JP2017501709A - 微生物細胞から微生物油を入手する方法 - Google Patents

微生物細胞から微生物油を入手する方法 Download PDF

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Abstract

本明細書で開示されているのは、１種または複数種の微生物細胞から１種または複数種の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む微生物油を入手するための方法であって、細胞を溶解して溶解細胞組成物を形成し、次いでこの溶解細胞組成物から油を回収することによる方法である。本明細書でさらに開示されているのは、本明細書に記載した少なくとも１つの方法により微生物細胞から回収される、１種または複数種のＰＵＦＡを含む微生物油である。【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明
［関連出願の相互参照］
[0001] 本出願は、２０１３年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／９１８，９５３号明細書の出願日の利益を主張し、上記特許出願の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
［発明の背景］
[0002] 本明細書で開示されているのは、１種または複数種の微生物細胞から１種または複数種の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む微生物油を入手するための方法であって、細胞を溶解して溶解細胞組成物を形成し、次いでこの溶解細胞組成物から油を回収することによる方法である。本明細書でさらに開示されているのは、本明細書に記載した少なくとも１つの方法により微生物細胞から回収される、１種または複数種のＰＵＦＡを含む微生物油である。
[0003] １種または複数種のＰＵＦＡを含む微生物油は、例えば藻類および真菌類等の微生物により産生される。
[0004] 微生物細胞からＰＵＦＡ含有油を入手するための典型的な方法は、所望の油を産生することができる微生物を発酵槽、ポンドまたはバイオリアクタ中で増殖させて微生物細胞バイオマスを製造する工程、バイオマスが増殖した発酵培地からバイオマスを分離する工程、水非混和性有機溶媒（例えばヘキサン）を使用して微生物細胞バイオマスを乾燥させ、乾燥細胞から油を抽出する工程、およびこの油から有機溶媒（例えばヘキサン）を除去する工程を含む。この方法は、細胞バイオマスを含む発酵培地を水で希釈し、続いて遠心分離により希釈発酵培地からバイオマスを分離する工程をさらに含むことができる。
[0005] 微生物細胞からＰＵＦＡ含有油を入手するための別の方法は、所望の油を産生することができる微生物を発酵槽、ポンドまたはバイオリアクタ中で増殖させて微生物細胞バイオマスを製造する工程、機械的力（例えばホモジナイゼーション）、酵素処理または化学処理を使用して細胞壁を破壊することにより、ＰＵＦＡ含有油を細胞が増殖した発酵培地中に放出させる工程、およびイソプロピルアルコール等の水混和性有機溶媒を使用して、結果として生じたＰＵＦＡ含有油、細胞断片および液体を含む組成物から油を回収する工程を含む。この組成物から油を機械的に分離することができ、この油および水性バイオマス廃棄物流の両方からアルコールを除去しなければならない。
[0006] 微生物細胞からＰＵＦＡ含有油を入手するための上記方法のいずれかの工業規模の使用では、大量の揮発性および可燃性有機溶媒を使用する必要があり、そのため、危険な運転条件が生じて高な防爆装置を使用する必要がある。加えて、有機溶媒の使用により有機溶媒廃棄物流が生じ、この有機溶媒廃棄物流は、揮発性有機化合物（ＶＯＣ）排出への厳しい環境規制に対処するために高価な溶媒回収プロセスの実施を必要とし、そのためより多くの人的資源および高価な装置の必要性が生じる。
[0007] さらに、細胞を乾燥させるための、および／または回収した油から溶媒を除去するための上記方法における熱の使用により、ＰＵＦＡ含有油が分解し、かつエネルギー使用量が増大する可能性があり、そのため処理コストがさらに増大する可能性がある。分解は、ＰＵＦＡ含有油が酸素に曝露されている場合、例えば微生物の細胞壁の完全性が崩壊している場合および／または微生物細胞が熱に曝露されている場合に発生する。
[0008] 微生物細胞からＰＵＦＡ含有油を入手するための無溶媒の方法は、所望の油を産生することができる微生物を発酵槽、ポンドまたはバイオリアクタ中で増殖させて微生物細胞バイオマスを製造する工程、機械的力（例えばホモジナイゼーション）、酵素処理または化学処理を使用して細胞壁を破壊することにより、ＰＵＦＡ含有油を細胞が増殖した発酵培地中に放出させる工程、ならびにｐＨを上昇させることにより、塩を加えることにより、加熱することにより、および／または結果として生じたＰＵＦＡ含有油、細胞断片および液体を含む組成物を撹拌することにより、この組成物から粗油を回収する工程を含む。しかしながら、細胞からＰＵＦＡ含有油を入手するためのこの無溶媒の方法は、長期にわたる油回収時間、大量の塩および／または多くの工程を必要とする可能性があり、そのため処理コストが全面的に増大する可能性がある。
[0009] 結果として、揮発性有機溶媒を使用しない、容易に利用可能な装置を使用して実施することができる、必要な工数が最小である、油回収時間がより短い、および高品質のＰＵＦＡ含有油を高収率で生成することができる、微生物細胞から高品質のＰＵＦＡ含有油を入手するための方法が依然として必要とされている。
[0010] 本明細書で開示されているのは、１種または複数種の微生物細胞から１種または複数種の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む微生物油を入手する方法であって、（ａ）微生物油を含む細胞を溶解して溶解細胞組成物を形成する工程、（ｂ）（ａ）の前に、（ａ）の最中にまたは（ａ）の後に乳化剤を添加する工程を含む、溶解細胞組成物を解乳化して解乳化溶解細胞組成物を形成する工程、（ｃ）解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程、および（ｄ）油を回収する工程を含む、方法である。
[0011] 本明細書で開示されているのは、１種または複数種の微生物細胞から１種または複数種の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む微生物油を入手する方法であって、（ａ）微生物油を含む細胞を溶解して溶解細胞組成物を形成する工程、（ｂ）（ａ）の前に、（ａ）の最中にまたは（ａ）の後に乳化剤を添加する工程を含む、溶解細胞組成物を解乳化して解乳化溶解細胞組成物を形成する工程、（ｃ）解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程、および（ｄ）油を回収する工程を含み、（ａ）または（ｂ）の少なくとも一方が、組成物を少なくとも７０℃の温度に加熱する工程をさらに含む、方法である。
[0012] 本明細書で開示されているのは、１種または複数種の微生物細胞から１種または複数種の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む微生物油を入手する方法であって、（ａ）微生物油を含む細胞を溶解して溶解細胞組成物を形成する工程、（ｂ）（ａ）の前に、（ａ）の最中にまたは（ａ）の後に乳化剤を添加し、および溶解細胞組成物のｐＨを８以上に上昇させる工程を含む、溶解細胞組成物を解乳化して解乳化溶解細胞組成物を形成する工程、（ｃ）解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程、ならびに（ｄ）油を回収する工程を含む、方法である。
[0013] 本明細書で開示されているのは、１種または複数種の微生物細胞から１種または複数種の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む微生物油を入手する方法であって、（ａ）微生物油を含む細胞を溶解して溶解細胞組成物を形成する工程、（ｂ）（ａ）の前に、（ａ）の最中にまたは（ａ）の後にイオン性乳化剤を添加する工程を含む、溶解細胞組成物を解乳化して解乳化溶解細胞組成物を形成する工程、（ｃ）解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程、および（ｄ）油を回収する工程を含む、方法である。
[0014] 本明細書で開示されているのは、１種または複数種の微生物細胞から１種または複数種の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む微生物油を入手する方法であって、（ａ）微生物油を含む細胞を溶解して溶解細胞組成物を形成する工程、（ｂ）（ａ）の前に、（ａ）の最中にまたは（ａ）の後にイオン性乳化剤を添加する工程を含む、溶解細胞組成物を解乳化して解乳化溶解細胞組成物を形成する工程、（ｃ）解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程、および（ｄ）油を回収する工程を含み、（ａ）または（ｂ）の少なくとも一方が、組成物を少なくとも７０℃の温度に加熱する工程をさらに含む、方法である。
[0015] 本明細書で開示されているのは、１種または複数種の微生物細胞から１種または複数種の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含む微生物油を入手する方法であって、（ａ）微生物油を含む細胞を溶解して溶解細胞組成物を形成する工程、（ｂ）（ａ）の前に、（ａ）の最中にまたは（ａ）の後にイオン性乳化剤を添加し、および溶解細胞組成物のｐＨを８以上に上昇させる工程を含む、溶解細胞組成物を解乳化して解乳化溶解細胞組成物を形成する工程、（ｃ）解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程、および（ｄ）油を回収する工程を含む、方法である。
[0016] 本明細書で開示されているのは、本明細書に記載した方法のいずれかにより入手される微生物油である。
[0017] 当業者は、下記の詳細な説明を読むことにより本発明の特徴および利点をより容易に理解することができる。明瞭さを理由として、上記に記載されている本発明のいくつかの特徴および下記において別々の実施形態と関連して記載されている本発明のいくつかの特徴を、これらの部分的組み合わせを形成するために組み合わせ得ることが認識されよう。
[0018] 本明細書において代表的とみなされる実施形態は、例示であり限定的ではないことが意図されている。
[0019] 用語「約」は、規定した数字と同じ結果を実質的に達成することができる、規定した数字の上下の変動値を捉えるように意図されている。
[0020] 脂肪酸は、炭素鎖の長さおよび飽和特性に基づいて分類される。微生物油中に存在する脂肪酸は４〜２８個の炭素原子を有することができ、鎖中に存在する炭素の数に基づいて、短鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸または長鎖脂肪酸と命名される。脂肪酸は、炭素原子間に二重結合が存在しない場合には飽和脂肪酸と命名され、二重結合が存在する場合には不飽和脂肪酸と命名される。不飽和の長鎖脂肪酸は、二重結合が１個のみ存在する場合には単価不飽和であり、二重結合が複数存在する場合には多価不飽和である。
[0021] 本明細書に記載した微生物油は、１種または複数種のＰＵＦＡを含み、かつ微生物細胞から入手される油を意味する。
[0022] 多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は脂肪酸のメチル末端からの最初の二重結合の位置に基づいて分類され、ω−３（ｎ−３）脂肪酸は３番目の炭素で最初の二重結合を含み、ω−６（ｎ−６）脂肪酸は６番目の炭素で最初の二重結合を含む。例えば、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、２２個の炭素の鎖長および６個の二重結合を有するω−３の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）であり、「２２：６ｎ−３」と表されることが多い。一実施形態では、ＰＵＦＡは、ω−３脂肪酸、ω−６脂肪酸およびそれらの混合物から選択される。別の実施形態では、ＰＵＦＡはＬＣ−ＰＵＦＡから選択される。さらなる実施形態では、ＰＵＦＡは、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、γ−リノール酸（ＧＬＡ）、ジホモ−γ−リノール酸（ＤＧＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）およびそれらの混合物から選択される。別の実施形態では、ＰＵＦＡは、ＤＨＡ、ＡＲＡおよびそれらの混合物から選択される。さらなる実施形態では、ＰＵＦＡはＤＨＡである。さらなる実施形態では、ＰＵＦＡはＡＲＡである。
[0023] ＬＣ−ＰＵＦＡは、少なくとも３個の二重結合を含み、かつ１８個以上の炭素または２０個以上の炭素の鎖長を有する脂肪酸である。ω−６シリーズのＬＣ−ＰＵＦＡとして、ジ−ホモ−γリノール酸（Ｃ２０：３ｎ−６）、アラキドン酸（Ｃ２０：４ｎ−６）（「ＡＲＡ」）、ドコサテトラエン酸またはアドレン酸（Ｃ２２：４ｎ−６）およびドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５ｎ−６）（「ＤＰＡ ｎ−６」）が挙げられるがそれらに限定されない。ω−３シリーズのＬＣ−ＰＵＦＡとして、エイコサトリエン酸（Ｃ２０：３ｎ−３）、エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４ｎ−３）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５ｎ−３）（「ＥＰＡ」）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５ｎ−３）およびドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６ｎ−３）が挙げられるがそれらに限定されない。ＬＣ−ＰＵＦＡとして２２個超の炭素および４個以上の二重結合を有する脂肪酸も挙げられ、この脂肪酸としてＣ２４：６（ｎ−３）およびＣ２８：８（ｎ−３）が挙げられるがそれらに限定されない。
[0024] ＰＵＦＡは、遊離脂肪酸、塩、脂肪酸エステル（例えばメチルエステルまたはエチルエステル）、モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）および／またはリン脂質（ＰＬ）の形態であることができる。
[0025] より多価の不飽和脂肪酸（ＨＵＦＡ）は、４個以上の不飽和炭素−炭素結合を含むω−３多価不飽和脂肪酸および／またはω−６多価不飽和脂肪酸である。
[0026] 本明細書で使用する場合、「細胞」は油を含む生体材料を意味しており、例えば油性微生物（ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）に由来する生体材料を意味する。微生物により産生された油または微生物細胞から入手される油は「微生物油」と称される。藻類および／または真菌類により産生された油はそれぞれ、藻類油および／または真菌油とも称される。
[0027] 本明細書で使用する場合、「微生物細胞」または「微生物」は、藻類、細菌、酵母、原生生物およびそれらの組み合わせ等の生物を意味しており、例えば単細胞生物を意味する。いくつかの実施形態では、微生物細胞は真核細胞である。微生物細胞として、黄金色藻類（例えばストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）界の微生物）；緑色藻類；珪藻類；渦鞭毛藻類（例えば、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属のメンバー等の渦鞭毛藻（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）目の微生物、例えばクリプテコディニウム・コーニィ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ）またはＣ．コーニィ（Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ））；スラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目の微生物；酵母（子嚢菌類または担子菌類）；ならびにムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属（モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）およびモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）節シュマッカリ（Ｓｃｈｍｕｃｋｅｒｉ）が挙げられるがそれらに限定されない）ならびにピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属（ピシウム・インシディオスム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ）が挙げられるがこれに限定されない）の真菌類が挙げられるがそれらに限定されない。
[0028] 一実施形態では、微生物細胞は、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属またはスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目に由来する。さらなる実施形態では、微生物細胞はクリプテコディニウム・コーニィ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ Ｃｏｈｎｉｉ）に由来する。さらなる実施形態では、微生物細胞は、クリプテコディニウム・コーニィ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ Ｃｏｈｎｉｉ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびそれらの混合物から選択される。
