ES2841141T3

ES2841141T3 - Cromatografía estéril y procesos de fabricación

Info

Publication number: ES2841141T3
Application number: ES15708622T
Authority: ES
Inventors: Rahul Godawat; Veena Warikoo; Rohan Patil; Konstantin Konstantinov; Venkat Kishore Ryakala; Mahsa Rohani
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2014-01-17
Filing date: 2015-01-16
Publication date: 2021-07-07
Anticipated expiration: 2035-01-16
Also published as: HK1227042A1; CN106103464A; KR102326354B1; HK1227042B; TWI709570B; BR112016016329A8; TWI671312B; US20150203529A1; SG11201605626SA; TW201936628A; US20200369718A1; US20150203532A1; IL246774B; BR112016016329A2; CA2936951C; RU2016133483A; KR20160107325A; RU2019102195A; CN106103464B; AU2015206422B2

Abstract

Un método para llevar a cabo la cromatografía con una resina de cromatografía de intercambio aniónico irradiada con gamma, que comprende: (a) proporcionar una columna de cromatografía que contiene una resina de cromatografía de intercambio aniónico irradiada con gamma; (b) llevar a cabo un primer ciclo de cromatografía a través de la columna, en donde el primer ciclo de cromatografía comprende recuperar la capacidad de unión de la resina de cromatografía de intercambio aniónico irradiada con gamma al exponer la resina de cromatografía de intercambio aniónica irradiada con gamma a un tampón desnaturalizante; y (c) llevar a cabo al menos un ciclo adicional de cromatografía a través de la columna, en donde llevar a cabo cada uno del al menos un ciclo adicional de cromatografía comprende recuperar la capacidad de unión de la resina de cromatografía de intercambio aniónico irradiada con gamma al exponer la resina de cromatografía de intercambio aniónica irradiada con gamma a un tampón desnaturalizante, en donde el tampón desnaturalizante comprende uno o más de urea, clorhidrato de guanidina y TritonTM X-100.

Description

DESCRIPCIÓN

Cromatografía estéril y procesos de fabricación

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional de los EE. UU. núm. 61/928.906, presentada el 17 de enero de 2014.

Campo técnico

La presente solicitud se refiere a métodos de biotecnología y la biofabricación de proteínas recombinantes.

Antecedentes

Las células de mamífero que incluyen un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante se usan a menudo para producir proteínas terapéuticamente o comercialmente importantes. En el entorno actual de carteras de diversos productos, se estimula de manera creciente a las empresas de biotecnología a desarrollar soluciones innovadoras para la fabricación muy flexible y rentable de sustancias farmacéuticas de proteína terapéutica. Una de las estrategias para aislar proteínas recombinantes de manera eficaz es a través de procesos que incluyen la cromatografía continua (p. ej., al usar un sistema cerrado). Una limitación conocida de la cromatografía continua es la presencia de agentes contaminantes en el sistema (p. ej., mayor grado de contaminación microbiana), que da lugar a un producto contaminado, una reducción en el rendimiento de la producción y una disminución en la velocidad de flujo (o aumento de la presión) en el sistema. Por ejemplo, el mayor grado de contaminación microbiana dentro de un sistema puede dar lugar a que el sistema deje de funcionar por completo.

El documento "Ion Exchange Chromatography & Chromatofocusing Principles and Methods", (GE Healthcare, Imagination at work, 2010) describe generalmente métodos de cromatografía de intercambio iónico y cromatoenfoque.

El documento WO 2011/076386 describe contenedores o bolsas para medios cromatográficos y métodos para rellenar columnas de cromatografía al usar los contenedores.

Compendio

La presente invención se define en las reivindicaciones.

La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que la irradiación gamma de la resina de cromatografía da lugar a una disminución en la capacidad de unión de la resina (p. ej., una disminución constante en la capacidad de unión de la resina en múltiples ciclos de cromatografía), y que la capacidad de unión de la resina irradiada con gamma se puede recuperar al exponer la resina a un tampón desnaturalizante. En virtud de este descubrimiento, en la presente memoria se describen métodos para llevar a cabo la cromatografía con resina de cromatografía irradiada con gamma que incluyen proporcionar una columna de cromatografía que incluye una resina de cromatografía irradiada con gamma; llevar a cabo un primer ciclo de cromatografía a través de la columna, donde el ciclo incluye exponer la resina de cromatografía a un tampón desnaturalizante; y llevar a cabo al menos un ciclo adicional de cromatografía a través de la columna. También se describen procesos integrados, cerrados o sustancialmente cerrados y continuos para la fabricación de una proteína recombinante que incluyen el uso de al menos una columna de cromatografía que incluye resina de cromatografía irradiada con gamma, donde la resina de cromatografía irradiada con gamma se expone a tampón desnaturalizante durante cada ciclo en el proceso, y se usa tampón de grado de contaminación microbiana reducido en el proceso. Cualesquiera de los métodos y procesos descritos en la presente memoria pueden ser métodos o procesos con grado de contaminación microbiana reducido, estériles, asépticos o absolutamente estériles (según se definen en la presente memoria). Cualesquiera de los métodos y procesos descritos en la presente memoria pueden ser una combinación de asépticos y con grado de contaminación microbiana reducido, estériles o absolutamente estériles.

En la presente memoria se describen métodos para llevar a cabo la cromatografía con resina de cromatografía irradiada con gamma que incluyen: (a) proporcionar una columna de cromatografía que contiene una resina de cromatografía irradiada con gamma; (b) llevar a cabo un primer ciclo de cromatografía a través de la columna, en donde el ciclo incluye exponer la resina de cromatografía a un tampón desnaturalizante; y (c) llevar a cabo al menos un ciclo adicional de cromatografía a través de la columna. En algunas realizaciones de estos métodos, llevar a cabo los ciclos en (b) y/o (c) incluye las etapas de: (a) capturar una proteína recombinante al exponer la resina de cromatografía con un líquido que contiene una proteína recombinante; (b) lavar la resina de cromatografía al exponer la resina de cromatografía con un tampón de lavado; (c) eluir la proteína recombinante al exponer la resina de cromatografía con un tampón de elución; y (d) regenerar la resina de cromatografía al exponer la resina de cromatografía al tampón desnaturalizante.

En algunos ejemplos de cualesquiera de los métodos descritos en la presente memoria, el líquido que contiene una proteína recombinante es un medio de cultivo líquido. En algunas realizaciones de cualesquiera de los métodos descritos en la presente memoria, los ciclos en (b) y (c) se llevan a cabo al usar un sistema cerrado e integrado. En algunos ejemplos de cualesquiera de los métodos descritos en la presente memoria, el tampón es un tampón de grado de contaminación microbiana reducido (p. ej., un tampón de grado de contaminación microbiana reducido preparado mediante filtración).

En algunos ejemplos de cualesquiera de los métodos descritos en la presente memoria, el tampón desnaturalizante incluye uno o más de urea, clorhidrato de guanidina y TritonTM X-100. En algunas realizaciones de cualesquiera de los métodos descritos en la presente memoria, el ciclo de (b) incluye, además, exponer la resina de cromatografía a tampón de lavado que incluye hidróxido de sodio a aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1,5 M después de la exposición al tampón desnaturalizante. En algunas realizaciones donde se usa una resina de cromatografía de afinidad que incluye un ligando de proteína, el ciclo de (b) incluye, además, exponer la resina de cromatografía a tampón de lavado que incluye hidróxido de sodio a aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM. En algunos ejemplos de cualesquiera de los métodos descritos en la presente memoria, la columna es parte de un sistema de cromatografía de multicolumna (MCCS, por sus siglas en inglés) (p. ej., un sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS, por sus siglas en inglés).

En algunas realizaciones de cualesquiera de los métodos descritos en la presente memoria, la resina de cromatografía es resina de cromatografía de intercambio aniónico, resina de cromatografía de intercambio catiónico, resina de cromatografía de exclusión por tamaño, resina de cromatografía de interacción hidrófoba, resina de cromatografía de afinidad o cualquier combinación de estas. En algunos ejemplos, la resina de cromatografía es resina de cromatografía de intercambio aniónico.

En algunos ejemplos de cualesquiera de los métodos descritos en la presente memoria, la resina de cromatografía se ha tratado con una dosis de irradiación gamma entre aproximadamente 10 kGy a aproximadamente 40 kGy (p. ej., entre aproximadamente 15 kGy a aproximadamente 35 kGy, o entre aproximadamente 20 kGy a aproximadamente 30 kGy). En algunas realizaciones de cualesquiera de los métodos descritos en la presente memoria, se llevan a cabo cuatro o más (p. ej., nueve o más, catorce o más, diecinueve o más, veinticuatro o más, veintinueve o más, o treinta y nueve o más) ciclos de cromatografía adicionales. En algunos ejemplos de cualesquiera de los métodos descritos en la presente memoria, la etapa (c) se lleva a cabo en un período de al menos 4 días (p. ej., al menos 5 días, al menos 7 días, al menos 14 días o al menos 28 días). En algunos ejemplos de cualesquiera de los métodos descritos en la presente memoria, la proteína recombinante es una proteína terapéutica recombinante.

También se describen procesos integrados, cerrados o sustancialmente cerrados y continuos para la fabricación de una proteína recombinante purificada que incluyen: (a) proporcionar un medio de cultivo líquido que incluye una proteína recombinante que está sustancialmente libre de células; y (b) alimentar de manera continua el medio de cultivo líquido en un sistema de cromatografía de multicolumna (MCCS) que incluye al menos una columna de cromatografía que contiene resina de cromatografía irradiada con gamma, en donde la resina de cromatografía se expone durante cada ciclo a tampón desnaturalizante; donde el proceso utiliza tampón de grado de contaminación microbiana reducido, es integrado y se ejecuta de manera continua desde el medio de cultivo líquido a un eluato del MCCS que es la proteína recombinante purificada. En algunas realizaciones de estos procesos, el MCCS lleva a cabo al menos dos operaciones de unidad diferentes. En algunos ejemplos de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, el MCCS implica una conmutación de columna. En algunas realizaciones de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, todas las columnas en el MCCS contienen resina de cromatografía irradiada con gamma.

En algunos ejemplos de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, el MCCS lleva a cabo las operaciones de unidad de capturar la proteína recombinante e inactivar virus, o las operaciones de unidad de capturar y purificar la proteína recombinante. En algunas realizaciones de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, el MCCS es un sistema de cromatografía en contracorriente periódica. En algunos ejemplos de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, el MCCS incluye una pluralidad de columnas para cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía de interacción hidrófoba o cualquier combinación de estas. En algunas realizaciones de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, donde el MCCS incluye una columna para cromatografía de afinidad, y la cromatografía de afinidad se lleva a cabo con un mecanismo de captura seleccionado del grupo que consiste en: mecanismo de captura de unión a proteína A, mecanismo de captura de unión a sustrato, mecanismo de captura de unión a anticuerpo o fragmento de anticuerpo, mecanismo de captura de unión a aptámero y mecanismo de captura de unión a cofactor. En algunos ejemplos de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, la cromatografía de afinidad se lleva a cabo con un mecanismo de captura de unión a proteína A y la proteína recombinante es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En algunos ejemplos de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, la proteína recombinante una proteína terapéutica recombinante. Algunas realizaciones de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria incluyen, además, formular la proteína recombinante purificada en una composición farmacéutica. En algunas realizaciones de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, el tampón desnaturalizante incluye uno o más de urea, clorhidrato de guanidina y TritonTM X-100. En algunos ejemplos de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, la resina de cromatografía se expone a tampón de lavado incluye hidróxido de sodio a aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1,5 M después de la exposición al tampón desnaturalizante en cada ciclo.

También se describen procesos integrados, cerrados o sustancialmente cerrados y continuos para la fabricación de una proteína recombinante que incluyen: (a) proporcionar un medio de cultivo líquido que incluye una proteína recombinante que está sustancialmente libre de células; (b) alimentar de manera continua el medio de cultivo líquido en un primer sistema de cromatografía de multicolumna (MCCS1); (c) capturar la proteína recombinante a partir el medio de cultivo líquido al usar el MCCS1; (d) producir un eluato a partir del MCCS1 que incluye la proteína recombinante y alimentar de manera continua el eluato a un segundo sistema de cromatografía de multicolumna (MCCS2); (e) alimentar de manera continua la proteína recombinante del eluato en el MCCS2 y posteriormente eluir la proteína recombinante para producir así la proteína recombinante purificada, donde: el proceso utilizar tampón de grado de contaminación microbiana reducido, es integrado y se ejecuta de manera continua desde el medio de cultivo líquido a la proteína recombinante purificada, y al menos una columna en el MCCS1 y/o MCCS2 es una columna de cromatografía que contiene resina de cromatografía irradiada con gamma y la resina de cromatografía se expone al tampón desnaturalizante durante cada ciclo en el proceso. En algunos ejemplos de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, el MCCS1 y/o el MCCS2 lleva a cabo al menos dos operaciones de unidad diferentes. En algunos ejemplos de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, el uso del MCCS1 o del MCCS2, o ambos, implica una conmutación de columna.

En algunas realizaciones de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, el MCCS1 lleva a cabo, además, las operaciones de unidad de capturar la proteína recombinante e inactivar virus. En algunas realizaciones de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, el MCCS2 lleva a cabo las operaciones de unidad de purificar y refinar la proteína recombinante. En algunos ejemplos de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, el MCCS1 y/o MCCS2 utiliza al menos dos columnas de cromatografía. En algunos ejemplos de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, todas las columna(s) de cromatografía en MCCS1 y MCCS2 son columnas de cromatografía que contienen resina de cromatografía irradiada con gamma. En algunos ejemplos de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, el MCCS1 es un primer sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS1). En algunas realizaciones de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, la captura se lleva a cabo al usar cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de intercambio aniónico o cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de interacción hidrófoba o cualquier combinación de estas. En algunos ejemplos de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, la captura se lleva a cabo al usar cromatografía de afinidad con un mecanismo de captura seleccionado del grupo de: mecanismo de captura de unión a proteína A, mecanismo de captura de unión a sustrato, mecanismo de captura de unión a anticuerpo o fragmento de anticuerpo, mecanismo de captura de unión a aptámero y mecanismo de captura de unión a cofactor. En algunas realizaciones de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, la cromatografía de afinidad se lleva a cabo con un mecanismo de captura de unión a proteína A y la proteína recombinante es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

En algunas realizaciones de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, el MCCS2 es un segundo sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS2). En algunos ejemplos de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, la proteína recombinante una proteína terapéutica recombinante. Algunas realizaciones de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria incluyen, además, formular la proteína recombinante purificada en una composición farmacéutica. En algunos ejemplos de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, el proceso se lleva a cabo de manera continua durante un período de al menos 4 días (p. ej., al menos 5 días, al menos 7 días, al menos 14 días o al menos 28 días).

En algunas realizaciones de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, la resina de cromatografía es resina de cromatografía de intercambio aniónico, resina de cromatografía de intercambio catiónico, resina de cromatografía de exclusión por tamaño, resina de cromatografía de interacción hidrófoba, resina de cromatografía de afinidad o cualquier combinación de estas. En algunos ejemplos de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, la resina de cromatografía es resina de cromatografía de intercambio aniónico. En algunos ejemplos de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, la resina de cromatografía se ha tratado con una dosis de irradiación gamma entre aproximadamente 10 kGy a aproximadamente 40 kGy (p. ej., entre aproximadamente 15 kGy a aproximadamente 35 kGy, o entre aproximadamente 20 kGy a aproximadamente 30 kGy). En algunas realizaciones de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, el tampón desnaturalizante incluye uno o más de urea, clorhidrato de guanidina y TritonTM X-100. En algunas realizaciones de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria, la resina de cromatografía se expone a un tampón de lavado incluye hidróxido de sodio a aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1,5 M después de la exposición al tampón desnaturalizante. En algunas realizaciones de cualesquiera de los procesos descritos en la presente memoria donde la resina de cromatografía es una resina de afinidad con un ligando de proteína (p. ej., un ligando de proteína A), la resina de cromatografía se expone a un tampón de lavado que incluye hidróxido de sodio a entre aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM después de la exposición al tampón desnaturalizante.

Según se usa en la presente memoria, la palabra "un/a" antes de un sustantivo representa uno/a o más del sustantivo particular. Por ejemplo, la frase "una columna de cromatografía" representa "una o más columnas de cromatografía".

El término "resina de cromatografía irradiada con gamma" significa una resina de cromatografía que se ha expuesto a irradiación gamma. Por ejemplo, una resina de cromatografía irradiada con gamma puede ser una resina de cromatografía expuesta a una cantidad de irradiación gamma suficiente para reducir el grado de contaminación microbiana de la resina de cromatografía. En algunos ejemplos, la resina de cromatografía irradiada con gamma se ha expuesto a una dosis de entre aproximadamente 1 kGy a aproximadamente 15 kGy, una dosis de entre a aproximadamente 1 kGy a aproximadamente 20 kGy de irradiación gamma, una dosis de entre aproximadamente 1 kGy a aproximadamente 25 kGy de irradiación gamma, una dosis de entre aproximadamente 1 kGy a aproximadamente 30 kGy de irradiación gamma o una dosis de entre aproximadamente 1 kGy a aproximadamente 35 kGy de irradiación gamma. Una resina de cromatografía irradiada con gamma puede tener un nivel de garantía de esterilidad de aproximadamente o menor que 1 x 10-6, 1 x 10-7, 1 x 10-8, 1 x 10-9, o 1 x 10-10. Los para irradiar con gamma una resina de cromatografía se describen en la presente memoria. Se conocen métodos adicionales para irradiar con gamma una resina de cromatografía en la técnica.

El término "columna de cromatografía que contiene, que incluye o que comprende una resina de cromatografía irradiada con gamma" significa una columna de cromatografía que incluye una resina de cromatografía irradiada con gamma (según se define en la presente memoria). Por ejemplo, dicha columna de cromatografía puede incluir una resina de cromatografía irradiada con gamma que se ha expuesto a una dosis de entre aproximadamente 1 kGy a aproximadamente 15 kGy, una dosis de entre a aproximadamente 1 kGy a aproximadamente 20 kGy de irradiación gamma, una dosis de entre aproximadamente 1 kGy a aproximadamente 25 kGy de irradiación gamma, una dosis de entre aproximadamente 1 kGy a aproximadamente 30 kGy de irradiación gamma o una dosis de entre aproximadamente 1 kGy a aproximadamente 35 kGy de irradiación gamma. Por ejemplo, dicha columna de cromatografía puede contener una resina de cromatografía irradiada con gamma que tiene un nivel de garantía de esterilidad de aproximadamente o menor que 1 x 10-6, 1 x 10-7, 1 x 10-8, 1 x 10-9, o 1 x 10-10. En algunas realizaciones, la columna de cromatografía que contiene, que incluye o que comprende una resina de cromatografía irradiada con gamma tiene un grado de contaminación microbiana reducido, o es estéril, absolutamente estéril, o aséptica (según se define en la presente memoria) (es decir, las superficies y contenido interiores de la columna de cromatografía que contiene, que incluye o que comprende una resina de cromatografía irradiada con gamma tiene grado de contaminación microbiana reducido, es estéril, es absolutamente estéril, o es aséptica). En algunas realizaciones, la columna de cromatografía que contiene, que incluye o que comprende una resina de cromatografía irradiada con gamma es aséptica y tiene un grado de contaminación microbiana reducido, es estéril o es absolutamente estéril.

El término "tampón desnaturalizante" significa un líquido que incluye una cantidad suficiente de uno o más agentes químicos (p. ej., detergente(s), reductor(es), ácido(s), base(s), agente(s) caotrópico(s), disolvente(s) orgánico(s) o agente(s) de reticulación, o cualquier combinación de estos) que provocan la desnaturalización de una proteína. Los ejemplos no limitantes de tampones desnaturalizantes se describen en la presente memoria. Se conocen ejemplos adicionales de tampones de lavado desnaturalizantes en la técnica. Los métodos para detectar la desnaturalización de la proteína también se conocen en la técnica (p. ej., detectar la desnaturalización de la proteína directamente (p.

ej., espectroscopía) o indirectamente (p. ej., a través de ensayo(s) de la actividad de la proteína (p. ej., actividad enzimática o actividad de unión de proteína)). Los ejemplos no limitantes de métodos para detectar la desnaturalización de la proteína se describen en la presente memoria. En cualesquiera de los métodos o procesos descritos en la presente memoria, se puede usar un tampón desnaturalizante para regenerar una columna de cromatografía que incluye una resina de cromatografía esterilizada por gamma (p. ej., cualquiera de la resina de cromatografía o combinación o resinas de cromatografía descritas en la presente memoria).

El término "tampón de grado de contaminación microbiana reducido" significa un líquido (p. ej., una disolución tamponada tratada) tratado (p. ej., filtrado, sometido a autoclave o irradiado con gamma) que tiene un nivel de agente(s) contaminante(s) biológico(s) autorreplicante(s) que es menor que el nivel de agente(s) contaminante(s) biológico(s) autorreplicante(s) encontrado en un líquido no tratado idéntico. Los ejemplos no limitantes de contaminantes biológicos autorreplicantes pueden ser bacterias (p. ej., bacterias Gram positivas o Gram negativas, o esporas bacterianas o fúngicas), micobacterias, virus (p. ej., un vesivirus, un virus del Valle Cache, un parvovirus, un virus del herpes y un bunyavirus), parásitos, hongos, levadura o protozoarios. Por ejemplo, un tampón de grado de contaminación microbiana reducido puede tener un nivel de garantía de esterilidad de aproximadamente o menor que

1 x 10-6, 1 x 10-7, 1 x 10-8, 1 x 10-9, o 1 x 10-10.

"Esterilidad absoluta" o "absolutamente estéril" son términos que se usan para describir una composición o proceso que está/n completamente libre de contaminantes biológicos autorreplicantes. Por ejemplo, el término se puede aplicar a una resina de cromatografía irradiada con gamma, la superficie y el contenido interiores (p. ej., resina de cromatografía) de una columna de cromatografía y/o un tampón. Una composición o proceso absolutamente estéril puede estar limpio (según dicho término se conoce en la técnica).

"Estéril" o "esterilidad" son términos que se usan para describir una composición o proceso que tiene un nivel de garantía de esterilidad de aproximadamente o menor que 1,0 x 10-6 (p. ej., aproximadamente o menor que 1,0 x 10-7, aproximadamente o menor que 1,0 x 10-8, aproximadamente o menor que 1,0 x 10-9, o 1 x 10-10). La determinación de si una composición o proceso es estéril se puede evaluar al usar varios procesos de producción validados conocidos en la técnica. Por ejemplo, una composición o proceso estéril puede estar completamente libre de contaminantes biológicos autorreplicantes viables (p. ej., cualesquiera de los contaminantes biológicos autorreplicantes descritos en la presente memoria). Una composición o proceso estéril también puede estar limpio (según dicho término se conoce en la técnica).

El término "esterilización" significa un proceso validado usado para volver estéril a una composición (como se define en la presente memoria). La tasa de inactivación de contaminantes biológicos autorreplicantes indicadores resistentes

(p. ej., bacterias) durante un proceso de tratamiento se puede medir para determinar si ha logrado la esterilidad (según se define en la presente memoria) para una composición.

El término "nivel de garantía de esterilidad" o "SAL" (por sus siglas en inglés) se conoce en la técnica y significa un nivel de confianza de lograr la esterilidad absoluta dentro de un lote de unidades tratadas. La probabilidad habitualmente se calcula en función de los resultados de estudios de inactivación llevados a cabo durante la validación y se expresa en forma de 1 x 10-n.

El término "aséptico/a" se usa para describir una composición o proceso que está libre de contaminantes biológicos autorreplicantes y/o proteínas que causan enfermedades o causan síntomas (p. ej., cualquiera de los contaminantes biológicos autorreplicante descritos en la presente memoria, toxinas (p. ej., endotoxinas) o proteínas inflamatorias). Una composición o proceso aséptico también puede estar limpio (según dicho término se conoce en la técnica).

El término "ciclo de cromatografía" o "ciclo cromatográfico" es un término de la técnica y significa todas las etapas llevadas a cabo en una única pasada de cromatografía al usar una única columna de cromatografía. Por ejemplo, un ciclo de cromatografía puede incluir una etapa de equilibrar una columna de cromatografía con un tampón, pasar una muestra que incluye una proteína recombinante a través de la columna de cromatografía, eluir la proteína recombinante desde la columna de cromatografía y lavar la columna de cromatografía al pasar un tampón desnaturalizante a través de la columna. Se describen ejemplos adicionales de etapas llevadas a cabo en un ciclo de cromatografía en la presente memoria. También se conocen ejemplos adicionales de etapas llevadas a cabo en un ciclo de cromatografía en la técnica.

El término "operación de unidad" es un término de la técnica y significa una etapa funcional que se puede llevar a cabo en un proceso para purificar una proteína recombinante a partir de un medio de cultivo líquido. Por ejemplo, una unidad de operación puede ser filtrar (p. ej., extraer bacterias, levadura, virus o micobacterias contaminantes, y/o materia particulada de un fluido que incluye una proteína recombinante), capturar, extraer identificador de epítopo, purificar, retener o almacenar, refinar, inactivar virus, ajustar la concentración iónica y/o el pH de un fluido que incluye la proteína recombinante y extraer sales indeseadas.

El término "capturar" significa una etapa que se lleva a cabo para purificar o aislar parcialmente (p. ej., al menos o aproximadamente 5 %, p. ej., al menos o aproximadamente 10 %, 15 %, 20 %, 25%, 30 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o al menos o aproximadamente 95 % pura en peso) y concentrar una proteína recombinante (p. ej., una proteína terapéutica recombinante) a partir de uno o más componentes distintos presentes en un medio de cultivo líquido o un medio de cultivo líquido diluido (p. ej., proteínas del medio de cultivo o uno o más componentes distintos (p. ej., ADN, ARN u otras proteínas) presentes en o secretadas desde una célula de mamífero). Típicamente, la captura se lleva a cabo al usar una resina de cromatografía que se une a una proteína recombinante (p. ej., a través del uso de cromatografía de afinidad). Los métodos no limitantes para capturar una proteína recombinante a partir de medio de cultivo líquido o medio de cultivo líquido diluido se describen en la presente memoria y se conocen otros en la técnica. Una proteína recombinante se puede capturar a partir de un medio de cultivo líquido al usar al menos una columna de cromatografía y/o membrana cromatográfica (p. ej., cualquiera de las columnas de cromatografía y/o membranas cromatográficas descritas en la presente memoria).

