ドメイン」(軽鎖の可変ドメイン(VL)、重鎖の可変ドメイン(VH))は、抗体のTau(pS422)抗原に対する結合性に直接関与する軽鎖ドメインと重鎖ドメインとの各ペアを指す。可変軽鎖及び重鎖ドメインは、同じ全体構造を有し、各ドメインは、4つのフレームワーク(FR)領域を含む。これらの配列は、広く保存されており、3つの「超可変領域」により連結されている。
リコンビナント発現ベクターの生成
a)ヒトIgG1定常領域を使用する免疫グロブリン重鎖発現用ベクターの生成
ヒトIgG1定常領域(CH1、ヒンジ、CH2、CH3)及びウサギ抗体Mab086由来のヒト化抗ヒトTau(pS422)抗体VHドメインを含むヒト化重鎖コード融合遺伝子を、各抗ヒトTau(pS422)特異的抗体VHドメインをコードするDNAフラグメントを、ヒトIgG1定常領域をコードする配列エレメントに融合させることによりアッセンブリした。
を有する。
−イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサー及びプロモーター(P−CMV)、
−ヒト重鎖免疫グロブリン 5’−非翻訳領域(5’UTR)、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−重鎖可変(VH)ドメインコード核酸、
−ヒトIgG1定常領域コード核酸、及び
ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGHpA)
ヒトIg−カッパ定常領域(CL−カッパ)及びウサギ抗体Mab086由来の抗ヒトTau(pS422)抗体VL(カッパ)ドメインを含むヒト化カッパ軽鎖コード融合遺伝子を、各抗ヒトTau(pS422)抗体VL(カッパ)ドメインをコードするDNAフラグメントを、ヒトIg−カッパ定常領域をコードする配列エレメントに融合させることによりアッセンブリした。
を有する。
−イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサー及びプロモーター(P−CMV)、
−ヒト重鎖免疫グロブリン 5’−非翻訳領域(5’UTR)、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−軽鎖可変(VL)ドメインコード核酸、
−ヒトIg−カッパ定常領域コード核酸、及び
ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGHpA)
ヒトIg−ラムダ定常領域(CL−ラムダ)及びウサギ抗体Mab086由来の抗ヒトTau(pS422)抗体VL(ラムダ)ドメインを含むヒト化ラムダ軽鎖コード融合遺伝子を、各抗ヒトTau(pS422)抗体VL(ラムダ)ドメインをコードするDNAフラグメントを、ヒトIg−ラムダ定常領域をコードする配列エレメントに融合させることによりアッセンブリした。
を有する。
−イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサー及びプロモーター(P−CMV)、
−ヒト重鎖免疫グロブリン 5’−非翻訳領域(5’UTR)、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−軽鎖可変(VL)ドメインコード核酸、
−ヒトIg−ラムダ定常領域コード核酸、及び
ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGHpA)
ヒトIg−カッパ定常領域(CL−カッパ)及びウサギ抗体Mab086由来の抗ヒトTau(pS422)抗体VL(カッパ)ドメインを含むヒトIg−カッパ軽鎖コード融合遺伝子を、各抗ヒトTau(pS422)抗体VL(カッパ)ドメインをコードするDNAフラグメントを、ヒトIg−カッパ定常領域をコードする配列エレメントに融合させることによりアッセンブリした。構築物は、ゲノム構成にあった。すなわち、イントロンが、シグナルペプチド及びVL(カッパ)とCL−カッパドメインとの間に存在した。
−ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサー及びプロモーター(P−CMV)、
−ヒト重鎖免疫グロブリン 5’−非翻訳領域(5’UTR)、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−軽鎖可変(VL)ドメインコード核酸、
−ヒトIgGカッパ定常領域、及び
ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGHpA)
ヒトIg−ラムダ定常領域(CL−ラムダ)及びウサギ抗体Mab086由来の抗ヒトTau(pS422)抗体VL(ラムダ)ドメインを含むヒトIg−ラムダ軽鎖コード融合遺伝子を、各抗ヒトTau(pS422)抗体VL(ラムダ)ドメインをコードするDNAフラグメントを、ヒトIg−ラムダ定常領域をコードする配列エレメントに融合させることによりアッセンブリした。構築物は、ゲノム構成にあった。すなわち、イントロンが、シグナルペプチド及びVL(ラムダ)とCL−ラムダドメインとの間に存在した。
−ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサー及びプロモーター(P−CMV)、
−ヒト重鎖免疫グロブリン 5’−非翻訳領域(5’UTR)、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−軽鎖可変(VL)ドメインコード核酸、
−ヒトIgGラムダ定常領域、及び
ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGHpA)
抗ヒトTau(pS422)抗体のリコンビナント生成
抗体を、F17培地(Invitrogen Corp.)中で培養された、一過性にトランスフェクションしたHEK293細胞(ヒト胚性腎臓細胞株293由来)中で生成した。実施例5で記載された各ベクターのトランスフェクションのために、「293-Free」トランスフェクション試薬(Novagen)を使用した。抗体を、個々の発現プラスミドから発現させた。トランスフェクションを、製造メーカーの説明書において特定されたように行った。リコンビナント抗体含有細胞の培養上清を、トランスフェクション後3〜7日で収集した。上清を、精製まで低温(例えば、−80℃)において保存した。
リコンビナント抗ヒトTau(pS422)抗体の精製
抗体を含有する培養上清をろ過し、2つのクロマトグラフ工程により精製した。
動力学的スクリーニング
