JP2017506218A - 無菌クロマトグラフィーおよび製造方法 - Google Patents

無菌クロマトグラフィーおよび製造方法 Download PDF

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Abstract

本明細書に、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を用いてクロマトグラフィーを実行する方法であって、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含むクロマトグラフィーカラムを準備すること；このカラムによって、クロマトグラフィー樹脂を変性用緩衝液に曝露することを含む第１のサイクルのクロマトグラフィーを実行すること；およびこのカラムによって少なくとも１つの追加のサイクルのクロマトグラフィーを実行することを含む、方法が提供される。また、組換えタンパク質を製造するための一体化され、クローズドなまたは実質的にクローズドな、連続的な方法も提供され、この方法はガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含む少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムの使用を含み、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂は本方法において各サイクル中に変性用緩衝液に曝露され、低減したバイオバーデンの緩衝液が本方法に使用される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１月１７日に出願された米国仮特許出願６１／９２８，９０６号の優先権を主張し、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
本発明は、組換えタンパク質に関するバイオテクノロジーおよびバイオ製造の方法に関する。
組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳類細胞は、しばしば、治療用または商業用に重要なタンパク質を製造するために使用されている。多様な製品パイプラインに関する現在の環境において、バイオテクノロジー系の会社は、非常に自由度が高くて対費用効果の良い治療用タンパク質原薬製造のための革新的な解決策の開発へと増々駆り立てられている。組換えタンパク質を効率的に単離する方策の１つは、（例えば、閉鎖系を用いる）連続クロマトグラフィーを包含するプロセスによるものである。連続クロマトグラフィーの１つの知られている制限は、夾雑製品、生産収率の低下、および系内の流量の減少（または圧力の上昇）をもたらすことになる系内の夾雑する作用物質（例えば、増大したバイオバーデン）の存在である。例えば、系内の増大したバイオバーデンはその系の完全なシャットダウンを引き起こす可能性がある。
本発明は、少なくとも部分的に、クロマトグラフィー樹脂のガンマ線照射の結果その樹脂の結合能力が低下する（例えば、樹脂の結合能力は複数のサイクルのクロマトグラフィーの間着実に低下する）こと、およびガンマ線照射された樹脂の結合能力はその樹脂を変性用緩衝液に曝露することによって回復することができるという発見に基づいている。この発見に鑑みて、本明細書に、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を用いてクロマトグラフィーを実行する方法であって、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含むクロマトグラフィーカラムを準備すること；カラムによって、クロマトグラフィー樹脂を変性用緩衝液に曝露することを含む第１のサイクルのクロマトグラフィーを実行すること；およびカラムによって少なくとも１つの追加のサイクルのクロマトグラフィーを実行すること：を含む、方法が提供される。また、組換えタンパク質を製造するための一体化され、クローズドなまたは実質的にクローズドな、連続的な方法であって、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含む少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムの使用を含み、ここでガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂は本方法における各サイクル中変性用緩衝液に曝露され、低減したバイオバーデンの緩衝液が本方法で使用される、方法も提供される。本明細書に記載されている方法およびプロセスのいずれも、（本明細書中に定義されている）低減したバイオバーデンの、無菌、殺菌した、または絶対的に無菌の方法またはプロセスであることができる。本明細書に記載されている方法およびプロセスのいずれも殺菌および低減したバイオバーデン、無菌、または絶対的に無菌の組合せであることができる。
本明細書に、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を用いてクロマトグラフィーを実行する方法であって、（ａ）ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含有するクロマトグラフィーカラムを準備すること；（ｂ）カラムによって、クロマトグラフィー樹脂を変性用緩衝液に曝露することを含む第１のサイクルのクロマトグラフィーを実行すること；および（ｃ）カラムによって少なくとも１つの追加のサイクルのクロマトグラフィーを実行すること：を含む、方法が提供される。これらの方法のいくつかの実施形態において、（ｂ）および／または（ｃ）におけるサイクルを実行することは、（ａ）組換えタンパク質を含有する液体にクロマトグラフィー樹脂を曝露することにより組換えタンパク質を捕獲する工程；（ｂ）クロマトグラフィー樹脂を洗浄用緩衝液に曝露することによりクロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程；（ｃ）クロマトグラフィー樹脂を溶出緩衝液に曝露することにより組換えタンパク質を溶出する工程；および（ｄ）クロマトグラフィー樹脂を変性用緩衝液に曝露することによりクロマトグラフィー樹脂を再生する工程：を含む。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、組換えタンパク質を含有する液体は液体培養培地である。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、（ｂ）および（ｃ）におけるサイクルは閉鎖され一体化されたシステムを用いて実行される。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、緩衝液は低減したバイオバーデンの緩衝液（例えば、ろ過により調製される低減したバイオバーデンの緩衝液）である。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、変性用緩衝液は尿素、グアニジン塩酸塩、およびＴｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ−１００のうち１つまたはそれ以上を含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、（ｂ）のサイクルは、変性用緩衝液への曝露後約０．５Ｍ〜約１．５Ｍの水酸化ナトリウムを含む洗浄用緩衝液にクロマトグラフィー樹脂を曝露することをさらに含む。タンパク質リガンドを含むアフィニティークロマトグラフィー樹脂を使用するいくつかの実施形態において、（ｂ）のサイクルは、約１ｍＭ〜約１００ｍＭの水酸化ナトリウムを含む洗浄用緩衝液にクロマトグラフィー樹脂を曝露することをさらに含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、カラムはマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）（例えば、定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ）の一部である。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、クロマトグラフィー樹脂はアニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、またはこれらの任意の組合せである。いくつかの例において、クロマトグラフィー樹脂はアニオン交換クロマトグラフィー樹脂である。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、クロマトグラフィー樹脂は約１０ｋＧｙ〜約４０ｋＧｙ（例えば、約１５ｋＧｙ〜約３５ｋＧｙ、または約２０ｋＧｙ〜約３０ｋＧｙ）の線量のガンマ線照射で処理されている。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、４またはそれ以上（例えば、９またはそれ以上、１４またはそれ以上、１９またはそれ以上、２４またはそれ以上、２９またはそれ以上、または３９またはそれ以上）の追加のサイクルのクロマトグラフィーが実行される。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、工程（ｃ）は少なくとも４日（例えば、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１４日、または少なくとも２８日）の期間にわたって実行される。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、組換えタンパク質は組換え治療用タンパク質である。
また、精製された組換えタンパク質を製造するための一体化され、クローズドなまたは実質的にクローズドな、連続的な方法であって、（ａ）組換えタンパク質を含み、実質的に細胞を含まない液体培養培地を準備すること；および（ｂ）各サイクル中に変性用緩衝液に曝露されるガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含有する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムを含むマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）に液体培養培地を連続的に供給すること；を含み、本方法は低減したバイオバーデンの緩衝液を利用し、一体化されており、液体培養培地から精製された組換えタンパク質であるＭＣＣＳからの溶出液まで連続的に稼動する、方法が提供される。これらの方法のいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳは少なくとも２つの異なる単位操作を実行する。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、ＭＣＣＳはカラムの切り替えを包含する。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ内の全てのカラムがガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含有する。
本明細書に記載の任意の方法のいくつかの例において、ＭＣＣＳは組換えタンパク質を捕獲する、およびウィルスを不活化するという単位操作、または組換えタンパク質を捕獲し精製するという単位操作を実行する。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳは定期的向流クロマトグラフィーシステムである。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、ＭＣＣＳはアフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、もしくは疎水性相互作用クロマトグラフィー、またはこれらの任意の組合せのための複数のカラムを含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳはアフィニティークロマトグラフィーのためのカラムを含み、アフィニティークロマトグラフィーは、プロテインＡ結合捕獲機構、基質結合捕獲機構、抗体または抗体フラグメント結合捕獲機構、アプタマー結合捕獲機構、および補因子結合捕獲機構：からなる群から選択される捕獲機構によって実行される。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、アフィニティークロマトグラフィーはプロテインＡ結合捕獲機構によって実行され、組換えタンパク質は抗体または抗体フラグメントである。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、組換えタンパク質は治療用組換えタンパク質である。本明細書に記載されているいずれかの方法のいくつかの実施形態は精製された組換えタンパク質を医薬組成物中に配合することをさらに含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、変性用緩衝液は尿素、グアニジン塩酸塩、およびＴｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ−１００のうち１つまたはそれ以上を含む。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの例において、クロマトグラフィー樹脂は各サイクルで変性用緩衝液への曝露後約０．５Ｍ〜約１．５Ｍの水酸化ナトリウムを含む洗浄用緩衝液に曝露される。
また、組換えタンパク質を製造するための一体化され、クローズドなまたは実質的にクローズドな、連続的な方法であって、（ａ）実質的に細胞を含まない、組換えタンパク質を含む液体培養培地を準備すること；（ｂ）液体培養培地を第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ１）に連続的に供給すること；（ｃ）ＭＣＣＳ１を用いて液体培養培地から組換えタンパク質を捕獲すること；（ｄ）ＭＣＣＳ１から組換えタンパク質を含む溶出液を生産し、溶出液を第２のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ２）に連続的に供給すること；（ｅ）組換えタンパク質を溶出液からＭＣＣＳ２に連続的に供給し、その後組換えタンパク質を溶出することにより、精製された組換えタンパク質を生産すること：を含み、ここで：本方法は低減したバイオバーデンの緩衝液を利用し、一体化されており、かつ液体培養培地から精製された組換えタンパク質まで連続的に稼動し、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内の少なくとも１つのカラムはガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含有するクロマトグラフィーカラムであり、クロマトグラフィー樹脂は本方法において各サイクル中に変性用緩衝液に曝露される、方法が提供される。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は少なくとも２つの異なる単位操作を実行する。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、ＭＣＣＳ１もしくはＭＣＣＳ２、または両方の使用はカラム切り替えを包含する。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ１は、組換えタンパク質を捕獲する、およびウィルスを不活化するという単位操作をさらに実行する。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ２は組換えタンパク質を精製する、およびポリッシュするという単位操作を実行する。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は少なくとも２つのクロマトグラフィーカラムを利用する。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、ＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２内のクロマトグラフィーカラム（複数可）は全てガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含有するクロマトグラフィーカラムである。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、ＭＣＣＳ１は第１の定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ１）である。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、捕獲はアフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、もしくはサイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、またはこれらの任意の組合せを用いて実行される。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、捕獲は、プロテインＡ結合捕獲機構、基質結合捕獲機構、抗体または抗体フラグメント結合捕獲機構、アプタマー結合捕獲機構、および補因子結合捕獲機構：の群から選択される捕獲機構を有するアフィニティークロマトグラフィーを用いて実行される。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーはプロテインＡ結合捕獲機構によって実行され、組換えタンパク質は抗体または抗体フラグメントである。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ２は第２の定期的向流（ＰＣＣＳ２）クロマトグラフィーシステムである。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、組換えタンパク質は治療用の組換えタンパク質である。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態は、精製された組換えタンパク質を医薬組成物中に配合することをさらに含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、本方法は少なくとも４日（例えば、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１４日、または少なくとも２８日）の期間連続的に実行される。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、クロマトグラフィー樹脂はアニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、またはこれらの任意の組合せである。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、クロマトグラフィー樹脂はアニオン交換クロマトグラフィー樹脂である。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの例において、クロマトグラフィー樹脂は約１０ｋＧｙ〜約４０ｋＧｙ（例えば、約１５ｋＧｙ〜約３５ｋＧｙ、または約２０ｋＧｙ〜約３０ｋＧｙ）の線量のガンマ線照射で処理されている。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、変性用緩衝液は尿素、グアニジン塩酸塩、およびＴｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ−１００のうち１つまたはそれ以上を含む。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、クロマトグラフィー樹脂は変性用緩衝液への曝露後約０．５Ｍ〜約１．５Ｍの水酸化ナトリウムを含む洗浄用緩衝液に曝露される。クロマトグラフィー樹脂がタンパク質リガンド（例えば、プロテインＡリガンド）を有するアフィニティー樹脂である、本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、クロマトグラフィー樹脂は変性用緩衝液への曝露後約１ｍＭ〜約１００ｍＭの水酸化ナトリウムを含む洗浄用緩衝液に曝露される。
本明細書で使用される場合、名詞の前の単語不定冠詞「１つの」はその特定の名詞の１つまたはそれ以上を表す。例えば、句「クロマトグラフィーカラム」は「１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム」を表す。
用語「ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂」は、ガンマ線照射に曝露されたクロマトグラフィー樹脂を意味する。例えば、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂は、クロマトグラフィー樹脂のバイオバーデンを低減するのに充分な量のガンマ線照射に曝露されたクロマトグラフィー樹脂であることができる。いくつかの例において、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂は、約１ｋＧｙ〜約１５ｋＧｙの線量、約１ｋＧｙ〜約２０ｋＧｙの線量のガンマ線照射、約１ｋＧｙ〜約２５ｋＧｙの線量のガンマ線照射、約１ｋＧｙ〜約３０ｋＧｙの線量のガンマ線照射、または約１ｋＧｙ〜約３５ｋＧｙの線量のガンマ線照射に曝露されている。ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂は約１×１０−６、１×１０−７、１×１０−８、１×１０−９、または１×１０−１０未満の滅菌保証レベルを有することができる。クロマトグラフィー樹脂にガンマ線照射する代表的な方法は本明細書に記載されている。クロマトグラフィー樹脂にガンマ線照射する追加の方法は当技術分野で公知である。
用語「ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含有する、または含むクロマトグラフィーカラム」は、（本明細書中に定義されているような）ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含むクロマトグラフィーカラムを意味する。例えば、かかるクロマトグラフィーカラムは、約１ｋＧｙ〜約１５ｋＧｙの線量、約１ｋＧｙ〜約２０ｋＧｙの線量のガンマ線照射、約１ｋＧｙ〜約２５ｋＧｙの線量のガンマ線照射、約１ｋＧｙ〜約３０ｋＧｙの線量のガンマ線照射、または約１ｋＧｙ〜約３５ｋＧｙの線量のガンマ線照射に曝露されているガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含むことができる。例えば、かかるクロマトグラフィーカラムは、約１×１０−６、１×１０−７、１×１０−８、１×１０−９、または１×１０−１０未満の滅菌保証レベルを有するガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含有することができる。いくつかの実施形態において、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含有する、または含むクロマトグラフィーカラムは（本明細書中に定義されているように）低減したバイオバーデンを有するか、または無菌もしくは絶対的に無菌であるか、または殺菌されている（すなわち、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含有する、または含むクロマトグラフィーカラムの内面および内容物は低減したバイオバーデンを有するか、無菌であるか、絶対的に無菌であるか、または殺菌されている）。いくつかの実施形態において、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含有する、または含むクロマトグラフィーカラムは殺菌されており、低減したバイオバーデンを有し、無菌であり、または絶対的に無菌である。
用語「変性用緩衝液」は、タンパク質の変性を引き起こす充分な量の１つまたはそれ以上の化学的作用物質（例えば、洗剤（複数可）、還元剤（複数可）、酸（複数可）、塩基（複数可）、カオトロピック剤（複数可）、有機溶媒（複数可）、もしくは架橋剤（複数可）、またはこれらの任意の組合せ）を含む液体を意味する。変性用緩衝液の非限定例は本明細書に記載されている。変性洗浄用緩衝液の追加の例は当技術分野で公知である。タンパク質の変性を検出する（例えば、タンパク質の変性を直接に（例えば、分光学）または間接的に（例えば、タンパク質活性（例えば、酵素活性またはタンパク質結合活性）アッセイ（複数可）を通して）検出する）方法も当技術分野で周知である。タンパク質の変性を検出する方法の非限定例も本明細書に記載されている。本明細書に記載の方法またはプロセスのいずれかにおいて、変性用緩衝液は、ガンマ線殺菌されたクロマトグラフィー樹脂（例えば、本明細書に記載されているクロマトグラフィー樹脂のいずれかまたはクロマトグラフィー樹脂の組合せ）を含むクロマトグラフィーカラムを再生するために使用することができる。
用語「低減したバイオバーデンの緩衝液」は、未処理の同じ液体中に見られる自己複製する生物学的夾雑性作用物質（複数可）のレベル未満のレベルの自己複製する生物学的夾雑性作用物質（複数可）を有する処理された（例えば、ろ過された、オートクレーブ処理された、またはガンマ線照射された）液体（例えば、処理された緩衝溶液）を意味する。自己複製する生物学的夾雑物質の非限定例は細菌（例えば、グラム陽性もしくはグラム陰性細菌、または細菌もしくは真菌胞子）、マイコバクテリア、ウィルス（例えば、ベシウィルス、Ｃａｃｈｅ Ｖａｌｌｅｙウィルス、パルボウィルス、ヘルペスウィルス、およびブニヤウィルス）、寄生虫、菌類、酵母、および原虫であることができる。例えば、低減したバイオバーデンの緩衝液は約または１×１０−６未満、１×１０−７未満、１×１０−８未満、１×１０−９未満、もしくは１×１０−１０未満の滅菌保証レベルを有することができる。
「絶対無菌」または「絶対的に無菌」は自己複製する生物学的夾雑物を完全に含まない組成物または方法を記述するために使用される用語である。例えば、この用語は、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂、クロマトグラフィーカラムの内面および内容物（例えば、クロマトグラフィー樹脂）、および／または緩衝液に適用することができる。絶対的に無菌の組成物または方法は（当技術分野で公知のように）クリーンであることができる。
「無菌の」または「無菌」は約または１．０×１０−６未満（例えば、約または１．０×１０−７未満、約または１．０×１０−８未満、約または１．０×１０−９もしくは１×１０−１０未満）の滅菌保証レベルを有する組成物または方法を記述するのに使用される用語である。組成物または方法が無菌であるかどうかの決定は当技術分野で公知の多くの確認された生産方法を用いて試験することができる。例えば、無菌の組成物または方法は生きている自己複製する生物学的夾雑物（例えば、本明細書に記載されている自己複製する生物学的夾雑物のいずれか）を完全に含まないことができる。無菌の組成物または方法もまた（当技術分野で公知のように）クリーンであることができる。
用語「滅菌」は組成物を（本明細書に定義されているように）無菌にするのに使用される確立された方法を意味する。ある組成物に対して（本明細書に定義されている）無菌が達成されたかどうかを決定するために、処理プロセス中耐性指示菌の自己複製する生物学的夾雑物（例えば、細菌）の不活化率を測定することができる。
用語「滅菌保証レベル」すなわち「ＳＡＬ」は業界で公知であり、１つのバッチの処理単位で絶対無菌を達成する信頼度レベルを意味する。この確率は通常、検証中に実行される不活化研究の結果に基づいて計算され、１×１０−ｎの形で表される。
用語「殺菌した」は、疾患を引き起こすかまたは症状を引き起こす自己複製する生物学的夾雑物質および／またはタンパク質（例えば、本明細書に記載の自己複製する生物学的夾雑物質、毒素（例えば、エンドトキシン）、または炎症性タンパク質のいずれか）を含まない組成物または方法を記述するために使用される。殺菌した組成物または方法も（当該用語が当技術分野で公知のように）クリーンであることができる。
用語「サイクルのクロマトグラフィー」または「クロマトグラフィーサイクル」は専門用語であり、単一のクロマトグラフィーカラムを用いる単一回のクロマトグラフィーで実行される全ての工程を意味する。例えば、１サイクルのクロマトグラフィーは、クロマトグラフィーカラムを緩衝液で平衡化し、組換えタンパク質を含むサンプルをクロマトグラフィーカラムに通し、組換えタンパク質をクロマトグラフィーカラムから溶出し、変性用緩衝液をカラムに通すことによりクロマトグラフィーカラムを洗浄する工程を含むことができる。クロマトグラフィーのサイクルで実行される工程の追加の例は本明細書に記載されている。クロマトグラフィーのサイクルで実行される工程のさらなる例も当技術分野で周知である。
用語「単位操作」は専門用語であり、液体培養培地から組換えタンパク質を精製する方法において実行することができる機能的な工程を意味する。例えば、一単位の動作は、ろ過すること（例えば、夾雑物細菌、酵母、ウィルスもしくはマイコバクテリア、および／または、組換えタンパク質を含む流体から出てくる微粒子状物質の除去）、捕獲すること、エピトープタグ除去、精製すること、保持もしくは貯蔵すること、ポリッシュすること、ウィルス不活性化、組換えタンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨを調節すること、ならびに、望ましくない塩を除去することであってよい。
用語「捕獲する」は、液体培養培地または希釈された液体培養培地中に存在する１つまたはそれ以上の他の成分（例えば、哺乳類細胞中に存在するかまたはそれから分泌される培養培地タンパク質または１つもしくはそれ以上の他の成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他のタンパク質））から、組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を部分的に精製または単離し（例えば、重量で少なくともまたは約５％、例えば、少なくとももしくは約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとももしくは約９５％純粋）、濃縮するために実行される工程を意味する。典型的には、捕獲は、（例えば、アフィニティークロマトグラフィーの使用によって）組換えタンパク質が結合するクロマトグラフィー樹脂を用いて実行される。液体培養培地または希釈済み液体培養培地から組換えタンパク質を捕獲する非限定的な方法は、本明細書で記載されており、他の方法も当技術分野で公知である。組換えタンパク質は、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜（例えば、本明細書に記載のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜のいずれか）を用いて、液体培養培地から捕獲することができる。