El término "purificar" significa una etapa que se lleva a cabo para aislar una proteína recombinante (p. ej., una proteína terapéutica recombinante) de una o más impurezas distintas (p. ej., impurezas a granel) o componentes presentes en un fluido que incluye una proteína recombinante (p. ej., proteínas del medio de cultivo líquido o uno o más componentes distintos (p. ej., a Dn , ARN u otras proteínas, endotoxinas, virus, etc.) presentes en o secretadas desde una célula de mamífero). Por ejemplo, la purificación se puede llevar a cabo durante o después de una etapa de captura inicial. La purificación se puede llevar a cabo al usar una resina de cromatografía, membrana o cualquier otro soporte sólido que se une a una proteína recombinante o contaminantes (p. ej., a través del uso de cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico o cromatografía con tamiz molecular). Una proteína recombinante se puede purificar a partir de un fluido que incluye la proteína recombinante al usar al menos una columna de cromatografía y/o membrana cromatográfica (p. ej., cualquiera de las columnas de cromatografía o membranas cromatográficas descritas en la presente memoria).

El término "refinar" es un término de la técnica y significa una etapa que se lleva a cabo para extraer restos o cantidades pequeñas restantes de contaminantes o impurezas de un fluido que incluye una proteína recombinante (p. ej., una proteína terapéutica recombinante) que está próxima a una pureza final deseada. Por ejemplo, la refinación se puede llevar a cabo al pasar un fluido que incluye la proteína recombinante a través de una(s) columna(s) cromatográfica(s) o membrana(s) absorbente(s) que se une selectivamente a la proteína recombinante diana o a cantidades pequeñas de contaminantes o impurezas presentes en un fluido que incluye una proteína recombinante. En dicho ejemplo, el eluato/filtrado de la(s) columna(s) cromatográfica(s) o membrana(s) absorbente(s) incluye la proteína recombinante.

El término "filtrar" significa retirar al menos parte de (p. ej., al menos 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) de contaminantes biológicos indeseados (p. ej., una célula de mamífero, bacterias, células de levadura, virus o micobacterias) y/o materia particulada (p. ej., proteínas precipitadas) de un líquido (p. ej., un medio de cultivo líquido o fluido presente en cualquiera de los procesos descritos en la presente memoria).

El término "eluato/filtrado" es un término de la técnica y significa un fluido que se emite de una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que incluye una cantidad detectable de una proteína recombinante (p. ej., una proteína terapéutica recombinante).

El término "proceso integrado" significa un proceso que se lleva a cabo al usar elementos estructurales que funcionan de manera cooperativa para lograr un resultado específico (p. ej., la purificación de una proteína recombinante a partir de un medio de cultivo líquido).

El término "proceso continuo" significa un proceso que alimenta de manera continua fluido a través de al menos una parte del sistema. Por ejemplo, un proceso continuo es un proceso que alimenta de manera continua un medio de cultivo líquido que incluye una proteína recombinante desde un biorreactor a través de un MCCS. Otro ejemplo de un proceso continuo es un proceso que alimenta de manera continua un medio de cultivo líquido que incluye una proteína recombinante desde un biorreactor a través de un primer y segundo MCCS (MCCS1 y MCCS2). Los ejemplos adicionales incluyen un proceso que alimenta de manera continua un medio de cultivo líquido que incluye una proteína recombinante a través de un MCCS, un proceso que alimenta de manera continua un medio de cultivo líquido que incluye una proteína recombinante a través de un MCCS1 y un MCCS2, o un proceso que alimenta de manera continua un fluido que incluye una proteína recombinante a través de MCCS2.

El término "proceso cerrado" es un término de la técnica y significa un proceso que se lleva a cabo de manera que los componentes del proceso (p. ej., resinas de cromatografía y/o tampones) que entran en contacto con la proteína recombinante o líquido que incluye la proteína recombinante no se exponen de manera intencional a agentes contaminantes durante un período de tiempo significativo (p. ej., no expuesto al aire intencionalmente durante un período de tiempo significativo).

El término "sustancia farmacéutica de proteína terapéutica" significa una proteína recombinante (p. ej., una inmunoglobulina, fragmento de proteína, proteína genomanipulada o enzima) que se ha purificado o aislado suficientemente de proteínas, lípidos y ácidos nucleicos contaminantes (p. ej., proteínas, lípidos y ácidos nucleicos contaminantes presentes en un medio de cultivo líquido o de una célula hospedante (p. ej., de una célula hospedante de mamífero, levadura o bacteriana)) y contaminantes biológicos (p. ej., contaminantes víricos y bacterianos), y se puede formular en un agente farmacéutico sin ninguna etapa(s) de purificación y/o descontaminación sustancial adicional).

El término "sistema de cromatografía de multicolumna" o "MCCS" significa un sistema de un total de dos o más columnas de cromatografía y/o membranas cromatográficas interconectadas o conmutables. Un ejemplo no limitante de un sistema de cromatografía de multicolumna es un sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCC, por sus siglas en inglés) que incluye un total de dos o más columnas de cromatografía y/o membranas cromatográficas interconectadas o conmutables. Se describen en la presente memoria y se conocen en la técnica ejemplos adicionales de sistemas de cromatografía de multicolumna.

El término "sustancialmente libre" significa una composición (p. ej., un medio de cultivo líquido) que está al menos o aproximadamente 90 % libre (p. ej., al menos o aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o al menos o aproximadamente 99 % libre, o aproximadamente 100 % libre) de una sustancia especificada (p. ej., una célula de mamífero o una proteína, ácido nucleico, carbohidrato, o forma lipídica de una célula de mamífero contaminante).

El término "célula de mamífero" significa cualquiera célula de o derivada de cualquier mamífero (p. ej., un humano, un hámster, un ratón, un mono verde, una rata, un cerdo, una vaca o un conejo). Por ejemplo, una célula de mamífero puede ser una célula inmortalizada. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es una célula diferenciada. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es una célula indiferenciada. Los ejemplos no limitantes de células de mamífero se describen en la presente memoria. Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de células de mamífero.

El término "cultivar" o "cultivar células" significa el mantenimiento o proliferación de una célula de mamífero en un conjunto controlado de condiciones físicas.

El término "cultivo de células de mamífero" significa un medio de cultivo líquido que incluye una pluralidad de células de mamífero que se mantiene o prolifera en un conjunto controlado de condiciones físicas.

El término "medio de cultivo líquido" significa un fluido que incluye suficientes nutrientes para posibilitar que una célula (p. ej., una célula de mamífero) se multiplique o prolifere in vitro. Por ejemplo, un medio de cultivo líquido puede incluir uno o más de: aminoácidos (p. ej., 20 aminoácidos), una purina (p. ej., hipoxantina), una pirimidina (p. ej., timidina), colina, inositol, tiamina, ácido fólico, biotina, calcio, niacinamida, piridoxina, riboflavina, timidina, cianocobalamina, piruvato, ácido lipoico, magnesio, glucosa, sodio, potasio, hierro, cobre, zinc y bicarbonato de sodio. En algunas realizaciones, un medio de cultivo líquido puede incluir suero de un mamífero. En algunas realizaciones, un medio de cultivo líquido no incluye suero ni otro extracto de un mamífero (un medio de cultivo líquido definido). En algunas realizaciones, un medio de cultivo líquido puede incluir oligoelementos metálicos, una hormona de crecimiento de mamífero y/o un factor de crecimiento de mamífero. Otro ejemplo de medio de cultivo líquido es un medio mínimo (p. ej., un medio que incluye solo sales inorgánicas, una fuente de carbono y agua). Los ejemplos no limitantes de medio de cultivo líquido se describen en la presente memoria. Se conocen en la técnica y están disponibles comercialmente ejemplos adicionales de medio de cultivo líquido. Un medio de cultivo líquido puede incluir cualquier densidad de células de mamífero. Por ejemplo, según se usa en la presente memoria, un volumen de medio de cultivo líquido retirado de un biorreactor puede estar sustancialmente libre de células de mamífero.

El término "medio de cultivo líquido libre de componentes derivados de animal" significa un medio de cultivo líquido que no incluye ningún componente (p. ej., proteínas o suero) derivado de un mamífero.

El término "medio de cultivo líquido libre de suero" significa un medio de cultivo líquido que no incluye un suero de mamífero.

El término "medio de cultivo líquido que contiene suero" significa un medio de cultivo líquido que incluye un suero de mamífero.

El término "medio de cultivo líquido químicamente definido" es un término de la técnica y significa un medio de cultivo líquido en el que todos los componentes químicos se conocen. Por ejemplo, un medio de cultivo líquido químicamente definido no incluye suero bovino fetal, seroalbúmina bovina ni seroalbúmina humana, ya que estas preparaciones típicamente incluyen una mezcla compleja de albúminas y lípidos.

El término "medio de cultivo líquido libre de proteína" significa un medio de cultivo líquido que no incluye ninguna proteína (p. ej., ninguna proteína detectable).

El término "inmunoglobulina" significa un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos de al menos 15 aminoácidos (p. ej., al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 aminoácidos) de una proteína inmunoglobulina (p. ej., una secuencia de dominio variable, una secuencia de marco y/o una secuencia de dominio constante). La inmunoglobulina puede incluir, por ejemplo, al menos 15 aminoácidos de una inmunoglobulina de cadena ligera, p. ej., al menos 15 aminoácidos de una inmunoglobulina de cadena pesada. La inmunoglobulina puede ser un anticuerpo aislado (p. ej., una IgG, IgE, IgD, IgA o IgM), p. ej., una subclase de IgG (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4). La inmunoglobulina puede ser un fragmento de anticuerpo, p. ej., un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento scFv. La inmunoglobulina también puede ser un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo triespecífico, o un anticuerpo dimérico, trimérico o multimérico, o un diacuerpo, un Affibody® o un Nanobody®. La inmunoglobulina también puede ser una proteína genomanipulada que incluye al menos un dominio de inmunoglobulina (p. ej., una proteína de fusión). Se describen en la presente memoria ejemplos no limitantes de inmunoglobulinas y se conocen en la técnica ejemplos adicionales de inmunoglobulinas.

El término "fragmento de proteína" o "fragmento de polipéptido" significa una porción de una secuencia polipeptídica que tiene al menos o aproximadamente 4 aminoácidos, al menos o aproximadamente 5 aminoácidos, al menos o aproximadamente 6 aminoácidos, al menos o aproximadamente 7 aminoácidos, al menos o aproximadamente 8 aminoácidos, al menos o aproximadamente 9 aminoácidos, al menos o aproximadamente 10 aminoácidos, al menos o aproximadamente 11 aminoácidos, al menos o aproximadamente 12 aminoácidos, al menos o aproximadamente 13 aminoácidos, al menos o aproximadamente 14 aminoácidos, al menos o aproximadamente 15 aminoácidos, al menos o aproximadamente 16 aminoácidos, al menos o aproximadamente 17 aminoácidos, al menos o aproximadamente 18 aminoácidos, al menos o aproximadamente 19 aminoácidos, o al menos o aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, o más de 20 aminoácidos de longitud. Se puede producir un fragmento de proteína recombinante al usar cualquiera de los procesos descritos en la presente memoria.

El término "proteína genomanipulada" significa un polipéptido no codificado naturalmente por un ácido nucleico endógeno presente dentro de un organismo (p. ej., un mamífero). Los ejemplos de proteínas genomanipuladas incluyen enzimas (p. ej., con una o más sustituciones, eliminaciones, inserciones o adiciones de aminoácidos que provocan un aumento en la estabilidad y/o actividad catalítica de la enzima genomanipulada), proteínas de fusión, anticuerpos (p. ej., anticuerpos divalentes, anticuerpos trivalentes, o un diacuerpo) y proteínas de unión a antígeno que incluyen al menos una secuencia de supercóntigo recombinante.

El término "proteína secretada" o "proteína recombinante secretada" significa una proteína (p. ej., una proteína recombinante) que incluía originalmente al menos una secuencia señal de secreción cuando se traduce dentro de una célula de mamífero, y a través de, al menos en parte, escisión enzimática de la secuencia señal de secreción en la célula de mamífero, se secreta al menos parcialmente en el espacio extracelular (p. ej., un medio de cultivo líquido). Los profesionales expertos apreciarán que una proteína "secretada" no necesita disociarse completamente de la célula para considerarse una proteína secretada.

El término "biorreactor de perfusión" significa un biorreactor que incluye una pluralidad de células (p. ej., células de mamífero) en un primer medio de cultivo líquido, en donde el cultivo de las células presentes en el biorreactor incluye la extracción periódica o continua del primer medio de cultivo líquido y al mismo tiempo o poco tiempo después la adición de sustancialmente el mismo volumen de un segundo medio de cultivo líquido al biorreactor. En algunos ejemplos, hay un cambio progresivo (p. ej., aumento o disminución) en el volumen del primer medio de cultivo líquido extraído y agregado en períodos progresivos (p. ej., un período de aproximadamente 24 horas, un período de entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 24 horas, o un período mayor que 24 horas) durante el período de cultivo (p. ej., la tasa de realimentación del medio de cultivo a diario). La fracción de medios extraídos y reemplazados cada día puede variar dependiendo de las células particulares que se cultivan, la densidad de siembra inicial y la densidad celular en un momento particular. "VR" o "volumen de reactor" significa el volumen del medio de cultivo presente en el inicio del proceso de cultivo (p. ej., el volumen total del medio de cultivo presente después de la siembra).

El término "biorreactor de alimentación por lotes" es un término de la técnica y significa un biorreactor que incluye una pluralidad de células (p. ej., células de mamífero) en un primer medio de cultivo líquido, en donde el cultivo de las células presentes en el biorreactor incluye la adición periódica o continua de un segundo medio de cultivo líquido al primer medio de cultivo líquido sin la extracción sustancial o significativa del primer medio de cultivo líquido o el segundo medio de cultivo líquido del cultivo celular. El segundo medio de cultivo líquido puede ser igual al primer medio de cultivo líquido. En algunos ejemplos de cultivo de alimentación por lotes, el segundo medio de cultivo líquido es una forma concentrada del primer medio de cultivo líquido. En algunos ejemplos de cultivo de alimentación por lotes, el segundo medio de cultivo líquido se agrega como un polvo seco.

El término "medio de cultivo líquido clarificado" significa un medio de cultivo líquido obtenido a partir de un cultivo celular bacteriano o de levadura que está sustancialmente libre (p. ej., al menos 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 94 %, 96 %, 98 % o 99 % libre) de células de bacterias o levadura.

A menos que se definan de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica al cual corresponde la presente invención. En la presente memoria se describen métodos y materiales para usar en la presente invención; también se pueden usar otros materiales y materiales adecuados conocidos en la técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones, prevalecerán.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y figuras, y a partir de las reivindicaciones.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico de las isotermas de unión en t0 de resina multimodal no tratada (virgen) con intercambio aniónico y grupos hidrófobos (resina AE) y resina AE irradiada con gamma a 25 kGy (sin ciclos de cromatografía).

La Figura 2 es un gráfico del porcentaje de capacidad de unión normalizada de la resina AE virgen (no tratada), la resina AE irradiada con gamma a 15 kGy y la resina AE irradiada con gamma a 25 kGy durante múltiples ciclos de cromatografía en columna, cuando se usa un tampón de arginina 700 mM, acetato 100 mM (pH 3,0) y posteriormente disolución de NaOH 1 N para lavar cada resina (después de la elución de la proteína recombinante) en cada ciclo. El porcentaje de capacidad de unión de cada resina se normaliza con respecto a la capacidad de unión de la resina AE virgen (no tratada) en el tiempo 0 (t0), que también se halló que es muy similar a la resina irradiada con gamma en t0 (27 ± 2 mg/mL).

La Figura 3 es un gráfico que muestra la tasa media de caída en la capacidad de unión durante múltiples ciclos de cromatografía en columna para la resina AE virgen (no tratada), la resina AE irradiada con gamma a 15 kGy y la resina AE irradiada con gamma a 25 kGy, cuando se usa un tampón de arginina 700 mM, acetato 100 mM (pH 3,0) y posteriormente disolución de NaOH 1 N para lavar cada resina (después de la elución de la proteína recombinante) en cada ciclo.

La Figura 4 es un gráfico del porcentaje de capacidad de unión normalizada de la resina AE virgen (no tratada) durante múltiples ciclos de cromatografía en columna al usar una única columna de cromatografía que incluye la resina AE virgen (no tratada) lavada con arginina 700 mM, acetato 100 mM (pH 3,0) y posteriormente disolución de NaOH 1 N después de la elución de la proteína recombinante en cada ciclo (arginina virgen de pH bajo), o al usar una única columna de cromatografía que incluye resina AE irradiada con gamma a 25 kGy lavada después de la elución de la proteína recombinante (en cada ciclo) con urea 8 M, NaCl 1 M, ácido cítrico 0,1 M, pH 2,5 (urea de pH bajo); HCl de guanidina 6 M (pH 2,5) (guanidina de pH bajo); Triton-X 100 al 0,5 % en ácido acético 0,1 M (pH 2,5) y posteriormente ácido acético 0,7 M, etanol al 20 %, etilenglicol al 50 % (pH 2,5) (Triton de pH bajo); arginina 700 mM, acetato 100 mM (pH 3,0) (arginina de pH bajo); o ácido acético 0,7 M, etanol al 20 %, etilenglicol al 50 % (pH 2,5) (orgánico de pH bajo), cada uno seguido de una disolución de NaOH 1 N. El porcentaje de capacidad de unión de cada resina en cada ciclo se normalizó con respecto a la capacidad de unión de la resina AE virgen (no tratada) en el tiempo 0 (t0), que también se halló que es muy similar a la resina irradiada con gamma en t0 (27 ± 2 mg/mL).

La Figura 5 es un perfil de cromatógrafo representativo de una pasada de cromatografía de multicolumna (MCC, por sus siglas en inglés) que muestra la absorbancia del eluato a 280 nm durante múltiples ciclos de cromatografía en columna llevados a cabo al usar tres columnas de cromatografía que incluyen resina AE irradiada con gamma a 25 kGy, cuando se usa urea 8 M, NaCl 1M, ácido cítrico 0,1 M, pH 2,5 y posteriormente disolución de NaOH 1 N para lavar cada resina (después de la elución de la proteína recombinante) en cada ciclo. Los picos que representan la proteína unidad liberada de la resina AE durante la exposición al tampón desnaturalizante de urea 8 M, NaCl 1 M, ácido cítrico 0,1 M, pH 2,5 en tres ciclos diferentes se indican con una flecha. El cromatógrafo muestra el rastro de UV para las tres columnas de cromatografía usadas para llevar a cabo la pasada de MCC.

La Figura 6 es un gráfico del porcentaje de proteína recombinante recuperada unida a la resina de cromatografía por ciclo durante múltiples ciclos de cromatografía en columna al usar una única columna de cromatografía que incluye la resina AE virgen (no tratada) lavada con arginina 700 mM, acetato 100 mM (pH 3,0) y posteriormente disolución de NaOH 1 N después de la elución de la proteína recombinante en cada ciclo (arginina virgen de pH bajo), o al usar una única columna de cromatografía que incluye resina AE irradiada con gamma a 25 kGy lavada después de la elución de la proteína recombinante (en cada ciclo) con urea 8 M, NaCl 1 M, ácido cítrico 0,1 M, pH 2,5 (urea de pH bajo); HCl de guanidina 6 M (pH 2,5) (guanidina de pH bajo); Triton-X 100 al 0,5 % en ácido acético 0,1 M (pH 2,5) y posteriormente ácido acético 0,7 M, etanol al 20 %, etilenglicol al 50 % (pH 2,5) (Triton de pH bajo); o ácido acético 0,7 M, etanol al 20 %, etilenglicol al 50 % (pH 2,5) (orgánico de pH bajo); cada uno seguido de una disolución de NaOH 1 N.

La Figura 7 es un gráfico de la proteína de célula hospedante (ng/mg) presente en el eluato durante múltiples ciclos de cromatografía en columna al usar una única columna de cromatografía que incluye la resina AE virgen (no tratada) lavada con arginina 700 mM, acetato 100 mM (pH 3,0) y posteriormente disolución de NaOH 1 N después de la elución de la proteína recombinante en cada ciclo (arginina virgen de pH bajo), o al usar una única columna de cromatografía que incluye resina AE irradiada con gamma a 25 kGy lavada después de la elución de la proteína recombinante (en cada ciclo) con urea 8 M, NaCl 1 M, ácido cítrico 0,1 M, pH 2,5 (urea de pH bajo); HCl de guanidina 6 M (pH 2,5) (guanidina de pH bajo); Triton-X 100 al 0,5 % en ácido acético 0,1 M (pH 2,5) y posteriormente ácido acético 0,7 M, etanol al 20 %, etilenglicol al 50 % (pH 2,5) (Triton de pH bajo); o ácido acético 0,7 M, etanol al 20 %, etilenglicol al 50 % (pH 2,5) (orgánico de pH bajo); cada uno seguido de una disolución de NaOH 1 N.

La Figura 8 es una lista de enfermedades de almacenamiento lisosómico y la enzima terapéutica recombinante que se puede usar para tratar cada enfermedad.

Descripción detallada

En la presente memoria se describen métodos para llevar a cabo la cromatografía con resina de cromatografía irradiada con gamma que incluyen proporcionar una columna de cromatografía que incluye una resina de cromatografía irradiada con gamma y llevar a cabo un primer ciclo de cromatografía a través de la columna, donde el ciclo incluye exponer la resina de cromatografía a un tampón desnaturalizante. También se describen procesos integrados, procesos cerrados o sustancialmente cerrados y continuos para la fabricación de una proteína recombinante que incluyen el uso de al menos una columna de cromatografía que incluye resina de cromatografía irradiada con gamma, donde la resina de cromatografía irradiada con gamma se expone a tampón desnaturalizante durante cada ciclo en el proceso, y se usa tampón de grado de contaminación microbiana reducido en el proceso. Se describen aspectos no limitantes de estos métodos y procesos más adelante. Como se puede apreciar en la técnica, los diversos aspectos descritos más adelante se pueden usar en cualquier combinación sin limitación.

Resina de cromatografía irradiada con gamma

Una amplia variedad de tipos diferentes de resina de cromatografía conocidos en la técnica (o combinaciones de estos) se pueden exponer a irradiación gamma al usar métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un isótopo tal como Cobalto-60 o Cesio-137 se usa como la fuente de rayos gamma. La resina de cromatografía que se expone a irradiación gamma puede estar presente en una columna de cromatografía rellena. En otros ejemplos, la resina de cromatografía que se expone a irradiación gamma está presente en un contenedor sellado (p. ej., una suspensión en un contenedor sellado).

La resina de cromatografía se puede exponer a irradiación gamma a una temperatura de aproximadamente entre aproximadamente -25 °C y aproximadamente 0 °C, inclusive, o entre aproximadamente 0 °C y aproximadamente 25 °C, inclusive. La resina de cromatografía se puede exponer a una dosis de irradiación gamma de entre aproximadamente 0,1 kGy a aproximadamente 100 kGy, entre aproximadamente 1 kGy a aproximadamente 100 kGy, entre aproximadamente 1 kGy a aproximadamente 90 kGy, entre aproximadamente 1 kGy a aproximadamente 80 kGy, entre aproximadamente 1 kGy a aproximadamente 70 kGy, entre aproximadamente 1 kGy a aproximadamente 65 kGy, entre aproximadamente 5 kGy a aproximadamente 65 kGy, entre aproximadamente 10 kGy a aproximadamente 60 kGy, entre aproximadamente 10 kGy a aproximadamente 55 kGy, entre aproximadamente 10 kGy a aproximadamente 50 kGy, entre aproximadamente 10 kGy a aproximadamente 45 kGy, entre aproximadamente 10 kGy a aproximadamente 40 kGy, entre aproximadamente 10 kGy a aproximadamente 35 kGy, entre aproximadamente 10 kGy a aproximadamente 30 kGy, entre aproximadamente 15 kGy a aproximadamente 50 kGy, entre aproximadamente 15 kGy a aproximadamente 45 kGy, entre aproximadamente 15 kGy a aproximadamente 40 kGy, entre aproximadamente 15 kGy a aproximadamente 35 kGy o entre aproximadamente 20 kGy a aproximadamente 30 kGy.

La resina de cromatografía irradiada con gamma puede ser una resina de cromatografía de intercambio aniónico, resina de cromatografía de intercambio catiónico, resina de cromatografía de exclusión por tamaño, resina de cromatografía de interacción hidrófoba, resina de cromatografía de afinidad o cualquier combinación de estas. Los ejemplos no limitantes de resina de cromatografía de afinidad incluyen resinas con un ligando de péptido, un ligando de proteína (p. ej., proteína A o proteína G), un ligando de aptámero, un ligando de sustrato, un ligando de producto, un ligando de metal y un ligando de cofactor. Una resina de cromatografía irradiada con gamma puede ser una resina de cromatografía bimodal (p. ej., con las características de resina de cromatografía de intercambio aniónico e interacción hidrófoba).

Columnas de cromatografía que incluyen resina de cromatografía irradiada con gamma

Los métodos descritos en la presente memoria incluyen el uso de una columna de cromatografía que incluye resina de cromatografía irradiada con gamma y los procesos descritos en la presente memoria incluyen el uso de uno o dos MCCS que incluyen al menos una columna de cromatografía que incluye una resina de cromatografía irradiada con gamma. La resina de cromatografía irradiada con gamma puede ser cualquier tipo de resina descrito en la presente memoria (o cualquier tipo de resina de cromatografía conocido en la técnica). La resina de cromatografía irradiada con gamma se puede preparar al usar cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica.