動力学的スクリーニングを、Schraeml et al.(Schraeml, M. and M. Biehl, Methods Mol. Biol. 901 (2012) 171-181)に従って、BIAcore CM5センサを搭載したBIAcore 4000機器において行った。BIAcore 4000機器を、software version V1.1の制御下とした。BIAcore CM5シリーズSチップを、該機器内に搭載し、流体力学的に取り扱い、製造メーカーの説明書に従って前処理した。機器バッファーを、HBS−EPバッファー(10mM HEPES(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.05%(w/v)P20)とした。抗体捕捉系を、センサ表面上に準備した。ヒトIgG−Fc特異性を有するポリクローナルヤギ抗ヒト抗体(Jackson Lab.)を、30μg/mLで、10mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH5)中において、該機器のフローセル1、2、3、及び4におけるスポット1、2、4、及び5に、NHS/EDC化学を使用する10,000RUで固定した。各フローセルにおいて、抗体を、スポット1及びスポット5に捕捉させた。スポット2及びスポット4を、参照スポットとして使用した。センサを、1M エタノールアミン溶液で不活性化した。ヒト化抗体誘導体を、1mg/mL CMD(カルボキシメチルデキストラン)を加えた機器バッファー中に濃度44nM〜70nMでアプライした。抗体を、流速30μL/分で2分間注入した。表面提示抗体の捕捉レベル(CL)を、rel.応答単位(RU)で測定した。溶液中の検体、リン酸化ヒトtauタンパク質、非リン酸化ヒトtauタンパク質、及びリン酸化ヒトtau変異タンパク質T422Sを、流速30μL/分において、300nMで3分間注入した。解離を、5分間モニターした。捕捉系を、10mM グリシンバッファー pH1.7を30μL/分で全てのフローセルに1分注入することにより再生した。2つの報告点(検体注入終了直前に記録したシグナルを結合後期(BL)とし、解離時間の終了直前に記録したシグナルを、安定後期(SL)とする)を使用して、動力学的スクリーニング性能を特徴決定した。さらに、解離速度定数kd(1/秒)を、ラングミュアモデルに従って算出し、抗体/抗原複合体半減期を、式ln(2)/(60*kd)により、分で算出した。モル比(MR)を、式MR=(結合後期(RU)/(捕捉レベル(RU)))*(MW(抗体)/(MW(抗原))に従って算出した。センサが適切な量の抗体リガンド捕捉レベルで構成された場合、各抗体は、溶液中の少なくとも1つの検体に機能的に結合可能であるべきである。この結合は、MR=1.0のモル比で表現される。また、モル比は、検体結合の結合価モードについての指標でもある。最大結合価は、2つの検体に結合する抗体(各Fab価を有するもの)について、MR=2であることができる。
ELISA
PBS中で、コートしていないMaxisorbプレートに、非ビオチン化ペプチド/タンパク質/凝集体を加え、ストレプトアビジンコートしたMaxisorbプレートに、ビオチン化ペプチド/タンパク質/凝集体を加え、一晩インキュベーションした。上清を捨て、ウェルを、洗浄バッファー(1×PBS/0.1% Tween20) 90μLで3回洗浄した。残った反応性スポットを、ブロッキングバッファー(1×PBS/2% BSA(ウシ血清アルブミン画分V、脂肪酸フリー、Roche, Cat. No.: 10735078001)/0.05% Tween20)で、1時間インキュベーションすることによりブロッキングした。上清を捨て、ウェルを、洗浄バッファー 90μLで3回洗浄した。サンプル及び対照抗体を、ELISAバッファー(1×PBS/0.5% BSA(ウシ血清アルブミン画分V、脂肪酸フリー、Roche, Cat. No.: 10735078001)/0.05% Tween20)中に、開始濃度500ng/mLで12回希釈(1:2)で調製した。インキュベーション時間を、振とう器において、RTで60分とした。上清を捨て、ウェルを、洗浄バッファー 90μLで3回洗浄した。二次抗体溶液を、ELISAバッファーで調製した。抗体混合物 合計25μLを、アッセイプレートの全てのウェルに移し、その後、このプレートを、振とう器において、RTで60分間インキュベーションした。上清を捨て、ウェルを、洗浄バッファー 90μLで3回洗浄した。全てのウェルに、ABTS溶液 25μLを加えた。吸光度を、405nm〜492nmで読み取った。
リコンビナントヒト化抗ビオチン抗体のビオチンラベル化合物(ハプテン化化合物)に対する結合性
ヒト化法及びその後のシステイン変異の導入が完全な結合活性を保持している誘導体をもたらすかどうかを判定するために、下記実験を行った。
表面プラズモン共鳴測定を、BIAcore(登録商標) T200機器(GE Healthcare Biosciences AB, Sweden)において、25℃で行った。約4300応答単位(RU) 捕捉系(10μg/mL ヒト抗体捕捉キットからの抗ヒト捕捉(IgG Fc)、BR-1008-39, GE Healthcare Biosciences AB, Sweden)を、CM3チップ(GE Healthcare, BR-1005-36)において、pH5.0で、GE Healthcareにより供給された標準的なアミンカップリングキット(BR-1000-50)を使用することにより結合させた。アミンカップリング用のランニングバッファーを、HBS−N(10mM HEPES、pH7.4、150mM NaCl、GE Healthcare, BR-1006-70)とした。下記結合性研究用のランニング及び希釈バッファーを、PBS−T(0.05% Tween20を含む10mM リン酸緩衝生理食塩水)pH7.4とした。ヒト化抗ビオチン抗体を、流速5μL/分で2nM 溶液を60秒間注入することにより捕捉した。ビオチン化siRNAを、PBS−Tで、濃度0.14〜100nM(1:3希釈系列)で希釈した。結合性を、流速30μL/分で各濃度を180秒間注入し、解離時間600秒で測定した。表面を、3M MgCl2溶液で流速5μL/分において、30秒洗浄することにより再生した。データを、BAIevaluation software(GE Healthcare Biosciences AB, Sweden)を使用して評価した。バルク屈折率差を、抗ヒトIgG Fc表面から得られた応答を差し引くことにより収集した。また、ブランクの注入も差し引いた(=二重参照)。KD及び動力学的パラメータの算出のために、ラングミュア1:1モデルを使用した。