[0029] さらなる実施形態では、微生物細胞として、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、コニディオボルス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、ピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、エントモフトラ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）属、エキノスポランギウム（Ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）属およびサプロレグニア（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ）属に属する微生物が挙げられるがそれらに限定されない。別の実施形態では、ＡＲＡをモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属に由来する微生物細胞から得ており、このモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属として、モルティエレラ・エロンガータ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｌｏｎｇａｔａ）、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｘｉｇｕａ）、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）、モルティエレラ・シュマッカリ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｃｈｍｕｃｋｅｒｉ）およびモルティエレラ・ミヌチシマ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）が挙げられるがそれらに限定されない。さらなる実施形態では、ＡＲＡを、モルティエレラ・エロンガータ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｌｏｎｇａｔａ）ＩＦＯ８５７０、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｘｉｇｕａ）ＩＦＯ８５７１、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）ＩＦＯ５９４１、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ＩＦＯ８５６８、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢＳ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢＳ６０８．７０およびＣＢＳ７５４．６８ならびにこれらの変異体に由来する微生物細胞から入手する。さらなる実施形態では、微生物細胞はモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）に由来する。
[0030] さらには、微生物細胞はスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目の微細藻類に由来し、この微細藻類として、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属（種として、アルジメンタレ（ａｒｕｄｉｍｅｎｔａｌｅ）、アウレウム（ａｕｒｅｕｍ）、ベンチコラ（ｂｅｎｔｈｉｃｏｌａ）、グロボスム（ｇｌｏｂｏｓｕｍ）、キンネイ（ｋｉｎｎｅｉ）、モチブム（ｍｏｔｉｖｕｍ）、ムルチルジメンタレ（ｍｕｌｔｉｒｕｄｉｍｅｎｔａｌｅ）、パキデルマム（ｐａｃｈｙｄｅｒｍｕｍ）、プロリフェルム（ｐｒｏｌｉｆｅｒｕｍ）、ロセウム（ｒｏｓｅｕｍ）、セトリアツム（ｓｔｒｉａｔｕｍ）が挙げられる）；シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕ）属（種として、アグレガツム（ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）、リムナセウム（ｌｉｍｎａｃｅｕｍ）、マングロベイ（ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）、ミヌツム（ｍｉｎｕｔｕｍ）、オクトスポルム（ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｍ）が挙げられる）；ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属（種として、アモエボイデア（ａｍｏｅｂｏｉｄｅａ）、ケルグエレンシス（ｋｅｒｇｕｅｌｅｎｓｉｓ）、ミヌタ（ｍｉｎｕｔａ）、プロフンダ（ｐｒｏｆｕｎｄａ）、ラジアタ（ｒａｄｉａｔｅ）、サイレンス（ｓａｉｌｅｎｓ）、サルカリアナ（ｓａｒｋａｒｉａｎａ）、シゾキトロプス（ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｏｐｓ）、ウィスルゲンシス（ｖｉｓｕｒｇｅｎｓｉｓ）、ヨルケンシス（ｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）が挙げられる）；アウランチアコキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉａｃｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属；オブロンギチトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属；シコイドチトリウム（Ｓｉｃｙｏｉｄｏｃｈｙｔｉｕｍ）属；パリエンティチトリウム（Ｐａｒｉｅｎｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属；ボトリオチトリウム（Ｂｏｔｒｙｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属；およびそれらの組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない。ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）内に記載した種は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属のメンバーとみなすことができる。別の実施形態では、微生物細胞は、スラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目に由来する。さらに別の実施形態では、微生物細胞はトラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）に由来する。さらなる実施形態では、微生物細胞はシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）に由来する。さらなる実施形態では、微生物細胞は、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）またはそれらの混合物から選択される。
[0031] 一実施形態では、本方法は、微生物油を含む微生物細胞を溶解して溶解細胞組成物を形成する工程を含む。用語「溶解する（ｌｙｓｅ）」および「溶解する（ｌｙｓｉｎｇ）」は、微生物細胞の壁および／または膜を破裂させるプロセスを意味する。一実施形態では、機械的、化学的、酵素的、物理的およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１種の処理を施すことにより微生物細胞を溶解する。別の実施形態では、本方法は、微生物油を含む微生物細胞を溶解して溶解細胞組成物を形成する工程を含み、この溶解は、機械的、化学的、酵素的、物理的およびそれらの組み合わせから選択される。
[0032] いくつかの実施形態では、細胞の溶解前に、細胞を洗浄するおよび／または低温殺菌することができる。いくつかの実施形態では、細胞の洗浄は、水等の水溶液を使用してあらゆる細胞外の水溶性化合物または水分散性化合物を除去する工程を含む。いくつかの実施形態では、細胞を１回、２回、３回またはそれを超える回数だけ洗浄することができる。いくつかの実施形態では、細胞の低温殺菌は、細胞を加熱してあらゆる望ましくない酵素を不活性化する工程を含み、例えば油を劣化させ得るか、またはＰＵＦＡの収率を低減させ得るあらゆる酵素を不活性化させる工程を含む。いくつかの実施形態では、細胞を溶解する前に洗浄し、次いで低温殺菌する。いくつかの実施形態では、溶解する細胞は発酵ブロスに含まれている。
[0033] いくつかの実施形態では、本方法は、微生物油を含む未洗浄の微生物細胞を溶解して溶解細胞組成物を形成する工程を含む。いくつかの実施形態では、微生物油を含む微生物細胞を含む発酵ブロスを例えば水により最初に洗浄し、次いで細胞を溶解して溶解細胞組成物を形成する。その他の実施形態では、本方法は、発酵培地中の未洗浄の細胞を溶解して溶解細胞組成物を形成する工程を含む。
[0034] 機械的処理として、ホモジナイゼーション、超音波、冷間圧搾、磨砕およびそれらの組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない。いくつかの実施形態では、本方法は、ホモジナイゼーションにより細胞を溶解する工程を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ホモジナイザーにより細胞を溶解する工程を含む。
[0035] ホモジナイゼーションとして、フレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ）細胞圧搾、超音波処理器、ホモジナイザー、マイクロフルイダイザー、ボールミル、ロッドミル、ペブルミル、ビーズミル、高圧粉砕ロール、垂直軸インパクター、工業用ブレンダー、高剪断ミキサー、パドルミキサー、ポリトロンホモジナイザー、工業用ホモジナイザー（例えば、Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ ＶＨＰホモジナイザーおよびＡＰＶ ＲａｎｎｉｅホモジナイザーおよびＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎホモジナイザー）、工業用高剪断流体処理装置（例えばマイクロフルディスク高剪断流体処理装置）、細胞溶解／ビーズミルホモジナイザー（例えばＤｙｎｏ−ＭｉｌｌおよびＢｕｈｌｅｒ）ならびにそれらの組み合わせを利用するプロセスが挙げられるがそれらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞を、任意選択的に加熱されるホモジナイザーに通す。いくつかの実施形態では、好適なホモジナイゼーションは、高圧および／または低圧のいずれかでホモジナイザーに１回〜３回通す工程を含むことができる。
[0036] いくつかの実施形態では、ホモジナイゼーション中の圧力は、１５０ｂａｒ〜１，４００ｂａｒ、１５０ｂａｒ〜１，２００ｂａｒ、１５０ｂａｒ〜９００ｂａｒ、１５０ｂａｒ〜３００ｂａｒ、３００ｂａｒ〜１，４００ｂａｒ、３００ｂａｒ〜１，２００ｂａｒ、３００ｂａｒ〜９００ｂａｒ、４００ｂａｒ〜８００ｂａｒ、５００ｂａｒ〜７００ｂａｒ、または６００ｂａｒである。いくつかの実施形態では、ホモジナイゼーション中の圧力は、２，０００ｐｓｉ〜２０，０００ｐｓｉ、２，０００ｐｓｉ〜１８，０００ｐｓｉ、２，０００ｐｓｉ〜１６，０００ｐｓｉ、２，０００ｐｓｉ〜１４，０００ｐｓｉ、２，０００ｐｓｉ〜１２，０００ｐｓｉ、２，０００ｐｓｉ〜１０，０００ｐｓｉ、２，０００ｐｓｉ〜８，０００ｐｓｉ、２，０００ｐｓｉ〜６，０００ｐｓｉ、２，０００ｐｓｉ〜４，０００ｐｓｉ、４，０００ｐｓｉ〜２０，０００ｐｓｉ、４，０００ｐｓｉ〜１８，０００ｐｓｉ、４，０００ｐｓｉ〜１６，０００ｐｓｉ、４，０００ｐｓｉ〜１４，０００ｐｓｉ、４，０００ｐｓｉ〜１２，０００ｐｓｉ、４，０００ｐｓｉ〜１０，０００ｐｓｉ、４，０００ｐｓｉ〜８，０００ｐｓｉ、４，０００ｐｓｉ〜６，０００ｐｓｉ、６，０００ｐｓｉ〜２０，０００ｐｓｉ、６，０００ｐｓｉ〜１８，０００ｐｓｉ、６，０００ｐｓｉ〜１６，０００ｐｓｉ、６，０００ｐｓｉ〜１４，０００ｐｓｉ、６，０００ｐｓｉ〜１２，０００ｐｓｉ、６，０００ｐｓｉ〜１０，０００ｐｓｉ、６，０００ｐｓｉ〜８，０００ｐｓｉ、８，０００ｐｓｉ〜２０，０００ｐｓｉ、８，０００ｐｓｉ〜１８，０００ｐｓｉ、８，０００ｐｓｉ〜１６，０００ｐｓｉ、８，０００ｐｓｉ〜１４，０００ｐｓｉ、８，０００ｐｓｉ〜１２，０００ｐｓｉ、８，０００ｐｓｉ〜１０，０００ｐｓｉ、１０，０００ｐｓｉ〜２０，０００ｐｓｉ、１０，０００ｐｓｉ〜１８，０００ｐｓｉ、１０，０００ｐｓｉ〜１６，０００ｐｓｉ、１０，０００ｐｓｉ〜１４，０００ｐｓｉ、１０，０００ｐｓｉ〜１２，０００ｐｓｉ、１２，０００ｐｓｉ〜２０，０００ｐｓｉ、１２，０００ｐｓｉ〜１８，０００ｐｓｉ、１２，０００ｐｓｉ〜１６，０００ｐｓｉ、１２，０００ｐｓｉ〜１４，０００ｐｓｉ、１４，０００ｐｓｉ〜２０，０００ｐｓｉ、１４，０００ｐｓｉ〜１８，０００ｐｓｉ、１４，０００ｐｓｉ〜１６，０００ｐｓｉ、１６，０００ｐｓｉ〜２０，０００ｐｓｉ、１６，０００ｐｓｉ〜１８，０００ｐｓｉまたは１８，０００ｐｓｉ〜２０，０００ｐｓｉである。
[0037] いくつかの実施形態では、微生物細胞を、ホモジナイズする前に高剪断ミキサー中で混合する。いくつかの実施形態では、この高剪断ミキサーを、少なくとも５，０００ｒｐｍ、少なくとも７，５００ｒｐｍ、少なくとも１０，０００ｒｐｍ、少なくとも１２，５００ｒｐｍ、少なくとも１５，０００ｒｐｍ、５，０００ｒｐｍ〜１５，０００ｒｐｍ、５，０００ｒｐｍ〜１２，５００ｒｐｍ、５，０００ｒｐｍ〜１０，０００ｒｐｍ、５，０００ｒｐｍ〜７，５００ｒｐｍ、７，５００ｒｐｍ〜１５，０００ｒｐｍ、７，５００ｒｐｍ〜１２，５００ｒｐｍ、７，５００ｒｐｍ〜１０，０００ｒｐｍ、１０，０００ｒｐｍ〜１５，０００ｒｐｍ、１０，０００ｒｐｍ〜１２，５００ｒｐｍまたは１２，５００ｒｐｍ〜１５，０００ｒｐｍの範囲で作動させる。
[0038] 物理処理として加熱する工程が挙げられるがこれに限定されず、この加熱として、抵抗、対流、蒸気、流体浴、太陽光およびそれらの組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞を、抵抗コイルを壁中／壁上に備えるタンク内で加熱する。いくつかの実施形態では、細胞を、管が貫通している液浴中で加熱する。
[0039] 化学処理として、細胞のｐＨを上昇させる工程、細胞のｐＨを低下させる工程、細胞と化学物質とを接触させる工程およびそれらの組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない。
[0040] いくつかの実施形態では、細胞のｐＨを上昇させることにより細胞を溶解する。いくつかの実施形態では、このｐＨを、塩基を添加することにより上昇させる。この塩基として、水酸化物（例えばＬｉＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨおよびＣａ（ＯＨ）２ならびにそれらの組み合わせ）、炭酸塩（例えばＮａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＭｇＣＯ３およびそれらの組み合わせ）、重炭酸塩（例えばＬｉＨＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＫＨＣＯ３およびそれらの組み合わせ）ならびにそれらの組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない。この塩基は、固体の形態（例えば結晶、顆粒およびペレット）、液体の形態（例えば水溶液ならびにそれらの組み合わせであることができる。
[0041] いくつかの実施形態では、この塩基のｐＫｂは、１〜１２、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜５、２〜１２、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜５、３〜１０、３〜６、３〜５、４〜１０、４〜８、４〜６、５〜１０または５〜８である。本明細書で使用する場合、用語「ｐＫｂ」は、塩基の塩基会合定数Ｋｂの負の対数を意味する。Ｋｂは水中での塩基のイオン化平衡定数を意味しており、ここで、
Figure 2017501709
であり、塩基であるＢのＫｂは下記のように定義される。
Figure 2017501709
[0042] いくつかの実施形態では、このｐＨは、約８以上、約９以上、約１０以上、約１１以上および約１２以上から選択される。その他の実施形態では、このｐＨは、７〜１３、７〜１２、７〜１１、７〜１０、７〜９、８〜１３、８〜１２、８〜１１、８〜１０、８〜９、９〜１２、９〜１１、９〜１０、１０〜１２および１０〜１１から選択される。
[0043] いくつかの実施形態では、塩素アルカリプロセスにより細胞のｐＨを上昇させることができる。いくつかの実施形態では、塩化ナトリウムおよび細胞を含む発酵ブロスに電気分解を施し、その結果、水酸化ナトリウムが形成され、この水酸化ナトリウムにより細胞のｐＨが上昇する。いくつかの実施形態では、この発酵ブロスは塩化ナトリウムの代わりにまたは塩化ナトリウムに加えて、塩化カルシウムまたは塩化カリウムを含み、電気分解により水酸化カルシウムまたは水酸化カリウムがそれぞれ形成され、それにより細胞のｐＨが上昇する。