Dichas columnas de cromatografía se pueden producir al rellenar una columna de cromatografía con una resina(s) de cromatografía no tratada(s) y exponer la columna rellena a irradiación gamma (p. ej., al usar cualquiera de las exposiciones y condiciones descritas en la presente memoria). En otros ejemplos, las columnas de cromatografía que incluyen una resina(s) irradiada(s) con gamma se pueden producir al exponer la resina de cromatografía a irradiación gamma (p. ej., resina de cromatografía proporcionada en un contenedor) y rellenar una columna de cromatografía con la resina de cromatografía irradiada con gamma. En dichos métodos, la resina de cromatografía que se expone a irradiación gamma puede estar presente como una suspensión en el contenedor y la columna de cromatografía se rellena en una campana de grado de contaminación microbiana reducido. En otros métodos, la resina de cromatografía se puede exponer a irradiación gamma como una mezcla sólida en el contenedor, y se puede preparar una suspensión de la resina de cromatografía irradiada con gamma al usar un tampón de grado de contaminación microbiana reducido (p. ej., preparado en una campana de grado de contaminación microbiana reducido), y la suspensión resultante se puede usar para rellenar una columna de cromatografía en una campana de grado de contaminación microbiana reducido. En algunos de estos ejemplos, la columna de cromatografía, antes de rellenarse, se puede tratar para reducir el grado de contaminación microbiana (p. ej., someterse a autoclave, irradiarse con gamma o exponerse a óxido de etileno).

La columna de cromatografía que incluye resina de cromatografía irradiada con gamma puede tener un nivel de garantía de esterilidad (SAL) de entre aproximadamente 1 x 10-3 y aproximadamente 1 x 10-12, entre aproximadamente 1 x 10-4 y aproximadamente 1 x 10-12, entre 1 x 10-5 y aproximadamente 1 x 10-11, entre aproximadamente 1 x 10-5 y aproximadamente 1 x 10-10, entre aproximadamente 1 x 10-5 y aproximadamente 1 x 10-9, entre aproximadamente 1 x 10-6 y aproximadamente 1 x 10-9, o entre aproximadamente 1 x 10-6 y aproximadamente 1 x 10-8, inclusive.

Tampones de grado de contaminación microbiana reducido

Los métodos y procesos descritos en la presente memoria pueden llevarse a cabo al usar uno o más tampones de grado de contaminación microbiana reducido. Como se puede apreciar en la técnica, un tampón de grado de contaminación microbiana reducido puede ser cualquier tipo de tampón usado en un ciclo de cromatografía (p. ej., un tampón usado en cualquiera de las etapas en un ciclo de cromatografía o en cualquiera de las operaciones de unidad descritas en la presente memoria). Los métodos ilustrativos para reducir el grado de contaminación microbiana de un tampón incluyen filtración (filtración por un tamaño de poro de 0,2 Tm), uso de autoclave e irradiación gamma. Se conocen métodos adicionales para reducir el grado de contaminación microbiana de un tampón en la técnica. Un tampón de grado de contaminación microbiana reducido puede tener un nivel de garantía de esterilidad de entre aproximadamente 1 x 10-3 y aproximadamente 1 x 10-12, entre aproximadamente 1 x 10-4 y aproximadamente 1 x 10 12, entre 1 x 10-5 y aproximadamente 1 x 10-11, entre aproximadamente 1 x 10-5 y aproximadamente 1 x 10-10, entre aproximadamente 1 x 10-5 y aproximadamente 1 x 10-9, entre aproximadamente 1 x 10-6 y aproximadamente 1 x 10-9, o entre aproximadamente 1 x 10-6 y aproximadamente 1 x 10-8, inclusive.

Tampones desnaturalizantes

Los métodos y procesos descritos en la presente memoria incluyen el uso de un tampón desnaturalizante. Los tampones desnaturalizantes incluyen una cantidad suficiente de uno o más agentes químicos (p. ej., detergente(s), reductor(es), ácido(s), agente(s) caotrópico(s), disolvente(s) orgánico(s) o agente(s) de reticulación, o cualquier combinación de estos) que provocan la desnaturalización de una proteína. Los detergentes ilustrativos no limitantes que se pueden incluir en un tampón desnaturalizante incluyen Triton X-100, dodecil sulfato sódico y bromuro de etil trimetil amonio. Los ejemplos no limitantes de disolventes orgánicos que se pueden incluir en un tampón desnaturalizante incluyen etanol, butanol, fenol, propanol y metanol. Los ejemplos no limitantes de reductores que se pueden incluir en un tampón desnaturalizante incluyen 2-mercaptoetanol, ditiotreitol y tris(2-carboxietil)fosfina. Los ejemplos no limitantes de ácidos que se pueden incluir en tampones desnaturalizantes incluyen ácido acético, ácido tricloroacético y ácido sulfosalicílico. Los ejemplos no limitantes de agentes caotrópicos que se pueden incluir en un tampón desnaturalizante incluyen urea (p. ej., urea 6 a 9 M), tiourea, cloruro de guanidio (p. ej., cloruro de guanidio 5 a 7 M), perclorato de litio (p. ej., perclorato de litio 4 a 7 M) o acetato de litio. Los ejemplos no limitantes de agentes de reticulación que se pueden incluir en un tampón desnaturalizante incluyen formaldehído y glutaraldehído.

Los ejemplos no limitantes de tampones desnaturalizantes incluyen: urea 8 M, NaCI 1 M, ácido cítrico 0,1 M, pH 2,5 (p. ej., seguido de NaOH 1 N); HCl de guanidina 6 M, pH 2,5 (p. ej., seguido de NaOH 1 N o NaOH 1 M más NaCl 1 M); y Triton-X 100 al 0,5 % en ácido acético 0,1 M, pH 2,5 (p. ej., seguido de ácido acético 0,7 M, etanol al 20 %, etilenglicol al 50 %, pH 2,5, seguido de NaOH 1 N).

Proteínas terapéuticas recombinantes

Una proteína recombinante como se describe en la presente memoria puede ser una proteína terapéutica recombinante. Los ejemplos no limitantes de proteínas terapéuticas recombinantes que se pueden producir mediante los métodos proporcionados en la presente memoria incluyen inmunoglobulina (incluidas inmunoglobulinas de cadena ligera y pesada, anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo (p. ej., cualquiera de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente memoria), enzimas (p. ej., una galactosidasa (p. ej., una alfa-galactosidasa), Myozyme®, o Cerezyme®), proteínas (p. ej., eritropoyetina, factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en inglés) o un interferón alfa o beta humanos), o proteínas o fragmentos de proteínas inmunógenas o antigénicas (p. ej., proteínas para usar en una vacuna). Los ejemplos no limitantes de enzimas terapéuticas recombinantes que se puede usar para tratar una variedad de enfermedades de almacenamiento lisosómico se muestran en la Figura 8. La proteína terapéutica recombinante puede ser un polipéptido de unión a antígeno genomanipulado que incluye al menos un supercóntigo de proteína recombinante multifuncional (ver, p. ej., las proteínas de unión a antígeno recombinantes descritas en Gebauer et al., Actual Opin. Chem. Biol. 13:245-255, 2009; y la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2012/0164066). Los ejemplos no limitantes de proteínas terapéuticas recombinantes que son anticuerpos incluyen: panitumumab, omalizumab, abagovomab, abciximab, actoxumab, adalimumab, adecatumumab, afelimomab, afutuzumab, alacizumab, alacizumab, alemtuzumab, alirocumab, altumomab, amatuximab, anatumomab, apolizumab, atinumab, tocilizumab, basilizimab, bectumomab, belimumab, bevacizumab, biciromab, canakinumab, cetuximab, daclizumab, densumab, eculizumab, edrecolomab, efalizumab, efungumab, ertumaxomab, etaracizumab, golimumab, infliximab, natalizumab, palivizumab, panitumumab, pertuzumab, ranibizumab, rituximab, tocilizumab y trastuzumab. Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de anticuerpos terapéuticos recombinantes que se pueden producir mediante los métodos descritos en la presente memoria. Los ejemplos no limitantes adicionales de proteínas terapéuticas recombinantes que se puede producir/purificar mediante los presentes métodos incluyen: alglucosidasa alfa, laronidasa, abatacept, galsulfasa, lutropina alfa, factor antihemofílico, agalsidasa beta, interferón beta-la, darbepoyetina alfa, tenecteplasa, etanercept, factor de coagulación IX, hormona estimulante de folículos, interferón beta-la, imiglucerasa, dornasa alfa, epoyetina alfa y alteplasa.

Una proteína terapéutica recombinante soluble secretada se puede recuperar del medio de cultivo líquido (p. ej., un primer y/o segundo medio de cultivo líquido) al extraer o separar físicamente de cualquier otra manera el medio de cultivo líquido de las células (p. ej., células de mamífero). En la técnica se conoce una variedad de métodos diferentes para extraer el medio de cultivo líquido de las células (p. ej., células de mamífero), que incluyen, por ejemplo, centrifugación, filtración, pipeteado y/o aspiración. La proteína terapéutica recombinante secretada después se puede recuperar y purificar adicionalmente del medio de cultivo líquido al usar una variedad de técnicas bioquímicas que incluyen varios tipos de cromatografía (p. ej., cromatografía de afinidad, cromatografía de tamiz molecular, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de intercambio aniónico o cromatografía de interacción hidrófoba o cualquier combinación de estas) y/o filtración (p. ej., filtración por corte de peso molecular).

Ciclo de cromatografía

Como se conoce en la técnica, las etapas en un ciclo de cromatografía pueden diferir dependiendo de la resina de cromatografía, los tampones usados para llevar a cabo cada etapa en el ciclo, y las características biofísicas de la proteína recombinante diana (p. ej., proteína terapéutica recombinante). Por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad puede incluir las etapas de cargar una columna de cromatografía de afinidad con un fluido que incluye la proteína recombinante diana, lavar la columna para extraer material biológico indeseado (p. ej., proteínas contaminantes y/o moléculas pequeñas), eluir la proteína recombinante diana unida a la columna y reequilibrar la columna. Un ciclo de cromatografía al usar una columna de cromatografía de intercambio catiónico y/o aniónico, donde la proteína recombinante diana se une a la resina de cromatografía en la etapa de carga, puede incluir las etapas de cargar la columna con un fluido que incluye la proteína diana, lavar la columna para extraer material biológico indeseado, eluir la proteína recombinante diana unida a la columna y reequilibrar la columna. En otros ejemplos, un ciclo de cromatografía al usar una columna de cromatografía de intercambio catiónico y/o aniónico, donde material biológico indeseado se une a la resina de cromatografía durante la carga de etapa, mientras la proteína recombinante diana no lo hace, puede incluir las etapas de cargar la columna con un fluido que incluye la proteína diana, recoger la proteína recombinante diana en el flujo de paso y reequilibrar la columna. Como se conoce en la técnica, cualquiera de las etapas únicas en un ciclo de cromatografía puede incluir un único tampón o múltiples tampones (p. ej., dos o más tampones), y una o más de cualquiera de las etapas únicas en un ciclo de cromatografía puede incluir un gradiente de tampón. Cualquiera de la combinación de varios aspectos conocidos de un único ciclo de cromatografía se puede usar en estos métodos en cualquier combinación, p. ej., diferente(s) resina(s) de cromatografía, velocidad(es) de flujo, tampón(es), volumen(es) de vacío de la columna, volumen(es) de lecho de la columna, volumen(es) de tampón usado en cada etapa, volumen(es) del fluido que incluye la proteína diana y el número y tipos de tampón(es) usados en cada etapa.

Métodos para llevar a cabo la cromatografía con una resina esterilizada con gamma

En la presente memoria se describen métodos para llevar a cabo la cromatografía con una resina de cromatografía irradiada con gamma. Estos métodos incluyen proporcionar una columna de cromatografía que incluye una resina de cromatografía irradiada con gamma, llevar a cabo un primer ciclo de cromatografía a través de la columna, en donde el ciclo incluye exponer la resina de cromatografía a un tampón desnaturalizante y llevar a cabo al menos un ciclo adicional de cromatografía a través de la columna. La resina de cromatografía irradiada con gamma puede ser cualquier tipo de resina de cromatografía y/o puede ser cualquieras de las resinas de cromatografía irradiadas con gamma descritas en la presente memoria o conocidas en la técnica. La columna de cromatografía puede ser cualquiera de las columnas de cromatografía que incluyen una resina de cromatografía irradiada con gamma descrita en la presente memoria o conocida en la técnica. La proteína recombinante puede ser una proteína terapéutica recombinante (p. ej., cualquiera de las proteínas terapéuticas recombinantes descritas en la presente memoria o conocidas en la técnica).

En algunos ejemplos, la columna es parte de un sistema de cromatografía de multicolumna (MCCS), p. ej., puede ser parte de un sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS).

El tampón desnaturalizante puede ser cualquiera de los tampones desnaturalizantes ilustrativos descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica. Por ejemplo, el tampón desnaturalizante puede incluir uno o más de urea, clorhidrato de guanidina y Triton™ X-100. En algunos ejemplos, la resina de cromatografía se expone al tampón desnaturalizante durante un período de entre al menos 1 minuto a aproximadamente 2 horas (p. ej., entre 1 minuto y aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 1,0 hora, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 55 minutos, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 50 minutos, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 45 minutos, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 40 minutos, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 40 minutos, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 35 minutos, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 30 minutos, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 25 minutos, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 20 minutos, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 15 minutos, o entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 10 minutos). En algunos ejemplos, exponer la resina de cromatografía a tampón desnaturalizante incluye pasar entre aproximadamente un volumen de lecho de 0,5x a aproximadamente un volumen de lecho de 10x (p. ej., entre aproximadamente un volumen de lecho de 0,5x a aproximadamente un volumen de lecho de 9,0x, entre aproximadamente un volumen de lecho de 0,5x a aproximadamente un volumen de lecho de 8,0x, entre aproximadamente un volumen de lecho de 0,5x a aproximadamente un volumen de lecho de 7,0x, entre aproximadamente un volumen de lecho de 0,5x a aproximadamente un volumen de lecho de 6,0x, entre aproximadamente un volumen de lecho de 0,5x a aproximadamente un volumen de lecho de 5,0x, entre aproximadamente un volumen de lecho de 0,5x a aproximadamente un volumen de lecho de 4,0x, entre aproximadamente un volumen de lecho de 0,5x a aproximadamente un volumen de lecho de 3,5x, entre aproximadamente un volumen de lecho de 0,5x a aproximadamente un volumen de lecho de 3,0x, entre aproximadamente un volumen de lecho de 0,5x a aproximadamente un volumen de lecho de 2,5x, entre aproximadamente un volumen de lecho de 0,5x a aproximadamente iun volumen de lecho de 2,0x o entre aproximadamente un volumen de lecho de 0,5x a aproximadamente un volumen de lecho de 1,5x) de tampón desnaturalizante a través de la columna de cromatografía. En algunos ejemplos, el primer ciclo de cromatografía puede incluir exponer la resina de cromatografía a tampón de lavado que comprende hidróxido de sodio a aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1,5 M después de la exposición al tampón desnaturalizante.

El primer ciclo de cromatografía llevado a cabo a través de la columna puede ser cualquier ciclo de cromatografía descrito en la presente memoria o conocido en la técnica que incluye exponer la resina de cromatografía a un tampón desnaturalizante. El al menos un ciclo de cromatografía adicional llevado a cabo a través de la columna puede ser cualquier ciclo de cromatografía descrito en la presente memoria o conocido en la técnica. Por ejemplo, el primer ciclo de cromatografía y el al menos un ciclo de cromatografía adicional puede incluir las etapas de: capturar la proteína recombinante al exponer la resina de cromatografía con un líquido que incluye una proteína recombinante; lavar la resina de cromatografía al exponer la resina de cromatografía con un tampón de lavado, eluir la proteína recombinante al exponer la resina de cromatografía con un tampón de elución; y regenerar la resina de cromatografía al exponer la resina de cromatografía al tampón desnaturalizante. En algunos ejemplos, el líquido que incluye la proteína recombinante es un medio de cultivo líquido (p. ej., un medio de cultivo líquido recogido desde un cultivo de perfusión o lote).

El primer ciclo de cromatografía y el al menos un ciclo de cromatografía adicional se puede llevar a cabo al usar un sistema cerrado e integrado (p. ej., cualquiera de los sistemas cerrados e integrados ilustrativos descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica). Por ejemplo, el primer ciclo de cromatografía y el al menos un ciclo de cromatografía adicional se puede llevar a cabo al usar un sistema cerrado e integrado, donde el tampón es tampón de grado de contaminación microbiana reducido (p. ej., todos los tampones usados en el primer y al menos un ciclos adicionales). Como se conoce en la técnica, el tampón de grado de contaminación microbiana reducido se puede producir al usar una variedad de métodos diferentes (p. ej., preparados mediante filtración, mediante autoclave o tratamiento térmico).

El al menos un ciclo de cromatografía adicional puede ser dos o más (p. ej., 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 13 o más, 14 o más, 15 o más, 20 o más, 25 o más, 30 o más, 35 o más, 40 o más, 45 o más, 50 o más, 55 o más, 60 o más, 65 o más, 70 o más, 75 o más, 80 o más, 85 o más, 90 o más, 95 o más, o 100 o más) ciclos de cromatografía adicionales. En algunos ejemplos, el al menos un ciclo de cromatografía adicional se lleva a cabo de manera continua en un período de al menos 3 días (p. ej., al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días, al menos 8 días, al menos 9 días, al menos 10 días, al menos 11 días, al menos 12 días, al menos 13 días, al menos 14 días, al menos 15 días, al menos 16 días, al menos 17 días, al menos 18 días, al menos 19 días, al menos 20 días, al menos 21 días, al menos 22 días, al menos 23 días, al menos 24 días, al menos 25 días, al menos 30 días, al menos 35 días, al menos 40 días, al menos 45 días, al menos 50 días, al menos 55 días, al menos 60 días, al menos 65 días, al menos 70 días, al menos 75 días, al menos 80 días, al menos 85 días, al menos 90 días, al menos 95 días o al menos 100 días).

Procesos integrados, cerrados o sustancialmente cerrados y continuos para fabricar una proteína recombinante

En la presente memoria se describen procesos integrados, cerrados o sustancialmente cerrados y continuos para fabricar una proteína recombinante purificada (p. ej., una proteína terapéutica recombinante). Estos procesos incluyen proporcionar un medio de cultivo líquido que incluye una proteína recombinante (p. ej., una proteína terapéutica recombinante) que está sustancialmente libre de células.

Algunos procesos incluyen alimentar de manera continua el medio de cultivo líquido en un sistema de cromatografía de multicolumna (MCCS) que incluye al menos una columna de cromatografía que incluye resina esterilizada con gamma, donde la resina de cromatografía se expone durante cada ciclo a tampón desnaturalizante (p. ej., se expone a cualquiera de los tampones desnaturalizantes descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica durante cualquiera de las duraciones descritas en la presente memoria). Estos procesos utilizan tampón de grado de contaminación microbiana reducido, son integrados y se ejecutan de manera continua desde el medio de cultivo líquido a un eluato del MCCS que es la proteína recombinante purificada (p. ej., una sustancia farmacéutica de proteína terapéutica).

Algunos procesos incluyen alimentar de manera continua el medio de cultivo líquido en un primer MCCS (MCCS1), capturar la proteína recombinante a partir el medio de cultivo líquido al usar el MCCS1, producir un eluato a partir del MCCS1 que incluye la proteína recombinante y alimentar de manera continua el eluato a un segundo MCCS (MCCS2) y alimentar de manera continua la proteína recombinante del eluato en el MCCS2 y posteriormente eluir la proteína recombinante para producir así la proteína recombinante purificada, donde al menos una columna en el MCCS1 y/o MCCS2 es una columna de cromatografía que incluye resina de cromatografía irradiada con gamma y la resina de cromatografía se expone al tampón desnaturalizante durante cada ciclo en el proceso (p. ej., se expone a cualquiera de los tampones desnaturalizantes descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica durante cualquiera de las duraciones descritas en la presente memoria). Estos procesos utilizan tampón de grado de contaminación microbiana reducido, son integrados y se ejecutan de manera continua desde el medio de cultivo líquido a la proteína recombinante purificada.

En algunos ejemplos, cada una de las columnas de cromatografía usadas en el MCCS, MCCS1 y/o MCCS2 incluye una resina de cromatografía irradiada con gamma. Algunas realizaciones incluyen, además, una etapa de formular la proteína recombinante purificada en una composición farmacéutica.

Los procesos descritos en la presente memoria proporcionan la producción continua y eficaz en términos del tiempo de una proteína recombinante purificada a partir de un medio de cultivo líquido que incluye la proteína recombinante. Por ejemplo, el tiempo transcurrido entre alimentar un medio de cultivo líquido que incluye una proteína terapéutica en el MCCS o MCCS 1 y eluir la proteína recombinante desde el MCCS o MCCS2, respectivamente, puede ser, p. ej., entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 48 horas, inclusive, p. ej., entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 40 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 35 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 30 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 28 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 26 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 24 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 22 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 20 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 18 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 16 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 14 horas, entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 12 horas, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 12 horas, entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 12 horas, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 20 horas, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 18 horas, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 14 horas, entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 16 horas, entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 14 horas, entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 12 horas, entre aproximadamente 10 horas y 20 horas, entre aproximadamente 10 horas y 18 horas, entre aproximadamente 10 horas y 16 horas, entre aproximadamente 10 horas y 14 horas, entre aproximadamente 12 horas y aproximadamente 14 horas, entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 40 horas, entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 35 horas, entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 30 horas, entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 25 horas, entre aproximadamente 15 horas y aproximadamente 40 horas, entre aproximadamente 15 horas y aproximadamente 35 horas, entre aproximadamente 15 horas y aproximadamente 30 horas, entre aproximadamente 20 horas y aproximadamente 40 horas, entre aproximadamente 20 horas y aproximadamente 35 horas, o entre aproximadamente 20 horas y aproximadamente 30 horas, inclusive. En otros ejemplos, el tiempo transcurrido entre alimentar el medio de cultivo líquido que incluye la proteína recombinante en el MCCS o MCCS1 y eluir la proteína recombinante desde el MCCS o MCCS2, respectivamente, es, p. ej., mayor que aproximadamente 4 horas y menor que aproximadamente 40 horas, inclusive, p. ej., mayor que aproximadamente 4 horas y menor que aproximadamente 39 horas, aproximadamente 38 horas, aproximadamente 37 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 35 horas, aproximadamente 34 horas, aproximadamente 33 horas, aproximadamente 32 horas, aproximadamente 31 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 29 horas, aproximadamente 28 horas, aproximadamente 27 horas, aproximadamente 26 horas, aproximadamente 25 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 5 horas, o aproximadamente 4,5 horas, inclusive.

Los aspectos no limitantes del MCCS que se pueden usar en cualquiera de estos procesos (MCCS, MCCS1 y/o MCCS2) se describen en las solicitudes de patente provisionales de los Estados Unidos núms. de serie 61/775.060 and 61/856.390.

Algunos procesos ilustrativos no utilizan una etapa de retención (p. ej., no usan un reservorio (p. ej., tanque de separación) en todo el proceso). Otros pueden usar un máximo de 1, 2, 3, 4 o 5 reservorio(s) (p. ej., tanque(s) de separación) en todo el proceso. Cualquiera de los procesos descritos en la presente memoria puede utilizar un máximo de 1,2, 3, 4 o 5 reservorio(s) (p. ej., tanque(s) de separación) en todo el proceso, donde cada tanque de proceso solo retiene una proteína recombinante durante un período de tiempo total de, p. ej., entre aproximadamente 5 minutos y menos de aproximadamente 6 horas, inclusive, p. ej., entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 5 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 1 hora, o aproximadamente 30 minutos, inclusive.

Algunos procesos utilizan uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis reservorio(s) (p. ej., tanque(s) de separación) y pueden tener una capacidad que está, p. ej., entre 1 mL y aproximadamente 300 mL, inclusive, p. ej., entre 1 mL y aproximadamente 280 mL, aproximadamente 260 mL, aproximadamente 240 mL, aproximadamente 220 mL, aproximadamente 200 mL, aproximadamente 180 mL, aproximadamente 160 mL, aproximadamente 140 mL, aproximadamente 120 mL, aproximadamente 100 mL, aproximadamente 80 mL, aproximadamente 60 mL, aproximadamente 40 mL, aproximadamente 20 mL, o aproximadamente 10 mL (inclusive). Cualquier reservorio(s) (p. ej., tanque(s) de separación) usado (en cualquiera de los procesos descritos en la presente memoria) para retener fluido antes de alimentarlo en el MCCS o MCCS1 puede tener una capacidad que está, p. ej., entre 1 mL y aproximadamente 100 %, inclusive, p. ej., entre 1 mL y aproximadamente 90 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 10 % o aproximadamente 5 %, inclusive, del volumen de carga de la primera columna del MCCS o MCCS1. Se puede usar un reservorio(s) (p. ej., tanque(s) de separación) para retener eluato desde el MCCS1 antes de que ingrese en el MCCS2 y puede tener una capacidad que está, p. ej., entre 1 mL y aproximadamente 100 %, inclusive, p. ej., entre 1 mL y aproximadamente 90 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 10 % o aproximadamente 5 %, inclusive, del volumen de carga de la primera columna del MCCS2.

A continuación, se describen varios aspectos adicionales de estos procesos en detalle y se puede usar en cualquier combinación en los procesos descritos en la presente memoria sin limitación. Los aspectos ilustrativos de los procesos descritos se describen a continuación; sin embargo, el experto en la técnica apreciará que se pueden agregar aspectos adicionales a los procesos descritos en la presente memoria y se pueden usar otros materiales para llevar a cabo cualquiera de las etapas de los procesos descritos en la presente memoria.