ハプテン化化合物と抗ハプテン抗体との非共有複合体の生成
全体的な方法
抗ハプテン抗体とハプテン化化合物(=ペイロードにコンジュゲートしたハプテン)との複合体の生成により、規定された複合体がもたらされるであろう。これらの複合体中の化合物(=ペイロード)は、その活性を保持していると推測されるであろう。ハプテン化化合物と各抗ハプテン抗体との複合体の生成について、ハプテン化化合物を、H2O中に、最終濃度1mg/mLに溶解させた。抗体濃度を、20mM ヒスチジンバッファー、140mM NaCl、pH=6.0中に、最終濃度1mg/mL(4.85μM)とした。ハプテン化ペイロード及び抗体を、上下のピペッティングにより、モル比2:1(抗体に対する化合物)で混合し、RTで15分間インキュベーションした。
ジゴキシゲニンポリペプチドと抗ジゴキシゲニン抗体との非共有複合体の生成について、マウスハイブリドーマ由来抗体(10mM KPO4、70mM NaCl;pH7.5からの凍結乾燥物)を、水 12mL中に溶解させ、20mM ヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0を含む溶液に対して透析して、バッファー 11mL中に300mg(2×10−6mol)を生成した(c=27.3mg/mL)。ジゴキシゲニン−PYY(3〜36)コンジュゲート(11.57mg、4×10−6mol、2当量)を、1時間以内に2.85mgで4回加え、室温でもう1時間インキュベーションした。複合体化反応の完了後、複合体を、20mM ヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中において、流速2.5ml/分で、Superdex 200 26/60 GLカラム(320mL)によるサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。溶出した複合体を、画分4mLで収集し、プールし、0.2μm フィルタを通過させて滅菌して、234mg 複合体を濃度14.3mg/mLで与えた。同様の方法で、ヒト化抗ジゴキシゲニン抗体の複合体生成について、抗体を、20mM ヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中において、濃度10.6mg/mL(0.93mL中に9.81mg、6.5×10−8mol)に調整した。0.57mg=1.97×10−7mol=3.03当量 ジゴキシゲニンポリペプチド(DIG−PYY)を、凍結乾燥物として抗体溶液に加えた。ポリペプチド及び抗体を、室温で1.5時間インキュベーションした。過剰のポリペプチドを、20mM ヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中において、流速0.5mL/分で、Superose 6 10/300 GLカラムによるサイズ排除クロマトグラフィーにより除去した。溶出した複合体を、0.5mL画分で収集し、プールし、0.2μm フィルタを通過させて滅菌して、4.7mg 複合体を濃度1.86mg/mLで与えた。
システインリンカーを含有するビオチン化PYY−ポリペプチドの非共有複合体生成について、0.16mg Ac−PYY−PEG3−Cys−PEG2−Biotを、100% DMF中において、濃度10mg/mLに溶解させた。該抗体を、50mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成されたバッファー中において、濃度10.7mg/mL(約73μM)で使用した。Ac−PYY−PEG3−Cys−PEG2−Biotと抗体とを、モル比2.5:1(抗体に対するAc−PYY−PEG3−Cys−PEG2−Biot)で混合し、RT及び350rpmで、60分間インキュベーションした。得られた複合体を、サイズ排除クロマトグラフィーにより、63% 単量体IgG様分子及び37% 二量体可溶性凝集体として規定した。得られた複合体を、更に、SDS−PAGE及びその後のウェスタンブロット分析により分析した。10μg 複合体を、4×LDSサンプルバッファー(Invitrogen)と混合し、95℃で5分間インキュベーションした。サンプルを、4〜12% Bis−Trisポリアクリルアミド−ゲル(NuPAGE, Invitrogen)にアプライし、このゲルを、200V及び120mAで35分間ランした。ポリアクリルアミド−ゲル中で分離された分子を、PVDFメンブラン(孔径0.2μm、Invitrogen)に、25V及び160mAで40分間トランスファーした。該メンブランを、1×PBST(1×PBS+0.1% Tween20)中の1%(w/v) スキムミルク中において、RTで1時間ブロッキングした。該メンブランを、1×PBST中において、3×5分間洗浄し、その後、ストレプトアビジン−POD−コンジュゲート(2900U/mL, Roche)と共にインキュベーションした。同コンジュゲートを、1:2000希釈で使用した。該メンブラン上のビオチンに結合したストレプトアビジン−PODの検出を、Lumi-Lightウェスタンブロット基質(Roche)を使用して行った。
システインリンカーを含有するフルオレセインコンジュゲートPYY−ポリペプチドの非共有複合体生成について、0.33mg Ac−PYY(PEG3−Cys−PEG2−5−Fluo)を、100% DMF中において、濃度10mg/mLに溶解させた。該抗体を、50mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.2で構成されたバッファー中において、濃度9.99mg/mL(約68μM)で使用した。Ac−PYY(PEG3−Cys−PEG2−5−Fluo)と抗体とを、モル比2.5:1(抗体に対するAc−PYY(PEG3−Cys−PEG2−5−Fluo))で混合し、RT及び350rpmで、60分間インキュベーションした。得られた混合物を、サイズ排除クロマトグラフィーにより、76% 単量体IgG様分子及び24% 二量体可溶性凝集体として規定した。得られた複合体を、更に、SDS−PAGE及びその後のポリアクリルアミド−ゲル中でのフルオレセイン関連蛍光の検出により分析した。8μg 複合体を、4×LDSサンプルバッファー(Invitrogen)と混合し、95℃で5分間インキュベーションした。フルオレセイン関連蛍光を、LumiImager F1装置(Roche)を使用して、励起波長645nmで記録した。
コンジュゲート中のポリペプチド及び抗ハプテン抗体との複合体中のポリペプチドは機能性を保持する