[0044] いくつかの実施形態では、細胞のｐＨを低下させることにより細胞を溶解する。いくつかの実施形態では、このｐＨを、酸を添加することにより低下させる。この酸として、硫酸、リン酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、次亜塩素酸、亜塩素酸、塩素酸、過塩素酸、フルオロ硫酸、硝酸、フルオロアンチモン酸、ホウフッ化水素酸、ヘキサフルオロリン酸、クロム酸、ホウ酸、酢酸、クエン酸、ギ酸およびそれらの組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない。いくつかの実施形態では、このｐＨは、約７以下、約６．５以下、約６以下、約５．５以下、約５以下、約４．５以下、約４以下、約３．５以下、約３以下、約２．５以下、約２以下、約１．５以下、約１以下および約０．５以下から選択される。その他の実施形態では、このｐＨは、約０．５〜約７、約０．５〜約６．５、約０．５〜約６、約０．５〜約５．５、約０．５〜約５、約０．５〜約４．５、約０．５〜約４、約０．５〜約３．５、約０．５〜約３、約０．５〜約２．５、約０．５〜約２、約０．５〜約１．５、約０．５〜約１、約１〜約７、約１〜約６．５、約１〜約６、約１〜約５．５、約１〜約５、約１〜約４．５、約１〜約４、約１〜約３．５、約１〜約３、約１〜約２．５、約１〜約２、約１〜約１．５、約１．５〜約７、約１．５〜約６．５、約１．５〜約６、約１．５〜約５．５、約１．５〜約５、約１．５〜約４．５、約１．５〜約４、約１．５〜約３．５、約１．５〜約３、約１．５〜約２．５、約１．５〜約２、約２〜約７、約２〜約６．５、約２〜約６、約２〜約５．５、約２〜約５、約２〜約４．５、約２〜約４、約２〜約３．５、約２〜約３、約２〜約２．５、約２．５〜約７、約２．５〜約６．５、約２．５〜約６、約２．５〜約５．５、約２．５〜約５、約２．５〜約４．５、約２．５〜約４、約２．５〜約３．５、約２．５〜約３、約３〜約７、約３〜約６．５、約３〜約６、約３〜約５．５、約３〜約５、約３〜約４．５、約３〜約４、約３〜約３．５、約３．５〜約７、約３．５〜約６．５、約３．５〜約６、約３．５〜約５．５、約３．５〜約５、約３．５〜約４．５、約３．５〜約４、約４〜約７、約４〜約６．５、約４〜約６、約４〜約５．５、約４〜約５、約４〜約４．５、約４．５〜約７、約４．５〜約６．５、約４．５〜約６、約４．５〜約５．５、約４．５〜約５、約５〜約７、約５〜約６．５、約５〜約６、約５〜約５．５、約５．５〜約７、約５．５〜約６．５、約５．５〜約６、約６〜約７、約６〜約６．５および約６．５〜約７から選択される。
[0045] いくつかの実施形態では、酸を、細胞ブロスの約２重量（もしくは体積）％〜約１０重量（もしくは体積）％、約２重量（もしくは体積）％〜約９重量（もしくは体積）％、約２重量（もしくは体積）％〜約８重量（もしくは体積）％、約２重量（もしくは体積）％〜約７重量（もしくは体積）％、約２重量（もしくは体積）％〜約６重量（もしくは体積）％、約３重量（もしくは体積）％〜約６重量（もしくは体積）％、約４重量（もしくは体積）％〜約６重量（もしくは体積）％、約５重量（もしくは体積）％〜約６重量（もしくは体積）％、約２重量（もしくは体積）％〜約５重量（もしくは体積）％、約２重量（もしくは体積）％〜約４重量（もしくは体積）％、約２重量（もしくは体積）％〜約３重量（もしくは体積）％、約３重量（もしくは体積）％〜約５重量（もしくは体積）％、約３重量（もしくは体積）％〜約４重量（もしくは体積）％または約４重量（もしくは体積）％〜約５重量（もしくは体積）％の量で添加してｐＨを低下させる。
[0046] 酵素処理は、細胞と１種または複数種の酵素とを接触させることを意味する。酵素として、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キチナーゼ、ペクチナーゼおよびそれらの組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない。プロテアーゼの非限定的な例として、セリンプロテアーゼ、セロニン（ｔｈｅｒｏｎｉｎｅ）プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、アラカーゼ（ａｌａｃａｓｅ）およびそれらの組み合わせが挙げられる。セルラーゼの非限定的な例として、スクラーゼ、マルターゼ、ラクターゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、リゾチーム、ノイラミニダーゼ、ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、プラルナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、アセチルガラクトサミニダーゼ、フコシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、イズロニダーゼ、マルターゼ−グルコアミラーゼおよびそれらの組み合わせが挙げられる。チキナーゼの非限定的な例としてキトトリオシダーゼが挙げられる。ペクチナーゼの非限定的な例として、ペクトリアーゼ、ペクトザイム（ｐｅｃｔｏｚｙｍｅ）、ポリガラクツロナーゼおよびそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、数種の酵素を加熱により活性化させる。いくつかの実施形態では、溶解は酵素の使用を含まない。
[0047] 本明細書で使用する場合、「溶解細胞組成物」は、細胞断片および細胞のその他の内容物等の１種または複数種の溶解細胞を（溶解細胞由来の）微生物油と共に含み、液体（例えば水）、栄養素および微生物細胞を含む発酵ブロスを任意選択的に含む組成物を意味する。いくつかの実施形態では、微生物細胞は、水を含む発酵ブロスまたは発酵培地に含まれている。いくつかの実施形態では、溶解細胞組成物は、１種または複数種の溶解細胞、細胞断片、微生物油、細胞の天然内容物、および発酵ブロス由来の水性成分を含む組成物を意味する。一実施形態では、この溶解細胞組成物は、液体、細胞断片および微生物油を含む。いくつかの実施形態では、溶解細胞組成物は、連続した水相と分散した油相との混合物を含む水中油型エマルションの形態である。いくつかの実施形態では、分散した油相は、乳化した溶解細胞組成物の約１重量（もしくは体積）％〜約６０重量（もしくは体積）％、約１重量（もしくは体積）％〜約５０重量（もしくは体積）％、約１重量（もしくは体積）％〜約４０重量（もしくは体積）％、約１重量（もしくは体積）％〜約３０重量（もしくは体積）％、約１重量（もしくは体積）％〜約２０重量（もしくは体積）％、約５重量（もしくは体積）％〜約６０重量（もしくは体積）％、約５重量（もしくは体積）％〜約５０重量（もしくは体積）％、約５重量（もしくは体積）％〜約４０重量（もしくは体積）％、約５重量（もしくは体積）％〜約３０重量（もしくは体積）％、約５重量（もしくは体積）％〜約２０重量（もしくは体積）％、約１０重量（もしくは体積）％〜約６０重量（もしくは体積）％、約１０重量（もしくは体積）％〜約５０重量（もしくは体積）％、約１０重量（もしくは体積）％〜約４０重量（もしくは体積）％、約２０重量（もしくは体積）％〜約６０重量（もしくは体積）％、２０重量（もしくは体積）％〜５０重量（もしくは体積）％、２０重量（もしくは体積）％〜約４０重量（もしくは体積）％、約３０重量（もしくは体積）％〜約６０重量（もしくは体積）％、約３０重量（もしくは体積）％〜約５０重量（もしくは体積）％または約４０重量（もしくは体積）％〜約６０重量（もしくは体積）％の濃度で存在する。
[0048] いくつかの実施形態では、微生物細胞を溶解することにより、細胞中のまたは細胞バイオマス中の、限定されないがタンパク質、リン脂質、炭水化物およびそれらの組み合わせ等からエマルションが形成される。いかなる特定の理論にも拘束されないが、本発明の方法は、乳化した溶解細胞組成物を分解または解乳化して、この溶解細胞組成物から微生物油を分離させると考えられる。用語「エマルション」および「乳化した」は、２つ以上の非混和性の相または層の混合物であって、一方の相または層が別の相または層中に分散している混合物を意味する。用語「壊す（ｂｒｅａｋ）」、「破壊する」、「解乳化する（ｄｅｍｕｌｓｉｆｙ）」、「解乳化」、「解乳化する（ｄｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ）」および「壊す（ｂｒｅａｋｉｎｇ）」は、エマルションの非混和性の相または層を分離するプロセスを意味する。例えば、乳化した溶解細胞組成物を解乳化する工程または壊す工程は、乳化した溶解細胞組成物が１つまたは複数の相または層を有するエマルションから２つ以上の相または層を有する組成物へと変化するプロセスを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の方法により、乳化した溶解細胞組成物が単一の相から２つ以上の相へと壊れる。いくつかの実施形態では、この２つ以上の相は油相および水相を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法により、乳化した溶解細胞組成物が壊れて少なくとも３つの相になる。いくつかの実施形態では、これら３つの相は、油相、水相および固相から選択される。いくつかの実施形態では、これらの相は、油相、エマルション相、水相および固相から選択される。
[0049] いくつかの実施形態では、解乳化中に形成される油滴の平均粒径は、５ミクロン〜５０ミクロン、５ミクロン〜４５ミクロン、５ミクロン〜４０ミクロン、５ミクロン〜３５ミクロン、５ミクロン〜３０ミクロン、５ミクロン〜２５ミクロン、５ミクロン〜２０ミクロン、５ミクロン〜１５ミクロン、１０ミクロン〜５０ミクロン、１０ミクロン〜４５ミクロン、１０ミクロン〜４０ミクロン、１０ミクロン〜３５ミクロン、１０ミクロン〜３０ミクロン、１０ミクロン〜２５ミクロン、１０ミクロン〜２０ミクロン、１０ミクロン〜１５ミクロン、１５ミクロン〜５０ミクロン、１５ミクロン〜４５ミクロン、１５ミクロン〜４０ミクロン、１５ミクロン〜３５ミクロン、１５ミクロン〜３０ミクロン、１５ミクロン〜２５ミクロン、１５ミクロン〜２０ミクロン、２０ミクロン〜５０ミクロン、２０ミクロン〜４５ミクロン、２０ミクロン〜４０ミクロン、２０ミクロン〜３５ミクロン、２０ミクロン〜３０ミクロン、２０ミクロン〜２５ミクロン、２５ミクロン〜５０ミクロン、２５ミクロン〜４５ミクロン、２５ミクロン〜４０ミクロン、２５ミクロン〜３５ミクロン、２５ミクロン〜３０ミクロン、３０ミクロン〜５０ミクロン、３０ミクロン〜４５ミクロン、３０ミクロン〜４０ミクロン、３０ミクロン〜３５ミクロン、３５ミクロン〜５０ミクロン、３５ミクロン〜４５ミクロン、３５ミクロン〜４０ミクロン、４０ミクロン〜５０ミクロン、４０ミクロン〜４５ミクロンおよび４５ミクロン〜５０ミクロンから選択される。さらなる実施形態では、解乳化中に形成される油滴の平均粒径は、少なくとも１０ミクロン、少なくとも１５ミクロン、少なくとも２０ミクロン、少なくとも２５ミクロン、少なくとも３０ミクロン、少なくとも３５ミクロンおよび少なくとも４０ミクロン以上から選択される。さらなる実施形態では、解乳化中に形成される油滴の平均粒径は、少なくとも１０ミクロン、少なくとも１５ミクロン、少なくとも２０ミクロンおよび少なくとも２５ミクロンから選択される。いくつかの実施形態では、この平均粒径を、例えばＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＬＳ １３ ３２０粒径アナライザ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（カリフォルニア州ブレア（Ｂｒｅａ，ＣＡ））を使用して測定することができる。いくつかの実施形態では、この平均粒径を、例えばＭａｌｖｅｒｎ ＭＳ２０００粒径アナライザ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．（英国ウスターシャー（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ））を使用して測定することができる。
[0050] いくつかの実施形態では、溶解細胞組成物に乳化剤が添加される。いくつかの実施形態では、この乳化剤は、内在性物質により形成されたエマルションを置き換え、なぜなら、ＰＵＦＡは内在性物質（例えばタンパク質、リン脂質および炭水化物）と比べて乳化剤に対する親和性が強いからである。いくつかの実施形態では、乳化剤により形成されたエマルションは、内在性物質により形成されたエマルションと比べて安定している。いくつかの実施形態では、乳化剤により形成されたエマルションは、内在性物質により形成されたエマルションと比べて、本明細書に記載した方法を使用して容易に解乳化される。
[0051] いくつかの実施形態では、乳化剤は洗浄剤である。いくつかの実施形態では、乳化剤は界面活性剤である。いくつかの実施形態では、溶解前に、溶解中にまたは溶解後に乳化剤を添加する。一実施形態では、溶解後に乳化剤を添加する。いくつかの実施形態では、溶解細胞組成物に乳化剤を添加する。本明細書で使用する場合、用語「乳化剤」は、エマルションを安定化させる物質を意味する。乳化剤は、イオン性乳化剤、非イオン性乳化剤およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、乳化剤はイオン性乳化剤である。
[0052] いくつかの実施形態では、イオン性乳化剤は、アニオン性乳化剤、カチオン性乳化剤およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、アニオン性乳化剤は、アニオン性硫酸塩乳化剤、例えばアルキル硫酸塩（例えばラウリル硫酸アンモニウム、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）／ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびそれらの組み合わせ）、アルキルエーテル硫酸塩（例えばラウリル硫酸ナトリウム／ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ミレス硫酸ナトリウムおよびそれらの組み合わせ）ならびにそれらの組み合わせ等；アニオン性スルホン酸塩乳化剤、例えばドクサート（ｄｏｃｕｓａｔｅ）（例えばスルホコハク酸ジオクチルナトリウム、スルホン酸塩フッ素系界面活性剤（例えばペルフルオロオクタンスルホン酸塩およびペルフルオロブタンスルホン酸塩）、アルキルベンゼンスルホン酸塩およびそれらの組み合わせ）等；アニオン性リン酸塩乳化剤（例えばアルキルアリールエーテルリン酸塩、アルキルエーテルリン酸塩およびそれらの組み合わせ）；アニオン性カルボン酸塩乳化剤（例えばアルキルカルボン酸塩（例えばステアリン酸ナトリウム、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、カルボン酸塩フッ素系界面活性剤（例えばペルフルオロノナン酸塩、ペルフルオロオクタン酸塩およびそれらの組み合わせ）ならびにそれらの組み合わせ）ならびにそれらの組み合わせであることができる。いくつかの実施形態では、乳化剤はアニオン性乳化剤である。一実施形態では、アニオン性乳化剤は、アニオン性硫酸塩乳化剤、アニオン性スルホン酸塩乳化剤、アニオン性リン酸塩乳化剤、アニオン性カルボン酸塩乳化剤およびそれらの組み合わせから選択される。別の実施形態では、アニオン性乳化剤はアニオン性硫酸塩乳化剤である。さらなる実施形態では、アニオン性硫酸塩乳化剤は、ラウリル硫酸アンモニウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ミレス硫酸ナトリウムおよびそれらの組み合わせから選択される。さらなる実施形態では、アニオン性硫酸塩乳化剤はドデシル硫酸ナトリウムである。
[0053] いくつかの実施形態では、カチオン性乳化剤は、ｐＨ依存性の第１級アミン；ｐＨ依存性の第２級アミン；ｐＨ依存性の第３級アミン；オクテニジン二塩酸塩；永続的に帯電した第４級アンモニウムカチオン（例えばアルキルトリメチルアンモニウム塩（例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）／臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）およびそれらの組み合わせ）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、塩化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＡＢ）およびそれらの組み合わせ）；ならびにそれらの組み合わせであることができる。
[0054] いくつかの実施形態では、乳化剤の分子量は、５００ｇ／モル以下、４５０ｇ／モル以下、４００ｇ／モル以下、３５０ｇ／モル以下および３００ｇ／モル以下から選択される。さらなる実施形態では、乳化剤の分子量は、２５０ｇ／モル〜５００ｇ／モル、２５０ｇ／モル〜４５０ｇ／モル、２５０ｇ／モル〜４００ｇ／モル、２５０ｇ／モル〜３５０ｇ／モル、２５０ｇ／モル〜３００ｇ／モル、３００ｇ／モル〜５００ｇ／モル、３００ｇ／モル〜４５０ｇ／モル、３００ｇ／モル〜４００ｇ／モル、３００ｇ／モル〜３５０ｇ／モル、３５０ｇ／モル〜５００ｇ／モル、３５０ｇ／モル〜４５０ｇ／モル、３５０ｇ／モル〜４００ｇ／モル、４００ｇ／モル〜５００ｇ／モル、４００ｇ／モル〜４５０ｇ／モルおよび４５０ｇ／モル〜５００ｇ／モルから選択される。例えば、ＳＤＳの分子量は２８８ｇ／モルであり、ＣＴＡＢの分子量は３６４ｇ／モルである。さらなる実施形態では、乳化剤の分子量は、２５０ｇ／モル〜４５０ｇ／モル、２５０ｇ／モル〜４００ｇ／モル、２５０ｇ／モル〜３５０ｇ／モルおよび２５０ｇ／モル〜３００ｇ／モルから選択される。
[0055] いくつかの実施形態では、乳化剤を粉末で添加する。いくつかの実施形態では、乳化剤を、エマルション濃度が５％〜５０％、５％〜４５％、５％〜４０％、５％〜３５％、５％〜３０％、１０％〜５０％、１０％〜４５％、１０％〜４０％、１０％〜３５％、１０％〜３０％、１５％〜５０％、１５％〜４５％、１５％〜４０％、１５％〜３５％、１５％〜３０％、２０％〜５０％、２０％〜４５％、２０％〜４０％、２０％〜３５％、２０％〜３０％、２５％〜５０％、２５％〜４５％、２５％〜４０％、２５％〜３５％、２５％〜３０％、３０％〜５０％、３０％〜４５％、３０％〜４０％および３０％〜３５％の量である溶液で添加する。