Medio de cultivo líquido

El medio de cultivo líquido que incluye una proteína recombinante (p. ej., una proteína terapéutica recombinante) que está sustancialmente libre de células puede derivarse de cualquier fuente. Por ejemplo, el medio de cultivo líquido se puede obtener a través de un cultivo celular recombinante (p. ej., un cultivo celular de bacteria, levadura o mamífero recombinante). El medio de cultivo líquido se puede obtener a partir de un cultivo celular de alimentación por lotes (p. ej., célula de mamífero) (p. ej., un biorreactor de alimentación por lotes que incluye un cultivo de células de mamífero que secretan la proteína recombinante) o un cultivo celular de perfusión (p. ej., célula de mamífero) (p. ej., un biorreactor de perfusión que incluye un cultivo de células de mamífero que secretan la proteína recombinante). El medio de cultivo líquido también puede ser un medio de cultivo líquido clarificado a partir de un cultivo de células bacterianas o de levadura que secretan la proteína recombinante.

El medio de cultivo líquido obtenido a partir de un cultivo celular recombinante se puede filtrar o clarificar para obtener un medio de cultivo líquido que está sustancialmente libre de células y/o virus. Los métodos para filtrar o clarificar un medio de cultivo líquido para extraer las células se conocen en la técnica (p. ej., filtración de 0,2 pm y filtración al usar un sistema de flujo tangencial alternante (ATF™)). Las células recombinantes también se pueden extraer del medio de cultivo líquido al usar centrifugación y extraer el sobrenadante que es el medio de cultivo líquido que está sustancialmente libre de células, o al permitir que las células se asienten en el fondo gravitatorio de un contenedor (p. ej., biorreactor) que incluye el medio de cultivo líquido y retirar el medio de cultivo líquido (el medio de cultivo líquido que está sustancialmente libre de células) que está distante de las células recombinantes asentadas.

El medio de cultivo líquido se puede obtener a partir de un cultivo de células recombinantes (p. ej., células de bacteria, levadura o mamífero recombinantes) que producen cualquiera de las proteínas recombinantes (p. ej., proteínas terapéuticas recombinantes) descritas en la presente memoria o conocidas en la técnica. Algunos ejemplos de cualquiera de los procesos descritos en la presente memoria pueden incluir, además, una etapa de cultivar células recombinantes (p. ej., células de bacteria, levadura o mamífero recombinantes) que producen la proteína recombinante (p. ej., proteína terapéutica recombinante).

El medio de cultivo líquido puede ser cualquiera de los tipos de medio de cultivo líquido descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica. Por ejemplo, el medio de cultivo líquido se puede seleccionar del grupo de: medio de cultivo líquido libre de componentes derivados de animales, medio de cultivo líquido libre de suero, medio de cultivo líquido que contiene suero, medio de cultivo líquido químicamente definido y medio de cultivo líquido libre de proteínas. En cualquiera de los procesos descritos en la presente memoria, un medio de cultivo líquido obtenido a partir de un cultivo se puede diluir mediante la adición de un segundo fluido (p. ej., un tampón) antes de alimentarlo en el MCCS o MCCS1.

El medio de cultivo líquido que incluye una proteína recombinante que está sustancialmente libre de células se puede almacenar (p. ej., a una temperatura por debajo de aproximadamente 15 °C (p. ej., por debajo de aproximadamente 10 °C, por debajo de aproximadamente 4 °C, por debajo de aproximadamente 0 °C, por debajo de aproximadamente -20 °C, por debajo de aproximadamente -50 °C, por debajo de aproximadamente -70 °C, o por debajo de aproximadamente -80 °C) durante al menos 1 día (p. ej., al menos aproximadamente 2 días, al menos aproximadamente 5 días, al menos aproximadamente 10 días, al menos aproximadamente 15 días, al menos aproximadamente 20 días, o al menos aproximadamente 30 días) antes de alimentar el medio de cultivo líquido en el MCCS o MCCS1. Alternativamente, en algunos ejemplos, el medio de cultivo líquido se alimenta en el MCCS o MCCS1 directamente desde un biorreactor (p. ej., se alimenta en el MCCS o MCCS1 directamente desde el biorreactor después de una etapa de filtración o clarificación).

Sistemas de cromatografía de multicolumna

Los procesos descritos en la presente memoria incluyen el uso de un MCCS o dos o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco o seis) sistemas de cromatografía de multicolumna (MCCS) (p. ej., un MCCS1 y MCCS2). Un MCCS puede incluir dos o más columnas de cromatografía, dos o más membranas cromatográficas, o una combinación de al menos una columna de cromatografía y al menos una membrana cromatográfica. En ejemplos no limitantes, un MCCS (p. ej., MCCS, MCCS1 y/o MCCS2 en cualquiera de los procesos en la presente memoria) pueden incluir cuatro columnas cromatográficas, tres columnas cromatográficas y una membrana cromatográfica, tres columnas cromatográficas, dos columnas cromatográficas, dos membranas cromatográficas y dos columnas cromatográficas y una membrana cromatográfica. Un experto en la técnica puede contemplar ejemplos adicionales de combinaciones de columnas de cromatografía y/o membranas cromatográficas para usar en un MCCS (p. ej., MCCS, MCCS1 y/o MCCS2 en cualquiera de los procesos descritos en la presente memoria) sin limitación. Las columnas de cromatografía y/o membranas cromatográficas individuales presentes en un MCCS pueden ser idénticas (p. ej., tener la misma forma, volumen, resina, mecanismo de captura y operación de unidad) o pueden ser diferentes (p. ej., tener uno o más de una forma, volumen, resina, mecanismo de captura y operación de unidad diferente). La(s) columna(s) de cromatografía y/o membrana(s) cromatográfica(s) individuales presentes en un MCCS (p. ej., MCCS, MCCS1 y/o MCCS2 en cualquiera de los procesos descritos en la presente memoria) pueden llevar a cabo la misma operación de unidad (p. ej., la operación de unidad de capturar, purificar o refinar) u operaciones de unidad diferentes (p. ej., operaciones de unidad diferentes seleccionadas de, p. ej., el grupo de capturar, purificar, refinar, inactivar virus, ajustar la concentración iónica y/o el pH de un fluido que incluye la proteína recombinante y filtrar). Por ejemplo, en ejemplos de los procesos descritos en la presente memoria, al menos una columna de cromatografía y/o membrana cromatográfica en el MCCS o MCCS1 lleva a cabo la operación de unidad de capturar la proteína recombinante.

La una o más columna(s) de cromatografía que pueden estar presentes en un MCCS (p. ej., presentes en el MCCS, MCCS1 y/o MCCS2) pueden tener un volumen de resina de, p. ej., entre aproximadamente 1 mL y aproximadamente 2 mL, aproximadamente 5 mL, aproximadamente 10 mL, aproximadamente 15 mL, aproximadamente 20 mL, aproximadamente 25 mL, aproximadamente 30 mL, aproximadamente 35 mL, aproximadamente 40 mL, aproximadamente 45 mL, aproximadamente 50 mL, aproximadamente 55 mL, aproximadamente 60 mL, aproximadamente 65 mL, aproximadamente 70 mL, aproximadamente 75 mL, aproximadamente 80 mL, aproximadamente 85 mL, aproximadamente 90 mL, aproximadamente 95 mL, o aproximadamente 100 mL, inclusive. La una o más columna(s) de cromatografía que pueden estar presentes en un MCCS (p. ej., presentes en el MCCS, MCCS1 y/o MCCS2) pueden tener un volumen de resina de entre aproximadamente 2 mL a aproximadamente 100 mL, entre aproximadamente 2 mL y aproximadamente 90 mL, entre aproximadamente 2 mL y aproximadamente 80 mL, entre aproximadamente 2 mL y aproximadamente 70 mL, entre aproximadamente 2 mL y aproximadamente 60 mL, entre aproximadamente 2 mL y aproximadamente 50 mL, entre aproximadamente 5 mL y aproximadamente 50 mL, entre aproximadamente 2 mL y aproximadamente entre aproximadamente 5 mL y aproximadamente 45 mL, entre aproximadamente 2 mL y aproximadamente entre aproximadamente 5 mL y aproximadamente 40 mL, entre aproximadamente 2 mL y aproximadamente entre aproximadamente 5 mL y aproximadamente 35 mL, entre aproximadamente 2 mL y aproximadamente entre aproximadamente 5 mL y aproximadamente 30 mL, entre aproximadamente 2 mL y aproximadamente

entre aproximadamente 5 mL y aproximadamente 25 mL, entre aproximadamente 15 mL y aproximadamente 60 mL, entre aproximadamente 10 mL y aproximadamente 60 mL, entre aproximadamente 10 mL y aproximadamente 50 mL y entre aproximadamente 15 mL y aproximadamente

50 mL. La una o más columna(s) de cromatografía en un MCCS (p. ej., el MCCS, MCCS1 y/o MCCS2) usadas en cualquiera de los procesos descritos en la presente memoria pueden tener sustancialmente el mismo volumen de resina o pueden tener volúmenes de resina diferentes. La velocidad de flujo usada para la una o más columna(s) de cromatografía en un MCCS (p. ej., el MCCS, MCCS1 y/o MCCS2) pude ser, p. ej., entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 25 mL/minuto (p. ej., entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 10 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL minuto y aproximadamente 14 mL/minuto, entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 25,0 mL/minuto, entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 15,0 mL/minuto).

La una o más columna(s) de cromatografía en un MCCS (p. ej., el MCCS, MCCS1 y/o MCCS2) pueden tener sustancialmente la misma forma o pueden tener formas sustancialmente diferentes. Por ejemplo, la una o más columna(s) de cromatografía en un MCCS (p. ej., en el MCCS, MCCS1 y/o MCCS2) pueden tener sustancialmente la forma de un cilindro circular o pueden tener la misma forma de un cilindro ovalado.

La una o más membrana(s) cromatográfica(s) que puede(n) estar presente(s) en un MCCS (p. ej., presentes en el MCCS, MCCS1 y/o MCCS2) pueden tener un volumen de lecho de, p. ej., entre aproximadamente 1 mL a

oximadam oximadam oximadam oximadam oximadam oximadam oximadam oximadam

te 5 te 2 te 1 te 5 te 2 te 2

te 2

mL y aproximadamente 10 mL).

Uno o más (p. ej., tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés o veinticuatro) tipos diferentes de tampón de grado de contaminación microbiana reducido se pueden emplear durante el uso del MCCS, MCCS1 y/o MCCS2 en cualquiera de los procesos descritos en la presente memoria. Como se conoce en la técnica, el uno o más tipos de tampón de grado de contaminación microbiana reducido usados en el MCCS, MCCS1 y/o MCCS2 en los procesos descritos en la presente memoria dependerán de la resina presente en la(s) columna(s) de cromatografía y/o la(s) membrana(s) cromatográficas(s) del MCCS, MCCS1 y/o MCCS2, las propiedades biofísicas de la proteína recombinante y la operación de unidad (p. ej., cualquiera de las operaciones de unidad ilustrativas descritas en la presente memoria) llevada a cabo por la(s) columna(s) de cromatografía y/o membranas de cromatografía específicas del MCCS, MCCS1 y/o MCCS2. Un experto en la técnica también puede determinar el volumen y tipo de tampón empleado durante el uso del MCCS, MCCS1 y/o MCCS2 en cualquiera de los procesos descritos en la presente memoria (p. ej., se describe en mayor detalle más adelante). Por ejemplo, el volumen y tipo(s) de tampón empleados durante el uso del MCCS, MCCS1 y/o MCCS2 en cualquiera de los procesos descritos en la presente memoria se pueden elegir para optimizar uno o más de los siguientes en la proteína recombinante purificada (p. ej., medicamento de proteína recombinante): el rendimiento general de la proteína recombinante, la actividad de la proteína recombinante, el nivel de pureza de la proteína recombinante y la extracción de contaminantes biológicos de un fluido

(p. ej., medio de cultivo líquido) que incluye la proteína recombinante (p. ej., ausencia de virus, células de micobacteria, levadura, bacteria o mamífero activos).

El MCCS, MCCS1 y/o MCCS2 puede ser un sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS). Un PCCS puede, p. ej., incluir dos o más columnas de cromatografía (p. ej., tres columnas o cuatro columnas) que se conmutan

para permitir la elución continua de proteína recombinante desde las dos o más columnas de cromatografía. Un PCCS puede incluir dos o más columnas de cromatografía, dos o más membranas cromatográficas, o al menos una columna cromatográfica y al menos una membrana cromatográfica. Una operación de columna (ciclo) generalmente consiste en las etapas de carga, lavado, elución y regeneración. En los PCCS, se usan múltiples columnas para ejecutar las mismas etapas por separado y de manera continua de forma cíclica. Dado que las columnas se operan en serie, el flujo de puso y el lavado de una columna se captura en otra columna. Esta característica única de los PCCS permite cargar la resina próxima a su capacidad de unión estática, en lugar de la capacidad de unión dinámica, como es típico durante la cromatografía en modo por lotes. Como resultado de la circulación y elución continuas, el fluido que ingresa en un PCCS se procesa de manera continua y el eluato que incluye proteína recombinante se produce de manera continua.

La estrategia de conmutación de columna se emplea para avanzar de una etapa a otro en un ciclo de PCCS. Los ejemplos de conmutación de columna que se pueden usar en un PCCS se describen en las solicitudes de patente provisionales de los Estados Unidos núms. de serie 61/775.060 and 61/856.390. Por ejemplo, un método de conmutación de columna puede emplear dos operaciones de conmutación automatizadas por columna: la primera está relacionada con la penetración del producto inicial, mientras que la segunda coincide con la saturación de la columna. La determinación de cuándo deberían llevarse a cabo las operaciones de conmutación de columna se puede determinar al monitorear la concentración de proteína recombinante (p. ej., el monitorea se lleva a cabo mediante monitoreo de UV) en el eluato de cada columna de cromatografía presente en un PCCS. Por ejemplo, la conmutación de la columna se puede determinar mediante cualquier herramienta PAT capaz de hacer una medición integral de la concentración de producto con control de retroalimentación. La herramienta PAT es capaz de hacer una medición en tiempo real integral de la concentración de producto con control de retroalimentación. Como se conoce en la técnica, las conmutaciones de columna también se pueden diseñar en función del tiempo o la cantidad de fluido (p. ej., tampón) que pasa a través de la una o más columna(s) de cromatografía y/o membranas cromatográficas en los MCCS, MCCS1 y/o MCCS2.

En los PCCS, el tiempo de residencia (TR) de la proteína recombinante en cada una de la columna de cromatografía y/o membrana cromatográfica presentes en el PCCS se puede disminuir sin aumentar el tamaño de la columna/membrana porque la penetración de la primera columna/membrana se puede capturar en otra columna/membrana en el PCCS. Se puede diseñar un sistema de proceso continuo para procesar medio de cultivo líquido a cualquier velocidad de perfusión (D) al variar el volumen de la columna/membrana (V) y el TR al usar la ecuación de: V = D * TR.

La una o más operaciones de unidad que se pueden llevar a cabo mediante el MCCS o el MCC1 y/o MCCS2 usados en los procesos descritos en la presente memoria incluyen, por ejemplo, capturar la proteína recombinante, inactivar virus presentes en un fluido que incluye la proteína recombinante, purificar la proteína recombinante, refinar la proteína recombinante, retener un fluido que incluye la proteína recombinante (p. ej., al usar cualquiera del(de los) tanque(s) de separación ilustrativo(s) descrito(s) en la presente memoria), filtrar o extraer material particulado y/o células de un fluido que incluye la proteína recombinante y ajustar la concentración iónica y/o el pH de un fluido que incluye la proteína recombinante.

En algunas realizaciones, el MCCS o el MCCS1 incluye al menos una columna cromatográfica y/o membrana cromatográfica que lleva a cabo la operación de unidad de capturar la proteína recombinante. La operación de unidad de capturar se puede llevar a cabo al usar al menos una columna de cromatografía y/o resina de cromatografía, p. ej., que utiliza un mecanismo de captura. Los ejemplos no limitantes de mecanismos de captura incluyen un mecanismo de captura de unión a proteína A, un mecanismo de captura de unión a anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un mecanismo de captura de unión a sustrato, un mecanismo de captura de unión a aptámero, un mecanismo de captura de unión a identificador (p. ej., un mecanismo de captura basado en el identificador poli-His) y un mecanismo de captura de unión a cofactor. La captura también se puede llevar a cabo al usar una resina que se puede usar para llevar a cabo la cromatografía de intercambio catiónico o intercambio aniónico, cromatografía de tamiz molecular o cromatografía de interacción hidrófoba. Se describen resinas no limitantes que se pueden usar para capturar una proteína recombinante en la presente memoria. Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de resinas que se pueden usar para capturar una proteína recombinante.

La operación de unidad para inactivar virus presentes en un fluido que incluye la proteína recombinante se puede llevar a cabo al usar un MCCS, MCCS1 y/o MCCS2 (p. ej., que incluye(n), p. ej., una columna de cromatografía, una membrana de cromatografía o un tanque de retención que es capaz de incubar un fluido que incluye la proteína recombinante a un pH de entre aproximadamente 3,0 a 5,0 (p. ej., entre aproximadamente 3,5 a aproximadamente 4,5, entre aproximadamente 3,5 a aproximadamente 4,25, entre aproximadamente 3,5 a aproximadamente 4,0, entre aproximadamente 3,5 a aproximadamente 3,8, o aproximadamente 3,75) durante un período de al menos 30 minutos (p. ej., un período de entre aproximadamente 30 minutos a 1,5 horas, un período de entre aproximadamente 30 minutos a 1,25 horas, un período de entre aproximadamente 0,75 horas a 1,25 horas, o un período de aproximadamente 1 hora).

La operación de unidad de purificar una proteína recombinante se puede llevar a cabo al usar uno o más MCCS (p. ej., un MCCS, MCCS1 y/o MCCS2) que incluye(n), p. ej., una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que incluye una resina, p. ej., que utiliza un sistema de captura. Los ejemplos no limitantes de mecanismos de captura incluyen un mecanismo de captura de unión a proteína A, un mecanismo de captura de unión a anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un mecanismo de captura de unión a sustrato, un mecanismo de captura de unión a aptámero, un mecanismo de captura de unión a identificador (p. ej., un mecanismo de captura basado en el identificador poli-His) y un mecanismo de captura de unión a cofactor. La purificación también se puede llevar a cabo al usar una resina que se puede usar para llevar a cabo la cromatografía de intercambio catiónico o intercambio aniónico, cromatografía de tamiz molecular o cromatografía de interacción hidrófoba. Se describen resinas no limitantes que se pueden usar para purificar una proteína recombinante en la presente memoria. Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de resinas que se pueden usar para purificar una proteína recombinante.

La operación de unidad de refinar una proteína recombinante se puede llevar a cabo al usar uno o más MCCS (p. ej., un MCCS, MCCS1 y/o MCCS) que incluye(n), p. ej., una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que incluye una resina, p. ej., que se puede usar para llevar a cabo la cromatografía de intercambio catiónico, intercambio aniónico, de tamiz molecular o cromatografía de interacción hidrófoba. Se describen resinas no limitantes que se pueden usar para refinar una proteína recombinante en la presente memoria. Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de resinas que se pueden usar para refinar una proteína recombinante.

La operación de unidad de retener un fluido que incluye la proteína recombinante se puede llevar a cabo al usar un MCCS (p. ej., un MCCS, MCCS1 y/o MCCS2) que incluye al menos un reservorio (p. ej., un tanque de separación) o un máximo de 1, 2, 3, 4 o 5 reservorio(s) (p. ej., tanque(s) de separación) en el MCCS o el MCCS1 y MCCS2 combinados. Por ejemplo, el(los) reservorio(s) (p. ej., tanque(s) de separación) que se puede(n) usar para lograr esta operación de unidad puede(n) tener cada uno un volumen de entre aproximadamente 1 mL a aproximadamente 1 L (p. ej., entre aproximadamente 1 mL a aproximadamente 800 mL, entre aproximadamente 1 mL a aproximadamente 600 mL, entre aproximadamente 1 mL a aproximadamente 500 mL, entre aproximadamente 1 mL a aproximadamente 400 mL, entre aproximadamente 1 mL a aproximadamente 350 mL, entre aproximadamente 1 mL a aproximadamente 300 mL, entre aproximadamente 10 mL y aproximadamente 250 mL, entre aproximadamente 10 mL y aproximadamente 200 mL, entre aproximadamente 10 mL y aproximadamente 150 mL, o entre aproximadamente 10 mL a aproximadamente 100 mL). El(los) reservorio(s) (p. ej., tanque(s) de separación) usados en los procesos descritos en la presente memoria pueden tener una capacidad que está, p. ej., entre 1 mL y aproximadamente 300 mL, inclusive, p. ej., entre 1 mL y aproximadamente 280 mL, aproximadamente 260 mL, aproximadamente 240 mL, aproximadamente 220 mL, aproximadamente 200 mL, aproximadamente 180 mL, aproximadamente 160 mL, aproximadamente 140 mL, aproximadamente 120 mL, aproximadamente 100 mL, aproximadamente 80 mL, aproximadamente 60 mL, aproximadamente 40 mL, aproximadamente 20 mL, o aproximadamente 10 mL, inclusive. Cualquiera del(de los) reservorio(s) (p. ej., tanque(s) de separación) usado(s) (en cualquiera de los procesos descritos en la presente memoria) para retener fluido antes de que ingrese en el MCCS o MCCS1 puede tener una capacidad que está, p. ej., entre 1 mL y aproximadamente 100 %, inclusive, p. ej., entre aproximadamente 1 mL y aproximadamente 90 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 10 % o aproximadamente 5 %, inclusive, del volumen de carga de la primera columna del MCCS o MCCS1. Cualquiera del(de los) reservorio(s) (p. ej., tanque(s) de separación) usado(s) para retener un eluato del MCCS1 (que incluye la proteína recombinante) antes de que ingrese en el MCCS2 puede tener una capacidad que está, p. ej., entre 1 mL y aproximadamente 100 %, inclusive, p. ej., entre aproximadamente 1 mL y aproximadamente 90 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 10 % o aproximadamente 5 %, inclusive, del volumen de carga de la primera columna del MCCS2.

El(los) reservorio(s) (p. ej., tanque(s) de separación) puede(n) retener cada uno el fluido que incluye la proteína recombinante durante al menos 10 minutos (p. ej., al menos 20 minutos, al menos 30 minutos, al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 4 horas, o al menos 6 horas). En otros ejemplos, el(los) reservorio(s) (p. ej., tanque(s) de separación) solo retiene(n) una proteína recombinante durante un período de tiempo total de, p. ej., entre aproximadamente 5 minutos y menos de aproximadamente 6 horas, inclusive, p. ej., entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 5 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 1 hora, o aproximadamente 30 minutos, inclusive. El(los) reservorio(s) (p. ej., tanque(s) de separación) se puede(n) usar para retener y refrigerar (p. ej., a una temperatura menor que 25 °C, menor que 15 °C o menor que 10 °C) el fluido que incluye la proteína recombinante. El reservorio puede tener cualquier forma, que incluye una bolsa sellada y no permeable en forma de cilindro circular, cilindro ovalado o aproximadamente rectangular.

Las operaciones de unidad de filtrar un fluido que incluye la proteína recombinante se pueden llevar a cabo al usar un MCCS (p. ej., el MCCS, MCCS1 y/o MCCS2) que incluye, p. ej., un filtro o una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que incluye una resina de tamiz molecular. Como se conoce en la técnica, una amplia variedad de filtros submicra (p. ej., un filtro con un tamaño de poro menor que 1 gm, menor que 0,5 gm, menor que 0,3 gm, aproximadamente 0,2 gm, menor que 0,2 gm, menor que 100 nm, menor que 80 nm, menor que 60 nm, menor que 40 nm, menor que 20 nm, o menor que 10 nm) están disponibles en la técnica que son capaces de extraer cualquier material precipitado y/o células (p. ej., proteína no plegada, precipitada; proteínas de célula hospedante no deseadas, precipitadas; lípidos precipitados; bacterias; células de levadura; células fúngicas; micobacterias; y/o células de mamífero). Se sabe que los filtros que tienen un tamaño de poro de aproximadamente 0,2 gm o menor que 0,2 gm son eficaces para extraer bacterias del fluido que incluye la proteína recombinante. Como se conoce en la técnica, una columna de cromatografía o una membrana cromatográfica que incluye una resina de tamiz molecular también se puede usar en un MCCS (p. ej., el MCCS, MCCS1 y/o MCCS2) para llevar a cabo la operación de unidad de filtrar un fluido que incluye una proteína recombinante.

Las operaciones de unidad de ajustar la concentración iónico y/o el pH de un fluido que incluye la proteína recombinante se pueden llevar a cabo al usar un MCCS (p. ej., un MCCS, un MCCS1 y/o un MCCS2) que incluye y utiliza un reservorio de ajuste de tampón (p. ej., un reservorio de ajuste de tampón integral) que agrega una nueva disolución de tampón en un fluido que incluye la proteína recombinante (p. ej., entre columnas dentro del MCCS, MCCS1 y/o MCCS2, o después de la última columna en un penúltimo MCCS (p. ej., el MCCS1) y antes de que el fluido que incluye la proteína recombinante se alimente en la primera columna del próximo MCCS (p. ej., el MCCS2)). Como se puede apreciar en la técnica, el reservorio de ajuste de tampón integral puede tener cualquier tamaño (p. ej., mayor que 100 mL) y puede incluir cualquier disolución tamponada (p. ej., una disolución tamponada que tiene uno o más de: un pH mayor o menor en comparación con el fluido que incluye la proteína recombinante, una concentración iónica (p. ej., sal) mayor o menor en comparación con el fluido que incluye la proteína recombinante y/o una concentración mayor o menor de un agente que compite con la proteína recombinante por la unión a resina presente en al menos una columna cromatográfica o al menos una membrana cromatográfica en un MCCS (p. ej., el MCCS, MCCS1 y/o MCCS2)).