非共有ハプテン−ポリペプチドコンジュゲートの一部であるポリペプチド及び抗ハプテン抗体との複合体中のポリペプチドが、機能性を保持することが、以前に示されている(国際公開公報第2011/003557号、同第2011/003780号、及び国際特許出願第EP2011/074273号)。
血液脳関門−シャトルモジュールの操作
ハプテン結合二重特異性血液脳関門−シャトルモジュールを、ジスルフィド安定化ハプテン結合性一本鎖Fvを、抗TfR抗体のCH3ドメインのC末端に融合させることにより生成した。以前に記載されたのと同様の設計及び技術を適用した(例えば、国際公開公報第2014/006124号を参照のこと)。これらの血液脳関門−シャトルモジュールの組成についての例を、図7に示す。
二重特異性抗体(血液脳関門−シャトルモジュール)の発現及び精製
血液脳関門−シャトルモジュール二重特異性抗体を、先に記載された(上記を参照のこと)規定の血清フリー培地中において、哺乳類細胞中で生成した。HEK293懸濁細胞を、L−及びH−鎖コード発現プラスミドにより一過性にトランスフェクションし、血液脳関門−シャトルモジュール二重特異性抗体を発現する培養物を生成した。
二重特異性ハプテン結合性血液脳関門−シャトルモジュールはハプテン化ペイロード及び血液脳関門レセプターに同時に結合する
二重特異性抗体の血液脳関門−シャトル機能を可能にするために、同抗体は、血液脳関門の内皮細胞上の血液脳関門レセプターと、シャトル化されるべきハプテン化ペイロードとに同時に結合すべきである。本明細書で報告されたハプテン結合二重特異性抗体のこの機能性を評価するために、細胞表面及びペイロードへの同時結合性を、FACS分析により取り組んだ。これらの分析のために、血液脳関門−シャトルモジュール(=二重特異性抗体)の細胞結合性を、フィトエリスリンラベルIgG認識二次抗体により検出した。同時ペイロード結合性を、ハプテン化蛍光ペイロード(ジゴキシゲニンCy5;DIG−Cy5)の適用により検出した。TfR発現BBB由来細胞株としてhCMEC/D3細胞を使用し、蛍光ペイロードとしてDIG−Cy5を使用する、FACS分析の結果を、図9に示す。両トランスフェリンレセプター結合二重特異性抗体は、抗IgG−PE関連シグナルにより示されたように、hCMEC/D3に結合する。また同様に、両二重特異性抗体は、細胞関連Cy5起因性シグナルにより示されたように、Dig−Cy5とも同時に結合する。(高い親和性の)TfR1二重特異性抗体と(低下した親和性の)TfR2二重特異性抗体との間のシグナル強度の比較から、(予測された通りに)高い親和性を有する細胞において、中程度の親和性の二重特異性抗体と比較して、より高いシグナル強度が示される。
血液脳関門−シャトルモジュールのレセプター結合モードは脳内皮細胞からの放出に影響を及ぼす
脳内皮細胞(hCMEC/D3)を使用して、本明細書で報告されたシャトルモジュールの細胞結合性及び経細胞輸送を調査した。以前の研究(Crepin et al., 2010; Lesley et al., 1989、国際公開公報第2012/075037号、同第2014/033074号)には、TfR結合抗体の結合価及び親和性が、血液脳関門の内皮細胞に対する結合性、同細胞を通過する経細胞輸送、及び同細胞からの放出の有効性に影響を及ぼすことが報告されている。hCMEC/D3における細胞結合性及び経細胞輸送を調査するために、フィルタインサート上で培養したhCMEC/D3を、二重特異性抗体又は(対照として、ハプテン結合性scFvを含まない)親抗体と、頂端方向において、37℃で1時間インキュベーションした。単層の細胞を、血清フリー培地中において、それぞれ、頂端方向(400μL)にRTで洗浄し、基底方向(1600μL)に3〜5分間で3回洗浄した。全ての洗浄量を収集して、結合しなかったリガンド又は抗体の除去効率をモニターした。予め温めた培地を、頂端チャンバに加え、フィルタを、予め温めた培地 1600μLを含有する、(1% BSAを含有するPBSで一晩ブロッキングした)新たな12ウェルプレートに移した。この時点で、特異的取込みを決定するために、細胞を、RIPAバッファー(Sigma, Munich, Germany, #R0278) 500μL中で溶解させた。残ったフィルタを、37℃でインキュベーションし、サンプルを、種々の時点で収集して、頂端及び/又は基底での放出を決定した。サンプル中の抗体含量を、非常に高感度のIgG ELISAを使用して定量した。これらの分析結果を、図10に示す。高親和性の二価抗TfR抗体(TfR1)は、該細胞に効率的に結合するが、頂端又は基底区画に放出されない。同様に、高親和性のTfR結合部位(TfR1−Dig、TfR1−Bio)を含有する二重特異性抗体は、該細胞に効率的に結合するが、頂端又は基底区画に放出されない。対照的に、低下した親和性を有する二価抗TfR抗体(TfR2)は、該細胞に効率的に結合し、その後、頂端又は基底区画に経時的に放出される。また、低下した親和性の二価TfR結合部位(TfR2−Dig、TfR2−Bio)を含有する二重特異性抗体も、該細胞に効率的に結合し、親抗体と同程度に、頂端又は基底区画に放出される。hCMEC/D3上に存在しない抗原と結合する対照の二重特異性抗体(CD33−Dig、CD33−Bio)は、これらの細胞に結合せず、このため、頂端又は基底区画に経時的に放出されることもない。
TfRシャトルに対して低下した親和性を有する血液脳関門−シャトルモジュールは内皮細胞を通過し、経細胞輸送を支持し、ハプテン化ペイロードを放出する
脳内皮細胞(hCMEC/D3)を使用して、ハプテン結合性血液脳関門−シャトルモジュールと非共有複合体を形成するハプテン化ペイロードの細胞結合性及び経細胞輸送を調査した。非共有的に複合体化されたペイロードについて、ペイロードの経細胞輸送を本明細書で報告されたハプテン結合性血液脳関門−シャトルモジュール(二重特異性抗体)により達成することができるかどうかを評価するために、トランスウェルシステム中のhCMEC/D3細胞を、本明細書で報告された二重特異性抗体(例示的な構築物については、先の実施例を参照のこと)により複合体化されたハプテン化ペイロードに、1時間曝して、TfRと結合させた。シャトル及びペイロードを洗浄(実施例15を参照のこと)により除去した後に、結合した分子、内部移行、細胞内ソーティング、経細胞輸送、及びペイロードの放出を、シャトルモジュールについて実施例15で記載されたのと同様に、経時的(実験開始後0〜5時間=洗浄工程)にモニターした。本実施例で使用したペイロードは、モノハプテン化DNAとし、本明細書で報告された二重特異性抗体とのインキュベーションに基づいて、図11Aで示されたように、(モル)比2:1で非共有的に複合体化される。