[0056] いくつかの実施形態では、（例えば粉末状のまたは溶液の）乳化剤を、発酵ブロスまたは溶解細胞組成物の０．２重量（または体積）％〜１０重量（または体積）％、０．２重量（または体積）％〜９．５重量（または体積）％、０．２重量（または体積）％〜９重量（または体積）％、０．２重量（または体積）％〜８．５重量（または体積）％、０．２重量（または体積）％〜８重量（または体積）％、０．２重量（または体積）％〜７．５重量（または体積）％、０．２重量（または体積）％〜７重量（または体積）％、０．２重量（または体積）％〜６．５重量（または体積）％、０．２重量（または体積）％〜６重量（または体積）％、０．２重量（または体積）％〜５．５重量（または体積）％、０．２重量（または体積）％〜５重量（または体積）％、０．２重量（または体積）％〜４．５重量（または体積）％、０．２重量（または体積）％〜４重量（または体積）％、０．２重量（または体積）％〜３．５重量（または体積）％、０．２重量（または体積）％〜３重量（または体積）％、０．２重量（または体積）％〜２．５重量（または体積）％、０．２重量（または体積）％〜２重量（または体積）％、０．２重量（または体積）％〜１．５重量（または体積）％、０．２重量（または体積）％〜１重量（または体積）％、０．２重量（または体積）％〜０．５重量（または体積）％、０．５重量（または体積）％〜１０重量（または体積）％、０．５重量（または体積）％〜９．５重量（または体積）％、０．５重量（または体積）％〜９重量（または体積）％、０．５重量（または体積）％〜８．５重量（または体積）％、０．５重量（または体積）％〜８重量（または体積）％、０．５重量（または体積）％〜７．５重量（または体積）％、０．５重量（または体積）％〜７重量（または体積）％、０．５重量（または体積）％〜６．５重量（または体積）％、０．５重量（または体積）％〜６重量（または体積）％、０．５重量（または体積）％〜５．５重量（または体積）％、０．５重量（または体積）％〜５重量（または体積）％、０．５重量（または体積）％〜４．５重量（または体積）％、０．５重量（または体積）％〜４重量（または体積）％、０．５重量（または体積）％〜３．５重量（または体積）％、０．５重量（または体積）％〜３重量（または体積）％、０．５重量（または体積）％〜２．５重量（または体積）％、０．５重量（または体積）％〜２重量（または体積）％、０．５重量（または体積）％〜１．５重量（または体積）％、０．５重量（または体積）％〜１重量（または体積）％、１重量（または体積）％〜１０重量（または体積）％、１重量（または体積）％〜９．５重量（または体積）％、１重量（または体積）％〜９重量（または体積）％、１重量（または体積）％〜８．５重量（または体積）％、１重量（または体積）％〜８重量（または体積）％、１重量（または体積）％〜７．５重量（または体積）％、１重量（または体積）％〜７重量（または体積）％、１重量（または体積）％〜６．５重量（または体積）％、１重量（または体積）％〜６重量（または体積）％、１重量（または体積）％〜５．５重量（または体積）％、１重量（または体積）％〜５重量（または体積）％、１重量（または体積）％〜４．５重量（または体積）％、１重量（または体積）％〜４重量（または体積）％、１重量（または体積）％〜３．５重量（または体積）％、１重量（または体積）％〜３重量（または体積）％、１重量（または体積）％〜２．５重量（または体積）％、１重量（または体積）％〜２重量（または体積）％、１重量（または体積）％〜１．５重量（または体積）％、１．５重量（または体積）％〜１０重量（または体積）％、１．５重量（または体積）％〜９．５重量（または体積）％、１．５重量（または体積）％〜９重量（または体積）％、１．５重量（または体積）％〜８．５重量（または体積）％、１．５重量（または体積）％〜８重量（または体積）％、１．５重量（または体積）％〜７．５重量（または体積）％、１．５重量（または体積）％〜７重量（または体積）％、１．５重量（または体積）％〜６．５重量（または体積）％、１．５重量（または体積）％〜６重量（または体積）％、１．５重量（または体積）％〜５．５重量（または体積）％、１．５重量（または体積）％〜５重量（または体積）％、１．５重量（または体積）％〜４．５重量（または体積）％、１．５重量（または体積）％〜４重量（または体積）％、１．５重量（または体積）％〜３．５重量（または体積）％、１．５重量（または体積）％〜３重量（または体積）％、１．５重量（または体積）％〜２．５重量（または体積）％、１．５重量（または体積）％〜２重量（または体積）％、２重量（または体積）％〜１０重量（または体積）％、２重量（または体積）％〜９．５重量（または体積）％、２重量（または体積）％〜９重量（または体積）％、２重量（または体積）％〜８．５重量（または体積）％、２重量（または体積）％〜８重量（または体積）％、２重量（または体積）％〜７．５重量（または体積）％、２重量（または体積）％〜７重量（または体積）％、２重量（または体積）％〜６．５重量（または体積）％、２重量（または体積）％〜６重量（または体積）％、２重量（または体積）％〜５．５重量（または体積）％、２重量（または体積）％〜５重量（または体積）％、２重量（または体積）％〜４．５重量（または体積）％、２重量（または体積）％〜４重量（または体積）％、２重量（または体積）％〜３．５重量（または体積）％、２重量（または体積）％〜３重量（または体積）％、２重量（または体積）％〜２．５重量（または体積）％、２．５重量（または体積）％〜１０重量（または体積）％、２．５重量（または体積）％〜９．５重量（または体積）％、２．５重量（または体積）％〜９重量（または体積）％、２．５重量（または体積）％〜８．５重量（または体積）％、２．５重量（または体積）％〜８重量（または体積）％、２．５重量（または体積）％〜７．５重量（または体積）％、２．５重量（または体積）％〜７重量（または体積）％、２．５重量（または体積）％〜６．５重量（または体積）％、２．５重量（または体積）％〜６重量（または体積）％、２．５重量（または体積）％〜５．５重量（または体積）％、２．５重量（または体積）％〜５重量（または体積）％、２．５重量（または体積）％〜４．５重量（または体積）％、２．５重量（または体積）％〜４重量（または体積）％、２．５重量（または体積）％〜３．５重量（または体積）％、２．５重量（または体積）％〜３重量（または体積）％、３重量（または体積）％〜１０重量（または体積）％、３重量（または体積）％〜９．５重量（または体積）％、３重量（または体積）％〜９重量（または体積）％、３重量（または体積）％〜８．５重量（または体積）％、３重量（または体積）％〜８重量（または体積）％、３重量（または体積）％〜７．５重量（または体積）％、３重量（または体積）％〜７重量（または体積）％、３重量（または体積）％〜６．５重量（または体積）％、３重量（または体積）％〜６重量（または体積）％、３重量（または体積）％〜５．５重量（または体積）％、３重量（または体積）％〜５重量（または体積）％、３重量（または体積）％〜４．５重量（または体積）％、３重量（または体積）％〜４重量（または体積）％および３重量（または体積）％〜３．５重量（または体積）％から選択される量で添加する。別の実施形態では、（例えば粉末状のまたは溶液の）乳化剤を、発酵ブロスまた溶解細胞組成物の０．２重量（または体積）％〜５重量（または体積）％、０．５重量（または体積）％〜５重量（または体積）％、１重量（または体積）％〜５重量（または体積）％、１．５重量（または体積）％〜５重量（または体積）％、２重量（または体積）％〜５重量（または体積）％、２．５重量（または体積）％〜５重量（または体積）％および３重量（または体積）％〜５重量（または体積）％から選択される量で添加する。さらなる実施形態では、乳化剤を、溶解細胞組成物の０．２重量％〜１０重量％の量で添加する。
[0057] いくつかの実施形態では、乳化剤は、発酵ブロスまたは溶解細胞組成物の界面張力（すなわち、表面張力）を低下させる。本明細書で使用する場合、用語「界面張力」または「表面張力」は、２つの相の間の界面における１メートルの長さの仮想線に作用する力を意味する。いくつかの実施形態では、乳化剤により形成されたエマルションの界面張力は、内在性物質により形成されたエマルションと比べて低い。いくつかの実施形態では、界面張力をダイン／ｃｍで測定することができる。
[0058] いくつかの実施形態では、乳化剤は、発酵ブロスまたは溶解細胞組成物のζ電位の絶対値を増加させる（すなわち、正のζ電位を増加させる、または負のζ電位を低下させる）。いくつかの実施形態では、アニオン性乳化剤の添加により、結果として発酵ブロスまたは溶解細胞組成物のζ電位が下方へシフトし得る（例えば正のζ電位が低下する、または負のζ電位が増加する）。いくつかの実施形態では、カチオン性乳化剤の添加により、結果として発酵ブロスまたは溶解細胞組成物のζ電位が上方へシフトし得る（例えば正のζ電位が増加する、または負のζ電位が増加する）。本明細書で使用する場合、用語「ζ電位」は、エマルション中の粒子間の運動電位を意味する。いくつかの実施形態では、このζ電位をｍＶで測定することができる。いくつかの実施形態では、乳化剤により形成されたエマルションのζ電位の絶対値は、内在性物質により形成されたエマルションと比べて高い。
[0059] いくつかの実施形態では、イオン性乳化剤の添加により水中油型エマルションが生じる。いくつかの実施形態では、この水中油型エマルションは油、水およびイオン性乳化剤を含むがそれらに限定されない。
[0060] いくつかの実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物のｐＨを上昇させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、このｐＨを、溶解細胞組成物に塩基を添加することにより上昇させる。溶解細胞組成物を解乳化するのに使用することができる塩基は、上述したものと同じである。いくつかの実施形態では、このｐＨは、約８以上、約９以上、約１０以上、約１１以上および約１２以上から選択される。その他の実施形態では、このｐＨは、７〜１３、７〜１２、７〜１１、７〜１０、７〜９、８〜１３、８〜１２、８〜１１、８〜１０、８〜９、９〜１２、９〜１１、９〜１０、１０〜１２および１０〜１１のｐＨから選択される。
[0061] いくつかの実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物に塩を添加する工程をさらに含む。用語「塩」は、酸由来の水素イオンを金属（例えばアルカリ金属、アルカリ土類金属および遷移金属）または正に帯電した化合物（例えばＮＨ４ ＋）に置き換えることにより形成されているイオン性化合物を意味する。いくつかの実施形態では、この塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、硫酸塩またはそれらの組み合わせであることができる。塩中に存在する負に帯電したイオン種として、ハライド、硫酸、重硫酸、亜硫酸、リン酸、リン酸水素、リン酸二水素、炭酸、重炭酸およびそれらの組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない。いくつかの実施形態では、塩は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、グルタミン酸モノナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化カリウム、塩化鉄、硫酸鉄、硫酸アルミニウム、酢酸アンモニウムおよびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、塩はＮａＯＨを含まない。塩を固体（例えば結晶状、アモルファス状、ペレット状および／もしくは粒状）で添加することができる、ならびに／または例えば水を含む溶液（例えば希釈溶液、飽和溶液もしくは過飽和溶液）で添加することができる。
[0062] いくつかの実施形態では、この塩を、５ｇ／ｌ〜２５ｇ／ｌ、５ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、１０ｇ／ｌ〜１５ｇ／ｌ、１５ｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌ、２０ｇ／ｌ〜２５ｇ／ｌまたは１０ｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌの量で添加する。
[0063] その他の実施形態では、塩を、溶解細胞組成物の２０重量（もしくは体積）％以下、１５重量（もしくは体積）％以下、１０重量（もしくは体積）％以下、７．５重量（もしくは体積）％、５重量（もしくは体積）％以下または２重量（もしくは体積）％の量で溶解細胞組成物に添加する。いくつかの実施形態では、塩を、溶解細胞組成物（例えば全ブロス重量（または全ブロス体積））の約０．０５重量（もしくは体積）％〜約２０重量（もしくは体積）％、約０．１重量（もしくは体積）％〜約２０重量（もしくは体積）％、約０．１重量（もしくは体積）％〜約１５重量（もしくは体積）％、約０．１重量（もしくは体積）％〜約１０重量（もしくは体積）％、約０．５重量（もしくは体積）％〜約２０重量（もしくは体積）％、約０．５重量（もしくは体積）％〜約１５重量（もしくは体積）％、約０．５重量（もしくは体積）％〜約１０重量（もしくは体積）％、約０．５重量（もしくは体積）％〜約５重量（もしくは体積）％、約０．５重量（もしくは体積）％〜約４重量（もしくは体積）％、約０．５重量（もしくは体積）％〜約３重量（もしくは体積）％、約０．５重量（もしくは体積）％〜約２．５重量（もしくは体積）％、約０．５重量（もしくは体積）％〜約２重量（もしくは体積）％、約０．５重量（もしくは体積）％〜約１．５重量（もしくは体積）％、約０．５重量（もしくは体積）％〜約１重量（もしくは体積）％、約１重量（もしくは体積）％〜約２０重量（もしくは体積）％、約１重量（もしくは体積）％〜約１５重量（もしくは体積）％、約１重量（もしくは体積）％〜約１０重量（もしくは体積）％、約１重量（もしくは体積）％〜約５重量（もしくは体積）％、約１重量（もしくは体積）％〜約４重量（もしくは体積）％、１重量（もしくは体積）％〜約３重量（もしくは体積）％、約１重量（もしくは体積）％〜約２．５重量（もしくは体積）％、約１重量（もしくは体積）％〜約２重量（もしくは体積）％、約１重量（もしくは体積）％〜約１．５重量（もしくは体積）％、約１．５重量（もしくは体積）％〜約５重量（もしくは体積）％、約１．５重量（もしくは体積）％〜約４重量（もしくは体積）％、約１．５重量（もしくは体積）％〜約３重量（もしくは体積）％、約１．５重量（もしくは体積）％〜約２．５重量（もしくは体積）％、約１．５重量（もしくは体積）％〜約２重量（もしくは体積）％、約２重量（もしくは体積）％〜２０重量（もしくは体積）％、約２重量（もしくは体積）％〜約１５重量（もしくは体積）％、約２重量（もしくは体積）％〜約１０重量（もしくは体積）％、約２重量（もしくは体積）％〜約５重量（もしくは体積）％、約２重量（もしくは体積）％〜約４重量（もしくは体積）％、約２重量（もしくは体積）％〜約３重量（もしくは体積）％、約２重量（もしくは体積）％〜約２．５重量（もしくは体積）％、約２．５重量（もしくは体積）％〜約５重量（もしくは体積）％、約２．５重量（もしくは体積）％〜約４重量（もしくは体積）％、約２．５重量（もしくは体積）％〜約３重量（もしくは体積）％、約３重量（もしくは体積）％〜約５重量（もしくは体積）％、約３重量（もしくは体積）％〜約４重量（もしくは体積）％、約４重量（もしくは体積）％〜約５重量（もしくは体積）％、約５重量（もしくは体積）％〜約２０重量（もしくは体積）％、約５重量（もしくは体積）％〜約１５重量（もしくは体積）％、約５重量（もしくは体積）％〜約１０重量（もしくは体積）％、約１０重量（もしくは体積）％〜約２０重量（もしくは体積）％、約１０重量（もしくは体積）％〜約１５重量（もしくは体積）％または約１５重量（もしくは体積）％〜約２０重量（もしくは体積）％の量で溶解細胞組成物に添加する。例えば、溶解細胞組成物の重量が１，０００ｋｇである場合、０．５重量（もしくは体積）％〜２０重量（もしくは体積）％の量で塩を添加するには、５ｋｇ〜２００ｋｇの塩を溶解細胞組成物に添加することが必要になる。いくつかの実施形態では、塩を、溶解細胞組成物の約０．０５重量（もしくは体積）％〜約２０重量（もしくは体積）％、約０．１重量（もしくは体積）％〜約２０重量（もしくは体積）％、約０．５重量（もしくは体積）％〜約１５重量（もしくは体積）％または約２重量（もしくは体積）％〜約１０重量（もしくは体積）％の量で溶解細胞組成物に添加する。
[0064] いくつかの実施形態では、本方法は、細胞の溶解前に、溶解中にまたは溶解後に加熱する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、この加熱を、乳化剤の添加前に、乳化剤の添加中に、乳化剤の添加後に、塩の添加前に、塩の添加中に、塩の添加後にまたはこれらの混み合わせで実施する。いくつかの実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物および／または細胞を少なくとも１０℃、少なくとも２０℃、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも４０℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、少なくとも９５℃または少なくとも１００℃に加熱する工程を含む。その他の実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物および／または細胞を、約１０℃〜約１００℃、約１０℃〜約９０℃、約１０℃〜約８０℃、約１０℃〜約７０℃、約２０℃〜約１００℃、約２０℃〜約９０℃、約２０℃〜約８０℃、約２０℃〜約７０℃、約３０℃〜約１００℃、約３０℃〜約９０℃、約３０℃〜約８０℃、約３０℃〜約７０℃、約４０℃〜約１００℃、約４０℃〜約９０℃、約４０℃〜約８０℃、約５０℃〜約１００℃、約５０℃〜約９０℃、約５０℃〜約８０℃、約５０℃〜約７０℃、約６０℃〜約１００℃、約６０℃〜約９０℃、約６０℃〜約８０℃、約７０℃〜約１００℃、約７０℃〜約９０℃、約８０℃〜約１００℃、約８０℃〜約９０℃または約９０℃〜約１００℃に加熱する工程を含む。さらなる実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を、約７０℃〜約１００℃、約７０℃〜約９０℃、約８０℃〜約１００℃、約８０℃〜約９０℃または約９０℃〜約１００℃に加熱する工程を含む。さらなる実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、少なくとも９５℃または少なくとも１００℃に加熱する工程を含む。