El MCCS, MCCS1 y/o MCCS2 puede llevar a cabo dos o más operaciones de unidad. Por ejemplo, el MCCS, MCCS1 y/o MCCS2 puede llevar a cabo cada uno al menos las siguientes operaciones de unidad: capturar la proteína recombinante e inactivar virus presentes en el fluido que incluye la proteína recombinante; capturar la proteína recombinante, inactivar virus presentes en el fluido que incluye la proteína recombinante y ajustar la concentración iónica y/o el pH de un líquido que incluye la proteína recombinante; purificar la proteína recombinante y refinar la proteína recombinante; purificar la proteína recombinante, refinar la proteína recombinante y filtrar una fluido que incluye la proteína recombinante o extraer precipitados y/o material particulado de un fluido que incluye la proteína recombinante; y purificar la proteína recombinante, refinar la proteína recombinante, filtrar un fluido que incluye la proteína recombinante o extraer precipitados y/o material particulado de un fluido que incluye la proteína recombinante y ajustar la concentración iónica y/o el pH de un fluido que incluye la proteína recombinante.

Capturar la proteína recombinante

Los presentes procesos incluyen una etapa de capturar la proteína recombinante al usar un MCCS o MCCS1. Como se puede apreciar en la técnica, el medio de cultivo líquido que incluye la proteína recombinante puede alimentarse de manera continua en el MCCS o MCCS1 al usar una variedad de medios diferentes. Por ejemplo, el medio de cultivo líquido se puede bombear de manera activa en el MCCS o MCCS1, o el medio de cultivo líquido se puede alimentar en el MCCS o MCCS1 al usar fuerza gravitatoria. El medio de cultivo líquido se puede almacenar en un reservorio (p. ej., un tanque de retención) antes de alimentarlo en el MCCS o MCCS1 o el medio de cultivo líquido se puede bombear de manera activa desde un biorreactor que incluye un cultivo de células (p. ej., células de mamífero que secretan la proteína recombinante en el medio de cultivo) en el MCCS o MCCS1.

El medio de cultivo líquido se puede alimentar (cargar) en el MCCS o MCCS1 a una velocidad de flujo de entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 25 mL/minuto (p. ej., entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 10 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL minuto y aproximadamente 14 mL/minuto, entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 25,0 mL/minuto, entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 15,0 mL/minuto). El medio de cultivo líquido que incluye la proteína recombinante se puede derivar de cualquiera de las fuentes ilustrativas descritas en la presente memoria o conocidas en la técnica.

Algunos ejemplos adicionales incluyen la etapa opcional de filtrar el medio de cultivo líquido antes de alimentarlo en el MCCS o MCCS1. Cualquiera de los medios ilustrativos para filtrar un medio de cultivo líquido o un fluido que incluye la proteína recombinante descrita en la presente memoria, o cualquier medio de filtración conocido en la técnica, se puede usar para filtrar el medio de cultivo líquido que incluye la proteína recombinante antes de alimentarlo en el MCCS o MCCS1.

En los procesos descritos en la presente memoria, la captura de la proteína recombinante a partir del medio de cultivo líquido se lleva a cabo al usar el MCCS o MCCS 1. Como se puede apreciar en la técnica, para lograr la captura de la proteína recombinante, al menos una columna cromatográfica o al menos una membrana cromatográfica en el MCCS o MCCS1 debe incluir una resina que utiliza un mecanismo de captura (p. ej., cualquiera de los mecanismos de captura ilustrativos descritos en la presente memoria), o incluye una resina capaz de llevar a cabo cromatografía de intercambio catiónico, de intercambio aniónico, de tamiz molecular o interacción hidrófoba. Por ejemplo, si la proteína recombinante es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, el sistema de captura puede ser un mecanismo de captura de unión a proteína A o un mecanismo de captura de unión a antígeno (donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante reconoce específicamente el antígeno de captura). Si la proteína recombinante es una enzima, el mecanismo de captura puede usar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a la enzima para capturar la enzima recombinante, un sustrato de la enzima para capturar la enzima recombinante, un cofactor de la enzima para capturar la enzima recombinante, o, si la enzima recombinante incluye un identificador, una proteína, quelato metálico o anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) que se une específicamente al identificador presente en la enzima recombinante. En la presente memoria se describe resinas no limitantes que se pueden usar para capturar una proteína recombinante y en la técnica se conocen resinas adicionales que se pueden usar para capturar una proteína recombinante. Un ejemplo no limitante de resina que utiliza un mecanismo de captura de unión a proteína A es la resina MabSelect SuRe (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

Los tamaños y formas no limitantes ilustrativos de la(s) columna(s) de cromatografía o membrana(s) cromatográficas(s) presentes en el MCCS o MCCS1 que se pueden usar para capturar la proteína recombinante se describen en la presente memoria. El medio de cultivo líquido alimentado (cargado) en el MCCS o MCCS1 puede incluir, p. ej., entre aproximadamente 0,05 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL proteína recombinante (p. ej., entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 90 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 80 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 70 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 60 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, entre 0,5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 15 mg/mL, entre aproximadamente 0,5 mg/mL a aproximadamente 15 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, o entre aproximadamente 0,5 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL de proteína recombinante). El tiempo medio requerido para que la proteína recombinante se una a la resina usada para llevar a cabo la operación de unidad de captura puede ser de, p. ej., entre aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 10 minutos (p. ej., entre aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 8 minutos, entre aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 7 minutos, entre aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 6 minutos, entre aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 5 minutos, entre aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 5 minutos, entre aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 5 minutos, entre aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 4 minutos, entre aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 4 minutos, o entre aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 4 minutos).

Como se puede apreciar en la técnica, para capturar la proteína recombinante al usar la(s) columna(s) de cromatografía o membrana(s) cromatográfica(s) presentes en el MCCS o MCCS1, se deben llevar a cabo las etapas cromatográficas secuenciales de carga, lavado, elución y regeneración de la(s) columna(s) de cromatografía o membrana(s) de cromatografía presentes en el MCCS o MCCS1. Cualquiera de las velocidades de flujo, volúmenes de tampón y/o extensiones de tiempo ilustrativos asignados para cada etapa cromatográfica secuencial descrita en la presente memoria se puede usar en la una o más de estas etapas cromatográficas secuenciales diferentes (p. ej., una o más de las etapas cromatográficas secuenciales de carga, lavado, elución y regeneración de la(s) columna(s) de cromatografía o membrana(s) de cromatografía presentes en el MCCS o MCCS1 que se usan para capturar la proteína recombinante). Las velocidades de flujo, volúmenes de tampón y/o extensiones de tiempo no limitantes asignados para cada etapa cromatográfica secuencial que se puede usar para capturar columna(s) de cromatografía o membrana(s) de cromatografía presentes en el MCCS o MCCS1 (p. ej., un PCCS o PCCS1) se proporcionan a continuación. Además, se describen a continuación tampones ilustrativos que se pueden usar en el MCCS y/o MCCS1.

El MCCS o MCCS1 que incluye al menos una columna cromatográfica y/o membrana cromatográfica que incluye una resina que puede llevar a cabo la operación de unidad de captura (p. ej., cualquiera de las resinas ilustrativas que se pueden usar para capturar descritas en la presente memoria) se puede cargar con el medio de cultivo líquido que incluye una proteína recombinante al usar cualquieras de las velocidades de flujo de carga (velocidades de alimentación) descritas anteriormente. En algunos ejemplos, una columna cromatográfica única o membrana cromatográfica única que incluye una resina que es capaz de llevar a cabo la operación de unidad de captura se carga en, p. ej., entre aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 90 minutos (p. ej., entre aproximadamente 15 minutos y aproximadamente 90 minutos, entre aproximadamente 20 minutos y 80 minutos, entre aproximadamente 30 minutos y 80 minutos, entre aproximadamente 40 minutos y aproximadamente 80 minutos, entre aproximadamente 50 minutos y aproximadamente 80 minutos, y entre aproximadamente 60 minutos y 80 minutos). En algunos ejemplos, en donde el MCCS o MCCS1 incluye al menos dos columnas cromatográficas que incluyen una resina que es capaz de llevar a cabo la operación de unidad de captura en serie, el tiempo necesario para cargar dos de las columnas cromatográficas en serie es, p. ej., entre aproximadamente 50 minutos a aproximadamente 180 minutos (p. ej., entre aproximadamente 60 minutos y aproximadamente 180 minutos, entre aproximadamente 70 minutos y aproximadamente 180 minutos, entre aproximadamente 80 minutos y aproximadamente 180 minutos, entre aproximadamente 90 minutos y aproximadamente 180 minutos, entre aproximadamente 100 minutos y aproximadamente 180 minutos, entre aproximadamente 110 minutos y 150 minutos, y entre aproximadamente 125 minutos y aproximadamente 145 minutos).

Después de cargar la proteína recombinante en la al menos una columna de cromatografía y/o membrana cromatográfica en el MCCS o MCCS1 que incluye una resina que es capaz de llevar a cabo la operación de unidad de captura, la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica se lava con al menos un tampón de lavado. Como se puede apreciar en la técnica, con el al menos un (p. ej., dos, tres o cuatro) tampón de lavado se pretende eluir todas las proteínas que no son la proteína recombinante de la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica, mientras no se altera la interacción de la proteína recombinante con la resina.

El tampón de lavado se puede pasar a través de la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica a una velocidad de flujo de entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 25 mL/minuto

(p. ej., entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 10 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL minuto y aproximadamente 14 mL/minuto, entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 25,0 mL/minuto, entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 15,0 mL/minuto). El volumen del tampón de lavado usado (p. ej., volumen total combinado de tampón de lavado usado cuando se usa más de un tampón de lavado) puede ser, p. ej., entre aproximadamente 1X volumen de columna (VC) a aproximadamente 15X CV (p. ej., entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 14X CV, aproximadamente 1X CV a aproximadamente 13X CV, aproximadamente 1 aproximadamente 12X CV, aproximadamente

aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2 aproximadamente 11X CV, aproximadamente 3X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 4 aproximadamente 11X CV, aproximadamente 5X CV a aproximadamente 11X CV, o aproximadamente 5X CV a aproximadamente 10X CV). El tiempo total de lavado puede ser, p. ej., entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 3 horas (p. ej., entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 2,5 horas, entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 2,0 horas, entre aproximadamente 5 minutos a aproximadamente

1.5 horas, entre aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 1,25 horas, entre aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 1,25 horas, o entre aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1 hora).

Después de lavar la al menos una columna cromatográfica y/o membrana cromatográfica en el MCCS o MCCS1 que incluye una resina que es capaz de llevar a cabo la operación de unidad de captura, la proteína recombinante se eluye de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica al pasar un tampón de elución a través de la al menos una columna cromatográfico o membrana cromatográfica en el MCCS o MCCS1 que incluye una resina que es capaz de llevar a cabo la operación de unidad de captura. El tampón de elución se puede pasar a través de la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que incluye una resina que es capaz de llevar a cabo la operación de unidad de captura a una velocidad de flujo de entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 25 mL/minuto (p. ej., entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 10 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto y aproximadamente 6,0 mL/minuto, entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 5,0 mg/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL minuto y aproximadamente 14 mL/minuto, entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 25,0 mL/minuto, entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 15,0 mL/minuto). El volumen del tampón de elución usado para eluir la proteína recombinante de cada una de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que incluye una resina que es capaz de llevar a cabo la operación de unidad de purificar puede ser, p. ej., entre aproximadamente cada 1X volumen de columna (VC) a aproximadamente

15X CV (p. ej., entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 14X CV, aproximadamente 1X CV a aproximadamente 13X CV, aproximadamente 1X CV a aproximadamente 12X CV, aproximadamente 1X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 3X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 4X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 5X CV a aproximadamente 11X CV, o aproximadamente 5X CV a aproximadamente 10X CV). El tiempo total de elución puede

ser, p. ej., entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 3 horas (p. ej., entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 2,5 horas, entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 2,0 horas, entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente

1.5 horas, entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 1,25 horas, entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 1,25 horas, entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 1 hora, entre aproximadamente

2 minutos y aproximadamente 40 minutos, entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 40 minutos, entre aproximadamente 20 minutos y aproximadamente 40 minutos). Los ejemplos no limitantes de tampones de elución que se pueden usar en estos métodos dependerán del mecanismo de captura y/o la proteína recombinante. Por ejemplo, un tampón de elución puede incluir una concentración de sal diferente (p. ej., una concentración de sal mayor), un pH diferente (p. ej., una concentración de sal mayor o menor), o una molécula que competirá con la proteína recombinante por la unión a la resina que es capaz de llevar a cabo la operación de unidad de captura. Los ejemplos de dichos tampones de elución para cada mecanismo de captura ilustrativo descrito en la presente memoria se conocen en la técnica.

Después de la elución de la proteína recombinante desde la al menos una columna cromatográfica y/o membrana cromatográfica en el MCCS o MCCS1 que incluye una resina que es capaz de llevar a cabo la operación de unidad de captura, y antes de que se pueda cargar el siguiente volumen de medio de cultivo líquido en la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica, la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica se debe equilibrar al usar un tampón de regeneración. El tampón de regeneración se puede pasar a través de la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que incluye una resina que es capaz de llevar a cabo la operación de unidad de captura a una velocidad de flujo de, p. ej., entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 25 mL/minuto (p. ej., entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 10 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto y aproximadamente 6,0 mL/minuto, entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 5,0 mg/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL minuto y aproximadamente 14 mL/minuto, entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 25,0 mL/minuto, entre aproximadamente 5,0 mL/minuto a aproximadamente 15,0 mL/minuto, o entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 15,0 mL/minuto). En algunos ejemplos, el tampón de regeneración es un tampón desnaturalizante (p. ej., cualquiera de los tampones desnaturalizantes o combinaciones de tampones desnaturalizantes descritos en la presente memoria). El volumen del tampón de regeneración usado para equilibrar la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que incluye una resina que es capaz de llevar a cabo la operación de unidad de captura puede ser, p. ej., entre aproximadamente 1X volumen de columna (VC) a aproximadamente 15X CV (p. ej., entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 14X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 13X CV, aproximadamente 1X CV a aproximadamente 12X CV, aproximadamente 1X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 3X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2X CV a aproximadamente 5X CV, aproximadamente 4X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 5X CV a aproximadamente 11X CV, o aproximadamente 5X CV a aproximadamente 10X CV).

En algunos de los procesos descritos en la presente memoria, el MCCS o MCCS1 incluye un reservorio que retiene un fluido que incluye la proteína recombinante a pH bajo (p. ej., un pH por debajo de 4,6, por debajo de 4,4, por debajo de 4,2, por debajo de 4,0, por debajo de 3,8, por debajo de 3,6, por debajo de 3,4, por debajo de 3,2, o por debajo de 3,0) durante, p. ej., aproximadamente 1 minuto a 1,5 horas (p. ej., aproximadamente 1 hora), e inactiva los virus presentes en un fluido que incluye la proteína recombinante. Un ejemplo de un reservorio que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de inactivar virus es un matraz de agitación (p. ej., un matraz de agitación de 500 mL, p. ej., un matraz de agitación de 500 mL con una placa de agitación programada) que es capaz de retener un fluido que incluye una proteína recombinante durante, p. ej., aproximadamente 1 minuto a 1,5 horas, p. ej., antes de que el fluido que incluye la proteína recombinante se alimente en el MCCS2. El reservorio que se usa para llevar a cabo la operación de unidad de inactivación de virus puede ser un matraz de agitación de 500 mL con una placa de agitación programada (p. ej., una placa de agitación programada para mezclar (p. ej., mezclar periódicamente) el fluido dentro del reservorio, p. ej., cada 4 horas). Otro ejemplo de un reservorio que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de inactivación de virus es una bolsa de plástico (p. ej., una bolsa de plástico de 500 mL) que es capaz de retener un fluido que incluye una proteína recombinante durante, p. ej., aproximadamente 1 minuto a 1,5 horas, p. ej., antes de que el fluido que incluye la proteína recombinante se alimente en el MCCS2. En algunos ejemplos, el fluido que incluye la proteína recombinante ya puede tener un pH bajo (p. ej., un pH por debajo de 4,6, por debajo de 4,4, por debajo de 4,2, por debajo de 4,0, por debajo de 3,8, por debajo de 3,6, por debajo de 3,4, por debajo de 3,2, o por debajo de 3,0) cuando se alimenta en el reservorio que se usa para llevar a cabo la operación de unidad de inactivación vírica. Como lo pueden apreciar los expertos en la técnica, se puede usar una variedad de otros medios para llevar a cabo la operación de unidad de inactivar virus. Por ejemplo, la irradiación UV de un fluido que incluye la proteína recombinante también se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de inactivar virus. En la presente memoria se describen ejemplos no limitantes de reservorios que se pueden usar para llevar a cabo la operación de unidad de inactivación de virus presentes en un fluido que incluye la proteína recombinante.

El MCCS o MCCS1 puede incluir un PCCS que incluye cuatro columnas de cromatografía, donde al menos tres de las cuatro columnas de cromatografía llevan a cabo la operación de unidad de captura la proteína recombinante a partir del medio de cultivo líquido (p. ej., al usar un MCCS que incluye una resina que es capaz de llevar a cabo la operación de unidad de captura (p. ej., cualquiera de las descritas en la presente memoria)). En estos ejemplos, la cuarta columna del PCC puede llevar a cabo la operación de unidad de inactivación de virus presentes en un fluido que incluye la proteína recombinante (p. ej., cualquiera de las columnas ilustrativas descritas en la presente memoria que se pueden usar para lograr la inactivación vírica de un fluido que incluye la proteína recombinante).

En algunos ejemplos, un fluido que incluye la proteína recombinante se eluye de manera continua desde el MCCS1 (p. ej., PCCS1) y se alimenta de manera continua en el MCCS2 (p. ej., PCCS2). El porcentaje de la proteína recombinante recuperada en el eluato del MCCS o MCCS1 (p. ej., PCCs o PCCS1) puede ser, p. ej., al menos 70 %, al menos 72 %, al menos 74 %, al menos 76 %, al menos 78 %, al menos 80 %, al menos 82 %, al menos 84 %, al menos 86 %, al menos 88 %, al menos 90 %, al menos 92 %, al menos 94 %, al menos 96 % o al menos 98 %). El eluato del MCCS1 (p. ej., PCCS1) se puede alimentar en el MCCS2 (p. ej., PCCS2) al usar una variedad de medios conocidos en la técnica (p. ej., tuberías). El eluato de MCCS1 (p. ej., PCCS1) se puede alimentar en el MCCS2 (p. ej., PCCS2) a una velocidad de flujo de, p. ej., entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 25 mL/minuto (p. ej., entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 10 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto y aproximadamente 6,0 mL/minuto, entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 5,0 mg/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL minuto y aproximadamente 14 mL/minuto, entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 25,0 mL/minuto, entre aproximadamente 5,0 mL/minuto a aproximadamente 15,0 mL/minuto, entre aproximadamente 15 mL/minuto a aproximadamente 25 mL/minuto, o entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 15,0 mL/minuto).

Algunos procesos descritos en la presente memoria pueden incluir, además, una etapa de ajustar la concentración iónica y/o el pH del eluato del MCCS1 (p. ej., PCCS1) antes de alimentarlo en el MCCS2 (p. ej., PCCS2). Como se describe en la presente memoria, se puede ajustar la concentración iónica y/o el pH del eluato del MCCS1 (p. ej., PCCS1) (antes de alimentarlo en el MCCS2) al agregar un tampón al eluato (p. ej., a través del uso de un reservorio de ajuste de tampón integral). El tampón se puede agregar al eluato del MCCS1 a una velocidad de flujo de, p. ej., entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto (p. ej., entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 12,5 mL/minuto, entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 10,0 mL/minuto, entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 8,0 mL/minuto, entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 6 mL/minuto, entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a 4 mL/minuto, o entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 5 mL/minuto).

Los procesos descritos en la presente memoria pueden incluir, además, una etapa de retener o almacenar (y opcionalmente también refrigerar) el eluato del MCCS1 antes de alimentar el eluato de MCCS1 en el MCCS2. Como se describe, esta etapa de retención o almacenamiento se puede llevar a cabo al usar cualquiera de los reservorios (p. ej., tanques de reserva) descritos en la presente memoria.

Los procesos descritos en la presente memoria también pueden incluir una etapa de filtrar del eluato del MCCS1 antes de alimentarlo en el MCCS2. Cualquiera de los filtros o métodos de filtración ilustrativos descritos en la presente memoria se pueden usar para filtrar del eluato del MCCS1 antes de alimentarlo en el MCCS2.

Refinar y purificar la proteína recombinante

El MCCS, MCCS1 y/o MCCS2 se pueden usar para llevar a cabo la operación de unidad de purificar y refinar la proteína recombinante. Por ejemplo, el MCCS2 se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de purificar y refinar la proteína recombinante y el eluato de MCCS2 es una sustancia farmacéutica de proteína. El MCCS, MCCS1 y/o MCCS2 puede incluir al menos una (p. ej., dos, tres o cuatro) columna de cromatografía o membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de purificar una proteína recombinante, y al menos una (p. ej., dos, tres o cuatro) columna de cromatografía o membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de refinar la proteína recombinante.

La al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de purificar la proteína recombinante puede incluir una resina que utiliza un mecanismo de captura (p. ej., cualquiera de los mecanismos de captura descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica) o una resina que se puede usar para llevar a cabo cromatografía de intercambio catiónico, de intercambio aniónico, de tamiz molecular o interacción hidrófoba. La al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la unidad de operación de refinar la proteína recombinante puede incluir una resina que se puede usar para llevar a cabo cromatografía de intercambio catiónico, de intercambio aniónico, de tamiz molecular o interacción hidrófoba (p. ej., cualquiera de las resinas ilustrativas para llevar a cabo cromatografía de intercambio catiónico, de intercambio aniónico, de tamiz molecular o interacción hidrófoba descritas en la presente memoria o conocidas en la técnica).

El tamaño, la forma y el volumen de la al menos una columna de cromatografía o membrana de cromatografía que se puede usar para llevar a cabo la unidad de operación de purificar la proteína recombinante y/o el tamaño y forma de al menos una membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de refinar la proteína recombinante puede ser cualquier combinación de los tamaños, formas y volúmenes ilustrativos de columnas de cromatografía o membranas cromatográficas descritos en la presente memoria. Como lo puede apreciar un experto en la técnica, la etapa de purificar o refinar una proteína recombinante puede, p. ej., incluir las etapas de cargar, lavar, eluir y equilibrar la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica usada para llevar a cabo la unidad de operación de purificar o refinar la proteína recombinante. Típicamente, el tampón de elución que sale de una columna de cromatografía o membrana cromatográfica usada para llevar a cabo la operación de unidad de purificar incluye la proteína recombinante. Típicamente, el tampón de carga y/o de lavado que sale de una columna de cromatografía o membrana cromatográfica usada para llevar a cabo la operación de unidad de refinar incluye la proteína recombinante.

Por ejemplo, el tamaño de la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de purificar la proteína recombinante puede tener un volumen de, p. ej., entre aproximadamente 2,0 mL a aproximadamente 200 mL (p. ej., entre aproximadamente 2,0 mL a aproximadamente 180 mL, entre aproximadamente 2,0 mL a aproximadamente 160 mL, entre aproximadamente 2,0 mL a aproximadamente 140 mL, entre aproximadamente 2,0 mL a aproximadamente 120 mL, entre aproximadamente 2,0 mL a aproximadamente 100 mL, entre aproximadamente 2,0 mL a aproximadamente 80 mL, entre aproximadamente 2.0 mL a aproximadamente 60 mL, entre aproximadamente 2,0 mL a aproximadamente 40 mL, entre aproximadamente 5.0 mL a aproximadamente 40 mL, entre aproximadamente 2,0 mL a aproximadamente 30 mL, entre aproximadamente 5.0 mL a aproximadamente 30 mL o entre aproximadamente 2,0 mL a aproximadamente 25 mL). La velocidad de flujo del fluido que incluye la proteína recombinante como se carga en la al menos una columna de cromatografía o al menos una cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de purificar la proteína recombinante puede ser, p. ej., entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 25 mL/minuto (p. ej., entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 12,5 mL/minuto, entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 10,0 mL/minuto, entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 8,0 mL/minuto, entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 6 mL/minuto, entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a 4 mL/minuto, entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 3 mL/minuto, entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 2 mL/minuto, o aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 4 mL/minuto). La concentración de la proteína recombinante en el fluido cargado en la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de purificar la proteína recombinante puede ser, p. ej., entre aproximadamente 0,05 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL proteína recombinante (p. ej., entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 90 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 80 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 70 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 60 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, entre 0,5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 15 mg/mL, entre aproximadamente 0,5 mg/mL a aproximadamente 15 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, o entre aproximadamente 0,5 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL de proteína recombinante). La resina en la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica usada para llevar a cabo la operación de unidad de purificar puede ser una resina que se puede usar para llevar a cabo cromatografía de intercambio aniónico o intercambio catiónico. La resina en la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que se usa para llevar a cabo la operación de unidad de purificar puede ser una resina de intercambio catiónico (p. ej., la resina Capto-S, GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ).

Después de cargar la proteína recombinante en la al menos una columna cromatográfica y/o membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de purificar la proteína recombinante, la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica se lava con al menos un tampón de lavado. Como se puede apreciar en la técnica, con el al menos un (p. ej., dos, tres o cuatro) tampón de lavado se pretende eluir todas las proteínas que no son la proteína recombinante de la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica, mientras no se altera la interacción de la proteína recombinante con la resina o se eluye de cualquier otra manera la proteína recombinante.