ペイロードの存在を、細胞抽出物、頂端及び基底区画中において、qPCRにより、検出及び定量することができる。例示的に、ペイロードとしての末端モノビオチン化又はモノジゴキシゲニン二重鎖DNA50mer(配列番号:140)と、Roche LightCyclerにおけるペイロード定量のための2つのPCRプライマーであるPrFor(配列番号:141)及びPrRev(配列番号:142)とを、図11Aに示す。これらの分析結果(図11B)から、非共有的に付着したハプテン化ペイロードが、細胞に結合し、内部移行し、その後、頂端及び基底区画に放出されることが証明される。結合及びその後の放出は、TfR結合性血液脳関門−シャトルモジュールにより媒介される。CD33結合性対照二重特異性抗体を適用した場合には、細胞への結合も放出も検出されない。さらに、二重特異性抗体を含まないハプテン化ペイロードを適用した場合には、細胞への結合も放出も検出されない。非共有的に複合体化されたペイロードの経細胞輸送は、二重特異性抗体及び対応するハプテン化ペイロードを含むジゴキシゲニン結合部位及びビオチン結合部位について観察された。このことは、種々のハプテンを使用して、非共有二重特異性抗体血液脳関門−シャトルモジュールを設計することができることを示している。このため、血液脳関門を通過するペイロードの経細胞輸送を、非共有的に複合体化されたハプテン化ペイロードのために、ハプテン結合二重特異性抗体を使用して達成することができる。
TfRに対して高い親和性を有する、結合部位を有する血液脳関門−シャトルモジュールは内皮細胞に結合するが、同内皮細胞から放出されなくとも、ハプテン化ペイロードの経細胞輸送及び放出を支持する
脳内皮細胞(hCMEC/D3)を使用して、先の実施例17に記載されたのと同様にして、ハプテン結合性血液脳関門−シャトルモジュールと非共有複合体を形成することができるハプテン化ペイロードの細胞結合性及び経細胞輸送を調査した。トランスウェルシステム中のHCMEC/D3細胞を、血液脳関門−シャトルモジュール(二重特異性抗体)により複合体化されたハプテン化ペイロードに、1時間曝して、TfRと結合させ、内部移行及び細胞内ソーティング、経細胞輸送をさせた。該ペイロードを、モノハプテン化DNAとし、二重特異性抗体とのインキュベーションに基づいて、図11Aで示されたように、(モル)比2:1で非共有的に複合体化される。モノビオチン化又はモノジゴキシゲニン二重鎖DNA50mer ペイロード(配列番号:140)の存在を、先の実施例17で記載されたように、細胞抽出物、頂端及び基底区画中において、qPCRにより定量した。
ハプテン化ペイロードは、小胞区画内で血液脳関門−シャトルモジュールから分離する
内皮細胞に結合するが、それ自体はこれらの細胞から放出されない血液脳関門−シャトルモジュールを含む高親和性のTfR結合部位(TfR1)についての経細胞輸送アッセイ法により、驚くべき結果が示された。シャトルモジュール自体が細胞に付着したままであり/同細胞に含まれたままであっても、ハプテン化ペイロードは、細胞を通過してシャトルされ、頂端及び基底区画に放出された。細胞結合、取込み、及びペイロードの分布を媒介した二重特異性抗体を、共焦点顕微鏡観察により分析した。このため、脳内皮細胞(hCMEC/D3)を、二重特異性複合体化されたハプテン化蛍光ペイロード(ハプテン−Cy5又はハプテン−DNA−Cy5)に曝し、共焦点蛍光顕微鏡観察により分析した。したがって、hCMEC/D3細胞を、顕微鏡観察グレードのカバーガラスに撒き、50nM 二重特異性抗体複合体化されたハプテン化蛍光ペイロードと共に、細胞培養培地中において、37℃で3時間インキュベーションした。ついで、細胞を洗浄し、固定し(4% パラホルムアルデヒド)、シャトルモジュールのIgG部分を、抗カッパ軽鎖特異性抗体、続けて、ALEXA Fluor 488にコンジュゲートさせた二次抗体により対比染色することにより検出した。画像を、LEICA SP5x共焦点顕微鏡において、ALEXAFluor488(IgG)及びCY5(ハプテン−DNA−CY5ペイロード)に適したバンドパスフィルタ設定を使用する100x/1.46NA対物レンズを使用して取得した。これらの分析結果を、図13に示す。高親和性の二重特異性抗体と蛍光ラベルハプテン化ペイロード(DNA−Cy5)との複合体は、TfRに結合し、最初に細胞表面上に位置する。その後、同複合体は、その同起源レセプターと共に内部移行し、細胞内の小胞区画、すなわち、エンドソーム及びリソソームに現れる。内部移行直後(3時間)、ハプテン化ペイロードによる蛍光シグナルからの、シャトルモジュールによる蛍光シグナルの実質的な分離が観察された。このため、本明細書で報告された血液脳関門−シャトルモジュールとハプテン化ペイロードとの非共有複合体は、細胞内で、異なる小胞区画に解離することができる。これにより、該ペイロードは、シャトルモジュールが細胞に結合したままであり/同細胞に保持されたままであっても、シャトルモジュールから放出され、経細胞輸送により内皮細胞から出ることができる。非共有的に複合体化されたハプテン化ペイロードの細胞内分離が、ジゴキシゲニン結合性及びビオチン結合性の血液脳関門−シャトルモジュール(二重特異性抗体)及び対応するハプテン化ペイロードについて観察された。このため、種々のハプテンを使用して、ペイロードを経細胞輸送することができる、ハプテン化ペイロードと血液脳関門−シャトルモジュールとの非共有複合体を設計することができる。
ペプチドYYを含有するHeliCarモチーフアミノ酸配列
ペプチドYYは、摂食に応じて、回腸及び結腸における細胞により放出される短い(36個のアミノ酸)ペプチドである。ヒトにおいて、ペプチドYYは、食欲を低下させると考えられる。最も一般的な形態の循環型PYYは、PYY3〜36である。PYY3〜36は、YファミリーレセプターのY2レセプター(Y2R)に結合する。PYYは、消化管、特に、回腸及び結腸の粘膜におけるL細胞に見出される。また、少量の、約1〜10% PYYが、食道、胃、十二指腸、及び空腸に見出される。循環において、PYY濃度は、食物摂取後に増大し、絶食中に低下する。PYYは、NPYレセプターを介して、その作用を発揮し、胃運動を阻害し、結腸における水及び電解質の吸収を増大させる。PYY及びPYY模倣物は、肥満に取り組むのに使用されてきた。
PYY3〜36の構造調査(Nygaard, R., et al., Biochem. 45 (2006) 8350-8357;配列番号:143)から、中心アミノ酸についてのらせん状モチーフ(HeliCar様モチーフアミノ酸配列)が明らかとなっている。N末端イソロイシン及び修飾C末端は、該ペプチドの機能性活性に必須であると記載されているため、HeliCarモチーフアミノ酸配列におけるアミノ酸を反映させるために、中心へリックスを改変した。