用語「精製する」は、組換えタンパク質を含む流体中に存在する１つもしくはそれ以上の他の不純物（例えば、かさ高い不純物）または成分（例えば、哺乳類細胞中に存在するかまたはそれから分泌される液体培養培地タンパク質または１つもしくはそれ以上の他の成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、他のタンパク質、内毒素、ウィルス、等））から組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を単離するために実行される工程を意味する。例えば、精製することは、最初にある捕獲する工程の最中または後に実行することができる。精製は、組換えタンパク質または夾雑物のいずれかに結合するクロマトグラフィー樹脂、膜または任意の他の固体担体を用いて（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アニオン交換もしくはカチオン交換クロマトグラフィー、または分子ふるいクロマトグラフィーの使用によって）、実行することができる。組換えタンパク質は、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜（例えば、本明細書に記載のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜のいずれか）を用いて、組換えタンパク質を含む流体から精製することができる。
「ポリッシュすること」という用語は専門用語であり、所望される最終的な純度に近い組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を含む流体から、微量または少量の残留夾雑物または残留不純物を除去するために実行される、工程を意味する。例えば、ポリッシュすることは、組換えタンパク質を含む流体が、標的とする組換えタンパク質に選択的に結合しまたは組換えタンパク質を含む流体中に存在する少量の夾雑物もしくは不純物に選択的に結合する、クロマトグラフィーカラム（複数可）または膜型吸着材（複数可）を通過することにより、実行することができる。このような例において、クロマトグラフィーカラム（複数可）または膜型吸着材（複数可）の溶出液／ろ液は、組換えタンパク質を含む。
「ろ過すること」という用語は、液体（例えば、本明細書に記載の方法のいずれかにおいて存在する液体培養培地または流体）から望ましくない生物型夾雑物（例えば、哺乳類細胞、細菌、酵母細胞、ウィルスまたはマイコバクテリア）および／または粒子状物質（例えば、沈殿したタンパク質）の少なくとも一部（例えば、少なくとも８０％、９０％、
９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）を除去することを意味する。
「溶出液／ろ液」という用語は専門用語であり、検出可能な量の組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を含んでいるクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から排出される、流体を意味する。
用語「一体化された方法」は、特定の結果（例えば、組換えタンパク質の液体培養培地からの精製）を達成するように協力して機能する構造要素を用いて実行される方法を意味する。
用語「連続的な方法」は、システムの少なくとも一部を介して流体を連続的に供給する方法を意味する。例えば、連続的な方法は、組換えタンパク質を含む液体培養培地をバイオリアクターからＭＣＣＳを介して連続的に供給する方法である。連続的な方法の別の例は、組換えタンパク質を含む液体培養培地をバイオリアクターから第１および第２のＭＣＣＳ（ＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２）を介して連続的に供給する方法である。さらなる例は、組換えタンパク質を含む液体培養培地をＭＣＣＳを介して連続的に供給する方法、組換えタンパク質を含む液体培養培地をＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２を介して連続的に供給する方法、または組換えタンパク質を含む流体をＭＣＣＳ２を介して連続的に供給する方法を含む。
用語「クローズドな方法」は専門用語であり、組換えタンパク質と接触する方法の構成要素（例えば、クロマトグラフィー樹脂および／または緩衝液）または組換えタンパク質を含む液体が、かなりの時間夾雑作用物質に意図的に曝露されない（例えば、かなりの時間意図的に空気に曝露されない）ように実行される方法を意味する。
「治療用タンパク質原薬」という用語は、十分に精製されており、または、汚染をもたらすタンパク質、脂質および核酸（例えば、液体培養培地中に存在するまたは宿主細胞に由来した（例えば、哺乳類宿主細胞、酵母宿主細胞または細菌宿主細胞に由来した）夾雑タンパク質、脂質および核酸）、ならびに、生物型夾雑物（例えば、ウィルス型夾雑物および細菌型夾雑物）から十分に単離されており、さらなる大幅な精製および／または汚染除去工程（複数可）を全く用いないで医薬品中に配合することができる、組換えタンパク質（例えば、免疫グロブリン、タンパク質フラグメント、人為的改変タンパク質または酵素）を意味する。
「マルチカラムクロマトグラフィーシステム」または「ＭＣＣＳ」という用語は、相互接続されているまたは切り替え処理を受けることになる合計で２つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜からできたシステムを意味する。マルチカラムクロマトグラフィーシステムの非限定的な例は、相互接続されているまたは切り替え処理を受けることになる合計で２つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜を含んでいる、定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣ）である。マルチカラムクロマトグラフィーシステムのさらなる例は、本明細書で記載されており、当技術分野で公知でもある。
用語「実質的に含まない」は、指定された物質（例えば、哺乳類細胞または哺乳類細胞に由来する夾雑タンパク質、核酸、炭水化物、もしくは脂質）を少なくともまたは約９０％含まない（例えば、少なくとももしくは約９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとももしくは約９９％含まない、または約１００％含まない）組成物（例えば、液体培養培地）を意味する。
「哺乳類細胞」という用語は、任意の哺乳類（例えば、ヒト、ハムスター、マウス、ミドリザル、ラット、ブタ、ウシまたはウサギ）から作られたまたは任意の哺乳類に由来した任意の細胞を意味する。例えば、哺乳類細胞は、不死化細胞であってよい。いくつかの実施形態において、哺乳類細胞は、分化細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳類細胞は、未分化細胞である。哺乳類細胞の非限定的な例は、本明細書で記載されている。哺乳類細胞のさらなる例は、当技術分野で公知である。
「培養」または「細胞培養」という用語は、制御下にある一組の物理的条件下における哺乳類細胞の維持または増殖を意味する。
「哺乳類細胞の培養物」という用語は、制御下にある一組の物理的条件下で維持または増殖される複数の哺乳類細胞を含有する、液体培養培地を意味する。
「液体培養培地」という用語は、細胞（例えば、哺乳類細胞）がインビトロで成長または増殖できるようにするのに十分な栄養素を含む、流体を意味する。例えば、液体培養培地は、次のうち１つまたはそれ以上を含み得る：アミノ酸（例えば、２０個のアミノ酸）、プリン（例えば、ヒポキサンチン）、ピリミジン（例えば、チミジン）、コリン、イノシトール、チアミン、葉酸、ビオチン、カルシウム、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チミジン、シアノコバラミン、ピルベート、リポ酸、マグネシウム、グルコース、ナトリウム、カリウム、鉄、銅、亜鉛および重炭酸ナトリウム。いくつかの実施形態において、液体培養培地は、哺乳類由来の血清を含み得る。いくつかの実施形態において、液体培養培地は、哺乳類由来の血清または別の抽出物を含まない（組成が明らかな液体培養培地（ｄｅｆｉｎｅｄ ｌｉｑｕｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ））。いくつかの実施形態において、液体培養培地は、微量金属、哺乳類成長ホルモンおよび／または哺乳類成長因子を含み得る。液体培養培地の別の例は、最少培地（例えば、無機塩、炭素源および水のみを含む培地）である。液体培養培地の非限定的な例は、本明細書で記載されている。液体培養培地のさらなる例が、当技術分野で公知であり、市販されてもいる。液体培養培地は、任意の密度の哺乳類細胞を含み得る。例えば、本明細書で使用されるとき、バイオリアクターから抜き出されたある体積の液体培養培地は、哺乳類細胞を実質的に含み得ない。
「動物由来成分無含有の液体培養培地」という用語は、哺乳類に由来したいかなる成分（例えば、タンパク質または血清）も含まない液体培養培地を意味する。
「血清無含有の液体培養培地」という用語は、哺乳類血清を含まない液体培養培地を意味する。
「血清含有液体培養培地」という用語は、哺乳類血清を含む液体培養培地を意味する。
「既知組成液体培養培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ ｌｉｑｕｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）」という用語は専門用語であり、化学的組成の全てが既知になっている液体培養培地を意味する。例えば、既知組成液体培養培地は、ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンを含まないが、こうした製造物はアルブミンと脂質との複雑な混合物を典型的には含む。
「タンパク質無含有の液体培養培地」という用語は、いかなるタンパク質も（例えば、検出可能ないかなるタンパク質も）含まない、液体培養培地を意味する。
「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリンタンパク質（例えば、可変ドメイン配列、フレームワーク配列および／または定常ドメイン配列）に関する少なくとも１５個のアミノ酸（例えば、少なくとも２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個または１００個のアミノ酸）からできたアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを意味する。免疫グロブリンは例えば、例えば少なくともアミノ酸１５個の軽鎖免疫グロブリン、例えば少なくともアミノ酸１５個の重鎖免疫グロブリンを含み得る。免疫グロブリンは単離された抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ）、例えば、ＩｇＧのサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）である。免疫グロブリンは、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントまたはｓｃＦｖフラグメントであってよい。免疫グロブリンは、二重特異性抗体もしくは三重特異性抗体、または二量体抗体、三量体抗体もしくは多量体抗体、またはジアボディ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）もしくはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）であってもよい。免疫グロブリンは、少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む人為的改変タンパク質（例えば、融合タンパク質）であってもよい。免疫グロブリンの非限定的な例は、本明細書で記載されており、免疫グロブリンのさらなる例は、当技術分野で公知である。
「タンパク質フラグメント」または「ポリペプチドフラグメント」という用語は、長さがアミノ酸少なくとももしくは約４個分、アミノ酸少なくとももしくは約５個分、アミノ酸少なくとももしくは約６個分、アミノ酸少なくとももしくは約７個分、アミノ酸少なくとももしくは約８個分、アミノ酸少なくとももしくは約９個分、アミノ酸少なくとももしくは約１０個分、アミノ酸少なくとももしくは約１１個分、アミノ酸少なくとももしくは約１２個分、アミノ酸少なくとももしくは約１３個分、アミノ酸少なくとももしくは約１４個分、アミノ酸少なくとももしくは約１５個分、アミノ酸少なくとももしくは約１６個分、アミノ酸少なくとももしくは約１７個分、アミノ酸少なくとももしくは約１８個分、アミノ酸少なくとももしくは約１９個分、またはアミノ酸少なくとももしくは約２０個分、または長さがアミノ酸２０個分超になっている、ポリペプチド配列の一部を意味する。組換えタンパク質フラグメントは、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて製造することができる。
「人為的改変タンパク質」という用語は、有機体（例えば、哺乳類）内部に存在する内因性核酸によって自然にコードされない、ポリペプチドを意味する。人為的改変タンパク質の例には、酵素（例えば、人為的改変酵素の安定性および／または触媒活性の増大をもたらす１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を受けている）、融合タンパク質、抗体（例えば、二価抗体、三価抗体またはジアボディ）、および、少なくとも１つの組換え足場配列を含む抗原結合性タンパク質が挙げられる。
「分泌されたタンパク質」または「分泌された組換えタンパク質」という用語は、元々含まれていた少なくとも１つの分泌シグナル配列が、哺乳類細胞内部で翻訳され、哺乳類細胞中の分泌シグナル配列が酵素によって少なくとも部分的に開裂されると、細胞外の空間（例えば、液体培養培地）に少なくとも一部が分泌される、タンパク質（例えば、組換えタンパク質）を意味する。分泌されたタンパク質として取り扱われるために、「分泌された」タンパク質が、細胞から完全にかい離している必要がないことについては、当業者ならば理解されよう。
「潅流型バイオリアクター」という用語は、第１の液体培養培地中の複数の細胞（例えば、哺乳類細胞）を含んでいるバイオリアクターを意味し、ここで、バイオリアクター内に存在する細胞の培養は、第１の液体培養培地を定期的または連続的に抜き出すこと、および同時またはすぐ後に、実質的に同じ体積の第２の液体培養培地をバイオリアクターに添加することを含む。いくつかの例において、培養期間（例えば、１日を基準とした際の培養培地再供給比率）中における増分による期間（例えば、約２４時間の期間、約１分から約２４時間の間の期間、または２４時間超の期間）にわたって、抜き出しおよび添加が実行される第１の液体培養培地の体積の増分による変化（例えば、増大または減少）がある。毎日抜き出して置き換える培地の割合は、培養されている特定の細胞、初期の播種密度、および、特定の時間における細胞密度に応じて変動し得る。「ＲＶ」または「反応器容積」は、培養プロセスの開始時に存在する培養培地の体積（例えば、播種後に存在する培養培地の合計体積）を意味する。
「流加型バイオリアクター」という用語は専門用語であり、第１の液体培養培地中の複数の細胞（例えば、哺乳類細胞）を含んでいるバイオリアクターを意味し、ここで、バイオリアクター内に存在する細胞の培養は、細胞培養物から第１の液体培養培地または第２の液体培養培地が大幅にまたは顕著に抜き出されることなく、第１の液体培養培地に第２の液体培養培地を定期的または連続的に添加することを含む。第２の液体培養培地は、第１の液体培養培地と同じであってよい。流加型培養のいくつかの例において、第２の液体培養培地は、濃縮された形態になった第１の液体培養培地である。流加型培養のいくつかの例において、第２の液体培養培地は、乾燥粉末として添加される。
「清澄化済み液体培養培地」という用語は、細菌細胞または酵母細胞を実質的に無含有（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％または９９％無含有）である、細菌細胞培養または酵母細胞培養から入手した液体培養培地を意味する。
そうではないとの規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書で記載されているが、当技術分野で公知になっている適切な他の方法および材料もまた、使用され得る。材料、方法および例は、説明用のものにすぎず、限定を加えるものになる意図はない。本明細書で言及された全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリおよび他の参考資料は、参照によって全部分を本明細書に組み入れる。矛盾する場合、本明細書の方が、規定を含めて支配する。
本発明に関する他の特色および利点については、下記の詳細な記載および図面および特許請求の範囲から明らかとなろう。
図１は、アニオン交換および疎水性基を有する未処理（バージン）の多モード樹脂（ＡＥ樹脂）ならびに２５ｋＧｙガンマ線照射したＡＥ樹脂（クロマトグラフィーサイクルなし）のｔ０における結合等温線のグラフである。 図２は、各サイクルにおいて（組換えタンパク質の溶出後）７００ｍＭアルギニン、１００ｍＭ酢酸塩（ｐＨ３．０）の緩衝液、続いて１Ｎ ＮａＯＨの溶液を用いて各樹脂を洗浄する場合、複数のサイクルのカラムクロマトグラフィーにわたるバージン（未処理）ＡＥ樹脂、１５ｋＧｙガンマ線照射したＡＥ樹脂、および２５ｋＧｙガンマ線照射したＡＥ樹脂の規格化された結合能力パーセントのグラフである。各樹脂の結合能力パーセントは時間０（ｔ０）におけるバージン（未処理の）ＡＥ樹脂の結合能力に対して規格化されており、これはｔ０におけるガンマ線照射した樹脂と極めてよく似ている（２７±２ｍｇ／ｍＬ）ことも見出された。 図３は、各サイクルにおいて（組換えタンパク質の溶出後）７００ｍＭアルギニン、１００ｍＭ酢酸塩（ｐＨ３．０）の緩衝液、続いて１Ｎ ＮａＯＨの溶液を用いて各樹脂を洗浄する場合、複数のサイクルのカラムクロマトグラフィーにわたるバージン（未処理の）ＡＥ樹脂、１５ｋＧｙガンマ線照射したＡＥ樹脂、および２５ｋＧｙガンマ線照射したＡＥの結合能力の低下の平均割合を示すグラフである。 図４は、各サイクルにおいて組換えタンパク質の溶出後７００ｍＭアルギニン、１００ｍＭ酢酸塩（ｐＨ３．０）、続いて１Ｎ ＮａＯＨの溶液で洗浄したバージン（未処理の）ＡＥ樹脂（低ｐＨアルギニンバージン）を含む単一のクロマトグラフィーカラムを用いた、または（各サイクルにおいて）組換えタンパク質の溶出後８Ｍ尿素、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍクエン酸、ｐＨ２．５（低ｐＨ尿素）；６ＭグアニジンＨＣｌ（ｐＨ２．５）（低ｐＨグアニジン）；０．１Ｍ酢酸中０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（ｐＨ２．５）、続いて０．７Ｍ酢酸、２０％エタノール、５０％エチレングリコール（ｐＨ２．５）（低ｐＨ Ｔｒｉｔｏｎ）；７００ｍＭアルギニン、１００ｍＭ酢酸塩（ｐＨ３．０）（低ｐＨアルギニン）；もしくは０．７Ｍ酢酸、２０％エタノール、５０％エチレングリコール（ｐＨ２．５）（低ｐＨ有機）で、各々続いて１Ｎ ＮａＯＨの溶液により洗浄した２５ｋＧｙガンマ線照射したＡＥ樹脂を含む単一のクロマトグラフィーカラムを用いた、複数のサイクルのカラムクロマトグラフィーにわたるバージン（未処理の）ＡＥ樹脂の規格化された結合能力パーセントのグラフである。各サイクルの各樹脂の結合能力パーセントは時間０（ｔ０）におけるバージン（未処理の）ＡＥ樹脂の結合能力に規格化されており、これはｔ０におけるガンマ線照射した樹脂と極めてよく似ていることも見出された（２７±２ｍｇ／ｍＬ）。 図５は、各サイクルにおいて（組換えタンパク質の溶出後）８Ｍ尿素、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍクエン酸、ｐＨ２．５、続いて１Ｎ ＮａＯＨの溶液を用いて各樹脂を洗浄した場合、２５ｋＧｙ照射したＡＥ樹脂を含む３つのクロマトグラフィーカラムを用いて実行された複数のサイクルのカラムクロマトグラフィーにわたる２８０ｎｍにおける溶出液吸光度を示すマルチカラムクロマトグラフィー（ＭＣＣ）実験の典型的なクロマトグラフプロファイルである。３つの異なるサイクルで８Ｍ尿素、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍクエン酸、ｐＨ２．５の変性用緩衝液に曝露中ＡＥ樹脂から放出された結合したタンパク質を表すピークは矢印で示されている。クロマトグラフはＭＣＣ実験を実行するのに使用した３つ全てのクロマトグラフィーカラムに対するＵＶトレースを示す。 図６は、各サイクルにおいて組換えタンパク質の溶出後７００ｍＭアルギニン、１００ｍＭ酢酸塩（ｐＨ３．０）、続いて１Ｎ ＮａＯＨの溶液で洗浄されたバージン（未処理の）ＡＥ樹脂（低ｐＨアルギニンバージン）を含む単一のクロマトグラフィーカラムを用いた、または（各サイクルにおいて）組換えタンパク質の溶出後８Ｍ尿素、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍクエン酸、ｐＨ２．５（低ｐＨ尿素）；６ＭグアニジンＨＣｌ（ｐＨ２．５）（低ｐＨグアニジン）；０．１Ｍ酢酸中０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（ｐＨ２．５）、続いて０．７Ｍ酢酸、２０％エタノール、５０％エチレングリコール（ｐＨ２．５）（低ｐＨ Ｔｒｉｔｏｎ）；もしくは０．７Ｍ酢酸、２０％エタノール、５０％エチレングリコール（ｐＨ２．５）（低ｐＨ有機）で；各々続いて１Ｎ ＮａＯＨの溶液で洗浄された２５ｋＧｙガンマ線照射したＡＥ樹脂を含む単一のクロマトグラフィーカラムを用いた複数のサイクルのカラムクロマトグラフィーにわたりサイクル当たりクロマトグラフィー樹脂に結合した回収された組換えタンパク質の割合のグラフである。 図７は、各サイクルにおいて組換えタンパク質の溶出後７００ｍＭアルギニン、１００ｍＭ酢酸塩（ｐＨ３．０）で、続いて１Ｎ ＮａＯＨの溶液で洗浄されたバージン（未処理の）ＡＥ樹脂（低ｐＨアルギニンバージン）を含む単一のクロマトグラフィーカラムを用いた、または（各サイクルにおいて）組換えタンパク質の溶出後８Ｍ尿素、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍクエン酸、ｐＨ２．５（低ｐＨ尿素）；６ＭグアニジンＨＣｌ（ｐＨ２．５）（低ｐＨグアニジン）；０．１Ｍ酢酸中０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（ｐＨ２．５）、続いて０．７Ｍ酢酸、２０％エタノール、５０％エチレングリコール（ｐＨ２．５）（低ｐＨ Ｔｒｉｔｏｎ）；もしくは０．７Ｍ酢酸、２０％エタノール、５０％エチレングリコール（ｐＨ２．５）（低ｐＨ有機）で；各々続いて１Ｎ ＮａＯＨの溶液で洗浄された２５ｋＧｙガンマ線照射したＡＥ樹脂を含む単一のクロマトグラフィーカラムを用いた、複数のサイクルのカラムクロマトグラフィーにわたる溶出液中に存在する宿主細胞タンパク質（ｎｇ／ｍｇ）のグラフである。 図８は、リソソーム貯蔵疾患および各疾患を治療するのに使用することができる組換え治療用酵素のリストである。
本明細書に、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂でクロマトグラフィーを実行する方法であって、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含むクロマトグラフィーカラムを準備すること、そのカラムによって第１のサイクルのクロマトグラフィーを実行することを含み、該サイクルはクロマトグラフィー樹脂を変性用緩衝液に曝露することを含む、方法が提供される。また、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含む少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムの使用を含む、組換えタンパク質を製造するための一体化されクローズドなまたは実質的にクローズドな連続的な方法も提供され、ここでガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂は該方法における各々のサイクル中に変性用緩衝液に曝露され、低減したバイオバーデンの緩衝液が該方法で使用される。これらの方法およびプロセスの非限定的な局面が以下に記載される。当技術分野では理解できるように、以下に記載される様々な局面は無制限に任意の組合せで使用することができる。
ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂
当技術分野で公知の多種多様な異なるタイプのクロマトグラフィー樹脂（またはその組合せ）は、当技術分野で公知の方法を用いてガンマ線照射に曝露することができる。例えば、コバルト−６０またはセシウム−１３７のような同位体がガンマ線源として使用される。ガンマ線照射に曝露されるクロマトグラフィー樹脂は充填されたクロマトグラフィーカラム内に存在することができる。他の例において、ガンマ線照射に曝露されるクロマトグラフィー樹脂は密封容器内に存在する（例えば、密封容器内のスラリー）。
クロマトグラフィー樹脂は約−２５℃〜約０℃（両端を含む）、または約０℃〜約２５℃（両端を含む）の温度でガンマ線照射に曝露することができる。クロマトグラフィー樹脂は約０．１ｋＧｙ〜約１００ｋＧｙ、約１ｋＧｙ〜約１００ｋＧｙ、約１ｋＧｙ〜約９０ｋＧｙ、約１ｋＧｙ〜約８０ｋＧｙ、約１ｋＧｙ〜約７０ｋＧｙ、約１ｋＧｙ〜約６５ｋＧｙ、約５ｋＧｙ〜約６５ｋＧｙ、約１０ｋＧｙ〜約６０ｋＧｙ、約１０ｋＧｙ〜約５５ｋＧｙ、約１０ｋＧｙ〜約５０ｋＧｙ、約１０ｋＧｙ〜約４５ｋＧｙ、約１０ｋＧｙ〜約４０ｋＧｙ、約１０ｋＧｙ〜約３５ｋＧｙ、約１０ｋＧｙ〜約３０ｋＧｙ、約１５ｋＧｙ〜約５０ｋＧｙ、約１５ｋＧｙ〜約４５ｋＧｙ、約１５ｋＧｙ〜約４０ｋＧｙ、約１５ｋＧｙ〜約３５ｋＧｙ、または約２０ｋＧｙ〜約３０ｋＧｙの線量のガンマ線照射に曝露することができる。
ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂はアニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、またはこれらの任意の組合せであることができる。アフィニティークロマトグラフィー樹脂の非限定例には、ペプチドリガンド、タンパク質リガンド（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）、アプタマーリガンド、基質リガンド、生成物リガンド、金属リガンド、および補因子リガンドを有する樹脂がある。ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂は二モードクロマトグラフィー樹脂（例えば、アニオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂の特徴を有するもの）であることができる。
ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含むクロマトグラフィーカラム
本明細書に記載されている方法はガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含むクロマトグラフィーカラムの使用を含み、また本明細書に記載されている方法は少なくとも１つのガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含むクロマトグラフィーカラムを含む１つまたは２つのＭＣＣＳの使用を含む。ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂は本明細書に記載されている任意のタイプの樹脂（または当技術分野で公知の任意のタイプのクロマトグラフィー樹脂）であることができる。ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂は本明細書に記載されているかまたは当技術分野で公知の方法のいずれかを用いて製造することができる。
かかるクロマトグラフィーカラムはクロマトグラフィーカラムに未処理のクロマトグラフィー樹脂（複数可）を充填し、ガンマ線照射に（例えば、本明細書に記載されている曝露および条件のいずれかを用いて）曝露することにより生産することができる。他の例において、ガンマ線照射された樹脂（複数可）を含むクロマトグラフィーカラムは、クロマトグラフィー樹脂（例えば、容器内に入れて提供されたクロマトグラフィー樹脂）をガンマ線照射に曝露し、クロマトグラフィーカラムにそのガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を充填することにより生産することができる。かかる方法において、ガンマ線照射に曝露されたクロマトグラフィー樹脂は容器内のスラリーとして存在することができ、クロマトグラフィーカラムは低減したバイオバーデンのフード内で充填される。他の方法において、クロマトグラフィー樹脂は容器内で固体混合物としてガンマ線照射に曝露することができ、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂のスラリーは（例えば、低減したバイオバーデンのフード内で製造された）低減したバイオバーデンの緩衝液を用いて製造することができ、得られたスラリーを用いて低減したバイオバーデンのフード内でクロマトグラフィーカラムに充填することができる。これらの例のいくつかにおいて、充填に先立って、クロマトグラフィーカラムを処理（例えば、オートクレーブ処理、ガンマ線照射、またはエチレンオキサイドへの曝露）してバイオバーデンを低減することができる。
ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含むクロマトグラフィーカラムは約１×１０−３〜約１×１０−１２、約１×１０−４〜約１×１０−１２、１×１０−５〜約１×１０−１１、約１×１０−５〜約１×１０−１０、約１×１０−５〜約１×１０−９、約１×１０−６〜約１×１０−９、または約１×１０−６〜約１×１０−８（両端を含む）の滅菌保証レベル（ＳＡＬ）を有することができる。
低減したバイオバーデンの緩衝液
本明細書に記載の方法およびプロセスは１種またはそれ以上の低減したバイオバーデンの緩衝液を用いて実行することができる。当技術分野では理解されるように、低減したバイオバーデンの緩衝液はクロマトグラフィーのサイクルで使用される任意の種類の緩衝液（例えば、クロマトグラフィーのサイクルまたは本明細書に記載の単位操作のいずれかの工程で使用される緩衝液）であることができる。緩衝液のバイオバーデンを低減するための代表的な方法には、ろ過（０．２μｍ孔径のろ過）、オートクレーブ処理、およびガンマ線照射がある。緩衝液のバイオバーデンを低減するさらなる方法は当技術分野で公知である。低減したバイオバーデンの緩衝液は約１×１０−３〜約１×１０−１２、約１×１０−４〜約１×１０−１２、１×１０−５〜約１×１０−１１、約１×１０−５〜約１×１０−１０、約１×１０−５〜約１×１０−９、約１×１０−６〜約１×１０−９、または約１×１０−６〜約１×１０−８（両端を含む）の滅菌保証レベルを有することができる。
変性用緩衝液