El tampón de lavado se puede pasar a través de la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica a una velocidad de flujo de entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 25 mL/minuto (p. ej., entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 10 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL minuto y aproximadamente 14 mL/minuto, entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 25,0 mL/minuto, entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 15,0 mL/minuto). El volumen del tampón de lavado usado (p. ej., volumen total combinado de tampón de lavado usado cuando se usa más de un tampón de lavado) puede ser, p. ej., entre aproximadamente 1X volumen de columna (VC) a aproximadamente 15X CV (p. ej., entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 14X CV, aproximadamente 1X CV a aproximadamente 13X CV, aproximadamente 1X CV a aproximadamente 12X CV, aproximadamente 1X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 3X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 4X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2,5X CV a aproximadamente 5,0X, CV, aproximadamente 5X CV a aproximadamente 11X CV, o aproximadamente 5X CV a aproximadamente 10X CV). El tiempo total de lavado puede ser, p. ej., entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 3 horas (p. ej., entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 2,5 horas, entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 2,0 horas, entre aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 1,25 horas, entre aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 1,25 horas, entre aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1 hora, entre aproximadamente 2 minutos y 10 minutos, entre aproximadamente 2 minutos y 15 minutos, o entre aproximadamente 2 minutos y 30 minutos).

Después de lavar la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica usada para llevar a cabo la operación de unidad de purificar la proteína recombinante, la proteína recombinante se eluye de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica al pasar un tampón de elución a través de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica usada para llevar a cabo la operación de unidad de purificar la proteína recombinante. El tampón de elución se puede pasar a través de la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de purificar la proteína recombinante a una velocidad de flujo de entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 25 mL/minuto (p. ej., entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 10 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto y aproximadamente 6,0 mL/minuto, entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 5,0 mg/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL minuto y aproximadamente 14 mL/minuto, entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 25,0 mL/minuto o entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 15,0 mL/minuto). El volumen del tampón de elución usado para eluir la proteína recombinante de cada una de la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de purificar la proteína recombinante puede ser, p. ej., entre aproximadamente 1X volumen de columna (V) a aproximadamente 25X CV (p. ej., entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 20X CV, entre aproximadamente 15X CV y aproximadamente 25X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 14X CV, aproximadamente 1X CV a aproximadamente 13X CV, aproximadamente 1X CV a aproximadamente 12X CV, aproximadamente 1X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 3X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 4X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 5X CV a aproximadamente 11X CV, o aproximadamente 5X CV a aproximadamente 10X CV). El tiempo total de elución puede ser, p. ej., entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 3 horas (p. ej., entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 2,5 horas, entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 2,0 horas, entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 1,25 horas, entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 1,25 horas, entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 1 hora, entre aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 40 minutos, entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 40 minutos, entre aproximadamente 20 minutos y aproximadamente 40 minutos o entre aproximadamente 30 minutos y 1,0 hora). Los ejemplos no limitantes de tampones de elución que se pueden usar en estos métodos dependerán de la resina y/o las propiedades biofísicas de la proteína recombinante. Por ejemplo, un tampón de elución puede incluir una concentración de sal diferente (p. ej., una concentración de sal mayor), un pH diferente (p. ej., una concentración de sal mayor o menor) o una molécula que competirá con la proteína recombinante por la unión a la resina. Los ejemplos de dichos tampones de elución para cada uno de los mecanismos de captura ilustrativos descritos en la presente memoria se conocen en la técnica.

Después de la elución de la proteína recombinante desde la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica usada para llevar a cabo la operación de unidad de purificar la proteína recombinante y antes de que se pueda cargar el siguiente volumen de fluido que incluye una proteína recombinante en la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica, la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica se debe equilibrar al usar un tampón de regeneración. El tampón de regeneración se puede pasar a través de la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica usada para llevar a cabo la operación de unidad de purificar la proteína recombinante a una velocidad de flujo de, p. ej., entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 25 mL/minuto (p. ej., entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 10 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto y aproximadamente 6,0 mL/minuto, entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 5,0 mg/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL minuto y aproximadamente 14 mL/minuto, entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 25,0 mL/minuto, entre aproximadamente 5,0 mL/minuto a aproximadamente 15,0 mL/minuto, o entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 15,0 mL/minuto). El volumen del tampón de regeneración usado para equilibrar la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que incluye una resina que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de purificar la proteína recombinante puede ser, p. ej., entre aproximadamente 1X volumen de columna (CV) a aproximadamente 15X CV (p. ej., entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 14X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 13X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 12X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 11X CV, entre aproximadamente 2X CV a aproximadamente 11X CV, entre aproximadamente 3X CV a aproximadamente 11X CV, entre aproximadamente 2X CV a aproximadamente 5X CV, entre aproximadamente 2,5X CV a aproximadamente 7,5X CV, entre aproximadamente 4X CV a aproximadamente 11X CV, entre aproximadamente 5X CV a aproximadamente 11X CV, o entre aproximadamente 5X CV a aproximadamente 10X CV). La concentración de la proteína recombinante en el eluato de la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica usada para llevar a cabo la operación de unidad de purificar la proteína recombinante puede ser, p. ej., entre aproximadamente 0,05 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL proteína recombinante (p. ej., entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 90 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 80 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 70 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 60 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, entre aproximadamente 2,5 mg/mL y aproximadamente 7,5 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, entre 0,5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 15 mg/mL, entre aproximadamente 0,5 mg/mL a aproximadamente 15 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, o entre aproximadamente 0,5 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL de proteína recombinante).

La al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de refinar la proteína recombinante puede incluir una resina que se puede usar para llevar a cabo cromatografía de intercambio catiónico, de intercambio aniónico o de tamiz molecular. Como se puede apreciar en la técnica, refinar una proteína recombinante al usar la al menos una columna de cromatografía o membrana de cromatografía que se puede usar para llevar a cabo la unidad de operación de refinar la proteína recombinante puede incluir, p. ej., las etapas de cargar, acanalar y regenerar la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de refinar la proteína recombinante. Por ejemplo, cuando se usan las etapas de cargar, acanalar y regenerar para llevar a cabo el refinamiento, la proteína recombinante no se une a la resina en la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que se usa para llevar a cabo la operación de unidad de refinar la proteína recombinante, y la proteína recombinante se eluye de la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica en las etapas de cargar y acanalar, y la etapa de regeneración se usa para extraer cualesquiera impurezas de la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica antes de que se pueda cargar fluido adicional que incluye proteína recombinante en la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica. Las velocidades de flujo y volúmenes de tampón ilustrativos para usar en cada una de las etapas de cargar, acanalar y regenerar se describen a continuación.

El tamaño, la forma y el volumen de la al menos una columna de cromatografía o membrana de cromatografía que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de refinar la proteína recombinante y/o el tamaño y forma de al menos una membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de refinar la proteína recombinante puede ser cualquier combinación de los tamaños, formas y volúmenes ilustrativos de columnas de cromatografía o membranas cromatográficas descritos en la presente memoria. Por ejemplo, el tamaño de la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de refinar la proteína recombinante puede tener un volumen de, p. ej., entre aproximadamente 0,5 mL a aproximadamente 200 mL (p. ej., entre aproximadamente 0,5 mL a aproximadamente 180 mL, entre aproximadamente 0,5 mL a aproximadamente 160 mL, entre aproximadamente 0,5 mL a aproximadamente 140 mL, entre aproximadamente 0,5 mL a aproximadamente 120 mL, entre aproximadamente 0,5 mL a aproximadamente 100 mL, entre aproximadamente 0,5 mL a aproximadamente 80 mL, entre aproximadamente 0,5 mL a aproximadamente 60 mL, entre aproximadamente 0,5 mL a aproximadamente 40 mL, entre aproximadamente 5,0 mL a aproximadamente 40 mL, entre aproximadamente 0,5 mL a aproximadamente 30 mL, entre aproximadamente 5,0 mL a aproximadamente 30 mL, entre aproximadamente 0,5 mL a aproximadamente 25 mL, entre aproximadamente 0,2 mL a aproximadamente 10 mL, o entre aproximadamente 0,2 mL a aproximadamente 5 mL). La velocidad de flujo del fluido que incluye la proteína recombinante como se carga en la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de refinar la proteína recombinante puede ser, p. ej., entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 25 mL/minuto (p. ej., entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 12,5 mL/minuto, entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 10,0 mL/minuto, entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 8,0 mL/minuto, entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 6 mL/minuto, entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a 4 mL/minuto, entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 3 mL/minuto, entre aproximadamente 2 mL/minuto and aproximadamente 6 mL/minuto, entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 2 mL/minuto, o aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 4 mL/minuto). El volumen total de fluido que incluye una proteína recombinante cargado en la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de refinar la proteína recombinante puede ser, p. ej., entre aproximadamente 1,0 mL a aproximadamente 250 mL (p. ej., entre aproximadamente 1,0 mL a aproximadamente 225 mL, entre aproximadamente 1,0 mL a aproximadamente 200 mL, entre aproximadamente 1,0 mL a aproximadamente 175 mL, entre aproximadamente 1,0 mL a aproximadamente 150 mL, entre aproximadamente 100 mL a aproximadamente 125 mL, entre aproximadamente 100 mL a aproximadamente 150 mL, entre aproximadamente 1,0 mL a aproximadamente 150 mL, entre aproximadamente 1,0 mL a aproximadamente 125 mL, entre aproximadamente 1,0 mL a aproximadamente 100 mL, entre aproximadamente 1,0 mL a aproximadamente 75 mL, entre aproximadamente 1,0 mL a aproximadamente 50 mL, o entre aproximadamente 1,0 mL a aproximadamente 25 mL). La resina en la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica usada para llevar a cabo la operación de unidad de refinar puede ser una resina de intercambio aniónico o intercambio catiónico. La resina en la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que se usa para llevar a cabo la operación de unidad de refinar puede ser una resina de intercambio catiónico (p. ej., resina Q Sartobind®, Sartorius, Goettingen, Alemania).

Después de la etapa de carga, se lleva a cabo una etapa de acanalar (p. ej., se pasa un tampón de acanalar a través de la al menos una membrana de cromatografía o membrana cromatográfica para recoger la proteína recombinante que no se une sustancialmente a la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica). En estos ejemplos, el tampón de acanalar se puede pasar a través de la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica a una velocidad de flujo de entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 50 mL/minuto (p. ej., entre aproximadamente 1 mL/minuto a aproximadamente 40 mL/minuto, entre aproximadamente 1 mL/minuto a aproximadamente 30 mL/minuto, entre aproximadamente 5 mL/minuto a aproximadamente 45 mL/minuto, entre aproximadamente 10 mL/minuto a aproximadamente 40 mL/minuto, entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 10 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL minuto y aproximadamente 14 mL/minuto, entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 25,0 mL/minuto, o entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 15,0 mL/minuto). El volumen del tampón de acanalar puede ser, p. ej., entre aproximadamente 1X volumen de columna (CV) a aproximadamente 100X CV (p. ej., entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 90X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 80X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 70X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 60X CV, entre aproximadamente 1X a aproximadamente 50X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 40X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 30X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 20X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 15X CV, entre aproximadamente 5X CV a aproximadamente 20X CV, entre aproximadamente 5 X CV a aproximadamente 30X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 14X CV, aproximadamente 1X CV a aproximadamente 13X CV, aproximadamente 1X CV a aproximadamente 12X CV, aproximadamente 1X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 3X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 4X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2.5X CV a aproximadamente 5.OX CV, aproximadamente 5X CV a aproximadamente 11X CV, o aproximadamente 5X CV a aproximadamente 10X CV). El tiempo total de acanalar puede ser, p. ej., entre aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 3 horas (p. ej., entre aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 2,5 horas, entre aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 2,0 horas, entre aproximadamente 1 minutos a aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 1 minutos a aproximadamente 1,25 horas, entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 1,25 horas, entre aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 5 minutos, entre aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 10 minutos, entre aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 4 minutos, entre aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1 hora, entre aproximadamente 2 minutos y 10 minutos, entre aproximadamente 2 minutos y 15 minutos, o entre aproximadamente 2 minutos y 30 minutos). La concentración combinada de la proteína recombinante presente en el eluato que va por la columna en la etapa de cargar y la etapa de acanalar puede ser, p. ej., entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL proteína recombinante (p. ej., entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 90 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 80 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 70 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 60 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 40 mg/mL, entre aproximadamente 2,5 mg/mL y aproximadamente 7,5 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 30 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, entre 0,5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 15 mg/mL, entre aproximadamente 0,5 mg/mL a aproximadamente 15 mg/mL, entre aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, entre aproximadamente 0,5 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL o entre aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 5 mg/mL de proteína recombinante).

Después de la etapa de acanalar y antes de que se pueda cargar el siguiente volumen de fluido que incluye la proteína recombinante en la al menos una columna de cromatográfica o membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de refinar, la al menos una columna cromatográfica o membrana cromatográfica se debe regenerar al usar un tampón de regeneración. El tampón de regeneración se puede pasar a través de la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de refinar la proteína recombinante a una velocidad de flujo de, p. ej., entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 50 mL/minuto (p. ej., entre aproximadamente 1 mL/minuto a aproximadamente 40 mL/minuto, entre aproximadamente 1 mL/minuto a aproximadamente 30 mL/minuto, entre aproximadamente 5 mL/minuto a aproximadamente 45 mL/minuto, entre aproximadamente 10 mL/minuto a aproximadamente 40 mL/minuto, entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 20 mL/minuto, entre aproximadamente 0,2 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 10 mL/minuto, entre aproximadamente 0,5 mL minuto y aproximadamente 14 mL/minuto, entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 25,0 mL/minuto, o entre aproximadamente 1,0 mL/minuto y aproximadamente 15,0 mL/minuto). El volumen del tampón de regeneración usado para regenerar la al menos una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de refinar puede ser, p. ej., entre aproximadamente 1X volumen de columna (CV) a aproximadamente 500X CV (p. ej., entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 450X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 400X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 350X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 300X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 250X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 200X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 150X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 100 X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 90X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 80X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 70X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 60X CV, entre aproximadamente 1X a aproximadamente 50X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 40X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 30X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 20X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 15X CV, entre aproximadamente 5X CV a aproximadamente 20X CV, entre aproximadamente 5 X CV a aproximadamente 30X CV, entre aproximadamente 1X CV a aproximadamente 14X CV, aproximadamente 1X CV a aproximadamente 13X CV, aproximadamente 1X CV a aproximadamente 12X CV, aproximadamente 1X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 3X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 4X CV a aproximadamente 11X CV, aproximadamente 2,5X CV a aproximadamente 5,0X CV, aproximadamente 5X CV a aproximadamente 11X CV, o aproximadamente 5X CV a aproximadamente 10X CV)

En otros ejemplos, la una o más columna(s) de cromatografía y/o membranas cromatográficas usadas para llevar a cabo la operación de unidad de refinar incluyen una a resina que selectivamente se une a o retiene las impurezas presentes en un fluido que incluye la proteína recombinante y, en lugar de regenerar la una o más columna(s) y/o membrana(s), la una o más columna(s) y/o membrana(s) se reemplazan (p. ej., reemplazan con una columna(s) y/o membrana(s) sustancialmente similar(es)) una vez que se ha alcanzado la capacidad de unión de la resina en la una o más columna(s) y/o membrana(s) o se está sustancialmente cerca de alcanzarla.

En algunos ejemplos de estos procesos descritos en la presente memoria, el MCCS2 incluye un PCCS que incluye tres columnas de cromatografía y una membrana cromatográfica, p. ej., donde las tres columnas de cromatografía en el PCCS llevan a cabo la operación de unidad de purificar la proteína recombinante (p. ej., al usar al menos una columna de cromatografía(s) que se puede usar para llevar a cabo la unidad de operación de purificar la proteína) y la membrana cromatográfica en el PCCS lleva a cabo la operación de unidad de refinar la proteína recombinante. En estos ejemplos, la membrana cromatográfica en el PCCS que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de refinar la proteína terapéutica puede ser cualquiera de las membranas cromatográficas ilustrativas descritas en la presente memoria que se pueden usar para llevar a cabo la operación de unidad de refinar la proteína recombinante. Cualquiera de los métodos de conmutar columnas descritos en la presente memoria se puede usar para determinar cuándo las primeras tres columnas de cromatografía y la membrana cromatográfica en el PCCS en este ejemplo se pueden conmutar.

Algunas realizaciones de este ejemplo pueden incluir, además, una etapa de ajustar la concentración iónica y/o el pH del eluato de las tres columnas cromatográficas en el PCCS antes de alimentar el eluato en la membrana cromatográfica en el PCCS. Como se describe en la presente memoria, se puede ajustar la concentración iónica y/o el pH del eluato de las tres columnas de cromatografía en el PCCS (antes de alimentarlo en la membrana cromatográfica en el PCCS en este ejemplo)) al agregar un tampón al eluato de las tres columnas de cromatografía en el PCCS (p. ej., a través del uso de un reservorio de ajuste de tampón integral). El tampón se puede agregar al eluato a una velocidad de flujo de, p. ej., entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 15 mL/minuto (p. ej., entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 12,5 mL/minuto, entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 10,0 mL/minuto, entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 8,0 mL/minuto, entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a aproximadamente 6 mL/minuto, entre aproximadamente 0,1 mL/minuto a 4 mL/minuto, o entre aproximadamente 0,5 mL/minuto a aproximadamente 5 mL/minuto).

Estos ejemplos pueden incluir, además, una etapa de retener o almacenar el eluato de las tres columnas de cromatografía en el PCCS en este ejemplo antes de alimentar el eluato en la membrana cromatográfica (la membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de refinar la proteína recombinante). Como se describe, esta etapa de retención o almacenamiento se puede llevar a cabo al usar cualquiera de los reservorios (p. ej., tanques de reserva) descritos en la presente memoria.

Estos ejemplos pueden incluir también una etapa de filtrar el eluato desde la membrana cromatográfica en el sistema PCCS ilustrativo (el eluato de la membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de refinar la proteína recombinante). Cualquiera de los filtros o métodos de filtración ilustrativas descritos en la presente memoria se pueden usar para filtrar el eluato desde la membrana cromatográfica en este PCCS ilustrativo (el eluato de la membrana cromatográfica que se puede usar para llevar a cabo la operación de unidad de refinar la proteína recombinante).

Como lo pueden apreciar aquellos en la técnica, la proteína recombinante purificada se puede eluir periódicamente del MCCS o MCCS2 al usar cualquiera de los procesos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, cualquiera de los procesos descritos en la presente memoria puede eluir la proteína recombinante purificada durante una duración de, p. ej., entre aproximadamente 30 segundos y aproximadamente 5 horas (p. ej., entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 4 horas, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 3 horas, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 2 horas, entre aproximadamente 1 minuto o aproximadamente 1,5 horas, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 1 hora, o entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 30 minutos) a una frecuencia de, p. ej., entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 6 horas (p. ej., entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 5 horas, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 4 horas, entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 3 horas, entre aproximadamente 1 minuto y 2 horas, entre aproximadamente 1 minuto y 1 hora, o entre aproximadamente 1 minuto y 30 minutos), dependiendo de, p. ej., la columna(s) de cromatografía y/o membrana(s) cromatográfica(s) usadas en el MCCS o el MCCS1 y MCCS2.

Métodos de cultivo

Algunos de los procesos descritos en la presente memoria incluyen, además, una etapa de cultivar células (p. ej., células mamífero recombinantes) que secretan una proteína recombinante en un biorreactor (p. ej., un biorreactor de perfusión o de alimentación por lotes) que incluye un medio de cultivo líquido, en donde un volumen del medio de cultivo líquido que está sustancialmente libre de células (p. ej., células mamífero) se extrae de manera continua o periódicamente del biorreactor (p. ej., biorreactor de perfusión) y se alimenta en el MCCS o MCCS1. El biorreactor puede tener un volumen de, p. ej., entre aproximadamente 1 L a aproximadamente 10.000 L (p. ej., entre aproximadamente 1 L a aproximadamente 50 L, entre aproximadamente 50 L a aproximadamente 500 L, entre aproximadamente 500 L a aproximadamente 1000 L, entre 500 L a aproximadamente 5000 L, entre aproximadamente 500 L a aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 5000 L a aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 1 L y aproximadamente 10.000 L, entre aproximadamente 1L y aproximadamente 8000 L, entre aproximadamente 1 L y aproximadamente 6000 L, entre aproximadamente 1 L y aproximadamente 5000 L, entre aproximadamente 100 L y aproximadamente 5000 L, entre aproximadamente 10 L y aproximadamente 100 L, entre aproximadamente 10 L y aproximadamente 4000 L, entre aproximadamente 10 L y aproximadamente 3000 L, entre aproximadamente 10 L y aproximadamente 2000 L, o entre aproximadamente 10 L y aproximadamente 1000 L). La cantidad de medio de cultivo líquido presente en un biorreactor puede ser, p. ej., entre aproximadamente 0,5 L a aproximadamente 5000 L (p. ej., entre aproximadamente 0,5 L a aproximadamente 25 L, entre aproximadamente 25 L a aproximadamente 250 L, entre aproximadamente 250 L a aproximadamente 500 L, entre 250 L a aproximadamente 2500 L, entre aproximadamente 250 L a aproximadamente 5000 L, entre aproximadamente 2500 L a aproximadamente 5000 L, entre aproximadamente 0,5 L y aproximadamente 5000 L, entre aproximadamente 0,5 L y aproximadamente 4000 L, entre aproximadamente 0,5 L y aproximadamente 3000 L, entre aproximadamente 0,5 L y aproximadamente 2500 L, entre aproximadamente 50 L y aproximadamente 2500 L, entre aproximadamente 5 L y aproximadamente 50 L, entre aproximadamente 5 L y aproximadamente 2000 L, entre aproximadamente 5 L y aproximadamente 1500 L, entre aproximadamente 5 L y aproximadamente 1000 L, o entre aproximadamente 5 L y aproximadamente 500 L). El cultivo de células se puede llevar a cabo, p. ej., al usar un biorreactor con alimentación por lotes o un biorreactor de perfusión. A continuación, se describen ejemplos no limitantes y diferentes aspectos de cultivar células (p. ej., cultivar células de mamífero) y se pueden usar en cualquier combinación.

Células

Las células que se cultivan en algunos de los procesos descritos en la presente memoria pueden ser bacterias (p. ej., bacterias gram negativas), levadura (p. ej., Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica o Arxula adeninivorans) o células de mamífero. La célula de mamífero puede ser una célula que se multiplica en suspensión o es una célula adherente. Los ejemplos no limitantes de células de mamífero que se pueden cultivar en cualquiera de los procesos descritos en la presente memoria incluyen: Célula de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) (p. ej., células CHO DG44 o células CHO-K1s), Sp2.0, células de mieloma (p. ej., NS/0), linfocitos B, células de hibridoma, linfocitos T, células de riñón embrionario humano (HEK, por sus siglas en inglés) (p. ej., HEK 293E y HEK 293 F), células epiteliales de riñón de mono verde africano (Vero) y células epiteliales de riñón canino de Madin-Darby (Cocker Spaniel) (MDCK). En algunos ejemplos donde se cultiva una célula adherente, el cultivo también puede incluir una pluralidad de microportadores (p. ej., microportadores que incluye uno o más poros). En la técnica se conocen células de mamífero adicionales que se pueden cultivar en cualquiera de los procesos descritos en la presente memoria.

La célula de mamífero puede incluir un ácido nucleico recombinante (p. ej., un ácido nucleico integrado establemente en el genoma de la célula de mamífero) que codifica una proteína recombinante (p. ej., una proteína recombinante). Los ejemplos no limitantes de ácidos nucleicos recombinantes que codifican proteínas recombinantes ilustrativas se describen a continuación, ya que son proteínas recombinantes que se pueden producir al usar los métodos descritos en la presente memoria. En algunas instancias, la célula de mamífero que se cultiva en un biorreactor (p. ej., cualquiera de los biorreactores descritos en la presente memoria) se derivó de un cultivo más grande.

Un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante se puede introducir en una célula de mamífero al usar una amplia variedad de métodos conocidos en biología molecular y genética molecular. Los ejemplos no limitantes incluyen transfección (p. ej., lipofección), transducción (p. ej., infección por lentivirus, adenovirus o retrovirus) y electroporación. En algunas instancias, el ácido nucleico que codifica una proteína recombinante no está integrado establemente en el cromosoma de la célula de mamífero (transfección transitoria), mientras que en otras el ácido nucleico está integrado. Alternativamente o adicionalmente, el ácido nucleico que codifica una proteína recombinante puede estar presente en un plásmido y/o en un cromosoma artificial de mamífero (p. ej., un cromosoma artificial humano). Alternativamente o adicionalmente, el ácido nucleico se puede introducir en la célula al usar un vector vírico (p. ej., un vector de lentivirus, retrovirus o adenovirus). El ácido nucleico se puede enlazar funcionalmente a una secuencia promotora (p. ej., un promotor potente, tal como un promotor de p-actina y promotor de CMV o un promotor inducible). Un vector que incluye el ácido nucleico puede, si se desea, incluir también un marcador seleccionable (p. ej., un gen que confiere resistencia a higromicina, puromicina o neomicina a la célula de mamífero).

En algunas instancias, la proteína recombinante es una proteína secretada y la célula de mamífero la libera en el medio extracelular (p. ej., el primer y/o segundo medio de cultivo líquido). Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína recombinante soluble puede incluir una secuencia que codifica un péptido señal de secreción en el extremo N o C de la proteína recombinante, que se escinde mediante una enzima presente en la célula de mamífero, y posteriormente se libera en el medio extracelular (p. ej., el primer y/o segundo medio de cultivo líquido).

Medios de cultivo

Se conocen medios de cultivo líquidos en la técnica. Los medios de cultivo líquidos (p. ej., un primer y/o segundo medio de cultivo de tejido) se pueden complementar con un suero de mamífero (p. ej., suero bovino fetal y suero bovino) y/o una hormona de crecimiento o factor de crecimiento (p. ej., insulina, transferrina y factor de crecimiento epidérmico). Alternativamente o adicionalmente, los medios de cultivo líquidos (p. ej., un primer y/o segundo medio de cultivo líquido) puede ser un medio de cultivo líquido químicamente definido, un medio de cultivo líquido libre de componentes derivados de animales, un medio de cultivo líquido libre de suero o medio de cultivo líquido que contiene suero. Los ejemplos no limitantes de medios de cultivo líquidos químicamente definidos, medios de cultivo líquidos libres de componentes derivados de animales, medios de cultivo líquidos libres de suero y medios de cultivo líquidos que contienen suero están disponibles comercialmente.