抗HeliCarモチーフアミノ酸配列抗体と化合物を含有するHeliCarモチーフアミノ酸配列との間の複合体のin vitro及びin vivoでの安定性を増大させるために、結合性に基づくジスルフィド架橋の形成が使用されている。
立体障害のリスクを最少化し、強力な親和性を低下させるのに適した位置を特定するために、HeliCarモチーフアミノ酸配列中に人工のシステイン残基を導入するための種々の位置が試験されている。システイン残基は、変異していないパラトープの主要部分を有するために、12mer(HeliCarモチーフアミノ酸配列)のC末端に導入されてきた。該ペプチドを合成し、蛍光モチーフに融合させた。
を有する。
を有する。
を有する。
を有する。
二価抗体0155を、HEK293細胞中において、遊離したシステインを含まないその親分子Y2R(bck)−0019と同様に発現させる。改変抗体を、抗体0019で使用したのと同じプロトコールを使用して精製する。質量分光分析から、脱グルコシル化抗体の実験的に決定された質量が、142,001Daであることが示される。この質量は、算出質量より259Da過剰である。還元型鎖は、48,167Da(完全な重鎖、計算値48,168Da、Cys=SH、C末端=−K)及び22,720Da(完全な軽鎖、N55C、計算値22,720Da、Cys=SH)の実験的に決定された質量を有する。該鎖の配列を、還元後に確認した。
蛍光化合物を含有するHeliCarモチーフアミノ酸配列の抗HeliCarモチーフアミノ酸配列抗体への共有コンジュゲーションは成功した。合計約43% 抗HeliCarモチーフアミノ酸配列抗体を、2つのHeliCarモチーフアミノ酸配列に共有的にコンジュゲートした。約40% 抗HeliCarモチーフアミノ酸配列抗体が、1つのHeliCarモチーフアミノ酸配列に共有的にコンジュゲートし、約17% 抗HeliCarモチーフアミノ酸配列抗体がコンジュゲートしなかった。
抗体0155と同様に、抗体0157を、大部分がシステイン化型として発現させる。質量分光分析から、脱グルコシル化抗体の実験的に決定された質量が、141,863Daであることが示される。この質量は、算出質量より3Da過剰である。該抗体は、主に、一本鎖又は二本鎖のホモシステイン化型として存在する。還元型鎖は、48,168Da(完全な重鎖、計算値48,168Da、Cys=SH、C末端=−K)及び22,777Da(完全な軽鎖、N55C、計算値22,777Da、Cys=SH)の実験的に決定された質量を有する。該鎖の配列を、還元後に確認した。
蛍光化合物を含有するHeliCarモチーフアミノ酸配列の抗HeliCarモチーフアミノ酸配列抗体への共有コンジュゲーションは成功しなかった。理論に拘束されるものではないが、この場合には、抗体のシステイン化は、結合ポケットにおいて、蛍光化合物を含有するHeliCarモチーフアミノ酸配列を、効率的に結合させ、C51を攻撃するのに適した位置に求核チオール基を送達するには深すぎると推測される。
HeliCarベースの方法は、リコンビナントに生成した、ポリペプチドを含有するHeliCarモチーフアミノ酸配列との共有複合体の形成を考慮する時に、特に魅力的になる。
BrdU含有ペイロードとの複合体からのBrdU結合二重特異性抗体
SEC−MALLS分析を、トランスフェリンレセプター(TfR)−及びブロモデオキシウリジン(BRDU)−結合二重特異性抗体(bsAb)がBRDU含有ペイロードに結合可能であるか、そして、その程度を評価するのに適用した。したがって、BRDU−DNAを、TfR−BRDU bsAbに。化学量論比2:1(350μg:2.5mg/mL)で加え、bsAb/ペイロード−複合体を形成するために、室温で30分間インキュベーションした。対照試薬として、遊離した二重特異性抗体(2.5mg/mL)及び遊離したBRDU−DNA(3.2mg/mL)を調製した。BRDU−DNA(BRDU−ACC AAG CCT AGA GAG GAG CAA TAC AAC AGT ACA TAT CGC GTG GTA AGC GT;配列番号:153)は、DNA分子当たりに、該DNAの5’端に1つのBRDUを含有した。複合体及び対照試薬を、分析まで−80℃で保存した。
ビオチン結合二重特異性抗体はビオチン含有IgGに結合する
TfR/ビオチン二重特異性抗体がモノビオチン化全長抗体IgGに結合できるかどうか、そして、その程度を分析するために、pTauに特異的に結合するIgGアイソタイプのモノビオチン化抗体(ビオチンラベル抗pTau抗体、BIO−pTau)を、抗TfR/ビオチン二重特異性抗体に、化学量論比2:1(300μg、1.3mg/mL)で加えた。この混合物を、室温で30分間インキュベーションした(二重特異性抗体−ペイロード複合体の形成)。モノビオチン化IgGを、IgGアイソタイプのノブ−into−ホールヘテロ二量体抗体における1つの鎖のC末端にAviタグを有するIgG誘導体を生成することにより生成した。Aviタグは、規定の方法において、1つのビオチンに対して、酵素的にコンジュゲートする。
ビオチンラベル抗pTau抗体と抗TfR/ビオチン二重特異性抗体との複合体の経細胞輸送
抗TfR/ビオチン二重特異性抗体が全長抗体ペイロードの経細胞輸送を容易にするかどうか、そして、その程度を分析するために、抗TfR/ビオチン二重特異性抗体(抗TfR/ビオチンbsAb−1及び抗TfR/ビオチンbsAb−2)とBIO−pTauとの複合体を、実施例22で記載されたように形成し、例えば、実施例18で上記された経細胞輸送アッセイ法に供した。非特異的経細胞輸送についての対照として、抗CD33/ビオチン二重特異性抗体とBIO−pTauとの複合体及び遊離したBIO−pTauを、平行して試験した。頂端及び基底区画のサンプル及び細胞ライゼートのサンプルを、細胞のローディング後0、1、2、3、4、及び5時間後に取得した。ローディングは、常に3.8μg/mLとした。
二重特異性抗ヒトTau(pS422)/ビオチン抗体とビオチン化抗TfR抗体Fabフラグメントとの複合体の経細胞輸送
上記で示された実施例と同様に、二重特異性抗ヒトTau(pS422)/ビオチン抗体とビオチン化抗TfR抗体Fabフラグメントとの非共有複合体の経細胞輸送を解明した。結果を、図21に示す。分析のために、ヒトTau(pS422)を、プレートに固定し、抗ヒトCH2を、二次抗体として使用した。検出を、抗ジゴキシゲニン抗体PODコンジュゲートにより行った。