本明細書に記載の方法およびプロセスは変性用緩衝液の使用を含む。変性用緩衝液としては、タンパク質の変性を引き起こす結果となる充分な量の１つまたはそれ以上の化学的作用物質（例えば、洗剤（複数可）、還元剤（複数可）、酸（複数可）、カオトロピック剤（複数可）、有機溶媒（複数可）、もしくは架橋剤（複数可）、またはこれらの任意の組合せ）がある。変性用緩衝液に包含され得る非限定的な代表的な洗剤にはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム、およびエチルトリメチルアンモニウムブロミドがある。変性用緩衝液に包含され得る有機溶媒の非限定例にはエタノール、ブタノール、フェノール、プロパノール、およびメタノールがある。変性用緩衝液に包含され得る還元剤の非限定例には２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、およびトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンがある。変性用緩衝液に包含され得る酸の非限定例には酢酸、トリクロロ酢酸、およびスルホサリチル酸がある。変性用緩衝液に包含され得るカオトロピック剤の非限定例には尿素（例えば、６〜９Ｍ尿素）、チオ尿素、塩化グアニジン（例えば、５〜７Ｍ塩化グアニジン）、過塩素酸リチウム（例えば、４〜７Ｍ過塩素酸リチウム）、または酢酸リチウムがある。変性用緩衝液に包含され得る架橋剤の非限定例にはホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドがある。
変性用緩衝液の非限定例には：８Ｍ尿素、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍクエン酸、ｐＨ２．５（例えば、続いて１Ｎ ＮａＯＨ）；６ＭグアニジンＨＣｌ、ｐＨ２．５（例えば、続いて１Ｎ ＮａＯＨまたは１Ｍ ＮａＯＨ＋１Ｍ ＮａＣｌ）；および０．１Ｍ酢酸中０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、ｐＨ２．５（例えば、続いて０．７Ｍ酢酸、２０％エタノール、５０％エチレングリコール、ｐＨ２．５、続いて１Ｎ ＮａＯＨ）がある。
組換え治療用タンパク質
本明細書に記載の組換えタンパク質は組換え治療用タンパク質であることができる。本明細書で提供された方法によって製造され得る組換え治療用タンパク質の非限定的な例には、免疫グロブリン（軽鎖および重鎖免疫グロブリンを含める）、抗体または抗体フラグメント（例えば、本明細書に記載の抗体フラグメントのいずれか）、酵素（例えば、ガラクトシダーゼ（例えば、アルファ−ガラクトシダーゼ）、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）またはＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標））、タンパク質（例えば、ヒトエリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、またはインターフェロンアルファもしくはベータ）、または免疫原性もしくは抗原性タンパク質もしくはタンパク質フラグメント（例えば、ワクチンにおける使用のためのタンパク質）が挙げられる。各種のリソソーム貯蔵疾患を治療するのに使用することができる組換え治療用酵素の非限定例が図８に示されている。組換え治療用タンパク質は、少なくとも１つの多機能性組換えタンパク質足場を含む、人為的改変抗原結合性ポリペプチドであってよい（例えば、Ｇｅｂａｕｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３：２４５〜２５５、２００９年；および米国特許出願公開第２０１２／０１６４０６６号（参照によって全部分を本明細書に組み入れる）で記載された、抗原結合性組換えタンパク質を参照されたい。）。抗体である組換え治療用タンパク質の非限定的な例には、パニツムマブ、オマリズマブ、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ（ａｌａｃｉｚｕｍａｂ）、アラシズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ）、アポリズマブ、アチヌマブ（ａｔｉｎｕｍａｂ）、トシリズマブ、バシリキシマブ（ｂａｓｉｌｉｚｉｍａｂ）、ベクツモマブ（ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビシロマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、デンスマブ（ｄｅｎｓｕｍａｂ）、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エファングマブ、エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、ナタリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブおよびトラスツズマブが挙げられる。本明細書に記載の方法によって製造され得る組換え治療用抗体のさらなる例は、当技術分野で公知である。本方法によって製造／精製され得る組換え治療用タンパク質のさらなる非限定的な例には、アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、アバタセプト、ガルスルファーゼ、ルトロピンアルファ、抗血友病因子、アガルシダーゼベータ、インターフェロンベータ−１ａ、ダーベポエチンアルファ、テネクテプラーゼ、エタネルセプト、凝固第ＩＸ因子、卵胞刺激ホルモン、インターフェロンベータ−１ａ、イミグルセラーゼ、ドルナーゼアルファ、エポエチンアルファおよびアルテプラーゼが挙げられる。
分泌された可溶性組換え治療用タンパク質は、細胞（例えば、哺乳類細胞）から液体培養培地を除去または物理的に分離することにより、液体培養培地（例えば、第１の液体培養培地および／または第２の液体培養培地）から回収することができる。細胞（例えば、哺乳類細胞）から液体培養培地を除去するための相異なる種々の方法は、当技術分野で公知であり、例えば、遠心分離、ろ過、ピペット操作および／または吸引が挙げられる。分泌された組換え治療用タンパク質は、その後、様々な種類のクロマトグラフィー（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、もしくは疎水性相互作用クロマトグラフィー、またはこれらの任意の組合せ）および／またはろ過（例えば、分子量カットオフろ過）を始めとする様々な生化学的技術を用いて、液体培養培地から回収し、さらに精製することができる。
クロマトグラフィーのサイクル
当技術分野で周知のように、クロマトグラフィーのサイクルにおける工程は、クロマトグラフィー樹脂、サイクルにおいて各々の工程を実行するのに使用される緩衝液、および標的とする組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）の生物物理学的な特性に応じて異なることができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラムは、標的とする組換えタンパク質を含む流体をアフィニティークロマトグラフィーカラムに装填し、カラムを洗浄して望ましくない生物学的材料（例えば、夾雑するタンパク質および／または小分子）を除去し、カラムに結合した標的とする組換えタンパク質を溶出し、カラムを再平衡化する工程を含むことができる。標的とする組換えタンパク質が装填工程でクロマトグラフィー樹脂に結合するカチオンおよび／またはアニオン交換クロマトグラフィーカラムを用いるクロマトグラフィーのサイクルは、標的とするタンパク質を含む流体をカラムに装填し、カラムを洗浄して望ましくない生物学的材料を除去し、カラムに結合した標的とする組換えタンパク質を溶出し、カラムを再平衡化する工程を含むことができる。他の例において、望ましくない生物学的材料が装填工程中にクロマトグラフィー樹脂に結合するが標的とする組換えタンパク質は結合しないカチオンおよび／またはアニオン交換クロマトグラフィーカラムを用いるクロマトグラフィーのサイクルは、標的とするタンパク質を含む流体をカラムに装填し、通過画分中の標的とする組換えタンパク質を収集し、カラムを再平衡化する工程を含むことができる。当技術分野で周知のように、クロマトグラフィーサイクルにおける単一の工程のいずれも単一の緩衝液または複数の緩衝液（例えば、２種またはそれ以上の緩衝液）を含むことができ、クロマトグラフィーサイクルにおける単一の工程のいずれか１つまたはそれ以上が緩衝液勾配を含むことができる。クロマトグラフィーの単一のサイクルの様々な周知の局面の組合せのいずれも、例えば、異なるクロマトグラフィー樹脂（複数可）、流量（複数可）、緩衝液（複数可）、カラムのボイド容積（複数可）、カラムのベッド容積（複数可）、各々の工程で使用される緩衝液の体積（複数可）、標的とするタンパク質を含む流体の体積（複数可）、ならびに各々の工程で使用される緩衝液（複数可）の数および種類を、任意の組合せでこれらの方法に使用することができる。
ガンマ線殺菌された樹脂でクロマトグラフィーを実行する方法
本明細書に、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を用いてクロマトグラフィーを実行する方法が提供される。これらの方法は、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含むクロマトグラフィーカラムを準備すること、このカラムによって、クロマトグラフィー樹脂を変性用緩衝液に曝露することを含む第１のサイクルのクロマトグラフィーを実行すること、該カラムによって少なくとも１つの追加のサイクルのクロマトグラフィーを実行することを含む。ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂は、任意のタイプのクロマトグラフィー樹脂であることができ、および／または本明細書に記載されているかまたは当技術分野で公知のガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂のいずれかであることができる。クロマトグラフィーカラムは、本明細書に記載されているかまたは当技術分野で公知のガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含むクロマトグラフィーカラムのいずれかであることができる。組換えタンパク質は組換え治療用タンパク質（例えば、本明細書に記載されているかまたは当技術分野で公知の組換え治療用タンパク質のいずれか）であることができる。
いくつかの例において、カラムはマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）の一部であり、例えば、定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ）の一部であることができる。
変性用緩衝液は本明細書に記載されているかまたは当技術分野で公知の代表的な変性用緩衝液のいずれかであることができる。例えば、変性用緩衝液は尿素、グアニジン塩酸塩、およびＴｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ−１００のうち１つまたはそれ以上を含むことができる。いくつかの例において、クロマトグラフィー樹脂は少なくとも１分〜約２時間（例えば、１分〜約１．５時間、約１分〜約１．０時間、約１分〜約５５分、約１分〜約５０分、約１分〜約４５分、約１分〜約４０分、約１分〜約４０分、約１分〜約３５分、約１分〜約３０分、約１分〜約２５分、約１分〜約２０分、約１分〜約１５分、または約１分〜約１０分）の期間変性用緩衝液に曝露される。いくつかの例において、クロマトグラフィー樹脂を変性用緩衝液に曝露することは、約０．５×ベッド容積〜約１０×ベッド容積（例えば、約０．５×ベッド容積〜約９．０×ベッド容積、約０．５×ベッド容積〜約８．０×ベッド容積、約０．５×ベッド容積〜約７．０×ベッド容積、約０．５×ベッド容積〜約６．０×ベッド容積、約０．５×ベッド容積〜約５．０×ベッド容積、約０．５×ベッド容積〜約４．０×ベッド容積、約０．５×ベッド容積〜約３．５×ベッド容積、約０．５×ベッド容積〜約３．０×ベッド容積、約０．５×ベッド容積〜約２．５×ベッド容積、約０．５×ベッド容積〜約２．０×ベッド容積、または約０．５×ベッド容積〜約１．５×ベッド容積）の変性用緩衝液をクロマトグラフィーカラムに通すことを含む。いくつかの例において、第１のサイクルのクロマトグラフィーは、約０．５Ｍ〜約１．５Ｍ水酸化ナトリウムを含む洗浄用緩衝液にクロマトグラフィー樹脂を曝露し、続いて変性用緩衝液に曝露することを含むことができる。
前記カラムによって実行される第１のサイクルのクロマトグラフィーは、クロマトグラフィー樹脂を変性用緩衝液に曝露することを含む本明細書に記載されているかまたは当技術分野で公知のいずれかのサイクルのクロマトグラフィーであることができる。前記カラムによって実行される少なくとも１つの追加のサイクルのクロマトグラフィーは本明細書に記載されているかまたは当技術分野で公知のいずれかのサイクルのクロマトグラフィーであることができる。例えば、第１のサイクルのクロマトグラフィーおよび少なくとも１つの追加のサイクルのクロマトグラフィーは：組換えタンパク質を含む液体にクロマトグラフィー樹脂を曝露することにより組換えタンパク質を捕獲し；クロマトグラフィー樹脂を洗浄用緩衝液に曝露することによりクロマトグラフィー樹脂を洗浄し、クロマトグラフィー樹脂を溶出緩衝液に曝露することにより組換えタンパク質を溶出し；クロマトグラフィー樹脂を変性用緩衝液に曝露することによりクロマトグラフィー樹脂を再生する工程を含むことができる。いくつかの例において、組換えタンパク質を含む液体は液体培養培地（例えば、潅流またはバッチ培養から収集された液体培養培地）である。
第１のクロマトグラフィーサイクルおよび少なくとも１つの追加のクロマトグラフィーサイクルは、閉鎖され一体化されたシステム（例えば、本明細書に記載されているかまたは当技術分野で公知の代表的な閉鎖され一体化されたシステムのいずれか）を用いて実行することができる。例えば、第１のクロマトグラフィーサイクルおよび少なくとも１つの追加のクロマトグラフィーサイクルは、緩衝液が低減したバイオバーデンの緩衝液（例えば、第１および少なくとも１つの追加のサイクルで使用されるあらゆる緩衝液）である閉鎖され一体化されたシステムを用いて実行することができる。当技術分野で周知のように、低減したバイオバーデンの緩衝液は様々な異なる方法を用いて生産する（例えば、ろ過、オートクレーブ処理、または熱処理により製造する）ことができる。
少なくとも１つの追加のサイクルのクロマトグラフィーは２またはそれ以上（例えば、３またはそれ以上、４またはそれ以上、５またはそれ以上、６またはそれ以上、７またはそれ以上、８またはそれ以上、９またはそれ以上、１０またはそれ以上、１１またはそれ以上、１２またはそれ以上、１３またはそれ以上、１４またはそれ以上、１５またはそれ以上、２０またはそれ以上、２５またはそれ以上、３０またはそれ以上、３５またはそれ以上、４０またはそれ以上、４５またはそれ以上、５０またはそれ以上、５５またはそれ以上、６０またはそれ以上、６５またはそれ以上、７０またはそれ以上、７５またはそれ以上、８０またはそれ以上、８５またはそれ以上、９０またはそれ以上、９５またはそれ以上、または１００またはそれ以上）のサイクルの追加のクロマトグラフィーであることができる。いくつかの例において、少なくとも１つの追加のサイクルのクロマトグラフィーは少なくとも３日（例えば、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、少なくとも１８日、少なくとも１９日、少なくとも２０日、少なくとも２１日、少なくとも２２日、少なくとも２３日、少なくとも２４日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、少なくとも５０日、少なくとも５５日、少なくとも６０日、少なくとも６５日、少なくとも７０日、少なくとも７５日、少なくとも８０日、少なくとも８５日、少なくとも９０日、少なくとも９５日、または少なくとも１００日）の期間にわたり連続的に実行される。
組換えタンパク質を製造するための一体化され、クローズドなまたは実質的にクローズドな、連続的な方法
本明細書に、精製された組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を製造するための一体化され、クローズドなまたは実質的にクローズドな、連続的な方法が提供される。これらの方法は、実質的に細胞を含まない組換えタンパク質（例えば組換え治療用タンパク質）を含有する液体培養培地を準備することを含む。
いくつかの方法はガンマ線殺菌された樹脂を含む少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムを含むマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）に液体培養培地を連続的に供給することを含み、ここでクロマトグラフィー樹脂は各サイクルの間変性用緩衝液に曝露される（例えば、本明細書に記載のいずれかの持続時間の間本明細書に記載されているかまたは当技術分野で公知の変性用緩衝液のいずれかに曝露される）。これらの方法は低減したバイオバーデンの緩衝液を利用し、一体化され、かつ液体培養培地から、精製された組換えタンパク質（例えば治療用タンパク質原薬）であるＭＣＣＳからの溶出液まで連続的に稼動する。
いくつかの方法は、液体培養培地を第１のＭＣＣＳ（ＭＣＣＳ１）に連続的に供給し、ＭＣＣＳ１を用いて組換えタンパク質を液体培養培地から捕獲し、組換えタンパク質を含むＭＣＣＳ１から溶出液を生産し、溶出液を第２のＭＣＣＳ（ＭＣＣＳ２）に連続的に供給し、組換えタンパク質を溶出液からＭＣＣＳ２に連続的に供給し、その後組換えタンパク質を溶出することにより、精製された組換えタンパク質を生産することを含み、ここでＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内の少なくとも１つのカラムはガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含むクロマトグラフィーカラムであり、クロマトグラフィー樹脂は該方法において各サイクルの間に変性用緩衝液に曝露される（例えば、本明細書に記載のいずれかの持続時間の間本明細書に記載されているかまたは当技術分野で公知の変性用緩衝液のいずれかに曝露される）。これらの方法は低減したバイオバーデンの緩衝液を利用し、一体化され、かつ液体培養培地から、精製された組換えタンパク質まで連続的に稼動する。
いくつかの例において、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１、および／またはＭＣＣＳ２で使用されるクロマトグラフィーカラムは各々がガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含む。いくつかの実施形態は、精製された組換えタンパク質を医薬組成物に配合する工程をさらに含む。
本明細書に記載の方法により、組換えタンパク質を含む液体培養培地からの精製された組換えタンパク質の連続的で時間効率の良い生産が提供される。例えば、治療用タンパク質を含む液体培養培地のＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１への供給から、それぞれＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ２からの組換えタンパク質の溶出までの経過時間は、例えば、約４時間〜約４８時間（両端を含む）、例えば、約４時間〜約４０時間、約４時間〜約３５時間、約４時間〜約３０時間、約４時間〜約２８時間、約４時間〜約２６時間、約４時間〜約２４時間、約４時間〜約２２時間、約４時間〜約２０時間、約４時間〜約１８時間、約４時間〜約１６時間、約４時間〜約１４時間、約４時間〜約１２時間、約６時間〜約１２時間、約８時間〜約１２時間、約６時間〜約２０時間、約６時間〜約１８時間、約６時間〜約１４時間、約８時間〜約１６時間、約８時間〜約１４時間、約８時間〜約１２時間、約１０時間〜２０時間、約１０時間〜１８時間、約１０時間〜１６時間、約１０時間〜１４時間、約１２時間〜約１４時間、約１０時間〜約４０時間、約１０時間〜約３５時間、約１０時間〜約３０時間、約１０時間〜約２５時間、約１５時間〜約４０時間、約１５時間〜約３５時間、約１５時間〜約３０時間、約２０時間〜約４０時間、約２０時間〜約３５時間、または約２０時間〜約３０時間（両端を含む）であることができる。他の例において、組換えタンパク質を含む液体培養培地のＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１への供給から、それぞれＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ２からの組換えタンパク質の溶出までの経過時間は、例えば、約４時間超〜約４０時間未満（両端を含む）、例えば、約４時間超〜約３９時間未満、約３８時間、約３７時間、約３６時間、約３５時間、約３４時間、約３３時間、約３２時間、約３１時間、約３０時間、約２９時間、約２８時間、約２７時間、約２６時間、約２５時間、約２４時間、約２３時間、約２２時間、約２１時間、約２０時間、約１９時間、約１８時間、約１７時間、約１６時間、約１５時間、約１４時間、約１３時間、約１２時間、約１１時間、約１０時間、約９時間、約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、または約４．５時間（両端を含む）である。
これらの方法のいずれかで使用することができるＭＣＣＳ（ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１、および／またはＭＣＣＳ２）の非限定的な局面は米国仮特許出願第６１／７７５，０６０号および同第６１／８５６，３９０号（各々参照によって本明細書に組み入れる）に記載されている。
いくつかの代表的な方法は保持する工程を利用しない（例えば、方法全体でリザーバ（例えば、停留タンク（ｂｒｅａｋ ｔａｎｋ））を使用しない）。他の方法においては、方法全体で最大１、２、３、４、または５個のリザーバ（例えば、停留タンク）が使用される。本明細書に記載の方法のいずれも方法全体で最大１、２、３、４、または５個のリザーバ（例えば、停留タンク）を利用することができ、ここで各々の停留タンクは、例えば、約５分〜約６時間未満（両端を含む）、例えば、約５分〜約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間、または約３０分（両端を含む）の全期間の間組換えタンパク質のみを保持する。
いくつかの方法は１、２、３、４、５、または６個のリザーバ（例えば、停留タンク）を利用し、例えば、１ｍＬ〜約３００ｍＬ（両端を含む）、例えば、１ｍＬ〜約２８０ｍＬ、約２６０ｍＬ、約２４０ｍＬ、約２２０ｍＬ、約２００ｍＬ、約１８０ｍＬ、約１６０ｍＬ、約１４０ｍＬ、約１２０ｍＬ、約１００ｍＬ、約８０ｍＬ、約６０ｍＬ、約４０ｍＬ、約２０ｍＬ、または約１０ｍＬ（両端を含む）である容量を有することができる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に供給される前に流体を保持するために（本明細書に記載の方法のいずれかで）使用されるいずれのリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））も、例えば、ＭＣＣＳの第１のカラムすなわちＭＣＣＳ１の装填体積の１ｍＬ〜約１００％（両端を含む）、例えば、１ｍＬ〜約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、または約５％（両端を含む）である容量を有することができる。ＭＣＣＳ１からの溶出液がＭＣＣＳ２に入る前にその溶出液を保持するためにリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））を使用することができ、このリザーバは、例えば、ＭＣＣＳ２の第１のカラムの装填体積の１ｍＬ〜約１００％（両端を含む）、例えば、１ｍＬ〜約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、または約５％（両端を含む）である容量を有することができる。
これらの方法の様々なさらなる局面は以下に詳細に記載され、本明細書に提供される方法において制限されることなく任意の組合せで使用することができる。提供される方法の代表的な局面が以下に記載されているが、当業者には理解されるように、本明細書に記載の方法に追加の工程を加えることができ、他の材料を使用して本明細書に記載の方法のいずれかの工程を実行することができる。
液体培養培地
実質的に細胞を含まない組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を含む液体培養培地は任意の起源に由来することができる。例えば、液体培養培地は組換え細胞培養物（例えば、組換え細菌、酵母、または哺乳類細胞培養物）から得ることができる。液体培養培地は、流加式細胞（例えば、哺乳類細胞）培養物（例えば、組換えタンパク質を分泌する哺乳類細胞の培養物を含む流加式バイオリアクター）または潅流細胞（例えば、哺乳類細胞）培養物（例えば、組換えタンパク質を分泌する哺乳類細胞の培養物を含む潅流バイオリアクター）から得ることができる。液体培養培地はまた、組換えタンパク質を分泌する細菌または酵母細胞の培養物からの清澄化液体培養培地であることもできる。
組換え細胞培養物から得た液体培養培地をろ過または清澄化して、細胞および／またはウィルスを実質的に含まない液体培養培地を得ることができる。細胞を除去するために液体培養培地をろ過または清澄化する方法は当技術分野で公知である（例えば、０．２−μｍのろ過およびＡｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ（ＡＴＦＴＭ）システムを用いるろ過）。組換え細胞はまた、遠心分離を用い、実質的に細胞を含まない液体培養培地である上澄みを除去して液体培養培地から除去することもでき、または液体培養培地を含む容器（例えば、バイオリアクター）の重力方向の底部（ｇｒａｖｉｔａｔｉｏｎａｌ ｂｏｔｔｏｍ）に細胞を沈降させ、沈降した組換え細胞から遠い液体培養培地（実質的に細胞を含まない液体培養培地）を除去することによっても液体培養培地から除去することができる。
液体培養培地は、本明細書に記載または当技術分野で公知の組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）のいずれかを産生する組換え細胞（例えば、組換え細菌、酵母、または哺乳類細胞）の培養物から得ることができる。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの例は、組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を産生する組換え細胞（例えば、組換え細菌、酵母、または哺乳類細胞）を培養する工程をさらに含むことができる。
液体培養培地は本明細書に記載または当技術分野で公知のあらゆる種類の液体培養培地であることができる。例えば、液体培養培地は：動物由来の成分を含まない液体培養培地、血清を含まない液体培養培地、血清を含有する液体培養培地、既知組成の液体培養培地、およびタンパク質を含まない液体培養培地からなる群から選択することができる。本明細書に記載の方法のいずれにおいても、培養物から得られた液体培養培地は、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に供給される前に第２の流体（例えば、緩衝液）の添加により希釈することができる。
実質的に細胞を含まない組換えタンパク質を含む液体培養培地は、液体培養培地をＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に供給する前に（例えば、約１５℃未満（例えば、約１０℃未満、約４℃未満、約０℃未満、約−２０℃未満、約−５０℃未満、約−７０℃未満、または約−８０℃未満）の温度で）少なくとも１日（例えば、少なくとも約２日、少なくとも約５日、少なくとも約１０日、少なくとも約１５日、少なくとも約２０日、または少なくとも約３０日）貯蔵することができる。あるいは、いくつかの例において、液体培養培地はバイオリアクターから直接ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に供給される（例えば、ろ過または清澄化工程の後バイオリアクターから直接ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に供給される）。
マルチカラムクロマトグラフィーシステム
本明細書に記載の方法は、ＭＣＣＳまたは２つまたはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つのまたは６つの）マルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）（例えば、ＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２）の使用を含む。ＭＣＣＳは、２つもしくはそれ以上のクロマトグラフィーカラム、２つもしくはそれ以上のクロマトグラフィー膜、または少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムと少なくとも１つのクロマトグラフィー膜との組合せを含み得る。非限定的な例において、ＭＣＣＳ（例えば、本明細書の方法のいずれかにおけるＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）は、４つのクロマトグラフィーカラム、３つのクロマトグラフィーカラムおよび１つのクロマトグラフィー膜、３つのクロマトグラフィーカラム、２つのクロマトグラフィーカラム、２つのクロマトグラフィー膜、ならびに、２つのクロマトグラフィーカラムおよび１つのクロマトグラフィー膜を含み得る。クロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜の組合せのさらなる例については、当業者ならば限定を伴うことなく、ＭＣＣＳ（例えば、本明細書に記載の方法のいずれかにおけるＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）における使用のために想定することができる。ＭＣＣＳ内に存在する個々のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜は、同一であってもよいし（例えば、同じ形状、容積、樹脂、捕獲機構および単位操作を有していてもよいし）、または異なっていてもよい（例えば、異なる形状、容積、樹脂、捕獲機構および単位操作のうち１つまたはそれ以上を有していてもよい）。ＭＣＣＳ（例えば、本明細書に記載の方法のいずれかにおけるＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）内に存在する個々のクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は、同じ単位操作（例えば、捕獲する単位操作、精製する単位操作またはポリッシュする単位操作）を実行することもできるし、または異なる単位操作（例えば、例えば捕獲すること、精製すること、ポリッシュすること、ウィルスを不活性化すること、組換えタンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨを調節すること、ならびにろ過することからできた群より選択される異なる単位操作）を実行することもできる。例えば、本明細書に記載の方法の例において、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜は組換えタンパク質を捕獲するという単位操作を実行する。