Un medio de cultivo líquido típicamente incluye una fuente de energía (p. ej., un carbohidrato, tal como glucosa), aminoácidos esenciales (p. ej., el conjunto básico de veinte aminoácidos más cisteína), vitaminas y/u otros compuestos orgánicos necesario en concentraciones bajas, ácidos grasos libres y/u oligoelementos. Los medios de cultivo líquidos (p. ej., un primer y/o segundo medio de cultivo líquido), si se desea, se pueden complementar con, p. ej., una hormona o factor de crecimiento de mamífero (p. ej., insulina, transferrina y factor de crecimiento epidérmico), sales y tampones (p. ej., sales de calcio, magnesio y fosfato), nucleósidos y bases (p. ej., adenosina, timidina e hipoxantina), hidrolizados de proteína y tejido y/o cualquier combinación de estos aditivos.

En la técnica se conoce una amplia variedad de diferentes medios de cultivo líquidos que se pueden usar para cultivar células (p. ej., células de mamífero) en cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria. Los componentes del medio que también pueden ser útiles en los presentes procesos incluyen, pero no se limitan a, hidrolizados químicamente definidos (QD, por sus siglas en inglés), p. ej., peptona QD, polipéptidos QD (dos o más aminoácidos) y factores de crecimiento QD. Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de medio de cultivo de tejido líquido y componentes del medio.

Los expertos apreciarán que el primer medio de cultivo líquido y el segundo medio de cultivo líquido descritos en la presente memoria puede ser el mismo tipo de medios o medios diferentes.

Características adicionales de biorreactores ilustrativos

La superficie interior de cualquiera de los biorreactores descritos en la presente memoria puede tener al menos un recubrimiento (p. ej., al menos un recubrimiento de gelatina, colágeno, poli-L-ornitina, poliestireno y laminina), y como se conoce en la técnica, uno o más puertos para el rociado de O2, CO2 y N2 en el medio de cultivo líquido y un mecanismo de agitación para agitar el medio de cultivo líquido. El biorreactor puede incluir el cultivo celular en una atmósfera controlada humidificada (p. ej., con una humedad mayor que 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %, o una humedad de 100 %). El biorreactor también se puede equipar con un dispositivo mecánico que es capaz de extraer un volumen de medio de cultivo líquido del biorreactor y opcionalmente, un filtro dentro del dispositivo mecánico que extrae las células del medio de cultivo líquido durante el proceso de transferencia del medio de cultivo líquido hacia fuera del biorreactor (p. ej., un sistema ATF o sistema de filtración de células descrito en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. de serie 61/878.502).

Temperatura

La etapa de cultivar células de mamífero se puede llevar a cabo a una temperatura de aproximadamente 31 °C a aproximadamente 40 °C. Los expertos apreciarán que la temperatura se puede cambiar en punto(s) de tiempo específico(s) durante la etapa de cultivo, p. ej., por hora o día. Por ejemplo, la temperatura se puede cambiar o variar (p. ej., aumentar o disminuir) después de aproximadamente un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, siete días, ocho días, nueve días, diez días, once días, doce días, catorce días, quince días, dieciséis días, diecisiete días, dieciocho días, diecinueve días o aproximadamente veinte días o más de la siembra inicial del biorreactor con la célula (p. ej., célula de mamífero). Por ejemplo, la temperatura se puede variar hacia arriba (p. ej., un cambio de hasta o aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o hasta o aproximadamente 20 °C). Por ejemplo, la temperatura se puede variar hacia abajo (p. ej., un cambio de hasta o aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o hasta o aproximadamente 20 °C).

CO2

La etapa de cultivo descrita en la presente memoria puede incluir, además, exponer el medio de cultivo líquido en el biorreactor a una atmósfera que incluye como máximo o aproximadamente 15 % de CO2 (p. ej., como máximo o aproximadamente 14 % de CO2, 12 % de CO2, 10 % de CO2, 8 % de CO2, 6 % de CO2, 5 % de CO2, 4 % de CO2, 3 % de CO2, 2 % de CO2 o como máximo o aproximadamente 1 % de CO2).

Biorreactor de perfusión

La etapa de cultivo descrita en la presente memoria se puede llevar a cabo al usar un biorreactor de perfusión. Cultivar una célula (p. ej., una célula de mamífero) en un biorreactor de perfusión incluye la extracción desde el biorreactor de un primer volumen de un primer medio de cultivo líquido (p. ej., que incluye cualquier concentración de células de mamífero, p. ej., un primer volumen de un primer medio de cultivo líquido que está sustancialmente libre de células), y agregar al primer medio de cultivo líquido un segundo volumen de un segundo medio de cultivo líquido. La extracción y adición se pueden llevar a cabo simultáneamente o secuencialmente, o una combinación de las dos. Además, la extracción y adición se pueden llevar a cabo de manera continua (p. ej., a una velocidad que extrae y reemplaza un volumen de entre 0,1 % a 800 % (p. ej., entre 1 % y 700 %, entre 1 % y 600 %, entre 1 % y 500 %, entre 1 % y 400 %, entre 1 % y 350 %, entre 1 % y 300 %, entre 1 % y 250 %, entre 1 % y 100 %, entre 100 % y 200 %, entre 5 % y 150 %, entre 10 % y 50 %, entre 15 % y 40 %, entre 8 % y 80 %, o entre 4 % y 30 %) del volumen del biorreactor o el volumen del primer medio de cultivo líquido durante cualquier período de tiempo dado (p. ej., en un período de 24 horas, en un período de tiempo incremental de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas, o en un período de tiempo incremental mayor que 24 horas)) o periódicamente (p. ej., una vez cada tres día, una vez cada dos días, una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, cuatro veces al día o cinco veces al día), o cualquier combinación de estos. Cuando se lleva a cabo periódicamente, el volumen que se extrae o reemplaza (p. ej., dentro de un período de aproximadamente 24 horas, dentro de un período de tiempo incremental de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas o dentro de un período de tiempo incrementa mayor que 24 horas) puede estar, p. ej., entre 0,1 % y 800 % (p. ej., entre 1 % y 700 %, entre 1 % y 600 %, entre 1 % y 500 %, entre 1 % y 400 %, entre 1 % y 300 %, entre 1 % y 200 %, entre 1 % y 100 %, entre 100 % y 200 %, entre 5 % y 150 %, entre 10 % y 50 %, entre 15 % y 40 %, entre 8 % y 80 %, o entre 4 % y 30 %) del volumen del biorreactor o el volumen del primer medio de cultivo líquido. El primer volumen del primer medio de cultivo líquido extraído y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido agregado, en algunas instancias, pueden retenerse aproximadamente de la misma manera cada durante un período de 24 horas (o, alternativamente, un período de tiempo incremental de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas o un período de tiempo incremental mayor que 24 horas) durante todo o parte del período de cultivo. Como se conoce en la técnica, la velocidad en la que se extrae el primer volumen del primer medio de cultivo líquido (volumen/unidad de tiempo) y la velocidad en la que se agrega el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido (volumen/unidad de tiempo) puede variar. La velocidad en la que se extrae el primer volumen del primer medio de cultivo líquido (volumen/unidad de tiempo) y la velocidad en la que se agrega el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido (volumen/unidad de tiempo) puede ser aproximadamente la misma o puede ser diferente.

Alternativamente, el volumen extraído y agregado puede cambiar (p. ej., aumentar gradualmente) durante cada período de 24 horas (o, alternativamente, un período de tiempo incremental de entre 1 hora y aproximadamente 24 horas o un período de tiempo incremental mayor que 24 horas) durante el período de cultivo. Por ejemplo, el volumen del primer medio de cultivo líquido extraído y el volumen del segundo medio de cultivo líquido agregado dentro de cada período de 24 horas (o, alternativamente, un período de tiempo incremental de entre aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas o un período de tiempo incremental mayor que 24 horas) durante el período de cultivo se puede aumentar (p. ej., gradualmente o a través de aumentos escalonados) durante el período de cultivo de un volumen que está entre 0,5 % a aproximadamente 20 % del volumen del biorreactor o el volumen del primer medio de cultivo líquido a aproximadamente 25 % a aproximadamente 150 % del volumen del biorreactor o el volumen del primer medio de cultivo líquido.

Los expertos apreciarán que el primer medio de cultivo líquido y el segundo medio de cultivo líquido descritos puede ser el mismo tipo de medios. En otras instancias, el primer medio de cultivo líquido y el segundo medio de cultivo líquido pueden ser diferentes.

El primer volumen del primer medio de cultivo líquido se puede extraer, p. ej., mediante un sistema mecánico que puede extraer el primer volumen del primer medio de cultivo líquido desde el biorreactor (p. ej., el primer volumen del primer medio de cultivo líquido que está sustancialmente libre de células desde el biorreactor). Alternativamente o adicionalmente, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido se puede extraer mediante penetración o flujo de gravedad del primer volumen del primer medio de cultivo líquido a través de una membrana estéril con un corte de peso molecular que excluye a la célula (p. ej., célula de mamífero).

El segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido se puede agregar al primer medio de cultivo líquido de forma automatizada, p. ej., mediante bomba de perfusión.

En algunas instancias, extraer el primer volumen del primer medio de cultivo líquido (p. ej., un primer volumen del primer medio de cultivo líquido que está sustancialmente libre de células de mamífero) y agregar al primer medio de cultivo líquido un segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido no se produce dentro de al menos 1 hora (p. ej., dentro de 2 horas, dentro de 3 horas, dentro de 4 horas, dentro de 5 horas, dentro de 6 horas, dentro de 7 horas, dentro de 8 horas, dentro de 9 horas, dentro de 10 horas, dentro de 12 horas, dentro de 14 horas, dentro de 16 horas, dentro de 18 horas, dentro de 24 horas, dentro de 36 horas, dentro de 48 horas, dentro de 72 horas, dentro de 96 horas o después de 96 horas) después de la siembra del biorreactor con una célula de mamífero.

Biorreactor de alimentación por lotes

La etapa de cultivo descrita en la presente memoria se puede llevar a cabo al usar un biorreactor de alimentación por lotes. Cultivar una célula en un biorreactor de alimentación por lotes incluye, durante la mayor parte del período de cultivo, la adición (p. ej., adición periódica o continua) al primer medio de cultivo líquido de un segundo volumen de un segundo medio de cultivo líquido. La adición del segundo medio de cultivo líquido se puede llevar a cabo de manera continua (p. ej., a una velocidad que agrega un volumen de entre 0,1 % a 300 % (p. ej., entre 1 % y 250 %, entre 1 % y 100 %, entre 100 % y 200 %, entre 5 % y 150 %, entre 10 % y 50 %, entre 15 % y 40 %, entre 8 % y 80 %, o entre 4 % y 30 %) del volumen del biorreactor o el volumen del primer medio de cultivo líquido durante cualquier período de tiempo dado (p. ej., en un período de 24 horas, en un período de tiempo incremental de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas, o en un período de tiempo incremental mayor que 24 horas)) o periódicamente (p. ej., una vez cada tres día, una vez cada dos días, una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, cuatro veces al día o cinco veces al día), o cualquier combinación de estos. Cuando se lleva a cabo periódicamente, el volumen que se agrega (p. ej., dentro de un período de aproximadamente 24 horas, dentro de un período de tiempo incremental de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas o dentro de un período de tiempo incrementa mayor que 24 horas) puede estar, p. ej., entre 0,1 % y 300 % (p. ej., entre 1 % y 200 %, entre 1 % y 100 %, entre 100 % y 200 %, entre 5 % y 150 %, entre 10 % y 50 %, entre 15 % y 40 %, entre 8 % y 80 %, o entre 4 % y 30 %) del volumen del biorreactor o el volumen del primer medio de cultivo líquido. El segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido agregado, en algunas instancias, pueden retenerse aproximadamente de la misma manera cada durante un período de 24 horas (o, alternativamente, un período de tiempo incremental de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas o un período de tiempo incremental mayor que 24 horas) durante todo o parte del período de cultivo. Como se conoce en la técnica, la velocidad en la que se agrega el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido (volumen/unidad de tiempo) se puede variar durante todo o parte del período de cultivo. Por ejemplo, el volumen del segundo medio de cultivo líquido agregado puede cambiar (p. ej., aumentar gradualmente) durante cada período de 24 horas (o, alternativamente, un período de tiempo incremental de entre 1 hora y aproximadamente 24 horas o un período de tiempo incremental mayor que 24 horas) durante el período de cultivo. Por ejemplo, el volumen del segundo medio de cultivo líquido agregado dentro de cada período de 24 horas (o, alternativamente, un período de tiempo incremental de entre aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas o un período de tiempo incremental mayor que 24 horas) durante el período de cultivo se puede aumentar (p. ej., gradualmente o a través de aumentos escalonados) durante el período de cultivo de un volumen que está entre 0,5 % a aproximadamente 20 % del volumen del biorreactor o el volumen del primer medio de cultivo líquido a aproximadamente 25 % a aproximadamente 150 % del volumen del biorreactor o el volumen del primer medio de cultivo líquido. La velocidad en la que se agrega el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido (volumen/unidad de tiempo) puede ser aproximadamente la misma durante todo o parte del período de cultivo.

Los expertos apreciarán que el primer medio de cultivo líquido y el segundo medio de cultivo líquido descritos puede ser el mismo tipo de medios. En otras instancias, el primer medio de cultivo líquido y el segundo medio de cultivo líquido pueden ser diferentes. El volumen del segundo medio de cultivo líquido se puede agregar al primer medio de cultivo líquido de forma automatizada, p. ej., mediante bomba de perfusión.

En algunas instancias, agregar al primer medio de cultivo líquido un segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido no se produce dentro de al menos 1 hora (p. ej., dentro de 2 horas, dentro de 3 horas, dentro de 4 horas, dentro de 5 horas, dentro de 6 horas, dentro de 7 horas, dentro de 8 horas, dentro de 9 horas, dentro de 10 horas, dentro de 12 horas, dentro de 14 horas, dentro de 16 horas, dentro de 18 horas, dentro de 24 horas, dentro de 36 horas, dentro de 48 horas, dentro de 72 horas, dentro de 96 horas o después de 96 horas) después de la siembra del biorreactor con una célula de mamífero. El medio de cultivo en cultivos alimentados por lotes típicamente se cosecha al finalizar el período de cultivo y se usa en cualquiera de los procesos descritos en la presente memoria, sin embargo, el medio de cultivo celular en cultivos alimentados por lotes también se puede cosechar en uno o más puntos de tiempo durante el período de cultivo y usarse en cualquiera de los procesos descritos en la presente memoria.

Los expertos apreciarán que cualesquiera de los diversos parámetros de cultivo (p. ej., contenedores, volúmenes, velocidades o frecuencias de reemplazo de volúmenes de cultivo, frecuencias de agitación, temperaturas, medios y concentraciones de CO2) se pueden usar en cualquier combinación para llevar a cabo estos métodos. Además, cualesquiera de las células de mamífero descritas en la presente memoria o conocidas en la técnica se pueden usar para producir una proteína recombinante.

Sistemas de fabricación biológica ilustrativos

Los ejemplos de sistemas de fabricación biológica útiles para llevar a cabo los procesos descritos en la presente memoria y que incluyen un MCCS o un MCCS1 y MCCS2 se describen en las solicitudes de patente provisionales de los Estados Unidos núms. de serie 61/775.060 and 61/856.390. En estos sistemas ilustrativos, está presente al menos una (p. ej., al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis) columna de cromatografía que incluye una resina de cromatografía irradiada con gamma en el MCCS o en el MCCS1 y/o MCCS2. Por ejemplo, el sistema entero puede incluir un total de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve o veinte columnas de cromatografía que incluyen una resina de cromatografía irradiada con gamma. Por ejemplo, el MCCS, MCCS1 y/o MCCS2 pueden (o pueden incluir cada uno) una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez columnas de cromatografía que incluyen una resina de cromatografía irradiada con gamma.

Por ejemplo, sistemas útiles pueden incluir un MCCS1 que incluye una entrada y un MCCS2 que incluye una salida, o un MCCS que incluye una entrada y una salida. En algunas realizaciones, el MCCS1 y MCCS2 están en comunicación continua entre sí. Estos sistemas también se pueden configurar de manera que el fluido se pueda pasar por la entrada, a través del MCCS 1 y el MCCS2, y salir de la salida de fabricación a través de la salida. Estos sistemas proporcionan la producción continua y eficaz en términos del tiempo de una sustancia farmacéutica terapéutica a partir de un medio de cultivo líquido. Por ejemplo, el tiempo transcurrido entre alimentar un fluido (p. ej., un medio de cultivo líquido) que incluye una proteína terapéutica en el MCCS1 y eluir proteína recombinante purificada (p. ej., sustancia farmacéutica de proteína terapéutica) desde la salida del MCCS2 puede estar, p. ej., entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 48 horas, inclusive.

Algunos sistemas ilustrativos no incluyen un tanque de separación. En otros, el sistema puede incluir un máximo de 1, 2, 3, 4 o 5 tanque(s) de separación en todo el sistema (p. ej., donde cada tanque de separación solo retiene una proteína terapéutica durante un período de tiempo total de, p. ej., entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 6 horas, inclusive). El(los) tanque(s) de separación puede(n) tener una capacidad que está entre 1 mL y aproximadamente 300 mL, inclusive. Cualquier tanque(s) de separación dispuesto(s) en el sistema de manera que el fluido ingrese al tanque(s) de separación antes de ingresar a MCCS1 o MCCS puede tener una capacidad que está entre 1 mL y aproximadamente 100 %, inclusive, del volumen de carga de la primera columna del MCCS1 o MCCS, respectivamente. Cualquier tanques(s) de separación dispuesto(s) en el sistema de manera que el fluido ingrese al tanque(s) de separación antes de ingresar a MCCS2 (y después de salir del MCCS1) puede tener una capacidad que está, p. ej., entre 1 mL y aproximadamente 100 %, inclusive, del volumen de carga de la primera columna del MCCS2.

Estructuras y características del sistema ilustrativas adicionales

El MCCS o MCCS1 puede incluir una entrada a través de la cual se puede pasar fluido (p. ej., un medio de cultivo líquido que está sustancialmente libre de células) al MCCS o MCCS1, respectivamente. La entrada puede ser cualquier estructura conocida en la técnica para dichos fines. Puede incluir, p. ej., una rosca, nervadura o un sello que permite que se inserte un conducto de fluido, de manera que después de la inserción del conducto de fluido en la entrada, ingresará fluido al MCCS o MCCS1 a través de la entrada sin infiltración significativa de fluido fuera de la entrada. Las entradas no limitantes que se pueden usar en los presentes sistemas se conocen y aquellos en la técnica las comprenderían.

El MCCS o MCCS1 puede incluir al menos dos columnas de cromatografía, al menos dos membranas cromatográficas, o al menos una columna de cromatografía y al menos una membrana cromatográfica y una entrada. El MCCS o MCCS1 puede ser cualquiera de los MCCS ilustrativos descritos en la presente memoria, o puede tener una o más de cualquiera de las características ilustrativas de un MCCS (en cualquier combinación) descritas en la presente memoria. La(s) columna(s) de cromatografía y/o la(s) membrana(s) cromatográfica(s) presentes en el MCCS o MCCS1 pueden tener uno o más de cualquiera de las formas, tamaños, volúmenes (volúmenes de lecho) y/u operación(es) de unidad ilustrativos descritos en la presente memoria.

La(s) columna(s) de cromatografía y/o la(s) membrana(s) cromatográfica(s) presentes en el MCCS o MCCS1 pueden incluir una o más de cualquiera de las resinas ilustrativas descritas en la presente memoria o conocidas en la técnica. Por ejemplo, la resina incluida en una o más de la(s) columna(s) de cromatografía y/o membrana(s) cromatográfica(s) presentes en el MCCS o MCCS1 puede ser una resina que utiliza un mecanismo de captura (p. ej., mecanismo de captura de unión a proteína A, mecanismo de captura de unión a proteína G, mecanismo de captura de unión a anticuerpo o fragmento de anticuerpo, mecanismo de captura de unión a sustrato, mecanismo de captura de unión a cofactor, un mecanismo de captura de unión a aptámero y/o un mecanismo de captura de unión a identificador). La resina incluida en una o más de la(s) columna(s) de cromatografía y/o membrana(s) cromatográfica(s) del MCCS o MCCS 1 puede ser una resina de intercambio catiónico, una resina de intercambio aniónico, una resina de tamiz molecular o una resina de interacción hidrófoba, o cualquier combinación de estas. Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de resinas que se pueden usar para purificar una proteína recombinante y se pueden incluir en una o más de la(s) columna(s) de cromatografía y/o membrana(s) cromatográfica(s) presentes en el MCCS o MCCS1. La(s) columna(s) de cromatografía y/o la(s) membrana(s) cromatográfica(s) presentes en el MCCS o MCCS1 pueden incluir la misma y/o resinas diferentes (p. ej., cualquiera de las resinas descritas en la presente memoria o conocidas en la técnica para usar purificación de la proteína recombinante) .

Las dos o más columna(s) de cromatografía y/o resina(s) cromatográfica(s) presentes en el MCCS o MCCS1 pueden llevar a cabo una o más de las operaciones de unidad (p. ej., capturar una proteína recombinante, purificar una proteína recombinante, refinar una proteína recombinante, inactivar virus, ajustar la concentración iónica y/o el pH de un fluido que incluye la proteína recombinante, o filtrar un fluido que incluye una proteína recombinante). En ejemplos no limitantes, el MCCS o MCCS1 puede llevar a cabo las operaciones de unidad de capturar una proteína recombinante a partir de un fluido (p. ej., un medio de cultivo líquido) e inactivar virus presente en el fluido que incluye la proteína recombinante. El MCCS o MCCS1 puede llevar a cabo cualesquiera combinaciones de dos o más operaciones de unidad descritas en la presente memoria o conocidas en la técnica.

La(s) columna(s) de cromatografía y/o membrana(s) cromatográfica(s) presentes en el MCCS o MCCS 1 se pueden conectar o mover entre sí mediante un mecanismo de conmutación (p. ej., un mecanismo de conmutación de columna). El MCCS o MCCS1 también puede incluir una o más (p. ej., dos, tres, cuatro o cinco) bombas (p. ej., automatizas, p. ej., bombas peristálticas automatizadas). Los eventos de conmutación de columna se pueden activar por la detección de un nivel de proteína recombinante detectado por absorbancia UV correspondiente a un cierto nivel de proteína recombinante en el fluido que pasa a través del MCCS o MCCS1 (p. ej., la enteada en y/o eluato desde una o más de la(s) columna(s) de cromatografía y/o membrana(s) cromatográfica(s) en el MCCS o MCCS1), un volumen de líquido específico (p. ej., tampón) o tiempo transcurrido específico. La conmutación de columnas generalmente significa un mecanismo por el cual se permite que al menos dos columnas de cromatografía y/o membranas cromatográficas diferentes en un MCCS o MCCS1 (p. ej., dos o más columnas de cromatografía y/o membranas cromatográficas diferentes presentes en el MCCS1 o MCCS2) pasen a través de una etapa diferente (p. ej., equilibrio, carga, elución o lavado) sustancialmente al mismo tiempo durante al menos parte del proceso.

El MCCS o MCCS1 puede ser un sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS). Por ejemplo, el PCCS que es el MCCS o MCCS1 (es decir, PCCS o PCCS1, respectivamente) puede incluir cuatro columnas de cromatografía, donde las primeras tres columnas llevan a cabo la operación de unidad de capturar una proteína recombinante a partir de un fluido (p. ej., un medio de cultivo líquido) y la cuarta columna del PCCS lleva a cabo la operación de unidad de inactivar virus en el fluido que incluye la proteína recombinante. Un PCCS que es el MCCS o MCCS1 puede utilizar un mecanismo de conmutación de columnas. El sistema de PCC puede utilizar un sistema ÁKTA modificado (GE Healthcare, Piscataway, NJ) capaz de ejecutar hasta, p. ej., cuatro, cinco, seis, siete u ocho columnas, o más.

El MCCS o MCCS1 se puede equipar con: una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) monitores de UV, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) válvulas, uno o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) medidores de pH y/o uno o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) medidores de conductividad. El MCCS o MCCS1 también se puede equipar con un sistema operativo que utiliza un programa informático (p. ej., el programa informático basado en Unicorn, GE Healthcare, Piscataway, NJ) para detectar cuando se produce una conmutación de columna (p. ej., en función de la absorbancia de UV, volumen de líquido o tiempo transcurrido) y afectar los eventos de conmutación de columna (activación).

El MCCS o MCCS1 puede incluir, además, uno o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés o veinticuatro) reservorio(s) de ajuste de tampón y/o un reservorio(s) de tampón integral(es). En otros ejemplos, el MCCS o MCCS1 puede incluir uno o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco o seis) tanques de separación que pueden retener fluido que no puede pasar fácilmente a una o más de las columnas de cromatografía y/o membranas cromatográficas en el MCCS o MCCS1. Los sistemas descritos en la presente memoria pueden incluir uno o más tanques de separación (p. ej., un tanque de separación descrito en la presente memoria) en el MCCS, MCCS1 y/o MCCS2. Otros ejemplos de los sistemas descritos en la presente memoria no incluyen un tanque de separación en el MCCS, MCCS1 o MCCS2, o no incluyen un tanque de separación en todo el sistema. Otros ejemplos de sistemas descritos en la presente memoria incluyen un máximo de uno, dos, tres, cuatro o cinco tanque(s) de separación (p. ej., cualquier tanque(s) de separación descrito en la presente memoria) en todo el sistema.