[0065] いくつかの実施形態では、溶解細胞組成物を、この溶解細胞組成物を解乳化するのに十分な期間にわたり加熱する。
[0066] いくつかの実施形態では、細胞および／または溶解細胞組成物を、閉鎖型システム中でまたはエバポレーターを備えたシステム中で加熱することができる。いくつかの実施形態では、細胞中におよび／または溶解細胞組成物中に存在する水の一部が蒸発により除去されるように、細胞および／または溶解細胞組成物を、エバポレーターを備えたシステム中で加熱することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞および／または溶解細胞組成物を、エバポレーターを備えたシステム中で加熱して、細胞中におよび／または溶解細胞組成物中に存在する水の最大で１重量（もしくは体積）％、５重量（もしくは体積）％、１０重量（もしくは体積）％、１５重量（もしくは体積）％、２０重量（もしくは体積）％、２５重量（もしくは体積）％、３０重量（もしくは体積）％、３５重量（もしくは体積）％、４０重量（もしくは体積）％、４５重量（もしくは体積）％または５０重量（もしくは体積）％を除去する工程を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞および／または溶解細胞組成物を、エバポレーターを備えたシステム中で加熱して、水の１重量（もしくは体積）％〜５０重量（もしくは体積）％、１重量（もしくは体積）％〜４５重量（もしくは体積）％、１重量（もしくは体積）％〜４０重量（もしくは体積）％、１重量（もしくは体積）％〜３５重量（もしくは体積）％、１重量（もしくは体積）％〜３０重量（もしくは体積）％、１重量（もしくは体積）％〜２５重量（もしくは体積）％、１重量（もしくは体積）％〜２０重量（もしくは体積）％、１重量（もしくは体積）％〜１５重量（もしくは体積）％、１重量（もしくは体積）％〜１０重量（もしくは体積）％、１重量（もしくは体積）％〜５重量（もしくは体積）％、５重量（もしくは体積）％〜５０重量（もしくは体積）％、５重量（もしくは体積）％〜４５重量（もしくは体積）％、５重量（もしくは体積）％〜４０重量（もしくは体積）％、５重量（もしくは体積）％〜３５重量（もしくは体積）％、５重量（もしくは体積）％〜３０重量（もしくは体積）％、５重量（もしくは体積）％〜２５重量（もしくは体積）％、５重量（もしくは体積）％〜２０重量（もしくは体積）％、５重量（もしくは体積）％〜１５重量（もしくは体積）％、５重量（もしくは体積）％〜１０重量（もしくは体積）％、１０重量（もしくは体積）％〜５０重量（もしくは体積）％、１０重量（もしくは体積）％〜４５重量（もしくは体積）％、１０重量（もしくは体積）％〜４０重量（もしくは体積）％、１０重量（もしくは体積）％〜３５重量（もしくは体積）％、１０重量（もしくは体積）％〜３０重量（もしくは体積）％、１０重量（もしくは体積）％〜２５重量（もしくは体積）％、１０重量（もしくは体積）％〜２０重量（もしくは体積）％、１０重量（もしくは体積）％〜１５重量（もしくは体積）％、１５重量（もしくは体積）％〜５０重量（もしくは体積）％、１５重量（もしくは体積）％〜４５重量（もしくは体積）％、１５重量（もしくは体積）％〜４０重量（もしくは体積）％、１５重量（もしくは体積）％〜３５重量（もしくは体積）％、１５重量（もしくは体積）％〜３０重量（もしくは体積）％、１５重量（もしくは体積）％〜２５重量（もしくは体積）％、１５重量（もしくは体積）％〜２０重量（もしくは体積）％、２０重量（もしくは体積）％〜５０重量（もしくは体積）％、２０重量（もしくは体積）％〜４５重量（もしくは体積）％、２０重量（もしくは体積）％〜４０重量（もしくは体積）％、２０重量（もしくは体積）％〜３５重量（もしくは体積）％、２０重量（もしくは体積）％〜３０重量（もしくは体積）％、２０重量（もしくは体積）％〜２５重量（もしくは体積）％、２５重量（もしくは体積）％〜５０重量（もしくは体積）％、２５重量（もしくは体積）％〜４５重量（もしくは体積）％、２５重量（もしくは体積）％〜４０重量（もしくは体積）％、２５重量（もしくは体積）％〜３５重量（もしくは体積）％、２５重量（もしくは体積）％〜３０重量（もしくは体積）％、３０重量（もしくは体積）％〜５０重量（もしくは体積）％、３０重量（もしくは体積）％〜４５重量（もしくは体積）％、３０重量（もしくは体積）％〜４０重量（もしくは体積）％、３０重量（もしくは体積）％〜３５重量（もしくは体積）％、３５重量（もしくは体積）％〜５０重量（もしくは体積）％、３５重量（もしくは体積）％〜４５重量（もしくは体積）％、３５重量（もしくは体積）％〜４０重量（もしくは体積）％、４０重量（もしくは体積）％〜５０重量（もしくは体積）％、４０重量（もしくは体積）％〜４５重量（もしくは体積）％または４５重量（もしくは体積）％〜５０重量（もしくは体積）％を除去する工程を含む。
[0067] いくつかの実施形態では、本方法は、（ｉ）細胞の溶解前に、溶解中にもしくは溶解後に、（ｉ）溶解脂肪組成物の解乳化前に、解乳化中にもしくは解乳化後に、またはこれらの組み合わせで撹拌する工程をさらに含む。用語「撹拌する」および「撹拌」は、力を加えることによって細胞および／または溶解細胞組成物中での運動に影響を及ぼすプロセスを意味する。いくつかの実施形態では、本方法は、混ぜることにより、混合することにより、混和することにより、振盪することにより、振動させることによりまたはこれらの組み合わせにより、細胞および／または溶解細胞組成物を撹拌する工程を含む。
[0068] いくつかの実施形態では、撹拌機は、細胞および／または溶解細胞組成物中で塩基および／または塩を分散させる分散型撹拌機である。いくつかの実施形態では、この撹拌機は加熱プレートを有する。いくつかの実施形態では、この撹拌機は混ぜるための外被を有する。いくつかの実施形態では、撹拌機は１つまたは複数のインペラを有する。本明細書で使用する場合、「インペラ」は、回転時に細胞または溶解細胞組成物に運動を付与するために配置されている装置を意味する。本発明での使用に適したインペラとして、直線状ブレードインペラ（ｓｔｒａｉｇｈｔ ｂｌａｄｅ ｉｍｐｅｌｌｅｒ）、ラシュトン（Ｒｕｓｈｔｏｎ）ブレードインペラ、軸流インペラ、放射状流インペラ、凹面状ブレードディスクインペラ（ｃｏｎｃａｖｅ ｂｌａｄｅ ｄｉｓｃ ｉｍｐｅｌｌｅｒ）、高性能インペラ、プロペラ、パドル、タービンおよびこれらの組み合わせが挙げられる。
[0069] いくつかの実施形態では、本発明の方法は、０．１ｈｐ／１，０００ｇａｌ〜１０ｈｐ／１，０００ｇａｌ、０．５ｈｐ／１，０００ｇａｌ〜８ｈｐ／１，０００ｇａｌ、１ｈｐ／１，０００ｇａｌ〜６ｈｐ／１，０００ｇａｌまたは２ｈｐ／１，０００ｇａｌ〜５ｈｐ／１，０００ｇａｌの組成物で細胞および／または溶解細胞組成物を撹拌する工程を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、０．１ｈｐ／１０００ｇａｌ〜１０ｈｐ／１０００ｇａｌの組成物で細胞および／または溶解細胞組成物を撹拌する工程を含む。
[0070] いくつかの実施形態では、本発明は、１０ｒｐｍ以下、２０ｒｐｍ以下、５０ｒｐｍ以下、１００ｒｐｍ以下、１５０ｒｐｍ以下、２００ｒｐｍ以下、２５０ｒｐｍ以下、３００ｒｐｍ以下、３５０ｒｐｍ以下、４００ｒｐｍ以下、１０ｒｐｍ〜４００ｒｐｍ、１０ｒｐｍ〜３５０ｒｐｍ、１０ｒｐｍ〜３００ｒｐｍ、１０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍ、１０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍ、１０ｒｐｍ〜１５０ｒｐｍ、１０ｒｐｍ〜１００ｒｐｍ、１０ｒｐｍ〜５０ｒｐｍ、１０ｒｐｍ〜２０ｒｐｍ、２０ｒｐｍ〜４００ｒｐｍ、２０ｒｐｍ〜３５０ｒｐｍ、２０ｒｐｍ〜３００ｒｐｍ、２０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍ、２０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍ、２０ｒｐｍ〜１５０ｒｐｍ、２０ｒｐｍ〜１００ｒｐｍ、２０ｒｐｍ〜５０ｒｐｍ、５０ｒｐｍ〜４００ｒｐｍ、５０ｒｐｍ〜３５０ｒｐｍ、５０ｒｐｍ〜３００ｒｐｍ、５０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍ、５０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍ、５０ｒｐｍ〜１５０ｒｐｍ、５０ｒｐｍ〜１００ｒｐｍ、１００ｒｐｍ〜４００ｒｐｍ、１００ｒｐｍ〜３５０ｒｐｍ、１００ｒｐｍ〜３００ｒｐｍ、１００ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍ、１００ｒｐｍ〜２００ｒｐｍ、１００ｒｐｍ〜１５０ｒｐｍ、１５０ｒｐｍ〜４００ｒｐｍ、１５０ｒｐｍ〜３５０ｒｐｍ、１５０ｒｐｍ〜３００ｒｐｍ、１５０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍ、１５０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍ、２００ｒｐｍ〜４００ｒｐｍ、２００ｒｐｍ〜３５０ｒｐｍ、２００ｒｐｍ〜３００ｒｐｍ、２００ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍ、２５０ｒｐｍ〜４００ｒｐｍ、２５０ｒｐｍ〜３５０ｒｐｍ、２５０ｒｐｍ〜３００ｒｐｍ、３００ｒｐｍ〜４００ｒｐｍ、３００ｒｐｍ〜３５０ｒｐｍまたは３５０ｒｐｍ〜４００ｒｐｍで撹拌する工程を含む。いくつかの実施形態では、この撹拌は３５０ｒｐｍ以下の速度で行われる。
[0071] いくつかの実施形態では、本方法は、インペラ先端速度が９０ｆｔ／分〜１，２００ｆｔ／分、２００ｆｔ／分〜１，０００ｆｔ／分、３００ｆｔ／分〜８００ｆｔ／分、４００ｆｔ／分〜７００ｆｔ／分または５００ｆｔ／分〜６００ｆｔ／分である撹拌機を使用して、細胞および／または溶解細胞組成物を撹拌する工程を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、インペラ先端速度が２００ｆｔ／分〜１０００ｆｔ／分である撹拌機により撹拌する工程を含む。
[0072] いくつかの実施形態では、ある方法は、インペラ先端速度が５ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、５ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、５ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、５ｃｍ／秒〜３５０ｃｍ／秒、５ｃｍ／秒〜３００ｃｍ／秒、５ｃｍ／秒〜２５０ｃｍ／秒、５ｃｍ／秒〜２００ｃｍ／秒、５ｃｍ／秒〜１５０ｃｍ／秒、５ｃｍ／秒〜１００ｃｍ／秒、５ｃｍ／秒〜５０ｃｍ／秒、５ｃｍ／秒〜２５ｃｍ／秒、２５ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、２５ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、２５ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、２５ｃｍ／秒〜３５０ｃｍ／秒、２５ｃｍ／秒〜３００ｃｍ／秒、２５ｃｍ／秒〜２５０ｃｍ／秒、２５ｃｍ／秒〜２００ｃｍ／秒、２５ｃｍ／秒〜１５０ｃｍ／秒、２５ｃｍ／秒〜１００ｃｍ／秒、２５ｃｍ／秒〜５０ｃｍ／秒、５０ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、５０ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、５０ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、５０ｃｍ／秒〜３５０ｃｍ／秒、５０ｃｍ／秒〜３００ｃｍ／秒、５０ｃｍ／秒〜２５０ｃｍ／秒、５０ｃｍ／秒〜２００ｃｍ／秒、５０ｃｍ／秒〜１５０ｃｍ／秒、５０ｃｍ／秒〜１００ｃｍ／秒、１００ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、１００ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、１００ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、１００ｃｍ／秒〜３５０ｃｍ／秒、１００ｃｍ／秒〜３００ｃｍ／秒、１００ｃｍ／秒〜２５０ｃｍ／秒、１００ｃｍ／秒〜２００ｃｍ／秒、１００ｃｍ／秒〜１５０ｃｍ／秒、１５０ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、１５０ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、１５０ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、１５０ｃｍ／秒〜３５０ｃｍ／秒、１５０ｃｍ／秒〜３００ｃｍ／秒、１５０ｃｍ／秒〜２５０ｃｍ／秒、１５０ｃｍ／秒〜２００ｃｍ／秒、２００ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、２００ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、２００ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、２００ｃｍ／秒〜３５０ｃｍ／秒、２００ｃｍ／秒〜３００ｃｍ／秒、２００ｃｍ／秒〜２５０ｃｍ／秒、２５０ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、２５０ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、２５０ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、２５０ｃｍ／秒〜３５０ｃｍ／秒、２５０ｃｍ／秒〜３００ｃｍ／秒、３００ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、３００ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、３００ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、３００ｃｍ／秒〜３５０ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜８５０ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜８００ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜７００ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜６５０ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜６００ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜５５０ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜４５０ｃｍ／秒、３５０ｃｍ／秒〜４００ｃｍ／秒、４００ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、４００ｃｍ／秒〜８５０ｃｍ／秒、４００ｃｍ／秒〜８００ｃｍ／秒、４００ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、４００ｃｍ／秒〜７００ｃｍ／秒、４００ｃｍ／秒〜６５０ｃｍ／秒、４００ｃｍ／秒〜６００ｃｍ／秒、４００ｃｍ／秒〜５５０ｃｍ／秒、４００ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、４００ｃｍ／秒〜４５０ｃｍ／秒、４５０ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、４５０ｃｍ／秒〜８５０ｃｍ／秒、４５０ｃｍ／秒〜８００ｃｍ／秒、４５０ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、４５０ｃｍ／秒〜７００ｃｍ／秒、４５０ｃｍ／秒〜６５０ｃｍ／秒、４５０ｃｍ／秒〜６００ｃｍ／秒、４５０ｃｍ／秒〜５５０ｃｍ／秒、４５０ｃｍ／秒〜５００ｃｍ／秒、５００ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、５００ｃｍ／秒〜８５０ｃｍ／秒、５００ｃｍ／秒〜８００ｃｍ／秒、５００ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、５００ｃｍ／秒〜７００ｃｍ／秒、５００ｃｍ／秒〜６５０ｃｍ／秒、５００ｃｍ／秒〜６００ｃｍ／秒、５００ｃｍ／秒〜５５０ｃｍ／秒、５５０ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、５５０ｃｍ／秒〜８５０ｃｍ／秒、５５０ｃｍ／秒〜８００ｃｍ／秒、５５０ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、５５０ｃｍ／秒〜７００ｃｍ／秒、５５０ｃｍ／秒〜６５０ｃｍ／秒、５５０ｃｍ／秒〜６００ｃｍ／秒、６００ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、６００ｃｍ／秒〜８５０ｃｍ／秒、６００ｃｍ／秒〜８００ｃｍ／秒、６００ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、６００ｃｍ／秒〜７００ｃｍ／秒、６００ｃｍ／秒〜６５０ｃｍ／秒、６５０ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、６５０ｃｍ／秒〜８５０ｃｍ／秒、６５０ｃｍ／秒〜８００ｃｍ／秒、６５０ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、６５０ｃｍ／秒〜７００ｃｍ／秒、７００ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、７００ｃｍ／秒〜８５０ｃｍ／秒、７００ｃｍ／秒〜８００ｃｍ／秒、７００ｃｍ／秒〜７５０ｃｍ／秒、７５０ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、７５０ｃｍ／秒〜８５０ｃｍ／秒、７５０ｃｍ／秒〜８００ｃｍ／秒、８００ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒、８００ｃｍ／秒〜８５０ｃｍ／秒または８５０ｃｍ／秒〜９００ｃｍ／秒である撹拌機を使用して、細胞および／または溶解細胞組成物を撹拌する工程を含む。用語「インペラ先端速度」は、インペラがその中心軸の周りを回転する際のインペラの最も外側の部分の速度を意味する。