ＭＣＣＳ内に存在し得る（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内に存在し得る）１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）は、例えば、上下限も含めて約１ｍＬから約２ｍＬの間、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、約２５ｍＬ、約３０ｍＬ、約３５ｍＬ、約４０ｍＬ、約４５ｍＬ、約５０ｍＬ、約５５ｍＬ、約６０ｍＬ、約６５ｍＬ、約７０ｍＬ、約７５ｍＬ、約８０ｍＬ、約８５ｍＬ、約９０ｍＬ、約９５ｍＬ、または約１００ｍＬの間の樹脂体積を有し得る。ＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内に存在し得る）内に存在し得る１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）は、約２ｍＬから約１００ｍＬの間、約２ｍＬから約９０ｍＬの間、約２ｍＬから約８０ｍＬの間、約２ｍＬから約７０ｍＬの間、約２ｍＬから約６０ｍＬの間、約２ｍＬから約５０ｍＬの間、約５ｍＬから約５０ｍＬの間、約２ｍＬから約４５ｍＬの間、約５ｍＬから約４５ｍＬの間、約２ｍＬから約４０ｍＬの間、約５ｍＬから約４０ｍＬの間、約２ｍＬから約３５ｍＬの間、約５ｍＬから約３５ｍＬの間、約２ｍＬから約３０ｍＬの間、約５ｍＬから約３０ｍＬの間、約２ｍＬから約２５ｍＬの間、約５ｍＬから約２５ｍＬの間、約１５ｍＬから約６０ｍＬの間、約１０ｍＬから約６０ｍＬの間、約１０ｍＬから約５０ｍＬの間、および約１５ｍＬから約５０ｍＬの間の樹脂体積を有し得る。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて使用される、ＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）内の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）は、実質的に同じ樹脂体積を有していてもよいし、または相異なる樹脂体積を有していてもよい。ＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）内の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）のために使用される流量は、例えば約０．２ｍＬ／分から約２５ｍＬ／分の間（例えば、約０．２ｍＬ／分から約２０ｍＬ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約２０ｍＬ／分の間、約０．２ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１０ｍＬ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）であってよい。
ＭＣＣＳ内（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内）の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）は、実質的に同じ形状を有していてもよいし、または実質的に異なる形状を有していてもよい。例えば、ＭＣＣＳ内（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内）の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）は、円形シリンダー状になった実質的に同じ形状を有していてもよいし、または、長円形シリンダー状になった実質的に同じ形状を有していてもよい。
ＭＣＣＳ内に存在し得る（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内に存在し得る）１つまたはそれ以上のクロマトグラフィー膜（複数可）は、例えば約１ｍＬから約５００ｍＬの間（例えば、約１ｍＬから約４７５ｍＬの間、約１ｍＬ〜約４５０ｍＬ、約１ｍＬ〜約４２５ｍＬ、約１ｍＬ〜約４００ｍＬ、約１ｍＬ〜約３７５ｍＬ、約１ｍＬ〜約３５０ｍＬ、約１ｍＬ〜約３２５ｍＬ、約１ｍＬ〜約３００ｍＬ、約１ｍＬ〜約２７５ｍＬ、約１ｍＬ〜約２５０ｍＬ、約１ｍＬ〜約２２５ｍＬ、約１ｍＬ〜約２００ｍＬ、約１ｍＬ〜約１７５ｍＬ、約１ｍＬ〜約１５０ｍＬ、約１ｍＬ〜約１２５ｍＬ、約１ｍＬ〜約１００ｍＬ、約２ｍＬ〜約１００ｍＬ、約５ｍＬ〜約１００ｍＬ、約１ｍＬ〜約８０ｍＬ、約２ｍＬ〜約８０ｍＬ、約５ｍＬ〜約８０ｍＬ、約１ｍＬ〜約６０ｍＬ、約２ｍＬ〜約６０ｍＬ、約５ｍＬ〜約６０ｍＬ、約１ｍＬ〜約４０ｍＬ、約２ｍＬ〜約４０ｍＬ、約５ｍＬ〜約４０ｍＬ、約１ｍＬ〜約３０ｍＬ、約２ｍＬ〜約３０ｍＬ、約５ｍＬ〜約３０ｍＬ、約１ｍＬから約２５ｍＬの間、約２ｍＬから約２５ｍＬの間、約１ｍＬから約２０ｍＬの間、約２ｍＬから約２０ｍＬの間、約１ｍＬから約１５ｍＬの間、約２ｍＬから約１５ｍＬの間、約１ｍＬから約１０ｍＬの間、または約２ｍＬから約１０ｍＬの間）のベッドボリュームを有し得る。
１つまたはそれ以上の（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４）異なる種類の低減したバイオバーデンの緩衝液が、本明細書に記載の方法のいずれかにおけるＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２の使用中に用いられ得る。当技術分野で公知のように、本明細書に記載の方法でＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１、および／またはＭＣＣＳ２に使用される低減したバイオバーデンの緩衝液の１つまたはそれ以上の種類は、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１、および／またはＭＣＣＳ２のクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）に存在する樹脂、組換えタンパク質の生物物理学的な性質、ならびにＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１、および／またはＭＣＣＳ２の特定のクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜により実行される単位操作（例えば、本明細書に記載の代表的な単位操作のいずれか）に依存する。本明細書に記載の方法のいずれかにおけるＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２の使用中に用いられるバッファーの体積および種類は、当業者によって決定することもできる（例えば、以下でより詳細に論述している）。例えば、本明細書に記載の方法のいずれかにおけるＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２の使用中に用いられるバッファーの体積および種類（複数可）は、精製された組換えタンパク質（例えば、組換えタンパク質薬物生成物）における次のもののうち１つまたはそれ以上を最適化するために選択することができる：組換えタンパク質の総合的収率、組換えタンパク質の活性、組換えタンパク質の純度の水準、および、組換えタンパク質を含む流体（例えば、液体培養培地）からの生物型夾雑物の除去（例えば、活性ウィルス、マイコバクテリア、酵母、細菌または哺乳類細胞の非存在）。
ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は、定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ）であってよい。ＰＣＣＳは例えば、２つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムからの組換えタンパク質の連続的な溶出を可能にするために切り替えられる、２つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（例えば、３つのカラムまたは４つのカラム）を含み得る。ＰＣＣＳは、２つもしくはそれ以上のクロマトグラフィーカラムを含み得、２つもしくはそれ以上のクロマトグラフィー膜を含み得、または少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび少なくとも１つのクロマトグラフィー膜を含み得る。カラム動作（サイクル）は一般に、装填工程、洗浄工程、溶出工程および再生工程からなる。ＰＣＣＳにおいては、サイクル方式にして同じ工程を別々に連続的に稼動させるために、複数のカラムが使用される。カラムが直列で動作するため、１つのカラムから出てくる通過画分および洗浄剤は、別のカラムによって捕捉される。こうしたＰＣＣＳに特有の特色は、バッチモード時のクロマトグラフィー中に典型的であるのと同様に、動的結合能力ではなく静的結合能力に近くなった樹脂のローディングを可能にする。連続的なサイクル運転および溶出の結果として、ＰＣＣＳに入り込む流体が連続的に処理され、組換えタンパク質を含む溶出液が連続的に製造される。
ＰＣＣＳサイクルで１つの工程から別の工程に進むためにカラム切り替え方策が使用される。ＰＣＣＳで使用することができるカラム切り替えの例は米国仮特許出願第６１／７７５，０６０号および同第６１／８５６，３９０号に記載されている。例えば、カラム切り替え方法はカラム毎に２つの自動化された切り替え操作を使用することができる：その第１は最初の生成物の破過に関連し、第２はカラム飽和に対応する。カラム切り替え操作をいつ発生させるべきかという決定は、ＰＣＣＳ内に存在する各クロマトグラフィーカラムから出てくる溶出液中の組換えタンパク質濃度を監視すること（例えば、ＵＶ監視によって実行される監視）によって決定することができる。例えば、カラム切り替えは、フィードバック制御を用いた生成物濃度のインライン測定が可能な任意のＰＡＴツールにより、決定することができる。ＰＡＴツールは、フィードバック制御を用いた生成物濃度の実時間インライン測定が可能である。当技術分野で公知になっているのと同様に、カラム転換は、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜を流体（例えば、バッファー）が通過する時間または通過する量に基づいて設計することもできる。
ＰＣＣＳにおいて、ＰＣＣＳ内に存在する各クロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜上における組換えタンパク質の滞留時間（ＲＴ）は、第１のカラム／膜からの破過がＰＣＣＳ内の別のカラム／膜によって捕捉され得るため、カラム／膜のサイズ増大を伴うことなく短縮され得る。連続的な方法によるシステムは、式：Ｖ＝Ｄ＊ＲＴを用いてカラム／膜容積（Ｖ）およびＲＴを変化させることにより、任意の潅流速度（Ｄ）で液体培養培地を処理するように設計され得る。
本記載の方法において使用されるＭＣＣＳまたはＭＣＣ１および／もしくはＭＣＣＳ２によって実行され得る１つまたはそれ以上の単位操作には例えば、組換えタンパク質を捕獲すること、組換えタンパク質を含む流体中に存在するウィルスを不活性化すること、組換えタンパク質を精製すること、組換えタンパク質をポリッシュすること、（例えば、本明細書に記載の例示的な任意の停留タンク（複数可）を用いて）組換えタンパク質を含む流体を保持すること、組換えタンパク質を含む流体から出てくる粒子状材料および／または細胞をろ過または除去すること、ならびに、組換えタンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨを調節することが挙げられる。
いくつかの実施形態において、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は組換えタンパク質を捕獲するという単位操作を実行する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜を含む。捕獲する単位操作は、例えば捕獲機構を利用する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー樹脂を用いて、実行することができる。捕獲機構の非限定的な例には、タンパク質Ａ結合式捕獲機構、抗体結合式または抗体フラグメント結合式捕獲機構、基質結合式捕獲機構、アプタマー結合式捕獲機構、タグ結合式捕獲機構（例えば、ポリＨｉｓタグに基づいた捕獲機構）および補因子結合式捕獲機構が挙げられる。捕獲はまた、カチオン交換もしくはアニオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行するのに使用することができる樹脂を用いて実行することもできる。組換えタンパク質を捕捉するために使用され得る非限定的な樹脂は、本明細書で記載されている。組換えタンパク質を捕捉するために使用され得る樹脂のさらなる例は、当技術分野で公知である。
組換えタンパク質を含む流体中に存在するウィルスを不活性化する単位操作は、（例えば、少なくとも３０分の期間（例えば、約３０分から１．５時間の間の期間、約３０分から１．２５時間の間の期間、約０．７５時間から１．２５時間の間の期間、または約１時間の期間）にわたって約３．０から５．０の間（例えば、約３．５から約４．５の間、約３．５から約４．２５の間、約３．５から約４．０の間、約３．５から約３．８の間、または約３．７５）のｐＨで組換えタンパク質を含む流体をインキュベートすることができる、例えばクロマトグラフィーカラム、クロマトグラフィー膜または保持タンクを含む）ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２を用いて、実行することができる。
組換えタンパク質を精製する単位操作は、例えば捕捉システムを利用する樹脂を含んでいる例えばクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を含む、１つまたはそれ以上のＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）を用いて、実行することができる。捕獲機構の非限定的な例には、タンパク質Ａ結合式捕獲機構、抗体結合式または抗体フラグメント結合式捕獲機構、基質結合式捕獲機構、アプタマー結合式捕獲機構、タグ結合式捕獲機構（例えば、ポリＨｉｓタグに基づいた捕獲機構）および補因子結合式捕獲機構が挙げられる。精製することは、カチオン交換もしくはアニオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行するために使用され得る樹脂を用いて、実行することもできる。組換えタンパク質を精製するために使用され得る非限定的な樹脂は、本明細書で記載されている。組換えタンパク質を精製するために使用され得る樹脂のさらなる例は、当技術分野で公知である。
組換えタンパク質をポリッシュする単位操作は、例えばカチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行するために使用され得る樹脂を含んでいる、例えばクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を含む、１つまたはそれ以上のＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）を用いて、実行することができる。組換えタンパク質をポリッシュするために使用され得る非限定的な樹脂は、本明細書で記載されている。組換えタンパク質をポリッシュするために使用され得る樹脂のさらなる例は、当技術分野で公知である。
組換えタンパク質を含む流体を保持する単位操作は、少なくとも１つのリザーバ（例えば、停留タンク）を含む、またはＭＣＣＳもしくはＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２とを合算して最大で１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））を含む、ＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）を用いて、実行することができる。例えば、上記保持する単位操作を達成するために使用され得るリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））はそれぞれ、約１ｍＬから約１Ｌの間（例えば、約１ｍＬから約８００ｍＬの間、約１ｍＬから約６００ｍＬの間、約１ｍＬから約５００ｍＬの間、約１ｍＬから約４００ｍＬの間、約１ｍＬから約３５０ｍＬの間、約１ｍＬから約３００ｍＬの間、約１０ｍＬから約２５０ｍＬの間、約１０ｍＬから約２００ｍＬの間、約１０ｍＬから約１５０ｍＬの間または約１０ｍＬから約１００ｍＬの間）の体積を有し得る。本明細書に記載の方法において使用されるリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））は、例えば上下限も含めて１ｍＬから約３００ｍＬの間、例えば、上下限も含めて１ｍＬから約２８０ｍＬ、約２６０ｍＬ、約２４０ｍＬ、約２２０ｍＬ、約２００ｍＬ、約１８０ｍＬ、約１６０ｍＬ、約１４０ｍＬ、約１２０ｍＬ、約１００ｍＬ、約８０ｍＬ、約６０ｍＬ、約４０ｍＬ、約２０ｍＬまたは約１０ｍＬの間である、容量を有し得る。流体がＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に進入するまで流体を保持しておくために（本明細書に記載の方法のいずれかにおいて）使用される、任意のリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））は、例えば上下限も含めて１ｍＬから第１のＭＣＣＳの第１のカラムの負荷量の約１００％の間、上下限も含めて約１ｍＬからＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１の第１のカラムの負荷量の約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％または約５％の間である、容量を有し得る。溶出液がＭＣＣＳ２に入る前に（組換えタンパク質を含む）ＭＣＣＳ１からの溶出液を保持するのに使用されるリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））のいずれも、例えば、ＭＣＣＳ２の第１のカラムの装填体積の１ｍＬ〜約１００％（両端を含む）、例えば、約１ｍＬ〜約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、または約５％（両端を含む）の容量を有することができる。
リザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））はそれぞれ、少なくとも１０分（例えば、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間または少なくとも６時間）にわたって、組換えタンパク質を含む流体を保持することができる。他の例において、リザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））は、例えば上下限も含めて約５分から約６時間未満の間、例えば上下限も含めて約５分から約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間または約３０分の間という合計時間での期間にわたって、組換えタンパク質のみを保持する。リザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））は、組換えタンパク質を含む流体の保持と（例えば、２５℃未満、１５℃未満または１０℃未満の温度における）冷蔵の両方を実行するために使用され得る。リザーバは、円形シリンダー、長円形シリンダー、または、ほぼ長方形で密封済みの不透過性袋を含めて、任意の形状を有し得る。
組換えタンパク質を含む流体をろ過する単位操作は、例えばフィルターを含むまたは分子ふるい樹脂を含んでいるクロマトグラフィーカラムもしくはクロマトグラフィー膜を含む、ＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）を用いて、実行することができる。当技術分野で公知であるとおり、沈殿した任意の材料および／または細胞（例えば、沈殿した折り畳まれていないタンパク質；沈殿した望ましくない宿主細胞タンパク質；沈殿した脂質；細菌；酵母細胞；真菌細胞；マイコバクテリア；および／または哺乳類細胞）を除去することができる、多種多様なサブミクロンフィルター（例えば、１μｍ未満、０．５μｍ未満、０．３μｍ未満、約０．２μｍ、０．２μｍ未満、１００ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満または１０ｎｍ未満の細孔径を有するフィルター）が、当技術分野で入手可能である。約０．２μｍまたは０．２μｍ未満の細孔径を有するフィルターは、組換えタンパク質を含む流体から細菌を効果的に除去することが知られている。当技術分野で公知であるとおり、分子ふるい樹脂を含んでいるクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜もまた、組換えタンパク質を含む流体をろ過する単位操作を実行するために、ＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）内に使用することができる。
組換えタンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨを調節する単位操作は、バッファー調節リザーバ（例えば、インラインバッファー調節リザーバ）を含んでいて利用する、ＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）を用いて、実行することができ、このバッファー調節リザーバは、（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／もしくはＭＣＣＳ２内部にあるカラムどうしの間、または、終わりから二番目のＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ１）内にある最後のカラムの後から、組換えタンパク質を含む流体が次のＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ２）の第１のカラムに送り込まれる前までの間に）組換えタンパク質を含む流体中に新たなバッファー溶液を添加する。当技術分野で理解され得るのと同様に、インラインバッファー調節リザーバは、任意のサイズ（例えば、１００ｍＬ超）であってよく、任意の緩衝液（例えば、次のもののうち１つまたはそれ以上を有する緩衝液：組換えタンパク質を含む流体に比較して増大もしくは減少するｐＨ、組換えタンパク質を含む流体に比較して増大もしくは減少するイオン（例えば、塩）濃度、および／または、ＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムもしくは少なくとも１つのクロマトグラフィー膜中に存在する樹脂への結合において組換えタンパク質と競合して濃度が増大もしくは減少する作用物質）を収容し得る。
ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は、２つまたはそれ以上の単位操作を実行することができる。例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２はそれぞれ、少なくとも次の単位操作を実行することができる：組換えタンパク質を捕獲すること、および組換えタンパク質を含む流体中に存在するウィルスを不活性化すること；組換えタンパク質を捕獲すること、組換えタンパク質を含む流体中に存在するウィルスを不活性化すること、ならびに組換えタンパク質を含む液体のイオン濃度および／またはｐＨを調節すること；組換えタンパク質を精製すること、および組換えタンパク質をポリッシュすること；組換えタンパク質を精製すること、組換えタンパク質をポリッシュすること、ならびに、組換えタンパク質を含む流体をろ過することまたは組換えタンパク質を含む流体から沈殿物および／もしくは特定の物質を除去すること；ならびに、組換えタンパク質を精製すること、組換えタンパク質をポリッシュすること、組換えタンパク質を含む流体をろ過することまたは組換えタンパク質を含む流体から沈殿物および／もしくは特定の微粒子状物質を除去すること、ならびに組換えタンパク質を含む液体のイオン濃度および／またはｐＨを調節すること。
組換えタンパク質を捕獲する
本方法は、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１を用いて組換えタンパク質を捕獲する工程を含む。当技術分野において認識することができるように、組換えタンパク質を含む液体培養培地は、種々の異なる手段を用いてＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１上に連続的に供給することができる。例えば、液体培養培地はＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１中に能動的にポンプで送ることができ、または液体培養培地は重力を用いてＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１中に供給することができる。液体培養培地はＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１中に供給する前にリザーバ（例えば、保持タンク）に貯蔵することができ、または、液体培養培地は細胞（例えば、組換えタンパク質を培地中に分泌する哺乳類細胞）の培養物を含むバイオリアクターからＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１中に能動的にポンプで送ることができる。
液体培養培地は約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１４ｍＬ／分、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量でＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１中に供給する（装填する）ことができる。組換えタンパク質を含む液体培養培地は本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の典型的な出所のいずれかに由来することができる。
いくつかの例は、さらに、液体培養培地をＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１中に供給する前にろ過する任意選択の工程を含む。本明細書に記載の組換えタンパク質を含む液体培養培地もしくは流体をろ過する典型的な手段のいずれか、または当技術分野で公知の任意のろ過手段を、組換えタンパク質を含む液体培養培地をＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１中に供給する前にろ過するために使用することができる。
本明細書に記載の方法において、組換えタンパク質の液体培養培地からの捕獲はＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１を用いて実行される。当技術分野において認識することができるように、組換えタンパク質の捕獲を達成するためには、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたは少なくとも１つのクロマトグラフィー膜が、捕獲機構（例えば、本明細書に記載の典型的な捕獲機構のいずれか）を利用する樹脂を含むか、またはカチオン交換、アニオン交換、もしくは分子ふるいクロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行することができる樹脂を含まなければならない。例えば、組換えタンパク質が抗体または抗体フラグメントであれば、捕獲システムはプロテインＡ−結合捕獲機構または抗原−結合捕獲機構（この場合捕獲抗原は組換え抗体または抗体フラグメントにより特異的に認識される）であることができる。組換えタンパク質が酵素であれば、捕獲機構は、組換え酵素を捕獲するために酵素に特異的に結合する抗体もしくは抗体フラグメントを、組換え酵素を捕獲するために酵素の基質を、組換え酵素を捕獲するために酵素の補因子を、または、組換え酵素がタグを含む場合、組換え酵素内に存在するタグに特異的に結合するタンパク質、金属キレート、もしくは抗体（もしくは抗体フラグメント）を使用することができる。組換えタンパク質を捕獲するために使用することができる非限定的な樹脂は本明細書に記載されており、組換えタンパク質を捕獲するのに使用することができる追加の樹脂は当技術分野で公知である。プロテインＡ−結合捕獲機構を利用する樹脂の１つの非限定的な例はＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）である。
組換えタンパク質を捕獲するために使用することができるＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在するクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の典型的な非限定的な大きさおよび形状は本明細書中に記載されている。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１中に供給される（装填される）液体培養培地は、例えば、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質（例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約９０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約８０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約７０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約６０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜１５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質）を含むことができる。捕獲する単位操作を実行するために使用される樹脂に組換えタンパク質が結合するのに必要とされる平均時間は、例えば、約５秒〜約１０分（例えば、約１０秒〜約８分、約１０秒〜約７分、約１０秒〜約６分、約１０秒〜約５分、約３０秒〜約５分、約１分〜約５分、約１０秒〜約４分、約３０秒〜約４分、または約１分〜約４分）であることができる。