Segundo MCCS

El segundo MCCS (MCCS2) en los sistemas ilustrativos incluye al menos dos columnas de cromatografía, al menos dos membranas cromatográficas, o al menos una columna(s) de cromatografía y al menos una membrana(s) cromatográfica(s) y una salida. El MCCS2 puede ser cualquiera de los MCCS ilustrativos descritos en la presente memoria, o puede tener una o más de cualquiera de las características ilustrativas de un MCCS (en cualquier combinación) descritas en la presente memoria. La(s) columna(s) de cromatografía y/o la(s) membrana(s) cromatográfica(s) presentes en el MCCS2 pueden tener uno o más de: cualquiera de las formas, tamaños, volúmenes (volúmenes de lecho) y/u operaciones de unidad descritos en la presente memoria. La(s) columna(s) de cromatografía y/o la(s) membrana(s) cromatográfica(s) pueden incluir cualquiera de las resinas ilustrativas descritas en la presente memoria o conocidas en la técnica. Por ejemplo, la resina incluida en una o más de la(s) columna(s) de cromatografía y/o membrana(s) cromatográfica(s) presentes en el MCCS2 puede ser una resina que utiliza un mecanismo de captura (p. ej., mecanismo de captura de unión a proteína A, mecanismo de captura de unión a proteína G, mecanismo de captura de unión a anticuerpo o fragmento de anticuerpo, mecanismo de captura de unión a sustrato, mecanismo de captura de unión a cofactor, un mecanismo de captura de unión a identificador y/o un mecanismo de captura de unión a aptámero). Las resinas útiles incluyen, p. ej., una resina de intercambio catiónico, una resina de intercambio aniónico, una resina de tamiz molecular y una resina de interacción hidrófoba. Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de resinas. La(s) columna(s) de cromatografía y/o la(s) membrana(s) cromatográfica(s) presentes en el MCCS2 pueden incluir la misma y/o resinas diferentes (p. ej., cualquiera de las resinas descritas en la presente memoria o conocidas en la técnica para usar purificación de la proteína recombinante) .

La(s) columna(s) de cromatografía y/o la(s) membrana(s) cromatográfica(s) presentes en el MCCS2 pueden llevar a cabo una o más operaciones de unidad (p. ej., cualquiera de las operaciones de unidad descritas en la presente memoria o cualquier combinación de las operaciones de unidad descritas en la presente memoria). En ejemplos no limitantes, el MCCS2 puede llevar a cabo las operaciones de unidad de purificar una proteína recombinante a partir de un fluido y refinar la proteína recombinante presente en el fluido que incluye la proteína recombinante. En otros ejemplos no limitantes, el MCCS2 puede llevar a cabo las operaciones de unidad de purificar una proteína recombinante presente en un fluido, refinar una proteína recombinante presente en un fluido y filtrar un fluido que incluye una proteína recombinante. En otro ejemplo, el MCCS2 puede llevar a cabo las operaciones de unidad de purificar una proteína recombinante presente en un fluido, refinar una proteína recombinante presente en un fluido, filtrar un fluido que incluye una proteína recombinante y ajustar la concentración iónica y/o el pH de un fluido que incluye una proteína recombinante. El MCCS2 puede llevar a cabo cualquiera combinación de dos o más operaciones de unidad descritas en la presente memoria o conocidas en la técnica.

La(s) columna(s) de cromatografía y/o membrana(s) cromatográfica(s) presentes en el MCCS2 se pueden conectar o mover entre sí mediante un mecanismo de conmutación (p. ej., un mecanismo de conmutación de columna). El MCCS2 también puede incluir una o más (p. ej., dos, tres, cuatro o cinco) bombas (p. ej., automatizas, p. ej., bombas peristálticas automatizadas). Los eventos de conmutación de columna se pueden activar por la detección de un nivel de proteína recombinante detectado por absorbancia UV correspondiente a un cierto nivel de proteína recombinante en el fluido que pasa a través del MCCS2 (p. ej., la enteada en y/o eluato desde una o más de la(s) columna(s) de cromatografía y/o membrana(s) cromatográfica(s) en el MCCS2), un volumen de líquido específico (p. ej., tampón) o tiempo transcurrido específico.

El MCCS2 puede ser un sistema de cromatografía en contracorriente periódica (es decir, PCCS2). Por ejemplo, el PCCS2 puede incluir tres columnas que llevan a cabo la operación de unidad de purificar una proteína recombinante presente en un fluido y una membrana cromatográfica que lleva a cabo la operación de unidad de refinar una proteína recombinante presente en un fluido. Por ejemplo, las tres columnas que llevan a cabo la operación de unidad de purificar una proteína recombinante presente en un fluido pueden incluir, p. ej., una resina de intercambio catiónico y una membrana cromatográfica que lleva a cabo la operación de unidad de refinar puede incluir una resina de intercambio catiónico. Un PCCS2 puede utilizar un mecanismo de conmutación de columnas. El PCCS2 puede utilizar un sistema ÁKTA modificado (GE Healthcare, Piscataway, NJ) capaz de ejecutar hasta, p. ej., cuatro, cinco, seis, siete u ocho columnas, o más.

El MCCS2 se puede equipar con: una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) monitores de UV, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) válvulas, uno o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) medidores de pH y/o uno o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) medidores de conductividad. El MCCS2 también se puede equipar con un sistema operativo que utiliza un programa informático (p. ej., el programa informático basado en Unicorn, GE Healthcare, Piscataway, NJ) para detectar cuando se produce un evento de conmutación de columna (p. ej., en función de la absorbancia de UV, volumen de líquido o tiempo transcurrido) y afectar los eventos de conmutación de columna.

El MCCS2 puede incluir, además, uno o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés o veinticuatro) reservorio(s) de ajuste de tampón y/o un reservorio(s) de tampón integral(es). En otros ejemplos, el MCCS2 puede incluir uno o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco o seis) tanques de separación (p. ej., cualquiera de los tanques de separación descritos en la presente memoria) que pueden retener fluido que no puede pasar fácilmente a una o más de las columnas de cromatografía y/o membranas cromatográficas en el MCCS2.

El MCCS2 incluye una salida a través de la cual puede salir del sistema la sustancia farmacéutica de proteína terapéutica. La salida puede incluir, p. ej., una rosca, nervadura o un sello que permite insertar un conducto de fluido o un vial diseñado para retener o almacenar la proteína recombinante purificada (p. ej., sustancia farmacéutica de proteína terapéutica). Una salida puede incluir una superficie que se puede usar para sellar un vial de grado de contaminación microbiana reducido u otro contenedor de almacenamiento de ese tipo en la salida para permitir que la proteína recombinante purificada (p. ej., la sustancia farmacéutica de proteína terapéutica) fluya directamente hacia el vial o contenedor de almacenamiento de grado de contaminación microbiana reducido. Las salidas no limitantes que se pueden usar en los presentes sistemas se conocen y aquellos en la técnica las comprenderían.

Los sistemas descritos en la presente memoria también pueden incluir un conducto de fluido que está dispuesto entre el MCCS1 y el MCCS2. Cualquiera de los conductos de fluido descritos en la presente memoria puede ser, p. ej., un tubo hecho de, p. ej., polietileno, policarbonato o plástico. El conducto de fluido dispuesto entre el MCCS1 y el MCCS2 puede incluir, además, uno o más de los siguientes en cualquier combinación: uno o más reservorios de ajuste de tampón integrales que están en comunicación continua con el conducto de fluido y están posicionados de manera que el tampón almacenado dentro del(de los) reservorio(s) de ajuste de tampón integral(es) se agrega al fluido presente en el conducto de fluido; un tanque de separación (p. ej., cualquiera del tanque(s) de separación descrito(s) en la presente memoria) que está en comunicación continua con el conducto de fluido y se posiciona de manera que pueda retener cualquier exceso de fluido presente en el conducto de fluido que es incapaz de alimentar sin inconvenientes en el MCCS2; y uno o más filtros que se disponen en el conducto de fluido de manera que sean capaces de filtrar (p. ej., extraer bacterias) el fluido presente en el conducto de fluido. Cualquiera de los reservorios de ajuste de tampón integrales puede incluir, p. ej., un volumen de entre aproximadamente 0,5 L a 50 L de tampón (p. ej., a una temperatura a o por debajo de 25 °C, 15 ° C o 10 °C).

Los sistemas descritos en la presente memoria opcionalmente incluyen un conducto de fluido dispuesto entre la columna de cromatografía o membrana cromatográfica final en el MCCS2 y la salida. Los sistemas descritos en la presente memoria pueden incluir, además, uno o más filtros en conexión continua con el conducto de fluido dispuesto entre la columna de cromatografía o membrana cromatográfica final en el MCCS2 y la salida, de manera que el filtro puede extraer, p. ej., material precipitado, materia particulada o bacterias del fluido presente en el conducto de fluido dispuesto entre la columna de cromatografía o membrana cromatográfica final en el MCCS2 y la salida.

Algunos ejemplos de los sistemas descritos en la presente memoria también incluyen un biorreactor que tiene conectividad continua con la entrada del MCCS o MCCS1. Cualesquiera de los biorreactores ilustrativos descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica se pueden usar en los presentes sistemas.

Algunos ejemplos de los sistemas descritos en la presente memoria también incluyen un sistema de bomba. Un sistema de bomba puede incluir uno o más de los siguientes: una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) bombas (p. ej., cualquiera de las bombas descritas en la presente memoria o conocidas en la técnica), uno o más (p. ej., dos, tres, cuatro o cinco) filtros (p. ej., cualquiera de los filtros descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica), uno o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) detectores de UV y uno o más (p. ej., dos, tres, cuatro o cinco) tanques de separación (p. ej., cualquiera de los tanques de separación descritos en la presente memoria). Algunos ejemplos de los sistemas descritos en la presente memoria incluyen, además, un conducto de fluido dispuesto entre la bomba y la entrada del MCCS o MCCS1 (p. ej., cualquiera de los conductos de fluido ilustrativos descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica). En algunos ejemplos, este conducto de fluido particular puede incluir una o más (p. ej., dos, tres o cuatro) bombas (p. ej., cualquiera de las bombas descritas en la presente memoria o conocidas en la técnica) y/o uno o más (p. ej., dos, tres o cuatro) tanques de separación (p. ej., cualquiera de los tanques de separación ilustrativos descritos en la presente memoria), donde esta(s) bomba(s) y/o tanque(s) de separación está(n) en conexión continua con el fluido presente en el conducto de fluido.

Algunos ejemplos de los sistemas descritos en la presente memoria incluyen, además, un conducto de fluido adicional conectado al conducto de fluido entre la bomba y la entrada, donde un extremo del conducto de fluido adicional está conectado de manera continua con un biorreactor y el otro extremo está conectado de manera continua con el conducto de fluido entre la bomba y la entrada. Este conducto de fluido adicional puede incluir un filtro que es capaz de extraer células del medio de cultivo líquido extraído desde el biorreactor (p. ej., sistema de retención celular ATF).

Los sistemas descritos en la presente memoria permiten la producción continua de una proteína recombinante purificada (p. ej., la sustancia farmacéutica de proteína terapéutica). Como se conoce en la técnica, los sistemas pueden proporcionar la elución periódica de una proteína recombinante purificada (p. ej., la sustancia farmacéutica de proteína terapéutica). Los sistemas descritos en la presente memoria también pueden dar como resultado un rendimiento neto de proteína recombinante purificada (p. ej., sustancia farmacéutica de proteína terapéutica) de al menos aproximadamente 5 g/día, al menos aproximadamente 10 g/día, al menos aproximadamente 15 g/día, al menos aproximadamente 20 g/día, al menos aproximadamente 30 g/día o al menos aproximadamente 40 g/día durante un período continuo de al menos aproximadamente 5 días, al menos aproximadamente 10 días, al menos aproximadamente 15 días, al menos aproximadamente 20 días, al menos aproximadamente 25 días, al menos aproximadamente 30 días, al menos aproximadamente 40 días, al menos aproximadamente 50 días, al menos aproximadamente 60 días, al menos aproximadamente 70 días, al menos aproximadamente 80 días, al menos aproximadamente 90 días o al menos aproximadamente 100 días.

La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1. Efecto de la irradiación gamma sobre la capacidad de unión de la resina de cromatografía en t0

Se llevó a cabo un conjunto de experimentos para estudiar el efecto de la irradiación gamma sobre la capacidad de unión de una resina de cromatografía bimodal que tiene propiedades de intercambio aniónico e hidrófobas (resina AE). La resina AE usada en estos experimentos fue Capto Adhere (GE Healthcare Life Sciences), que tiene un ligando de N-bencil-N-metiletanolamina, un tamaño de partícula promedio de 75 Tm y una capacidad iónica de 0,09 - 0,12 mmol Cl-1/mL de medio. La resina AE se dejó sin tratar (virgen) o se trató para reducir el grado de contaminación microbiana de la resina (se expuso a 25 kGy de irradiación gamma). La irradiación se llevó a cabo al usar 0,2 mL de resina suspendida en fosfato sódico 50 mM, pH 7,0.

La cantidad de proteína (Fabrazyme®) unida a la resina AE no tratada (en el medio de cultivo líquido) y la resina AE irradiada con gamma a 25 kGy en t0 (sin pasadas de cromatografía) se determinó en diferentes concentraciones de proteína diana (Fabrazyme®). La Figura 1 muestra las isotermas de unión en t0 para la resina AE no tratada e irradiada con gamma a 25 kGy. Estos datos muestran que la unión de la proteína diana no cambia después de la irradiación gamma de la resina en t0.

Ejemplo 2. Efecto de la irradiación gamma sobre la capacidad de unión de la resina de cromatografía a lo largo de múltiples ciclos y uso de tampones desnaturalizantes para m itigar la pérdida de la capacidad de unión

Se llevaron a cabo experimentos para evaluar el efecto de la irradiación gamma sobre la capacidad de unión de la resina de cromatografía a lo largo de múltiples ciclos. En la cromatografía de multicolumna, cada una de las columnas usadas se carga con proteína (Fabrazyme® en medio de cultivo líquido) hasta su capacidad de unión. El equilibrio y lavado de la columna se llevó a cabo con MES 20 mM (ácido 2-(W-morfolino)etanosulfónico), pH 7,0. Se usó tampón de elución, arginina 200 mM, MES 270 mM, etilenglicol al 20 %, pH 7,5 para eluir la proteína unida de las columnas. Para evaluar el desempeño de la resina de cromatografía irradiada con gamma a lo largo de toda su vida útil en este Ejemplo, se ciclaron columnas que contenían resina AE no tratada o resina de cromatografía irradiada con gamma a 25 kGy (preparada como se describe en el Ejemplo 1) al usar un sistema de cromatografía de multicolumna (MCCS) o se usaron columnas simples para llevar a cabo ciclos repetidos de cromatografía en condiciones que imitan las condiciones de un MCCS (cada columna se cargó hasta su capacidad de unión estática, antes de llevar a cabo el lavado y la elución). Cada una de las etapas de lavado y elución en los experimentos descritos en este Ejemplo se llevaron a cabo de manera escalonada.

Se llevaron a cabo múltiples ciclos de cromatografía en columna al usar una columna de cromatografía simple que incluía la resina AE (resina virgen, irradiada con gamma a 15 kGy o irradiada con gamma a 25 kGy) y un tampón de lavado de arginina 700 mM, acetato 100 mM (pH 3,0) y posteriormente una disolución de NaOH 1 N (después de la elución de la proteína recombinante) en cada ciclo. Se determinó el porcentaje de capacidad de unión normalizado (en comparación con la resina no tratada (virgen) en t0) a lo largo de múltiples ciclos. Los datos de estos experimentos muestran que, aunque la capacidad de unión para la resina no tratada e irradiada con gamma son similares en t0, la capacidad de unión de la resina no tratada e irradiada con gamma muestra una tasa de disminución diferente en la capacidad de unión a lo largo de múltiples ciclos de cromatografía (Figura 2). Mientras la resina virgen muestra una disminución en la capacidad de unión a lo largo de múltiples ciclos de cromatografía, la resina irradiada con gamma muestra una disminución más pronunciada en la capacidad de unión a lo largo de múltiples ciclos de cromatografía (Figura 2). La tasa calculada de caída en la capacidad de unión para cada resina en este conjunto de experimentos también se muestra en la Figura 3. Estos datos demuestran que el uso de irradiación gamma para reducir el grado de contaminación microbiana de la cromatografía resulta en una disminución en la capacidad de unión de la resina que se vuelve progresivamente peor a lo largo de múltiples ciclos de cromatografía.

Se llevaron a cabo conjuntos de experimentos para determinar si se podría usar una variedad de tampones desnaturalizantes para recuperar la capacidad de unión perdida de la resina de cromatografía irradiada con gamma. En estos experimentos, se llevaron a cabo ciclos de cromatografía al usar la resina AE virgen (sin tratar) con un tampón de lavado de arginina 700 mM, acetato 100 mM (pH 3,0) y posteriormente una disolución de NaOH 1 N (arginina de pH bajo). También se llevaron a cabo ciclos de cromatografía al usar resina irradiada con gamma a 25 kGy con una de las siguientes combinaciones de tampones para lavar la resina después de la elución de la proteína recombinante en cada ciclo: urea 8 M, NaCl 1 M, ácido cítrico 0,1 M, pH 2,5, posteriormente una disolución de NaOH 1N (urea de pH bajo); HCl de guanidina 6 M (pH 2,5), posteriormente una disolución de NaOH 1N (o NaOH 1 M NaCl 1M) (guanidina de pH bajo); Triton-X 100 al 0,5 % en ácido acético 0,1 M (pH 2,5), posteriormente disolución de ácido acético 0,7 M, etanol al 20 %, etilenglicol al 50 % (pH 2,5), posteriormente una disolución de NaOH 1N (Triton de pH bajo); ácido acético 0,7 M, etanol al 20 %, etilenglicol al 50 % (pH 2,5) (orgánico de pH bajo), posteriormente una disolución de NaOH 1N (pH bajo orgánico); o arginina 700 mM, acetato 100 mM (pH 3,0), posteriormente una disolución de NaOH 1N (arginina de pH bajo). Se determinaron el porcentaje de capacidad de unión normalizado (normalizado con respecto a la capacidad de unión de la resina virgen (no tratada) en t = 0), el porcentaje de recuperación de proteína recombinante (con respecto a la cantidad de proteína recombinante presente en el fluido cargado en la resina) por ciclo y los niveles de proteína de célula hospedante (ng/mg) presentes en el eluato por ciclo. Los datos en la Figura 4 muestran que todos los tampones desnaturalizantes fueron capaces de mitigar la pérdida en la capacidad de unión de la resina de cromatografía irradiada con gamma, excepto ácido acético 0,7 M, etanol al 20 %, etilenglicol al 50 % (pH 2,5) y arginina 700 mM, acetato 100 mM (pH 3,0). Los datos en la Figura 4 muestran que todos los tampones desnaturalizantes, excepto 0,7 M ácido acético, etanol al 20 %, etilenglicol al 50 % (pH 2,5) y arginina 700 mM, acetato 100 mM (pH 3,0), fueron capaces de limpiar de manera eficaz la resina de cromatografía irradiada con gamma y mantener la capacidad de unión de la resina de cromatografía irradiada con gamma a lo largo de múltiples ciclos de cromatografía.

Los datos en la Figura 6 muestran que todos los tampones desnaturalizantes evaluados dieron como resultado un porcentaje de recuperación constante de la proteína recombinante unida a la resina de cromatografía irradiada con gamma por ciclo en múltiples ciclos. Los datos en la Figura 6 muestran que cada uno de los tampones desnaturalizantes evaluados fue capaz de recuperar cualquier cantidad de proteína unida a la resina de cromatografía irradiada con gamma por ciclo de manera similar. Los datos en la Figura 7 muestran que el uso de los diversos tampones desnaturalizantes evaluados dio como resultado niveles aceptables de proteína de célula hospedante en el eluato de proteína recombinante en cada ciclo.

Se cree que el tampón desnaturalizante usado en cada ciclo recuperó la capacidad de unión de la resina de cromatografía irradiada con gamma al liberar proteínas unidad estrechamente de la resina. Se registraron cromatógrafos representativos de múltiples ciclos de cromatografía llevados a cabo al usar tres columnas de cromatografía que incluían resina AE irradiada con gamma a 25 kGy, lavada con urea 8 M, 1 M NaCl, 0,1 M ácido cítrico, pH 2,5 y una disolución de NaOH 1 N después de la elución de la proteína recombinante (después de cada ciclo) (Figura 5). Los cromatógrafos muestran que el tratamiento con el tampón desnaturalizante de la resina irradiada con gamma dio como resultado la liberación de una cantidad sustancialmente igual de proteína desde la resina irradiada con gamma en cada una de las tres columnas de cromatografía a lo largo de múltiples ciclos (ver flechas en la Figura 5).

En resumen, estos datos muestran que se pueden usar diferentes tampones desnaturalizantes para recuperar la capacidad de unión de la resina de cromatografía irradiada con gamma para lograr el desempeño esperado.

Otras realizaciones

Se entenderá que, aunque la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de esta, se pretende que la descripción anterior ilustre y no limite el alcance de la invención, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para llevar a cabo la cromatografía con una resina de cromatografía de intercambio aniónico irradiada con gamma, que comprende:

(a) proporcionar una columna de cromatografía que contiene una resina de cromatografía de intercambio aniónico irradiada con gamma;

(b) llevar a cabo un primer ciclo de cromatografía a través de la columna, en donde el primer ciclo de cromatografía comprende recuperar la capacidad de unión de la resina de cromatografía de intercambio aniónico irradiada con gamma al exponer la resina de cromatografía de intercambio aniónica irradiada con gamma a un tampón desnaturalizante; y

(c) llevar a cabo al menos un ciclo adicional de cromatografía a través de la columna,

en donde llevar a cabo cada uno del al menos un ciclo adicional de cromatografía comprende recuperar la capacidad de unión de la resina de cromatografía de intercambio aniónico irradiada con gamma al exponer la resina de cromatografía de intercambio aniónica irradiada con gamma a un tampón desnaturalizante, en donde el tampón desnaturalizante comprende uno o más de urea, clorhidrato de guanidina y Triton™ X-100.

2. El método de la reivindicación 1, en donde llevar a cabo el primer ciclo de cromatografía en la etapa (b) y/o el al menos un ciclo adicional de cromatografía en la etapa (c) comprende las etapas de:

(a) capturar una proteína recombinante al exponer la resina de cromatografía de intercambio aniónico irradiada con gamma con un líquido que contiene una proteína recombinante;

(b) lavar la resina de cromatografía de intercambio aniónico irradiada con gamma al exponer la resina de cromatografía de intercambio aniónico irradiada con gamma con un tampón de lavado;

(c) eluir la proteína recombinante al exponer la resina de cromatografía de intercambio aniónico irradiada con gamma con un tampón de elución; y

(d) recuperar la capacidad de unión de la resina de cromatografía de intercambio aniónico irradiada con gamma al exponer la resina de cromatografía de intercambio aniónico irradiada con gamma al tampón desnaturalizante.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el líquido que contiene una proteína recombinante es un medio de cultivo líquido.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el primer ciclo de cromatografía en la etapa (b) y el al menos un ciclo adicional de cromatografía en la etapa (c) se llevan a cabo al usar un sistema cerrado e integrado.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el tampón desnaturalizante tiene un nivel de garantía de esterilidad de aproximadamente o menor que 1 x 10-6.

6. El método de la reivindicación 1, en donde el primer ciclo de cromatografía de la etapa (b) comprende, además, después de exponer la resina de cromatografía de intercambio aniónico irradiada con gamma al tampón desnaturalizante, exponer la resina de cromatografía de intercambio aniónica irradiada con gamma a un tampón de lavado que comprende hidróxido de sodio a aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1,5 M.

7. El método de la reivindicación 1, en donde la columna es parte de un sistema de cromatografía de multicolumna (MCCS), p. ej., un sistema de cromatografía en contracorriente periódica (PCCS).

8. El método de la reivindicación 1, en donde la resina de cromatografía de intercambio aniónica irradiada con gamma se ha tratado con una dosis de irradiación gamma de aproximadamente 10 kGy a aproximadamente 40 kGy.

9. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa (c) comprende llevar a cabo cuatro o más ciclos adicionales de cromatografía.

10. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa (c) se lleva a cabo de manera continua durante un período de al menos 4 días.

11. Un proceso integrado, cerrado y continuo para fabricar una proteína recombinante purificada que comprende: (a) proporcionar un medio de cultivo líquido que comprende una proteína recombinante que está sustancialmente libre de células; y

(b) alimentar de manera continua el medio de cultivo líquido en un sistema de cromatografía de multicolumna (MCCS) que comprende al menos una columna de cromatografía que contiene una resina de cromatografía de intercambio aniónico irradiada con gamma y llevar a cabo al menos dos ciclos de cromatografía con la al menos una columna de cromatografía, en donde la al menos una columna de cromatografía se expone a un tampón desnaturalizante durante cada uno de los al menos dos ciclos de cromatografía;

en donde el tampón desnaturalizante tiene un nivel de garantía de esterilidad de aproximadamente o menor que 1 x 10-6 y comprende uno o más de urea, clorhidrato de guanidina y Triton™ X-100, y el proceso es integrado y se ejecuta de manera continua desde el medio de cultivo líquido a un eluato del MCCS que es la proteína recombinante purificada.

12. El método de la reivindicación 11, en donde, en cada uno de los al menos dos ciclos de cromatografía, después de la exposición de la al menos una columna de cromatografía al tampón desnaturalizante, la al menos una columna de cromatografía se expone a un tampón de lavado que comprende hidróxido de sodio a aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1,5 M.

13. El método de la reivindicación 1 u 11, en donde el tampón desnaturalizante comprende urea a 6 M a 9 M.

14. El método de la reivindicación 1 u 11, en donde el tampón desnaturalizante comprende clorhidrato de guanidina a 5 M a 7 M.

15. El método de la reivindicación 1 u 11, en donde el tampón desnaturalizante comprende Triton™ X-100.

16. El método de la reivindicación 1 u 11, en donde el tampón desnaturalizante se selecciona del grupo que consiste en:

urea 8 M, NaCl 1 M, ácido cítrico 0,1 M, pH 2,5;

clorhidrato de guanidina 6 M, pH 2,5; y

Triton™ X-100 al 0,5 % en ácido acético 0,1 M, pH 2,5.