[0073] いくつかの実施形態では、この撹拌（および本明細書に記載したような任意選択的な追加の工程）を、インペラを含む容器中で実施し、この容器の容積に対するインペラの直径の比率は、０．１〜０．５、０．１〜０．４、０．２〜０．５、０．２〜０．４、０．３〜０．５または０．３〜０．４である。
[0074] いくつかの実施形態では、この撹拌（および本明細書に記載したような任意選択的な追加の工程）を、インペラを含む容器中で実施し、この容器の内径に対するインペラの直径の比率は、少なくとも０．２５、少なくとも０．３４、少なくとも０．６５、０．２５〜０．６５、０．２５〜０．３３、０．３〜０．６、０．３〜０．５、０．３〜０．４、０．３４〜０．６５、０．３４〜０．６、０．３４〜０．５５、０．３７〜０．５５、０．４〜０．６５、０．４〜０．６、０．４〜０．５または０．４２〜０．５５である。
[0075] いくつかの実施形態では、撹拌は、細胞および／または溶解細胞組成物が１０〜１０，０００、１，０００〜１０，０００、１，５００〜１０，０００または２，０００〜１０，０００のレイノルズ数で表される流動条件下に置かれるように、細胞および／または溶解細胞組成物を混合する工程を含む。いくつかの実施形態では、この撹拌中での溶解細胞エマルションのレイノルズ数は、２，０００以上、３，０００以上もしくは５，０００以上、または２，０００〜１０，０００、３，０００〜１０，０００もしくは５，０００〜１０，０００である。
[0076] いくつかの実施形態では、撹拌ベッセルは２つのインペラを有することができる。いくつかの実施形態では、これらのインペラはラシュトンブレードインペラである。いくつかの実施形態では、これらのインペラは、少なくとも最小のインペラの直径に等しい距離だけ互いに離間されている。いくつかの実施形態では、これらのインペラは先端間が３０インチ〜４０インチ、３３インチ〜３７インチ、３３インチ、３４インチ、３５インチ、３６インチまたは３７インチである。いくつかの実施形態では、撹拌ベッセルの容積は、少なくとも１０，０００リットル、少なくとも２０，０００リットル、少なくとも３０，０００リットル、少なくとも４０，０００リットルまたは少なくとも５０，０００リットルである。いくつかの実施形態では、撹拌ベッセルの内径は、９０インチ〜１１０インチ、９５インチ〜１０５インチ、９８インチ、９９インチ、１００インチ、１０１インチまたは１０２インチである。いくつかの実施形態では、第１のインペラは、撹拌ベッセルの底から１５インチ〜２０インチ、１６インチ〜１９インチまたは１７インチ〜１８インチに位置しており、第２のインペラは、第１のインペラの上方６０インチ〜８０インチ、６５インチ〜７５インチ、６８インチ、６９インチ、７０インチ、７１インチ、７２インチ、７３インチ、７４インチまたは７５インチに位置する。いくつかの実施形態では、溶解細胞組成物を少なくとも５０ｒｐｍ、少なくとも６０ｒｐｍまたは少なくとも７０ｒｐｍで撹拌する。いくつかの実施形態では、溶解細胞組成物を５０ｒｐｍ〜７０ｒｐｍ、５０ｒｐｍ〜６０ｒｐｍまたは６０ｒｐｍ〜７０ｒｐｍで撹拌する。
[0077] いくつかの実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を撹拌する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、溶解細胞組成物を撹拌するプロセスにより、溶解細胞組成物が解乳化される。
[0078] いくつかの実施形態では、乳化剤、塩基、塩、熱および撹拌のうちの１つまたは複数を溶解細胞組成物に施して、解乳化溶解細胞組成物を形成する。
[0079] いくつかの実施形態では、本方法は、微生物油を含む未洗浄の溶解細胞組成物を解乳化して未洗浄の解乳化溶解細胞組成物を形成し、次いで、この未洗浄の解乳化溶解細胞組成物から微生物油を分離する工程を含む。未洗浄の解乳化溶解細胞組成物は、溶解細胞組成物が、後に例えば遠心分離により除去される例えば水または緩衝液で洗浄されないプロセスを意味する。溶解細胞組成物を洗浄することにより、細胞から入手される油の全収率が低下する可能性がある。
[0080] 代替実施形態では、溶解細胞組成物を洗浄する回数を、１回、２回、３回またはそれを超える回数だけ低減させることができる。いくつかの実施形態では、この洗浄はわずか１回、２回または３回である。
[0081] いくつかの実施形態では、溶解細胞組成物を形成する工程、溶解細胞組成物に乳化剤を添加する工程、溶解細胞組成物と塩基とを接触させる工程または溶解細胞組成物のｐＨを上昇させる工程、溶解細胞組成物と塩とを接触させる工程、溶解細胞組成物を加熱する工程、および溶解細胞組成物を撹拌する工程の様々な組み合わせを、単一のベッセル中で行うことができる。いくつかの実施形態では、細胞を形成する工程、細胞と塩基とを接触させる工程または細胞のｐＨを上昇させる工程、溶解細胞組成物に乳化剤を添加する工程、細胞と塩とを接触させる工程、細胞を加熱する工程、および細胞を撹拌する工程の様々な組み合わせを単一のベッセル中で行うことができる。いくつかの実施形態では、この単一のベッセルとして発酵ベッセルが挙げられる。いくつかの実施形態では、この発酵ベッセルの容積は、少なくとも２０，０００リットル、少なくとも５０，０００リットル、少なくとも１００，０００リットル、少なくとも１２０，０００リットル、少なくとも１５０，０００リットル、少なくとも２００，０００リットルまたは少なくとも２２０，０００リットルであることができる。いくつかの実施形態では、この発酵ベッセルの容積は、２０，０００リットル〜２２０，０００リットル、２０，０００リットル〜１００，０００リットル、２０，０００リットル〜５０，０００リットル、５０，０００リットル〜２２０，０００リットル、５０，０００リットル〜１５０，０００リットル、５０，０００リットル〜１００，０００リットル、１００，０００リットル〜２２０，０００リットル、１００，０００リットル〜１５０，０００リットル、１００，０００リットル〜１２０，０００リットル、１５０，０００リットル〜２２０，０００リットル、１５０，０００リットル〜２００，０００リットルまたは２００，０００リットル〜２２０，０００リットルであることができる。
[0082] いくつかの実施形態では、ベッセル中で形成する細胞または溶解細胞組成物のある量を、１つまたは複数の撹拌ベッセルに移すことができる。いくつかの実施形態では、この撹拌ベッセルの容積は、少なくとも２０，０００リットル、少なくとも３０，０００リットル、少なくとも４０，０００リットルまたは少なくとも５０，０００リットルであることができる。いくつかの実施形態では、この撹拌ベッセルの容積は、２０，０００リットル〜５０，０００リットル、２０，０００リットル〜４０，０００リットル、２０，０００リットル〜３０，０００リットル、３０，０００リットル〜５０，０００リットル、３０，０００リットル〜４０，０００リットルまたは４０，０００リットル〜５０，０００リットルであることができる。
[0083] 通常、本明細書に記載した方法は、微生物細胞から微生物油を入手するために、分離するためにまたは回収するために有機溶媒を利用しない。いくつかの実施形態では、微生物細胞から微生物油を入手するのに有機溶媒を使用しない。別の実施形態では、本明細書で開示したプロセス中に、有機溶媒を、微生物油を入手するのに十分な量または濃度で細胞に添加しない、溶解細胞組成物に添加しない、および／または油に添加しない。有機溶媒として、極性溶媒、無極性溶媒、水混和性溶媒、水非混和性溶媒およびそれらの組み合わせが挙げられる。
[0084] いくつかの実施形態では、本方法は、解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、解乳化溶解細胞組成物を遠心分離することにより、この解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程を含む。いくつかの実施形態では、解乳化溶解細胞組成物を静置させることにより、この解乳化溶解細胞組成物から油を分離し、この静置では、重力を使用して、解乳化溶解細胞組成物から（例えば分離層として）油が分離する。いくつかの実施形態では、親油性膜により分離が実現される。いくつかの実施形態では、この分離は、１０℃〜１００℃の温度で遠心分離する工程を含む。いくつかの実施形態では、（例えば、上記に記載した塩基を添加することにより）ｐＨを最初に上昇させ、次いで解乳化溶解細胞組成物を遠心分離して油を入手することにより、解乳化溶解細胞組成物から油を分離する。
[0085] いくつかの実施形態では、本方法は、解乳化溶解細胞組成物を少なくとも１０℃、少なくとも２０℃、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも４０℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、少なくとも９０℃、少なくとも９５℃または少なくとも１００℃の温度で遠心分離することにより、この解乳化溶解細胞組成物から油を分離する工程を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、解乳化溶解細胞組成物を１０℃〜１００℃、１０℃〜９０℃、１０℃〜８０℃、２０℃〜１００℃、２０℃〜９０℃、２０℃〜８０℃、２５℃〜１００℃、２５℃〜９０℃、２５℃〜８０℃、２５℃〜７５℃、３０℃〜１００℃、３０℃〜９０℃、３０℃〜８０℃、４０℃〜１００℃、４０℃〜９０℃、４０℃〜８０℃、５０℃〜１００℃、５０℃〜９０℃、５０℃〜８０℃、５０℃〜７０℃、６０℃〜１００℃、６０℃〜９０℃、６０℃〜８０℃、６０℃〜７０℃、７０℃〜１００℃、７０℃〜９０℃、７０℃〜８０℃、８０℃〜１００℃、８０℃〜９０℃または９０℃〜１００℃の温度で遠心分離することにより、この解乳化溶解細胞組成物から油を分離すること含む。
[0086] いくつかの実施形態では、遠心分離を、１分当たり１キログラム（ｋｇ／分）〜５００ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜４００ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜３００ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜２００ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜１００ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜７５ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜５０ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜４０ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜３０ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜２５ｋｇ／分、１ｋｇ／分〜１０ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜５００ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜４００ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜３００ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜２００ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜１００ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜７５ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜５０ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜４０ｋｇ／分、１０ｋｇ／分〜３０ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜５００ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜４００ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜３００ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜２００ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜１００ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜７５ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜５０ｋｇ／分、２０ｋｇ／分〜４０ｋｇ／分、２５ｋｇ／分〜５００ｋｇ／分、２５ｋｇ／分〜４００ｋｇ／分、２５ｋｇ／分〜３００ｋｇ／分、２５ｋｇ／分〜２００ｋｇ／分、２５ｋｇ／分〜１００ｋｇ／分、２５ｋｇ／分〜７５ｋｇ／分、２５ｋｇ／分〜５０ｋｇ／分、３０ｋｇ／分〜６０ｋｇ／分、３０ｋｇ／分〜５０ｋｇ／分、３０ｋｇ／分〜４０ｋｇ／分、５０ｋｇ／分〜５００ｋｇ／分、１００ｋｇ／分〜５００ｋｇ／分または２００ｋｇ／分〜５００ｋｇ／分の（解乳化溶解細胞組成物の遠心分離機への）供給速度で行う。
[0087] いくつかの実施形態では、本方法は、解乳化溶解細胞組成物を、１，０００ｇ〜２５，０００ｇ、１，０００ｇ〜２０，０００ｇ、１，０００ｇ〜１０，０００ｇ、２，０００ｇ〜２５，０００ｇ、２，０００ｇ〜２０，０００ｇ、２，０００ｇ〜１５，０００ｇ、３，０００ｇ〜２５，０００ｇ、３，０００ｇ〜２０，０００ｇ、５，０００ｇ〜２５，０００ｇ、５，０００ｇ〜２０，０００ｇ、５，０００ｇ〜１５，０００ｇ、５，０００ｇ〜１０，０００ｇ、５，０００ｇ〜８，０００ｇ、１０，０００ｇ〜２５，０００ｇ、１５，０００ｇ〜２５，０００ｇ、または少なくとも１，０００ｇ、少なくとも２，０００ｇ、少なくとも４，０００ｇ、少なくとも５，０００ｇ、少なくとも７，０００ｇ、少なくとも８，０００ｇ、少なくとも１０，０００ｇ、少なくとも１５，０００ｇ、少なくとも２０，０００ｇもしくは少なくとも２５，０００ｇの遠心力で遠心分離する工程を含む。本明細書で使用する場合、「ｇ」は、標準重力または約９．８ｍ／秒２を意味する。いくつかの実施形態では、本方法は、解乳化溶解細胞組成物を、４，０００ｒｐｍ〜１４，０００ｒｐｍ、４，０００ｒｐｍ〜１０，０００ｒｐｍ、６，０００ｒｐｍ〜１４，０００ｒｐｍ、６，０００ｒｐｍ〜１２，０００ｒｐｍ、８，０００〜１４，０００ｒｐｍ、８，０００ｒｐｍ〜１２，０００ｒｐｍまたは８，０００ｒｐｍ〜１０，０００ｒｐｍで遠心分離する工程を含む。
[0088] いくつかの実施形態では、例えば、分離した組成物の表面から微生物油をデカントすることにより、すくい取ることにより、吸引することにより、ポンプでくみ上げることにより、吸い出すことにより、流し出すことにより、サイホンで吸い上げることにより、または別の方法で回収することにより、この油を回収することができる。
[0089] いくつかの実施形態では、本方法は、回収した油を乾燥させてこの油から水を除去する工程を含む。いくつかの実施形態では、この油を乾燥させる工程として、この油を加熱して水を蒸発させる工程を挙げることができるがこれに限定されない。いくつかの実施形態では、乾燥後、この油の含水量は、油の重量（または体積）パーセントで３％未満、２．５％未満、２％未満、１．５％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満または０％である。いくつかの実施形態では、乾燥後、この油の含水量は、油の重量（または体積）パーセントで０％〜３％、０％〜２．５％、０％〜２％、０％〜１．５％、０％〜１％、０％〜０．５％、０．１％〜３％、０．１％〜２．５％、０．１％〜２％、０．１％〜１．５％、０．１％〜１％、０．１％〜０．５％、０．５％〜３％、０．５％〜２．５％、０．５％〜２％、０．５％〜１．５％、０．５％〜１％、１％〜３％、１％〜２．５％、１％〜２％、１％〜１．５％、１．５％〜３％、１．５％〜２．５％、１．５％〜２％、２％〜３％、２％〜２．５％または２．５％〜３％である。
[0090] 本明細書で開示されているのは、本明細書で開示した方法のいずれかにより微生物細胞から入手することができる微生物油である。いくつかの実施形態では、この油は少なくとも３０重量（または体積）％のアラキドン酸を含む。いくつかの実施形態では、この油は少なくとも３０重量（または体積）％のドコサヘキサエン酸を含む。
[0091] アニシジン値（ＡＶ）をＡＯＣＳ公式法Ｃｄ １８−９０に従って決定する。一実施形態では、本明細書に記載した油のＡＶは、約５０未満、約４０未満、約３０未満、約２０未満、約１５未満または約１０未満である。いくつかの実施形態では、この油のＡＶは約５０未満である。用語アニシジン値は、油の酸化中に生じる二次反応生成物の測定値を意味しており、例えばアルデヒドおよびケトンの測定値を意味する。