当技術分野において認識することができるように、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在するクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を用いて組換えタンパク質を捕獲するためには、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在するクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を装填し、洗浄し、溶離し、再生するという連続したクロマトグラフィー工程を実行しなければならない。本明細書に記載の連続したクロマトグラフィー工程の各々に割り当てられる典型的な流量、バッファー容積、および／または時間の長さのいずれかを、これらの異なる連続したクロマトグラフィー工程の１つまたはそれ以上（例えば、組換えタンパク質を捕獲するのに使用されるＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在するクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を装填し、洗浄し、溶離し、再生するという連続したクロマトグラフィー工程の１つまたはそれ以上）で使用することができる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１（例えば、ＰＣＣＳまたはＰＣＣＳ１）でクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜を捕獲するのに使用することができる各々の連続したクロマトグラフィー工程に割り当てられる非限定的な流量、バッファー容積、および／または時間の長さは以下に提供される。加えて、ＭＣＣＳおよび／またはＭＣＣＳ１に使用することができる典型的なバッファーは以下に記載される。
捕獲する単位操作を実行することができる樹脂（例えば、本明細書に記載の捕獲するのに使用することができる典型的な樹脂のいずれか）を含む少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜を含むＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、上に記載した装填流量（供給速度）のいずれかを用いて、組換えタンパク質を含む液体培養培地を装填することができる。いくつかの例において、捕獲する単位操作を実行することができる樹脂を含有する単一のクロマトグラフィーカラムまたは単一のクロマトグラフィー膜が、例えば、約１０分〜約９０分（例えば、約１５分から約９０分の間、約２０分から約８０分の間、約３０分から約８０分の間、約４０分から約８０分の間、約５０分から約８０分の間、および約６０分から約８０分の間）で装填される。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１が、捕獲する単位操作を実行することができる樹脂を含む少なくとも２つのクロマトグラフィーカラムを直列に含むいくつかの例において、２つのクロマトグラフィーカラムを連続して装填するのに必要とされる時間は、例えば、約５０分〜約１８０分（例えば、約６０分から約１８０分の間、約７０分から約１８０分の間、約８０分から約１８０分の間、約９０分から約１８０分の間、約１００分から約１８０分の間、約１１０分から１５０分の間、および約１２５分から約１４５分の間）である。
捕獲する単位操作を実行することができる樹脂を含むＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上への組換えタンパク質の装填の後、その少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を少なくとも１種の洗浄用バッファーで洗浄する。当技術分野において認識することができるように、少なくとも１種（例えば、２、３、または４種）の洗浄用バッファーとは、組換えタンパク質ではない全てのタンパク質を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から溶出する一方で、組換えタンパク質と樹脂との相互作用を乱さないことを意味する。
洗浄バッファーは、約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１４ｍＬ／分、約１．０ｍＬ／分〜約２５．０ｍＬ／分、約１．０ｍＬ／分〜約１５．０ｍＬ／分）の流量で少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を通過させることができる。使用される洗浄バッファーの容積（例えば、１より多くの洗浄バッファーを使用するときの洗浄バッファーの合計総容積）は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約１５ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。洗浄の合計時間は、例えば、約２分〜約３時間（例えば、約２分〜約２．５時間、約２分〜約２．０時間、約５分〜約１．５時間、約１０分〜約１．５時間、約１０分〜約１．２５時間、約２０分〜約１．２５時間、または約３０分〜約１時間）であることができる。
捕獲する単位操作を実行することができる樹脂を含むＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の洗浄の後、捕獲する単位操作を実行することができる樹脂を含むＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に溶出バッファーを通すことによって、組換えタンパク質を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から溶離する。溶出バッファーは、捕獲する単位操作を実行することができる樹脂を含む少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を、約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約６．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約５．０ｍｇ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で通過することができる。精製する単位操作を実行することができる樹脂を含む少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の各々から組換えタンパク質を溶離するために使用される溶出バッファーの容積は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約１５ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。溶離する合計時間は、例えば、約２分〜約３時間（例えば、約２分〜約２．５時間、約２分〜約２．０時間、約２分〜約１．５時間、約２分〜約１．５時間、約２分〜約１．２５時間、約２分〜約１．２５時間、約２分〜約１時間、約２分から約４０分の間、約１０分から約４０分の間、約２０分から約４０分の間）であることができる。これらの方法で使用することができる溶出バッファーの非限定的な例は捕獲機構および／または組換えタンパク質に依存する。例えば、溶出バッファーは、異なる濃度の塩（例えば、増大した塩濃度）、異なるｐＨ（例えば、増大または低減した塩濃度）、または捕獲する単位操作を実行することができる樹脂に対する結合に関して組換えタンパク質と競合する分子を含むことができる。本明細書に記載の各々の典型的な捕獲機構に対するかかる溶出バッファーの例は当技術分野で周知である。
捕獲する単位操作を実行することができる樹脂を含むＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から組換えタンパク質を溶離した後、次の容積の液体培養培地を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上に装填することができる前に、その少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を、再生バッファーを用いて平衡化しなければならない。再生バッファーは、捕獲する単位操作を実行することができる樹脂を含む少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を、例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約６．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約５．０ｍｇ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約５．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間、または約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で通すことができる。いくつかの例において、再生緩衝液は変性用緩衝液（例えば、本明細書に記載の変性用緩衝液のいずれかまたは変性用緩衝液の組合せ）である。捕獲する単位操作を実行することができる樹脂を含む少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を平衡化するために使用される再生バッファーの容積は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約１５ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約５ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。
本明細書に記載の方法のいくつかで、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、組換えタンパク質を含む流体を、低いｐＨ（例えば、ｐＨ４．６未満、４．４未満、４．２未満、４．０未満、３．８未満、３．６未満、３．４未満、３．２未満、または３．０未満）に、例えば、約１分〜１．５時間（例えば、約１時間）保持し、組換えタンパク質を含む流体中に存在するウィルスを不活化するリザーバを含んでいる。ウィルスを不活化する単位操作を実行するために使用することができるリザーバの一例は、例えば、組換えタンパク質を含む流体をＭＣＣＳ２中に供給する前に、その組換えタンパク質を含む流体を例えば約１分〜１．５時間保持することができる撹拌フラスコ（ｓｔｉｒ ｆｌａｓｋ）（例えば、５００−ｍＬ撹拌フラスコ、例えば、プログラムされた撹拌プレート（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｓｔｉｒ ｐｌａｔｅ）付きの５００−ｍＬ撹拌フラスコ）である。ウィルスの不活化の単位操作を実行するために使用されるリザーバは、プログラムされた撹拌プレート（例えば、リザーバ内で流体を、例えば４時間毎に混合する（例えば、定期的に混合する）ようにプログラムされた撹拌プレート）付きの５００−ｍＬ撹拌フラスコであることができる。ウィルスの不活化の単位操作を実行するために使用することができるリザーバのもう１つ別の例は、例えば、組換えタンパク質を含む流体をＭＣＣＳ２中に供給する前に、その組換えタンパク質を含む流体を例えば約１分〜１．５時間保持することができるプラスチックバッグ（例えば、５００−ｍＬプラスチックバッグ）である。いくつかの例において、組換えタンパク質を含む流体は、ウィルスの不活化の単位操作を実行するために使用されるリザーバ中に供給されるとき、既に低いｐＨ（例えば、ｐＨ４．６未満、４．４未満、４．２未満、４．０未満、３．８未満、３．６未満、３．４未満、３．２未満、または３．０未満）を有していることができる。当業者には認識することができるように、ウィルスを不活化する単位操作を実行するために様々な他の手段を使用することができる。例えば、組換えタンパク質を含む流体のＵＶ照射も、ウィルスを不活化する単位操作を実行するために使用することができる。組換えタンパク質を含む流体中に存在するウィルスの不活化の単位操作を実行するために使用することができるリザーバの非限定的な例が本明細書中に記載されている。
ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は４つのクロマトグラフィーカラムを含むＰＣＣＳを含むことができ、ここで４つのクロマトグラフィーカラムのうちの少なくとも３つは（例えば、捕獲する単位操作を実行することができる樹脂を含む少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムのいずれか（例えば、本明細書に記載されているもののいずれか））を含むＭＣＣＳを用いて、組換えタンパク質を液体培養培地から捕獲する単位操作を実行する。これらの例において、ＰＣＣの第４のカラムは、組換えタンパク質を含む流体中のウィルスを不活化する単位操作を実行することができる（例えば、組換えタンパク質を含む流体のウィルスの不活化を達成するために使用することができる本明細書中に記載の典型的なカラムのいずれか）。
いくつかの例において、組換えタンパク質を含む流体がＭＣＣＳ１（例えば、ＰＣＣＳ１）から連続的に溶出され、ＭＣＣＳ２（例えば、ＰＣＣＳ２）に連続的に供給される。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１（例えば、ＰＣＣＳまたはＰＣＣＳ１）の溶出液中に回収される組換えタンパク質の割合（％）は、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７２％、少なくとも７４％、少なくとも７６％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、または少なくとも９８％であることができる。ＭＣＣＳ１（例えば、ＰＣＣＳ１）からの溶出液は当技術分野で公知の種々の手段（例えば、配管）を用いてＭＣＣＳ２（例えば、ＰＣＣＳ２）中に供給することができる。ＭＣＣＳ１（例えば、ＰＣＣＳ１）の溶出液は、例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約６．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約５．０ｍｇ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約５．０ｍＬ／分〜約１５．０ｍＬ／分、約１５ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分、または約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量でＭＣＣＳ２（例えば、ＰＣＣＳ２）中に供給することができる。
本明細書に記載のいくつかの方法は、さらに、ＭＣＣＳ１（例えば、ＰＣＣＳ１）からの溶出液のイオン濃度および／またはｐＨを、その溶出液がＭＣＣＳ２（例えば、ＰＣＣＳ２）中に供給される前に調節する工程を含むことができる。本明細書に記載されているように、ＭＣＣＳ１（例えば、ＰＣＣＳ１）からの溶出液のイオン濃度および／またはｐＨは、（その溶出液がＭＣＣＳ２中に供給される前に）その溶出液に（例えば、インラインバッファー調節リザーバを使用することにより）バッファーを添加することによって調節することができる。このバッファーは、例えば、約０．１ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分（例えば、約０．１ｍＬ／分〜約１２．５ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約１０．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約８．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約６ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約４ｍＬ／分、または約０．５ｍＬ／分〜約５ｍＬ／分）の流量でＭＣＣＳ１からの溶出液に添加することができる。
本明細書に記載の方法は、さらに、ＭＣＣＳ１からの溶出液をＭＣＣＳ２中に供給する前にそのＭＣＣＳ１からの溶出液を保持または貯蔵する（かつ場合により冷蔵する）工程を含むことができる。本明細書に記載されているように、この保持または貯蔵する工程は本明細書に記載のリザーバのいずれか（例えば、バックアップタンク）を用いて実行することができる。
本明細書に記載の方法はまた、ＭＣＣＳ１からの溶出液をＭＣＣＳ２中に供給する前にその溶出液をろ過する工程も含むことができる。本明細書に記載のろ過方法または典型的なフィルターのいずれもＭＣＣＳ１からの溶出液をＭＣＣＳ２中に供給する前にその溶出液をろ過するために使用することができる。
組換えタンパク質をポリッシュおよび精製する
ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１、および／またはＭＣＣＳ２は組換えタンパク質を精製しポリッシュするという単位操作を実行するのに使用することができる。例えば、ＭＣＣＳ２を使用して組換えタンパク質を精製しポリッシュする操作を実行することができ、ＭＣＣＳ２からの溶出液はタンパク質原薬である。ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は、組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つ（例えば、２つ、３つ、または４つ）のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜、および組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つ（例えば、２つ、３つ、または４つ）のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を含むことができる。
組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜は、捕獲機構（例えば、本明細書に記載されているかまたは当技術分野で公知の捕獲機構のいずれか）を利用する樹脂、またはアニオン交換、カチオン交換、分子ふるいクロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行するために使用することができる樹脂を含むことができる。組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜はアニオン交換、カチオン交換、分子ふるいクロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行するために使用することができる樹脂（例えば、本明細書に記載されているかまたは当技術分野で公知のアニオン交換、カチオン交換、分子ふるいクロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行するための典型的な樹脂のいずれか）を含むことができる。
組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムもしくはクロマトグラフィー膜の大きさ、形状、および容積、ならびに／または組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィー膜の大きさおよび形状は、本明細書に記載のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の典型的な大きさ、形状、および容積の組合せのいずれかであることができる。当業者には認識することができるように、組換えタンパク質を精製またはポリッシュする工程は、例えば、組換えタンパク質を精製またはポリッシュする単位操作を実行するために使用される少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を装填する工程、洗浄する工程、溶離する工程、および平衡化する工程を含むことができる。通例、精製する単位操作を実行するために使用されるクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から出て来る溶出バッファーは組換えタンパク質を含む。通例、ポリッシュする単位操作を実行するために使用されるクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から出て来る装填および／または洗浄バッファーは組換えタンパク質を含む。
例えば、組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の大きさは、例えば、約２．０ｍＬ〜約２００ｍＬ（例えば、約２．０ｍＬ〜約１８０ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約１６０ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約１４０ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約１２０ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約１００ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約８０ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約６０ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約４０ｍＬ、約５．０ｍＬ〜約４０ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約３０ｍＬ、約５．０ｍＬ〜約３０ｍＬ、または約２．０ｍＬ〜約２５ｍＬ）の容積を有することができる。組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたは少なくとも１つのクロマトグラフィー膜上に装填されるときの組換えタンパク質を含む流体の流量は、例えば、約０．１ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．１ｍＬ／分〜約１２．５ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約１０．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約８．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約６ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約４ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約３ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約２ｍＬ／分、または約０．２ｍＬ／分〜約４ｍＬ／分）であることができる。組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上に装填される流体中の組換えタンパク質の濃度は、例えば、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質（例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約９０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約８０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約７０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約６０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜１５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質）であることができる。精製する単位操作を実行するために使用される少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜内の樹脂は、アニオン交換またはカチオン交換クロマトグラフィーを実行するために使用することができる樹脂であることができる。精製する単位操作を実行するために使用される少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜内の樹脂はカチオン交換樹脂（例えば、Ｃａｐｔｏ−Ｓ樹脂、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）であることができる。
組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上への組換えタンパク質の装填の後、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を少なくとも１種の洗浄用バッファーで洗浄する。当技術分野において認識することができるように、少なくとも１種（例えば、２種、３種、または４種）の洗浄用バッファーは、組換えタンパク質ではないあらゆるタンパク質を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から溶離する一方で、組換えタンパク質と樹脂の相互作用またはその他の点で組換えタンパク質の溶離を乱さないことを意味する。
洗浄バッファーは少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で通ることができる。使用される洗浄バッファーの容積（例えば、１種より多くの洗浄バッファーを使用する場合は洗浄バッファーの合計総容積）は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約１５ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２．５ＸＣＶ〜約５．０ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。洗浄の合計時間は、例えば、約２分〜約３時間（例えば、約２分〜約２．５時間、約２分〜約２．０時間、約５分〜約１．５時間、約１０分〜約１．５時間、約１０分〜約１．２５時間、約２０分〜約１．２５時間、約３０分〜約１時間、約２分から約１０分の間、約２分から約１５分の間、または約２分から約３０分の間）であることができる。
組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の洗浄後、組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に溶出バッファーを通すことによって組換えタンパク質を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から溶離する。溶出バッファーは、組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に、約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約６．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約５．０ｍｇ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、または約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で通すことができる。組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の各々から組換えタンパク質を溶離するために使用される溶出バッファーの容積は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約２５ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約２０ＸＣＶ、約１５ＸＣＶ〜約２５ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。溶離する合計時間は、例えば、約２分〜約３時間（例えば、約２分〜約２．５時間、約２分〜約２．０時間、約２分〜約１．５時間、約２分〜約１．５時間、約２分〜約１．２５時間、約２分〜約１．２５時間、約２分〜約１時間、約２分から約４０分の間、約１０分から約４０分の間、約２０分から約４０分の間、または約３０分から１．０時間の間）であることができる。これらの方法に使用することができる溶出バッファーの非限定的な例は樹脂および／または組換えタンパク質の生物物理学的な性質に依存する。例えば、溶出バッファーは、異なる濃度の塩（例えば、増大した塩濃度）、異なるｐＨ（例えば、上昇または低下した塩濃度）、または樹脂と結合することに関して組換えタンパク質と競合する分子を含むことができる。本明細書に記載の典型的な捕獲機構の各々に対してかかる溶出バッファーの例は当技術分野で周知である。
組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜からの組換えタンパク質の溶離の後、かつ組換えタンパク質を含む流体の次の容積を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上に装填することができる前に、その少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を、再生バッファーを用いて平衡化しなければならない。再生バッファーは、組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に、例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約６．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約５．０ｍｇ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約５．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間、または約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で通すことができる。組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる樹脂を含む少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を平衡化するために使用される再生バッファーの容積は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約１５ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約５ＸＣＶ、約２．５ＸＣＶ〜約７．５ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。組換えタンパク質を精製する単位操作を実行するために使用する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の溶出液中の組換えタンパク質の濃度は、例えば、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質（例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約９０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約８０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約７０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約６０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約２．５ｍｇ／ｍＬ〜約７．５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質）であることができる。