Claims (28)
- ヒトTau(pS422)に特異的に結合する抗体の血液脳関門を通過する輸送のための、ヒトTau(pS422)に特異的に結合するハプテン化抗体と、抗血液脳関門レセプター/ハプテン二重特異性抗体との非共有複合体の使用。
- ヒトTau(pS422)に特異的に結合する抗体の血液脳関門を通過する輸送のための、ヒトTau(pS422)及びハプテンに特異的に結合する二重特異性抗体と、ハプテン化抗血液脳関門レセプター抗体との非共有複合体の使用。
- ヒトTau(pS422)に特異的に結合する抗体の血液脳関門を通過する輸送のための、ヒトTau(pS422)に特異的に結合するハプテン化抗体と、二重特異性抗体とを含む非共有複合体の使用であって、前記二重特異性抗体が、ヒトTau(pS422)に特異的に結合するハプテン化抗体のハプテンに特異的に結合する第1の結合特異性と、血液脳関門レセプターに特異的に結合する第2の結合特異性とを有し、ここで、前記ヒトTau(pS422)に特異的に結合するハプテン化抗体が、前記二重特異性抗体の第1の結合特異性により特異的に結合している、非共有複合体の使用。
- ヒトTau(pS422)に特異的に結合する抗体の血液脳関門を通過する輸送のための、血液脳関門レセプターに特異的に結合するハプテン化抗体と、二重特異性抗体とを含む非共有複合体の使用であって、前記二重特異性抗体が、ヒトTau(pS422)に特異的に結合する第1の結合特異性と、血液脳関門レセプターに特異的に結合するハプテン化抗体のハプテンに特異的に結合する第2の結合特異性とを有し、ここで、前記血液脳関門レセプターに特異的に結合するハプテン化抗体が、前記二重特異性抗体の第1の結合特異性により特異的に結合している、非共有複合体の使用。
- 前記ハプテン化抗体が、ビオチン化抗体又はジゴキシゲニン抗体である、請求項1〜4のいずれか一項記載の使用。
- 前記血液脳関門レセプターが、トランスフェリンレセプター(TfR)又は低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質8(LRP8)である、請求項1〜5のいずれか一項記載の使用。
- 前記二重特異性抗体が、
a)ハプテン化抗体のハプテンに対する1つの結合部位と血液脳関門レセプターに対する1つの結合部位、又は
b)ハプテン化抗体のハプテンに対する2つの結合部位と血液脳関門レセプターに対する1つの結合部位、又は
c)ハプテン化抗体のハプテンに対する1つの結合部位と血液脳関門レセプターに対する2つの結合部位、又は
d)ハプテン化抗体のハプテンに対する2つの結合部位と血液脳関門レセプターに対する2つの結合部位、又は
e)ハプテン化抗体のハプテンに対する1つの結合部位とヒトTau(pS422)に対する1つの結合部位、又は
f)ハプテン化抗体のハプテンに対する2つの結合部位とヒトTau(pS422)に対する1つの結合部位、又は
g)ハプテン化抗体のハプテンに対する1つの結合部位とヒトTau(pS422)に対する2つの結合部位、又は
h)ハプテン化抗体のハプテンに対する2つの結合部位とヒトTau(pS422)に対する2つの結合部位
を含み、
ここで、b)、c)、f)、及びg)の場合には、二重特異性抗体の1つの重鎖がホールの変異を含み、各他の鎖がノブの変異を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の使用。 - 前記二重特異性抗体が、ハプテン化抗体のハプテンに特異的に結合する2つの結合特異性(2つの抗ハプテン結合特異性)と、(ヒト)トランスフェリンレセプターに特異的に結合する2つの結合特異性(2つの抗(ヒト)トランスフェリンレセプター結合特異性)又は低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質8に特異的に結合する結合特異性(抗低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質8結合特異性)とを有する、請求項1〜7のいずれか一項記載の使用。
- 前記ヒトTau(pS422)に特異的に結合する抗体が、
i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauに特異的に結合する、請求項1〜8のいずれか一項記載の使用。 - 前記ヒトTau(pS422)に特異的に結合する抗体が、
a)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、18、及び10のHVR、又は
b)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、09、及び10のHVR
を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の使用。 - 前記ヒトTau(pS422)に特異的に結合する抗体が、更に、
a)軽鎖可変ドメインに、配列番号:13、14、及び15のHVR、又は
b)軽鎖可変ドメインに、配列番号:12、05、及び15のHVR
を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の使用。 - 前記ヒトTau(pS422)に特異的に結合する抗体が、
a)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、18、及び10のHVR、及び、軽鎖可変ドメインに、配列番号:13、14、及び15のHVR、又は
b)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、09、及び10のHVR、及び、軽鎖可変ドメインに、配列番号:12、05、及び15のHVR、又は
c)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、09、及び10のHVR、及び、軽鎖可変ドメインに、配列番号:13、14、及び15のHVR
を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の使用。 - 前記ヒトTau(pS422)に特異的に結合する抗体が、
a)配列番号:20の重鎖可変ドメイン及び配列番号:17の軽鎖可変ドメイン、又は
b)配列番号:19の重鎖可変ドメイン及び配列番号:16の軽鎖可変ドメイン、又は
c)配列番号:19の重鎖可変ドメイン及び配列番号:17の軽鎖可変ドメイン、又は