[0092] 過酸化物値（ＰＶ）をＡＯＣＳ公式法Ｃｄ ８−５３に従って決定する。一実施形態では、本明細書に記載した油のＰＶは、約２０ｍｅｑ／ｋｇ未満、約１０ｍｅｑ／ｋｇ未満または約５ｍｅｑ／ｋｇ未満である。いくつかの実施形態では、この油のＰＶは約５ｍｅｑ／ｋｇ未満である。用語過酸化物値は、油の酸化中に生じる一次反応生成物の測定値を意味しており、例えば過酸化物およびヒドロペルオキシドの測定値を意味する。本明細書で使用する場合、過酸化物値をｍｅｑ／ｋｇで測定する。
[0093] いくつかの実施形態では、油のリン含量は、１００ｐｐｍ以下、９５ｐｐｍ以下、９０ｐｐｍ以下、８５ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７５ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６５ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５５ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、４５ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３５ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２５ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、９ｐｐｍ以下、８ｐｐｍ以下、７ｐｐｍ以下、６ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、４ｐｐｍ以下、３ｐｐｍ以下、２ｐｐｍ以下または１ｐｐｍ以下である。いくつかの実施形態では、油のリン含量は約８ｐｐｍ以下である。
[0094] いくつかの実施形態では、油は１種または複数種のＰＵＦＡを含む。いくつかの実施形態では、油は、（ＰＵＦＡ重量で）少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％のＰＵＦＡを含む。いくつかの実施形態では、油は、（ＤＨＡ重量で）少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％もしくは少なくとも８０％のＤＨＡを含む、および／または（ＤＰＡ ｎ−６重量で）少なくとも１０％、少なくとも１５％もしくは少なくとも２０％のＤＰＡ ｎ−６を含む、および／または（ＥＰＡ重量で）少なくとも１０％、少なくとも１５％もしくは少なくとも２０％のＥＰＡを含む、および／または（ＡＲＡ重量で）少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも８０％のＡＲＡを含む。いくつかの実施形態では、油は、（ＥＰＡ重量で）５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満のＥＰＡを含む。いくつかの実施形態では、油は、（ＤＨＡ重量で）５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満のＤＨＡを含む。いくつかの実施形態では、油は、１０重量（もしくは体積）％未満、５重量（もしくは体積）％未満、２重量（もしくは体積）％未満、１重量（もしくは体積）％未満または０．５重量（もしくは体積）％未満のステロールを含む。
[0095] いくつかの実施形態では、油は、少なくとも５０重量（もしくは体積）％、少なくとも６０重量（もしくは体積）％、少なくとも７０重量（もしくは体積）％、少なくとも８０重量（もしくは体積）％、少なくとも９０重量（もしくは体積）％、少なくとも９５重量（もしくは体積）％または５０重量（もしくは体積）％〜９５重量（もしくは体積）％、５０重量（もしくは体積）％〜９０重量（もしくは体積）％、５０重量（もしくは体積）％〜８５重量（もしくは体積）％、５０重量（もしくは体積）％〜８０重量（もしくは体積）％、５０重量（もしくは体積）％〜７５重量（もしくは体積）％、６０重量（もしくは体積）％〜９５重量（もしくは体積）％、６０重量（もしくは体積）％〜９０重量（もしくは体積）％、６０重量（もしくは体積）％〜８５重量（もしくは体積）％、７０重量（もしくは体積）％〜９５重量（もしくは体積）％、７０重量（もしくは体積）％〜９０重量（もしくは体積）％、７０重量（もしくは体積）％〜８５重量（もしくは体積）％、７５重量（もしくは体積）％〜９５重量（もしくは体積）％、７５重量（もしくは体積）％〜９０重量（もしくは体積）％または７５重量（もしくは体積）％〜８５重量（もしくは体積）％のトリグリセリドを含む。
[0096] いくつかの実施形態では、このトリグリセリドは、少なくとも１０重量（もしくは体積）％、少なくとも２０重量（もしくは体積）％、少なくとも３０重量（もしくは体積）％、少なくとも３５重量（もしくは体積）％、少なくとも４０重量（もしくは体積）％、少なくとも５０重量（もしくは体積）％、少なくとも６０重量（もしくは体積）％、少なくとも７０重量（もしくは体積）％または少なくとも８０重量（もしくは体積）％のＤＨＡを含む。いくつかの実施形態では、このトリグリセリドは、少なくとも１０重量（もしくは体積）％、少なくとも２０重量（もしくは体積）％、少なくとも３０重量（もしくは体積）％、少なくとも３５重量（もしくは体積）％、少なくとも４０重量（もしくは体積）％、少なくとも４５重量（もしくは体積）％、少なくとも５０重量（もしくは体積）％、少なくとも５５重量（もしくは体積）％、少なくとも６０重量（もしくは体積）％、少なくとも６５重量（もしくは体積）％、少なくとも７０重量（もしくは体積）％、少なくとも７５重量（もしくは体積）％または少なくとも８０重量（もしくは体積）％のＡＲＡを含む。いくつかの実施形態では、このトリグリセリドは、少なくとも５０重量（もしくは体積）％、少なくとも４０重量（もしくは体積）％、少なくとも３０重量（もしくは体積）％、少なくとも２０重量（もしくは体積）％、少なくとも１５重量（もしくは体積）％、少なくとも１０重量（もしくは体積）％または少なくとも５重量（もしくは体積）％のＥＰＡを含む。
[0097] 一実施形態では、本明細書に記載した方法のいずれかにより入手および／または回収される微生物油は粗油である。別の実施形態では、本明細書に記載した油は精油である。「粗油」は、さらに加工することなく微生物細胞から入手される油である。「精油」は、精製、漂白および／または脱臭のための標準的な加工で粗油を処理することにより入手される油である。例えば米国特許第５，１３０，２４２号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態では、精製として、苛性精製、脱ガム、酸処理、アルカリ処理、冷却、加熱、漂白、脱臭、脱酸およびそれらの組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない。
[0098] いくつかの実施形態では、本方法は、微生物細胞を含む発酵ブロスを濃縮する工程を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、溶解細胞組成物を濃縮する工程を含む。本明細書で使用する場合、「濃縮する」は、ある組成物から水を除去することを意味する。濃縮として、蒸発、化学的乾燥、遠心分離等およびそれらの組み合わせを挙げることができるがそれらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞組成物または溶解細胞組成物を濃縮して、油の濃度をこの組成物の少なくとも４重量（もしくは体積）％、少なくとも５重量（もしくは体積）％、少なくとも１０重量（もしくは体積）％、少なくとも１５重量（もしくは体積）％、少なくとも２０重量（もしくは体積）％、少なくとも２５重量（もしくは体積）％または少なくとも３０重量（もしくは体積）％にする。いくつかの実施形態では、細胞組成物または溶解細胞組成物を濃縮して、油の濃度をこの組成物の４重量（もしくは体積）％〜４０重量（もしくは体積）％、４重量（もしくは体積）％〜３０重量（もしくは体積）％、４重量（もしくは体積）％〜２０重量（もしくは体積）％、４重量（もしくは体積）％〜１５重量（もしくは体積）％、５重量（もしくは体積）％〜４０重量（もしくは体積）％、５重量（もしくは体積）％〜３０重量（もしくは体積）％、５重量（もしくは体積）％〜２０重量（もしくは体積）％、１０重量（もしくは体積）％〜４０重量（もしくは体積）％、１０重量（もしくは体積）％〜３０重量（もしくは体積）％、１０重量（もしくは体積）％〜２０重量（もしくは体積）％、１５重量（もしくは体積）％〜４０重量（もしくは体積）％、１５重量（もしくは体積）％〜３０重量（もしくは体積）％、２０重量（もしくは体積）％〜４０重量（もしくは体積）％、２０重量（もしくは体積）％〜３０重量（もしくは体積）％、２５重量（もしくは体積）％〜４０重量（もしくは体積）％または３０重量（もしくは体積）％〜４０重量（もしくは体積）にする。
[0099] 本発明で使用する微生物細胞の有効な培養条件として、油の産生を可能にする有効培地、バイオリアクタ、温度、ｐＨおよび酸素条件が挙げられるがそれらに限定されない。有効培地は、微生物細胞、例えばスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）の微生物細胞が概して培養されるあらゆる培地を意味する。そのような培地は、吸収可能な炭素、窒素およびリン酸塩の供給源、ならびに適切な塩、ミネラルおよびその他の栄養素、例えばビタミンを有する水性培地を概して含む。本発明で使用する微生物細胞を、従来の発酵バイオリアクタ中で、振盪フラスコ中で、試験管中で、マイクロタイター皿中でおよびペトリ皿中で培養することができる。
[00100] いくつかの実施形態では、微生物細胞は、少なくとも３０重量（もしくは体積）％の油、少なくとも３５重量（もしくは体積）％の油、少なくとも４０重量（もしくは体積）％の油、少なくとも５０重量（もしくは体積）％の油、少なくとも６０重量（もしくは体積）％の油、少なくとも７０重量（もしくは体積）％の油または少なくとも８０重量（もしくは体積）％の油を含む。いくつかの実施形態では、本発明で使用するための微生物細胞は、１時間当たり１リットルにつき少なくとも０．１グラム（ｇ／Ｌ／ｈ）のＤＨＡ、少なくとも０．２ｇ／Ｌ／ｈのＤＨＡ、少なくとも０．３ｇ／Ｌ／ｈのＤＨＡまたは少なくとも０．４ｇ／Ｌ／ｈのＤＨＡを産生することができる。いくつかの実施形態では、本発明で使用するための微生物細胞は、１時間当たり１リットルにつき少なくとも０．０１グラム（ｇ／Ｌ／ｈ）のＡＲＡ、少なくとも０．０５ｇ／Ｌ／ｈのＡＲＡ、少なくとも０．１ｇ／Ｌ／ｈのＡＲＡ、少なくとも０．２ｇ／Ｌ／ｈのＡＲＡ、少なくとも０．３ｇ／Ｌ／ｈのＡＲＡまたは少なくとも０．４ｇ／Ｌ／ｈのＡＲＡを産生することができる。
[00101] いくつかの実施形態では、本明細書に記載した方法のいずれかに従って入手される油、バイオマス残渣またはそれらの組み合わせを、食品または食品成分として、例えばベビーフード、調製粉乳、飲料、ソース、乳製品（例えばミルク、ヨーグルト、チーズおよびアイスクリーム）、油（例えば食用油またはサラダドレッシング）および焼き菓子；（例えばカプセルまたは錠剤の形状の）栄養補助剤；任意の非ヒト動物（例えば、生産物（例えば肉、乳または卵）がヒトにより消費されるもの）用の飼料および飼料補助剤；栄養補助食品；ならびに医薬品（直接的なまたは補助的な治療用途）での一成分として直接使用することができる。用語「動物」は、動物界に属するあらゆる生物を意味しており、あらゆるヒト動物、および生産物（例えば乳、卵、家禽肉、牛肉、豚肉または子羊肉）が得られる非ヒト動物を含む。いくつかの実施形態では、油および／またはバイオマスを海産食品で使用することができる。海産食品は魚、エビおよび甲殻類から得られるがそれらに限定されない。用語「生産物」は、そのような動物から得られるあらゆる生産物を含み、この生産物として、肉、卵、乳またはその他の生産物が挙げられるがそれらに限定されない。油および／またはバイオマスをそのような動物に給餌すると、多価不飽和油がそのような動物の肉、乳、卵またはその他の生産物に取り込まれて、この生産物の油含量を高めることができる。
［実施例］
［実施例１］
[00102] 微生物細胞（モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ））を含む細胞ブロス（２５０ｍＬ）を３０秒にわたり剪断ミキサーを通して送り、次いでこのブロスをＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｍ−１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（マサチューセッツ州ニュートン（Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ））に２回通すことにより、機械的にホモジナイズして細胞を溶解した。このマイクロフルイダイザーに１回目も２回目も１０，０００ｐｓｉで通した。溶解細胞組成物に、この溶解細胞組成物の１重量％の量でドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）粉末を添加した。溶解細胞組成物を、３時間にわたり１８０ｒｐｍの速度で撹拌しつつ９０℃に加熱した。ＮａＯＨの１２．５重量／重量％溶液を溶解細胞組成物の２重量％〜４重量％で添加することにより、溶解細胞組成物のｐＨを８．４２に調整した。固体のＮａＣｌを溶解細胞組成物の２重量％の量で添加し、この組成物を３０時間にわたり９０℃にて１８０ｒｐｍで撹拌した。撹拌中、溶解細胞組成物のｐＨが低下し、ＮａＯＨの１２．５重量／重量％溶液を溶解細胞組成物の２重量％〜４重量％で添加してｐＨを８に調整した。溶解細胞組成物を５分にわたり８，０００ｇで遠心分離して粗油を生成し、この粗油から（ＡＲＡ重量で）６９．７％のＡＲＡを得た。この粗油のアニシジン値（ＡＶ）は２７．９であった。
［実施例２］
[00103] 微生物細胞（モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ））を含む細胞ブロス（２５０ｍＬ）を３０秒にわたり剪断ミキサーを通して送り、次いでこのブロスをＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｍ−１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（マサチューセッツ州ニュートン）に２回通すことにより、機械的にホモジナイズして細胞を溶解した。このマイクロフルイダイザーに１回目も２回目も１０，０００ｐｓｉで通した。ＮａＯＨの１２．５重量／重量％溶液を溶解細胞組成物の４重量％〜８重量％で添加することにより、溶解細胞組成物のｐＨを１０．０２に調整した。ＳＤＳ粉末を溶解細胞組成物の１重量％の量で添加し、この組成物を３時間にわたり１８０ｒｐｍの速度で撹拌しつつ９０℃に加熱した。溶解細胞組成物のｐＨが８．５に低下し、このｐＨで固体のＮａＣｌを溶解細胞組成物の２重量％の量で添加し、この組成物を４０時間にわたり９０℃にて１８０ｒｐｍで撹拌した。撹拌中、溶解細胞組成物のｐＨが低下し、ＮａＯＨの１２．５重量／重量％溶液を溶解細胞組成物の２重量％〜４重量％で添加してｐＨを８に調整した。次いで、溶解細胞組成物を５分にわたり８，０００ｇで遠心分離して粗油を生成し、この粗油から（ＡＲＡ重量で）７８．９％のＡＲＡを得た。この粗油のＡＶは１１．２であった。
［実施例３］
[00104] 微生物細胞（モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ））を含む細胞ブロス（７１６ｋｇ）をＧＥＡ Ｎｉｒｏホモジナイザー（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ、ニューハンプシャー州ベドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＮＨ））に２回通すことにより、このブロスを機械的にホモジナイズして細胞を溶解して溶解細胞組成物を形成した。このマイクロフルイダイザーに１回目も２回目も１０，０００ｐｓｉで通した。ＳＤＳ粉末を溶解細胞組成物の１重量％の量で添加し、この組成物を３時間にわたり１８０ｒｐｍの速度で撹拌しつつ９０℃に加熱した。ＮａＯＨの５０重量／重量％溶液を１．３ｋｇ添加して溶解細胞組成物のｐＨを約８．５に調整した。固体のＮａＣｌを溶解細胞組成物の２重量％の量で添加し、この組成物を６０時間にわたり９０℃で撹拌した。撹拌中、溶解細胞組成物のｐＨが低下し、その後、ＮａＯＨの５０重量／重量％溶液を溶解細胞組成物の０．５重量％〜１重量％で添加してｐＨを８に調整した。この組成物を４０ｋｇ／分の供給速度にて６，０００ｒｐｍで遠心分離（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ ＲＳＥ−１１０遠心分離機（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ ＡＧ、ドイツ）を使用した）して粗油を生成し、この粗油から（ＡＲＡ重量で）８５％のＡＲＡを得た。粗油のＡＶは４８．９であり、リン含有量は３．２ｐｐｍであった。
［実施例４］
[00105] 微生物細胞（モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ））を含む細胞ブロス（１，６００ｋｇ）を６０分にわたり剪断ミキサーを通して送り、次いでこのブロスをＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｍ−１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、マサチューセッツ州ニュートン）に２回通すことにより、機械的にホモジナイズして細胞を溶解して溶解細胞組成物を形成した。このマイクロフルイダイザーに１回目も２回目も１０，０００ｐｓｉで通した。ＮａＯＨの５０重量／重量％溶液を溶解細胞組成物の１重量％で添加して溶解細胞組成物のｐＨを約１０に調整した。ＳＤＳの３０重量／重量％溶液を溶解細胞組成物の３重量％の量で添加し、この組成物を３時間にわたり１８０ｒｐｍの速度で撹拌しつつ９０℃に加熱した。溶解細胞組成物のｐＨが約８．５に低下し、このｐＨで固体のＮａＣｌを溶解細胞組成物の２重量％の量で添加し、この組成物を１００時間にわたり９０℃にて１８０ｒｐｍで撹拌した。撹拌中、溶解細胞組成物のｐＨが低下し、ＮａＯＨの５０重量／重量％溶液を溶解細胞組成物の０．５重量％〜１重量％で添加してｐＨを８に調整した。この組成物を８Ｌ／分の供給速度にて１１，０００ｒｐｍで遠心分離（Ｓｅｉｔａｌ ＳＲ １０１０遠心分離機（Ｓｅｉｔａｌ ｓｒｌ、イタリア）を使用した）して粗油を生成し、この粗油から（ＡＲＡ重量で）６６．９％のＡＲＡを得た。粗油のＡＶは１４．６であり、リン含有量は１ｐｐｍであった。