組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜は、カチオン交換、アニオン交換、または分子篩クロマトグラフィーを実行するために使用することができる樹脂を含むことができる。当技術分野において認識することができるように、組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を用いて組換えタンパク質をポリッシュすることは、例えば、組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を装填する工程、追跡する（ｃｈａｓｉｎｇ）工程、および再生する工程を含むことができる。例えば、装填、追跡、および再生する工程を用いてポリッシュを実行する場合、組換えタンパク質は、組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用される少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜中の樹脂と結合せず、組換えタンパク質は装填および追跡工程で少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から溶離され、再生工程は、組換えタンパク質を含む追加の流体を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上に装填することができる前に、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜からあらゆる不純物を除去するために使用される。装填、追跡、および再生工程の各々で使用される典型的な流量とバッファー容積は以下に記載する。
組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の大きさ、形状、および容積、ならびに／または組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィー膜の大きさおよび形状は、本明細書に記載のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の典型的な大きさ、形状、および容積の組合せのいずれかであることができる。例えば、組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の大きさは、例えば、約０．５ｍＬ〜約２００ｍＬ（例えば、約０．５ｍＬ〜約１８０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約１６０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約１４０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約１２０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約１００ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約８０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約６０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約４０ｍＬ、約５．０ｍＬ〜約４０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約３０ｍＬ、約５．０ｍＬ〜約３０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約２５ｍＬ、約０．２ｍＬ〜約１０ｍＬ、または約０．２ｍＬ〜約５ｍＬ）の容積を有することができる。組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上に装填されるときの組換えタンパク質を含む流体の流量は、例えば、約０．１ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．１ｍＬ／分〜約１２．５ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約１０．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約８．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約６ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約４ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約３ｍＬ／分、約２ｍＬ／分〜約６ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約２ｍＬ／分、または約０．２ｍＬ／分〜約４ｍＬ／分）であることができる。組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上に装填される組換えタンパク質を含む流体の総容積は、例えば、約１．０ｍＬ〜約２５０ｍＬ（例えば、約１．０ｍＬ〜約２２５ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約２００ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約１７５ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約１５０ｍＬ、約１００ｍＬ〜約１２５ｍＬ、約１００ｍＬ〜約１５０ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約１５０ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約１２５ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約１００ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約７５ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約５０ｍＬ、または約１．０ｍＬ〜約２５ｍＬ）であることができる。ポリッシュを実行するために使用される少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜内の樹脂はアニオン交換またはカチオン交換樹脂であることができる。ポリッシュする単位操作を実行するために使用される少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜内の樹脂はカチオン交換樹脂（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ樹脂，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）であることができる。
装填工程後、追跡工程を実行する（例えば、追跡バッファーを少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に通して、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に実質的に結合しない組換えタンパク質を収集する）。これらの例において、追跡バッファーは、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に、約０．２ｍＬ／分〜約５０ｍＬ／分（例えば、約１ｍＬ／分〜約４０ｍＬ／分、約１ｍＬ／分〜約３０ｍＬ／分、約５ｍＬ／分〜約４５ｍＬ／分、約１０ｍＬ／分〜約４０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、または約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で通すことができる。使用される追跡バッファーの容積は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約１００ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約９０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約８０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約７０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約６０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約５０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約４０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約３０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約２０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１５ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約２０ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約３０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２．５ＸＣＶ〜約５．０ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。追跡の合計時間は、例えば、約１分〜約３時間（例えば、約１分〜約２．５時間、約１分〜約２．０時間、約１分〜約１．５時間、約２分〜約１．５時間、約１分〜約１．２５時間、約２分〜約１．２５時間、約１分〜約５分、約１分〜約１０分、約２分〜約４分、約３０分〜約１時間、約２分から約１０分の間、約２分から約１５分の間、または約２分から約３０分の間）であることができる。装填工程および追跡工程でカラムを通って来る溶出液中に存在する組換えタンパク質の合わせた濃度は、例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質（例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約９０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約８０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約７０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約６０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約２．５ｍｇ／ｍＬから約７．５ｍｇ／ｍＬの間、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、または約１ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質）であることができる。
追跡する工程の後、そしてポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上に組換えタンパク質を含む流体の次の容積を装填することができる前に、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を再生バッファーを用いて再生しなければならない。再生バッファーは、組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に、例えば、約０．２ｍＬ／分〜約５０ｍＬ／分（例えば、約１ｍＬ／分〜約４０ｍＬ／分、約１ｍＬ／分〜約３０ｍＬ／分、約５ｍＬ／分〜約４５ｍＬ／分、約１０ｍＬ／分〜約４０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、または約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で通すことができる。ポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を再生するために使用される再生バッファーの容積は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約５００ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約４５０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約４００ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約３５０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約３００ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約２５０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約２００ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１５０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１００ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約９０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約８０ＸＣＶ、または約１ＸＣＶ〜約７０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約６０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約５０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約４０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約３０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約２０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１５ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約２０ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約３０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２．５ＸＣＶ〜約５．０ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。
他の例において、ポリッシュする単位操作を実行するために使用される１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜は、組換えタンパク質を含む流体中に存在する不純物を選択的に結合するかまたは保持する樹脂を含み、１つまたはそれ以上のカラムおよび／または膜の樹脂の結合能力に達するかまたは達したと実質的に同等になったら、１つまたはそれ以上のカラムおよび／または膜を再生する代わりに、１つまたはそれ以上のカラムおよび／または膜を取り替える（例えば、実質的に類似のカラムおよび／または膜と取り替える）。
本明細書に記載のこれらの方法のいくつかの例において、ＭＣＣＳ２は、例えば、３つのクロマトグラフィーカラムおよび１つのクロマトグラフィー膜を含むＰＣＣＳを含み、ここでＰＣＣＳ内の３つのクロマトグラフィーカラムは（例えば、タンパク質を精製する単位操作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムを用いて）組換えタンパク質を精製する単位操作を実行し、ＰＣＣＳ内のクロマトグラフィー膜は組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行する。これらの例で、治療用タンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができるＰＣＣＳ内のクロマトグラフィー膜は、組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができる、本明細書に記載の典型的なクロマトグラフィー膜のいずれかであることができる。本明細書に記載のカラムスイッチング法のいずれかを使用して、この例においてＰＣＣＳ内の第１の３つのクロマトグラフィーカラムおよびクロマトグラフィー膜を切り替えることができる時を決定することができる。
この例のいくつかの実施形態は、さらに、ＰＣＣＳ内の３つのクロマトグラフィーカラムからの溶出液をＰＣＣＳ内のクロマトグラフィー膜中に供給する前にその溶出液のイオン濃度および／またはｐＨを調節する工程を含むことができる。本明細書に記載されているように、ＰＣＣＳ内の３つのクロマトグラフィーカラムからの溶出液のイオン濃度および／またはｐＨは（この例においてはこの溶出液をＰＣＣＳ内のクロマトグラフィー膜中に供給する前に）（例えば、インラインバッファー調節リザーバの使用により）ＰＣＣＳ内の３つのクロマトグラフィーカラムの溶出液にバッファーを添加することによって調節することができる。バッファーは、例えば、約０．１ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分（例えば、約０．１ｍＬ／分〜約１２．５ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約１０．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約８．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約６ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜４ｍＬ／分、または約０．５ｍＬ／分〜約５ｍＬ／分）の流量で溶出液に添加することができる。
これらの例は、さらに、この例においてはＰＣＣＳ内の３つのクロマトグラフィーカラムからの溶出液をクロマトグラフィー膜（組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができるクロマトグラフィー膜）中に供給する前にその溶出液を保持または貯蔵する工程を含むことができる。本明細書に記載されているように、この保持または貯蔵する工程は本明細書に記載のリザーバのいずれか（例えば、バックアップタンク）を用いて実行することができる。
これらの例はまた、典型的なＰＣＣＳシステム内におけるクロマトグラフィー膜からの溶出液（組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができるクロマトグラフィー膜の溶出液）をろ過する工程を含むこともできる。本明細書に記載のろ過のための典型的なフィルターまたは方法のいずれかを用いて、この典型的なＰＣＣＳにおけるクロマトグラフィー膜からの溶出液（組換えタンパク質をポリッシュする単位操作を実行するために使用することができるクロマトグラフィー膜の溶出液）をろ過することができる。
当技術分野において認識することができるように、精製された組換えタンパク質は、本明細書に記載の方法のいずれかを用いてＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ２から定期的に溶離することができる。例えば、本明細書に記載の方法のいずれも、例えば、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２に使用されるクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜に応じて、例えば、約３０秒〜約５時間（例えば、約１分から約４時間の間、約１分から約３時間の間、約１分から約２時間の間、約１分から約１．５時間の間、約１分から約１時間の間、または約１分から約３０分の間）の持続時間の間、例えば、約１分〜約６時間（例えば、約１分から約５時間の間、約１分から約４時間の間、約１分から約３時間の間、約１分から約２時間の間、約１分から約１時間の間、または約１分から３０分の間）の頻度で、精製された組換えタンパク質を溶離することができる。
培養する方法
本明細書に記載の方法のいくつかは、さらに、液体培養培地を含むバイオリアクター（例えば、潅流またはフェドバッチバイオリアクター）で、組換えタンパク質を分泌する細胞（例えば、組換え哺乳類細胞）を培養する工程を含み、ここでは細胞（例えば、哺乳類細胞）を実質的に含まないある容積の液体培養培地がバイオリアクター（例えば、潅流バイオリアクター）から連続的または定期的に除去され、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１中に供給される。バイオリアクターは、例えば、約１Ｌ〜約１０，０００Ｌ（例えば、約１Ｌ〜約５０Ｌ、約５０Ｌ〜約５００Ｌ、約５００Ｌ〜約１０００Ｌ、５００Ｌ〜約５０００Ｌ、約５００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約５０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約１Ｌから約１０，０００Ｌの間、約１Ｌから約８，０００Ｌの間、約１Ｌ〜約６，０００Ｌ、約１Ｌから約５，０００Ｌの間、約１００Ｌから約５，０００Ｌの間、約１０Ｌから約１００Ｌの間、約１０Ｌから約４，０００Ｌの間、約１０Ｌから約３，０００Ｌの間、約１０Ｌから約２，０００Ｌの間、または約１０Ｌから約１，０００Ｌの間）の容積を有することができる。バイオリアクター内に存在する液体培養培地の量は、例えば、約０．５Ｌ〜約５，０００Ｌ（例えば、約０．５Ｌ〜約２５Ｌ、約２５Ｌ〜約２５０Ｌ、約２５０Ｌ〜約５００Ｌ、２５０Ｌ〜約２５００Ｌ、約２５０Ｌ〜約５，０００Ｌ、約２５００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約０．５Ｌから約５，０００Ｌの間、約０．５Ｌから約４，０００Ｌの間、約０．５Ｌから約３，０００Ｌの間、約０．５Ｌから約２，５００Ｌの間、約５０Ｌから約２，５００Ｌの間、約５Ｌから約５０Ｌの間、約５Ｌから約２，０００Ｌの間、約５Ｌから約１，５００Ｌの間、約５Ｌから約１，０００Ｌの間、または約５Ｌから約５００Ｌの間）であることができる。細胞の培養は、例えば、フェドバッチバイオリアクターまたは潅流バイオリアクターを用いて実行することができる。細胞の培養（例えば、哺乳類細胞の培養）の非限定的な例およびいろいろな局面は以下に記載されており、いかなる組合せで使用することもできる。
細胞
本明細書に記載の方法のいくつかで培養される細胞は細菌（例えば、グラム陰性細菌）、酵母（例えば、サッカロマイセス・セリビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、またはアークスュラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ））、または哺乳類細胞であることができる。哺乳類細胞は懸濁液中で、または接着細胞として増殖する細胞であることができる。本明細書に記載の方法のいずれかで培養することができる哺乳類細胞の非限定的な例として：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞またはＣＨＯ−Ｋ１ｓ細胞）、Ｓｐ２．０、骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ／０）、Ｂ−細胞、ハイブリドーマ細胞、Ｔ−細胞、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ ２９３ＥおよびＨＥＫ ２９３Ｆ）、アフリカミドリザル腎臓上皮（Ｖｅｒｏ）細胞、およびメイディン・ダービー（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ）イヌ（コッカースパニエル（Ｃｏｃｋｅｒ Ｓｐａｎｉｅｌ））腎臓上皮（ＭＤＣＫ）細胞がある。接着細胞を培養するいくつかの例で、培養物はまた複数のマイクロキャリア（例えば、１つまたはそれ以上の細孔を含むマイクロキャリア）を含むこともできる。本明細書に記載の方法のいずれかで培養することができる追加の哺乳類細胞は当技術分野で公知である。
哺乳類細胞は、組換えタンパク質（例えば、組換えタンパク質）をコードする組換え核酸（例えば、哺乳類細胞のゲノムに安定に組み込まれた核酸）を含むことができる。典型的な組換えタンパク質をコードする組換え核酸の非限定的な例は、本明細書に記載の方法を用いて生成することができる組換えタンパク質と共に以下に記載する。いくつかの例において、バイオリアクター（例えば、本明細書に記載のバイオリアクターのいずれか）で培養される哺乳類細胞はより大きい培養物から誘導された。
組換えタンパク質をコードする核酸は分子生物学および分子遺伝学で公知の多種多様な方法を用いて哺乳類細胞中に導入することができる。非限定的な例として、トランスフェクション（例えば、リポフェクション）、形質導入（例えば、レンチウィルス、アデノウィルス、またはレトロウィルス感染）、およびエレクトロポレーションがある。いくつかの例において組換えタンパク質をコードする核酸は哺乳類細胞の染色体中に安定に組み込まれない（一過性トランスフェクション）が、他の場合には核酸が組み込まれる。あるいは、または加えて、組換えタンパク質をコードする核酸はプラスミド内および／または哺乳類の人工染色体（例えば、ヒト人工染色体）内に存在することができる。あるいは、または加えて、核酸はウィルスベクター（例えば、レンチウィルス、レトロウィルス、またはアデノウィルスベクター）を用いて細胞に導入することができる。核酸はプロモーター配列（例えば、β−アクチンプロモーターおよびＣＭＶプロモーターのような強力なプロモーター、または誘導性プロモーター）に機能可能に結合することができる。所望により、核酸を含むベクターはまた、選択可能なマーカー（例えば、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、またはネオマイシン耐性を哺乳類細胞に授与する遺伝子）を含むこともできる。
いくつかの例において、組換えタンパク質は分泌タンパク質であり、哺乳類細胞により細胞外培地（例えば、第１および／または第２の液体培養培地）中に放出される。例えば、可溶性の組換えタンパク質をコードする核酸配列は、組換えタンパク質のＮ−またはＣ−末端に、分泌シグナルペプチドをコードする配列を含むことができ、これは哺乳類細胞内に存在する酵素により開裂され、その後細胞外培地（例えば、第１および／または第２の液体培養培地）中に放出される。
培養培地
液体培養培地は当技術分野で公知である。液体培養培地（例えば、第１および／または第２の組織培養培地）は哺乳類の血清（例えば、ウシ胎児血清およびウシ血清）、および／または成長ホルモンまたは増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、および上皮増殖因子）を補充することができる。あるいは、または加えて、液体培養培地（例えば、第１および／または第２の液体培養培地）は既知組成液体培養培地、動物由来成分を含まない液体培養培地、無血清液体培養培地、または血清含有液体培養培地であることができる。既知組成液体培養培地、動物由来成分を含まない液体培養培地、無血清液体培養培地、および血清含有液体培養培地の非限定的な例は市販されている。
液体培養培地は通例エネルギー源（例えば、グルコースのような炭水化物）、必須アミノ酸（例えば、２０のアミノ酸＋システインの基本的な組）、低濃度で必要とされるビタミンおよび／または他の有機化合物、遊離脂肪酸、および／または微量元素を含む。液体培養培地（例えば、第１および／または第２の液体培養培地）は、所望により、例えば、哺乳類ホルモンもしくは増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩およびバッファー（例えば、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、ヌクレオシドおよび塩基（例えば、アデノシン、チミジン、およびヒポキサンチン）、タンパク質および組織加水分解物、および／またはこれらの添加物の任意の組合せを補充することができる。
本明細書に記載の方法のいずれかで細胞（例えば、哺乳類細胞）を培養するために使用することができる多種多様な異なる液体培養培地は当技術分野で公知である。同様に本方法で有用であり得る培地成分には、限定されることはないが、既知組成（ＣＤ）加水分解物、例えば、ＣＤペプトン、ＣＤポリペプチド（２またはそれ以上のアミノ酸）、およびＣＤ増殖因子がある。液体の組織培養培地および培地成分の追加の例は当技術分野で公知である。
熟練した実務者には認識されるように、本明細書に記載の第１の液体培養培地と第２の液体培養培地は同じタイプの培地または異なる培地であることができる。
典型的なバイオリアクターの追加の特徴