d)配列番号:21の重鎖可変ドメイン及び配列番号:17の軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の使用。 - ヒトTau(pS422)に特異的に結合するハプテン化抗体と、抗血液脳関門レセプター/ハプテン二重特異性抗体との非共有複合体。
- ヒトTau(pS422)及びハプテンに特異的に結合する二重特異性抗体と、ハプテン化抗血液脳関門レセプター抗体との非共有複合体。
- ヒトTau(pS422)に特異的に結合するハプテン化抗体と、二重特異性抗体とを含む非共有複合体であって、前記二重特異性抗体が、ヒトTau(pS422)に特異的に結合するハプテン化抗体のハプテンに特異的に結合する第1の結合特異性と、血液脳関門レセプターに特異的に結合する第2の結合特異性とを有し、ここで、前記ヒトTau(pS422)に特異的に結合するハプテン化抗体が、前記二重特異性抗体の第1の結合特異性により特異的に結合している、非共有複合体。
- 血液脳関門レセプターに特異的に結合するハプテン化抗体と、二重特異性抗体とを含む非共有複合体であって、二重特異性抗体が、ヒトTau(pS422)に特異的に結合する第1の結合特異性と、血液脳関門レセプターに特異的に結合するハプテン化抗体のハプテンに特異的に結合する第2の結合特異性とを有し、ここで、前記血液脳関門レセプターに特異的に結合するハプテン化抗体が、前記二重特異性抗体の第2の結合特異性により特異的に結合している、非共有複合体。
- 前記ハプテン化抗体が、ビオチン化抗体又はジゴキシゲニン抗体である、請求項14〜17のいずれか一項記載の非共有複合体。
- 前記血液脳関門レセプターが、トランスフェリンレセプター(TfR)である、請求項14〜18のいずれか一項記載の非共有複合体。
- 前記二重特異性抗体が、
a)ハプテン化抗体のハプテンに対する1つの結合部位と血液脳関門レセプターに対する1つの結合部位、又は
b)ハプテン化抗体のハプテンに対する2つの結合部位と血液脳関門レセプターに対する1つの結合部位、又は
c)ハプテン化抗体のハプテンに対する1つの結合部位と血液脳関門レセプターに対する2つの結合部位、又は
d)ハプテン化抗体のハプテンに対する2つの結合部位と血液脳関門レセプターに対する2つの結合部位、又は
e)ハプテン化抗体のハプテンに対する1つの結合部位とヒトTau(pS422)に対する1つの結合部位、又は
f)ハプテン化抗体のハプテンに対する2つの結合部位とヒトTau(pS422)に対する1つの結合部位、又は
g)ハプテン化抗体のハプテンに対する1つの結合部位とヒトTau(pS422)に対する2つの結合部位、又は
h)ハプテン化抗体のハプテンに対する2つの結合部位とヒトTau(pS422)に対する2つの結合部位
を含み、
ここで、b)、c)、f)、及びg)の場合には、二重特異性抗体の1つの重鎖がホールの変異を含み、各他の鎖がノブの変異を含む、請求項14〜19のいずれか一項記載の非共有複合体。 - 前記二重特異性抗体が、ハプテン化抗体のハプテンに特異的に結合する2つの結合特異性(2つの抗ハプテン結合特異性)と、(ヒト)トランスフェリンレセプターに特異的に結合する2つの結合特異性(2つの抗(ヒト)トランスフェリンレセプター結合特異性)又は低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質8に特異的に結合する結合特異性(抗低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質8結合特異性)とを有する、請求項14〜20のいずれか一項記載の非共有複合体。
- 前記ヒトTau(pS422)に特異的に結合する抗体が、
i)配列番号:03のアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に結合し、及び/又は
ii)全長ヒトTau(配列番号:01)に1μg/mLでは結合せず、及び/又は
iii)422位のセリンにおいてリン酸化されている全長ヒトTau(配列番号:02)に特異的に結合し、及び/又は
iv)422位のセリンにおいてリン酸化されているヒトTau(配列番号:02)の凝集体に特異的に結合し、及び/又は
v)配列番号:01のアミノ酸配列を有し、アミノ酸変異S422Aを有するヒトTauに特異的に結合する、
請求項14〜21のいずれか一項記載の非共有複合体。 - 前記ヒトTau(pS422)に特異的に結合する抗体が、
a)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、18、及び10のHVR、又は
b)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、09、及び10のHVR
を含む、請求項14〜22のいずれか一項記載の非共有複合体。 - 前記ヒトTau(pS422)に特異的に結合する抗体が、更に、
a)軽鎖可変ドメインに、配列番号:13、14、及び15のHVR、又は
b)軽鎖可変ドメインに、配列番号:12、05、及び15のHVR
を含む、請求項14〜23のいずれか一項記載の非共有複合体。 - 前記ヒトTau(pS422)に特異的に結合する抗体が、
a)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、18、及び10のHVR、及び、軽鎖可変ドメインに、配列番号:13、14、及び15のHVR、又は
b)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、09、及び10のHVR、及び、軽鎖可変ドメインに、配列番号:12、05、及び15のHVR、又は
c)重鎖可変ドメインに、配列番号:08、09、及び10のHVR、及び、軽鎖可変ドメインに、配列番号:13、14、及び15のHVR
を含む、請求項14〜24のいずれか一項記載の非共有複合体。 - 前記ヒトTau(pS422)に特異的に結合する抗体が、
a)配列番号:20の重鎖可変ドメイン及び配列番号:17の軽鎖可変ドメイン、又は
b)配列番号:19の重鎖可変ドメイン及び配列番号:16の軽鎖可変ドメイン、又は
c)配列番号:19の重鎖可変ドメイン及び配列番号:17の軽鎖可変ドメイン、又は
d)配列番号:21の重鎖可変ドメイン及び配列番号:17の軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項14〜25のいずれか一項記載の非共有複合体。 - 医薬として使用するための、請求項14〜26のいずれか一項記載の非共有複合体。
- アルツハイマー病を処置するのに使用するための、請求項14〜26のいずれか一項記載の非共有複合体。
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