［実施例５］
[00106] 微生物細胞（モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ））を含む細胞ブロス（２５０ｇ）を３０秒にわたり剪断ミキサーを通して送り、このブロスをＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｍ−１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、マサチューセッツ州ニュートン）に２回通すことにより、機械的にホモジナイズして細胞を溶解した。このマイクロフルイダイザーに１回目も２回目も１０，０００ｐｓｉで通した。ＮａＯＨの１２．５重量／重量％溶液を添加して溶解細胞組成物のｐＨを１０に調整した。溶解細胞組成物に、この溶解細胞組成物の１重量％の量でＴｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）を添加し、この組成物を３時間にわたり２５０ｒｐｍの速度で撹拌しつつ９０℃に加熱した。溶解細胞組成物のｐＨが８．３に低下し、このｐＨで固体のＮａＣｌを溶解細胞組成物の２重量％の量で添加し、この組成物を２０時間にわたり９０℃にて２５０ｒｐｍで撹拌した。２０時間の撹拌期間全体を通して試料を採取し、５分にわたり８，０００ｇで遠心分離した。油が分離する兆候はなかった。Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）を溶解細胞組成物の２重量％の量で添加して実験を繰り返した。油が分離する兆候はなかった。ＳＤＳは実施例１〜４の溶解細胞組成物からの油の分離を促進し、これは、ＳＤＳがイオン性乳化剤であり（Ｔｗｅｅｎ８０は非イオン性乳化剤である）、Ｔｗｅｅｎ８０（１３１０ｇ／ｍｏｌ）と比べて分子量が小さい（２８８ｇ／ｍｏｌ）ためであると考えられる。
［実施例６］
[00107] 微生物細胞（シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種）を含む細胞ブロス（３００ｇ）を、６０℃で１時間にわたり低温殺菌した。この細胞ブロスを１８０ＲＰＭの速度で撹拌し、６０℃に加熱した。５０重量％のＮａＯＨ溶液を添加して未洗浄のブロスのｐＨを７〜７．５に調整し、Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）２．４ ＦＧ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（ノースカロライナ州フランクリントン（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ））から入手可能である）を、ブロス重量を基準として０．５％の量で添加することにより、細胞を溶解した。このブロスを２時間にわたり反応させ、次いで１２．５重量％のＮａＯＨ溶液を添加してｐＨを１０〜１１に調整した。同時に、ＳＤＳ粉末を溶解細胞組成物の２重量％の量で添加し、この組成物を２〜５時間にわたり８０〜９０℃に加熱した。この保持時間後に、固体のＮａＣｌを溶解細胞組成物の２重量％の量で添加し、この組成物を１９時間にわたり９０℃に加熱した。溶解細胞組成物を５分にわたり８０００ＲＰＭで遠心分子（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｒｖｅｌｌ ＳＴ４０Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）して粗油を生成し、この粗油から（ＤＨＡ重量で）５１．４４％のＤＨＡを得た。
［実施例７］
[00108] 微生物細胞（シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種）を含む細胞ブロス（３００ｇ）を、６０℃で１時間にわたり低温殺菌した。未洗浄の細胞ブロスをＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｍ−１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、マサチューセッツ州ニュートン）に１０，０００ｐｓｉで１回通すことにより、このブロスを機械的にホモジナイズして細胞を溶解した。溶解細胞組成物を１８０ＲＰＭの速度で撹拌しつつ、１２．５重量％のＮａＯＨ溶液を添加してこの組成物のｐＨを１０〜１１に調整した。同時に、ＳＤＳ粉末を溶解細胞組成物の２重量％の量で添加し、この組成物を２〜５時間にわたり８０〜９０℃に加熱した。この保持時間後に、固体のＮａＣｌを溶解細胞組成物の２重量％の量で添加し、この組成物を９０℃に加熱して数時間にわたり保持した。溶解細胞組成物を５分にわたり８０００ＲＰＭで遠心分子（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｒｖｅｌｌ ＳＴ４０Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）して粗油を生成し、この粗油から（ＤＨＡ重量で）５９．３２％のＤＨＡを得た。
［実施例８］
[00109] 微生物細胞（シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種）を含む細胞ブロス（３００ｇ）を、６０℃で１時間にわたり低温殺菌した。この細胞ブロスを１８０ＲＰＭの速度で撹拌し、６０℃に加熱した。５０重量％のＮａＯＨ溶液を添加して未洗浄のブロスのｐＨを７〜７．５に調整し、Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）２．４ ＦＧ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（ノースカロライナ州フランクリントン）から入手可能である）を、ブロス重量を基準として０．５％の量で添加することにより、細胞を溶解した。撹拌を維持しつつ、１２．５重量％のＮａＯＨ溶液を添加して溶解細胞組成物のｐＨを１０〜１１に調整した。同時に、ＳＤＳ粉末を溶解細胞組成物の１重量％の量で添加し、この組成物を１．５時間にわたり８０〜９０℃に加熱した。この保持時間後に、固体のＮａＣｌを溶解細胞組成物の２重量％の量で添加し、この組成物を９０℃に加熱して数時間にわたり保持した。溶解細胞組成物を５分にわたり８０００ＲＰＭで遠心分子（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｒｖｅｌｌ ＳＴ４０Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）して、粗油を生成した。
［実施例９］
[00110] 微生物細胞（シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種）を含む細胞ブロス（３００ｇ）を、６０℃で１時間にわたり低温殺菌した。この細胞ブロスを１８０ＲＰＭの速度で撹拌し、６０℃に加熱した。５０重量％のＮａＯＨ溶液を添加して未洗浄のブロスのｐＨを７〜７．５に調整し、Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）２．４ ＦＧ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（ノースカロライナ州フランクリントン）から入手可能である）を、ブロス重量を基準として０．５％の量で添加することにより、細胞を溶解した。撹拌を維持しつつ、１２．５重量％のＮａＯＨ溶液を添加して溶解細胞組成物のｐＨを１０〜１１に調整した。同時に、ＳＤＳ粉末を溶解細胞組成物の０．５重量％の量で添加し、この組成物を２時間にわたり８０〜９０℃に加熱した。この保持時間後に、固体のＮａＣｌを溶解細胞組成物の２重量％の量で添加し、この組成物を９０℃に加熱して１８時間にわたり保持した。溶解細胞組成物を５分にわたり８０００ＲＰＭで遠心分子（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｒｖｅｌｌ ＳＴ４０Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）して８０％の粗油を得て、この粗油から（ＤＨＡ重量で）８５％のＤＨＡを得た。
［実施例１０］
[00111] 微生物細胞（シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種）を含む細胞ブロス（３００ｇ）を、６０℃で１時間にわたり低温殺菌した。この細胞ブロスを１８０ＲＰＭの速度で撹拌し、６０℃に加熱した。５０重量％のＮａＯＨ溶液を添加して未洗浄のブロスのｐＨを７〜７．５に調整し、Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）２．４ ＦＧ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（ノースカロライナ州フランクリントン）から入手可能である）を、ブロス重量を基準として０．５％の量で添加することにより、細胞を溶解した。撹拌を維持しつつ、１２．５重量％のＮａＯＨ溶液を添加して溶解細胞組成物のｐＨを１０〜１１に調整した。同時に、ＳＤＳ粉末を溶解細胞組成物の１重量％の量で添加し、この組成物を９０℃に加熱した。９０℃での２．５時間後に、この組成物を５分にわたり８０００ＲＰＭで遠心分子（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｒｖｅｌｌ ＳＴ４０Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）して粗油を生成し、この粗油から（ＤＨＡ重量で）９２％のＤＨＡを得た。

Claims (37)

  1. １種または複数種の微生物細胞から１種または複数種の多価不飽和脂肪酸を含む微生物油を入手するための方法であって、
    （ａ）前記微生物油を含む前記細胞を溶解して溶解細胞組成物を形成する工程；
    （ｂ）前記溶解細胞組成物を解乳化して解乳化溶解細胞組成物を形成する工程；
    （ｃ）前記解乳化溶解細胞組成物から前記油を分離する工程；および
    （ｄ）前記油を回収する工程
    を含み、（ｂ）が、工程（ａ）の前に、工程（ａ）の最中にまたは工程（ａ）の後に乳化剤を添加する工程を含む、方法。
  2. （ａ）または（ｂ）の少なくとも一方が、前記細胞または前記組成物を少なくとも７０℃に加熱する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. （ａ）または（ｂ）の少なくとも一方が、前記細胞または前記組成物を約７０℃〜約１００℃に加熱する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. （ｂ）が、前記溶解細胞組成物に塩基を添加する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. （ｂ）が、前記溶解細胞組成物のｐＨを約８以上に上昇させる工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. （ｂ）が、前記溶解細胞組成物の約０．０５重量％〜約２０重量％の量で塩を添加する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. （ｂ）が、前記溶解細胞組成物を撹拌する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. （ａ）が、前記細胞を撹拌する工程をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. （ａ）の前記細胞が未洗浄である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. （ａ）の前記細胞が発酵ブロスに含まれている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. （ｃ）が、前記解乳化溶解細胞組成物を遠心分離する工程を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記多価不飽和脂肪酸が、ω−３脂肪酸、ω−６脂肪酸およびそれらの混合物から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記多価不飽和脂肪酸が、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、γ−リノール酸（ＧＬＡ）、ジホモ−γ−リノール酸（ＤＧＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）およびそれらの混合物から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記多価不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記多価不飽和脂肪酸がアラキドン酸（ＡＲＡ）である、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記微生物細胞が、藻類、酵母、真菌類、抵抗または細菌の細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記微生物細胞が、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属またはスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目に由来する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記微生物細胞がスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目に由来する、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記微生物細胞が、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属またはそれらの混合物に由来する、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記微生物細胞がモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ Ａｌｐｉｎａ）に由来する、請求項１６に記載の方法。
  21. 前記溶解細胞組成物が、液体、細胞断片および微生物油を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記油を前記細胞から入手するために有機溶媒が使用されない、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記解乳化溶解細胞組成物の平均粒径が少なくとも１０ミクロンである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記乳化剤がイオン性乳化剤である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記イオン性乳化剤が、アニオン性硫酸塩乳化剤、アニオン性スルホン酸塩乳化剤、アニオン性リン酸塩乳化剤、アニオン性カルボン酸塩乳化剤およびこれらの組み合わせから選択されるアニオン性乳化剤である、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記アニオン性乳化剤がアニオン性硫酸塩乳化剤である、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記アニオン性硫酸塩乳化剤が、ラウリル硫酸アンモニウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ミレス硫酸ナトリウムおよびこれらの組み合わせから選択される、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記乳化剤が前記溶解細胞組成物の０．２重量％〜１０重量％の量で添加される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記塩が、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、硫酸塩およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. （ｄ）の前記油が粗油である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. （ｄ）が、前記粗油を精製して精油を入手する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記油が少なくとも３０重量％のアラキドン酸を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記油が少なくとも３０重量％のドコサヘキサエン酸を含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記油のアニシジン値が約５０未満である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記油のリン含量が約８ｐｐｍ以下である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記油の過酸化物値が約５ｍｅｑ／ｋｇ未満である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法により入手される油。
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