本明細書に記載のバイオリアクターのいずれかの内面は、少なくとも１つのコーティング（例えば、ゼラチン、コラーゲン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリスチレン、およびラミニンの少なくとも１つのコーティング）、ならびに当技術分野で公知のように、Ｏ２、ＣＯ２、およびＮ２を液体培養培地中にスパージするための１つまたはそれ以上の口、および液体培養培地をかき混ぜるための撹拌機構を有し得る。バイオリアクターは制御加湿雰囲気中で（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％より高い湿度、または１００％の湿度で）細胞培養物をインキュベートすることができる。バイオリアクターはまた、バイオリアクターからある体積の液体培養培地を取り出すことができる機械的装置、および場合により、その機械的装置内に、液体培養培地のバイオリアクターからの移動過程の間に液体培養培地から細胞を除去するフィルター（例えば、米国仮特許出願第６１／８７８，５０２号に記載されているＡＴＦシステムまたは細胞ろ過システム）を装備することもできる。
温度
哺乳類細胞の培養工程は約３１℃〜約４０℃の温度で実行することができる。熟練した実務者には認識されるように、温度は、培養工程中特定の時点で、例えば、１時間または１日単位で変えることができる。例えば、温度は、バイオリアクターに細胞（例えば、哺乳類細胞）を最初に播種した後約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、もしくは約２０日またはそれ以上で変化またはシフトする（例えば、上昇もしくは低下する）ことができる。例えば、温度は上方へシフト（例えば、最大もしくは約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または最大もしくは約２０℃の変化）することができる。例えば、温度は下方へシフト（例えば、最大もしくは約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または最大もしくは約２０℃の変化）することができる。
ＣＯ２
本明細書に記載の培養工程は、さらに、バイオリアクター内の液体培養培地を最高または約１５％のＣＯ２（例えば、最高もしくは約１４％ＣＯ２、１２％ＣＯ２、１０％ＣＯ２、８％ＣＯ２、６％ＣＯ２、５％ＣＯ２、４％ＣＯ２、３％ＣＯ２、２％ＣＯ２、または最高もしくは約１％ＣＯ２）を含む雰囲気に曝露することを含むことができる。
潅流バイオリアクター
本明細書に記載の培養工程は潅流バイオリアクターを用いて実行することができる。潅流バイオリアクター内での細胞（例えば、哺乳類細胞）の培養は、第１の容積の第１の液体培養培地（例えば、任意の濃度の哺乳類細胞を含む、例えば、実質的に細胞を含まない第１の容積の第１の液体培養培地）のバイオリアクターからの除去、および第２の容積の第２の液体培養培地を第１の液体培養培地に添加することを含む。除去と添加は同時もしくは順次に、またはこれら２つの組合せで実行することができる。さらに、除去と添加は、（例えば、バイオリアクターの容積または第１の液体培養培地の容積の０．１％〜８００％（例えば、１％から７００％の間、１％から６００％の間、１％から５００％の間、１％から４００％の間、１％から３５０％の間、１％から３００％の間、１％から２５０％の間、１％から１００％の間、１００％から２００％の間、５％から１５０％の間、１０％から５０％の間、１５％から４０％の間、８％から８０％の間、または４％から３０％の間）の容積をある所与の時間期間にわたって（例えば、２４時間の期間にわたって、約１時間〜約２４時間の増加する時間期間にわたって、または２４時間を超える増加する時間期間にわたって）除去し取り替える速度で）連続的に、または定期的に（例えば、３日毎に一回、２日毎に一回、１日に一回、１日に二回、１日に三回、１日に四回、または１日に五回）、またはこれらの任意の組合せで実行することができる。定期的に実行する場合、（例えば、約２４時間の期間内、約１時間〜約２４時間の増加する時間期間内、または２４時間を超える増加する時間期間内に）除去されるかまたは取り替えられる容積は、例えば、バイオリアクターの容積または第１の液体培養培地の容積の０．１％〜８００％（例えば、１％から７００％の間、１％から６００％の間、１％から５００％の間、１％から４００％の間、１％から３００％の間、１％から２００％の間、１％から１００％の間、１００％から２００％の間、５％から１５０％の間、１０％から５０％の間、１５％から４０％の間、８％から８０％の間、または４％から３０％の間）であることができる。除去される第１の液体培養培地の第１の容積および添加される第２の液体培養培地の第２の容積は、いくつかの例において、培養期間の全体または一部の間、各々の２４時間の期間（または代わりに、約１時間〜約２４時間の増加する時間期間もしくは２４時間を超える増加する時間期間）にわたっておよそ同じに保つことができる。当技術分野で公知のように、第１の液体培養培地の第１の容積を除去する速度（容積／単位時間）および第２の液体培養培地の第２の容積を添加する速度（容積／単位時間）は変えることができる。第１の液体培養培地の第１の容積を除去する速度（容積／単位時間）および第２の液体培養培地の第２の容積を添加する速度（容積／単位時間）はほぼ同じであることができ、または異なることができる。
あるいは、除去され添加される容積は培養期間中各々の２４時間の期間（または代わりに、１時間〜約２４時間の増加する時間期間もしくは２４時間を超える増加する時間期間）にわたって変化する（例えば、次第に増大する）ことができる。例えば、培養期間中各々の２４時間の期間（あるいは、約１時間〜２４時間超の増加する時間期間または２４時間を超える増加する時間期間）内に除去される第１の液体培養培地の容積および添加される第２の液体培養培地の容積は、培養期間中、バイオリアクター容積または第１の液体培養培地容積の０．５％〜約２０％である容積から、バイオリアクター容積または第１の液体培養培地容積の約２５％〜約１５０％まで（例えば、次第に、または互い違いの増加量によって）増大することができる。
熟練した実務者には認識されるように、第１の液体培養培地と第２の液体培養培地は同じタイプの培地であることができる。他の例において、第１の液体培養培地と第２の液体培養培地は異なることができる。
第１の液体培養培地の第１の容積は、例えば、第１の容積の第１の液体培養培地をバイオリアクターから（例えば、実質的に細胞を含まない第１の容積の第１の液体培養培地をバイオリアクターから）除去することができる機械系により除去することができる。代わりに、または加えて、第１の容積の第１の液体培養培地は、細胞（例えば、哺乳類細胞）を排除する分子量カットオフを有する無菌膜を通る第１の容積の第１の液体培養培地の染み出しまたは重力流により除去することができる。
第２の容積の第２の液体培養培地は、自動的に、例えば、注入ポンプにより第１の液体培養培地に添加することができる。
いくつかの例において、第１の容積の第１の液体培養培地（例えば、実質的に哺乳類細胞を含まない第１の容積の第１の液体培養培地）の除去、および第２の容積の第２の液体培養培地の第１の液体培養培地への添加は、バイオリアクターに哺乳類細胞を播種した後少なくとも１時間以内（例えば、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、７時間以内、８時間以内、９時間以内、１０時間以内、１２時間以内、１４時間以内、１６時間以内、１８時間以内、２４時間以内、３６時間以内、４８時間以内、７２時間以内、９６時間以内、または９６時間後）には起こらない。
フェドバッチバイオリアクター
本明細書に記載の培養工程はフェドバッチバイオリアクターを用いて実行することができる。フェドバッチバイオリアクターでの細胞の培養は、大半の培養期間にわたって、第１の液体培養培地への第２の容積の第２の液体培養培地の添加（例えば、定期的または連続的な添加）を含む。第２の液体培養培地の添加は、連続的に（例えば、バイオリアクターの容積または第１の液体培養培地容積の０．１％〜３００％（例えば、１％〜２５０％、１％〜１００％、１００％〜２００％、５％〜１５０％、１０％〜５０％、１５％〜４０％、８％〜８０％、または４％〜３０％）の容積をある所与の時間期間にわたって（例えば、２４時間の期間にわたって、約１時間〜約２４時間の増加する時間期間にわたって、または２４時間を超える増加する時間期間にわたって）添加する速度で）、または定期的に（例えば、３日毎に一回、２日毎に一回、１日に一回、１日に二回、１日に三回、１日に四回、または１日に五回）、またはこれらの任意の組合せで実行することができる。定期的に実行する場合、（例えば、約２４時間の期間内、約１時間〜約２４時間の増加する時間期間内、または２４時間を超える増加する時間期間内に）添加される容積は、バイオリアクターの容積または第１の液体培養培地容積の、例えば、０．１％〜３００％（例えば、１％〜２００％、１％〜１００％、１００％〜２００％、５％〜１５０％、１０％〜５０％、１５％〜４０％、８％〜８０％、または４％〜３０％）であることができる。添加される第２の液体培養培地の第２の容積は、いくつかの例において、培養期間の全体または一部の間、各々の２４時間の期間（または、代わりに、約１時間〜約２４時間の増加する時間期間または２４時間を超える増加する時間期間）にわたってほぼ同じに保つことができる。当技術分野で公知のように、第２の容積の第２の液体培養培地を添加する速度（容積／単位時間）は培養期間の全体または一部の間変えることができる。例えば、添加される第２の液体培養培地の容積は、培養期間中、各々の２４時間の期間（または代わりに、１時間〜約２４時間の増加する時間期間または２４時間を超える増加する時間期間）にわたって変化する（例えば、次第に増大する）ことができる。例えば、培養期間中、各々の２４時間の期間（または代わりに、約１時間〜２４時間超の増加する時間期間または２４時間を超える増加する時間期間）内に添加される第２の液体培養培地の容積は、培養期間の間中、（例えば、次第にまたは互い違いの増加によって）バイオリアクター容積または第１の液体培養培地容積の０．５％〜約２０％である容積からバイオリアクター容積または第１の液体培養培地容積の約２５％〜約１５０％まで増大することができる。第２の容積の第２の液体培養培地を添加する速度（容積／単位時間）は培養期間の全体または一部にわたってほぼ同じであることができる。
熟練した実務者には認識されるように、第１の液体培養培地と第２の液体培養培地は同じタイプの培地であることができる。他の例において、第１の液体培養培地と第２の液体培養培地は異なることができる。第２の液体培養培地の容積は自動的に、例えば、注入ポンプにより第１の液体培養培地に添加することができる。
いくつかの例において、第１の液体培養培地への第２の容積の第２の液体培養培地の添加は、バイオリアクターへの哺乳類細胞の播種から少なくとも１時間以内（例えば、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、７時間以内、８時間以内、９時間以内、１０時間以内、１２時間以内、１４時間以内、１６時間以内、１８時間以内、２４時間以内、３６時間以内、４８時間以内、７２時間以内、９６時間以内、または９６時間後）には起こらない。フェドバッチ培養における細胞培養培地は通例培養期間の終了時に収穫され、本明細書に記載の方法のいずれかで使用される。しかし、フェドバッチ培養の細胞培養培地はまた培養期間中の１つまたはそれ以上の時点で収穫され、本明細書に記載の方法のいずれかで使用されることもできる。
熟練した実務者には認識されるように、種々の培養パラメーター（例えば、容器、容積、培養物容積を交換する頻度率、撹拌頻度、温度、培地、およびＣＯ２濃度）のいずれかをこれらの方法を実行するためにいかなる組合せで使用することもできる。さらに、本明細書に記載されているかまたは当技術分野で公知の哺乳類細胞のいずれも組換えタンパク質を産生するために使用することができる。
代表的な生物学的製造システム
ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２を含む本明細書に記載の方法を実行するのに有用な生物学的製造システムの例は米国仮特許出願第６１／７７５，０６０号および同第６１／８５６，３９０号（参照によって組み入れる）に記載されている。これらの代表的なシステムにおいて、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）のガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含むクロマトグラフィーカラムはＭＣＣＳ内に、またはＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内に存在する。例えば、全システムが全部で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含むクロマトグラフィーカラムを含むことができる。例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１、および／またはＭＣＣＳ２は（または各々が）ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のクロマトグラフィーカラムを含むことができる。
例えば、有用なシステムは、入口を含むＭＣＣＳ１および出口を含むＭＣＣＳ２、または入口および出口を含むＭＣＣＳを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２は互いに流体連通している。これらのシステムはまた、流体が入口に流入し、ＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２を通過し、出口を通って製造システムから出て行くことができるように構成することもできる。これらのシステムにより、液体培養培地からの治療用原薬の連続的で時間効率の良い生産が可能になる。例えば、治療用のタンパク質を含む流体（例えば、液体培養培地）のＭＣＣＳ１への供給から、精製された組換えタンパク質（例えば、治療用タンパク質原薬）のＭＣＣＳ２の出口からの溶出までの経過時間は、例えば、約４時間〜約４８時間（両端を含む）であることができる。
いくつかの代表的なシステムは停留タンクを含まない。他の例において、システムは（例えば、各々の停留タンクが、例えば約５分〜約６時間（両端を含む）の全期間の間治療用のタンパク質を保持するのみである場合）システム全体で最大１、２、３、４、または５の停留タンクを含むことができる。停留タンク（複数可）は１ｍＬ〜約３００ｍＬ（両端を含む）の容量を有することができる。流体がＭＣＣＳ１またはＭＣＣＳに入る前に停留タンク（複数可）に入るようにシステム内に配置された停留タンク（複数可）はいずれも、それぞれＭＣＣＳ１またはＭＣＣＳの第１のカラムの装填体積の１ｍＬ〜約１００％（両端を含む）である容量を有することができる。流体がＭＣＣＳ２に入る前に（そしてＭＣＣＳ１を出た後に）停留タンク（複数可）に入るようにシステム内に配置された停留タンク（複数可）はいずれも、例えば、ＭＣＣＳ２の第１のカラムの装填体積の１ｍＬ〜約１００％（両端を含む）である容量を有することができる。
追加の代表的なシステムの構造および特徴
ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、流体（例えば、実質的に細胞を含まない液体培養培地）がそれぞれＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に入るために通過することができる入口を含むことができる。入口はこのような目的のために当技術分野で公知のいかなる構造であることもできる。入口への流体管の挿入後その入口からの流体の有意な漏出を起こすことなく流体がその入口を通ってＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に入るように流体管を挿入することが可能な、例えば、ネジ、リブ、またはシールを含むことができる。本システムに使用することができる非限定的な入口は公知であり、当業者は理解できるであろう。
ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は少なくとも２つのクロマトグラフィーカラム、少なくとも２つのクロマトグラフィー膜、または少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび少なくとも１つのクロマトグラフィー膜、ならびに入口を有することができる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、本明細書に記載の代表的なＭＣＣＳのいずれかであることができるか、または本明細書に記載のＭＣＣＳの（任意の組合せの）代表的な特徴のいずれか１つまたはそれ以上を有することができる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は本明細書に記載の代表的な形状、大きさ、体積（ベッド容積）、および／または単位操作のいずれか１つまたはそれ以上を有することができる。
ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は本明細書に記載または当技術分野で公知の代表的な樹脂のいずれか１つまたはそれ以上を含むことができる。例えば、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）の１つまたはそれ以上に含まれる樹脂は、ある捕獲機構（例えば、プロテインＡ結合捕獲機構、プロテインＧ結合捕獲機構、抗体または抗体フラグメント結合捕獲機構、基質結合捕獲機構、補因子結合捕獲機構、アプタマー結合捕獲機構、および／またはタグ結合捕獲機構）を利用する樹脂であることができる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１のクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）の１つまたはそれ以上に含まれる樹脂はカチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂、分子ふるい樹脂、もしくは疎水性相互作用樹脂、またはこれらの任意の組合せであることができる。組換えタンパク質を精製するのに使用することができる樹脂のさらなる例は当技術分野で公知であり、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在する１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜に含ませることができる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜は同じおよび／または異なる樹脂（例えば、本明細書に記載または組換えタンパク質の精製に使用されることが当技術分野で公知の樹脂のいずれか）を含むことができる。
ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在する２つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー樹脂は１つまたはそれ以上の単位操作（例えば、組換えタンパク質の捕獲、組換えタンパク質の精製、組換えタンパク質のポリッシュ、ウィルスの不活化、組換えタンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨの調節、または組換えタンパク質を含む流体のろ過）を実行することができる。非限定例において、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、流体（例えば、液体培養培地）から組換えタンパク質を捕獲する、および組換えタンパク質を含む流体中に存在するウィルスを不活化するという単位操作を実行することができる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は本明細書に記載または当技術分野で公知の２またはそれ以上の単位操作の任意の組合せを実行することができる。
ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は切り替え機構（例えば、カラム切り替え機構）により互いに連結または移動することができる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１はまた１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、または５つ）のポンプ（例えば、自動化された、例えば、自動化されたぜん動ポンプ）を含むこともできる。カラム切り替え事象は、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１を通過する流体（例えば、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜への投入物および／またはそれ（ら）からの溶出液）中のある特定のレベルの組換えタンパク質に対応するＵＶ吸光度、ある特定の体積の液体（例えば、緩衝液）、または特定の経過時間により検出されるある一定レベルの組換えタンパク質の検出によって始動させることができる。カラム切り替えとは一般に、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内の少なくとも２つの異なるクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜（例えば、ＭＣＣＳ１またはＭＣＣＳ２内に存在する２つまたはそれ以上の異なるクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜）が、本方法の少なくとも一部の間異なる工程（例えば、平衡化、装填、溶出、または洗浄）を実質的に同時に通過できるようにする機構を意味する。
ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ）であることができる。例えば、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１であるＰＣＣＳ（すなわち、それぞれ、ＰＣＣＳまたはＰＣＣＳ１）は４つのクロマトグラフィーカラムを含むことができ、ここで最初の３つのカラムは流体（例えば、液体培養培地）から組換えタンパク質を捕獲するという単位操作を実行し、ＰＣＣＳの４つめのカラムは組換えタンパク質を含む流体中のウィルスを不活化するという単位操作を実行する。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１であるＰＣＣＳはカラム切り替え機構を利用することができる。ＰＣＣシステムは、例えば４、５、６、７、または８つのカラム、またはそれ以上までのカラムを稼動させることができる改良されたＡＫＴＡシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を利用することができる。
ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は：１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のＵＶ監視装置、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のバルブ、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のｐＨ計、および／または１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の導電率計を装備することができる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１はまた、（例えば、ＵＶ吸光度、液体の体積、または経過時間に基づいて）カラム切り替えがいつ起こるべきかを検知し、カラム切り替え事象に影響を及ぼす（始動させる）ためのソフトウェア（例えば、Ｕｎｉｃｏｒｎベースのソフトウェア、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を利用するオペレーティングシステムも装備することができる。
ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２０−１、２０−２、２０−３、または２０−４）のインライン緩衝液調節リザーバおよび／または緩衝液リザーバをさらに含むことができる。他の例において、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１内の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜中に容易には通過することができない流体を保持することができる１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、または６つ）の停留タンクを含むことができる。本明細書に記載のシステムはＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１、および／またはＭＣＣＳ２内に１つまたはそれ以上の停留タンク（例えば、本明細書に記載の停留タンク）を含むことができる。本明細書に記載のシステムの他の例は、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１、またはＭＣＣＳ２内に停留タンクを含まないか、またはシステム全体に停留タンクを含まない。本明細書に記載のシステムの他の例はシステム全体に最大で１、２、３、４、または５つの停留タンク（例えば、本明細書に記載のいずれかの停留タンク（複数可））を含む。
第２のＭＣＣＳ
代表的なシステムにおける第２のＭＣＣＳ（ＭＣＣＳ２）は少なくとも２つのクロマトグラフィーカラム、少なくとも２つのクロマトグラフィー膜、または少なくとも１つのクロマトグラフィーカラム（複数可）および少なくとも１つのクロマトグラフィー膜（複数可）、ならびに出口を含む。ＭＣＣＳ２は、本明細書に記載の代表的なＭＣＣＳのいずれかであることができ、または本明細書に記載のＭＣＣＳの代表的な特徴のいずれか１つまたはそれ以上を（任意の組合せで）有することができる。ＭＣＣＳ２内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は：本明細書に記載の形状、大きさ、体積（ベッド容積）、および／または単位操作のいずれか１つまたはそれ以上を有することができる。クロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は本明細書に記載または当技術分野で公知の代表的な樹脂のいずれかを含むことができる。例えば、ＭＣＣＳ２内に存在する１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜に含まれる樹脂は、捕獲機構（例えば、プロテインＡ結合捕獲機構、プロテインＧ結合捕獲機構、抗体もしくは抗体フラグメント結合捕獲機構、基質結合捕獲機構、補因子結合捕獲機構、タグ結合捕獲機構、および／またはアプタマー結合捕獲機構）を利用する樹脂であることができる。有用な樹脂としては、例えば、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂、分子ふるい樹脂、および疎水性相互作用樹脂がある。樹脂のさらなる例は当技術分野で公知である。ＭＣＣＳ２内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜は同じおよび／または異なる樹脂（例えば、本明細書に記載の、または当技術分野で組換えタンパク質の精製に使用することが知られている樹脂のいずれか）を含むことができる。
ＭＣＣＳ２内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は１つまたはそれ以上の単位操作（例えば、本明細書に記載の単位操作のいずれかまたは本明細書に記載の単位操作の任意の組合せ）を実行することができる。非限定例において、ＭＣＣＳ２は流体から組換えタンパク質を精製する、および組換えタンパク質を含む流体中に存在する組換えタンパク質をポリッシュするという単位操作を実行することができる。他の非限定例において、ＭＣＣＳ２は流体中に存在する組換えタンパク質を精製する、流体中に存在する組換えタンパク質をポリッシュする、および組換えタンパク質を含む流体をろ過するという単位操作を実行することができる。別の例において、ＭＣＣＳ２は流体中に存在する組換えタンパク質を精製する、流体中に存在する組換えタンパク質をポリッシュする、組換えタンパク質を含む流体をろ過する、および組換えタンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨを調節するという単位操作を実行することができる。ＭＣＣＳ２は本明細書に記載または当技術分野で公知の単位操作の２つまたはそれ以上の任意の組合せを実行することができる。
ＭＣＣＳ２内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は切り替え機構（例えば、カラム切り替え機構）により互いに対して連結または移動することができる。ＭＣＣＳ２はまた、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、または５）のポンプ（例えば、自動化された、例えば、自動化されたぜん動ポンプ）を含むこともできる。カラム切り替え事象は、ＭＣＣＳ２を通過する流体（例えば、ＭＣＣＳ２内の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜への投入物および／またはそれからの溶出液）中のある特定のレベルの組換えタンパク質に対応するＵＶ吸光度、特定の体積の液体（例えば、緩衝液）、または特定の経過時間により検出されるあるレベルの組換えタンパク質の検出によって始動させることができる。
ＭＣＣＳ２は定期的向流クロマトグラフィーシステム（すなわち、ＰＣＣＳ２）であることができる。例えば、ＰＣＣＳ２は、組換えタンパク質を流体から精製するという単位操作を実行する３つのカラム、および流体中に存在する組換えタンパク質をポリッシュするという単位操作を実行するクロマトグラフィー膜を含むことができる。例えば、組換えタンパク質を流体から精製するという単位操作を実行する３つのカラムは、例えば、カチオン交換樹脂を含むことができ、ポリッシュするという単位操作を実行するクロマトグラフィー膜はカチオン交換樹脂を含むことができる。ＰＣＣＳ２はカラム切り替え機構を利用することができる。ＰＣＣＳ２は、例えば、４、５、６、７、または８つのカラム、またはそれ以上まで稼動させることができる改良されたＡＫＴＡシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を利用することができる。
ＭＣＣＳ２は：１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のＵＶ監視装置、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のバルブ、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のｐＨ計、および／または１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の導電率計を装備することができる。ＭＣＣＳ２はまた、（例えば、ＵＶ吸光度、液体の体積、または経過時間に基づいて）カラム切り替え事象がいつ起こるべきかを検知し、カラム切り替え事象に影響を及ぼすためのソフトウェア（例えば、Ｕｎｉｃｏｒｎベースのソフトウェア、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を利用するオペレーティングシステムを装備することもできる。
ＭＣＣＳ２は、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２０−１、２０−２、２０−３、または２０−４）のインライン緩衝液調節リザーバおよび／または緩衝液リザーバをさらに含むことができる。他の例において、ＭＣＣＳ２は、ＭＣＣＳ２内の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜中に容易に通過することができない流体を保持することができる１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、または６つ）の停留タンク（例えば、本明細書に記載の停留タンクのいずれか）を含むことができる。
ＭＣＣＳ２は、治療用タンパク質原薬がシステムを出て行くのに通ることができる出口を含む。出口は、例えば、流体管を挿入することができるネジ、リブ、もしくはシール、または精製された組換えタンパク質（例えば、治療用タンパク質原薬）を保持もしくは貯蔵するように設計されたバイアルを含むことができる。出口は、精製された組換えタンパク質（例えば、治療用タンパク質原薬）が低減したバイオバーデンのバイアルまたは貯蔵容器中に直接流入することができるように、低減したバイオバーデンのバイアルまたはその他のこのような貯蔵容器を出口に対して密閉するために使用することができる表面を含むことができる。本システムに使用することができる非限定的な出口は公知であり、当業者により理解されよう。
本明細書に記載のシステムはまた、ＭＣＣＳ１とＭＣＣＳ２との間に配置された流体管を含むこともできる。本明細書に記載の流体管のいずれも、例えば、例えばポリエチレン、ポリカーボネート、またはプラスチックで作成されたチューブであることができる。ＭＣＣＳ１とＭＣＣＳ２との間に配置された流体管は、次のもの：流体管と流体連通しており、当該インライン緩衝液調節リザーバ（複数可）内に貯蔵されている緩衝液が流体管内に存在する流体に加えられるように位置している１つまたはそれ以上のインライン緩衝液調節リザーバ；流体管と流体連通しており、ＭＣＣＳ２中に容易に供給することができない、流体管内に存在するあらゆる過剰の流体を保持することができるように位置している停留タンク（例えば、本明細書に記載の停留タンク（複数可）のいずれか）；ならびに流体管内に存在する流体をろ過する（例えば、細菌を除去する）ことができるように流体管内に配置された１つまたはそれ以上のフィルターの１つまたはそれ以上を任意の組合せでさらに含むことができる。インライン緩衝液調節リザーバのいずれも、例えば、約０．５Ｌ〜５０Ｌの体積の緩衝液を（例えば、２５℃、１５℃、または１０℃以下の温度で）含むことができる。
本明細書に記載のシステムは場合により、ＭＣＣＳ２内の最終のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜と出口との間に配置された流体管を含むことができる。本明細書に記載のシステムは、ＭＣＣＳ２内の最終のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜と出口との間に配置された流体管と流体接続している１つまたはそれ以上のフィルターをさらに含むことができ、その結果このフィルターはＭＣＣＳ２内の最終のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜と出口との間に配置された流体管中に存在する流体から、例えば沈殿した物質、微粒子状物質、または細菌を除去することができる。
本明細書に提供されるシステムのいくつかの例はまた、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１の入口と流体連通しているバイオリアクターも含む。本明細書に記載または当技術分野で公知の代表的なバイオリアクターのいずれも本システムに使用することができる。
本明細書に提供されるシステムのいくつかの例はまたポンプシステムも含む。ポンプシステムは１つまたはそれ以上の次のもの：１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のポンプ（例えば、本明細書に記載または当技術分野で公知のポンプのいずれか）、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、または５つ）のフィルター（例えば、本明細書に記載または当技術分野で公知のフィルターのいずれか）、１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のＵＶ検出器、および１つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、または５つ）の停留タンク（例えば、本明細書に記載の停留タンクのいずれか）を含むことができる。本明細書に提供されるシステムのいくつかの例は、ポンプとＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１の入口との間に配置された流体管（例えば、本明細書に記載または当技術分野で公知の代表的な流体管のいずれか）をさらに含む。いくつかの例において、この特定の流体管は１つまたはそれ以上（例えば、２、３、または４つ）のポンプ（例えば、本明細書に記載または当技術分野で公知のポンプのいずれか）および／または１つまたはそれ以上（例えば、２、３、または４つ）の停留タンク（例えば、本明細書に記載の代表的な停留タンクのいずれか）を含むことができ、ここでこれらのポンプ（複数可）および／または停留タンク（複数可）は流体管内に存在する流体と流体接続している。
本明細書に記載のシステムのいくつかの例は、ポンプと入口との間で流体管に連結されたさらなる流体管をさらに含み、このさらなる流体管の一端はバイオリアクターに流体接続し、他端はポンプと入口との間の流体管と流体接続する。このさらなる流体管は、バイオリアクターから除去された液体培養培地から細胞を除去することができるフィルター（例えば、ＡＴＦ細胞保持システム）を含むことができる。
本明細書に提供されるシステムによって、精製された組換えタンパク質（例えば、治療用タンパク質原薬）の連続的な生産が可能になる。当技術分野で公知のように、本システムにより、精製された組換えタンパク質（例えば、治療用タンパク質原薬）の定期的な溶出が可能になり得る。本明細書に記載のシステムはまた、少なくとも約５日、少なくとも約１０日、少なくとも約１５日、少なくとも約２０日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約４０日、少なくとも約５０日、少なくとも約６０日、少なくとも約７０日、少なくとも約８０日、少なくとも約９０日、または少なくとも約１００日の連続的な期間にわたり、少なくとも約５ｇ／日、少なくとも約１０ｇ／日、少なくとも約１５ｇ／日、少なくとも約２０ｇ／日、少なくとも約３０ｇ／日、または少なくとも約４０ｇ／日の正味の収率の精製された組換えタンパク質（例えば、治療用タンパク質原薬）をもたらし得る。
以下の実施例で本発明をさらに例証するが、これらの実施例は特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
ｔ０におけるクロマトグラフィー樹脂の結合能力に対するガンマ線照射の効果
アニオン交換および疎水性特性の両方を有する二モードクロマトグラフィー樹脂（ＡＥ樹脂）の結合能力に対するガンマ線照射の効果を研究するために一組の実験を実行した。これらの実験で用いたＡＥ樹脂はＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）であり、これはＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンリガンド、７５μｍの平均粒径、および０．０９〜０．１２ｍｍｏｌのＣｌ−１／ｍＬ培地のイオン容量を有していた。ＡＥ樹脂を未処理のままとするか（バージン）または樹脂のバイオバーデンを低減するために処理した（２５ｋＧｙのガンマ線照射に曝露した）。照射は５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中にスラリー化された０．２ｍＬの樹脂を用いて実行した。
ｔ０における未処理のＡＥ樹脂（液体培養培地中）および２５ｋＧｙガンマ線照射したＡＥ樹脂（クロマトグラフィー稼動なし）に結合したタンパク質（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標））の量をいろいろな標的タンパク質（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標））濃度で決定した。図１は、未処理および２５ｋＧｙガンマ線照射したＡＥ樹脂に対するｔ０における結合等温線を示す。これらのデータは、標的タンパク質の結合がｔ０における樹脂のガンマ線照射の後に変化しないことを示している。
複数のサイクルの間のクロマトグラフィー樹脂の結合能力に対するガンマ線照射の効果および結合能力の損失を軽減するための変性用緩衝液の使用
複数のサイクルの間のクロマトグラフィー樹脂の結合能力に対するガンマ線照射の効果を試験するために実験を実行した。マルチカラムクロマトグラフィーで、使用したカラムの各々にタンパク質（液体培養培地中のＦａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標））をその結合能力まで装填した。カラムの平衡化および洗浄を２０ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ｐＨ７．０で実行した。溶出緩衝液、２００ｍＭアルギニン、２７０ｍＭ ＭＥＳ、２０％エチレングリコール ｐＨ７．５を用いて、結合したタンパク質をカラムから溶出した。この実施例において、その全ライフサイクルにわたるガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂の性能を試験するために、未処理のＡＥまたは２５ｋＧｙガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂（実施例１に記載したようにして製造）を含有するカラムを、マルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）を用いてサイクルにかけたか、または単一のカラムを用いてＭＣＣＳ条件を模倣する条件下で繰り返しサイクルのクロマトグラフィーを実行した（各々のカラムにはその静的結合能力まで装填した後洗浄および溶出を実行した）。この実施例に記載されている実験における洗浄および溶出工程は各々段階的に実行した。
ＡＥ樹脂（バージン、１５ｋＧｙガンマ線照射された、または２５ｋＧｙガンマ線照射された樹脂）を含む単一のクロマトグラフィーカラムおよび各サイクルで７００ｍＭアルギニン、１００ｍＭ酢酸塩（ｐＨ３．０）の洗浄用緩衝液、その後（組換えタンパク質の溶出後）１Ｎ ＮａＯＨの溶液を用いて、複数のサイクルのカラムクロマトグラフィーを実行した。複数のサイクルの間の（ｔ０における未処理の（バージン）樹脂と比較した）規格化された結合能力のパーセントを決定した。これらの実験で得られたデータは、未処理およびガンマ線照射した樹脂両方の結合能力がｔ０で同様であるが、未処理およびガンマ線照射した樹脂の結合能力が複数のサイクルのクロマトグラフィーの間に結合能力の異なる割合の低下を示すということを示している（図２）。バージン樹脂は複数のサイクルのクロマトグラフィーの間に結合能力の低下を示すが、ガンマ線照射された樹脂は複数のサイクルのクロマトグラフィーの間に結合能力のより劇的な低下を示す（図２）。この組の実験における各々の樹脂の結合能力の計算された低下割合も図３に示す。これらのデータは、クロマトグラフィーのバイオバーデンを低減するためのガンマ線照射の使用の結果樹脂の結合能力が低下し、複数のサイクルのクロマトグラフィーの間に次第に悪くなることを立証している。
ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂の失われた結合能力を回復するために様々な変性用緩衝液を使用できるかどうか決定するために複数の組の実験を実行した。これらの実験において、バージン（未処理の）ＡＥ樹脂を用いて実行された複数サイクルのクロマトグラフィーは、７００ｍＭアルギニン、１００ｍＭ酢酸塩（ｐＨ３．０）の洗浄用緩衝液を、続いて１Ｎ ＮａＯＨの溶液を用いて実行した（低ｐＨアルギニン）。複数サイクルのクロマトグラフィーはまた、２５ｋＧｙガンマ線照射された樹脂を用い、各サイクルで組換えタンパク質の溶出後樹脂を洗浄するために次の緩衝液の組合せを用いても実行した：８Ｍ尿素、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍクエン酸、ｐＨ２．５、続いて１Ｎ ＮａＯＨの溶液（低ｐＨ尿素）；６ＭグアニジンＨＣｌ（ｐＨ２．５）、続いて１Ｎ ＮａＯＨの溶液（または１Ｍ ＮａＯＨ＋１Ｍ ＮａＣｌ）（低ｐＨグアニジン）；０．１Ｍ酢酸中０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（ｐＨ２．５）、続いて０．７Ｍ酢酸、２０％エタノール、５０％エチレングリコールの溶液（ｐＨ２．５）、続いて１Ｎ ＮａＯＨの溶液（低ｐＨ Ｔｒｉｔｏｎ）；０．７Ｍ酢酸、２０％エタノール、５０％エチレングリコール（ｐＨ２．５）、続いて１Ｎ ＮａＯＨの溶液（低ｐＨ有機）；または７００ｍＭアルギニン、１００ｍＭ酢酸塩（ｐＨ３．０）、続いて１Ｎ ＮａＯＨの溶液（低ｐＨアルギニン）。規格化された結合能力パーセント（ｔ＝０におけるバージン（未処理の）樹脂の結合能力に対して規格化）、サイクル当たりの組換えタンパク質の回収パーセント（樹脂上に装填された流体中に存在する組換えタンパク質の量に対して）、およびサイクル当たりの溶出液中に存在する宿主細胞タンパク質のレベル（ｎｇ／ｍｇ）を決定した。図４のデータは、試験した変性用緩衝液のうち０．７Ｍ酢酸、２０％エタノール、５０％エチレングリコール（ｐＨ２．５）および７００ｍＭアルギニン、１００ｍＭ酢酸塩（ｐＨ３．０）を除く全てがガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂の結合能力の損失を軽減することができたということを示している。図４のデータは、変性用緩衝液のうち０．７Ｍ酢酸、２０％エタノール、５０％エチレングリコール（ｐＨ２．５）および７００ｍＭアルギニン、１００ｍＭ酢酸塩（ｐＨ３．０）を除く全てが、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を効率よく清浄化し、かつ複数のサイクルのクロマトグラフィーの間ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂の結合能力を維持することができるということを示している。
図６のデータは、試験した変性用緩衝液の全てが、複数のサイクルの間ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂に結合した組換えタンパク質のサイクル当たりの安定した回収割合を与えることを示している。図６のデータは、試験した変性用緩衝液の各々が、サイクル当たりガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂に結合したタンパク質を同程度に回収することができたということを示している。図７のデータは、様々な試験された変性用緩衝液の使用の結果、各サイクルで組換えタンパク質溶出液中の宿主細胞タンパク質の許容できるレベルを与えることを示している。
各サイクルで使用された変性用緩衝液は固く結合したタンパク質を樹脂から放出させることによりガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂の結合能力を回復すると考えられた。２５ｋＧｙガンマ線照射したＡＥ樹脂を含む３つのクロマトグラフィーカラムを用いて実行され、８Ｍ尿素、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍクエン酸、ｐＨ２．５、および（各サイクルの後）組換えタンパク質の溶出後１Ｎ ＮａＯＨの溶液で洗浄した複数サイクルのクロマトグラフィーの代表的なクロマトグラフを記録した（図５）。クロマトグラフは、ガンマ線照射された樹脂の変性用緩衝液による処理の結果、複数のサイクルの間３つのクロマトグラフィーカラムの各々でガンマ線照射された樹脂から実質的に同じ量のタンパク質が放出されたことを示している（図５の矢印参照）。
要約すると、これらのデータは、いろいろな変性用緩衝液を用いて、ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂の結合能力を回復して予期された性能を達成することができるということを示している。
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と共に記載して来たが、以上の記載は説明することを意図したものであり、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定するものではないことと理解されたい。他の局面、利点、および変更は以下の特許請求の範囲内に入る。

Claims (68)

  1. ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を用いてクロマトグラフィーを実行する方法であって、
    （ａ）ガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含有するクロマトグラフィーカラムを準備すること；
    （ｂ）該カラムによって、該クロマトグラフィー樹脂を変性用緩衝液に曝露することを含む第１のサイクルのクロマトグラフィーを実行すること；および
    （ｃ）該カラムによって少なくとも１つの追加のサイクルのクロマトグラフィーを実行すること：
    を含む、前記方法。
  2. （ｂ）および／または（ｃ）においてサイクルを実行することが、
    （ａ）組換えタンパク質を含有する液体に該クロマトグラフィー樹脂を曝露することにより該組換えタンパク質を捕獲する工程；
    （ｂ）該クロマトグラフィー樹脂を洗浄用緩衝液に曝露することにより該クロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程；
    （ｃ）該クロマトグラフィー樹脂を溶出緩衝液に曝露することにより該組換えタンパク質を溶出する工程；
    （ｄ）該クロマトグラフィー樹脂を該変性用緩衝液に曝露することにより該クロマトグラフィー樹脂を再生する工程：
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 組換えタンパク質を含有する液体が液体培養培地である、請求項２に記載の方法。
  4. （ｂ）および（ｃ）におけるサイクルが閉鎖され一体化されたシステムを用いて実行される、請求項１に記載の方法。
  5. 緩衝液が低減したバイオバーデンの緩衝液である、請求項４に記載の方法。
  6. 低減したバイオバーデンの緩衝液がろ過により調製される、請求項５に記載の方法。
  7. 変性用緩衝液が尿素、グアニジン塩酸塩、およびＴｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ−１００のうち１つまたはそれ以上を含む、請求項１に記載の方法。
  8. （ｂ）のサイクルが、変性用緩衝液への曝露後約０．５Ｍ〜約１．５Ｍの水酸化ナトリウムを含む洗浄用緩衝液にクロマトグラフィー樹脂を曝露することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  9. カラムがマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）の一部である、請求項１に記載の方法。
  10. ＭＣＣＳが定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ）である、請求項９に記載の方法。
  11. クロマトグラフィー樹脂がアニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、またはこれらの任意の組合せである、請求項１に記載の方法。
  12. クロマトグラフィー樹脂がアニオン交換クロマトグラフィー樹脂である、請求項１１に記載の方法。
  13. クロマトグラフィー樹脂が約１０ｋＧｙ〜約４０ｋＧｙの線量のガンマ線照射で処理されている、請求項１に記載の方法。
  14. クロマトグラフィー樹脂が約１５ｋＧｙ〜約３５ｋＧｙの線量のガンマ線照射で処理されている、請求項１３に記載の方法。
  15. クロマトグラフィー樹脂が約２０ｋＧｙ〜約３０ｋＧｙの線量のガンマ線照射で処理されている、請求項１４に記載の方法。
  16. ４またはそれ以上の追加のサイクルのクロマトグラフィーが実行される、請求項１に記載の方法。
  17. ９またはそれ以上の追加のサイクルのクロマトグラフィーが実行される、請求項１６に記載の方法。
  18. １４またはそれ以上の追加のサイクルのクロマトグラフィーが実行される、請求項１７に記載の方法。
  19. １９またはそれ以上の追加のサイクルのクロマトグラフィーが実行される、請求項１８に記載の方法。
  20. ２４またはそれ以上の追加のサイクルのクロマトグラフィーが実行される、請求項１９に記載の方法。
  21. ２９またはそれ以上の追加のサイクルのクロマトグラフィーが実行される、請求項２０に記載の方法。
  22. ３９またはそれ以上の追加のサイクルのクロマトグラフィーが実行される、請求項１８に記載の方法。
  23. （ｃ）が少なくとも４日の期間にわたって連続的に実行される、請求項１に記載の方法。
  24. （ｃ）が少なくとも５日の期間にわたって連続的に実行される、請求項２３に記載の方法。
  25. （ｃ）が少なくとも７日の期間にわたって連続的に実行される、請求項２４に記載の方法。
  26. （ｃ）が少なくとも１４日の期間にわたって連続的に実行される、請求項２５に記載の方法。
  27. （ｃ）が少なくとも２８日の期間にわたって連続的に実行される、請求項２６に記載の方法。
  28. 組換えタンパク質が組換え治療用タンパク質である、請求項２に記載の方法。
  29. 精製された組換えタンパク質を製造するための一体化され、クローズドな、連続的な方法であって、
    （ａ）実質的に細胞を含まない、組換えタンパク質を含む液体培養培地を準備すること；および
    （ｂ）各サイクル中に変性用緩衝液に曝露されるガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含有する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムを含むマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）に該液体培養培地を連続的に供給すること；
    を含み、
    該方法は低減したバイオバーデンの緩衝液を利用し、一体化されており、該液体培養培地から該精製された組換えタンパク質であるＭＣＣＳからの溶出液まで連続的に稼動する、前記方法。
  30. ＭＣＣＳが少なくとも２つの異なる単位操作を実行する、請求項２９に記載の方法。
  31. ＭＣＣＳの使用がカラム切り替えを包含する、請求項３０に記載の方法。
  32. ＭＣＣＳ内のカラムの全てがガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含有する、請求項２９に記載の方法。
  33. ＭＣＣＳが組換えタンパク質を捕獲する、およびウィルスを不活化するという単位操作を実行する、請求項２９に記載の方法。
  34. ＭＣＣＳが組換えタンパク質を捕獲する、および精製するという単位操作を実行する、請求項２９に記載の方法。
  35. ＭＣＣＳが定期的向流クロマトグラフィーシステムである、請求項２９に記載の方法。
  36. ＭＣＣＳがアフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、もしくは疎水性相互作用クロマトグラフィー、またはこれらの任意の組合せのための複数のカラムを含む、請求項２９に記載の方法。
  37. ＭＣＣＳがアフィニティークロマトグラフィー用のカラムを含み、該アフィニティークロマトグラフィーがプロテインＡ結合捕獲機構、基質結合捕獲機構、抗体−または抗体フラグメント結合捕獲機構、アプタマー結合捕獲機構、および補因子結合捕獲機構：からなる群から選択される捕獲機構によって実行される、請求項３６に記載の方法。
  38. アフィニティークロマトグラフィーがプロテインＡ結合捕獲機構によって実行され、組換えタンパク質が抗体または抗体フラグメントである、請求項３７に記載の方法。
  39. 組換えタンパク質が治療用組換えタンパク質である、請求項２９に記載の方法。
  40. 精製された組換えタンパク質を医薬組成物中に配合することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 変性用緩衝液が尿素、グアニジン塩酸塩、およびＴｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ−１００のうち１つまたはそれ以上を含む、請求項２９に記載の方法。
  42. クロマトグラフィー樹脂が、各サイクルにおいて変性用緩衝液への曝露後約０．５Ｍ〜約１．５Ｍの水酸化ナトリウムを含む洗浄用緩衝液に曝露される、請求項２９に記載の方法。
  43. 組換えタンパク質を製造するための一体化され、クローズドな、連続的な方法であって、（ａ）実質的に細胞を含まない、組換えタンパク質を含む液体培養培地を準備すること；（ｂ）該液体培養培地を第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ１）に連続的に供給すること；
    （ｃ）該ＭＣＣＳ１を用いて該液体培養培地から該組換えタンパク質を捕獲すること；
    （ｄ）該ＭＣＣＳ１から該組換えタンパク質を含む溶出液を生産し、該溶出液を第２のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ２）に連続的に供給すること；
    （ｅ）該組換えタンパク質を該溶出液から該ＭＣＣＳ２に連続的に供給し、その後該組換えタンパク質を溶出することにより、精製された組換えタンパク質を生産すること：
    を含み、ここで：
    該方法は低減したバイオバーデンの緩衝液を利用し、一体化されており、かつ該液体培養培地から該精製された組換えタンパク質まで連続的に稼動し、該ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内の少なくとも１つのカラムはガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含有するクロマトグラフィーカラムであり、該クロマトグラフィー樹脂は該方法において各サイクル中に変性用緩衝液に曝露される、前記方法。
  44. ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２が少なくとも２つの異なる単位操作を実行する、請求項４３に記載の方法。
  45. 該ＭＣＣＳ１もしくは該ＭＣＣＳ２、または両方の使用がカラム切り替えを包含する、請求項４３に記載の方法。
  46. ＭＣＣＳ１が組換えタンパク質を捕獲する、およびウィルスを不活化するという単位操作をさらに実行する、請求項４３に記載の方法。
  47. ＭＣＣＳ２が組換えタンパク質を精製する、およびポリッシュするという単位操作を実行する、請求項４３に記載の方法。
  48. 該ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２が少なくとも２つのクロマトグラフィーカラムを利用する、請求項４３に記載の方法。
  49. ＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２内のクロマトグラフィーカラム（複数可）の全てがガンマ線照射されたクロマトグラフィー樹脂を含有するクロマトグラフィーカラムである、請求項４３に記載の方法。
  50. ＭＣＣＳ１が第１の定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ１）である、請求項４３に記載の方法。
  51. 捕獲が、アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、もしくはサイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、またはこれらの任意の組合せを用いて実行される、請求項４３に記載の方法。
  52. 捕獲が、プロテインＡ結合捕獲機構、基質結合捕獲機構、抗体または抗体フラグメント結合捕獲機構、アプタマー結合捕獲機構、および補因子結合捕獲機構：からなる群から選択される捕獲機構を有するアフィニティークロマトグラフィーを用いて実行される、請求項５１に記載の方法。
  53. アフィニティークロマトグラフィーがプロテインＡ結合捕獲機構によって実行され、組換えタンパク質が抗体または抗体フラグメントである、請求項５２に記載の方法。
  54. ＭＣＣＳ２が第２の定期的向流（ＰＣＣＳ２）クロマトグラフィーシステムである、請求項４３に記載の方法。
  55. 組換えタンパク質が治療用の組換えタンパク質である、請求項４３に記載の方法。
  56. 精製された組換えタンパク質を医薬組成物中に配合することをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 少なくとも４日の期間連続的に実行される、請求項２９または４３に記載の方法。
  58. 少なくとも５日の期間連続的に実行される、請求項５７に記載の方法。
  59. 少なくとも７日の期間連続的に実行される、請求項５８に記載の方法。
  60. 少なくとも１４日の期間連続的に実行される、請求項５９に記載の方法。
  61. 少なくとも２８日の期間連続的に実行される、請求項５９に記載の方法。
  62. クロマトグラフィー樹脂がアニオン交換クロマトグラフィー樹脂、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、またはこれらの任意の組合せである、請求項２９または４３に記載の方法。
  63. クロマトグラフィー樹脂がアニオン交換クロマトグラフィー樹脂である、請求項６２に記載の方法。
  64. クロマトグラフィー樹脂が約１０ｋＧｙ〜約４０ｋＧｙの線量のガンマ線照射で処理されている、請求項２９または４３に記載の方法。
  65. クロマトグラフィー樹脂が約１５ｋＧｙ〜約３５ｋＧｙの線量のガンマ線照射で処理されている、請求項６４に記載の方法。
  66. クロマトグラフィー樹脂が約２０ｋＧｙ〜約３０ｋＧｙの線量のガンマ線照射で処理されている、請求項６５に記載の方法。
  67. 変性用緩衝液が尿素、グアニジン塩酸塩、およびＴｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ−１００のうち１つまたはそれ以上を含む、請求項４３に記載の方法。
  68. クロマトグラフィー樹脂が、該変性用緩衝液への曝露後約０．５Ｍ〜約１．５Ｍの水酸化ナトリウムを含む洗浄用緩衝液に曝露される、請求項４３に記載の方法。
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